CN103113428B

CN103113428B - 果糖赖氨酸的制备方法

Info

Publication number: CN103113428B
Application number: CN201310047017.8A
Authority: CN
Inventors: 邹炳德; 邹继华; 陆慧贤
Original assignee: NINGBO MEIKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Meikang biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2013-02-06
Filing date: 2013-02-06
Publication date: 2015-12-23
Anticipated expiration: 2033-02-06
Also published as: CN103113428A

Abstract

本发明公开一种果糖赖氨酸的制备方法，步骤包括：1~10份的赖氨酸α-NH₂衍生物、10~100份的D-葡萄糖、80~800份醇溶液回流反应，温度40~90℃、时间1~10h；减压蒸干加20~150份纯水溶解；以0.1~5mL/min的流速泵入到强酸性阳离子交换树脂层析柱中，用纯水以1~8mL/min洗脱，用0.01~3mol/LpH3~6的吡啶甲酸盐或吡啶乙酸盐洗脱，收集洗脱液进行冷冻干燥，得到白色固体物质将其溶于1~2mol/L盐酸溶液中放置过夜，试液冷冻干燥，得白色固形物溶于甲醇或乙醚，0~10℃下放置析出白色固形物，过滤，冷冻干燥得白色固体物质即为果糖赖氨酸。本发明具有制备得率高且得到的底物纯度高的优点。

Description

果糖赖氨酸的制备方法

技术领域

本发明涉及果糖赖氨酸，即由葡萄糖和氨基酸反应形成的Amadori产物的制备方法。

背景技术

血液中的糖化白蛋白反应了一段时期内生物体内的血糖水平，近年来被用作糖尿病诊断和治疗的重要指标。目前市场上主要采用酶法用于检测人体内糖化白蛋白的含量，利用该法测定糖化白蛋白需用到一类特殊的酶类——果糖赖氨酸氧化酶，该酶作用于糖化多肽或糖化氨基酸，其作用产物经过一系列氧化还原反应，最后通过终产物的显色来确定糖化白蛋白的含量。因此果糖赖氨酸氧化酶为糖化白蛋白测定中的关键酶。

目前研究表明，人血液中糖化白蛋白糖基化的位点为赖氨酸ε-NH2残基，因此制备人血液糖化白蛋白的模拟底物，即果糖赖氨酸[N_ε-（1-脱氧-D-果糖-1-yl）-赖氨酸]，对筛选高活性、高稳定性及高特异性的果糖赖氨酸氧化酶及研究其酶学性质格外重要。该底物的实质即是氨基酸与还原糖通过美拉德（Maillard）反应生成的中间产物——Amadori化合物。其反应原理是还原糖的羰基与氨基酸的氨基之间进行加成，加成物迅速失去1分子水转变为希夫（Schiff）碱，再经环化形成相应的N-取代的醛，最后通过Amadori重排形成较稳定的1-氨基-1-脱氧-2-酮糖。具体的反应过程如下：

目前，合成Amadori化合物的方法主要采用“加热回流”法，通常是通过葡萄糖和氨基酸直接在无水甲醇中回流数小时，但因副反应比较多，要得到纯度较高的Amadori化合物，则必须经过提纯。在已有的Amadori化合物分离提纯技术中，主要有阳离子交换树脂分离、纤维素柱分离、硅胶柱分离等，其中以阳离子交换树脂分离提纯应用最为广泛。但是，由于不同的氨基酸之间本身存在分子量大小、带电性状、疏水性状及空间结构的差异，利用上述方法制备相应的Amadori化合物存在一定的局限性，即会出现收率过低、纯度不高的结果。因此需要改进现有的技术方法来解决上述弊端。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种果糖赖氨酸的制备方法，该方法具有收率高且得到的底物纯度高的优点。

本发明的果糖赖氨酸，其结构式如下所示：

为实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案：一种果糖赖氨酸的制备方法，包括以下制备步骤：

（1）以1~10重量份的赖氨酸α-NH2衍生物、10~100重量份的D-葡萄糖为原料，80~800重量份醇溶液为溶剂，放入反应容器中，设定反应温度为40~90℃进行回流反应；

（2）反应经1~10h后，停止加热，冷却；

（3）将冷却后的反应液控制真空度为-0.01~-0.09MPa、温度为30~50℃进行减压蒸干，得到干物质，在所得的干物质中加入20~150重量份纯水，待溶解后得溶液；

（4）将步骤（3）的溶液以0.1~5mL/min的流速泵入到强酸性阳离子交换树脂层析柱中，完毕后，先用纯水以1~8mL/min流速洗脱，以除去残留的糖，当所得洗脱液与葡萄糖检测试剂反应不显色时，开始改用0.01~3mol/L、pH3~6的吡啶甲酸盐或吡啶乙酸盐溶液洗脱，当所得洗脱液与底物检测试剂反应显色时，开始收集洗脱液，直至所得洗脱液与底物检测试剂反应不显色或颜色极浅为止；

（5）将步骤（4）收集的洗脱液进行冷冻干燥，得到的固体物质溶于1~2mol/L盐酸溶液中，室温放置过夜，以脱去保护基团；

（6）将步骤（5）放置过夜的试液冷冻干燥，得到固体物质以1:0.5~10（g/mL即重量与体积比）比例溶于甲醇或乙醚中，在0~10℃下放置，析出白色固形物，过滤，经冷冻干燥后所得的白色固体物质即为果糖赖氨酸。

本发明上述的赖氨酸α-NH₂衍生物为赖氨酸a-氨基的一个氢原子被其他化合物取代后所得到的衍生物，用于保护赖氨酸的α-NH2，上述衍生物例如：Nα-苄氧羰基-L-赖氨酸，Nα-叔丁氧羰基-L-赖氨酸，Nα-芴甲氧羰基-L-赖氨酸，Nα-马尿酰基-L-赖氨酸，Nα-甲酰基-L-赖氨酸，Nα-甲酰基-L-赖氨酸。

本发明上述的醇溶液为无水甲醇或无水乙醇溶液。

本发明上述的葡萄糖检测试剂的配方：缓冲液（0.01~1mol/L，pH5~8.5），葡萄糖氧化酶（1~16KU/L），过氧化氢的显色系统；过氧化氢的显色系统包括：过氧化物酶（0.5~10KU/L），色原（0.2~10mmol/L）和成色剂（0.2~10mmol/L）；上述各组分浓度均为在整体葡萄糖检测试剂中的浓度。

本发明上述的底物检测试剂的配方：缓冲液（20~200mmol/L，pH5~8.5），果糖赖氨酸氧化酶（0.3~10KU/L），过氧化氢的显色系统；过氧化氢的显色系统包括：过氧化物酶（0.5~10KU/L），色原（0.2~10mmol/L）和成色剂（0.2~10mmol/L）；上述各组分浓度均为在整体葡萄糖检测试剂中的浓度。

上述检测试剂配置均以水为溶剂。

本发明上述的吡啶乙酸盐如4-吡啶乙酸盐、2-吡啶乙酸盐、3-吡啶乙酸盐等，优选4-吡啶乙酸盐酸盐；上述的吡啶甲酸盐如4-吡啶甲酸盐、2-吡啶甲酸盐、3-吡啶甲酸盐等，优选为2-吡啶甲酸盐酸盐。

本发明上述缓冲液是指能保持上述几种酶稳定的任何缓冲液试剂，如包括：磷酸盐缓冲液，乙酸-乙酸钠缓冲液，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，甘氨酸-盐酸缓冲液等。优选磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（Tris-HCl缓冲液）。

本发明上述过氧化氢的显色系统中的色原，包括苯酚，苯酚衍生物，苯胺衍生物，例如：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐,N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐中的一种。

上述过氧化氢的显色系统中的成色剂为4-氨基安替比林，3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物中的一种。

本发明的优点和有益效果：

1.本发明制备葡萄糖和赖氨酸衍生物反应生成的Amadori产物即果糖赖氨酸采用“加热回流”法，在除糖纯化步骤中，采用酶法在线监测葡萄糖的去除情况，该反应比传统的化学方法灵敏度高，可有效判断糖份的残留程度，以保证产物的纯度；在洗脱收集产物的步骤中，同样采用酶法在线监测产物的洗脱情况，该法比薄层层析色谱法更为方便快捷，且比已报道的采用铁氰化钾显色的化学方法更为灵敏，因此充分降低了产物的损耗，提高了收率。

2.本发明制备得到的果糖赖氨酸纯度高，适用于果糖赖氨酸氧化酶的优选及酶学性质的研究，有助于糖化白蛋白体外诊断检测试剂盒的开发研究。

具体实施方式

本发明结合以下实施例做进一步描述，但并不限制本发明。

实施例1：

果糖赖氨酸制备方法包括以下操作步骤：

（1）称取1gNα-苄氧羰基-L-赖氨酸（CAS：2212-75-1）、5g葡萄糖于三颈瓶中，加入50mL甲醇，插入温度计，设定反应温度为80℃，以自来水作冷却液，启动回流反应；

（2）反应经4h后，停止加热，冷却；

（3）将反应液于-0.01MPa、40℃真空干燥箱内减压蒸干，在所得的干物质中加入100mL纯水，待溶解后得到溶液；

（4）将步骤（3）的溶液以1mL/min的流速泵入到1.2×5.0cm（内直径×柱高）强酸性阳离子交换树脂层析柱中，完毕后，先用纯水以5mL/min流速洗脱，当洗脱液与葡萄糖检测试剂不显紫红色时，开始改用2mol/L、pH3.25的吡啶甲酸盐溶液（2-吡啶甲酸盐酸盐溶液）以2mL/min的流速洗脱，当洗脱液与底物检测试剂显紫红色时，开始收集，直至与底物检测试剂不显色或颜色极浅为止（行业人员通常判断方法）；

（5）将收集的洗脱液进行冷冻干燥，得到的白色固体物质溶于1mol/L盐酸溶液中，室温放置过夜；

（6）将试液冷冻干燥，得到的白色固形物溶于10mL甲醇中，4℃冰箱放置，析出白色固形物，过滤，经冷冻干燥后所得的白色固体物质即为果糖赖氨酸。

冷冻干燥为行业常规技术，在此不再赘述。

所述的葡萄糖检测试剂的配方：磷酸钾缓冲液（50mmol/L，pH5），葡萄糖氧化酶（8KU/L），过氧化氢的显色系统，过氧化氢的显色系统包括：过氧化物酶（3KU/L），N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐（5mmol/L）和4-氨基安替比林（10mmol/L），葡萄糖检测试剂的体积共90μL（以水为溶剂）。

所述的底物检测试剂的配方：Tris-HCl缓冲液（100mmol/L，pH8），果糖赖氨酸氧化酶（0.5KU/L），过氧化氢的显色系统，过氧化氢的显色系统包括：过氧化物酶（6KU/L），N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐（2mmol/L）和4-氨基安替比林（1mmol/L），底物检测试剂体积共140μL。

得到的果糖赖氨酸的理化性质如下：Nα-苄氧羰基-L-赖氨酸与D-葡萄糖反应，最后经“脱保护基团”生成的Amadori产物为纯白色粉末，无味，熔点为55℃，分子式为C₁₂H₂₄N₂O₇，相对分子量为308.33，产率为45.3%，纯度98%。

实施例2：

果糖赖氨酸制备方法包括以下操作步骤：

（1）称取0.5gNα-叔丁氧羰基-L-赖氨酸（CAS：13734-28-6）、10g葡萄糖于三颈瓶中，加入100mL无水乙醇，插入温度计，以自来水作回流冷却液，设定反应温度为90℃，启动反应；

（2）反应经4.5h后，停止加热，冷却；

（3）将反应液于-0.02MPa、42℃真空干燥箱内减压蒸干，在所得的干物质中加入100mL纯水，待溶解后得到溶液；

（4）将步骤溶液（3）以2mL/min的流速泵入到1.2×10.0cm（内直径×柱高）强酸性阳离子交换树脂层析柱中，完毕后，先用纯水以4mL/min流速洗脱，当洗脱液与葡萄糖检测试剂不显紫红色时，开始改用0.09mol/L、pH4.5的吡啶乙酸盐溶液（4-吡啶乙酸盐酸盐溶液）以3mL/min的流速洗脱，当洗脱液与底物检测试剂显紫红色时，开始收集，直至与底物检测试剂不显色或颜色极浅为止；

（5）将收集的洗脱液进行冷冻干燥，得到的白色固体物质溶于1.5mol/L盐酸溶液中，室温放置过夜，以脱去保护基团；

（6）将试液冷冻干燥，得到的白色固形物溶于20mL乙醚中，4℃冰箱放置，析出白色固形物，过滤，经冷冻干燥后所得的白色固体物质即为果糖赖氨酸。

所述的葡萄糖检测试剂的配方：磷酸钾缓冲液（10mmol/L，pH6），葡萄糖氧化酶（5KU/L），过氧化氢的显色系统，过氧化氢的显色系统包括：过氧化物酶（5KU/L），N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐（1mmol/L）和4-氨基安替比林（1mmol/L），葡萄糖检测试剂的体积共90μL。

所述的底物检测试剂的配方：Tris-HCl缓冲液（50mmol/L，pH7），果糖赖氨酸氧化酶（1KU/L），过氧化氢的显色系统，过氧化氢的显色系统包括：过氧化物酶（5KU/L），N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐（1mmol/L）和4-氨基安替比林（1mmol/L），底物检测试剂体积共140μL。

得到的果糖赖氨酸的理化性质如下：Nα-叔丁氧羰基-L-赖氨酸与D-葡萄糖反应，最后经“脱保护基团”生成的Amadori产物为纯白色粉末，无味，熔点为55℃，分子式为C₁₂H₂₄N₂O₇，相对分子量为308.33，产率为46.1%，纯度98%。

实施例3：

一种果糖赖氨酸氧化酶活性测定方法：

（1）采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。

（2）果糖赖氨酸氧化酶活性的测定：取100μL果糖缬氨酸氧化酶液加到反应混合液中，37℃温浴5-10分钟，测量550处的吸光值。反应混合液的成分为：100mmol/LTris-Hcl（pH8.0）,0.5mmol/L4-氨基安替匹林，0.5mmol/LN-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，6.0unit/mL过氧化物酶，5.0mmol/L果糖赖氨酸，总体积为3mL。其中，一个酶活性单位定义为：在37℃下每分钟催化产生0.5umol醌染料所需要的酶量。实际酶活力按每分钟每mg蛋白所形成的μmol产物来测定。

Claims

1.一种果糖赖氨酸的制备方法，其特征在于：包括以下制备步骤：

（1）以1~10重量份的赖氨酸α-NH₂衍生物、10~100重量份的D-葡萄糖为原料，80~800重量份醇溶液为溶剂，放入反应容器中，设定反应温度为40~90℃进行回流反应；

（2）反应经1~10h后，停止加热，冷却；

（4）将步骤（3）的溶液以0.1~5mL/min的流速泵入到强酸性阳离子交换树脂层析柱中，完毕后，先用纯水以1~8mL/min流速洗脱，当所得洗脱液与葡萄糖检测试剂反应不显色时，开始改用0.01~3mol/L、pH3~6的吡啶甲酸盐或吡啶乙酸盐洗脱，当所得洗脱液与底物检测试剂反应显色时，开始收集洗脱液，直至所得洗脱液与底物检测试剂反应不显色或颜色极浅为止；

（5）将步骤（4）收集的洗脱液进行冷冻干燥，得到固体物质并将其溶于1~2mol/L盐酸溶液中，室温放置过夜；

（6）将步骤（5）放置过夜的试液冷冻干燥，得到固体物质并以1:0.5~10重量比溶于甲醇或乙醚中，在0~10℃下放置，析出白色固形物，过滤，经冷冻干燥后所得的白色固体物质即为果糖赖氨酸；

所述的葡萄糖检测试剂的配方：缓冲液0.01~1mol/L，pH5~8.5，葡萄糖氧化酶1~16KU/L，过氧化氢的显色系统；过氧化氢的显色系统包括：过氧化物酶0.5~10KU/L，色原0.2~10mmol/L和成色剂0.2~10mmol/L；

所述的底物检测试剂的配方：缓冲液20~200mmol/L，pH5~8.5果糖赖氨酸氧化酶0.3~10KU/L，过氧化氢的显色系统，过氧化氢的显色系统包括：过氧化物酶0.5~10KU/L，色原0.2~10mmol/L和成色剂0.2~10mmol/L;

所述的色原为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐,N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐中的一种;所述的成色剂为4-氨基安替比林，3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物中的一种；

所述的吡啶乙酸盐为4-吡啶乙酸盐、2-吡啶乙酸盐或3-吡啶乙酸盐；所述的吡啶甲酸盐为4-吡啶甲酸盐、2-吡啶甲酸盐或3-吡啶甲酸盐。

2.根据权利要求1所述的果糖赖氨酸的制备方法，其特征在于：所述的赖氨酸α-NH₂衍生物为Nα-苄氧羰基-L-赖氨酸，Nα-叔丁氧羰基-L-赖氨酸，Nα-芴甲氧羰基-L-赖氨酸，Nα-马尿酰基-L-赖氨酸，Nα-甲酰基-L-赖氨酸中的一种。

3.根据权利要求1所述的果糖赖氨酸的制备方法，其特征在于：所述的醇溶液为无水甲醇溶液或无水乙醇溶液。

4.根据权利要求1所述的果糖赖氨酸的制备方法，其特征在于：所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液，乙酸-乙酸钠缓冲液，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，甘氨酸-盐酸缓冲液中的一种。

5.根据权利要求4所述的果糖赖氨酸的制备方法，其特征在于：所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。