KR101969719B1 - 리시닐-프럭토오즈(Lysinyl-Fructose, LF)를 포함하는 혈당상승 억제제 및 그 제조방법 - Google Patents

리시닐-프럭토오즈(Lysinyl-Fructose, LF)를 포함하는 혈당상승 억제제 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Lysinyl-Fructose (LF)를 제조하는 방법과 상기 방법으로 제조된 LF의 Rat intestinal α-glucosidase, Porcine pancreatic α-amylase, Rat intestinal sucrase, Rat intestinal maltase, Rat intestinal glucoamylase에 대한 in vitro 저해활성 및 starch와 sucrose의 분해에 관한 in vivo 저해활성에 관한 것이며, 이러한 결과로 볼 때, 상기 방법으로 제조된 LF는 당뇨병의 예방, 치료 및 당뇨병성 합병증을 예방하는 목적으로 사용될 수 있다.

Description

리시닐-프럭토오즈(Lysinyl-Fructose, LF)를 포함하는 혈당상승 억제제 및 그 제조방법{An inhibitor of hyperglycemia containing Lysinyl-Fructose(LF) and a method manufacturing the same}
본 발명은 리시닐-프럭토오즈(Lysinyl-Fructose, LF)의 식후 혈당상승 억제 효능에 관한 것으로서, 리시닐-프럭토오즈를 유효성분으로 포함하는 혈당상승 억제제 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근 미국당뇨병협회(American Diabetes Association, ADA)에 따르면, 인체의 공복 혈당이 126mg/dL 이상이거나 또는 식사 후 2시간이 지난 혈당이 200mg/dL일 때 이를 당뇨병이라고 정의하고 있다.
혈당조절은 당뇨병의 예방 및 치료관리에서 가장 중요한 인자이고, 당뇨병의 합병증 유발 가능성을 결정할 수 있는 가장 중요한 인자로 알려져 있다. 혈당은 공복 혈당, 식후 혈당, 당화혈 색소가 동시에 조절되어야 한다. 특히 식후 혈당은 당뇨병성 혈관 합병증을 유발하는 주된 병리기전이고, 혈당조절이 양호한 정상군이나 당뇨병의 유병기간이 길지 않은 환자에게서 식후 혈당 조절은 당뇨병의 발병이나 당뇨 합병증을 예방하기 위해 매우 중요한 요인이 되고 있다).
식후 고혈당은 LDL 산화과정을 촉진하고, 내피세포에서 NO 생산과 이용을 감소시킬 뿐 아니라 FMD를 억제하며, 내피세포와 백혈구의 상호작용을 활성화시키고 내피세포에서 다양한 염증유발 및 산화 스트레스를 증가시켜 내피세포 기능을 감소시킨다. 내피세포 기능장애는 심혈관질환 발생의 첫 단계이자, 가장 초기에 발견될 수 있는 표지자로 알려져 있으므로, 식후 고혈당은 산화스트레스 유발 및 내피세포기능장애에 기여하여 혈관합병증을 유발할 수 있다.
이와 관련하여 한국등록특허 제10-0996985호는 κ-카제인을 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 GLP-1 분비 촉진제 및 식후 혈당값 상승 억제제, 및 젖 유래의 카제인 단백질을 함유하고, 해당 젖 유래의 카제인 단백질의 60질량% 이상이 κ-카제인인 것을 특징으로 하는 GLP-1 분비 촉진용 음식품 및 식후 혈당값 상승 억제용 음식품을 개시하고 있다.
또한 한국등록특허 제10-0966613호는 혈당상승억제 효능을 갖는 아르기닌 유도체 화합물을 개시하고 있고, 한국등록특허 제10-1155079호는 녹차추출물로부터 분리된 카테킨 칼레이트를 이용한 식후 혈당상승과 비만을 억제하는 조성물을 개시하고 있으며, 한국등록특허 제10-0924478호는 약학적으로 허용되는 음이온 교환 수지인 콜레스티미드를 이용한 식후 과혈당 개선제를 개시하고 있다.
이러한 연구결과에서 알 수 있듯이, 당뇨의 발병 또는 당뇨병 환자에게서 식후 고혈당 조절이 매우 중요하고, 식후 고혈당을 조절할 수 있는 치료약제들이 적절히 투여된다면 당뇨병 또는 당뇨병성 합병증 예방에 도움이 될 수 있을 것이다.
한국등록특허 제10-0996985호 한국등록특허 제10-0966613호 한국등록특허 제10-1155079호 한국등록특허 제10-0924478호
본 발명은 당뇨병을 유발할 수 있는 식후 혈당조절이나 당뇨병 환자의 혈당조절 또는 혈관합병증을 예방 또는 감소시킬 수 있는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 포도당과 리신을 반응시켜 리시닐-프럭토오즈(Lysinyl-Fructose, LF)를 제조하는 단계를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 리시닐-프럭토오즈의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제조방법은 상기 제조된 리시닐-프럭토오즈를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 리시닐-프럭토오즈를 정제하는 단계는 1) 컬럼에 레진을 충전하는 단계; 2) 상기 리시닐-프럭토오즈를 상기 컬럼에 로딩하는 단계; 및 3) 상기 리시닐-프럭토오즈가 로딩된 컬럼에 NH4OH를 이용하여 농도별 용출분획을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제조방법은 상기 단계 3)에서 수득한 용출분획을 단계 1)의 컬럼에 로딩하는 단계; 및 상기 용출분획이 로딩된 컬럼에 NH4OH를 이용하여 농도별 재용출분획을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제조방법은 상기 재용출분획을 Thin Layer Chromatography(TLC)로 확인하여 활성분획을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 리시닐-프럭토오즈(Lysinyl- Fructose, LF)를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 리시닐-프럭토오즈는 상기 제조방법으로 제조되는 것을 특징으로 한다.
아울러 본 발명은 리시닐-프럭토오즈(Lysinyl- Fructose, LF)를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 합병증 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 리시닐-프럭토오즈는 상기 제조방법으로 제조되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 무수포도당과 리신을 반응시키고 레진이 충전된 컬럼을 이용하여 정제함으로써 당뇨병 예방 또는 치료용 LF의 제조방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 당뇨병의 예방, 당뇨병 환자의 혈당조절 또는 혈관합병증을 예방하거나 치료할 수 있는 LF를 포함하는 약학 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 합성한 LF 의 Thin Layer Chromatography(TLC) 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 1차 정제한 LF의 TLC 확인결과를 나타낸 것이다.
도 3은 2차 정제한 LF의 TLC 확인결과를 나타낸 것이다.
도 4는 정제한 LF를 High-performance liquid chromatography(HPLC) 분석법으로 분석한 크로마토그램 및 이로부터 직선성, 검출한계, 정량한계를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 정제한 LF를 High-performance liquid chromatography(HPLC)분석으로 검출한 데이터이다.
도 6은 LF의 농도에 따른 α-glucosidase Inhibitory activity를 측정한 결과이다.
도 7은 LF의 농도에 따른 α-amylase Inhibitory activity를 측정한 결과이다.
도 8은 LF의 농도에 따른 sucrase Inhibitory activity를 측정한 결과이다. 도 9는 LF의 농도에 따른 maltase Inhibitory activity를 측정한 결과이다. 도 10은 LF의 농도에 따른 glucoamylase Inhibitory activity를 측정한 결과이다.
도 11은 LF의 in vitro 테스트에 대한 IC50 (mM)을 측정한 결과이다.
도 12는 LF의 농도에 따른 항산화 활성을 측정한 결과이다.
도 13은 LF의 sucrose에 대한 혈당조절 작용에 대한 in vivo 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 LF의 starch에 대한 혈당조절 작용에 대한 in vivo 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 in vivo test 결과에 따른 PD parameter를 나타낸 것이다.
도 16은 MicroQ-TOF III mass spectrometer를 이용하여 분석한 LF의 질량분석 결과를 나타낸 것이다.
이하 실시예를 바탕으로 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명에 사용된 용어, 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고 통상의 기술자의 이해를 돕기 위하여 예시된 것에 불과할 뿐이며, 본 발명의 권리범위 등이 이에 한정되어 해석되어서는 안 된다.
본 발명에 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 다른 정의가 없다면 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 나타낸다.
본 발명은 무수포도당과 리신을 반응시켜 LF를 합성한 후, 레진을 충진한 컬럼을 이용하여 정제하는 것을 기술적 특징으로 한다. 상기 레진으로는 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 셀룰로오스, 덱스트란, 아가로오스 등이 제한 없이 사용될 수 있다.
리시닐-프럭토오즈(Lysinyl- Fructose, LF)의 구조는 아래의 화학식 1과 같다.
[화학식 1]
Figure 112017063995813-pat00001
합성한 LF 및 정제된 LF는 Thin Layer Chromatography(TLC) 분석으로 분획한 후 Phenol-sulfuric acid와 Ninhydrin 발색약으로 발색한 후 활성 분획을 얻는 단계로 정제하였다.
최종 얻어진 활성 분획으로부터 HPLC 분석을 통해 LF를 검출하였고, MicroQ-TOF III mass spectrometer를 이용하여 분자량 309.17Da(m/z, M+H)인 LF를 동정하였다.
본 발명의 LF는 Rat intestinal α-glucosidase, Porcine pancreatic α-amylase, Rat intestinal sucrase, Rat intestinal maltase, Rat intestinal glucoamylase에 대한 in vitro 저해활성을 갖는 것을 확인하였다.
본 발명의 LF는 starch와 sucrose의 분해에 관한 in vivo 저해활성을 갖는 것을 확인하였다.
본 발명은 LF를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 분획물과 결합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 LF를 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 실시를 위하여 예시된 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 리시닐-프럭토오즈(Lysinyl- Fructose, LF)의 제조
LF의 합성
무수포도당 0.15M을 메탄올 200ml에 넣고 미열을 가하여 녹였다. 다 녹은 무수포도당 용액에 라이신 0.04M을 넣고 환류장치를 이용하여 65℃에서 4시간동안 반응시켰다.
도 1은 합성한 LF의 TLC 분석 결과에 관한 것으로 왼쪽 TLC plate는 Phenol-Sulfuric acid reagent로 발색시킨 것이고, 오른쪽 TLC plate는 Ninhydrin reagent로 발색시킨 것이다. 두 개의 TLC plate를 확인 한 결과 동일한 Rf 값을 가진 spot을 확인하였다.
LF의 1차 정제
30cm 정도의 오픈 컬럼에 400 mesh resin을 충진하여 정제 컬럼을 제작하였다. 합성된 LF용액을 pH 3~4로 맞춘 다음 2ml을 제작된 컬럼에 넣고 로딩하였다. Wash 용액 100ml을 흘려준 후 0.1N, 0.5N, 1N NH4OH 용액을 50ml씩 순차적으로 흘려주면서 용출액을 받았고, 각 분획된 용출액은 회전진공농축기(rotary vacuum evaporator, EYELA)를 이용하여 10ml로 농축하였다. 각각의 분획은 TLC 분석법으로 확인한 결과 도 2에서와 같이 0.1N NH4OH 분획에서 LF를 확인하였다.
왼쪽 TLC plate는 Ninhydrin reagent로 발색시킨 것이고, 오른쪽 TLC plate는 Phenol-Sulfuric acid reagent로 발색시킨 것이다. 두 개의 TLC plate를 확인 한 결과 Ninhydrin reagent로 발색한 TLC plate는 NH4OH 0.1N, 0.5N, 1N에서 spot을 나타냈고, Phenol-Sulfuric acid reagent로 발색한 TLC plate는 NH4OH 0.1N에서 spot을 나타냈다. 확인 결과 NH4OH 0.1N에서 동일한 Rf 값을 가진 spot을 확인하였다.
LF의 2차 정제
TLC 분석법으로 확인된 LF 용출분획을 따로 모아 2ml로 농축하였다. 1차에서 사용한 오픈컬럼에 상기 농축된 용출분획을 넣고 로딩하고, wash 용액 100ml을 흘려준 후 0.01 N, 0.05N, 0.1N NH4OH 용액을 50ml씩 순차적으로 흘려주면서 용출액을 받았다. 받은 용액은 회전진공농축기(rotary vacuum evaporator, EYELA)를 이용하여 10ml로 농축한 다음 TLC 분석법을 활용하여 활성분획을 확인한 결과 도 3에서와 같이 0.05N NH4OH 분획에서 LF를 확인하였고, 확인된 분획의 용출액은 동결건조기(freeze dryer TD5070R, lishin Lab)를 이용하여 동결건조 후 실험에 사용하였다.
왼쪽 TLC plate는 Phenol-Sulfuric acid reagent로 발색시킨 것이고, 오른쪽 TLC plate는 Ninhydrin reagent로 발색시킨 것이다. 두 개의 TLC plate를 확인 한 결과 Ninhydrin reagent로 발색한 TLC plate는 NH4OH 0.05N에서 spot을 나타냈고, Phenol-Sulfuric acid reagent로 발색한 TLC plate는 NH4OH 0.05N에서 spot을 나타냈다. 확인 결과 NH4OH 0.05N에서 동일한 Rf 값을 가진 spot을 확인하였다.
실시예 2: 합성 및 정제과정에서 LF를 확인하기 위한 TLC 분석법
상기 실시예 1에서 LF를 포함하고 있는 용출액은 진공회전농축기를 이용하여 10 ml 가량으로 농축한 후, 1.5ml 튜브로 옮겨 speed-Vac을 이용하여 한 번 더 농축하였다. 농축된 LF를 TLC 용매를 사용하여 전개시킨 후 완전히 건조하였다. 건조된 TLC sheet은 Phenol-Sulfuric acid reagent, Ninhydrin reagent를 이용하여 발색시킨 다음 시약이 다 마른 후 TLC sheet에 열을 가하여 spot을 확인한다.
실시예 3: LF의 High-performance liquid chromatography(HPLC) 분석법
LF의 정량범위와 직선성을 나타내는 농도를 확인하기 위해 이온 크로마토그래피용 HPLC 장치(Dionex)에 시료를 주입하여 분석하였다. 도 4(a)는 농도별로 나타난 피크의 면적비로 검량선을 나타내었을 때 25~250 ug/ml의 농도에서 가장 높은 직선성을 나타내는 것을 도식화한 것이고, 도 4(b)는 HPLC 분석으로 검출된 LF의 피크를 나타내는 것이다. 도 5에는 실시예 1에서 최종 정제된 활성 분획을 HPLC로 분석한 것으로, 6.18~6.23 min대의 Lysinyl-Fructose (LF) peak을 검출하였으며, 순도는 약 85% 정도 되는 것을 확인하였다. 이온 크로마토그래피용 HPLC 장치의 분석 조건 및 설정은 아래 표 1과 같다.
Column Dionex Carbopac® PA10 4×250mm
Mobile Phase 360 mM NaOH
Column temp. 40℃
njection volumn 20 ㎕
Detector ECD
실시예 4: 쥐의 장내 알파-글루코시다아제(α-glucosidase)에 대한 in vitro 저해활성 분석
Rat intestinal acetone powder 300 ㎎에 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.9) 9 ml을 첨가하여 30초간 12회 ice water bath에서 sonication 후, 13,000 rpm, 4℃에서 30분간 원심 분리하였다. 원심분리 후 상층액을 회수하여 Rat intestinal α-glucosidase Inhibition assay에 사용하였다. Rat α-glucosidase solution 100 ㎕와 실시예 1에서 정제한 LF 시료 50 ㎕를 넣고 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 50 ㎕의 5 mM pNPG solution을 가하여 37℃에서 30분간 반응시킨다. 반응시간이 끝난 후, 405 nm에서 ELISA reader를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
LF의 α-glucosidase 저해활성을 측정해 본 결과, 도 6에서 나타낸 바와 같이 농도에 비례하여 α-glucosidase 저해활성이 높아지는 것을 볼 수 있었다. 20 mM에서 26.13 ± 2.09%, 40 mM에서 48.93 ± 1.27%, 60 mM에서 59.49 ± 1.06%의 α-glucosidase 저해활성을 나타냈다.
실시예 5: 돼지의 췌장유래의 알파-아밀라아제(α-amylase)에 대한 in vitro 저해활성 분석
0.02 M sodium phosphate buffer (pH 6.9)에 녹인 1 U 농도의 돼지 췌장유래의 α-amylase 용액 300 ㎕에 실시예 1에서 정제한 LF 시료 200 ㎕을 넣고 25℃에서 10 분간 incubation시켰다. 이 용액에 25℃에서 10 min pre-incubation시킨 1% starch 용액 500 ㎕를 첨가하여 25℃에서 10분간 반응시켰다. 30% Rochelle염에 녹인 1% DNS 용액을 1 ml 첨가하여 반응을 정지시킨 후 boiling water bath에서 5분간 처리한 다음 실온으로 식히고 10 ml distilled water를 첨가하였다. 알파-아밀라아제(α-amylase)에 의해서 기질로부터 분해된 당과 DNS 용액과의 반응액을 540 nm에서 ELISA reader를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
LF의 알파-아밀라아제(α-amylase) 저해활성을 측정해 본 결과, 도 7에서 나타낸 바와 같이 농도에 비례하여 알파-아밀라아제(α-amylase) 저해활성이 높아지는 것을 볼 수 있었다. 40 mM에서 13.11 ± 1.63%, 50 mM에서 29.48 ± 0.63%, 60 mM에서 59.07 ± 3.66%의 알파-아밀라아제(α-amylase) 저해활성을 나타냈다.
실시예 6: 쥐의 장내유래 glucose oxidase (Maltase, Sucrase, Glucoamylase) 활성 분석
효소는 rat 유래의 intestinal acetone powder (Sigma S9765)를 사용하였고 기질은 maltose, sucrose, starch (Junsei)를 사용하였다. Rat intestinal acetone powder 100 mg을 3 ml의 0.9% NaCl solution (Junsei)에 첨가한 후 30초간 12회 ice water bath에서 sonication하고 나서 10,000×g, 4℃에서 30분간 원심 분리하였다. 분리된 상층액은 바로 실험에 사용하였다. 96 clear plate에 100 ㎕의 rat α-glucosidase solution과 실시예 1에서 정제한 LF 시료 50 ㎕를 넣은 다음 37℃ Incubator에서 10분간 반응시켰다. 각각의 실험 방법에 따라 50 ㎕의 100mM maltose, 200mM sucrose, 또는 1% starch solution을 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰다. 30분간 반응 사이에 Glucose oxidase/peroxidase reagent (Sigma G3660) 와 O-Dianisidine reagnt (Sigma D2679) 섞은 용액 1 ml을 2 ml Epp Tube에 넣은 후 37℃ Incubator에서 5분간 방치하여 온도를 37℃ 로 맞춘 후 앞서 30분 동안 반응한 혼합시료 200 ㎕을 취하여 1mL Glucose oxidase/peroxidase reagent 와 O-Dianisidine reagnt 용액과 반응시킨 후 37℃ Incubator 에서 10분간 반응시켰다. 반응이 끝난 tube에 12N 황산 1 ml을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 96 clear plate에 200 ㎕씩 옮겨 ELISA reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여, maltase, sucrase, glucoamylase에 대한 저해활성을 각각 계산하였다.
LF의 sucrase 저해활성을 측정해 본 결과, 도 8에서 나타낸 바와 같이 농도에 비례하여 sucrase Inhibitory activity가 높아지는 것을 볼 수 있었다. 10 mM에서 31.26 ± 3.82%, 20 mM에서 52.97 ± 2.22%, 30 mM에서 69.89 ± 0.93%의 sucrase 저해활성을 나타냈다. 도 9는 LF의 maltase 저해활성을 나타낸 것으로, 농도에 비례하여 maltase Inhibitory activity가 높아지는 것을 볼 수 있었다. 75 mM에서 32.39 ± 1.48%, 100 mM에서 50.03 ± 2.66%, 125 mM에서 63.34 ± 2.53%의 maltase 저해활성을 나타냈다. 또한 도 10은 LF의 glucoamylase 저해활성을 측정한 결과를 나타낸 것으로, 농도에 비례하여 glucoamylase 저해활성이 높아지는 것을 볼 수 있었다. 30 mM에서 43.05 ± 0.57%, 50 mM 에서 53.05 ± 1.01%, 70 mM에서 73.26 ± 0.78%의 glucoamylase 저해활성을 나타냈다.
In vitro assay 실험 결과는 도 11에 나타내었다. LF의 in vitro assay 중 sucrase가 19.29 mM로 가장 낮은 IC50 값은 나타냈으며, maltase 가 102.288 mM로 가장 높은 IC50 값은 나타냈다. α-Glucosidase 와 α-Amylase 는 각각 46.172 mM과 57.012 mM을 나타냈다.
실시예 7: Oxygen radical absorbance capacity (ORACROO · assay) 분석법을 이용한 LF의 in vitro 항산화 효능분석
80 nM fluorescein solution (60 ml)은 fluorescein 0.0064 g을 30 ml acetone과 30 ml 증류수로 녹인 뒤, 75mM potassium phosphate buffer(pH 7.4)를 이용하여 4000배 희석하여 실험 에 사용하였다. 80 mM AAPH는 0.1085 g을 75mM potassium phosphate buffer(pH 7.4) 5ml에 녹인 후 실험 에 사용하였다.
80 nM fluorescein solution 100 ㎕와 실시예 1에서 정제한 LF 50 ㎕, 50 ㎕ AAPH를 함께 넣고 시간별 fluorescence변화를 측정하였다.
ORACROO assay를 이용하여 Lysinyl-Fructose (LF)의 항산화 활성을 측정해 본 결과는 도 12와 같다. Vitamin E 유도체인 Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-teteamethylchroman-2-carbonyl acid) 1 μM에 의해 나타난 area curve와 LF의 area curve의 면적 값을 비교하여 계산하였다. LF 1, 10, 100 μM 농도에서 비교한 결과 Trolox 대비 낮은 peroxyl radical 소거활성을 나타내었다.
실시예 8: LF의 sucrose 및 starch에 대한 식후 혈당조절 작용에 대한 in vivo 평가
생후 4주령의 SD rat을 라온바이오로부터 구입하여 동물 사육실에서 사육 후, 생후 6 주령 때 건강한 동물만을 선별 후 실험에 사용하였다. 실험동물을 실험 전 20시간 이상 절식시킨 후, 2 g/kg body weight의 sucrose 처리구는 LF를 0.1 g/kg, 0.5 g/kg의 농도로 첨가하고, starch 처리구는 LF를 0.5 g/kg의 농도로 실험에 사용하였다. 경구 투여용 존대를 이용하여 경구 투여 하였으며, 투여군은 sucrose는 4군, starch는 3군으로 각 군당 8마리씩 사용하였다. 경구 투여 후 0.5, 1, 2, 3시간에 rat의 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 정맥혈의 혈당 농도 변화를 혈당계(Caresens Ⅱ)로 측정하였다.
SD rat을 이용한 sucrose loading test를 실시해 본 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 LF의 농도가 증가함에 따라 투여 후 30 분 후의 혈당치가 감소하는 것을 볼 수 있었다. LF 0.5 g/kg의 농도에서 sucrose만 투여한 control group과 비교하였을 때 P<0.01의 유의적인 차이를 보였다.
Starch loading test를 실시해 본 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이 LF를 처리한 경우 식후 30분 후의 혈당치가 감소하는 것을 볼 수 있었다. Lysinyl-Fructose (LF) 0.5 g/kg의 농도에서 starch 만 투여한 control group과 비교 하였을 때 P<0.001 의 유의적인 차이를 보였다.
도 15는 in vivo test 결과에 따른 PD parameter를 평가한 것으로, LF를 투여 후 control 및 투여군의 C max, T max 및 AUCt 세 가지 PD parameter를 계산해 본 결과, sucrose에서는 0.5 g/kg 농도의 LF를 투여하였을 때, C max 와 AUCt 값이 sucrose만 투여한 군과 유의적인 차이를 보였으나, 0.1 g/kg의 농도에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다. T max 는 각 군에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다. Starch를 투여하였을 때에는, 0.5 g/kg 농도에서 C max 와 AUCt 값 모두 starch만 투여한 군과 유의적인 차이를 보였다. T max 는 각 군에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
이러한 결과로 보아 Lysinyl-Fructose (LF)가 상당한 혈당상승억제 효능을 가지고 있으므로, 식후 혈당 조절로 인한 당뇨병의 예방, 치료 또는 당뇨병성 합병증을 예방하는 효능을 갖는다는 것을 알 수 있다.
실시예 9: 질량분석기를 이용한 LF의 동정
실시예 1의 LF를 동정하기 위하여 다음의 조건으로 MS 분석을 수행하였다.
MS 기기 : MicroQ-TOF III mass spectrometer(Bruker Daltonics, 255748 Germany )
Mode : ESI positive
MS parameter
a. Source - On Volt: 800V, Dry Gas: 3 L/min, Dry Tem: 120℃
b. Transfer - Funnel 1RF: 400Vpp, Funnel 2RF: 400Vpp, ISCID energy: 0eV, Hexapole RF: 250Vpp
c. Quadruple - Ion Energy : 5.0eV, Low Mass : 300m/z
d. Collision Cell - Collision Energy : 7ev, Collision RF : 600, Transfer Time : 75us, Pre Puls Storage : 8us
Scan range : m/z 50-2000
Rolling Average spectra Rate : 2 X 1.0 Hz
Source Temperature : 120°c
Lysinyl-Fructose (LF)의 monoisotopic mass는 308.17Da이며, M+H분자량은 309.17Da의 이론적 질량값을 가진다. 실시예 1에서 합성 및 정제된 LF는 MicroQ-TOF III mass spectrometer (Bruker Daltonics, 255748 Germany)를 이용하여 분자량을 확인한 결과 도 16에서와 같이 측정된 질량값이 이론적 LF의 분자량 309.17Da과 일치하였고, 309.17Da 의 fragment 패턴을 확인 할 수 있었다.

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 리시닐-프럭토오즈(Lysinyl- Fructose, LF)를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서,
    상기 리시닐-프럭토오즈는
    포도당과 리신을 반응시켜 리시닐-프럭토오즈(Lysinyl-Fructose, LF)를 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 리시닐-프럭토오즈를 정제하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되며,
    상기 리시닐-프럭토오즈를 정제하는 단계는
    1) 컬럼에 레진을 충전하는 단계;
    2) 상기 리시닐-프럭토오즈를 상기 컬럼에 로딩하는 단계;
    3) 상기 리시닐-프럭토오즈가 로딩된 컬럼으로부터 용출분획을 수득하는 단계;
    4) 상기 단계 3)에서 수득한 용출분획을 단계 1)의 컬럼에 로딩하는 단계;
    5) 상기 용출분획이 로딩된 컬럼으로부터 재용출분획을 수득하는 단계; 및
    6) 상기 재용출분획을 Thin Layer Chromatography(TLC)로 확인하여 활성분획을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 리시닐-프럭토오즈(Lysinyl- Fructose, LF)를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 합병증 예방을 위한 약학 조성물에 있어서,
    상기 리시닐-프럭토오즈는
    포도당과 리신을 반응시켜 리시닐-프럭토오즈(Lysinyl-Fructose, LF)를 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 리시닐-프럭토오즈를 정제하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되며,
    상기 리시닐-프럭토오즈를 정제하는 단계는
    1) 컬럼에 레진을 충전하는 단계;
    2) 상기 리시닐-프럭토오즈를 상기 컬럼에 로딩하는 단계;
    3) 상기 리시닐-프럭토오즈가 로딩된 컬럼으로부터 용출분획을 수득하는 단계;
    4) 상기 단계 3)에서 수득한 용출분획을 단계 1)의 컬럼에 로딩하는 단계;
    5) 상기 용출분획이 로딩된 컬럼으로부터 재용출분획을 수득하는 단계; 및
    6) 상기 재용출분획을 Thin Layer Chromatography(TLC)로 확인하여 활성분획을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 합병증 예방을 위한 약학 조성물.
  9. 삭제
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