KR102673921B1

KR102673921B1 - p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 간 관련 질환의 개선 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102673921B1
Application number: KR1020220099096A
Authority: KR
Inventors: 강인혜; 트롱티마이티엔; 서석희; 호띠렌
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2022-08-09
Publication date: 2024-06-11
Also published as: KR20230103907A

Abstract

본 발명의 목적은 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간 관련 질환의 개선 및 치료용 조성물을 제공하는 것으로써, p-쿠마르산(PCA)이 간 염증 또는 간 섬유증 치료를 확인 위해, 고지방 및 고자당(HFHS) 식이한 마우스 모델에 본 발명의 p-쿠마르산 처리하였다. 그 결과, 1) 총 콜레스테롤(Total Cholesterol) 감소 및 유리 콜레스테롤(free cholesterol) 축적을 억제하고, 포도당 내성 및 인슐린 민감성을 높이며, 2) 간 조직 염증성 유전자 및 단백질을 억제시키고, 3) 섬유증 관련 유전자 또는 단백질을 억제시키는 효과를 확인하였다. 또한, NLRP3 활성화 및 caspase-1 절단을 하향 조절하는 p-쿠마르산(PCA)의 역할을 최초 규명하여, 간 섬유증 및 간 염증과 관련된 치료에 효과적인 바, 관련된 사업의 유용하게 사용될 수 있다.

Description

p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 간 관련 질환의 개선 및 치료용 조성물{A composition for improving and treating liver-related diseases comprising p-kumaric acid as an active ingredient}

본 발명의 목적은 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 간 관련 질환의 개선 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

세계적으로 가장 흔한 간 질환인 비알코올성 지방간 질환(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 알코올 과부하로 인한 것이 아닌 간세포에 비정상적인 지방 축적이 특징으로써, NAFLD 환자의 약 20%는 만성 염증과 세포 손상을 동반하는 진행성 스테아토증인 비알코올성 지방간염(NASH)이 발병할 수 있다. 또한, NASH를 가진 개인 중 약 9-25%는 간경변이나 간종 세포암으로 발전할 수 있는 섬유증이 발병될 수 있다. 간세포(HSC)는 간섬유화 과정에서 우세한 효소로 활성화 시 근섬유아세포로 변화한다. HSC는 정상 간에서 비확산적이고 정지된 표현형을 유지하는 반면, HSC는 고지방 및 수크로스 식단의 만성 노출과 같은 간 손상에 대응하여 증식성, 이동성, 섬유성 표현형으로 전환된다. 간섬유화의 진행을 막기 위해서는 HSC 활성화 관리를 위한 효과적인 치료치가 시급하다.

NOD 유사 수용체 단백질 3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)은 병원체 관련 분자 패턴(PAMP) 또는 내인성 손상 관련 분자 패턴(DAMP)을 감지하고 염증 반응을 조절하기 위해 절단된 카스파아제-1(caspase-1)로 활성화하는 다중 단백질 복합체이다. NLRP3 염증은 두 가지 신호를 통해 활성화된다. 프라이밍 신호(신호 1)는 지질다당류(LPS)와 같은 미생물/바이러스 자극에 의해 발생하며, NF-γB의 활성화와 프로인테루킨(IL)-1γ 수준의 조절을 유도한다. 활성화 신호(신호 2)는 포화지방산, 활성산소종(ROS) 또는 콜레스테롤 결정과 같은 내인성 위험 신호에 의해 제공되어 NLRP3의 올리고머화와 인플라마좀(inflammasome)의 조립으로 이어지며, NLRP3 염증이 HSC 활성화 및 간 섬유화에 직접 관여한다는 것을 시사한다. 염증 자극 HSC는 섬유화 특징을 보였으나, NLRP3-/-HSC는 나타나지 않았다. 반면, 과활동성 NLRP3인 HSC 특이적 NLRP3L351PneoR 유전자 삽입한 마우스에서는 NLRP3 인플라마좀(inflammasome) 활성화가 간에서 α 평활근(α-SMA) 양성 세포의 수를 현저하게 증가시킨다. 이러한 결과는 NLRP3 염증이 HSC 활성화를 통해 간섬유화와 밀접하게 연관되어 있음을 시사한다. 그러나 부작용이 낮거나 전혀 없는 어떤 종류의 생체활성 성분이 NLRP3 인플라마좀(inflammasome)의 조절을 통해 간섬유증을 약화시키는지 여전히 불분명하다.

또한, 포화지방과 콜레스테롤을 포함한 만성적인 식사 과부하로 인해 카일로미크론의 과도한 유입과 염증 매개 지방분해를 유발하여 순환성 유리 지방산과 지방독성을 증가시키며, 고지방 식이(high-fat, HF) 식이요법과 함께, 증가된 설탕 섭취는 지방원성 전사인자를 통해 NAFLD의 발병 위험을 증가시키는 것으로 보고되었으며, 이는 간염과 섬유증의 발병과 관련있다.

p-쿠마르산(PCA, 4-hydroxycinnamic acid)은 식물, 땅콩, 버섯에서 자유 또는 결합 공액 형태로 발견되는 하이드록시신남산의 이성질체(m-, o-, p-쿠마르산) 중 하나이다. 이전 보고서에서는 땅콩 새싹이 고지방 식단 유도 비만을 억제하고 LPS 유도 염증에 대한 지방세포 갈변 손실을 역전시켰다는 것을 보여주었다. p-쿠마르산(PCA)이 PS의 대사 이점을 발휘하는 가장 책임감 있는 폴리페놀이라는 것을 확인했다. 최근의 연구 결과에 따르면 p-쿠마르산(PCA)은 항산화제와 항암제를 포함한 다양한 약리학적 활동을 한다. p-쿠마르산(PCA)의 많은 건강 증진 효과 중, 항염증 작용은 1) 유리 지방산에 의해 활성화되는 패턴 인식 수용체 및 2) 핵인자-KB(NF-γB)의 다운스트림 표적을 억제함으로써 보고된다.

이에 본 발명자들은 TLR4/NF-γB 시그널링이 NLRP3 염증 활성화의 핵심 프라이밍 단계 중 하나라는 점을 고려할 때, p-쿠마르산(PCA)이 HFHS(High fat and high sucrose) 식이 대해 NLRP3 염증 및 추가 간 섬유화를 효과적으로 완화시킬 것이라고 파악하였다. 이를 입증하기 위해, 간 섬유증의 생체 내(HFHS 식이한 C57BL/6 마우스) 및 체외(TGF-β-처리 HSC LX-2 세포) 모델에 본 발명의 유효성분인 p-쿠마르산(PCA)을 투여한 결과, 부분적으로 NLRP3 염증 조절을 통해 간 염증 및 섬유화 발병을 효과적으로 감소시키는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는 간 섬유증의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는 간 섬유증의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는 간 염증의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는 간 염증의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는 간 섬유증의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는 간 섬유증의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는 간 염증의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는 간 염증의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

p-쿠마르산(PCA)이 간 염증 또는 간 섬유증 치료를 확인 위해, 고지방 및 고자당(HFHS) 식이한 마우스 모델에 본 발명의 p-쿠마르산 처리하였다. 그 결과, 1) 총 콜레스테롤(Total Cholesterol) 감소 및 유리 콜레스테롤(free cholesterol) 축적을 억제하고, 포도당 내성 및 인슐린 민감성을 높이며, 2) 간 조직 염증성 유전자 및 단백질을 억제시키고, 3) 섬유증 관련 유전자 또는 단백질을 억제시키는 효과를 확인하였다. 또한, NLRP3 활성화 및 caspase-1 절단을 하향 조절하는 p-쿠마르산(PCA)의 역할을 최초 규명하여, 간 섬유증 및 간 염증과 관련된 치료에 효과적인 바, 관련된 사업의 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 P-쿠마르산(PCA)의 화학적 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 LF군,HFHS군 및 HFHS+PCA군의 무게 변화량을 나타낸 도이다.
(LF군:LF(low-fat) diet, 저지방 식단을 식이한 쥐, HF군:HF(high-fat diet, 고지방 식단을 식이한 쥐, HFHS군:HFHS(high fat and high sucrose, 20% sucrose)고자당 음료를 식이한 쥐, HFHS+PCA군:HFHS(high fat and high sucrose)고자당 음료+PCA(p-coumaric acid, PCA), 50 mg/kg를 복강내 주사한 쥐)
도 3은 LF군, HFHS군 HFHS+PCA군의 공복 포도당을 나타낸 도이다.
도 4는 HFHS군 및 HFHS+PCA군의 간 공복 인슐린 수치를 나타낸 도이다.
도 5는 HFHS군 및 HFHS+PCA군의 인슐린 저항성 지표(HOMA-IR)를 나타낸 도이다.
도 6은 LF군, HFHS군 및 HFHS+PCA군의 포도당부하검사(Glucose tolerance test, GTT)에서 글루코스(glucise) 수치를 나타낸 도이다.
도 7은 LF군, HFHS군 및 HFHS+PCA군의 포도당부하검사(Glucose tolerance test, GTT) 중 AUG(Area Under Curve)를 수치로 나타낸 도이다.
도 8은 LF군, HFHS군 및 HFHS+PCA군의 인슐린내성시험(Insulin tolerance test)에서 글로코스 수치를 나타낸 도이다.
도 9는 LF군, HFHS군 및 HFHS+PCA군의 포도당 처리 비율(Glucose disposal rate)를 나타낸 도이다.
도 10은 LF군, HFHS군 및 HFHS+PCA군의 혈청의 아스파르트산 트랜스아미나아제(aspartate transaminase, AST) 수치를 나타낸 도이다.
도 11은 LF군, HFHS군 및 HFHS+PCA군의 혈청의 알라닌 트랜스아미나아제(alanine transaminase, ALT) 수치를 나타낸 도이다.
도 12는 HFHS군 및 HFHS+PCA군의 간 조직의 Tlr2(toll like receptor 2) 및 Tlr4(toll like receptor 4)의 mRNA 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 13은 HFHS군 및 HFHS+PCA군의 NF kappa B alpha (IkBα)를 억제를 나타낸 도이다.
도 14는 LF군, HFHS군 및 HFHS+PCA둔의 간 조직에서 염증성 유전자(Cox2, Cd11c, Il-1β, Tnfα, Mcp1)의 mRNA 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 15는 HFHS군 및 HFHS+PCA군의 간 조직에서 p-JNK, p-ERK, BiP, CHOP의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 16은 HFHS군 및 HFHS+PCA군의 간장 말론디알데히드(Hepatic malondialdehyde, MDA) 수치를 나타낸 도이다.
도 17은 LF군, HFHS근 및 HFHS+PCA군의 간 유리 콜레스테롤(Liver free cholesterol)을 나타낸 도이다.
도 18는 LF군, HFHS군 및 HFHS+PCA군의 혈장 내 IL-1β 수치를 나타낸 도이다.
도 19는 LF군, HFHS군 및 HFHS+PCA군의 간 조직을 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome)으로 염색한(20×Magnication) 도이다.
도 20은 LF군, HFHS군 및 HFHS+PCA군의 간 조직을 시리우스 레드염색(Sirius Red staining)으로 염색한(20×Magnication) 도이다.
도 21는 LF군, HFHS군 및 HFHS+PCA군의 간 조직에서 정량적 콜라겐 부피분율을 나타낸 도이다.
도 22는 LF군, HFHS군 및 HFHS+PCA군의 시리우스 레드염색(Sirius Red staining)의 정량적 콜라겐 면적을 나타낸 도이다.
도 23은 LF군, HFHS군 및 HFHS+PCA군의 간 조직에서 α-평활근액틴(αSMA)의 mRNA 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 24는 HFHS군 및 HFHS+PCA군의 간 조직에서 α-평활근액틴(αSMA)의 발현을 나타낸 도이다.
(β-actin은 loading control로 사용됨)
도 25는 HFHS군 및 HFHS+PCA군의 간 조직에서 염증을 일으키는 유전자인 Tgfβ, Col1a1, Col1a2, Col3a1, Col4a1 및 조직 억제제인 MMP 1(Timp1)의 mRNA 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 26은 LX-2 HSC에서 PCA와 함께 배양하였을 시, 인터루킨-6(Interleukin 6, Il-6), α-평활근액틴(α-Sma), Tgfβ, Col1a, Timp1의 mRNA 발현을 나타낸 도이다.
도 27은 IkBα, α-평활근액틴(α-Sma), Collagen I, 및 GAPDH 단백질 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 28은 IkBα, αSMA 및 콜라겐 I의 상대적 단백질 발현을 Image Lab에 의해 정량화하여 나타낸 도이다.
도 29는 지방다당류(LPS) 유도 골수유래 대식세포(BMDM)에 나이제리신(Ng)을 처리시, NLR Family Pyrin Domain Containing 3 (Nlrp3), Il-1β, 및 Il18 발현을 나타낸 도이다.
도 30은 지방다당류(LPS) 유도 골수유래 대식세포(BMDM)에 팔미테이트(PA) 를 처리시, NLR Family Pyrin Domain Containing 3 (Nlrp3), Il-1β, 및 Il18 발현을 나타낸 도이다.
도 31은 배양 배지에서 골수유래 대식세포 BMDMs에서 LPS로 염증유발한 뒤, Ng로 자극한뒤 Il-1β 분비를 측정한 도이다.
도 32는 Ng는 LPS-프라이밍된 BMDM에서 NLRP3 및 카스파제-1(Caspase-1)의 단백질 수준을 나타낸 도이다.
도 33은 배양 배지에서 골수유래 대식세포 BMDMs에서 LPS로 염증유발한 뒤, PA로 자극한뒤 Il-1β 분비를 측정한 도이다.
도 34는 PA는 LPS-프라이밍된 BMDM에서 NLRP3 및 카스파제-1(Caspase-1)의 단백질 수준을 나타낸 도이다.
도 35는 p-쿠마르산(PCA)이 간의 TLR4/NF-γB 관련 염증의 감쇠 및 활성화(신호 2)를 통해 NLRP3 프라이밍(신호 1)와 관련이 있음을 나타낸 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다, 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 (terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 사료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 간 섬유증 또는 간 염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하여 간 섬유증 또는 간 염증의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 조성물을 간 섬유증 또는 간 염증 발병 의심 개체에 투여하여 간 섬유증 또는 간 염증 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명은 p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는 간 섬유증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

일 실시예에서, 상기 조성물은 NLRP3 인플라마솜(NOD-like receptor protein 3 inflammasome)의 활성화를 억제하는 것일 수 있다.

상기 NLRP3 인플라마솜(NLRP3 inflammasome)의 활성화는 미토겐활성화단백질키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 시그널링, ROS 생성(ROS production) 및 미접힘 단백질 반응(unfolded protein response, UPR)와 관련된 것이다.

일 실시예에서, 상기 조성물은 총 콜레스테롤(Total Cholesterol) 감소 및 유리 콜레스테롤(free cholesterol) 축적을 억제 시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

일 실시예에서, 상기 조성물은 공복 포도당을 감소 시키며, 인슐린 저항성 지표(Homeostatic model assessment for insulin resistance, HOMA-IR)를 감소 시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

일 실시예에서, 상기 조성물은 포도당 내성 및 인슐린 민감성을 향상시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

일 실시예에서, 상기 조성물은 아스파르테이트 트랜스아미나제(aspartate transaminase, AST) 및 알라닌 트랜스아미나제(alanine transaminase, ALT)을 감소 시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

일 실시예에서, 기 조성물은 Tlr2(Toll like receptor 2) mRNA의 발현 및 Tlr4(Toll like receptor 4)의 mRNA 발현을 감소시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 Tlr4(Toll like receptor 4) mRNA의 발현의 감소는 IkBα(ihibitor of kappa B) 분해 억제시키는 것일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 조성물은 간 조직 염증 관련 유전자 발현을 감소시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 간 조직 염증성 관련 유전자는 Cox2, 인터그린 서브유닛 알파 x(integrin subunit alpha x, Cd11c), 인터루킨 1 베타(Interleukin 1 beta, Il-1β), Il-6을 포함한 NF-kB의 표적 유전자인 것이나, 이에 제한되지 않는다.

일 실시예에서, 상기 조성물은 간장 말론디알데히드(Hepatic malondialdehyde, MDA)를 감소 시켜, 소포체(ER) 스트레스를 감소시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

일 실시예에서, 상기 조성물은 α-SMA(α smooth muscle)의 유전자 및 단백질 발현을 감소시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

일 실시예에서, 상기 조성물은 상기 조성물은 섬유증 관련 유전자 또는 단백질을 감소 시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 섬유화 관련 유전자 또는 단백질은 전환성장인자(transforming growth factor beta, Tgfβ), 프로콜라겐 타입 I procollagen type I, a2 (Col1a2), 프로콜라겐 타입 III (procollagen type III, a1 (Col3a1)), 프로콜라겐 타입 IV (procollagen type IV, a1 (Col4a1)) 및 금속단백질가수분해효소-1 조직 억제제(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, Timp1), 카스파제-1(caspase-1)인 것일 수 있다.

상기 간 섬유증은 알코올성 간경변증, 비알코올성 간경변증, 윌슨병 관련 간경변증, 혈색소증 관련 간경변증, 문맥성 간경변증, 괴사후성 간경변증, 영양결핍과 관련된 간경변증 및 심장성 간경변증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상인 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 간 섬유증은 고지방 및 고자당 식이로 인해 발생된 것이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.

또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.

본 발명은 p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는 간 섬유증의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성 식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.

본 발명은 p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는 간 염증 관련 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는 간 염증 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

이하 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

실시예 1. 재료 및 방법

실시예 1-1. 실험 재료 및 시료 준비

모든 세포 배양 접시는 달리 명시되지 않는 한 SPL Life Sciences(서울, 한국)에서 구입했다. Dulbecco's Modified Eagle 's Medium (DMEM) 포도당, 태아 소 혈청 (FBS) 및 페니실린 / 스트렙토 마이신은 Gibco (Grand Island, NY, USA)에서 구입했다. 다른 모든 화학 물질 및 시약은 달리 명시되지 않는 한 씨그마알드리치코리아(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA)에서 구입했다.

p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)은 씨그마알드리치코리아(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에서 구입했다(도 1). 본 발명에서 새로 분취된 400 mg/mL PCA 스톡을 동물 실험에 사용하기 전에 인산완충식염수(PBS)로 희석하고 200mM PCA 스톡을 세포 배양을 위해 DMSO(디메틸 설폭사이드)로 희석했다.

실시예 1-2. 동물과 식단

모든 프로토콜과 절차는 제주대학교 동물병원 동물관리위원회(승인번호 2020-0015)의 승인을 받았다. C57BL/6J 생후 6주된 마우스는 ORIENT BIO 동물 센터(한국 성남시)에서 구입하여 제주대학교의 명암 주기로 사육하였다. p-쿠마르산(PCA)효능을 알아보기 위한 동물 실험을 준비하였으며, C57BL/6 마우스는 새 환경 적응을 위해 1주일 후 서로 다른 식단을 자유롭게 먹인 3개의 실험 그룹 중 하나에 무작위로 p-쿠마르산(PCA)을 투여하였다. 저지방 식단(지방에서 11% kcal, LF 그룹, n=6) , 또는 고지방 식이(지방에서 61% kcal, HF), 고자당 음료(20% 자당, HFHS 그룹, n=6) 또는 PCA 복강내(i.p.) 주사가 포함된 HFHS (HFHS+PCA 그룹, 50 mg /kg BW, n=6) 13주 동안 투여 하였다. AIN-93G식이 요법은 LF 대조군식이 요법으로 사용되었으며 이전에 설명한대로 HF식이 요법은 AIN-93G와 일반적인 HF군은 HF식이 (지방에서 60 % kcal)를 일부 변경했다(표 1). 체중은 13주차까지 매주 측정되었다. 음식섭취량과 음료섭취량은 실험 5주차부터 실험종료까지 주 3회 측정하였다.

Dietary composition of low-fat (LF) diet, high-fat (HF) diet
Ingredients	LF	HF
	g/kg	g/kg
Casein	200	200
L-Cysteine	3	3
Sucrose	0	69
Corn starch	600	0
Maltodextrin 10	50	125
Lard	10	245
Cholesterol	0	2
Soybean oil	39	39
Cellulose	50	50
Mineral mix	35	35
Calcium phosphate	4	4
Vitamin mix	10	10
Choline bitartrate	2	2
Total	1003	784

	kcal (%)	kcal (%)
Carbohydrate	67.8	19.4
Protein	20.9	19.5
Fat	11.3	61.1
The AIN-93G diet was modified

실시예 1-3. 혈청 생화학 매개변수 측정

실험 종료 후 실험동물은 12시간 동안 금식하고 이산화탄소 마취하여 희생시켰다. 심장에 천자하여 혈액을 수집하고 혈청 샘플을 채취하였다. 혈청 총 콜레스테롤(TC, mg/dL) 수치와 중성지방(TG, mg/dL) 수치는 효소 분석 키트(아산약품, 서울, 한국)를 사용하여 각각 550 nm 및 500 nm에서 흡광도에 대한 제조 프로토콜을 사용하여 반복적으로 분석했다. 혈청 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST, IU/L) 또는 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT, IU/L)는 (아산약품, 서울, 한국)프로토컬을 사용하여 505 nm 흡광도에서 수행하였다. 혈청 고밀도지단백(HDL, mg/dL) 콜레스테롤 및 저밀도지단백(LDL)/초저밀도지단백(VLDL) 콜레스테롤(LDL/VLDL, mg/dL)은 각각 EZ-HDL, LDL/ VLDL Assay Kit(Dogen Bio Co., Ltd., Seoul, Korea)의 프로토콜에따라 측정 되었다. 마우스 혈청의 정량적 인슐린은 제조사의 프로토콜(Crystal Chem, Elk Grove Village, IL 60007, USA)에 따라 초고감도 마우스 인슐린 ELISA 키트로 측정되었다. 혈장 IL-1β는 Mouse IL-1 beta/IL-1F2 quantikine ELISA Kit(MLB00C, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN 55413, USA)의 프로토콜에 따라 측정되었다.

실시예 1-4. 포도당 및 인슐린 내성 검사

포도당 내성 시험(GTT) 및 인슐린 내성 시험(ITT)의 위해, 마우스를 금식(12시간)하였고 10% D-포도당 용액(0.5g/kg BW) 또는 인슐린(0.75mU/kg BW)을 복강 내 주사하였다. 혈당 측정기는 주사 전과 주사 후 15분, 30분, 60분, 120분에 혈당 측정기(Midium Blood Glucose Analyzer, Kia Ace Co., Ltd., 경기도, 한국)를 사용하여 측정하였다. 인슐린 저항성(HOMA-IR)에 대한 항상성 모델 평가는 [(공복 혈장 포도당) x(공복 혈장 인슐린)]/22.5(mmol/L)로 측정되었다.

실시예 1-5. 조직 준비 및 간 섬유증 조직학적 검사

마우스를 부검시 지방 조직 및 간 조직을 수집하고 10% 완충 포르말린으로 플래시 고정하였다. 파라핀이 포함된 지방 조직을 5-7 μm 부분 절단하고 종래 기술에 따라[Seo SH, Int J Environ Res Public Health,. 2021;18] 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 처리했다. 앞서 설명한 바와 같이 밝은 영역 이미지는 10X 배율에서 Invitrogen Microscope(Invitrogen™ EVOS™ FL Digital Inverted Fluorescence Microscope, Invitrogen, CA, USA)을 이미지화 하였고, 부고환 지방 조직의 H&E 염색 섹션은 기존 문헌 [Seo SH, Int J Environ Res Public Health,. 2021;18] 프로토콜에 따라 크기 결정에 사용되었다.

또한, 지방 세포 크기는 Image J 소프트웨어(NIH, USA)에 의해 조사되었다. 마우스에서 간 조직을 절개하고 즉시 10% 완충 포르말린에 고정시켰다. 조직을 파라핀에 고정하고, 4μm 두께로 절편하고 콜라겐 섬유의 검출을 위해 Masson's trichrome 염색으로 염색했다. 슬라이드의 모든 이미징은 LEICA DM 2500 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 사용하였다. 간 섬유증을 반영하는 전체 조직 영역에 대해 파란색으로 염색된 콜라겐 침착은 MIPAR 소프트웨어(MIPARTM, Worthington, OH, USA)에 의해 백분율을 계산하였다. 파라핀 내장 간 조직도 Sirius red 염색으로 염색되었다. 이미지는 LEICA DM 2500 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 사용하여 20X 배율로 촬영하고 ImageJ 소프트웨어로 간 콜라겐을 정량화 하였다.

실시예 1-6. 간 지질 축적

총 간 지질은 메탄올/클로로포름(1:2 volume for volume [v/v])의 간 조직 200mg에서 추출되었다. 그 후, 샘플을 60 °C에서 3시간 동안 인큐베이션한 후 실온에서 밤새 인큐베이션했다. 다음날, 얻어진 추출물을 Whatman®여과지를 사용하여 여과하였다. 샘플을 클로로포름으로 여러 번 세척하고 혼합물을 실온에서 건조시켰다. 그 후, 얻어진 샘플을 탈이온수에 재현탁시켰다. 간내 TG 및 TC 함량을 측정하기 위해 TG 및 TC(Asan Pharmaceutical Co., Seoul, Korea)의 효소 분석 키트를 각각 550 nm 및 500 nm에서 흡광도로 사용하였다. 간 유리 콜레스테롤은 535 nm 여기에서 형광 및 587 nm 방출로 콜레스테롤 분석 키트(ab65390, Abcam, Cambridge, MA, USA)의 프로토콜에 따라 측정되었다.

실시예 1-7. 간 산화 스트레스 측정

간 산화 스트레스의 측정을 위해 말론디알데히드(MDA)는 지질 과산화의 가장 일반적인 결과 중 하나가 측정되었다. 간단히, 총 간 단백질은 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 RIPA 완충액에서 25mg의 간 조직으로부터 분리되었다. MDA 절차는 TBARS 분석 키트(Item No. 10009055, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)의 프로토콜을 따랐다.

실시예 1-8. 세포 배양 및 처리

LX-2 인간 간 성상 세포주는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. LX-2 세포를 2% FBS, DMEM(1000 mg/L D-글루코스, L-글루타민, 110 mg/L 소듐 피루브산, 100 units/mL 페니실린 및 100 g/mL 스트렙토마이신) 기본 배지에서 배양하였다. LX-2 세포를 35mm 배양 플레이트에 1.2 x 10⁶ 세포 cm^-2로 시딩하고 48시간 동안 1000X DMSO(비히클) 또는 200μM PCA와 함께 사전 인큐베이션하였다. 48시간 후, LX-2 세포는 200μM PCA가 포함되어 있거나 포함되어 있지 않은 DMEM에서 2시간 동안 결핍 시켜켰다. 그 후, 24시간 동안 200μM PCA의 포함되어 있거나 포함되지 않는 LX-2 세포에 24시간 동안 5ng/mL TGFβ로 자극하였다. 단백질, RNA 및 배지는 실험이 끝날 때 수집되었다.

1차 골수 세포를 C57BL/6 마우스의 대퇴골에서 분리하고 이전에 설명한 대로 L-세포 조건 배지(CM)에서 7-10일 동안 분화하도록 자극했다. 분화된 골수 유래 대식세포(BMDM)는 200 μM PCA 또는 운반체(1000X DMSO)로 24시간 동안 전처리한 후, 1시간 동안 리포다당류(LPS)(100 ng/ml)로 프라이밍하고 1 시간 nigericin(Ng; 6.5 μM, K+/H+ ionophore) 또는 12시간 or palmitate (PA; 400 μM complexed with BSA)으로 자극하였다.

실시예 1-9. Real-time Polymerase Chain Reaction(실시간 PCR)에 의한 mRNA 분석

실시간 PCR을 이용하여 유전자 발현 수준을 측정하였다. 냉동실에 급속 보관한 간 0.2g을 Trizol 시약(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 RNA 추출하였다. 나노드롭(Nano-200 Micro-Spectrophotometer, Hangzhou City, China)을 이용하여 추출된 RNA 농도를 측정한 후 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystem, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자 발현은 제주대학교 Bio-Health Materials Core-Facility에서 Real-Time PCR(CFX96™Real-Time PCR Detection System, Bio-Rad, USA)로 측정하였다. 모든 프라이머 서열은 하기 표 2에 표시하였다. 상대 유전자 발현은 표준화된 리보솜 단백질 측면 줄기 소단위 P0(RPLP0, 36B4), β액틴, 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH) 또는 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT)였습다(코스모 제네텍).

Primer sequences for real-time PCR
Gene	Forward	Reverse
mAcc	TGGACAGACTGATCGCAGAGAAAG	TGGAGAGCCCCACACACA
mCd11c	CTGGATAGCCTTTCTTCTGCTG	GCACACTGTGTCCGAACTC
mCol1a1	CAAGAACAGCAACGAGTACCG	GTCACTGGTCAACTCCAGCAC
mCol1a2	GTAACTTCGTGCCTAGCAACA	CCTTTGTCAGAATACTGAGCAGC
mCol3a1	CAGGTCCTAGAGGAAACAGA	TCACCTCCAACTCCAGCAATG
mCol4a1	CTGGCACAAAAGGGACGAG	ACGTGGCCGAGAATTTCACC
mCox2	AAAGGTTCTTCTACGGAGAGAGTTCA	TGGGCAAAGAATGCAAACATC
mDgat2	CCGCAAAGGCTTTGTGAAG	GGAATAAGTGGGAACCAGATCA
mIL-18	GACAGCCTGTGTTCGAGGAT	TGGATCCATTTCCTCAAAGG
mIL-1β	AAATACCTGTGGCCTTGGGC	CTTGGGATCCACACTCTCCAG
mLpl	CATCTCATTCCTGGATTAGCAGAC	CCGATACAACCAGTCTACTACAATG
mMcp1	AGGTCCCTGTCATGCTTCTG	GCTGCTGGTGATCCTCTTGT
mNlrp3	ATGCTGCTTCGACATCTCCT	AACCAATGCGAGATCCTGAC
mScd1	GGGACAGATATGGTGTGAAACTATG	TTACAGACACTGCCCCTCAAC
mSrebp1c	GTGAGCCTGACAAGCAATCA	GGTGCCTACAGAGCAAGAGG
mTgfβ	TTGCCCTCTACAACCAACACAA	GGCTTGCGACCCACGTAGTA
mTimp1	GATATGCCCACAAGTCCCAGAACC	GCACACCCCACAGCCAGCACTAT
mTnfα	GGCTGCCCCGACTACGT	ACTTTCTCCTGGTATGAGATAGCAAAT
mTlr2	CAAACTGGAGACTCTGGAAGC	GCACCTACGAGCAAGATCAACA
mTlr4	AGTGGGTCAAGGAACAGAAGCA	CTTACCAGCTCATTTCTCACC
m36B4	GGATCTGCTGCATCTGCTTG	GGCGACCTGGAAGTCCAACT
mβ-actin	GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC	ACTCATCGTACTCCTGCTTGCT
hCol1a	CCCTGGAAAGAATGGAGATGAT	ACTGAAACCTCTGTGTCCCTTCA
hIl-6	CTTCTCCACAAGCGCCTTC	CAGGCAACACCAGGAGCA
hTgfβ	CAACAATTCCTGGCGATACC	GAACCCGTTGATGTCCACTT
hTipm1	GGGGACACCAGAAGTCAACC	GGGTGTAGACGAACCGGATG
haSma	TGGCCGAGATCTCACTGACTA	CTTCTCAAGGGAGGATGAGGA
h36B4	GAAGGCTGTGGTGCTGATG	GTGAGGTCCTCCTTGGTGAA

실시예 1-10. 단백질 분리 및 웨스턴 블로팅

취된 조직 샘플은 단백질분해효소 및 포스파타아제 억제제 칵테일(Sigma, St.Louis, MO, USA)과 함께 방사면역침강법(radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 용해 완충액(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)에서 균질기로 균질화하고 원심분리하여 상등액을 채취하였다. 10% SDS-PAGE를 이용하여 단백질 10-12μg을 분리하여 트리스버퍼 식염수/Tween 20으로 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF)막(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)에 전달하고 상온에서 1시간 차단하였다.

TBS(Tris-Buffered Saline) 완충 식염수로 20 (TBST) 용액을 사용하여 여러 번 세척한 후 4℃에서 카스파스-1에 대한 1차 항체와 밤새 반응했다. B-세포 억제제의 카파 라이트 폴리펩타이드 유전자 증강제, alpha (IkBα), Binding immunoglobulin protein (BiP), C/EBP homologous protein (CHOP), -actin, GAPDH, phosphor 또는 total of extracellular signal-regulated kinases (ERK), stress-activated protein kinase/Jun-amino-terminal kinase (SAPK/JNK), 및 p38 (Cell signaling Technology, Danvers, MA, USA). Anti-alpha smooth muscle Actin (αSMA), anti-Collagen I (Collagen I) (Abcam, Cambridge, MA, USA), 및 human/mouse NLRP3/NALP3 antibody (NLRP3) (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN 55413, USA) 들을 사용 하였다. 다음날, 막은 1X TBST로 여러 번 세척한 후 2차 항체, 염소 항토끼, 항랫트 IgG, HRP 연결 항체(Cell signaling Technology, Danvers, MA, USA), 염소 항쥐 IgG-HRP(Santa Cruz biotechnology, CA, USA)로 1시간 동안 배양 하였다. 막은 세척 후, 강화된 화학 발광(ECL) 시약(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)과 반응했다. 밴드를 식별하기 위해 ChemiDoc(Bio-Rad, CA, USA, at Bio-Health Materials Core-Facility at Jeju National University)을 사용하고 ImageLab(Bio-Rad, CA, USA) 또는 ImageJ(NIH, MD, USA)를 사용하여 표현 수준을 계산하였다.

실시예 1-11. 통계 분석

실험 결과는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표시되었다. Bonferroni의 다중 비교 테스트 또는 스튜던트티이검정(student's t-test)와 함께 ANOVA(일방향 분산 분석)를 사용하여 통계 계산을 수행 하였다. p-값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 모든 분석은 GraphPad Prism 8.02.263(La Jolla, California., USA)으로 수행되었다.

실시예 2. 본 발명 p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)의 비정상 포도당 대사 개선

저지방(low-fat, LF) 대조군과 함께 PCA(50mg/kg BW) 및 고자당 음료(HFHS) 식이한 C57BL/6마우스에서 식이/음료 섭취 시, 변화를 확인 하였다.

HFHS군은 비만이 되었으며, LF군에 비해 체중, 체중 증가량, 간 및 부고환 지방무게가 증가하였다(도 2,표 3). HFHS+PCA군의 음식 및 음료 섭취량 변화 없이, HFHS군 보다 총 콜레스테롤(Total Cholesterol, TC) 수준이 감소함을 확인 하였다(표 3).

또한, 본 발명의 p-쿠마르산(PCA)이 포도당 대사를 개선시키는지 확인하기 위해, 13주 동안 HFHS군은 식이를 계속 섭취한 결과 공복 포도당이 크게 증가한 반면, HFHS+PCA군 식이를 계속 섭취한 결과 공복 포도당 감소 되었다(도 3). HFHS군과 HFHS+PCA군 간 공복 인슐린 수치의 차이는 없었고(도 4), HFHS+PCA군은 HFHS군 비해 인슐린 저항성 지표(Homeostatic model assessment for insulin resistance, HOMA-IR)(γ50%, p=0.06)가 감소하는 것을 확인하였다(도 5).

또한, 본 발명의 p-쿠마르산(PCA)이 인슐린 감수성을 향상시키는 것을 확인하기 위해, HFHS군과 HFHS+PCA군의 포도당 부하 검사(GTT) 및 인슐린 내성 시험(ITT)으로 확인한 결과, 포도당 부하 검사(GTT)에서 단독 HFHS군 보다 HFHS+PCA군의 포도당 처리 속도가 더 빠른 것을 확인 하였다(도 6,도 7). 일관되게, HFHS+PCA 그룹은 낮은 포도당 수치를 보였으며, 포도당 소실률(kITT)은 HFHS군과 LF군 비교한 결과 포도당 소실률(kITT)은 유사한 것을 확인 하였다(도 8, 도 9).

결과적으로, p-쿠마르산(PCA)이 총 콜레스테롤(TC) 수준이 감소시켰으며, 포도당 내성 및 인슐린 민감성을 향상시키는 것을 확인 하였다.

실시예 3. 본 발명의 p-쿠마르산(PCA)이 간 손상을 개선 효과 확인

본 발명의 p-쿠마르산(PCA)이 간 손상에 개선하는지 확인하기 위해, 간 손상의 중증도를 정도를 판단하는 것으로 잘 알려진 바이오마커인 아스파르테이트 트랜스아미나제(aspartate transaminase, AST) 및 알라닌 트랜스아미나제(alanine transaminase, ALT) 수준을 통해 PCA의 영향을 확인했다.

그 결과, HFHS 그룹은 LF 그룹보다 혈청 아스파르테이트 트랜스아미나제(aspartate transaminase, AST) 및 알라닌 트랜스아미나제(alanine transaminase, ALT) 수치가 더 높았으며, HFHS+PCA 그룹은 HFHS 그룹보다 아스파르테이트 트랜스아미나제(aspartate transaminase, AST) 및 알라닌 트랜스아미나제(alanine transaminase, ALT) 수치가 낮은 것을 확인하였다(도 10, 도 11).

따라서, 도 10 및 11에 나타낸 바와 같이, HFHS군에 비해 HFHS+PCA군이 AST 및 ALT 수치가 감소된 것을 확인하여, 본 발명의 p-쿠마르산(PCA)이 간 손상을 개선시키는 것을 확인 하였다.

Characteristic of diet intake and metabolic parameters
Group	LF	HFHS	HFHS+PCA	p-value
Diet intake
Food intake (g/mouse/day)	5.69±1.19^b	2.38±0.57^a	2.26±0.43^a	<0.01
Drink intake (g/mouse/day)		9.13±1.89	8.95±2.70	n.s.
Total kcal intake (kcal/mouse/day)	22.08±4.60	19.83±4.17	18.57±3.78	n.s.
Blood Chemistry
Total Cholesterol (mg/dL)	91.28±4.70	130.64±18.28	99.14±12.58	n.s.
LDL/VLDL (mg/dL)	0.71±0.23	0.67±0.14	0.64±0.17	n.s.
* Values are mean ±S.E.M. All groups n= 6/group.

실시예 4. PCA는 TLR4/NFB, ER 및 산화 스트레스를 억제하여 NLRP3 인플라마솜의 프라이밍 및 활성화를 억제.

p-쿠마르산(PCA)가 NLRP3 인플라마솜(NLRP3 inflammasome)을 포함한 간에서 HFHS 식이에 의해 염증 억제하는 것을 확인하기 위해, p-쿠마르산(PCA) 처리는 HFHS식이한 쥐의 간의 Tlr2(Toll like receptor 2)의 발현을 감소시켰으며, Tlr4(Toll like receptor 4) 발현을 현저하게 감소시켰다(도 12).

감소된 Tlr4 mRNA 수치에 따라, p-쿠마르산(PCA) 처리에 의하여 IkBα 분해가 현저하게 억제되었고(도 13), 간 조직에서 염증성 관련 유전자인 Cox2, 인터그린 서브유닛 알파 x(integrin subunit alpha x, Cd11c), 인터루킨 1 베타(Interleukin 1 beta, Il-1β)를 포함하여 NF-γB의 표적 유전자의 mRNA 발현이 감소된 것을 확인 하였다(도 14).

또한, TLR4/NFbB 신호축 외에도, p-쿠마르산(PCA)이 간에서 NLRP3 염증 활성화에 관련된 미토겐활성화단백질키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 시그널링, ROS 생성(ROS production) 및 미접힘 단백질 반응(unfolded protein response, UPR)은 다른 신호 경로 간의 상호 작용으로 확인하였다.

ERK와 JNK 인산화의 단백질 수준은 HFHS+PCA군의 간에서 감소함을 확인하였고, 인산화 p38 수준의 차이는 없었다(도 15). 또한, HFHS+PCA군의 간의 BiP 및 CHAP의 단백질 발현은 HFHS군 간의 BiiP 및 CHAP의 단백질 발현 보다 더 낮음을 확인 하였다(도 15).

소포체(ER) 스트레스가 산화적 손상을 유발할 수 있기 때문에, 본 발명의 p-쿠마르산(PCA)이 간에서 HFHS식이에 의한 산화 스트레스를 억제하는지 확인하기 위해, MDA는 조직 산화 스트레스의 종점 마커에 대해 측정된 지질 과산화 생성물로써 사용하였고, HFHS군에 비해 p-쿠마르산(PCA) 처리 HFHS+PCA군에서 유의하게 감소되었다(도 16)

간의 유리 콜레스테롤 축적은 간세포와 조혈모세포(hematopoietic stem cell, HSCs)가 간 섬유증을 가속화하는데 중요한 역할을 한다. p-쿠마르산(PCA) 처리는 HFHS군의 간에서 유도된 유리 콜레스테롤 축적을 상당히 억제하였고(도 17), IL-1β의 혈장 수준은 LF군에 비해 HFHS군에서 급격하게 높았다.(~4.3배). p-쿠마르산(PCA)에 의한 NLRP3 프라이밍 신호 감소와 병행하여 혈장 IL-1β 수준은 HFHS군 보다 p-쿠마르산(PCA)을 병용 처리 시 약 3.1배 낮았다(도 18).

따라서, p-쿠마르산(PCA)가 프라이밍 신호(TLR4/NFbB 축)에 따라 간의 염증을 억제할 뿐만 아니라 만성 HFHS 식이에 대해 NLRP3 assemblies(즉, 산화 스트레스, 콜레스테롤 및 ER 스트레스)를 촉진하는 다른 경로도 감쇠시켰음을 시사한다.

실시예 5. PCA는 간에서 HFHS 매개 간 섬유증을 완화하고 TGFβ로 자극된 간 성상 LX-2 세포에서 섬유증 특징을 개선

간 섬유증의 발병에 대한 PCA 치료를 확인하기 위해, 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome)과 씨리어스 레드(Sirius red)를 사용하여 간 조직을 염색하여 콜라겐 축적을 각각 파란색과 빨간색으로 시각화하였다. 13주 동안 HFHS 식이한 HFHS군은 LF군에 비해 콜라겐 부피 분율이 악화되었으며, p-쿠마르산(PCA)에 의해 콜라겐 부피 분율이 감소 되었다(도 19, 도 21). 일관되게, 씨리어스 레드(Sirius red) 염색에 의한 콜라겐 축적의 조직학적 검사는 HFHS군에서 콜라겐 섬유의 과도한 침착을 보여주었으며, 이는 LF군과 유사하게는 p-쿠마르산(PCA) 처리에 의해 예방되었음을 확인하였다(도 20, 도 22). 또한, HFHS식이에 의한 상향조절된 αSMA 유전자 및 단백질 발현은 p-쿠마르산(PCA)에 의해 유의하게 감소되었다(도 23, 도 24).

p-쿠마르산(PCA)은 HFHS 식이를 매개로한 유도된 섬유증 관련 유전자인 전환성장인자(transforming growth factor beta, Tgfβ), 프로콜라겐 타입 I (procollagen type I, a2, Col1a2), 프로콜라겐 타입 III (procollagen type III, a1, (Col3a1)), 프로콜라겐 타입 IV (procollagen type IV, a1 (Col4a1)) 및 금속단백질가수분해효소-1 조직 억제제(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, Timp1) 발현을 정상화하였다(도 25).

시험관 내 간 섬유증에 대한 p-쿠마르산(PCA)의 억제 효능을 확인하기 위해, TGFβ는 섬유형성 과정에서 HSC를 근섬유아세포로 활성화시키는 중심 매개체 역할을 하여 TGFβ(5 ng/mL)를 LX-2 HSC 세포에 처리하여 섬유형성을 하였다. p-쿠마르산(PCA)는 염증 표지자 Il-6의 하향 조절과 LX-2 HSC에서 α-Sma, Tgfβ, Col1a 및 Timp1의 섬유화 관련 유전자 발현을 통해 TGFβ 유도 염증과 섬유화를 감소하는 것을 확인 하였다(도 26).

또한, PCA 치료는 LX-2 간 성상 세포에서 감소된 NFκ활성화 및 콜라겐 I 단백질 발현에 대한 신호인 TGFβ유도 IkBα 분해를 억제 하였다.

또한, LX-2 HSC에서 단독 TGFβ group, TGFβ+PCA group 사이의 α-SMA 단백질 발현에는 유의한 변화가 없는 것을 확인 하였다(도 27, 도 28).

이러한 결과는, TGFβ가 유도 LX-2 HSC에서 시험관 내에서 삽입된 것을 의미 하며, p-쿠마르산(PCA)은 간에서 HFHS식이한 HFHS군의 간 섬유화를 완화시켰고, TGFβ 자극 LX-2 세포에서 섬유화 특징을 개선하였다.

실시예 6. PCA는 LPS-프라이밍된 골수 유래 대식세포에서 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제.

NLRP3 인플라마솜 조절에서 PCA의 역할을 추가로 확인하기 위해 LPS-프라이밍된 BMDM을 사용하고 니제리신(nigericin, Ng) 또는 팔미테이트(palmitate, PA)로 자극하였다.

LPS+Ng 처리 시, p-쿠마르산(PCA) 처리는 Nlrp3, Il-1β및 Il18의 mRNA 수준 및 배지로의 IL-1β분비를 유의하게 감소시켰다(도 29, 도 31). 이러한 결과와 유사하게, 카스파아제-1(caspase-1) 절단 및 배지에 대한 분비는 p-쿠마르산(PCA) 치료에 의해 유의미하게 감소하였다(도 32). 또한, PCA 치료는 LPS+PA 처리 BMDM 세포에서 Nlrp3, Il-1β, Il-18, IL-1β 분비물, 카스파제-1의 mRNA 수치를 크게 억제하는 것을 확인 하였다(도 30, 도 33, 도 34).

이러한 데이터는 p-쿠마르산(PCA)에 의한 간 염증/스트레스 및 섬유증의 관찰된 개선이 NLRP3 인플라마좀 활성화 억제와 관련될 수 있음을 시사한다.

따라서, p-쿠마르산(PCA)는 지방다당류(LPS) 유도 골수유래 대식세포(BMDM)에서 나이제리신(Ng)과 팔미테이트(PA) 유도 NLRP3 염증을 억제 하였다.

결론적으로 본 발명의 p-쿠마르산(PCA)은 NLRP3유도 섬유화와 관련된 매커니즘 및 이의 염증을 규명하였다. p-쿠마르산(PCA)이 NLRP3 인플라마솜의 감소를 통해 간 섬유화를 억제하는지 확인기 위해, 포화지방과 콜레스테롤을 포함한 만성적과도한 식이로인해, 카일로미크론의 과도한 유입과 염증 매개 지방분해가 유발되어, 이에따라, 순환성 유리 지방산과 지방독성을 증가시킨다. 또한, 고지방 (high-fat, HF)식이와 함께, 증가된 설탕 섭취는 지방원성 전사인자를 통해 NAFLD의 발병 위험을 증가시키는 것으로 보고되었으며, 이는 간염과 섬유증의 발병과 관련있다.

간섬유화의 주요 특징인 HSC 활성화에 관여하는 NLRP3 염증소체가 보고되었으며 결과적으로 간에서 매트릭스 분해와 염증 신호 전달을 변화시킨다.

이에, 본 발명의 p-쿠마르산(PCA)이 간의 TLR4/NF-γB 관련 염증의 감쇠 및 활성화(신호 2)를 통해 NLRP3 프라이밍(신호 1)에 모두 기여하여 HFHS군에서 간섬유화/HSC 활성화의 결과로 카세스-1 및 IL-1 성숙도를 낮추는 것을 확인 하였다.

따라서, 본 발명의 p-쿠마르산(PCA)은 NLRP3 인플라마솜을 완화하여 HFHS 식이로 유발된 간 섬유증을 감소하는 효과가 있다(도 35).

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는, NLRP3 인플라마솜(NOD-like receptor protein 3 inflammasome)의 활성화에 의해 발생된 간 섬유증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 NLRP3 인플라마솜(NLRP3 inflammasome)의 활성화는 미토겐활성화단백질키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 시그널링, ROS 생성(ROS production) 및 미접힘 단백질 반응(unfolded protein response, UPR)와 관련된 것인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 총 콜레스테롤(Total Cholesterol) 감소 및 유리 콜레스테롤(free cholesterol) 축적을 억제 시키는 것인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 공복 포도당 및 인슐린 저항성 지표(Homeostatic model assessment for insulin resistance, HOMA-IR)를 감소 시키는 것인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 포도당 내성 및 인슐린 민감성을 향상시키는 것인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 아스파르테이트 트랜스아미나제(aspartate transaminase, AST) 및 알라닌 트랜스아미나제(alanine transaminase, ALT)을 감소 시키는 것인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 Tlr2(Toll like receptor 2) mRNA의 발현 및 Tlr4(Toll like receptor 4)의 mRNA 발현을 감소시키는 것인, 조성물.
제 8항에 있어서,
상기 Tlr4(Toll like receptor 4) mRNA의 발현의 감소는 IkBα(ihibitor of kappa B) 분해 억제시키는 것인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 간 조직 염증 관련 유전자 발현을 감소시키는 것인, 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 간 조직 염증성 관련 유전자는 Cox2, 인터그린 서브유닛 알파 x(integrin subunit alpha x, Cd11c), 인터루킨 1 베타(Interleukin 1 beta, Il-1β), Il-6을 포함한 NF-kB의의 표적 유전자인 것인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 간장 말론디알데히드(Hepatic malondialdehyde, MDA)를 감소 시켜, 소포체(ER) 스트레스를 감소시키는 것인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 α-SMA(α smooth muscle)의 유전자 및 단백질 발현을 감소시키는 것인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 섬유증 관련 유전자 또는 단백질을 감소 시키는 것인, 조성물.
제 14항에 있어서,
상기 섬유증 관련 유전자 또는 단백질은 전환성장인자(transforming growth factor beta, Tgfβ), 프로콜라겐 타입 I procollagen type I, a2 (Col1a2), 프로콜라겐 타입 III (procollagen type III, a1 (Col3a1)), 프로콜라겐 타입 IV (procollagen type IV, a1 (Col4a1)) 및 금속단백질가수분해효소-1 조직 억제제(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, Timp1), 카스파제-1(caspase-1)인 것인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 간 섬유증은 알코올성 간경변증, 비알코올성 간경변증, 윌슨병 관련 간경변증, 혈색소증 관련 간경변증, 문맥성 간경변증, 괴사후성 간경변증, 영양결핍과 관련된 간경변증 및 심장성 간경변증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상인 것인, 조성물.
제 16항에 있어서
상기 간 섬유증은 고지방 및 고자당 식이로 인해 발생된 것인, 조성물.
p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는 간 섬유증의 예방 및 개선용 식품 조성물로서,
상기 조성물은 NLRP3 인플라마솜(NOD-like receptor protein 3 inflammasome)의 활성화를 억제하는 것인, 식품 조성물.
p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는 간 염증 관련 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로서,
상기 간 염증 관련 질환은 알코올성 간경변증, 비알코올성 간경변증, 윌슨병 관련 간경변증, 혈색소증 관련 간경변증, 문맥성 간경변증, 괴사후성 간경변증, 영양결핍과 관련된 간경변증 및 심장성 간경변증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상인 것인, 약학적 조성물.
p-쿠마르산(p-Coumaric acid, PCA)을 유효성분을 포함하는, 간 염증 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물로서,
상기 간 염증 관련 질환은 알코올성 간경변증, 비알코올성 간경변증, 윌슨병 관련 간경변증, 혈색소증 관련 간경변증, 문맥성 간경변증, 괴사후성 간경변증, 영양결핍과 관련된 간경변증 및 심장성 간경변증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상인 것인, 식품 조성물.