JP2001502894A

JP2001502894A - ドメイン死アゴニストと相互作用するｂｈ３

Info

Publication number: JP2001502894A
Application number: JP10512987A
Authority: JP
Inventors: ジェイコルスメイヤ，スタンリー
Original assignee: ワシントンユニヴァーシティ
Priority date: 1996-09-09
Filing date: 1997-09-09
Publication date: 2001-03-06
Also published as: EP1007534A1; WO1998009980A1; CA2264578A1; AU722622B2; AU4411197A; EP1007534A4; US5998583A; US5955593A

Abstract

(57)【要約】 BH1、BH2、BH4あるいは関連するBCL-2系統群メンバーにおいて発見された膜アンカーリングドメインを含まないが、BH3ドメインのみを含む新規な死アゴニストであるBIDは、BID誘導体、bidポリヌクレオチドとそれの誘導体と、成分とそのための使用に沿って提供される。

Description

【発明の詳細な説明】ドメイン死アゴニストと相互作用するBH3発明の背景（１）発明の分野本発明は、概してアポプトーシスの規制とアンタゴニストとアゴニストの双方をを含むポリペプチドに関するものである。アンタゴニストとアゴニストはこれらのポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを、さらに特に新規な死アゴニストであるBIDとBIDをコード化するポリヌクレオチドだけでなくアポプトーシスを規定する。（２）従来技術の記述アポプトーシスと呼ばれるプログラム化された細胞死は、すべての多細胞生物内でのホメオスタシスの発達と維持において必須な役割を担っている（Raff、Na ture 356:397-400，1992参考のために引用される）。線虫から人間までの遺伝的と分子的な分析により、細胞自殺のアポプトーティック経路は非常に維持されている（HengartnerとHorvitz、Cell 76:1107-1114,1994参考のために引用される）。正常な発達と維持のためにはきわめて重要であることに加えて、アポプトーシスはウイルス感染に対する防衛や癌の出現を予防する点において重要である。各段階におけるアポプトーティック経路を規制する分子を確認する点において、かなりの進展があった。ポジティブとネガティブ調節剤の双方とも、しばしばタンパク質の同系統群内においてコード化され、細胞外、細胞表面と細胞内の段階を特徴付ける（OltvaiとKorsmeyer、Cell 79:189-192，1994参考のため引用される）。アポプトーシスの細胞内チェックポイントを構成するタンパク質の一つのそのような系統群は、タンパク質のBCL-2系統群である。本系統群の発見したメンバーは、濾胞性リンパ腫から初期に分離されたbcl-2がん原遺伝子によりコード化されたアポプトーシス抑制タンパク質である（Bakhshiら、Cell 41:889-906、1985,Tsujimotoら、Science 229:1390-1393，1985，ClearyとSklar、Proc Natl AcadSci USA 82:7439-7443， 1985参考のために引用される）。BCL-2は25kDで、ミトコンドリアの膜内在性タンパク質である。死を引き起こす刺激の多くの種類により引き出されるアポプトーシスを抑制することにより、この因子は多くの異なったタイプの細胞中で生き残ることができる（Korsmeyer、Blood 80:876-886、1992参考ために引用される）。 BCL-2に関連したタンパク質の系統群は、bcl相同性ドメインと呼ばれる保存されたモチーフ（motifs）に主として基づく配列相同性により定義されてきた（Yi nら、Nature 369:321-323、1994 参考のために引用される）。Bcl相同性ドメイン1と2（BH1とBH2）ドメインは2量化とアポプトーシスを調節する点において重要であることが示されてきた（Yinら、Nautre 369:321-323、1994 参考のために引用される）。第3の相同性領域、BH3はさらにアポプトーシスだけでなく2量化にとって重要であることが確認された（Boydら、Oncogene 11:1921-1928；Chi ttendenら、Embo J 14:5589-5596、1995 参考のために引用される）。第4相同性領域として、BH4、は同系統群メンバーのアミノ末端の近くにある（FarrowとB rown、Curr Opin Genet Dev 6:45-49、1996 参考のために引用される）（図13a -13eを参照）。この系統群のメンバーはヘテロ2量化でき、多くの場合、ホモ2量化もできる。死アンタゴニスト（BCL-2、BCL-X_L、MCL-とAl）のアゴニスト（BAX、BAK、BCL-X_S とBAD）に対する割合は、ホモ2量体あるいはヘテロニ2量体が形成されるのを決定し、これらのバランスは細胞がアポプトーティックシグナルに応答するであろうかどうかを決定する（OltvaiとKorsmeyer、Cell 79:189-192、1994参考のために引用される）。よって、アゴニストとアンタゴニストの間の2量化は競争反応である。例えば、死を促進する分子 BAXは死を助長するホモ2量体を形成するが、一方BAXはさらにBCL-2やBCL-X_Lとヘテロ2量体を形成し（Oltvaiら、Cell、74:609-619、1993 参考のために引用される）、これらのヘテロ2量体の形成は細胞死の抑制になる。突然変異誘発研究により、BAXとヘテロ2量化し細胞死を抑制するにはアンタゴニスト（BCL-2、BCL -X_L）の無傷のBH1とBH2ドメインがそれらにとって必要であること明らかにされた（Yinら、Nautre 369:321-323、1994;Sedlakら、1995参考のために引用される）。逆に、欠失分析によりBCL-X_LあるいはBCL-2とヘテロ2量化し細胞死を促進するには、死アゴニスト（BAK、BAX）のBH3ドメインがそれらにとっては必要であることが示された（Chittendennら、Embo J 14:5589-5596、1995;Zhaら、1996参考のために引用される）。しかしながら、BCL-X_Lにおける他の突然変異はBAXとのヘテロ2量化を引き裂くが、死抑制体活性を保持することは注目される（Cheng ら、Nature 379:554-556、1996参考のために引用される）。このことはこれらの分子はお互いに独立して機能もすることを暗示している。最近、系列群メンバーであるBCL-XLの最初のX線と多次元NMR構造が決定された（Muchmoreら、Nature 3 81:335-341、1996参考のために引用される）。BH1-BH4ドメインに相当するαヘリックスと疎水性ポケットは、BH1、BH2とBH3ドメインの空間的に密接な接近からの結果であることが明らかにされた。 BH3ドメインは死アゴニストのいくつかによる死の促進において役割を演じているが、BADのような他の場合にはBH3ドメインは存在しない。BH3の重要な役割は死アゴニスト系統群に対して、BH1とBH2ドメイン双方が欠けているが、BH3ドメインは有していることを示している。1つのそのような系統群メンバーはBCL-X_L である。BCL-X_Lをコード化するmRNAの代わりにスプライスされたバージョンから翻訳されたこのタンパク質は、BCL-2タンパク質が成長因子を遮断された細胞の生存を高める能力を抑制する（Boiseら、 Cell 74:597-608、1993参考のために引用される）。BCL-X_SもBCL-X_Lと同じようにBH4相同性を含む。 BIKはBH3ドメインを有しているがBH1あるいはBH2ドメインを有していない別の死アゴニストであり、このタンパク質もBH4ドメインが欠けている（Boydら、Onc ogene 11:1921-1928、1995 参考のために引用される）。BCL-2自身のような古典的な系統群メンバーのように、このタンパク質は膜内外局在を可能にするシグナル/アンカー部分として機能するであろうC−末端疎水ドメインを有している（ Nguyenら、J Biol Chem 268:25265-25268、1993参考のために引用する）。 BAKのBH3ドメイン、BH1、BH2、BH3とC-末端膜局在ドメインを有するアゴニストは、この系統群メンバーの細胞死を促進させる効果を仲介する点において、最重要であると仮定されている。この結論はBH3領域は細胞死の誘導に必要であるとして確認され、BH3を含むがBH1とBH2は含まない50のアミノ酸ポリペプチドフラグメントによる細胞死滅活性の保持により、BH3ドメインは細胞死を誘発するのに十分であることを示した欠失研究に基づいていた。ある病気の状態は、病気に侵された細胞におけるアポプトーシスの欠陥のあるダウンレギュレーションの展開に関連していると信じられている。例えば、新生物は少なくとも部分的には、細胞の増殖シグナルが不適当に細胞死シグナルよりも上回るアポプトーシス抵抗の状態からの結果である。さらに、エプスタイン− バーウイルス、アフリカ豚コレラウイルスとアデノウイルスのようなあるDNAウイルスは、それら自身の複製を進めるために宿主細胞マシーナリーに寄生し、同時に細胞死を抑制するためにアポプトーシスを調節し、ターゲット細胞がウイルスの複製を可能にする。そのうえ、リンパ増幅状態、薬剤耐性癌を含む癌、関節炎、炎症、自己免疫疾患等のようなある病気の状態は、細胞死の規制のダウンレギュレーションから生じることもある。そのような病気の場合には、アポプトーティック機構を促進することが望ましく、一つの有利なアプローチは、重要なアゴニスト決定因子であると確認されているBH3ドメインを有する細胞死アゴニストで治療することである。さらに、ある病気の状態では、AIDS、老化、神経変性病気、虚血性レパーフュージョン(reperfusion)細胞死、不妊症、創傷治癒などを含む免疫不全病気の治療におけるように、アポプトーシスを抑制することが望ましい。そのような病気の治療において、BH3ドメインを含む内因性タンパクの細胞死アゴニスト活性を減少させることが望ましい。よって、BH3の存在による細胞死アゴニスト細胞死の性質を有するBCL-2系統の新しいメンバーを確認することと、不適当な抑制と不適当な細胞死の増大のいずれも含む病気の状態において、アポプトーティック過程を有利に調節する理学療法用の基礎として、これらを利用することは望まれている。本発明の要約よって、簡単には、本発明は実質的に精製されたタンパク質とタンパク質を規定するアポプトーシスのBCL-2系統群のに属するコード化するポリヌクレオチドの確認、分離と使用に向けられる。それゆえ、発明者はここに、BCL-2系統群と同じようにBH3ドメインしか含まない新しい細胞死アゴニストを発見することに成功した。この新しい死アゴニストをここではBID（ドメイン死アゴニストと相互作用するBH3）と呼ぶが、この配列はBH3ドメインしかないBCL-2系統群に関係している。BIDは21.95kDaという予想される分子量を有する195のアミノ酸のBID cDNAから導かれる配列を有している。ここで確認され分離されたBID cDNA分子は、人間BIDポリペプチド（SEQ ID NO:4）をコード化する人間ポリヌクレオチド（ SEQ ID NO:1）とマウスBIDポリペプチド（SEQ ID NO:6）をコード化するマウスポリヌクレオチド（SEQ ID NO:3）を含む。人間BID cDNAは、3'末端の近くにさらに15のヌクレオチド（SEQ ID NO:2）を含み、200のアミノ酸を有する人間BIDポリペプチド（SEQ ID NO:5）をコード化する様々な形で存在することも明らかにされた。 BIDは、イーストトゥーハイブリッド（yeast two-hybrid）分析法だけでなく生体内と生体外中での結合分析法を用いることにより、死アンタゴニストである BCL-2とBCL-X_Lと、死アゴニストであるBAX双方とヘテロ2量化することも、思いかけずに明らかにされた。BID過剰発現はBCL-2によるカウンター保護だけでなくアポプトーティック死を引き起こし、システインプロテアーゼを含むアポプトーシスの共通の経路を活性化させる（MartinとGreen、Cell、82:349-352、1995;He nkart、Immunity 4:195-201、参考のために引用される）。 BCL-2系統群でのBIDだけの相同性は、パートナーとヘテロ2量化するのにと、死促進化活性に必要とされるBH3ドメインを保持している。BIDにはカルボキシ末端シグナル-アンカー部分が欠けているが、シトゾルと膜ロケーションの双方を有している。BH3の突然変異生成はBID/BAXヘテロ2量体の重要性を示し、BIDが死アゴニストリガンドとしての役目をすることを示した。よって、本発明は細胞死の調節可能な作用物質の確認方法だけでなく、BIDポリヌクレオチド配列とBIDポリペプチド配列を用いた細胞死を調節する新規な成分と方法を提供する。従って、本発明の一つの具体例において、分離され実質的に精製された哺乳類 BIDポリペプチドとそのフラグメントが提供される。本発明のBIDポリペプチドは、実質的には哺乳類種とは異なるオルソログ（orthologs）中の少なくとも約85 ％配列が確認されていると信じられている自然発生する配列と同じであり、（a ）BCL-2系統群のメンバーに結合した膜に特徴的であるカルボキシ末端シグナル- アンカー配列が欠けていること、（b）BH1とBH2ドメインが欠けていること、（c ）BH3ドメインのアミノ酸配列を有していることと、（d）BAX、BCL-2とBCL-X_Lと選択的にヘテロ2量化すること、により確認することができる。ある具体例において、BIDポリペプチドのBH3ドメインは、Leu-Ala-Glu-Xaa₁-Gly-Asp-Xaa₂-Met-Aspの配列から構成される。ここでXaa₁はIleあるいはValであり、Xaa₂はGluあるいはSer（SEQ ID NO:7 ）であり、さらに特に人間BIDのBH3ドメインはLeu-Ala-Glu-Val-Gly-Asp-Ser-Me t-Asp（SEQ ID NO:8）の配列から構成される。BIDポリペプチドは人間BIDポリペプチド（SEQ ID NOS:4と5）、あるいはマウスBIDポリペプチド（SEQ ID NO:6 ）、あるいはそれらの誘導体やフラグメントやそれらの融合タンパク質と、実質的には同じである。さらに本発明はBH3ドメインと、アミノ酸置換、付加と/あるいは自然発生する BID配列（SEQ ID NOS:4-6）やそれらのフラグメントの一つと比較して欠失している全体の配列から成る修飾BIDポリペプチドを提供する。そのような修飾BIDポリペプチドは、自然発生するBIDポリペプチドとしての死アゴニスト活性、あるいは元のタンパク質からの改質された生物学的活性、あるいは自然発生したBID ポリペプチドの効果をブロックするアンタゴニスト活性のいずれかを示すことができる。他の具体例において、本発明はBIDポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをも提供する。そのようなポリヌクレオチドはBIDポリペプチドの量の組換え体発現の鋳型として、あるいはポリヌクレオチドが雑種形成し、ノーザンブロット法のような内因性BIDポリヌクレオチドになる際の検出分析法のプローブとしての役目をすることができる。本発明は、BIDポリペプチドをコード化する核酸配列に結合可能な発現調節剤要素から成る組換えDNAを構成するベクターをも提供する。別の具体例は、BAX、BCL-2あるいはBCL-X_Lや他のBCL-2の系統群メンバーとのB IDの結合の抑制を調節する作用物質を確認するスクリーニング分析法を提供する。本発明は、BIDポリペプチド配列をコード化するポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスポリヌクレオチドをも提供する。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドはBIDポリペプチドmRNAの転写と/あるいは翻訳を抑制するのに利用され、それによって細胞中のそれぞれのBIDポリペプチド量の減少をもたらす。アンチセンスポリヌクレオチドそれ自体、アポプトーティック細胞死を抑制することができる。本発明のポリヌクレオチドは、BID機能に関連した新生物あるいは他の病気の状態に関連した病的な状態や遺伝病の診断分析法においても用いることが可能であり、具体的には、BIDポリペプチドの構造と豊富な量における変性、RNA転写やスプライシング中間体、mRNA、やゲノミック遺伝子座を含む状態や病気である。本発明はBIDに結合し、変性、老化の、新生物発生前の、増殖性の、あるいは新生物細胞におけるようなBIDポリペプチドの変質発現を検出するため、あるいは特定の病気のコースを追跡するための診断分析法において有用なBCL-2系統群メンバーに選択的に関連した抗体をも提供する。BID抗体は、BIDポリペプチドの不適当なあるいは過剰発現の治療において有用でもある。本発明の別の面において、マウスのような非人間動物は、内因性BID遺伝子を機能的に引き裂く同型接合対を有するノックオウト（knockout）動物を含むものを与えられる。さらに遺伝子導入した非人間動物や、人間あるいはBIDポリペプチドをコード化する遺伝子導入体を有する非人間細胞からの細胞をも含まれる。本発明は、BIDポリヌクレオチドを用いた遺伝子治療と病気を治療あるいは予防するためのBID遺伝子治療ベクターの方法と成分をも提供する。他の具体例において、本発明は新生物あるいは自己免疫のような状態において細胞死が不適当に抑制された場合の病気治療方法を提供する。そのような方法は、BIDポリペプチドやそのフラグメントや融合タンパク質やBIDのペプチドミメティック（peptido-mime-tic）での治療を含む。BIDが過剰発現されたあるいは不適当に発現された場合の病気の治療方法をも提供し、BIDアンチセンス分子あるいはBID抗体やBIDに結合し中性化する物質の投与から成る。あるいは、BIDの突然変異形は内因性BID活性に対抗するために投与される。本発明は、BIDポリペプチドやBIDポリヌクレオチドの薬学的に効果のある量と適当な薬学的なキャリアあるいはデリバリーシステムを含む薬学的な成分をも提供する。よって、本発明により達成されたとわかったいくつかの長所に中に、新生物あるいは自己免疫のようなアポプトーティックな状態を不適当に抑制された細胞中での細胞死を促進させるそのフラグメントだけでなく、BCL-2系統群のタンパク質とBIDポリペプチドの誘導体に同じようにBH3ドメインしか含まない新しい死アゴニスト、BIDの提供することは注目される。BIDポリペプチドをコード化するbi dポリヌクレオチドとその誘導体の提供；BIDポリペプチドあるいはそれの誘導体やそれのフラグメントを用いて抑制されたアポプトーティック状態により媒介された病気状態の治療法の提供；BIDアンチセンス分子あるいはBID抗体を用いてBI Dの過剰発現あるいは不適当な発現を調節する方法の提供；細胞内あるいは患者内でのBIDポリペプチドレベルを検出しモニターする方法の提供；BID遺伝子内の変質の検出方法の提供である。図面の簡単な説明図1はcDNA配列の全長を示す。（a）は人間BID（SEQ ID NO:1）の配列を、（b ）は下線部で示さされているように3'末端の近くに追加的に15ヌクレオチドを有する人間BIDの変種（SEQ ID N0:2）の配列を、（c）はマウスBID（SEQ ID NO:3 ）の配列を示す。図2は上線を付けたBH3ドメインを有する配列された人間とマウスBIDポリヌクレオチドと、下線部で示された抗体を誘発することができた2つのマウスポリペプチドエピトープを示す。図3はプローブとしてのオープンリーディングフレームを含む放射標識化されたマウスBid cDNAを用いた大人のマウス組織におけるノーザンブロット分析を示す。図4はウエスタンブロット分析を用いた、シトゾルとFL5.-Bcl-2細胞の膜フラクションにおけるBIDとBCL-2タンパク質の分布を示す。図5は、（a）はIL-3に続くbidクローンとトリパンブルー排除により測定されたネオコントロールでの減少した生存率を、（b）はウエスタンブロット分析により測定された同一細胞中におけるBIDのレベルを、示す。（ライン1：FL5.12-ネオ；ライン2：FL5.12-Bid -14;ライン3：FL5.12-Bid-15；ライン4：FL5.12-Bid-29）図6はIL-3排除に続くbcl-2/bidクローン中とトリパンブルー排除により測定されたFL5.12コントロール中での減少した生存率を示す。（b）はBIDレベルを、（ c）はウエスタンブロット分析により測定された同一細胞中におけるBCL-2のレベルを（ライン1：FL5.12;ライン2：FL5.12-Bcl-2;ライン3：FL5.12-Bcl-2/Bid-1; ライン4：FL5.12-Bcl-2/Bid-3;ライン5：FL5.12-Bcl-2/Bid-8）、示す。図7は、（a）はBIDを発現しzVADによるアポプトーティック効果のブロッキングするジャーガット細胞中における生存率の減少を、（b）は細胞溶解産物のウエスタンブロットにより測定されたドキシサイクリン（doxycycline）と放置した後のBIDタンパク質レベルを、（c）はbidとルシフェラーゼリポーター遺伝子を共形質移入されたRat-1繊維芽細胞におけるルシフェラーゼ活性と、zVADによるアポプトーティック効果の濃度依存したブロッキングにおいて測定された生存率を、示す。図8は、（a）はT7-遺伝子-10-BID融合タンパク質とNIHT 3T3細胞中で発現されたBCL-X_L、BCL-2、BCL-2-mI4（G145E）との共免疫沈降において、（b）は｛³⁵S ｝Met標識化されたBCL-X_L、BCL-2、BAXあるいはBIDと精製されたGST-BIDあるいはGSTコントロールとの生体外での結合において、（c）は[³⁵S]Met標識化された BCL-2とBAX変異体とGST-BIDとの生体外での結合において、（d）は[³⁵S]Met標識化された前もって結合されたBCL-2wtとBAX変異体とGST-BIDと生体外での結合において、BIDとBCL-2系統群メンバーの相互作用を示す。図9は、（a）は死促進分子のBH3ドメインの配列（2つの上流と2つの下流アミノ酸、SEQ ID NOS:42-45で表現される人間BAK、マウスBAK、人間BIKとマウスBID 、SEQ ID NOS:38-41）とBID（SEQ ID NOS:46-49）に導入された突然変異の概略図を、（b）はBCL-2あるいはBAXとGST-BIDあるいはBID変異体との生体外での結合を、示している。図10は、（a）は野生型をあるいはBH3ドメイン変異体BIDを発現するFL5.12-Bc l-2の生存率を、（b）はBID発現を示すウエスタンブロットを、（c）野生型あるいはBH3ドメイン変異体BIDとBCL-2とBAXとの関係を示すウエスタンブロット（ライン1：FL5.12-Bcl-2/Hygro.1;ライン2：FL5.12-Bcl-2/Bid-8;ライン3：FL5.12- Bcl-2/BidmIII-1.15;ライン4：FL5.12-Bcl-2/BidmIII-2.10;ライン5：FL5.12-Bc l-2/BidmIII-3.1;ライン6：FL5.12-Bcl-2/BidmIII-4.1）を、示す。図11は、（a）は野生型とBH3ドメイン変異体BIDを発現するジャーガット細胞の生存率を、（b）はBIDポリペプチドのレベルを示すウエスタンブロットを、（ c）はルシフェラーゼリポーター遺伝子とbcl-2、bidに沿ったbcl-2と野生型とBH 3ドメイン変異体bidとともに共形質移入されたRat-1繊維芽細胞におけるルシフェラーゼ活性において測定された生存率を、示す。図12は、（a）は矢印で示された切形されたポリペプチドを発生させるために用いられた全長とプライマーにより切形されたマウスBIDポリペプチドと、各切形されたポリペプチド全長のマウスBIDのアミノ酸（SEQ ID NOS:50-53）を、（b ）はHIV-1tatタンパク質（SEQ ID NO:54）とマウスBIDのアミノ酸75-106（ペプチドA）、81-100（ペプチドB）と84-98（ぺプチドC）（それぞれSEQ ID NOS:55 、85、と86である）のポリペプチドを包含するBH3ドメインを含むTat-BH3融合タンパク質を、（c）は100μｍTat-BID（75-106）（ペプチドA;SEQ ID NO:56）と1 00μｍTat-BID（81-100）（ペプチドB;SEQ ID NO:87）で処理した2B4細胞における生存率の減少を、示す。図13は、（a）はBH1、BH2、BH3、BH3、BH4とBIDの膜内外のドメインとBCL-2系統群メンバーを、（b）はBH3（SEQ ID NOS:38、40、41と57-61）の、（c）はBH1 （SEQ ID NOS:62-71）の、（d）はBH2（SEQ ID NOS:72811）の、（e）はBH4ドメイン（SEQ ID NOS:82-84）の配列の比較を、示す。好ましい具体例の説明本発明はポリヌクレオチドによりコード化されたbidポリヌクレオチドと誘導されたBIDポリペプチドの双方を含む、新しいBCL-2系統群メンバーであるBIDの発見、分離と確認を基礎にしている。驚くべきことに、BIDポリペプチドは死アゴニストであるBAXと死アンタゴニストであるBCL-2とBCL-X_Lとヘテロ2量化し、細胞死を促進可能であることを明らかにした。本発明の前に、BIDは知られておらず、精製された形では分離されておらず、個別の生物学的活性物質として確認されていなかった。多くの大人の組織の維持だけでなく発達は、細胞増殖、分化とプログラム化させた細胞死を含むいくつかのダイナミックに規制された過程により達成されることは知られている。後半の過程では、細胞は、アポプトーシスと呼ばれる非常に特徴的な自滅プログラムにより排除される。 BCL-2は、濾胞性B細胞リンパ腫を含んだ染色体切断ポイントのt（14;18）において初めて分離された。転座を反復発生されるBCL-2-Igミニ遺伝子を含んだ遺伝子導入マウスは、増加した増殖よりも細胞生存の拡大にため、安静なB細胞とB細胞自体の蓄積において４倍の増加を有するポリクローン濾胞性増殖を示した。大人の組織の調査により、BCL-2は多くの種類の細胞系列においていくつかの役割を担っていることが示された。ホルモン刺激や成長因子に応答して、増殖あるいは衰退する腺状上皮はBCL-2を発現する。皮膚や腸のような複雑な上皮において、概してBCL-2は幹細胞と増殖ゾーンに限定される。大人の神経系内では、B CL-2は中枢神経系よりも抹消神経系でより目立つ。よって、BCL-2は多くの種類の細胞系列において始原細胞と長寿命細胞を救うために必要とされる。 BCL-2は細胞内膜に局在しており、特にミトコンドリア外膜に局在している。それは生体内でBAXと呼ばれる21kKDタンパク質パートナーと関連しており、BAX はBCL-2と同じ拡張したアミノ酸相同性を示し、自分自身とホモ2量体を、生体内でBCL-2とBCL-X_Lとヘテロ2量体を形成する。BAXは6つのエキソンによりコード化され、21kD膜型を予想する交互RNAスプライシングの複雑なパターンを示す。BAX が細胞内で優位を占めれば、プログラム化された細胞死は有利となり、BCL-2と/ あるいはBCL-X_Lの死抑制体活性は悪影響を受ける。 BCL-2/BAXと/あるいはBCL-X_L/BAXの比は、アポプートティック刺激に続く死への細胞感受性の決定因子の一つである。IL-3存在下において、過剰発現されたBA Xは正常な細胞分裂や生存率を著しく変化させない。BAXが存在し、成長因子遮断前にBCL-2と/あるいはBCL-X_Lと関連する。BAX mRNAは、正常組織中と死を誘導するシグナル前に多くの細胞系において発現される。過剰なBAXはさらにBCL-2の死抑制体活性に対抗する。BCL-2が過剰の時、細胞は保護される。しかしながら、BAX が過剰でBAXホモ2量体が支配的であれば、細胞はアポプトーシスを受けやすい。それにもかかわらず、完全に一致していながアポプトーシスの規制において、死アゴニストあるいはアンタゴニストが支配的であるかはいずれにしろ、前の突然変異生成が評価に値する。BCL-2あるいはBCL-X_LのBH1とBH2ドメイン内での突然変異を選ぶことは、同時にBAXの結合とアンチアポプトーティック活性を失わせる（Yinら、1994;Sedlakら、Proc Natl Acad Sci ＵＳＡ 92:7834-7838，1995 ;Chengら、Nature 379:554-556,1996参考のために引用される）。このことは死抑制体はBAXのような死アゴニストと結合し中性化することにより細胞を保護する。しかしながら、BAXあるいはBAKとの相互作用を失わせるいくつかのBCL-X_Lの突然変異は、それらのアンチアポプトーティック活性の70-80%をいまだに保持し（Chengら、Nature 379:554-556,1996参考のために引用される）、系統群の死アンタゴニストとアゴニストメンバーはお互いに独立して機能することを示唆している。ここで明らかにされたBIDは、BCL-2系統群の死アゴニストと死アンタゴニスト双方と驚くべきほどに相互作用する新規なパートナーである。よってBIDの特徴から、アゴニスト（BAX）やアンタゴニスト（BCL-2）におけるさらに別のモデルは、共通のリガンドである BIDと競争する抑制体に結合された膜を表すことを示す。本発明の基礎は、BH3ドメインを含むが、BH1、BH2、BH4やタンパク質を調節するアポプトーシスのBCL-2系統群のメンバーに発見された膜アンカーリングドメインを含まない、新しい自然発生するポリペプチドであるBIDを予期せずに発見したことにある。BIDは関連したBCL-2系統群メンバーとヘテロ2量化するように作用する、具体的には死アゴニストBAXと死アンタゴニストBCL-2とBCL-X_Lと結合するだけでなく、死アゴニストとして作用する。マウスBID cDNAはタンパク質相互作用クローニングにより、確認され分離された。カルボキシ末端シグナルアンカー部分が欠損したマウスBCL-2とBAX cDNA類は、グルタチオンs-トランスフェラーゼ、（GST）/心筋キナーゼ（HMK）/BCL-2 や生体外で標識化されたGST/HMK/BCL-2融合タンパク質を発生させるのに利用された。標識化されたタンパク質は、マウスT雑種細胞系列2B4から組み立てられた λEXlox発現ライブラリーをスクリーンするために使用された。同じ新規な遺伝子がBCL-2とBAXプローブ双方により何度も確認された。全長のマウスcDNAは588のヌクレオチド（SEQ ID NO:3、図1a）のオープンリーディングフレームを持っていることがわかった。コード化されたポリペプチドは、21.95kDAという予想された分子量を有する195のアミノ酸（SEQ ID NO:6）を含むように誘導された（図2a）。マウスポリヌクレオチド配列を用いて、ゲンバンク研究によりマウスbidポリヌクレオチドと実質的に相同な2つの発現された配列 Tag（EST）人間cDNAクローンがわかった。各ESTは推定される人間BIDに相当する全長の配列の重なる部分を含む（乳児脳cDNAライブラリーからのクローンID No. :52055と胎児肝臓、脾臓cDNAライブラリーからのクローンID No.:128065）。これらのクローンの1つが得られ、マウスbid cDNAと相同である人間bid cDNAを得るために完全に配列された（それぞれ図1aと図1cでSEQ ID NOS:1と3である）。このクローン（乳児脳cDNA）から得られた人間の配列には588のヌクレオチドがあるが、一方配列あるいは128065クローン（胎児肝臓脾臓cDNA）は、報告されているEST配列から推定され、余分の15の塩基対（図1b;SEQ ID NO:2）を含む。128 065クローンからのこの配列は人間bid cDNAの変種であると考えられた。 588のヌクレオチド人間bid cDNAによりコード化されたポリヌクレオチドは、マウスBIDポリペプチドと72.3%相同性である195のアミノ酸オープンリーディングフレームをコード化するために誘導され、人間と相同体であることを表す（図2参照）。人間BIDポリペプチド配列は、BCL-2系統群のBH3ドメイン（Chittendenら、Emb o J 14:5589-5596、1995;Hanら、Genes & Dev 10:461-477、1996;Zhaら、J Biol Chem 271:7440-7444、1996参考のために引用される）をよく保存されている高い配列相同性を有する領域（アミノ酸90-98;図2、9aと13b）を含む。しかしながら、BIDは、BH1、BH2やBH4ドメイン（図13a-d）を含むBCL-2系統群の他の領域の配列保存を示さない。さらに、BIDはこれらの膜タンパク質のシグナル-アンカー部分として役目をするほとんどのBCL-2系統群に当てはまるカルボン酸末端親水性領域を持っていない（Nguyenら、J Biol Chem 268:25265-25268、1993参考のために引用される）（図13e）。よって、BIDはBCL-2系統群のBH3ドメインしか含まない。別の死アゴニストBIKはBH3とカルボン酸末端シグナル−アンカー部分を有しているが、さらに見分けがつくBH1、2や4ドメインは欠けている（Boydら、Oncogene 11:1921-1928 、1995参考のために引用される）。BIDとBIKはBH38あるいは9のアミノ酸を共有するが（図9a）、本ドメイン以上の相同性は示さないことは注目すべきである。区別することにおいて、BIDはカルボン酸末端シグナル-アンカー部分を有しないが、膜フラクションだけでなくシトゾルにも存在する。ここで言及される”BID”や”BIDポリペプチド”や”BIDタンパク質”という語は、ここで特徴づけられ記述されるBIDポリペプチドに実質的に相同性であることと、生物学的に同等である起源の細胞死のポリペプチド修飾物質を含むと解釈されるべきように意図される。そのような実質的に相同性のあるポリペプチドはどんな組織や種にも固有であり、同様に生物学的活性は多くの生物学的分析法において特徴付けられる。ここでBIDに言及すると、好ましくはSEQ ID NOS:3-6ポリペプチドの一つ、あるいはそのようなBIDポリペプチドの一つをコード化するbidポリヌクレオチドを少なくとも85%保存しているBIDポリペプチドを含むことであり、さらに好ましくは、SEQ ID NOS:3-6ポリペプチドの一つ、あるいはそのようなBIDポリペプチドの一つをコード化するbidポリポリヌクレオチド、あるいはSEQ ID NOS:1-3ポリヌクレオチドの一つに少なくとも実質的に85%同じであるbidポリポリヌクレオチドに、少なくとも実質的に85%同じであるBIDポリペプチドであり、もっと好ましくは、SEQ ID NOS:3-6ポリペプチドの一つ、あるいはそのようなBIDポリペプチドの一つをコード化するbidポリポリヌクレオチドを少なくとも90−95%保存しているBIDポリペプチドであり，さらにもっと好ましくは、SEQ ID NOS:3-6ポリペプチドの一つ、あるいはそのようなBIDポリペプチドの一つをコード化するbidポリヌクレオチド、あるいはSEQ ID NOS:1-3ポリヌクレオチドの一つに少なくとも実質的に90-95%同じであるbidポリポリヌクレオチドに、少なくとも実質的に90- 95％同じであるBIDポリペプチドであり、かなり好ましくは、SEQ ID NOS:3-6ポリペプチドの一つ、あるいはそのようなBIDポリペプチドの一つをコード化するb idポリヌクレオチドを100%保存しているBIDポリペプチドであり、一番好ましくは、SEQ ID NOS:3-6ポリペプチドの一つ、あるいはそのようなBIDポリペプチドの一つをコード化するbidポリヌクレオチド、あるいはSEQID NOS:1-3ポリヌクレオチドの一つに少なくとも実質的に100%同じであるbidポリヌクレオチドに、実質的に100％同じであるBIDポリペプチドである。好ましいbidポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1と/あるいはSEQ ID NO:2と/あるいはSEQ ID NO:3に明らかにされているように、自然発生するbidポリヌクレオチドと雑種形成可能である。最も好ましいbidポリヌクレオチドは、かなりの緊縮状態下で自然発生する bidポリヌクレオチドと雑種形成可能である（Sambrookら、MolecuIar Cloning、 2nd Ed．、1989:参考のために引用される）。 ”生物学的に同等”という語は、本発明の成分が同じアポプトーシス促進効果のいくつかあるいはすべてを示すことができることを意味することを意図しているが、人間あるいはマウス起源、あるいは組換え発現症状からの生成物のcDNAライブラリーから確認された配列から誘導されるBIDポリペプチドとして、必ずしも同程度でなくてもよい。 ”実質的に相同である”ことは、どんな種からのBIDポリペプチドと、人間とマウスのBIDポリペプチドの相同性の程度が、タンパク質のBCL-2系統群の以前報告されたメンバーとBIDの間のそれより大きいことを意味している。配列確認あるいはパーセント確認は、2つの配列の間にある同じ残基のパーセントを意味することを意図している。2つの配列がレーザバイオコンピューティングソフトウエアにおけるマルチシーケンスアライメント（DNAスター、INC、マディソン、ワイアイ）のクルトラタル（Clustlal）法（Higginsら、Cabios 8:18 9-191、1992参考にために引用される）を用いて配列されているならば、非人間B IDポリペプチドのパーセント確認を決定する際は人間BIDポリペプチドを参考にし、非BID BCL-2系統群メンバーのパーセント確認を決定する際は人間BIDポリペプチドを参考にする。この方法は多重配列を徐々に実行し、大きく長い配列基は、一連のペアワイズ（pairwise）配列から計算された類似性スコアを用いて組み立てられる。最適なシーケンスアライメントは最大の配列スコアを見つけることから得られる。最大の配列スコアは、一定の進化インターバル（interval）以上での２つの関連したタンパク質において発生する一定のアミノ酸変化の可能性を表す、残基ウエイトテーブル（weight table）から求められた配列内の分離した残基間のすべてのスコアの平均である。配列におけるオープニング（opening）とレングスニング（lengthening）のペナルティはスコアに寄与する。このプログラムで用いられるデフォルトパラメーターは以下のようである。多重配列のギャップペナルティは10である。多重配列のギャップレングス（gap length）ペナルティは10である。ペアワイズ配列におけるk-タプル（k-tuple）値は1である。ペアワイズ配列におけるギャップペナルティは3である。ペアワイズ配列におけるウインドゥ値（window value）は5である。ペアワイズ配列において保存されたダイアゴナル（diagonals）は５である。配列プログラムに使用された残基ウエイトテーブルはPAM250である（Dayhoffら、Atlas of Protein Sequence and S tructureにおけるDayhoff、Ed．、NBRF、ワシントン、Vol.5、suppl.3，p.345、 1978参考のために引用される）。パーセント保存は、同じ残基のパーセントを2つの残基は保存置換を表す位置のパーセントに足すことにより前記配列から計算される（PAM250残基ウエイトテーブルにおいて0.3と同等あるいはそれ以上の対数奇数値を有するとして定義される）。保存は確認比較のために、前記したように配列を参考にする。保存性のアミノ酸はこの要求を満足させながら変化する。R-K;E-D，Y-F，L-M;V-I，Q-H。マウスBIDポリペプチドと人間BIDポリペプチドの間の相同性の程度は72.3%と確認された。すべてのBIDポリペプチドオルソログは人間BIDポリペプチドと少なくとも約65%と確認されていると信じられている。 BIDポリペプチドはさらに、BIDポリペプチド誘導体を含むことができる。その誘導体は融合タンパク質とBIDフラグメントを含むBIDの雑種と修飾形を含むことを意図する。雑種と修飾形においては、あるアミノ酸が欠損あるいは置換され、雑種あるいは修飾形がBIDの生物学的活性を持続させることに関する限り、一つあるいはそれ以上のアミノ酸が、修飾されたアミノ酸や普通でないアミノ酸と糖鎖形成のような修飾へ変化する。生物学的活性を持続することは、細胞死はBIDポリペプチドにより誘発されることを意味しているが、具体的には組換え的に形成された人間やマウスで確認された自然発生するBIDポリペプチドと同じレベルの効力を必ずしももっていなければいけないことはない。実質的に相同性であるという意味にはさらに、BIDポリペプチドが、抗体とゲノミックDNA、mRNAやここで記述されたBIDポリペプチドあるいはゲノミックあるいはサブゲノミックヌクレオチド配列やここのBIDポリヌクレオチドやそのフラグメントのcDNAの相補的配列との雑種形成から分離されたcDNAを含む、ヌクレオチド配列をコード化するものと、交差感受性により分離されたBIDポリペプチドを含むことである。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者には、変性DNA配列は人間BIDポリヌクレオチド配列をコード化することができ、これらはさらに本発明内にBIDの対立変種として含まれることを理解できるであろう。全長のBIDあるいはそれのフラグメントやそれの類似体をコード化するポリヌクレオチドは、コード化されたポリペプチド生成物が生成するように、転写（配列発現）と配列コード化の翻訳を促進する配列を含む。そのようなポリヌクレオチドの構成はManiatisらによりさらに記述されている（Maniatisら、Molecular Cloning:A Labo-ratory Manual、2nd Ed．、1989、Cold Spring Harbor、N.Y.参考のために引用される）。例えば、しかし限定されないが、そのようなポリヌクレオチドは促進物質、転写末端部位（真核性発現宿主におけるポリアデニレーション部位）、部位に結合したリポゾームと、または真核性発現宿主における使用のエンハンサーやベクターの複製に必要な配列を含むことができる。典型的な真核性発現カセットは、HSV tk促進物質やpgk（ホスホグリセラートキナーゼ）促進物質のような促進物質の下流（つまりポリヌクレオチド結合の翻訳のリーディングフレームの配向において）に結合する、またはエンハンサーと下流ポリアデニレーション部位（例えば、SV40 ラージT AgポリA付加部位）へ結合するBIDポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含むであろう。好ましくは、BIDポリペブチドのアミノ酸配列が一定の順序で起こり、他の介在と/または末端配列から成る。概してそのようなポリペプチドは長さで1000以下のアミノ酸から成り、より普通には長さで約500以下のアミノ酸から成り、しばしば長さで約194のアミノ酸から成る。遺伝暗号の変性によりこれらのアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチド配列の有限なセットが得られる。変性配列のこのセットは、手であるいは商業的に入手可能なソフトウエアを利用したコンピュータにより容易に作り出せる。分離されたBIDポリヌクレオチドは特徴的には、長さにして約10,000のヌクレオチド以下である。さらに、ポリペプチドの発現が望まれていないところでは、本発明のポリヌクレオチドは機能性タンパク質をコード化する必要はない。本発明のポリヌクレオチドは、雑種形成プローブと/あるいはBID RNAやDNA配列を検出するPCRプライマーとしての役目をする。 BIDポリヌクレオチドは、例えば20-100の塩基長のような、雑種形成プローブと/あるいはPCRプライマーとしての使用のような、短いオリゴヌクレオチドである。BIDポリヌクレオチド配列は、大きなポリヌクレオチド、例えばBIDクローンから成るクローニングベクターの一部からも成り、ポリヌクレオチド結合により、融合タンパク質の発現をコード化するための異なったタンパク質（例えば、グルタチオン、s−トランスフェラーゼあるいはβ-ガラクトシダーゼ）をコード化する、別のポリヌクレオチド配列の形に融合される。特徴的には、BIDポリヌクレオチドは少なくとも25の連続した、実質的に自然発生したBID配列と同じであるヌクレオチドから成り、より一般には、BIDぼりヌクレオチドは自然発生するB ID配列と実質的に同じである、少なくとも50から100の連続したヌクレオチドから成る。しかしながら、BIDターゲット配列への特定の雑種形成に要求されるBIDポリヌクレオチドの最小の長さは、いくつかの因子、G/C 含有量、ミスマッチな塩基類（もしあるならば）の位置どり、ターゲットポリヌクレオチドの集団と比較して配列の一義性の程度と、他の因子の中でのポリヌクレオチドの化学的性質（例えばメチルホスフェイト骨格、ポリアミド核酸、ホスホロチオレートなど）に依存するであろう。 BIDあるいは関連するBCL-2系統群メンバーに関してここで使用しされる”自然発生する”という語は、自然に発見されると生体内（ウイルスを含む）に存在しているポリヌクレオチドあるいはポリペプチドを意味しており、必ずしも別々にあるいは分離された形ではなく、自然界の資源から分離されることができ、研究室において人間により意図的に修飾されていないことである。 BIDポリヌクレオチドは、Leu-Ala-Glu-Xaa₁-Gly-Asp-Xaa₂-Met-Asp配列、ここでXaa₁はIleあるいはValであり、Xaa₂はGluあるいはSer（SEQ ID NO:7）であり、から成るBH3ドメインポリペプチドをコード化する配列を含む。人間BIDポリヌクレオチドは、BH3ドメインLeu-Ala-Glu-Val-Gly-Asp-Ser-Met-Asp（SEQ ID NO: 8）をコード化する配列を含むことが好ましい。本発明の好ましいBidポリヌクレオチドは以下の配列から成る。さらに、BIDポリヌクレオチドは以下のものから成る群から選ばれた１つあるいはそれ以上の配列から成る。好ましいBIDポリヌクレオチドは一定の配列間にスペーサーポリヌクレオチドなるなしで、一定の順序の上記配列のすべてから成る。上記の配列は、自然発生するBID配列と雑種形成するのに適した雑種形成プローブとして利用することもできる。 BIDポリペプチドは、1つあるいはそれ以上のBIDエピトープから成る隣接したアミノ酸の配列を含むこともある。好ましいBIDエピトープは以下のものである。 BIDのゲノミッククローン、特にマウスBID遺伝子は、少なくとも1つの機能的に分離されたBID対立遺伝子を有する細胞と遺伝子導入非人間動物を作り出すために、相同性のあるターゲット構成物を組み立てるために利用される。相同性のターゲット構成物を組み立てるための誘導は、従来技術で知られている。相同性ターゲットは”ノックオウト”マウスを作り出すために利用され、このマウスは不活性化された対抗遺伝子のため異種接合あるいは同種接合である。そのようなマウスは研究用動物として商業的に販売されており、機能的にBIDを置換できる物質のスクリーンするために利用される。そのような物質は新生物と自己免疫疾患の治療において有用である。キメラターゲットマウスはHoganら（Hoganら、Manipulating t he Mouse Embryo:A LAboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1998 参考のために引用される）とRobertson（Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach、E.J Robertson、Ed．、IRL Press、Washington 、D.C.、1987）に従い誘導される。両方とも参考のために引用される。胚幹細胞は従来技術において知られている手順に従い操作される（Id．、Zjilstraら、Na ture 342:435、1989;とSchwartzbergら、Science 246:799参考のために引用される）。さらに、BID cDNAやゲノミック遺伝子コピーは、BIDポリペプチドを、高いレベルと/あるいはBID遺伝子に隣接して自然には発生しない転写コントロール配列の転写コントロール下で発現させるための遺伝子導入を組み立てるために利用される。例えば、構成成分である促進物質（例えばHSV-tkやpgk促進物質）や特定の転写調節体配列の細胞系列（例えばCD4やCD8遺伝子促進物質/エンハンサー）は、ポリヌクレオチド配列をコード化するBIDと結合し、遺伝子導入体を作る。（典型的にはネオ遺伝子発現カセットのような選択可能なマーカーと組み合わせる）。そのような遺伝子導入体は、造血幹細胞と遺伝子導入細胞と従来の方法に従い得られることができる遺伝子導入非人間動物のような細胞へ導入される。遺伝子導入細胞と/あるいは遺伝子導入非人間動物は、病気のモデルを作り出し、例えばAIDS、老化、神経変性病気、虚血性レパーフェージョン細胞死、不妊症、創傷治癒などを含む免疫不全病気のようなBIDの過剰発現や不適当な発現に関係する病気を治療する作用物質のスクリーンに利用される。 BIDの過剰発現あるいは不適当な発現に関連する病気の治療において、細胞により生産されるあるいは発現されるBIDの量を調節あるいは減少させることが望ましい。そのような病気の状態において、BIDを調節あるいは減少させる治療が用いられる。そのような治療は、ポリクローナルあるいはモノクローナルや、BI Dあるいは内因性BID活性に逆らうBIDの突然変異体に結合し中性化する物質の使用のいずれかにより、BID発現やBID抗体の使用を調節するアンチセンスポリヌクレオチドの投与を意味する。よって、本発明の別の面では、分離され精製されたBIDアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つあるいはそれ以上のBIDアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することからなる細胞によるBID発現のレベルを減少させることに利用される方法に沿って提供される。BIDアンチセンスオリゴヌクレオチドにより、BID発現が減少されるようにBID発現において関係する特定の相補的核酸配列を有する塩基対を通して、相互作用するヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオへ参考にされる。好ましくはBID発現のおいて関係する特定の核酸配列は、BIDをコード化するゲノミックDNA分子やmRNA分子である。このゲノミックDNA分子は、BID遺伝子の調製領域やBIDポリペプチドのための暗号配列から成る。BIDアンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列に相補的であるという語とその方法は、細胞内での配列への雑種形成を可能にするような、つまり生理学的な状態下で、配列に十分相補的であることを意味する。好ましくはBIDアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約8から約100のヌクレオチドを含む配列から成り、より好ましくはBIDアンチセンスオリゴヌクレオチドは約15から約30のヌクレオチドから成る。BIDアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば核酸塩基と/あるいは糖類などを修飾させた核酸間のつながりのようなヌクレオチド分解への抵抗を与えるいろいろな修飾を含む誘導体をも包含する（UhlmannとPeyman、Chemical Reviews 90:543-584、1990;SchneiderとBanner、Tetrahedron Lett 31:335、1990;Millig anら、J Med Chem 36:1923-1937、1993;Tsengら、Cancer Gene Therap1:65-71、 1994;Millerら、Parasitology 10:92-97、1994参考のために引用される）。そのような誘導体は、モルホリノ、ペプチド核酸類似体とジチオエート繰り返し単位だけでなくホスホトリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホナート、ホスホラミデート、ホスホロジチオエートとホルムアセタールのようなものを含むが、骨格修飾に限定されるわけではない。本発明のBIDアンチセンスポリヌクレオチドはAIDS、老化、神経変性病気、虚血性レパーフュージョン細胞死、不妊症、創傷治癒などを含む免疫不全病気の治療におけるようなBIDの過剰発現やBIDの不適当な発現を治療するのに用いるとこができる。そのような治療は細胞の半ビボ治療をも含むことができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、個々の造血幹細胞集団のすべてあるいは一部分を再形成させるために用いられる遺伝子導入された多能性造血幹細胞のような形質移入された細胞あるいは遺伝子導入された細胞内の異種発現カセットから作り出される。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、生体外の培養媒質中あるいは生体内の循環系や細胞間液中のいずれかの外部環境に投与された溶解性オリゴヌクレオチドから成る。外部環境に存在する溶解性アンチセンスポリヌクレオチドは細胞質に接近でき、特定のmRNA種の翻訳を抑制することが示されてきた。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを含むBIDポリペプチドとポリヌクレオチドは、分離され精製された形で提供される。”純粋形”や”精製された形” や”実質的に精製された形”は、BIDポリヌクレオチドやBIDポリペプチドのような目的種は、実質的に目的種ではない他の物質が存在しないことを意味する。一般に、実質的に純粋な成分は、成分中に存在するすべての高分子種の約80から90 パーセント以上から構成されているであろう。最も好ましくは、目的種は、従来の検出方法により不純物質が成分中に検出されないように、本質的に均質であるように精製され、この場合成分は本質的には単一高分子種から成っている。溶解性種、小さい分子（500ダルトン以下）と元素のようなイオン種は高分子種とは考えられていない。好ましい人間BIDは、適当に形質転換された宿主細胞において人間BIDポリペプチドをコード化するDNA配列の発現により作り出される。公知技術の方法を用いることにより、BIDをコード化するDNAは発現ベクターに結合され、宿主細胞と形質転換された細胞によるBIDポリペプチドの発現に適する確立された状態へ形質転換される。適当な発現ベクターは、例えば、啼乳類発現ベクターｐCB6（Brewer、Meth Ce ll Biol 43:233-245、1994参考のために引用される）やE.coli pET発現ベクター、具体的にはpFT-30a（Studierら、Methods Enzymol 185:60-89、1990参考のために引用される）の双方ともここでは使用されるが、のような組換え人間BIDポリペプチドを作り出すために利用される。哺乳類と細菌細胞における発現用の他の適した発現ベクターは、イーストや昆虫細胞中で使用される発現ベクターとして従来技術において知られている。バキュロウイルス発現系も利用される。BID ポリペプチドは、化学合成や生体外でのポリヌクレオチド鋳型を用いた転写システムや、生物学的サンプルからの分離によっても調製される。ペプチドの化学合成は、例えば固相ペプチド合成の古典的なメリフェルド法や（Merrifeld、J Am Chem Soc 85:2149、1963参考のために引用される）、高速自動多重ペプチド合成システムのFMOCストラテジー（DuPontCompany、Wilmington、DE）（CaprionとHa n、J Org Chem 37:3404、1972参考のために引用される）により実施される。 BIDポリペプチドのフラグメントや類似体も作り出される。BIDポリペプチドのフラグメントはアミノ末端と/あるいはカルボキシ末端の欠損しているポリペプチドであるが、全長のBIDポリペプチドの配列における相当する位置は同じであるアミノ酸配列を残している。フラグメントは少なくとも10のアミノ酸長を有し、好ましくは少なくとも20のアミノ酸長を有し、最も好ましくは少なくとも50のアミノ酸長あるいは全長の自然発生するBIDポリペプチドの長さまでの長さを有する。”類似体”、”突然変異タンパク質”や”突然変異体”という語は、ここでは自然発生するタンパク質のある部分と実質的に同じである少なくとも10のアミノ酸の部分からなるポリペプチドのことを言う。典型的には、類似体ポリペプチドは自然発生する配列に関して保存性のあるアミノ酸の置換（あるいは付加や削除）から成る。特徴的には、類似体は少なくとも20のアミノ酸長であり、好ましくは少なくとも50のアミノ酸長あるいは自然発生する全長のBI Dポリペプチドの長さまでの長さである。 BIDポリペプチドあるいはそれのエピトーブへのポリクローナルあるいはモノクローナル抗体は、BIDポリペプチドの過剰発現や不適当な発現を治療するときの使用、あるいはBIDポリペプチドを検出するイムノアッセイ法に使用するために作り出される。エピトープにより、ポリペプチドの抗原決定基が参考にされる。エピトープは、エピトープに独自である空間的配置に3つのアミノから成る。一般に、エピトープは少なくともそのような5つのアミノ酸を含む。典型的には、エピトープはポリペプチドの特定領域が水溶性に基づく環境にさらされやすくなるように、親水性のアミノ酸を含む。さらに、BIDポリペプチドへの抗体はここで確認されたBH3ドメインのような保存された領域を含むオリゴペプチドに対して培養される。 BIDポリペプチドやそれのエピトープの調製方法は、化学合成、組換えDNA技術や生物学的サンプルからの分離のようなポリペプチド合成用の公知技術の方法により可能である。ポリクローナル抗体は抗原を注入し、その後適当な時間をおいて追加抗原することによるラビットあるいは他の動物を免疫することにより調製される。動物は出血し、細胞中のアポプトーシスを加速させる能力に基づくELISAあるいは生物検定法により、通常の精製されたBIDポリペプチドに対してセラアッセイ（sera assay）された。モノクローナル抗体は、骨髄腫やリンパ腫細胞のようなたえず複製する腫脹細胞で免疫されたマウスから融合したスプレノサイト（splenocytes）により、MilsteinとKohlerの方法後に調製された（MilsteinとK ohler Nature 256:495-497、1975;GulfreとMilstein、Methods in Enzymology:I mmunochemical Techniques 73:1-46、LangoneとBanatis eds.、Academic Press 、1981参考のために引用される）。そのように形成された雑種細胞はそれから限定希釈法によりクローン化され、上澄み液はEISA、RIAや生物検定法により抗体生成の分析が行われた。ターゲットポリペプチドを認識し特別に結合する抗体の独特な能力は、BIDポリペプチドの過剰発現や不適当な発現を治療する手法を提供する。よって、本発明の別の面はBIDポリペプチドへの特定の抗体を有する患者の治療により、BIDポリペプチドの過剰発現に関する病気の予防や治療の方法を提供する。ポリクローナルとモノクローナルのいずれにしろ、BIDポリペプチドへの特定の抗体は、前記議論したように公知技術の適当な方法により作り出すことができる。例えば、マウスあるいは人間モノクローナル抗体は雑種細胞技術により作り出すことができ、あるいは、BIDポリペプチドや、それの免疫学的に活性なフラグメントや、アンチ-イディオタイプ抗体や、それのフラグメントは、BIDポリヌクレオチドを認識し結合可能な抗体の生産を誘発するために、動物へ投与される。そのような抗体は、IgG、IgA、IgM、IgD、とIgEに限定されないが、鳥類種の場合はIgYや抗体のサブクラスから成る抗体のクラスを含む。小さい分子はBIDポリペプチドへ結合することによりアンチ-BID抗体の効果を模倣できる。そのような小さい分子は、BAXやBCL-2やBCL-X_LのようなBCL-2の系統群メンバーの類似体あるいは一部分のフラグメントや全配列や、BH1ドメイン突然変異を有する突然変異タンパク質のような小さいポリペプチドであり、突然変異タンパク質の場合、アポプトーシスにはほとんどあるいは全く効果がない。しかしながら、類似体やフラグメントや突然変異タンパク質は細胞によって作り出されたBIDポリペプチドへ結合することができ、それによってBIDの死アゴニスト活性を減少させる。さらにBIDポリペプチドには、BID突然変異タンパクはアポプトーシスにはほとんどあるいは全く効果はないが、BCL-2 系統群メンバーパートナーと結合でき、細胞により作り出されたBIDポリペプチドの結合を妨害し、それによって細胞内でのBIDの死アゴニスト活性を調節するようなBH3ドメイン内での突然変異がある。アポプトーティック状態あるいはアンタゴニストBIDポリペプチドを導き出すB IDポリペプチドの生物学的性質を有する非タンパク質物質も作り出される。ペプチド模倣の展開の技術は公知技術である（例えば、NaviaとPeattie、Trends Pha rm Sci 14:189-195、1993;Olsonら、J Med Chem 36:3039-3049参考のために引用される）。典型的には、この方法はＸ線結晶構造解析や核磁気共鳴技法を用いたタンパク質リガンドだけでなくタンパク質ターゲット部位の確認と特性に関係する。BIDポリペプチドのアミノ酸配列と必要とされるBH3ドメインは確認された。コンピュータ化された分子モデリングに沿ってこの情報を用いて、ファーマコホア（pharmacophore）仮定が展開され、化合物が作られ、分析システムにおいてテストされた。本発明のBIDポリペプチドは、標準的な放射リガンド分析システムを用いて、B IDの特定の系統群メンバーへ結合するアゴニストあるいはアンタゴニストのいずれとしても役目をするための、BCL-2系統群メンバーへの連結あるいは結合可能な非タンパク質成分だけでなく、新しいポリペブチドを検出するのに使用可能である（例えば、BylundとToews、Am J Physiol 265:L421-429、1993参考のために引用される）。これは標準的な方法に従い³Hや¹²⁵Iのいずれかを用いて、系統群メンバーへ結合可能なBIDポリペプチドあるいはそれのフラグメントの放射標識化された形をまず調製することにより実施された。例えば、Bolton Hunter試薬が利用できる（ICN ケミカルズ、ラジオアイソトープ部門、アービン、シーエイ）。標準的なELISA スタイルのプレート分析のような基板に固定されたBCL-2系統群メンバー（例えばBAX）へ、放射標識化されたBIDリガンドが結合する。それから結合したものと /あるいはフリーな放射標識されたリガンドの量が測定された（例えば、Slackら、BioTechniques 7:1132-1138、1989;Dowerら、J Immunol 142:4314-4320、1989 参考のために引用される）。あるいは、BCL-2系統群メンバーが放射標識化され、BIDポリペプチドが基板に固定された。この手法の変形において、結合分析法が溶解性の非固定BIDポリペプチドとBCL-2系統メンバーで行われた。テスト化合物の添加により放射標識化されたBIDリガンドのBCL-2系統群メンバーへの結合の競争阻害が、標準的な分析方法により評価された（例えば、Rovati、Pharmacol Res 28:277-299、1993参考のために引用される）。本発明はBIDポリペプチドへ結合するポリペプチド配列を確認するためのイーストトゥーハイブリッド分析システムに基づく方法とキットをも提供する（Chie nら、PNAS USA 88:9578、1991参考のために引用される）。この手法は転写活性化物質であるイーストGAL4転写タンパク質の再形成による生体中でのタンパク質 -タンパク質相互作用を確認する。2つの雑種タンパク質、1つは既知のタンパク質のポリペプチド配列へ融合されたドメインにイーストGAL4 DNAが結合したものから成り、もう1つは第2のタンパク質のポリペプチド配列へ融合されたBal4活性化ドメインから成る、をコード化するポリヌクレオチドは、イースト宿主細胞へ導入され組み立てられた。2つの融合タンパク質間の分子内結合はGal4活性化ドメインを有するGal4 DNA結合したドメインを再形成し、例えばGal4結合部位へ結合可能なlacZのようなレポーター遺伝子の転写活性化を誘導する。典型的には、トゥーハイブリッド方法は既知のタンパク質と相互作用するポリペプチド配列を確認するのに利用される。この分析法における変形は、既知のポリペプチドの突然変異効果の評価と、相互作用する構造的なドメインの確認と、ヘテロ2量体あるいはヘテロ多量体を形成する相互作用のあるタンパク質を確認することに利用される。本発明はBIDタンパク質のトゥーハイブリッドシステムに宿す宿主生体（典型的には単一細胞生体であり、例えばサッカロミセス属セルビシアエ（cervisiae ）のようなイースト細胞。）をも提供し、トゥーハイブリッドシステムは特徴的には、第1の雑種タンパク質、第2の雑種タンパク質とリポーター遺伝子をコード化するポリヌクレオチドの形で存在し、ポリヌクレオチドは安定に複製されるか一過性発現に導入されるかのいずれかである。（1）BAX、BCL-2やBCL-X_Lポリペプチドへ結合可能なBIDの結合フラグメントへ融合されたGAL4 DNA結合ドメイン（あるいはGAL4活性化物質ドメイン）をコード化する発現カセット、（2）cDNAライブラリーのメンバーあるいはBIDポリペプチドへ結合可能なBAX、BCL-2やBCL-X_Lの結合フラグメントへ融合されたGAL4 DNA活性化物質ドメイン（あるいはそれぞれGAL4結合ドメイン）をコード化する発現カセット、（3）シス結合したGAL4転写応答要素から成るリポーター遺伝子（例えばβ−ガラクトシダーゼ）、を包含するイーストは作用物質スクリーニングのために使用できる。そのようなイーストはテスト作用物質と放置され、リポーター遺伝子の発現は決定される。リポーター遺伝子を抑制する作用物質の能力はコントロール培養と比較さて、BID修飾作用物質の候補として作用物質が確認される。イーストトゥーハイブリッドシステムは、BIDに結合するタンパク質をコード化するcDNAの哺乳類cDNA発現ライブラリーをスクリーンするために利用される。本発明は、（1）BIDポリペプチドと転写活性化ドメインから成る第1のハイブリッドタンパク質と、（2）BAX、BCL-2やBCL-X_LポリペプチドとDNA結合ドメイン、宿主細胞と仕様書から成る第2ハイブリッドタンパク質と、を有するトゥーハイブリッドシステムから成るキットをも提供する。あるいは、BIDポリペプチドはDNA結合ドメインと融合されており、BAX,BCL-2やBCL-X_Lポリペプチドが活性化ドメインに融合されていてもかまわない。そのようなキットは、第1と第2のハイブリットタンパク質の間の分子間結合を変化させる能カテストの作用物質のパネルを自由に含んでもよい。本発明は細胞死シグナルがダウンレギュレートされ、病気に侵された細胞が、ここでは減少したアポプトーティック状態と呼ばれる不適当に減少した細胞死性向を呈している病気あるいは病気の状態を治療するのに効果的な量の、BIDポリペプチド、それの誘導体、それの生物学的に活性なフラグメントから成る治療的あるいは薬学的成分をも含む。さらに本発明内には、BIDポリペプチドの治療的に効果的な量を投与することから成る方法も含む。これらの成分と方法は、例えば細胞死規制のダウンレギュレーションから生じる癌、他のリンパ増殖性状態、関節炎、炎症、自己免疫疾患などのような多くの病気治療にとって有用である。治療は病気に侵された半ビボ細胞への投与をも含む。本発明の治療的や薬学な成分は、例えば静脈、皮下、筋肉内、トランスダーマル（transdermal）、くも膜下、大脳内を含む公知技術の適当なルートにより投与されることができ、半ビボでの治療プロトコールでの細胞への投与も可能である。投与は注射により速くあるいは時間をかけてゆっくりと注入するのいずれの方法でもよく、またはゆっくりと放出する配合物の投与でもよい。中枢神経システムの組織の治療では、投与は髄液（CSF）へ注射あるいは注入により行われる。BIDポリペプチドが中枢神経システムヘ投与されたなら、血液脳関門を横切ってBIDポリペプチドの浸透を促進可能にする1つあるいはそれ以上の作用物質とともに投与できる。 BIDは、望ましい薬学的あるいは薬理学的な性質を有する作用物質と結合あるいは接合させることもできる。例えば、トランスフェリンレセプターへの抗体や静脈へ注射による投与のような血液脳関門を横切って浸透あついは輸送を促進する従来技術で既知の物質とBIDを結合されることもできる（例えば、Fridenら、Science 259:373-377、1993参考のために引用される）。さらに、溶解性、安定性、半減期と他の薬学的に有利な性質を得るためにポリエチレングリコールのようなポリマーと安定に結合させることができる（例えば、Davisら、Enzyme Eng 4:169-73、1978;Burnham、Am J Hosp Ph arm 51:210-218、1994参考のために引用される）。さらに、BIDポリペプチドは細胞のシトゾルへの運搬においてその成分内に酸を有することができる。例えば、ペプチドを細胞のシトゾルへペプチドを運搬可能とするリポソームのようなキャリア部分と接合できる。そのような方法は従来技術ではよく知られている（例えば、Amselemら、Chem Phy Lipids 64:219-237 、1993参考のために引用される）。あるいは、BIDポリペプチドは特定の一過性ペプチドを含むように修飾される、あるいはBIDポリペプチドを細胞内へ運搬可能なそのような一過性ペプチドと融合させることができる。さらに、ポリペプチドは顕微注射により直接細胞へ運ぶこともできる。成分は通常の薬学的調製の形で利用される。そのような調製は薬学的な技術においてよく知られて方法で行われる。1つの好ましい調製は、生理学的塩類溶液の媒体を利用し、他の無毒塩の生理学的濃度、5%のグルコース水溶液、無菌水などのような他の薬学的に許容なキャリアも使用可能であると予想される。成分中には適当な緩衝液が存在していることも好ましい。好ましくは、そのような溶液は凍結乾燥され、すぐに注射に使えるように無菌水を添加して再構成がいつでもできるように無菌のアンプル中に保存される。主な溶媒は水溶性であり、あるいは非水系である。治療に必要とされる組織へ移植可能な生物学的に相溶性のある固体あるいは半固体のマトリックスへ、BIDを組み込むことも可能である。配合物のpH、重量モル濃度、粘度、透明度、色、不稔性、安定性、溶解速度や臭気を変更あるいは維持するために、キャリアは他の薬学的に許容な賦形剤を含むこともできる。同様に、キャリアは血液脳関門を横切って放出や吸収や浸透を変更維持できるさらに他の生物学的に許容な賦形物を含む。そのような賦形物は、１回の投与量や多投与形式のいずれにおいての非経口投与や、絶えずあるいは定期的に直接注入での投与量を調製するために、通常慣習的に利用されている物質である。投与配合と用いた投与ルートの薬理学的なパラメーターに依存して、投与量は繰り返えされる。 BIDポリペプチドやそれのフラグメントを含むある調合は経口的に投与されるべきであると予想される。そのような調合は、好ましくはカプセル化され、固形投与の形で適当なキャリアと配合される。適当なキャリア、賦形物と希釈剤のいくつかの例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、珪酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチルーとプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウム、ステアレート、水、ミネラルオイルなどである。調合には他に、潤滑剤、加湿剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、加糖剤や着香剤を含むことができる。迅速に持続させ、あるいは従来技術でよく知られている手順を利用することにより、患者へ投与後の活性成分が遅れて放出させるように、成分は配合される。配合にはタンパク分解を減少させる物質と/あるいは、例えば界面活性剤のような吸収を促進させる物質も含む。特定の投与量は、患者のおおよその体重、体表面積や空間を占める体の体積に従い計算される。投与量はさらに選択された投与の特定なルートにも依存して計算される。さらに治療のための適当な投与量を決定するのに必要な計算の改善が、本発明の属する技術分野における通常の知識を者によって日常的に行われる。そのような計算は、ここで明らかにされたターゲット細胞の分析における活性を考慮して、本発明の属する技術分野における通常の知識を者による不当な実験によってではなく求めた。正確な投与量は、標準的な投与応答研究と共に求めた。実際に投与された成分の量は、治療すべき状態、投与した成分の選択、年齢、個々の患者の反応、患者の症状の厳しさ、選択された投与のルートを考慮して、開業医により求められると理解できるであろう。本発明の1つの具体例において、BIDポリヌクレオチドは患者のベクターへあるいはBIDやBID前駆体の生物学的活性な形、つまり体により容易に生物学的活性な形へ変換可能な分子、を作り出すことが可能な細胞への移植により、治療的に投与された。１つの手法において、BIDを隠した細胞を患者に移植するために半透過性膜にカプセル化させた。細胞は正常にBIDあるいはその前駆体を発現し、BID あるいは生物学的に活性なそのフラグメントやその前駆体を発現させるように変質された。患者は人間の場合には細胞は人間起源の細胞であり、BIDポリペプチドは人間起源のBIDであることが望ましい。しかしながら、ここでの配合と方法は人間への応用だけでなく、家畜病治療へも利用でき、”患者”という語はここでは人間と獣医の患者を含むように意図される。多くの環境において、患者内に存在するBIDポリペプチドのレベルを求めることが望ましい。BIDポリペプチドは多くの組織により発現されることを示した本報告に沿ってBIDを確認することにより、BIDが存在することは細胞死の調節に関連した正常な生理的機能の役目をするという結論の根拠を与えた。細胞死がアップレギュレーティッドである、あるいはダウンレギュレーティッドであるのいずれであろうと、内因的に作り出されたBIDポリペプチドは、ある病気の状態においても役割を果たす。 BIDが腎臓、脳、脾臓、肝臓、睾丸や肺で発現されたと仮定すると、BIDのレベルは多くの状態により変化し、しかもBIDレベルの数量化は臨床的に有用な情報を提供するであろう。さらに、ここで細胞により発現されたBIDのレベルが増加することは、生存率が減少させる細胞死調節機構に変化することが示されたので、細胞あるいは組織や新生物などの細胞のグループにおけるような細胞類におけるBIDレベルの測定は細胞あるいは細胞類のアポプトーティック状態に関する有用な情報を提供すると信じられる。さらに、BIDは関係するBCL-2系統群メンバー、特にBAXとさらにBCL-2とBCL-X_Lと相互作用するので、これらのBCL-2系統群メンバーと相互作用するBIDの細胞内でのレベルを求めることも望まれている。さらに病気状態の治療において、BIDを含む成分が外因的に投与され、セラ内で望ましい組織区画や病気に侵された組織内のターゲットBIDポリペプチドのレベルを得ることが望まれる。よって、患者内や患者から得られた生体組織検査サンブルを含む生物学的サンプル内において、BIDポリペプチドのレベルをモニターすることは望ましく、ある場合には、BAXのレベルもモニターし、ある環境ではBCL-2とBCL-X_Lをもモニターすることが望ましい。従って、本発明は患者からのサンプルにおけるBIDの存在を検出する方法をも提供する。ここで患者内のBIDの存在を検出するという文脈で用いられる”検出”という語は、BIDの量や患者内のBIDの量を発現する能力を求めること、関連するBCL-2 系統群メンバーからBIDを区別すること、BIDと回復の見通しに関係する病気の予想される結果に関する予後の見積ること、病気の状態の尺度としてある期間の時間に渡ってBIDレベルをモニターすること、患者にとって好ましい治療的生活規制を決定するBIDレベルのモニターすること、を含む。患者内のBIDの存在を検出するためには、患者からサンプルを得る。サンプルは生体組織検査サンプルであり、血液、血漿、血清、CSFなどのサンプルである。BIDは腎臓、脳、脾臓、肝臓、睾丸や肺や新生物のような病気の組織からだけでなくこれらの組織から取り出されたBIDを検出するためのサンプルを含む多くの種類の組織で発現される。BIDポリペプチド周辺のレベルを評価するとき、サンプルは血液から得られた細胞や、血漿や血清のような細胞のないサンプルである。ある例では、BID遺伝子が患者内や組織内や患者内の細胞系列内で、あるいは患者から得られ半ビボを維持した状態で無傷であるかどうかを決めることが望ましい。無傷のBIDとは、点突然変異、欠損、挿入、染色体切断、染色体再配列などのような遺伝子における変質がないことを意味し、そのような変質はBIDの生産やその生物学的活性、安定性などを変化させ、病気の過程や細胞死の抑制への感受性に変化をもたらす。よって、本発明の１つの具体例において、BID遺伝子における変質の検出と特性を決定する方法を提供する。その方法はBID cDNA、ゲノミックDNAやそれのフラグメントやそれの誘導体を含むオリゴヌクレオチドを提供することから成る。オリゴヌクレオチドの誘導体とは、誘導されたオリゴヌクレオチドは、BID遺伝子と雑種形成して誘導されたものからの配列と誘導された配列が十分相補的な配列である配列と、実質的に同じであることを意味している。誘導されたヌクレオチド配列は、必ずしもヌクレオチド配列から物理的に誘導されたわけではなく、例えば化学合成やDNA複製や逆転写や転写を含む方法で作り出されてもかまわない。典型的には、患者のゲノミックDNAは患者からの細胞サンプルから分離され、例えばTapIとAluIのような1つやそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化される。従来技術としてよく知られているサザンブロットプロトコールを用いて、患者あるいは患者内の特定の組織は無傷のBID遺伝子を持っているか、あるいはBID 遺伝子に異常があるかどうかを、この分析法により決定できる。 BID遺伝子への雑種形成は、1本鎖DNAを得るために染色体DNAが変性すること、 1本鎖DNAとBID遺伝子配列と関連した遺伝子プローブと接触させることと、少なくとも人間BID遺伝子の1部分を含む染色体DNAを検出するために雑種形成されたDNA−プローブを確認すること、を意味している。ここで用いられている”プローブ”という語は、ターゲット領域の配列とプローブ配列の相補性のために、ターゲット配列を有する雑種構造を形成するポリヌクレオチドから成る構造と関係がある。プローブとして利用に適するオリゴマーは、ターゲット配列と相補的である最低約8−12の隣接するヌクレオチドを含み、好ましくは最低でも約20のヌクレオチドを含む。本発明のBID遺伝子ブローブはDNAやRNAオリゴヌクレオチドであり、例えば切除、転写や化学合成のような従来技術として知られている方法でも作られる。例えば放射性や蛍光性標識や酵素的マーカーのような従来技術として知られている検出可能な標識で、プローブは標識化される。プローブの標識化はPCR、ランダムプリミング、末端基標識化、切れ目翻訳などのような、従来技術で知られている方法で達成できる。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、標識化されたプローブを用いない他の方法が雑種形成を決定するのに利用できることは認識できるであろう。サザンブロット、生体内での雑種形成での蛍光や PCR増幅による1本鎖構造の染色体の多型を含む方法の例は、雑種形成を検出するのに利用される。典型的には、雑種形成は25-45℃で、好ましくは32-40で、より好ましくは37-3 8℃で行われる。雑種形成に必要な時間は約0.25から約96時間、好ましくは約1から約72時間、より好ましくは約4時間から約24時間である。 PCR法とBID遺伝子内の側面に立つあるいは横たわっているプライマーを用いて、BID遺伝子異常は検出もされる。PCR法は従来技術においてよく知られている。簡単に言えば、BID遺伝子内にあるターゲット配列の側面にあり、ターゲット配列を増幅する核酸配列と雑種形成可能な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いることで、この方法は実施される。ここで使用される”オリゴヌクレオチドプライマー”という語は、約8から約30の塩基の長さの範囲にわたる短い鎖のDNAあるいは RNAのことを言う。特徴的には、上流と下流のプライマーは長さで約20から約30 の塩基対から成り、ヌクレオチド配列の複製のフランキング（flanking）領域へ雑種形成する。2本鎖DNA分子を作り出すために、デオキシヌクレオチドトリホスフェートやヌクレオチド類似体存在下で、DNAポリメラーゼにより重合が触発される。それから2本鎖は物理的、化学的や触媒的な変性方法により分離される。一般には、物理的変性の方法は、核酸を典型的には約80℃から105℃で約1分から約10分間の範囲で加熱することにより行われる。その過程を望ましい回数繰り返される。プライマーは増幅されるDNAの鎖と実質的に相補的であるように選択される。よって、プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、増幅される鎖と選択的に雑種形成するのに十分に相補的でなければならない。 PCR増幅後、BIDポリヌクレオチドやそれのフラグメントから成るDNA配列はそれから直接配列され、活性や発現などが変化する変性を確認するために、ここで明らかにされた配列との比較から分析された。別の具体例では、BIDの検出方法はBID遺伝子を発現する以下の例2で確認された組織のようなBID遺伝子を発現する組織の分析に基づいて提供される。この方法は、ポリヌクレオチドが正常にBID遺伝子を発現する組織のサンプルからのmRN Aと雑種形成することから成る。サンプルはBID遺伝子あるいは特定の細胞のBID 遺伝子に異常を有している疑いのある患者から得られた。 BIDポリペプチドをコード化するmRNAの存在を検出するために、患者からサンプルは得られた。サンプルは血液あるいは生体組織検査サンプルから得られた。サンプルはそれの中に含まれる核酸を抽出するための処理された。サンプルから得られた核酸はゲル電気泳動や他のサイズ分離技術の処理を受けた。サンプルのmRNAは、雑種ニ重鎖を形成するプローブとして働くDNA配列と接触させた。前記議論されたような標識化されたプローブを用いることにより、結果生成するニ重鎖の検出を可能とする。プローブとしてBIDポリペプチドをコード化するcDNAあるいはcDNAの誘導体を用いるときは、間違った陽性反応、実際には無傷であり機能するBID遺伝子が存在していないのに雑種形成とBIDヌクレオチドの見かけ上の検出、を防ぐためにかなりの緊縮条件が利用される。BID cDNAから誘導された配列を用いたとき、それほどの緊縮状態は利用されないが、間違った陽性反応の可能性のためあまり好ましい手法ではない。雑種形成の緊縮は、雑種形成中と温度、イオン強度、時間の長さとホルムアミドの濃度をふくむ洗浄手順中の多くの要因により決定される。これらの要因は、例えばSambrookらに概説されている（Sambrookら、1989、上記引用文献）。 BIDポリペプチドをコード化するmRNAのサンプルにおける検出感度を増大させるために、逆転写/ポリメラーゼ連鎖反応（RT/PCR）技法がBIDポリペプチドをコード化するmRNAから転写されたcDNAを増幅するために利用された。PT/PCR法は従来技術としてよく知られている。 PT/PCR法は以下のように実施される。全細胞RNA、例えば標準的なグアニジウムイソチオシアネート法により分離され、全RNAは逆転写された。逆転写法は逆転写酵素と3’末端プライマーを用いて、RNAを鋳型としたDNAの合成と関連している。典型的には、プライマーはオリゴ（dT）配列を含む。よって生成したcDNA は、それからPCR法とBID特定プライマーを用いて増幅される（Belyavskyら、Nuc l Acid Res 17:2919-2932、1989;KrungとBerger、Methods inEnzymology、Acade mic Press、N.Y.、Vol.152、pp.316-325、1987参考のために引用される）。ポリメラーゼ連鎖反応法は、増幅されるべきDNA部分の2つのフラッキング領域と実質的に相補的である2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記議論したように実施される。増幅に続き、それからPCR生成物は電気泳動され、臭化エチヂウム染色やホスホイメージングにより検出された。本発明はさらに、患者から得られたサンプル中におけるBIDポリペプチドの存在を検出する方法を提供する。タンパク質検出する従来技術に知られている方法が利用される。そのような方法には、限定されないが、免疫拡散、免疫電気泳動、免疫化学法、バインダー-リガンド分析法、免疫組織化学技法、凝集と補体分析法を含む（例えば、Basic and Clinical Immunology、Sites and Terr、eds. 、Appleton & Lange、Norwalk、Conn．pp217-262、1991参考のために引用される）。好ましいバインダー-リガンド免疫分析法は、抗体とエピトープあるいはBID ポリペプチドのエピトープを反応させることと、標識化されたBIDポリペプチドやそれの誘導体を競争的に置換させることを含む。ここで用いられているように、BIDポリペプチド誘導体は、削除され、あるいは置換され、あるいは変質や普通でないアミノ酸へ変化したアミノ酸から成るポリペプチドを含み、BIDポリペプチド誘導体がBIDポリペプチドと生物学的に同等であり、ポリペプチド誘導体がBIDポリペプチドに対して培養された抗体とクロス反応させたものである。クロス反応とは、抗体がその形成を誘発するもの以外の抗原と反応することを意味する。多くの競争的と非競争的タンパク質結合免疫分析法が、従来技術にはよく知られている。そのような分析法に利用される抗体は、例えば凝集テストに用いられるようなときは標識化されないが、広い範囲の種類の分析法に用いられるときは標識化される。放射性同位元素標識免疫測定法（RIA）、酵素免疫測定法、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、蛍光性免疫分析法などに利用される放射性核種、酵素、蛍光体、化学発光体、酵素基質や補助因子、酵素阻害剤、粒子、色素類などを含む標識化合物が利用される。BIDポリペプチドやそれのエピトープへのポリクローナルあるいはモノクローナル抗体は、従来技術において知られている多くの方法による免疫測定法に利用される。ターゲットタンパク質を認識し、特定の部位に結合する抗体の独特な能力は、 BIDポリペブチドの過剰発現を治療する手法を提供する。よって、本発明の別の面から、BIDポリペプチドへの特定の抗体を有する患者の治療により、BIDポリペプチドの過剰発現に関連する病気を予防あるいは治療する方法を提供する。抗体はポリクローナルあるいはモノクローナルのいずれかであり、抗体のクラスあるいはサブクラスから成る。本発明の好ましい具体例を以下の例に記述する。ここでの請求項の範囲内での他の具体例は本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者にとっては、ここに明らかにされた発明の明細書や実施例の考慮から明らかであろう。例とともに明細書は、例に従う請求項により指摘される発明の範囲と意図をもって、模範と考えられることを意図する。例1 本例はマウスと人間のBID cDNAの分離と確認を示す。 BIDはマウスT雑種細胞系である2B4のcDNA発現ライブラリーから、クローニング相互作用するタンパク質により分離された。まずストランドDNA合成がオリゴ（dT）と注入され、スーパースクリプトチョイスシステム（ビブコビーアールエル）を用いて完成させた。サイズ分画されたcDNA（³500bp）はλEXloxベクター（ノバゲン）へ方向性を有するようにクローン化され、T7促進物質下でのT7- 遺伝子-10生成物の形でクローン化されたcDNAの発現を可能にする。ノバゲンページメーカーシステムはパッキングのために利用され、cDNAライブラリーは1回の増幅を行った。スクリーニングが以前に記述したように実施された（BlanarとRutter、Scienc e 256:1014-1018、1992参考のために引用される）。マウスbcl−2とカルボン酸末端シグナル-アンカー部分のないbax cDNAは、GST-HNK-BCL-2やGST-HMK-mBAX融合タンパク質を作り出すために使用された。カルボン酸末端22や19のアミノ酸のないbcl−2とbax cDNAはそれぞれPCRにより増幅され、修飾されたpGEX-3Xベクター（pGEX-HMK）のEcoRI部位へ挿入して、pGEK-HMK-BCL-2や-BAXが生成した。精製された融合タンパク質は生体外でウシHMK（シグマ）と[γ-³²P]ATPを有する心筋キナーゼ（HMK）エピトープのリン酸化により標識化された。標識化されたタンパク質は2B4マウスT雑種細胞系から構成されたλEXlox発現ライブラリーをスクリーンするために用いられた。 1x10⁶プラークの全量は平板された。プラークは1晩IPTG浸漬されたニトロセルロースフィルターへ移動された。フィルターをその後ブロックされプローブと1 晩放置された。洗浄後、フィルターはオートラジオグラフィーを受けた。同じ、新規な遺伝子はBCL-2とBAXプローブを用いて何度も確認された。陽性クローンはさらに精製された。loxP-cre組換えはプラスミドを切断するために利用された。配列決定は標準的な手順により行われた。588のヌクレオチド（SEQ ID NO:6）を有し、マウスBID 195のアミノ酸ポリペプチド（SEQ ID NO:3）をコード化する全長のcDNAは得られた。マウスBIDポリペプチドの分子量は21.95kDaであると予想された。 BID配列と相同性を有するものを含む2つの人間クローンは、我々が新しく決定したマウスBid cDNA配列でゲンバンクのESTディビジョンの研究により確認された。2つのクローンのEST配列は、推定された人間ホモログがマウスBIDに部分的に重なる配列を含んだ。これらのクローン（Clone Id No:52055）の1つは乳児脳から得られ、もう1つは（Clone Id No:128065）は胎児肝臓腎臓から得られた。 52055クローンの5’EST配列は人間bid cDNA（図1a、SEQ ID NO:1）のヌクレオチド1−345に相当する部分的な配列を含み、128065クローンの5’EST配列は変種人間bid cDNA（図1b、SEQ ID NO:2）のヌクレオチド289−603に相当する部分的な配列を含んだ。我々は1.1kb挿入切断を含む52055クローンを得て配列を完全に決定した。人間bid配列はマウスBIDとの相同性により確認された（図1aと図1c）。変種人間bid cDNA全長の配列は52055クローンの完全な配列と3’末端の近くの追加的な15のヌクレオチド配列（図1b）を含む128065クローンの報告されたESTから誘導された。 BLAST研究はBCL-2系統のよく保存されたBH3ドメインとかなりの配列相同性を有するこの遺伝子内の領域を確認した。しかし、BIDはBH1、BH2やBH4ドメインを含むBCL-2系統の他の領域とは配列保存されていないこと示す。さらに、BIDはこれらの膜タンパク質に対してシグナル-アンカー部分として働くほとんどのBCL-2 系統群に当てはまるカルボン酸末端親水性領域を有していなかった。例2 本例はノーザンブロット分析を用いた大人のマウスにおけるBID mRNAの分布と発現を示す。ノーザンブロット分析は、プローブとしてオープンリーディングフレーム含む放射標識化されたマウスBid cDNAを用いて実施され、大人のマウス組織（クロンテック）のポリ（A）⁺RNAブロットに対して雑種形成され、標準的なプロトコールにより洗浄された。図3に示したように、BIDは多くの組織で発現され、腎臓に最も豊富に発現され、脳、腎臓、肝臓、睾丸と肺にも存在した。心臓や骨格筋にはほとんどあるいは全くBIDは発見されなかった。例3 本例はポリクローナルアンチ-BID抗体を用いたシトゾルとFL5.-Bcl-2細胞の膜フラクションにおけるBIDの細胞内分布を示す。精製されたGST-BID融合タンパク質はラビットを免疫させるために利用させ、ポリクローナルアンチ-BID抗体を作り出す。アンチ-BID抗体はタンパク質Aで精製され、脱脂され、この抗体は特に指摘しない限り、本例と次例のウエスタンブロッティングと免疫沈降に利用された。アンチ-BIDは図2aで確認されたエピトープを用いても調製された。アンチ-人間-BCL-2モノクローナル抗体6C8とビオチニレイテッド（biotinylated）アンチ-マウス-BAXポリクローナル抗体651はウエスタンブロッティング分析用（それぞれ1：2000と1：500）に利用された。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合2次抗体（カルタッグ）やストレプトアビジン（ジメッド）は、それぞれ1：2000と1：4000で利用された。 FL5.12-Bcl-2細胞は、10%の胎児ウシ血清（ギブコビーアールエル）、ペニシリン（100U／ml）、ストレプトマイシン（100μｇ/ml）とIL-3の供給源として 10%WEHI-3B条件設定された媒質で補充されたダルベッコを変形させたアイスコベ（Iscove）培地で維持された。 BIDの細胞内分布を決定するために、10⁷のFL5.12-Bcl-2細胞が遠心分離により集められ、PBSで2回洗浄され、低張性緩衝液A（10mM Tris[pH7.5],25mM NaF,5mM 塩化マグネシウム,１mM EGTA，1mM DTT，0.15U/mlアプロチニン,20mMロイペプチンと1mM PMSF）中で再懸濁させた。15分間氷上で放置した後、細胞は50ストロークでダウンス（Dounce）ホモジナイザーで均質化された。細胞は溶解の程度をモニターするために顕微鏡下で検査された。核と溶解していない細胞は10分間500X gでの遠心分離により取り除かれた。上澄液は移動させられ、シトゾリックと膜フラクションを分離するために30分間315，000Xgで遠心分離された。各フラクションからの同量のタンパク質はSDS-PAGEによりサイズ分画され、続いてアンチ-BIDポリクローナル抗体やアンチ-人間-BCL-2モノクローナル抗体6C8を用いてウエスタンブロッティング展開させた。ウエスタンブロッティングでは、細胞溶解産物は12.5あるいは16%Tris-グリシンゲル（ノバックス）で分離され、PVDF膜（バイオトレース、ゲルマンサイエンス）へ移動された。フィルターは4℃で6%非脂肪ミルクを含む0.1%Tween 20（TBST）を含有するTri s緩衝液生理食塩水で1晩ブロックされ、抗体と1時間放置され、続いて５分間TBS T中で3回洗浄され、ECL（アメルスハム）で展開された。アンチ-BID抗体は2B4細胞とマウス造血細胞系、FL5.12（図4）からの溶解産物のウエスタンブロット分析により、23kDタンパク質であると認められる。2つのB IDポリペブチド（図2、ペプチド1と2）に対して発生した抗体は、ウエスタンブロット分析上では同じタンパク質を認めた。サブ細胞分別により、BIDは膜フラクション（図4）にて見つけ出された小さいフラクションのシトゾル（90％以上）へ主に局在していることを示した。この観察はBIDポリペプチドにカルボン酸末端親水性部分がないことと一致しており、ミトコンドリアに固着していないであろう。比較によって、予想されたように、BCL-2はアンチ-人間-BCL-2モノクローナルAb 6CB（1：2000）を用いてのウエスタンブロットにおける膜フラクションに専ら存在していることが明らかにされた。例4 本例はBIDの細胞死アゴニスト活性とBIDを発現する形質変化された造血細胞中でのBCL-2による保護に対するBIDの逆効果を示す。哺乳類発現プラスミドであるｐSFFV-Bidは、スプレニックフォーカス-フォーミングウイルス（Splenic Focus-Forming Virrus）（SFFV）の長い末端の繰り返しのコントロール下でBidを添加することにより構成される。BIDを発現する安定なクローンは、早期の造血細胞系、FL5.12に依存したインターロイキン（IL-3）へのｐSFFV-Bidの形質移入に続いて定着された（Nunezら、J Immunol 144:3602-3610、1990参考のために引用される）。安定な形質移入は10mM HEPES（pH7.4）を有するPRMI 1640の1m l中の10⁷のFL5.12細胞を懸濁されることにより達成された。10-20μｇの線状のｐSFEV構成物が添加された。氷上に５分間置いた後、細胞は200V、900μＦで5秒間（トランスフェクター300、BTX）エレクトロポレイトされた。氷上に10分間置いた後、細胞は25cm²フラスコ中の6-7mlの非選択的培地へ移動させた。2日後細胞は2μｇ/ml G418サルフェート（ギブコビーアールエル）や2μｇ/mlハイグロマイシンB（カルバイオケム）を有する96−ウエルプレート（well plates）の選択下に置かれた。 IL-３遮断分析が記述されているように実施された（Oltvaiら、Cell 74:609-6 19、1993参考のために引用される）。簡単に言えば、1−2X10⁸細胞/mlで培養された細胞は遠心分離で集められ、血清のない媒質で2回、IL-3のない媒質で1回洗浄された。細胞はIL-3のない媒質で10⁸細胞/mlで再懸濁され、200μｌアリコートが96−ウエルプレートに入れられた。各時間で25μｌのサンプルが2つの分離したウエルから取り出され、同体積の0.08%トリパンブルーと混合された。細胞生存率は顕微鏡下で数えられた染色されていない細胞のパーセントとして計算されたトリパンブルー排除により求められた。 2つのサンプルの平均±標準偏差を示す図5aから、一致しているがアポプトーシスにおける微妙な増加がわかり、IL-3を取り除いてクローンを最も多く発現する2つのBIDにおいて観察された（図5a）。いろいろなFL5.12クローンの溶解産物は12.5％SDS-PAGEとその後に続くアンチ-BID Abによるウエスタンブロット展開により分離された。個々のBIDクローンにおける細胞死の程度は、図5bライン２ −４に示されているようにウエスタンブロット分析により検出されたBIDタンパク質のレベルに相当した。親のFL.12細胞はそれらが豊富なBAXを有しているが、BCL-2やBCL-X_Lをほとんど有していないので、アポプトーシスをとても受けやすい。BIDがBCL-2のアンチ -アポプトーティック効果に逆らうかどうかを決定するために、我々はBIDをFL5. -Bcl-2クローンに導入した。ｐSFFV構成物とともに1μｇのPGK−Hygroを加えた以外は前記で議論した方法を利用した。親のFL5.12とFL5.12-Bcl-2細胞間での中間の死速度で、クローンを過剰発現したBCL-2のアポプトーシスを回復させた（図6a）。ウエスタンブロット分析は例3で記述されたようにアンチ-BID抗体で展開された。IL-3排除に続く細胞死の程度はウエスタンブロットで評価されたBID タンパク質のレベルと相互関係があった（図6b）。かなり発現されたとき、ウエスタンブロットでBIDは2重線になり、翻訳後の変質を示唆している（図6b）。例５本例は、BIDが追加的な死刺激のないジャーガットT細胞におけるアポプトーシスを誘発することができ、しかもBIDがきっかけとなる細胞死はｚVADにより抑制されることを示す。 FL5.12内でのBIDの発現は、BIDは死シグナル、IL-3排除後アポプトーシスを高めることを示している。追加的な死刺激のないときには、BIDはアポプトーシスを誘発するかどうかを評価するために、我々は2つの分析法を確立した。ジャーガットT細胞における発現システムを誘発できるドキシサイクリン（doxycycline ）とRat-1繊維芽細胞における一過性形質移入である。誘発可能なJt-Bidクローンは、逆テトラサイクリン-コントロールドトランスアクテイベーター（tetracycline-controlled trans-activator）（rｔTA）を安定に発現するジャーガットクローンへの7量体tet-オペレーターのコントロール下で、Bid cDNAを導入することにより作り出された。ジャーガット細胞はCMV促進物質/エンハンサーのコントロール下で、TetR^rとVP16（Gossenら、Science 268:1766-1769、1995参考のために引用される）の間の融合から成るr ｔTAトランスアクティベーターをコード化するpUHD172-lneoで形質移入された。安定な形質移入剤は、7量体tet-オペレーターを有するCMV最小促進物質により動かされたルシフェラーゼリポーター遺伝子をコード化するpUHC13-3の一過性形質移入によりスクリーンされ、続いてドキシサイクリンで誘導された後にルシフェラーゼ活性の定量を行った。最も誘導の程度が大きかったJt1によるクローンが選ばれ、その後の研究に利用された。野生型や突然変異BIDタンパク質をコード化するcDNAは、pUHC10-3へあるいはｐGK-HygroとともにJt1細胞と共形質移入されたクローニングによる7量体tet-オペレーターと、選択された2μｇ/mlハイグロマイシンBのコントロール下に置かれる。Hygro抵抗クローンは、Dox誘導前後の細胞溶解産物のウエスタンブロットによりBID発現のためにスクリーンされた。2つあるいはそれ以上の誘導可能なクローンが得られ、各突然変異体と野生型Bidのために保存された。エレクトロポレーションがエレクトロセルマニピュレーター600（ビーティーエックス）を用いて、250V、960μＦで行われた。生存率分析のために、1μｇ/mlのドキシサイクリン（シグマ）が各クローンの 2mlの培養へ添加された。各時間で細胞培養の0.3mlから細胞が集められ、アネクシンV/FITC（ベンダーメドシステム）の1：4000溶液と1μｇ/mlよう化プロピジウム（PI）で再懸濁させられた。流動血球計算が行われ（エフエーシースキャン、ベクトンディキンソン）、アネクシンVとPIの双方に対して細胞集団陰性は生存できるとして評価される。ドキシサイクリンハイドロクロリド（Dox）を添加するすぐに、12時間以内にJ t-Bidクローンは急速にアポプトーシスを開始し、48時間では40%以下の生存率である（図7a）。ウエスタンブロット分析から、12時間までのBID発現はDox処理後の約24時間までに最大になったことがわかった（図7b）。次に我々はBID誘発アポプトーシスによってICEライクのシステインプロテアーゼが必要かどうかを求めたかった。ベンゾキシカルボニル-Val-Ala-Asp-フルオロメチルケトン（zVAD-fmk）の分子に基づく小さなペプチドは、システインプロテアーゼのCPP32-ライクサブセットに対する特に有効な、不可逆な抑制物質である（Fearnheadら、FEBS Lett 375:283-288、1995;Armstrongら、J Biol Chem 27 1:16850-16855、1996;Jacobsonら、J Cell Biol 133:1041-1051、1996参考のために引用される）。Jt-Bid細胞をBldを抑制させた50μMのｚVAD-fmkで処理すると、アポプトーシスを誘発した（図7a）。対照的に、Jt-BidをICEの抑制物質（T hornberryら、Nature 356:768-774、1992;Lazebnikら、Nature 371:346-347、19 94参考のために引用される）である35μMのYVAD-cmkで処理すると、効果はない。この結果はCPP32−ライクシステインプロテアーゼはBIDをきっかけとする細胞死経路において必要であること示している。一過性形質移入システムはRat−1繊維芽細胞において展開された。予備的な研究により、ルシフェラーゼリポーターの発現はアポプトーシスが進行する細胞において排除されることがわかっていた（示していないが）。その後に、CMV促進物質のコントロール下でのアポプトーティック調節遺伝子はルシフェラーゼリポーターとともに共形質移入され、ルシフェラーゼ活性分析が18-20時間後に行われた。すべてのcDNA構成物はCMV即座早期促進物質の下でpcDNA3（インベトロゲン）へクローン化された。Rat−1細胞は形質移入前に12ウエルプレート中で約80%融合へ成長するようになった。リポータールシフェラーゼプラスミド（0.1μｇ）が、指摘されたいろいろな構成物の0.05μｇと混合され、5時間の形質移入につき0.5ml の体積において、リポフェクトアミン^TM（LipofectAMINE^TM）（ギブコビーアールエル）の3μｌで混合された。細胞は18-20時間後に溶解産物が生じ、ルシフェラーゼ分析が、プロメガ（Promega）から提供されたルシフェラーゼ基質を用いて行われた。ルシフェラーゼ活性はルミノメーター（オプトコムIIエムジーエムインストルメンツインク）により検出された。細胞生存率は、ルシフェラーゼリポーターがpcDNA3プラスミドを含まないで共形質移入されたコントロールと、テスト構成物の共形質移入との比較から相対的なルシフェラーゼ活性として評価された。ルシフェラーゼリポーターとBidの共形質移入から、ルシフェラーゼ活性の５倍の減少が起こった（図7c）。BCL-2は３倍の増加になり、細胞死を誘導する形質移入から細胞を保護した。BIDとBCL-2の同時の形質移入からは、互いに反発するBIDとBCL-2の能力を確認する中間的なルシフェラーゼ活性を示した。ジャーガット誘発可能なシステムでも同様なことが観測され、BIDによるアポプトーシスの誘導は、投与量に依存した形でzVAD−fmkによっても抑制される。例6 本例はBIDの死アゴニストであるBAXと、死アンタゴニストであるBCL-2とBCL-X_L とのヘテロ２量化を示す。生体内でのBCL-２系統群メンバーとBIDの相互作用をさらに特徴つけるために、一過性形質移入分析に媒介されたワクチニアウイルスが利用された。5’末端のフレームにT7-遺伝子-10を有するT7促進物質により動かされるEXloxベクター（ノバゲン）へ、Bidはクローン化された。T7-遺伝子-10-BID融合タンパク質をコード化するEXlox-Bidプラスミドは組換えを媒介としたloxP-creより作り出される。EXlox-Bidプラスミドはそれから、T7促進物質がT7ポリメラーゼをコード化し[³⁵S]Met標識化された組換えワクチニアウイルスに感染したNIH 3T3細胞へコントロールされているもとで、BCL-X_LやBCL-2発現プラスミドに沿ったリポフェクション（lipofection）により共形質移入される。その方法の詳細は以下のようである。 NIH 3T3細胞は形質移入18時間前に、2X10⁵細胞/ウエル培地の2mlを有する6つのウエルプレートに添加された。細胞は血清のない媒質で洗浄され、2-5pfu/ウエルワクチニアウイルスと混合された新鮮な媒質の1mlとともに37℃30分間放置された。各形質移入に対して、T7促進物質の下で、pBlueScriptやｐGEM4Zのいずれかにおいて全量5μｇのDNA構成物を、血清のない媒質の100μｌへそれぞれ加えた。DNAとリポフェクトエース^TM（LipofectACE^TM）は結合され、ゆっくりと混合され、10-15分間室温で放置された。細胞は洗浄され、0.8mlの血清のない媒質と前もって放置されたDNA−リポフェクトエース^TM複合体が各形質移入へ添加された。[³⁵S]メチオニン/[³⁵S]システイン（トラン³⁵S標識、アイシーエヌ）が各ウエルへ添加され、20μＣｉ/mlの最終濃度になった。8-10時間後、細胞は集められ、免疫沈降用の溶解産物が生成した。アンチ-T7エピトープmAb（ノバゲン）を用いて、細胞の溶解産物の免疫沈降が SDS-PAGEにより評価された。免疫沈降用各サンプルにおいて、5-10X10⁶の細胞が利用された。新鮮なプロテアーゼ抑制物質（142.5mM塩化カリウム、5mM塩化マグネシウム、10mM HEPES[pH7 .2]、1mM EDTA、0.25%NP-40、0.2mM PMSF、0.1%アプロチニン、1μｇ/mlペプスタチンと1μｇ/mlロイペプチン）を添加した等張性のNP-40リーシス緩衝液の100 μｌ中で溶解産物を生成させ、30分間氷上に放置し、核と溶解しなかった細胞を沈殿させるために、10分間15,000Xgで遠心分離させた。アンチ-BID Abの20μｇを各サンプルの上澄み液に加え、混合させ、30分間氷上に放置した。その後400 μｌのNP-40緩衝液を、タンパク質A-セファロースの25μｌに沿ってサンプルに加え、4℃ で1-2時間転頭で放置した。免疫沈降物はブリーフスプン（brief spin）により集められ、1mlのNP-40緩衝液で3回洗浄され、1X SDS-PAGEサンプル緩衝液で溶解された。ウエスタンブロッティングは例3の直接的な細胞溶解産物で記述されたように免疫沈降物で行われた。 BH1ドメイン突然変異体、BCL-2-ml-4（G145E）はないが（図8a）、BCL-X_LとBC L-2の双方はT7-遺伝子-10-BID融合タンパク質で共沈殿した。しかしながら、我々はさらにこのシステムにおけるBIDとBAXの間の相互作用を評価することはできなかった。なぜなら、それらの共発現は、NIH 3T3細胞のアポプトーシスを見かけ上誘発することにより、著しくT7-遺伝子-10-BID発現のレベルを低下させるからである。一過性形質移入で注目される生体内での相互作用を確認するために、我々は例 4の安定に形質移入されたFL5.12−Bcl-2細胞で得られたBCL-2とタンパク質レベルでBIDが2量化するかどうか評価した。BIDは一連のFL5.12クローンから免疫沈降され、その免疫沈降物はSDS-PAGEによりサイズ分画され、続いてアンチ-人間B CL-2モノクローナル抗体（6C8）（図6c）で免疫ブロティングした。親のFL5.12 細胞は人間BCL-2（図6c、ライン1）を含まないが、FL5.12-Bcl-2細胞（図6c、ライン2）は内因性BIDへ結合した人間BCL-2を明示した。実質的には、より多くのB CL-2はBIDを過剰発現されたクローンにおいてヘテロ２量化された（図6c、ライン3−5）。 BIDとBCL-2系統群メンバーの間の相互作用の部位をさらに評価するために、我々は生体外での結合分析法を確立した。BAX、BCL-2、BCL-X_Lの生体外で翻訳され、³⁵S標識化された生成物とBIDの等量を30分間氷上で、1μｇの精製されたGST-B ID融合タンパク質（wtあるいは突然変体）と放置させた。プロテアーゼ抑制物質を有する500μｌのNP-40緩衝液を、25μｌのGSH-アガロースとともに各結合混合物に添加して、1-2時間4℃で転頭させた。GSH-アガロースへ結合した物質は沈殿し、1mlのNP-40緩衝液で3回洗浄され、25μｌの1X SDS-PAGEサンプル緩衝液に溶解させた。12.5%SDS-PAGEでの電気泳動がオートラディオグラフィーにより追跡された。 BIDは異なるが、BCL-X_L、BCL-2やBAXはすべてGST-BIDに結合したが、GSTには結合しなかった（図8b）。このデータは、BIDは活性化ドメインだけでなくDNA結合ドメインにおいて分析されたイーストトゥーハイブリッドシステムおいて確認された。イーストトゥーハイブリッド分析は以下の簡潔な標準的手順に従い行われた。pBTM-Bid wtと突然変異体がpACTIIにおいて、BCL-X_L、BCL-2やBIDとともにイースト菌L40（MNTa his3D200 trpl-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::（lexAop）₄ -HIS3 URA3::（lexAop）₈-lacZ）へ共形質転換された。形質変換物は-Trp-Leu プレート上で成長させ、以前記述したようにβ-gal活性を分析した（Sedlakら、 Proc Natl Acad Sci U S A92:7834-7838、1995参考のために引用される）。BID はイーストトゥーハイブリッド分析において、BCL-X_Lと相互作用するが、自分自身とはホモ2量化しない（データは示していないが）。これらのデータはBIDはモノマーとして存在し、2量体を形成する、あるいは多分死アゴニストとアンタゴニスト双方と多量体を形成することができることを示す。 BIDと相互作用するアンタゴニスト（BCL-2）とアゴニスト（BAX）内でのドメインを確認するために、BCL-2とBAXの突然変異体が生体外での結合分析をテストした。BCL-2mI-3（G145A）突然変異体は以下のように作り出された。人間Bcl-2 cDNAのEcoRIフラグメントは、SacIとBamHI部位は取り除かれ、変質されたpBlues cript II Ksベクター（ストラタジーン）へクローン化された。BH1ドメインを含む153bp SacI/BamHIフラグメントは、置換ヌクレオチドを含むPCR合成されたフラグメントと置換された。突然変異したBcl-2cDNAはその後に、生体外翻訳のSp6 促進物質のコントロール下でｐGEM-4Zへクローン化された。 BAXmI-3（G108A）とBAXmIII-3（G67A）、-4（G67E）と-5（M74A）は以下のように作り出された。EcoRI/PstI（BAXmI-3のため）やEcoRI/NheI（BAXmIII-3,4 & %のため）フラグメントはそれぞれ、マウスBax cDNAの5’ハーフからPCR増幅された。突然変異はオープンリーディングフレームへのPstIやNheIサイト226bpや3 49bpでコード化する3’プライマーへ導入された。BAX mI-3のために、HA Tagが5 ’プライマーへ加えられた。増幅されたフラグメントと分子の3’ハーフはpBTM のEcoRI部位へ連結された。突然変異されたBAX cDNAはその後、生体外翻訳のSp6 促進物質のコントロールされた下でpGEM-4Zへクローン化された。 BCL-2mI-3（G145A）とBAXmI-3（G108A）は、BH1ドメインにおいて保存されたG lyが置換されたが、双方ともBIDとは結合しなかった（図8c）。BH3ドメインに突然変異を有するBAXmIII-3（G67A）、mIII-4（G67E）とmIII-5（M74A）はまだGST -BIDと相互作用する（図8c）。これらの結果はBH3ドメインを除いたBH1は、BID と結合するパートナータンパク質内で相互作用の部位として関係している。 BIDはBCL-2あるいはBAXのいずれとも相互作用し、BCL-2はBAXとヘテロ2量化し、BIDはBCL-2/BAXヘテロ2量体とあるいは各個々の分子と選択的に相互作用するかという疑問が生じる。この問いに答えるために、生体外で転写されたBCL-2とB AXは、GST-BIDと混合される前に前もって結合させた（図8d）。BAX単独と比較すると、BCL-2/BAXヘテロ2量体の存在はGST-BIDへの結合を増大させない（図8d）。次に我々はBAXmI-3を用いて、GST-BIDと結合しないBH1突然変異体は野生型のB CL-2とヘテロ2量体をまだ形成する（データは示していない）。BAXmI-3はBCL-2 とヘテロ2量化した時でさえもGST-BIDと結合しない（図8d）。これらの結果はBI DはBCL-2/BAXヘテロ2量体と3分子複合体を形成しないことを示唆している。このことを確認するために、我々はBAXmIII-5、BCL-2 とヘテロ2量体を形成しないBH3突然変異体を用いて反対の実験を行った（未公表データ）。BAXmIII-5やGST-BIDと結合する野生型BAXの量は同じにして、BCL-2の存在により影響を受けないようにした（図8d）。全体でこれらの観察から、BID はモノマーと、あるいは多分ホモ2量体であるBCL-2やBAXとは相互作用するが、B CL-2/BAXヘテロ2量体とは相互作用しないことが議論される。例７本例は、BIDの死アゴニスト活性とBIDのBCL-2やBAXとの結合におけるBH3ドメイン突然変異の効果を示す。 BIDが有する唯一つの保存されたドメインはBH3であり、機能重要性の突然変異性評価を促す（図9a）。BH3突然変異Bid構成物は2段階で作り出された。ます、分子の5’部分はPCR増幅された。5’プライマーがEcoRI部位に加えられ、3’プライマーはオープンリーディングフレームへのNheIサイト324bpの末端に付けられる。次に増幅されたEcoRI/NheIフラグメントと3’NheI/EcoRIフラグメントはp BTMのEcoRI部位へ連結される。その後、全体の挿入物は、FL5.12細胞への形質移入のpSFFV、一過性形質移入のpcDNA3、ジャーガット細胞における誘発可能なクローンのpUHD10-3とGST-融合タンパク質のpGEX-HMKへサブクローン化された。 BIDのBH3突然変異体は生体外のBCL-2とBAXへの結合をテストされた（図9b）。テストされたすべての4つの突然変異体はBCL-2やBAXのいずれとも相互作用したB IDを分裂させた。しかしながら、突然変異体は個々の特異性を示した。BIDmIII- 1（M97A、D98A）はBCL-2へでなくBAXへ結合し、BIDmIII-3（G94A）はBAXでなくB CL-2へ結合し、一方BIDmIII-2とmIII-4はいずれとも結合しなかった（図9b）。生体外でのこの結合データが正確に生体内でのBID突然変異体の相互作用を反映しているかどうかを確かめるために、我々は各BID突然変異体をFL5.12-Bcl-2細胞へ導入し、安定なクローン発現を選んだ（図10a）。BID突然変異体の発現レベルは野生型BID形質移入体のそれと匹敵した（図10b）。BCL-2やBAXと相互作用する各突然変異体の能力は、アンチ-BID abによる免疫沈降とそれに続くアンチ-BCL-2やアンチ-BAX免疫ブロットにより評価された（図10c）。アンチ-人間-BCL-2モノクローナルAb 6 C8とビオチニレイティッドアンチ-マウス-BAXポリクローナルAb 651はブロット分析（それぞれ1：2000と1：500）のために利用された。野生型BID（ライン2）とBIDmIII-3（ライン3）はBCL-2と相互作用したが、野生型BIDとBID mIII-1（ライン3）は生体内でBAXと相互作用し、生体外の結合データが確認できた。生体外での分析と同様に量は減少したが、BIDmIII-1のみが依然としてBAXと相互作用する突然変異体である（図10c）。 BID突然変異体のBCL-2による逆保護の能力は、IL-3の排除された安定的に形質移入されたFL5.12-Bcl-2クローンにおいて評価された（図10a）。BIDのBH3突然変異体のすべては、BCL-2による保護に逆らう能力を与えられたことは注目すべきである。依然としてBCL-2とよくヘテロ2量化するBIDmIII-3（G94A）でさえ、野生型BIDよりあまり効果はなかった。これはBIDの能力を分解され、BCL-2保護の逆らうBCL-2とヘテロ２量体を形成する（図10a）。このことは別のアポプトーティックシグナルの必要のないジャーガット細胞における誘発可能なシステムの BID突然変異体のさらなる評価を促す（図11a）。さらに、ジャーガット細胞はBC L-2の量をあまり発現しない。タンパク質はかなりのレベルであるにもかかわらず（図11b）、BIDmIII-2、-3と-4は効果を促進する意味のある死を示さない（図 11a）。BIDmIII-1だけがwt BIDよりやや少ない実質的な死を示し（図11a）、多分BAXへの弱い結合を反映しているのであろう（図9bと10c）。このBID突然変異体は、Rat-1繊維芽細胞の一過性形質移入死分析においても分析された。もう1度、BIDmIII-1は強い死滅活性を示したが、一方BIDmIII-3と-4の活性は実質的には与えられた（図11c）。よって、BIDにおけるBH3突然変異は、BIDの発現が誘発され他のシグナルを必要としないシステムと比較するとき（図11aと11c ）、外部死刺激（IL-3の排除、図10a）を必要とするBCL-2のかなりのレベルを有する安定な形質移入とは異なって評価される。BID突然変異体（mIII-1）だけが依然としてBCL-2とではなくBAXと結合（図9bと10c）可能（M97A、D98A）であることは注目すべきことである。 BIDの部位特定の突然変異生成から、死促進活性にはBH3が必要であることがわかった。このことはジャーガットT細胞あるいはRat-1繊維細胞芽において発現されたとき、アポプトーシスに依存したシステインブロテアーゼを誘発するだけでなく、BCL-2による保護に逆らう能力を含んでいた（表1）。＊IL-3排除後のFL5.12-Bcl-2細胞におけるBCL-2の死抑制効果に対抗する能力＃ドキシサイクリン処理によるBID発現の誘発後のジャーガット細胞における細胞死誘発能力・ルシフェラーゼ分析によるRat-1細胞へのBIDとルシフェラーゼプラスミド双方の一過性共形質移入死促進効果に対するBIDにおける野生型BH3ドメインの必要条件は、死滅活性を減少させる結果を招くBAK,BAXとBIK（以前はBip1）から排除されたBH3ドメインを含む、12のアミノ酸における構成物の前もって欠損されたものと一致する（Ch ittendennら、Embo J 14:5589-5596、1995参考のために引用される）。加えて、 BAXからのBH3の周りの23のアミノ酸部分のBCL-2への交換は、それを死アゴニストに変換させた（HunterとParslow、J Biol Chem 271:8521-8524、1996参考のために引用される）。BID(7)BH3における点突然変異はBH3の中心のグリシンはアポプトーティック活性によって重要であると求められた。 BIDの点突然変異は、BH3ドメインはBCL-2、BCL-X_LやBAXと相互作用するのに必要であることも示した（図8、9、10と表1）。逆に、BCL-2とBAXのの点突然変異はパートナータンパク質のBH1ドメイン（BH2は排除していない）がBH3と結合することを示唆している（図8）。BCL-2とBAXにおける予想されるα-ヘリックス領域の保存からは、BCL-X_Lが溶解された条件で3次元構造がBCL-X_Lのそれと同様であろうころが示唆される（Muchmoreら、Nature 381:335-341、1996参考のために引用される）。ここでの点突然変異情報はBIDのBH3ドメイン、パートナータンパク質のBH1ドメインにより提供される浅い溝の、さらされた親水性アミノ酸と結合するであろう両親媒性のα-ヘリックスが議論される。教育的には、BIDのさまざまなBH3突然変異は、BCL-2とBAXとの相互作用や死アゴニスト分析のおいて、全く同じには評価できない。BAXとではなくBCL-2と結合するBIDmIII-3（G94A）はBCL-2に逆らい、アポプトーシスを誘発する能力を失う。対照的に、BIDmIII-1（M97A、D98A）はBCL-2とではなくBAXと依然として結合し、死アゴニスト活性が持続された。得られたすべてのデータに一致したモデルは、決定的で機能ペアとしてBID/BCL-2ヘテロ2量体よりもBID/BAXを採用するであろう。さらに、BCL-2保護に逆らうことができないBID mIII-1はBIDの能力を分解し、BCL-2への結合からBCL-2保護を反対にする。これはBCL-2との結合に依存しない死促進活性により、FL5.12-Bcl-2細胞におけるアポプトーシスをBIDが回復されることの証拠を提供する（表1）。これはさらになぜBIDmIII-1がBAXへあまりよく結合していない（図9bと10c）、弱い結合のBIDmI II-1はBCL-2で充填された細胞において、より緊縮な分析でのアポプトーシスを促進できないことを説明する（FL5.12-Bcl-2、表1）。カルボン酸末端シグナル-アンカー部分を有するBCL-2系統群メンバーは、主にミトコンドリア外膜と核膜に局在している細胞内タンパク質である（Monaghanら、J Histochem Cytochem 40:1819-1825、1992;Krajewskiら、Cancer Res 53:470 1−4714、1993;Nguyenら、J Biol Chem 268:25265-25268、1993;de Jongら、Can -cer Res 54:256-260、1994参考のために引用される）。突然変異分析からキーヘテロ2量体としてBID/BAXが関係している。特定の理論により結び付けられることを意図していなが、これらのデータから、BAXはレセプターに結合した膜を表し、BIDはフリーなシトゾリックとレセプター部位に結合した膜との間を移行する”死リガンド”を表すモデルを提案する。例8 本例はBIDフラグメントと融合タンパク質におけるBH3ドメインは細胞死を誘発するのに十分であることを示す。我々は以下の全長のマウスBIDを参考にして、それらのアミノ酸位置に従って定義される4つの異なった切形BIDポリペプチドを作った。：BID 1-73、BID 74-1 95、BID 74-128、とBID 74-106（図12a;プライマーは矢印で示されている）である。これらのそれぞれは、CMV促進物質と例5のようにルシフェラーゼリポーター遺伝子に沿ったRat-1細胞へ共形質移入された構成物の下で、pCDNA3へ別々にクローン化された。BIDのN末端フラグメント（BID1-73）は細胞死を誘発させないが、BH3ドメインを含む他のすべての構成物は誘発した。さらに、2つの短いBID配列（BID 81-100:EIIHNIARHLAQIGDEMDHN,SEQ IDNO:85とBID 84-98:NHIARHLAQIGDE MD,SEQ IDNO:86）は作られたが、上記システムではテストしなかった。 BIDペプチドを含む外因的投与されたBH3は細胞死を促進するがどうかを決定するために、HIV-1からのtatタンパク質とBH3ドメインを含むマウスBIDのさまざま配列を包含する融合タンパク質を作った。：BID（75-106）（ペプチドA；SEQ ID NO:55）、BID（81-100）（ペプチドB；SEQ ID NO:85）とBID（84-98）（ペプチドC；SEQ ID NO:86）（図12b）である。Tat配列が存在すると、細胞培養に加えられたときペプチドが細胞に浸透しやすくなると信じられている。図12cに示されているように、マウスT細胞雑種細胞2B4をtat-BID（75-106）（SEQ ID NO:56 ）やtat-BID（81-100）（SEQ ID NO:87）融合タンパク質（それぞれペプチドAとペプチドBである)で処理すると、媒質のみで処理されたコントロール細胞中での生存率との比較から、19と43時間でのトリパンブルー排除により決定された細胞生存率は減少した。しかしながら、tat-BID（84-98）ではテストしていないが、この融合タンパク質も細胞生存率を減少させると信じられている。よって、BID のBH3ドメインは形質変換された細胞により発現されたとき、あるいはキャリアH IV-1 tatペプチドと結合されたものを外因的に投与されたとき、細胞死を誘発するのに十分である。以上のことを考慮して、本発明のいくつかの長所は達成され、他の有利な結果も得られた。本発明の範囲から脱しない限り、上記方法と成分におけるさまざまな変更は可能であるので、上記の記述と添付された図に含まれるすべての事柄は例証として、意味を限定せずに解釈されるように意図したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 15/00 Ａ６１Ｐ 17/02 17/02 25/00 25/00 29/00 29/00 31/12 31/12 35/00 35/00 37/00 37/00 43/00 １０５ 43/00 １０５Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims

【特許請求の範囲】 1.BID配列とそれのフラグメントから成る分離され、実質的に精製されたポリペプチド。 2.該BID配列が、（a）BCL-2系統群のメンバーに結合した膜に特徴的であるカルボキシ末端シグナル-アンカー配列が欠けていることと、（b）BH1とBH2 ドメインが欠けていることと、（c）BH3を有していることと、（d）BAX、BCL-2 とBCL-X_Lとヘテロ2量化すること、を特徴とする請求項1記載の分離され、実質的に精製されたポリペプチド。 3.SEQ ID NO:4に明らかにされたアミノ酸に少なくとも85パーセント同じであるアミノ酸配列から成ることを特徴する請求項2記載の分離され、実質的に精製されたポリペプチド。 4.SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、あるいはそれの保存的に置換された変種から成ることを特徴とする請求項3記載の分離され、実質的に精製されたポリペプチド。 5.BIDポリペプチドの細胞内運搬を向上させる異種ポリペプチド配列へ共有結合的につながることを特徴とする請求項1記載のポリペプチドから成る分離され、実質的に精製された融合タンパク質。 6.請求項1のポリペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメントをコード化するbidポリヌクレオチドから成る分離され、実質的に精製された核酸。 7.（a）BCL-2系統群のメンバーに結合した膜に特徴的であるカルボキシ末端シグナル-アンカー配列が欠けていることと、（b）BH1とBH2ドメインが欠けていることと、（c）BH3ドメインを有していることと、（d）BAX、BCL-2とBCL-X_L あるいは該ポリペプチドのフラグメントとヘテロ2量化する、ポリペプチドである啼乳類BIDポリペプチドをコード化する配列からなることを特徴とする請求項6 記載の分離され、実質的に精製された核酸。 8.該ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、あるいはSEQ ID N O:3から成ることを特徴とする請求項7記載の分離され、実質的に精製された核酸。 9.請求項5記載の融合タンパク質をコード化する配列から成ることを特徴とするDNA分離体。 10.SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、あるいはSEQ ID NO:3の補体と雑種形成する該核酸であることを特徴とするSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5あるいはSEQ ID N O:6に明らかにされたアミノ酸配列と少なくとも85％同じであるアミノ酸配列を有する人間BIDポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列から成る核酸あるいはポリヌクレオチドに相補的であることを特徴とする、分離され、実質的に精製された核酸あるいはポリヌクレオチド。 11．請求項1記載のBIDポリペプチドをコード化する核酸配列に結合可能な発現調節剤要素から成る請求項６や請求項10の核酸から成ることを特徴とするベクター。 12．請求項11記載のベクターと形質転換することを特徴とする宿主細胞。 13．（a）転写活性化のタンパク質のDNA結合ドメインをコード化するポリヌクレオチドへのフレームに融合される請求項6の核酸から成る融合遺伝子と、（b）（a）記載の該転写活性化のタンパク質のDNA結合ドメインをコード化するポリヌクレオチドへのフレームに融合されるBAX、BCL-2やBCL-X_Lをコード化する配列から成る融合遺伝子と、（c）（a）と（b）の融合遺伝子によりコード化されるヘテロ2量体やペプチドの量に依存する転写活性のある転写調節剤要素へ機能的に結合したリポーター遺伝子と、から成る成分。 14.BIDペプチドあるいはそれのエピトープと反応可能であることを特徴とする分離され、実質的に精製された抗体。 15．コード化されたBIDポリペプチドの転写と/あるいは翻訳を妨害する BIDポリペプチドをコード化する自然発生するDNAやmRNAポリヌクレオチド配列と相補的であり、雑種形成可能な配列から成ることを特徴とする分離され、実質的に精製されたBIDアンチセンスポリヌクレオチド。 16．約15から約30の連続的なヌクレオチドから成ることを特徴とする請求項15記載の分離され、実質的に精製されたBIDアンチセンスポリヌクレオチド。 17．請求項1記載のポリペプチドの効果的な量を細胞に投与することから成る、細胞の減少したアポプトーティック状態を予防あるいは治療する方法。 18．BIDポリペプチドの細胞内運搬を向上させるのに適するキャリア成分とともに、BIDポリペプチドが投与されることを特徴とする請求項17記載の方法。 19．癌、ウイルス感染、リンパ増殖状態、関節炎、炎症と自己免疫疾患から成る群から選ばれた病気からの結果から生じる減少したアポプトーティック状態における請求項17記載の方法。 20．請求項6で定義された効果的な量の核酸を細胞に投与することから成る、細胞集団中の、あるいは患者内の細胞の減少したアポプトーティック状態を予防あるいは治療する方法。 21．癌、ウイルス感染、リンパ増殖状態、関節炎、炎症と自己免疫疾患から成る群から選ばれた病気からの結果から生じる減少したアポプトーティック状態における請求項20記載の方法。 22．コード化されたBIDポリペプチドの転写と/あるいは翻訳を妨害する BIDタンパク質をコード化する、自然発生するDNAやmRNAポリヌクレオチド配列と相補的であり、雑種形成可能であることを特徴とする、分離され、実質的に精製されたbidアンチセンスポリヌクレオチドやそれの誘導体の阻害物質の効果的な量を投与することから成る、細胞におけるBIDポリペプチドの発現により媒介される病気状態を治療する方法。 23．免疫不全病気、老化、神経変性病気、虚血性細胞死、レパーフュージョン細胞死、不妊症、創傷治癒から成る群から選ばれる病気状態である請求項 22記載の方法。 24．請求項14記載の精製された抗体とサンプル中に存在するBIDポリペプチドとが反応し、抗体とBIDポリペプチドとの結合を検出するから成る細胞あるいは細胞集団中のBIDポリペプチドを検出する方法。 25．抗体がBIDポリペプチドと反応し、容器内にパッケージされて検出可能となることを特徴とする請求項14記載の抗体から成る細胞あるいは細胞集団中のBIDポリペプチドを検出するキット。 26.SEQ ID NO:4で明らかにされたアミノ酸配列をコード化するmRNAの存在を検出と/あるいは定量することから成る細胞あるいは細胞集団中におけるBID ポリペプチドを検出する方法。 27．（a）SEQ ID NO:4あるいはそれの保存的な置換をされた変種やそれの誘導体で明らかにされたアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供することと、（b）細胞あるいは細胞集団からのmRNAと雑種形成できるポリヌクレオチドのある状態下で、細胞あるいは細胞集団とポリヌクレオチドを放置することと、（c）DNA-RNA雑種形成複合体の存在を検出すること、の各段階から成ることを特徴とする検出と/あるいは定量化段階から成る請求項2 6記載の方法。 28．（a）細胞あるいは細胞集団からのサンプルにおける逆転写法を用いてmRNAからcDNAを作り出すことと、（b）ポリメラーゼ連鎖反応法のプライマーであり、SEQ ID NO:4あるいはそれの保存的な置換された変形で明らかにされたアミノ酸配列をコード化するcDNA内にあるターゲットDNA配列の側面に位置している、２つのオリゴヌクレオチドを提供することと、（c）ポリメラーゼ連鎖反応法によるターゲットDNA配列を増幅することと、（d）増幅されたターゲットDNA配列の存在を検出すること、の各段階から成ることを特徴とする検出と/あるいは定量化段階から成る請求項2 6記載の方法。 29．（a）ポリメラーゼ連鎖反応法のプライマーであり、bid遺伝子内に存在するターゲットDNA配列を増幅可能とする２つのオリゴヌクレオチドを提供することと、（b）ターゲットDNA配列を増幅することとと、（c）無傷のbid遺伝子からの増幅されたDNA配列の存在あるいは存在しないことを検出すること、の段階から成るbid遺伝子変質を検出する方法。 30．（a）無傷のbid遺伝子と雑種形成可能であるオリゴヌクレオチドを提供することと、（b）オリゴヌクレオチドが無傷のbid遺伝子と雑種形成可能である状態において、サンプルとオリゴヌクレオチドを放置することと、（c）DNA-DNA雑種形成複合体の存在あるいは存在しないことを検出すること、の段階から成るbid遺伝子変質を検出する方法。