MXPA05010312A

MXPA05010312A - Proteinas activadoras de elementos de respuesta de amp ciclico y usos relacionados a ellas.

Info

Publication number: MXPA05010312A
Application number: MXPA05010312A
Authority: MX
Inventors: Zhu Jian
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2003-03-26
Filing date: 2004-03-25
Publication date: 2005-11-17
Also published as: EP1611239A1; JP2007523608A; AU2004223739B2; BRPI0408778A; WO2004085646A1; US20070036810A1; AU2004223739A1; CA2520001A1

Abstract

La invencion describe proteinas activadoras de elementos de repuesta de AMP ciclico (proteinas CREAP) recien identificadas. Se contempla en la presente que dichas proteinas sean objetivos de medicamento adecuados para el desarrollo de nuevos terapeuticos para prevenir, tratar o mejorar las condiciones patologicas relacionadas con la activacion anormal de expresion de gene dependiente de CRE o activacion anormal de quimiocinas. La invencion se refiere a metodos para prevenir, tratar o mejorar dichas condiciones patologicas y composiciones farmaceuticas para ello que comprenden moduladores con efecto inhibitorio en la actividad de proteina CREAP y/o expresion de gene de CREAP. La invencion tambien se refiere a metodos para identificar compuestos con utilidad terapeutica para tratar dichas condiciones patologicas, que comprende identificar compuestos que pueden inhibir la actividad de proteina CREAP y/o expresion de gene de CREAP.

Description

PROTEINAS ACTIVADORAS DE ELEMENTOS DE RESPUESTA DE AMP CICLICO Y USOS RELACIONADOS A ELLAS ANTECEDENTES DE LA INVENCION La proteína de unión de elemento de respuesta de AMP cíclico (CREB), el factor de transcripción de activación 1 (ATF1) y modulador de elemento de respuesta de cAMP (CREM) son un subgrupo de proteínas estrechamente relacionadas que pertenecen a la superfamilia de factor de transcripción de cierre de leucina de región básica (bZIP). Son los mediadores centrales del control transcripcional ejercido por una variedad de estímulos extracelulares, tales como hormonas, factores de crecimiento, neuropéptidos y neurotransmisores, calcio, hipoxia y tensión oxidante. Está bien establecido, mayormente a través de estudios de CREB, que la fosforilación de residuos de serina conservados en el dominio inducible por cinasa ( ID) de estas proteínas conduce a activación transcripcional de un espectro de genes objetivo involucrados en la regulación de crecimiento celular y diferenciación, metabolismo, reproducción y desarrollo, modulación de actividad neuronal e inmuno-regulación. Todos estos genes objetivo comparten un elemento de respuesta de AMP cíclico (CRE) que actúa en cis, conservado, el cual tiene la secuencia palindrómica de TGACGTCA o variaciones asimétricas que incluyen un sitio de mitad de CRE con la secuencia de núcleo TGAC (ver Mayr B, Montminy M., Nat Rev Mol Cell Biol 2001 Aug;2(8):599-609). La regulación de transcripción ocurre cuando los homo- y/o heterodímeros CREB/CREM/ATF1 fosforilados se unen al sitio CRE a través de los dominios bZI P, mientras q ue los dom inios KI D recluían moléculas efectoras, tales como la proteína de unión de CREB de 265 kD CBP o p300 y la maquinaria de transcripción basal Pol I I asociada a la cercanía del sitio de inicio de transcripción . Una tremenda cantidad de investigación se ha dedicado a identificar moléculas que enlazan la estimulación de células a activación de CREB/C REM/ATF 1 . La complejidad de estos activadores es ejemplificada por el estudio de cinasas de fosforilación de C REB . De manera original, CREB fue considerada un mediador de transcripción exclusivo de estímulos extracelulares que aumentan cAMP , que a su vez activa la proteína cinasa A (PKA) para la forsforilación de CREB. Sin em bargo, investigaciones subsecuentes revelaron que las proteínas de CREB también son fosforiladas por pp90RSK en respuesta a factores de crecimiento, SK-1 en respuesta a mitogenes y tensión, CA K ll/IV en respuesta a la elevación de Ca++ y AKT en respuesta a señales de hipoxia y supervivencia. Es evidente a partir de estos estudios que la regulación de las actividades de las proteínas de la familia CREB/CRE/ATF1 es extremadamente compleja para asegurar especificidad y sensibilidad , en una manera dependiente de contexto celular, para generar rendimiento celular apropiado de un amplio arreglo de estímulos extracelulares . Describimos en la presente los resultados de una clasificación funcional basada en células de escala de genoma de una gran colección de clones de cDNA humanos de longitud completa , que representan copias de 1 1 ,000 a 15, 000 genes, para proteínas q ue activan la expresión de genes depend ientes de CRE. Los datos indican varios activadores de CRE hasta ahora no identificados, incluyendo KIAA061 6, un gene de función previamente desconocida y el cual ha sido renom brado en la presente CREAP 1 . Los solicitantes también han descubierto dos proteínas humanas más distintas similares en estructura y actividad a CREAP 1 , llamadas en la presente CREAP2 y CREAP3 , así como homólogos de ratón y Drosophila, todos los cuales son miem bros de una familia de genes hasta ahora desconocida que regulan la expresión de genes dependiente de CRE. Los solicitantes también reportan en la presente, el sorprendente descu brimiento de que CREAP1 es un potente inductor de otras proteínas incluyendo fosfoenolpirovato carboxi cinasa (PEPC ) , anfirregulin y quim iocinas, tales como I L-8 y Exodus-1 /MI Palpha. Como tal , se contempla en la presente que las proteínas CREAP de la presente invención pueden ser usadas como objetivos de medicamento novedosos para el tratamiento de condiciones patológicas relacionadas con la activación anormal de genes que contienen sitio(s) de CRE en sus regiones promotoras, así como para el tratam iento de condiciones asociadas con la activación anormal de PEPCK, anfirregulin y quimiocinas, en particular I L-8 y Exodus- 1 / I Palpha. Estas condiciones incluyen, pero no están limitadas a, osteoartritis, psoriasis, asma, COPD, artritis reum atoide, cáncer, angiogénesis patológica, diabetes, hipertensión , dolor crónico y otras enfermedades inflamatorias y autoinm u nes, as í como condiciones neurodegenerativas , tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington . La invención también proporciona un método para identificar moduladores que in hiben o intensifican la actividad de CREAP y/o inhiben o intensifican la expresión de gene de CREAP y el uso de tales moduladores para el tratamiento de estas condiciones en pacientes humanos y veterinarios. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas comprendiendo dichos moduladores.

BREVE DESC RI PCION DE LA INVENCION La presente solicitud se refiere ai descubrimiento de una nueva familia de proteínas, referidas en la presente como CREAP, las cuales son activadores de transcripción dependiente de CRE así como inductores de quimiocinas. Como tal, se contempla en la presente que los miembros de esta familia de proteínas son objetivos adecuados para el desarrollo de nuevos terapéuticos para prevenir, tratar o mejorar las condiciones patológicas relacionadas con activación anormal de expresión de genes dependiente de CRE o activación anormal de quimiocinas incluyendo, pero no limitando a, osteoartritis, psoriasis, asma, COPD, artritis reumatoide, cáncer, angiogénesis patológica, diabetes, hipertensión, dolor crónico y otras enfermedades inflamatorias y autoinm unes. Además, como la pérdida de la función de CREB ha sido asociada con déficits en aprendizaje y neurodegeneración, los agonistas de proteínas CREAP pueden ser útiles para prevenir, tratar o mejorar desórdenes neurodegenerativos, tales como enfermedades de Alzeheimer, Parkinson y Huntington. De esta manera, en un aspecto la invención se refiere a un método para identificar moduladores útiles para prevenir, tratar o mejorar dichas condiciones, que comprende: a) ensayar la capacidad de un modulador candidato, in vitro, ex vivo o in vivo, para inhibir o intensificar la actividad de una proteína CREAP y/o inhibir oa intensificar la expresión de una proteína CREAP y que además puede incluir b) ensayar la capacidad de un modulador CRAP identificado para invertir los efectos patológicos observados en modelos in vivo, ex vivo o in vitro de dichas condiciones patológicas y/o en estudios clínicos con sujetos con dichas condiciones patológicas. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para prevenir, tratar o mejorar las condiciones patológicas relacionadas a la activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quimiocinas, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de lo mismo, una cantidad efectiva de un modulador de CREAP, en donde dicho modulador, por ejemplo, inhibe o intensifica la actividad de cualquiera o más de dichas proteínas CREAP o inhibe o intensifica la expresión de cualquiera o más proteínas CREAP, en donde dicha proteína CREAP es seleccionada del grupo que consiste de CREAP 1 , CREAP2 y CREAP3. En una modalidad, el modulador comprende cualquiera o más substancias seleccionadas del grupo que consiste de oligonucleótidos antisentido, DNA de triple hélice, ribozimas, RNA aptámeros, siRNA o RNA de filamento doble o simple, en donde dichas substancias son diseñadas para inhibir la expresión de una proteína CREAP. En una modalidad adicional, el modulador comprende anticuerpos para una proteína CREAP o fragmentos de la misma, en donde dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden inhibir la actividad de dicha proteína CREAP. En una modalidad adicional de esta invención, el modulador comprende imitadores de péptido de una proteína CREAP, en donde dicho imitador de péptido puede inhibir la actividad de dicha proteína CREAP. Se contempla en la presente que uno o más moduladores descritos en la presente pueden ser administrados concurrentemente. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para tratar, prevenir o mejorar condiciones patológicas relacionadas con activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quiimiocinas, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de los mismo, una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un modulador de CREAO. En una modalidad, dicho modulador inhibe o intensifica la actividad de una proteína CREAP o inhibe o intensifica la expresión de un gene que codifica dicha proteína en un sujeto, en donde dicha proteína CREAP es seleccionada del grupo que consiste de CREAP 1 , CREAP2 o CREAP3. En una modalidad, el modulador comprende cualquiera de una o más substancias seleccionadas del grupo que consiste de oligonucleótidos antisentidos, DNA de triple hélice, ribozimas, RNA aptámeros, siRNA y RNA de filamento doble o simple, en donde dichas substancias son disñeadas para inhibir la expresión de una proteína CREAP. En una modalidad adicional, el modulador comprende anticuerpos o imitadores de péptido para una proteína CREAP o fragmentos de la misma, en donde dichos anticuerpos o imitadores pueden, por ejemplo, inhibir la actividad enzimático u otra actividad de dicha proteína CREAP. Se contempla en la presente que uno o más moduladores de una o más de dichas proteínas pueda ser administrado concurrentemente. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más moduladores de CREAP en una cantidad efectiva para tratar, prevenir o mejorar condiciones patológicas relacionadas con la activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quimiocinas en un sujeto en necesidad de los mismo, en donde dicho modulador anormal puede inhibir o intensificar la actividad de una proteína CREAP y/o inhibir o intensificar la expresión de una proteína CREAP, en donde dicha proteína CREAP es seleccionada del grupo que consiste de CREAP1 , CREAP2 o CREAP3. En una modalidad adicional, el modulador comprende cualquiera de una o más substancias seleccionadas del grupo que consiste de oligonucleótidos antisentido, DNA de triple hélice, aptámeros de RNA, siRNA y RNA de filamento doble o simple, en donde dichas substancias son diseñadas para inhibir la expresión de CREAP. En una modalidad adicional, el modulador comprende anticuerpos para o imitadores de péptido de una proteína CREAP o fragmentos de la misma, en donde dichos anticuerpos o imitadores pueden, por ejemplo, inhibir la actividad enzimática u otra actividad de dicha proteína CREAP. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende proteínas CREAP. Todavía en otro aspecto, la invención se refiere a un método para tratar, prevenir o mejorar las condiciones patológicas relacionadas con la activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quimiocinas que comprende administrar a un sujeto en necesidad de los m ismos, una composición farmacéutica comprendiendo proteínas CREAP.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para diagnosticar sujetos que sufren de una cond ición patológica relacionada con la activación anormal de expresión de gene dependiente de C RE o activación anormal de q uimiocinas, q uienes pueden ser candidatos adecuados para tratamiento con moduladores de CREAP o proteínas CREAP exógenas, que comprende detectar niveles de proteína CREAP en una m uestra biológica desde d icho sujeto, en donde los sujetos con niveles anorm a les com parados con controles serían un cand idato adecuado para tratamiento . Todavía en otro aspecto, la i nvención se refiere a un método para diagnosticar un sujeto que sufre de una condición patológica relacionada con la activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de q uim iocinas, quienes pueden ser un candidato adecuado para tratamiento con uno o más moduladores de CREAP o proteínas CREAP exógenas, que comprende ensayar los n iveles de m RNA de proteína CREAP en una muestra biológica de dicho sujeto, en donde un sujeto con niveles de mRNA anormales comparados con controles serían un cand idato adecuado para tratam iento. Todavía en otro aspecto, se proporciona un método para tratar, preven ir o mejorar una condición patológ ica relacionada con la activación anorma l de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quimiocinas que comprende: (a) ensayar niveles de mRNA de CREAP y/o proteína CREAP en un sujeto, y (b) admin istrar a un sujeto con n iveles anorma les de m RNA y/o proteína CREAP comparados con controles , un modulador de CREAP o proteínas CREAP exógenas en una cantidad suficiente para tratar, prevenir o mejorar dicha condición patológica. Todavía en otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos y conjuntos de ensayo que comprenden los componentes necesarios para detectar la expresión de polinucleótidos que codifican proteínas CREAP o niveles de proteínas CREAP o fragmentos de los mismos, en muestras biológicas derivadas de un paciente, comprendiendo dichos conjuntos, por ejemplo, anticuerpos o imitadores de péptido que se unen a proteínas CREAP, o a fragmentos de las mismas, o sondas d epolinucleótidos que hibridan con polinucleótidos de CREAP. En una modalidad preferida, tales conjuntos también comprenden instrucciones que detallan los procedimientos mediante los cuales se van a usar los componentes del conjunto. La presente invención también pertenece al uso de un modulador de cCREAP o proteínas CREAP exógenas en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejoramiento de condiciones patológicas relacionadas con activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quimiocinas. De preferencia, dicha condición patológica es una enfermedad autoinmune o neurodegenerativa. En una modalidad, dicho modulador comprende cualquiera de una o más substancias seleccionadas del grupo que consiste de oligonucleótidos antisentido, DNA de triple hélice, ribozimas, RNA aptámero, siRNA y RNA de filamento doble o simple, en donde dichas substancias son diseñadas para inhibir expresión de gene CREAP. Todavía en una modalidad adicional, dicho modulador comprende uno o más anticuerpos para una proteína CREAP o fragmentos de la misma, en donde dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden, por ejemplo, inhibir la actividad de CREAP enzimática u otra actividad. En otra modalidad, dicho modulador comprende uno o más imitadores de péptido de una proteína CREAP, en donde dicho imitador puede, por ejemplo, inhibir la actividad de CREAP enzimática u otra actividad. La invención también pertenece a proteínas CREAP exógenas o moduladores de proteínas CREAP para uso como un farmacéutico. En una modalidad, dicho modulador comprende cualquiera de una o más substancias seleccionadas del grupo que consiste de oligonucleótidos antisentido, DNA de triple hélice, ribozimas, RNA aptámero, siRNA o RNA de filamento doble o simple, en donde dichas substancias son diseñadas para inhibir la expresión de CREAP. Todavía en una modalidad adicional, dicho modulador comprende uno o más anticuerpos para o imitadores de péptido de CREAP, o fragmentos de los mismos, en donde dichos anticuerpos, imitadores o fragmentos de los mismos pueden, por ejemplo, inhibir la actividad de CREAP enzimática u otra actividad. En otra modalidad, dicho modulador comprende uno o más imitadores de péptido de una proteína CREAP, en donde dicho imitador puede, por ejemplo, inhibir la actividad de CREAP enzimática u otra actividad. Como la secuencia de polinuclóeitod correcta de CREAP2 y CREAP3 no han sido descritas hasta ahora, se contempla en la presente que la presente invención también proporciona polipéptidos aislados que comprenden secuencias de aminoácidos expuestos en SEQ I D NO: 16 y SEQ I D NO:25, respectivamente. De manera adicional, la invención proporciona polipéptidos aislados que consisten de secuencias de aminoácidos expuestos en SEQ ID NO: 16 y SEQ I D NO:25 y fragmentos de los mismos. De acuerdo con este aspecto de la invención, se proporcionan polipéptidos novedosos de origen humano así como fragmentos biológica, diagnóstica o terapéuticamente útiles, variantes, homólogos y derivados de los mismos, variantes y derivados de los fragmentos, y análogos de los anteriores. La presente invención también hace disponible ácidos nucleicos aislados que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas CREAP descritas en la presente, en particular, CREAP2 y CREAP3 y homólogos y fragentos de los mismos y/o equivalentes o ácidos nucleicos que son substancíalmente similares a los ácidos nucleicos con las secuencias de nucleótidos como se exponen en SEQ ID NO 15 y SEQ I D NO:24. En una modalidad preferida, el DNA aislado toma la forma de una molécula de vector que comprende al menos un fragmento de un DNA de la presente invención, en particular que comprende el DNA que consiste de una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ I D NO: 1 , SEQ ID NO: 1 5 o SEQ I D NO:24. Otro aspecto de la invención proporciona un proceso para producir los polipéptidos antes mencionados, fragmentos de polipéptidos, variantes y derivados, fragmentos de las variantes y derivados, y análogos de los anteriores. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, se proporcionan métodos para producir las proteínas CREAP antes mencionadas que comprenden cultivar células huésped teniendo incorporado en ellas un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos derivada de manera exógena que codifica tal polinucleótido bajo condiciones suficientes para la expresión del polipéptido en la célula huésped, provocando con ello la expresión del polipéptido y opcionalmente recuperando el polipéptido expresado. En una modalidad preferida de este aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir polipéptidos que comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:25, el cual comprende cultivar una célula huésped teniendo incorporado en ella un vector de expresión que contiene un polinucleótido derivado de manera exógena que codifica un polipéptido que comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:25, bajo condiciones suficientes para la expresión de tal polipéptido en la célula huésped, provocando con ello la producción de un polipéptido expresado y opcionalmente recuperando el polipéptido expresado. De preferencia, en cualquiera de tales métodos, el polinucleótido derivado de manera exógena comprende o consiste de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1, la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO.15, o la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO.24. De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporcionan productos, composiciones, procesos y métodos que utilizan los polipéptidos y polinucleótidos antes mencionados para, ínter alia, fines de investigación, biológicos, clínicos y terapéuticos. Todavía en otro aspecto, la invención proporciona células huésped las cuales pueden ser propagadas in vitro, de preferencia células de vertebrados, en particular células de mamífero, o células bacterianas, las cuales son capaces de crecimiento en cultivo para producir un polipéptido que comprenda la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2, SEQ I D NO: 16, SEQ I D NO:25, o fragmentos de las mismas, donde las células contienen secuencias de DNA de control transcripcional, de preferencia diferentes de secuencias de control transcripcional de CREAP humanas, donde las secuencias de control transcripcional controlan la transcripción de DNA que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:25 o fragmentos de las mismas, incluyendo pero no limitando a secuencias de aminioácidos que comprenden las porciones y fragmentos activos de las t proteínas CREAP. Todavía en otro aspecto, la invención se dirige a métodos para la introducción de ácidos nucleicos de la invención en uno o más tejidos de un sujeto en necesidad de tratamiento con el resultado de que una o más proteínas codificadas por los ácidos nucleicos son expresadas y/o secretadas por células dentro del tejido.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra que CREAP1 es una proteína altamente conservada y contiene un potente dominio de activación de transcripción. La secuencia de aminoácidos de CREAP1 humana y los genes relacionados de CREAP1 de muríno, fugu y drosofila predichos son mostrados. Los aminoácidos idénticos y altamente conservados están sombreados. Un sitio de fosforilación de PKA potencial conservado está encasillado. La primera secuencia representa al humano, la segunda es de ratón, la tercera es de Fugu y la cuarta es de Drosophlla. La Figura 2 ilustra las secuencias de aminoácidos de cDNAs de longitud completa que corresponden a proteínas de CREAp de humano y Drosophila. Los aminoácidos están alineados usando ClustalW y los aminoácidos conservados están sombreados.

DESCRI PCION DETALLADA DE LA INVENCION Se contempla que la invención descrita en la presente no está limitada a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos ya que éstos pueden variar. También se entenderá que la terminología usada en la presente es para el fin de describir modalidades particulares solamente, y no se pretende limitar el alcance de la presente en manera alguna. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen los mismos significados como se entiende comúnmente por alguien de habilidad ordinaria en la técnica, a la cual pertenece la invención. Aunque pueden usarse cualquier método y materiales similares o equivalentes a aquéllos descritos en la presente en la práctica o prueba de la presente invención, se describen ahora los métodos, dispositivos y materiales preferidos. Todas las publicaciones mencionadas en la presente son incorporadas por referencia con el fin de describir y divulgar los materiales y metodologías que son reportados en la publicación que pudieran ser usados en relación con la invención. Para practicar la presente invención, se usan muchas técnicas convencionales en biológica molecular. Estas técnicas son bien conocidas y son explicadas en , por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, (Protocoles actuales en biología molecular), volúmenes I , I I y I I I , 1997 • (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual (Clonación molecular: Un manual de laboratorio), segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practica! Approach (Clonación de DNA: una aproximación práctica), volúmenes I y II , 1985 (D.N . Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis (Síntesis de oligonucleótidos, 1 984 (M.L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization (Hibridación de ácido nucleico), 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation (Transcripción y traducción) , 1 984 (Hames and Higgins eds.) ; Animal Cell culture (Cultivo de células animales), 1986 (R.l . Freshney ed.) ; Immobilized Cells and Enzymes (Enzimas y células inmovilizadas), 1 986 (I RL Press); Perbal, 1984, A Practical guide to Molecular Cloning (Una guía práctica para clonación molecular); la serie, Methods in Enzymology (Métodos en enzimolog ía) , (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, (Vectores de transferencia de genes para células de mamífero), 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds. , Cold Spring Harbor Laboratory); y Methods in Enzymology (Métodos en enzimología) , Vol. 154 y Vol. 155 (Wu and Grossman , y Wu, eds. , respectivamente).

Inhibidor de unión A-20 de NF-kappaB activación-2 Proteína NFkB-activadora 1 Proteína de dominio de repetición de ancirin 3 AP-1 Proteína activadora 1 ARHG EF 1 Factor de intercambio de nucleótidos de guanina Rho (GEF) 1 ATCC America Type Culture Collection ATF Factor de transcri pción de activación BZI P Cierre de leucina de región básica C/EB P CCAAT/Proteína de unión de intensificador CAD Dominio activo constitutivo CAM K Proteína cinasa dependiente de Ca++/calmod ulina cAMP A P cícl ico CBP Proteína de unión de CRE B CN S Sistema nervioso central COPD Enfermedad pulmonar obstructora crón ica CR53 Factor de transcripción putativo CR53 CRE Elemento de respuesta de AMP cíclico CREB Proteína de unión de elemento de respuesta de AMP cíclico CREB1 Proteína de unión de elemento responsivo de cAMP 1 CRE-BPa Proteína de unión de elemento de respuesta de cAMP CREM Modulador de elemento de respuesta de cAMP ERK Cinasa regu lada por seña l extracelular EST Etiqueta de secuencia expresada HPH2 Homólogo humano de proteína de Drosophila Polyhomeotic (Ph) HPH2 Homólogo Polycomb humano 2 HTS Clasificación de alto rendimiento IBMX 3-isobutil-1 -metilxantina ICER Represor temprano de cAMP inducible IkBa Inhibidor de subunidad alfa de factor nuclear kappa-B cinasa IKK IkBoc cinasa ???? IkB cinasa gamma IL-1 lnterleucin-1 IL-8 lnterleucin-8 ll-8p-Luc Expresión de luciferasa impulsora de reportador- promotor de IL-8 IL-24 lnterleucin-24 KIAA0616 Proteína hipotética predicha por el clon de cDNA KIAA0616 KID Dominio inducible de cinasa AP3K11 Cinasa cinasa cinasa de proteína activada por mitogene 11 MAP3K12 Cinasa cinasa cinasa de proteína activada por mitogene 12 MEK Cinasa de proteína activada por mitogene/ERK cinasa MEKK Cinasa de proteína activada por mitogene/ERK cinasa cinasa-1 MSK Proteína cinasa activada por mitogene y tensión NFAT Factor nuclear de células T activadas NF-IL-6 Factor nuclear-interleucin-factor de transcripción 6 NF-?? Factor nuclear de intensificador de gene de polipéptido ligero kappa en células B NPY Neuropéptido Y NR2F2 Subfamila de receptor nuclear 2, grupo F, miembro 2 Oct-1 Factor de transcripción de unión a octámero 1 Oct-1/C/EBP Factor de transcripción de unión a octámero 1/CCAAT/proteína de unión de intensificador PCK1 Fosfoenolpiruvato carboxi cinasa I P A Proteína cinasa dependiente de A P cíclico POLII RNA polimerasa II relA Homólogo de oncogene viral de reticuloendoteüosis A, alias NK-KB subunidad 3, p65 Rho-GEF-p114 Factor de intercambio de nucleótido de guanina rho- específico p114 R1PK2 serina-treonina cinasa que interactúa con receptor 2 RLU Unidad de luminiscencia relativa RSK S6 cinasa ribosomal TBP proteína de unión a TATA TEF1 Factor embriónico tirotrófico 1 TF Factor transcripcional TNFcc Factor de necrosis de tumor - a TRAF6 Factor asociado a receptor de TNF 6 TSHcc Hormona tiroide-estimulante alfa VCAM1 Molécula de adhesión celular vascular-1 XboxP Proteína de unión casilla X 1 Como se usa en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen referencia plural a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia al "anticuerpo" es una referencia a uno o más anticuerpos y equivalentes de los mismos concidos para aquéllos expertos en la técnica. Además, la referencia a una proteína CREAP o "CREAP" a menos que se note de otra manera, incluye cualquiera de una o más de las proteínas CREAP descritas en la presente, en particular, cualquiera de una o más de los polipéptidos de CREAP1 -3 humanos identificados en la presente como pertenecientes a la familia de proteínas CREAP. La capacidad de una substancia para "modular" una proteína CREAP (por ejemplo, un modulador de "CREAP") incluye, pero no está limitada a, la capacidad de una substancia a inhibir o intensificar la actividad de una proteína CREAP y/o inhibir o intensificar la expresión de cualquiera de una o más de dichas proteínas. Tales moduladores incluyen tanto agonistas como antagonistas de la actividad de CREAP. Tal modulación también podría involucra efectuar la capacidad de otras proteínas a interactuar con proteínas CREAP, por ejemplo, proteínas reguladoras relacionadas o proteínas que son modificadas por CREAP. El término "agonista", como se usa en la presente, se refiere a una molécula (es decir, modulador), el cual, directa o indirectamente, puede modular un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de CREAP) y el cual puede aumentar la actividad biológica de dicho polipéptido. Los agonistas pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos u otras moléculas. Un modulador que intensifica la transcripción de gene o la función bioquímica de una proteína es algo que aumenta la transcripción o estimula las propiedades bioquímicas o actividad de dicha proteína, respectivamente. Los términos "antagonista" o "inhibidor", como se usa en la presente, se refieren a una molécula (es decir, modulador), la cual puede modular directa o indirectamente un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de CREAP) el cual bloquea o inhibe la actividad biológica de dicho polipéptido. Los antagonistas e inhibidores pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos u otras moléculas. Un modulador que inhibe la expresión o la función bioquímica de una proteína es algo que reduce la expresión de gene o actividad biológica de dicha proteína, respectivamente. "Secuencia de ácido nucleico", como se usa en la presente, se refiere a un oligonucleótido, nucleótido o polinucleótido y fragmentos o porciones de los mismos, y a DNA o RNA de origen genómico o sintético que puede ser de filamento doble o simple, y representa el filamento de sentido o antisentido. El término "antisentido", como se usa en la presente, se refiere a secuencias de nucleótidos las cuales son complementarias a una secuencia de DNA o RNA específica. El término "filamento antisentido" es usado en referencia a un filamento de ácido nucleico que es complementario al filamento de "sentido". Las moléculas antisentido pueden ser producidas por cualquier método, incluyendo síntesis al ligar el o los genes de interés en una orientación inversa a un promotor viral, lo cual permite la síntesis de un filamento complementario. Una vez introducido en la célula, este filamento transcrito combina las secuencias naturales producidas por la célula para formar duplos. Estos duplos bloquean entonces ya sea la transcripción o traducción adicional. La designación "negativo" es usada algunas veces en referencia al filamento antisentido, y "positivo" es usada algunas veces en referencia al filamento de sentido. Como se contempla en la presente, los oligonucleótidos antisentido, DNA de triple hélice, RNA aptámeros, siRNA, ribozimas y RNA de filamento doble o simple son diseñados para inhibir la expresión de CREAP, de manera que la secuencia de nucleótidos elegida de la proteína a la cual la molécula inhibitoria diseñada puede provocar inhibición específica de producción de CREAP endógena. Por ejemplo, el conocimiento de la secuencia de nucleótidos de CREAP1 puede ser usada para diseñar una molécula antisentido la cual de la más fuerte hibridación para mRNA de CREAP sin experimentación indebida. De manera similar, las ribozimas pueden ser sintetizadas para reconocer las secuencias de nucleótidos específicas de una proteína de interés y cortarla (Cech. J. Amer. Med Assn. 260:3030 (1988)). Las técnicas para el diseño de tales moléculas para uso en inhibición enfocada de expresión de gene son bien conocidas para alguien de habilidad en la técnica. Las proteínas CREAP descritas en la presente incluyen, pero no están limitadas a, los polipéptido humanos de CREAP1 , CREAP2 y CREAP3, cualquiera y todas las formas de estos polipéptidos incluyendo, pero no limitando a, formas parciales, homólogos, isoformas, formas precursoras, los polipéptidos de longitud completa, proteínas de fusión conteniendo la secuencia de proteína o fragmentos de cualquiera de las anteriores, de humanos y cualquier otra especie. Los fragmentos de interés incluyen, pero no están limitados a, aquéllos fragmentos que contienen aminoácidos de importancia particular para función de CREAP normal, incluyendo por ejemplo, los aminoácidos 356-580. La secuencia de CREAP1 y sus variantes, pueden encontrarse en Genbank, números de acceso NM_025021 y AB014516. Las secuencias correctas, completas de CREAP2 y CREAP3, al conocimiento del solicitante, no han sido descritas previamente; secuencias parciales pueden encontrarse en Genbank (CREAP 2 número de acceso XM_1 17201 (DNA) y XP_1 17201 (proteína) y CREAP3 número de acceso AK090443 (DNA) y BAC03424 (proteína)). Los homólogos de CREAP incluyen aquéllos descritos en la presente, y aquéllos los cuales serían evidentes para alguien de habilidad en la técnica y se pretenden incluir dentro del alcance de la invención. También se contempla que las proteínas CREAP incluyen aquéllas aisladas de fuentes que ocurren de manera natural de cualquier especie, tal como genotecas de DNA genómico así como células huésped diseñadas genéticamente que comprenden sistemas de expresión, o producidos por síntesis químicas usando, por ejemplo, sintetizadores de péptido automatizados o una combinación de tales métodos. Los medios para aislar y preparar tales polipéptidos son bien entendidos en la técnica. El término "muestra" o "muestra biológica", como se usa en la presente, es usado en su sentido más amplio. Una muestra biológica de un sujeto puede comprender sangre, orina u otro material biológico con el cual pueda ensayarse con actividad o expresión de gene de proteínas CREAP. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas intactas así como fragmentos de las mismas, tales como Fa, F(ab')2 y Fv, los cuales son capaces de unir el determinante epitópico. Anticuerpos que unen los polipéptidos de CREAP descritos en la presente pueden prepararse usando polipéptidos intactos o fragmentos conteniendo pequeños péptidos de interés como el antígeno inmunizante. Los polipéptidos o péptidos usados para inmunizar un animal pueden ser derivados de la traducción de RNA o ser sintetizados químicamente, y pueden ser conjugados a una proteína portadora, si se desea. Los portadores comúnmente usados que son acoplados químicamente a péptidos incluyen albúmina de suero bovino y tiroglobulina. El péptido acoplado es usado entonces para inmunizar un animal (por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo). El término "anticuerpo humanizado", como se usa en la presente, se refiere a moléculas de anticuerpo en las cuales los aminoácidos han sido reemplazados en las regiones de unión no de antígeno con el fin de asemejarse más estrechamente a un anticuerpo humano, mientras que todavía retienen la capacidad de unión original. Un imitador de péptido es un péptido derivado sintéticamente o agente o de péptido creado con base en un conocimiento de los residuos críticos de un polipéptido sujeto, el cual puede imitar la función de polipéptido normal. Los imitadores de péptido pueden romper la unión de un polipéptido a su receptor o a otras proteínas, y así interferir con la función normal de un polipéptido. Por ejemplo, un imitador de CREAP interferiría con una función de CREAP normal. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es la cantidad de medicamento suficiente para tratar, prevenir o mejorar las condiciones patológicas relacionadas con la activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quimiocinas. "Proteínas reguladoras relacionadas" y "polipéptidos reguladores relacionados", como se usan en a presente, se refieren a polipéptidos involucrados en la regulación de proteínas CREAP, que pueden ser identificados por alguien de habilidad en la técnica usando métodos convencionales tales como los descritos en la presente. "Condiciones patológicas relacionadas con la activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quimiocinas" incluyen, pero no están limitadas a, condiciones tales como: osteoartritis, COPD, psoriasis, asma, artiritis reumatoide, cáncer, angiogénesis patológica, diabetes, hipertensión, dolor crónico y otras enfermedades inflamatorias y autoinmunes, así como condiciones neurodegenerativas, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y Enfermedad de Huntington. La activación anormal puede incluir activación excesiva, por ejemplo, estados donde el mRNA que codifica una proteína CREAP es sobre-regulada o los productos de proteína de estos genes tienen actividad intensificada en una célula a través ya sea de aumentos en cantidad absoluta o actividad específica, así como estados en los cuales existe una sub-regulación de expresión de gene dependiente de CRE o existe activación de quimiocina anormalmente baja.

Como se contempla aquí, la presente invención incluye un método para usar los genes y productos de gene CREAP descritos en la presente para descubrir agonistas y antagonistas que inducen o reprimen, respectivamente, gens dependientes de CRE. Como se usa en la presente, un gene "dependiente de CRE" incluye esos genes que son dependientes de un elemento de respuesta de AMP cíclico, el cual actúa a través de una proteína de unión de CRE, tal como CREB1 , CREB2, CRE-Bpa (para revisión, ver Lonze, B. , y Ginty, D. (2002) Neuron 35, 605; Muller FU , Neumann J. Schmitz W. , Mol Cell Biochem 2000 Sep;212 (1 -2): 1 1 -7 y Mayr B, Montminy M. Nat Rev Mol Cell Biol 2001 Aug:2(8):599-609) . Estos genes incluyen, pero no están limitados a, genes que son vitales para control metabólico tal como PEPCK, proteína no acopladora 1 , moléculas neuroreguladoras, tales como Galanina y tirosina hidroxilasa, y factores de crecimiento incluyendo insulina y anfirregulin. Las quimiocinas activadas por CREAP incluyen I L-8 y Exodus1/MI P3 alfa y quimiocinas activadas por CRE incluyendo MI P-1 beta (Proffitt et al. , 1995, Gene 152: 173-1 79; y Zhang et al., 2002; J . Biol Chem, 277: 19042-19048). "Sujeto" se refiere a cualquier organismo humano o no humano. En su sentido más amplio, el término "substancialmente similar" o "equivalente", cuando se usa en la presente con respecto a una secuencia de nucleótidos, significa una secuencia de nucleótidos correspondiente a una secuencia de nucleótidos de referencia, en donde la secuencia correspondiente codifica un polipéptido que tiene substancialmente la misma estructura y función que el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de referencia, por ejemplo, donde solo ocurren cambios en aminoácidos que no afectan la función del polipéptido. De manera deseable, la secuencia de nucleótidos substancialmente similar codifica el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de referencia. El porcentaje de identidad entre la secuencia de nucleótidos substancialmente similar y la secuencia de nucleótidos de referencia de manera deseable es al menos 80%, más deseablemente al menos 85%, de preferencia al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, todavía más preferiblemente al menos 99%. Una secuencia de nucleótidos "substancialmente similar" a la secuencia de nucleótidos de referencia híbrida a la secuencia de nucleótidos de referencia en 7% dodecil sulfato de sodio (SDS), 0.5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C con lavado en 2X SSC, 0.1% SDS a 50°C, más deseablemente en 7% dodecil sulfato de sodio (SDS), 0.5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C con lavado en 1X SSC, 0.1% SDS a 50°C, más deseablemente todavía en 7% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 0.5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C con lavado en 0.5X SSC, 0.1% SDS a 50°C, de preferencia en 7% dodecil sulfato de sodio (SDS), 0.5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C con lavado en 0.1X SSC, 0.1% SDS a 50°C, más preferiblemente en 7% dodecil sulfato de sodio (SDS), 0.5 M NaP0 , 1 mM EDTA a 50°C con lavado en 0.1X SSC, 0.1% SDS a 65°C, aún todavía codifica un producto de gene funcionalmente equivalente. En general, las condiciones de hibridación pueden ser altamente astringentes o menos altamente astringentes. En casos en donde las moléculas de ácido nucleico son desoxioligonucleótidos ("oligos"), las condiciones altamente astringentes pueden referirse, por ejemplo, a lavado en 6X SSC/0.05% pirofosfato de sodio a 37°C (para oligos de 14 bases), 48°C (para oligos de 17 bases), 55°C (para oligos de 20 bases) y 60°C (para oligos de 23 bases). Los rangos adecuados de tales condiciones de astringencia para ácidos nucleicos de composiciones variantes son descritos en Krause y Aaronson (1991 ), Methods in Enzymology, 200:546-556 además de Maniatis et al. , citado antes. "Transcripción elevada de mRNA" se refiere a una mayor cantidad de RNA mensajero transcrito a partir del gene humano endógeno natural que codifica un polipéptido CREAP de la presente invención en un tejido o célula apropiado de un individuo que sufre de una condición patológica relacionada con la activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quimiocinas comparadas con niveles de control, en particular al menos aproximadamente el doble, de preferencia al menos cinco veces, más preferiblemente al menos diez veces, muy preferiblemente al menos aproximadamente 100 veces la cantidad de mRNA encontrado en tejidos correspondientes en sjetos que no sufren de tal condición. Tal nivel elevado de mRNA puede conducir eventualmente a niveles incrementados de proteína traducidos de tal mRNA en un individuo que sufre de dicha condición como se compara con un individuo saludable. Una "célula huésped", como se usa en la presente, se refiere a una célula procariótica o eucariótica que contiene DNA heterólogo que ha sido introducido en la célula por cualquier medio, por ejemplo, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, microinyección, transformación, infección viral y similares. "Heterólogo", como se usa en la presente, significa "de diferente origen natural" o representa un estado no natural. Por ejemplo, si una célula huésped es transformada con un DNA o gene derivado de otro organismo, en particular de otra especie, ese gene es heterólogo con respecto a esa célula huésped y también con respecto a los descendientes de la célula huésped que porta ese gene. De manera similar, heterólogo se refiere a una secuencia de nucleótidos derivada de e insertada en el mismo tipo de céula original, natural, pero que está presente en un estado no natural, por ejemplo, un número de copia diferente, o bajo el control de diferentes elementos reguladores. Una molécula de "vector" es una molécula de ácido nucleico en la cual el ácido nucleico heterólogo puede ser insertado, que puede ser introducida en una célula huésped apropiada. Los vectores de preferencia tienen uno o más orígenes de repücación y uno o más sitios en los cuales el DNA recombinante puede ser insertado. Los vectores frecuentemente tienen medios convenientes por los cuales las células con vectores pueden ser seleccionados de aquéllos sin, por ejemplo, codifican genes de resistencia de medicamento. Los vectores comunes incluyen plásmidos, genomas virales y (principalmente en levadura y bacteria) "cromosomas artificiales". Los "plásmidos" generalmente son designados en la presente por una p minúscula precedida y/o seguida por mayúsculas y/o números, de acuerdo con convenciones de nombramiento estándares que son familiares a aquéllos de habilidad en la técnica. Los plásmidos iniciales descritos en la presente son ya sea comercialmente disponibles, públicamente disponibles en una base sin restringir, o pueden ser construidos a partir de plásmidos disponibles mediante aplicación de rutina de procedimientos publicados, bien conocidos. Muchos plásmidos y otros vectores de clonación y expresión que pueden ser usados de acuerdo con la presente invención son bien conocidos y fácilmente disponibles para aquéllos de habilidad en la técnica. Más aún, aquéllos de habilidad fácilmente pueden construir cualquier variedad de otros plásmidos adecuados para uso en la invención. Las propiedades, construcción y uso de tales plásmidos, así como otros vectores, en la presente invención, serán fácilmente evidentes para aquéllos de habilidad de la presente descripción. El término "aislado" significa que el material es removido de su ambiente original (por ejemplo, el amibnete natural si es que ocurre de manera natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que ocurre de manera natural presente en un animal vivo no es aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o todo los materiales coexistentes en el sistema natural, es aislado, aún si es reintroducido subsecuentemente en el sistema nautral. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y todavía ser aislados en tal vecotr o composición no es parte de su ambiente natural. Como se usa en la presente, el término "secuencia de control transcripcional" se refiere a secuencias de DNA, tales como secuencias iniciadoras, secuencias intensificadoras y secuencias promotoras, las cuales induce, reprimen o controla de otra manera la transcripción de secuencias de ácido nucleico que codifican proteína a las cuales están enlazadas de manera operable.

Como se usa en la presente, "secuencias de control transcripcional humanas" son cualquiera de esas secuencias de control transcripcional normalmente encontradas asociadas con un gene humano que codifica cualquiera de una o más de las proteínas CREAP de la presente invención, como se encuentra en el cromosoma humano respectivo. Como se usa en la presente, "secuencia de control transcripcional no humano" es cualqueir secuencia de control transcripcional no encontrada en el genoma humano. Como se usa en la presente, un "derivado químico" de un polipéptido de la invención es un polipéptido de la invención que contiene porciones quím icas adicionales no normalmente una parte de la molécula. Tales porciones pueden mejorar la solubilidad, absorción, vida media biológica de la molécula, etc. Las porciones pueden disminuir alternativamente la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto lateral indeseable de la molécula, etc. Las porciones capaces de mediar tales efectos son descritas, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Ciencias farmacéuticas de Remington), 16a ed. , Mack Publishing Co. , Easton, Pa. (1 980). La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que la proteína previamente referida en las bases de datos de secuencia públicas como "KIAA0616" y hasta ahora de función desconocida, es una proteína activadora de CRE. Referida en la presente com CREAP 1 , además de activar la transcripción dependiente de CRE en general, este polipéptido también induce una variedad de genes asociados con enfermedad, tal como quimiocinas, enzimas tales como PEPCK y factores de crecimiento tal como anfirregulin. Además, una investigación de bases de datos públicas indica que dos cDNAs y proteínas previamente depositadas (aunque con errores y/o solo secuencia parcial) sin ninguna referencia a función, XP_1 17201 y FLJ00364, codifican proteínas con actividades similares a CREAP 1. Como tal, la presente invención incluye secuencias de nucleótidos precisas no descritas hasta ahora, las cuales codifican polipéptidos designados en la presente como CREAP2 y CREAP3 y las cuales pertenecen a una nueva familia de proteínas CREAP, como será señalado con detalle en la presente. Así, la presente invención proporciona polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO:25. Adicionalmente, la invención proporciona polipéptidos aislados que consisten de secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 1 6 y SEQ ID NO.25. Tales polipéptidos puede ser, por ejemplo, una proteína de fusión incluyendo la secuencia de aminoácidos de CREAP2 o CREAP3. Las proteínas de fusión que comprenden CREAP1 también son contempladas en la presente. La invención también incluye moléculas de ácido nucleico o nucleótido, de preferencia moléculas de DNA, en particular que codifican proteínas CREAP, en particular, CREAP2 o CREAP3. De preferencia, una molécula de ácido nucleico aislada, de preferencia una molécula de DNA, de la presente invención, codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ I D NO: 16 o SEQ ID NO:25. De igual manera preferida es una molécula de ácido nucleico aislada, de preferencia una molécula de DNA, que codifica un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ I D NO: 16 o SEQ ID NO.25. La invención también abarca: (a) vectores que comprenden una secuencia de nucleótidos de una proteína CREAP, en particular CREAP1 , CREAP2 o CREAP3 humanas o un fragmento de la misma y/o sus complementos (es decir, antisentido); (b) moléculas de Vector, de preferencia moléculas de vector que comprenden secuencias de control transcripcional, en particular vectores de expresión, los cuales comprenden secuencias de codificación de cualquiera de las proteínas CREAP anteriores asociadas operativamente con un elemento regulador que dirige la expresión de las secuencias codificadoras; y (c) células huésped diseñadas genéticamente que contienen una molécula de vector como se menciona en la presente o al menos un fragmento de cualquiera de las secuencias de nucleótidos anteriores asociadas operativamente con un elemento regulador que dirige la expresión de las secuencias codificadoras en la célula huésped. Como se usa en la presente, los elementos reguladores incluyen, pero no están limitados a, promotores, intensificadores, operadores y otros elementos inducibles o no ¡nducibles conocidos para aquéllos expertos en la técnica que impulsan y regulan la expresión. De preferencia, las células huésped pueden ser células huésped de vertebrados, de preferencia células huésped de mamífero, tales como células humanas o células roedoras, tales como células CHO o BHK. De igualmente preferidas, las céluas huésped pueden ser células huésped bacterianas, en particular células de E. coli.

Es particularmente preferida una célula huésped, en particular del tipo antes descrito, el cual puede ser propagado in vitro y el cual es capaz de crecimiento en cultivo para producir un polipéptido de CREAP, en particular un polipéptido que comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Nos: 2, 1 6 o 25, en donde dicha célula comprende al menos una secuencia de control transcripcional que no es una secuencia de control transcripcional del gene humano endógeno natural que codifica dicho polipéptido, en donde dicha una o más secuencias de control transcripcional controlan la transcripción de un DNA que codifica dichos polipéptidos. La invención también incluye fragmentos de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente. Fragmentos de las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido CREAP pueden ser usados como una sonda de hibridación para una genoteca de cDNA para aislar el gene de longitud completa y aislar otros genes los cuales tienen una similitud de secuencia alta a un gene de CREAP de actividad biológica similar. Las sondas de este tipo de preferencia tienen al menos aproximadamente 30 bases y pueden contener, por ejemplo, desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 50 bases, aproximadamente 50 hasta aproximadamente 100 bases, aproximadamente 1 00 hasta aproximadamente 200 bases, o más de 200 bases. La sonda también puede ser usada para identificar un clon de cDNA correspondiente a un transcripto de longitud completa y un clon genómico o clones que contienen un gene de CREAP completo incluyendo regiones reguladoras y promotoras, exones e intrones. Un ejemplo de una clasificación comprende aislar la región de codificación de un gene de CREAP al usar la secuencia de DNA conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Los oligonucleótidos marcados que tienen una secuencia complementara a aquélla del gene de la presente invención se usan para clasificar una genoteca de cDNA humano, DNA genómico o mRNA para determinar a cuales miembros de la genoteca híbrida la sonda. Además de las secuencias de gene descitas antes, los homólogos de tales secuencias son descritos en la presente, de manera específica, proteínas CREAP de Drosophila, ratón y Fugu rubripres han sido identificados (ver Ejemplos más adelante). Los homólogos adicionales pueden ser identificados y aislados fácilmente, sin experimentación indebida, mediante técnicas de biología molecular bien conocidas en la técnica. Además, pueden existir genes de otros lugares genéticos dentro del genoma que codifican proteínas que tienen homología extensiva a uno o más dominios de tales productos de gene. Estos genes también pueden ser identificados vía técnicas similares. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos aislada de la presente invención que codifica un polipéptido de CREAP puede ser marcada y usada para clasificar una genoteca de cDNA construida a partir de mRNA obtenido del organismo de interés. Las condiciones de hibridación serán de una menor astringencia cuando la genoteca de cDNA fue derivada de un organismo diferente del tipo de organismo del cual la secuencia marcada fue derivada. De manera alternativa, el fragmento marcado puede ser usado para clasificar una genoteca genómica derivada del organismo de interés, nuevamente, usando condiciones astringentes de manera apropiada. Tales condiciones de baja astringencia serán bien concidas para aquéllos de habilidad en la técnica y variarán de manera predecible dependiendo de los organismos específicos a partir de los cuales se derivan la genoteca y las secuencias etiquetadas. Para guía con respecto a tales condiciones ver, por ejemplo, Sambrook et al. citado antes. Además, una secuencia tipo gene expresada diferencialmente, previamente desconocida, puede ser aislada al realizar PCR usando dos depósitos de iniciadores de oligonucleótidos degenerados diseñados en la base de secuencias de aminoácidos dentro del gene de interés. La plantilla para la reacción puede ser cDNA obtenido mediante transcripción inversa de mRNA preparado a partir de líneas de células humanas o no humanas o tejido conocido o que se sospecha que expresa un alelo de gene expresado diferencialmente. El producto de PCR puede ser subclonado y secuenciado para asegurar que las secuencias amplificadas representan las secuencias de una secuencia de ácido nucleico similar a gene expresado diferencialmente. El fragmento de PCR puede ser usado entonces para aislar un clon de cDNA de longitud completa mediante una variedad de métodos. Por ejemplo, el fragmento amplificado puede ser etiquetado y usado para clasificar una genoteca de cDNA de bacteriófago. De manera alternativa, el fragmento etiquetado puede ser usado para clasificar una genoteca genómica. La tecnología de PCR también puede ser utilizada para aislar secuencias de cDNA de longitud completa. Por ejemplo, puede aislarse RNA, siguiendo procedimientos estándares, a partir de una fuente celular o de tejido apropiada. La reacción de transcripción inversa puede ser realizada en el RNA usando un iniciador de oligonucleótido específico para el extremo más 50' del fragmento amplificado para la iniciación de la síntesis de primer filamento. El híbrido de RNA/DNA resultante puede ser "provisto de cola" con guaninas usando una reacción de transferasa terminal estándar, el híbrido puede ser digerido con RNAasa H, y la síntesis del segundo filamento puede ser iniciada entonces con un iniciador poly-C. De esta manera, las secuencias de cDNA corriente arriba del fragmento amplificado pueden ser aisladas fácilmente. Para una revisión de estrategias de clonación las cuales pueden ser usadas, ver por ejemplo, Sambrook et al. , 1 989, supra. En casos donde el gene identificado es el gene normal, o tipo natural, este gene puede ser usado para aislar alelos mutantes del gene. Tal aislamiento es preferible en procesos y desórdenes los cuales son conocidos o que se sospecha que tienen una base genética. Los alelos mutantes pueden ser aislados de individuos ya sea conocidos o que se sospecha que tienen un genotipo que contribuye a los síntomas de enfermedad relacionados con inflamación o respuesta inmune. Los alelos mutantes y productos de alelo mutantes pueden ser utilizados entonces en los sistemas de ensayo diagnóstico descritos más adelante. Un cDNA del gene mutante puede ser aislado, por ejemplo, al usar PCR, una técnica que es bien conocida para aquéllos de habilidad en la técnica. En este caso, el primer filamento de cDNA puede ser sintetizado al hibridar un oligonucleótido oligo-dT a mRNA aislado de tejido conocido o que se sospecha que es expresado en un individuo que porta putativamente el alelo muíante y al extender el nuevo filamento con transcriptasa inversa. El segundo filamento del cDNA es sintetizado entonces usando un oligonucleótido que híbrida específicamente el extremo 50 del gene normal. Usando estos dos iniciadores, el producto es amplificado entonces vía PCR, clonado en un vector adecuado, y sometido a un análisis de secuencia de DNA a través de métodos bien conocidos para aquéllos de habilidad en la técnica. Al comparar la secuencia de DNA del gene mutante a aquélla del gene normal, la o las mutaciones responsables por la pérdida o alteración de función del producto de gene mutante pueden ser averiguadas. De manera alternativa, una genoteca genómica o de cDNA puede ser construida y clasificada usando DNA o RNA, respectivamente, a partir de un tejido conocido o que se sospecha que expresa el gene de interés en un individuo que se sospecha o se sabe que porta el alelo mutante. El gene normal o cualquier fragmento adecuado del mismo puede ser etiquetado enotnces y usado como una sonda para identificar el alelo mutante corespondiente en la genoteca. El clon que contiene este gene puede ser purificado entonces a través de métodos prácticos de manera rutinaria en la técnica y sometido a análisis de secuencia como se describe antes. De manera adicional, una genoteca de expresión puede ser construida utilizando DNA aislado de o cDNA sintetizado a partir de un tejido conocido o que se sospencha que expresa el gene de interés en un individuo que se sospecha o se sabe que porta el alelo mutante. En esta manera, los productos de gene hechos por el tejido mutante putativmente pueden ser expresados y clasificados usando técnicas de clasificación de anticuerpos estándares en conjunción con anticuerpos cultivados contra el producto de gene normal, como se describe, más adelante. (Para técnicas de clasificación ver, por ejemplo, Harlow, E. y Lañe, eds. , 1988 "Antibodies: A Laboratory Manual" (Anticuerpos: Un manual de laboratorio), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor) . En casos donde la mutación resulta en un producto de gene expresado con función alterada (por ejemplo, como un resultado de una mutación en sentido equivocado), un conjunto policlonal de anticuerpos es probable que reaccione cruzado con el producto de gene mutante. Los clones de genoteca detectados vía su reacción con tales anticuerpos etiquetados pueden ser purificados y sometidos a análisis de secuencia como se describe antes. La presente invención incluye esas proteínas o fragmentos de las mismoas codificadas por secuencias de nucleótidos expuestas en cualquiera de SEQ I D Nos: 1 , 15, 24, 26, 28,31 . Adicionalmente, la presente invención incluye proteínas que representan productos de gene funcionalmente equivalentes. Tal producto de gene expresado diferencialmente equivalente puede contener supresiones, adiciones o substituciones de residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias de gene expresadas diferencialmente descritas antes, pero que resultan en un cambio silencioso, produciendo así un producto de gene expresado diferencialmente, equivalente funcionalmente. Las substituciones de amionácidos pueden hacerse en la base de similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteina, tirosina, asparagina y glutamina; aminoácidos (básicos) cargados positivamente incluyen arginina, lisina e histidina; y aminoácidos (ácido) cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. "Funcionalmente equivalente", como se utiliza en la presente, puede referirse a una proteína o polipéptido capaz de exhibir una actividad in vivo o in vitro substancialmente similar como los productos de gene expresados diferencialmente, endógenos, codificados por las secuencias de gene expresadas diferencialmente descritas antes. "Funcionalmente equivalente" puede referirse también a proteínas o polipéptidos capaces de interactuar con otras moléculas celulares o extracelulares en una manera substancialmente similar a la manera en la cual la porción correspondiente del producto de gene expresado diferencialmente, endógeno, lo haría. Por ejemplo, un péptido "funcionalmente equivalente" sería capaz, en un inmunoensayo, de disminuir la unión de un anticuerpo al péptido correspondiente (es decir, el péptido, la secuencia de aminoácidos de la cual fue modificado para alcanzar el péptido "funcionalmente equivalente") de la proteína endógena, o a la proteína endógena por sí misma, donde el anticuerpo fue cultivado contra el péptido correspondiente de la proteína endógena. Una concentración equimolar del péptido funcionalmente equivalente disminuirá la unión antes mencionada del péptido correspondiente por al menos aproximadamente 5% , de preferencia entre aproximadamente 5% y 10% , más preferiblemente entre aproximadamente 10% y 25% , aún más preferiblemente entre aproximadamente 25% y 50%, y muy preferiblemente entre aproximadmente 40% y 50%. Los datos descritos en la presente indican que los fragmentos de polipéptido particulares son críticos para la actividad de la familia de proteínas CREAP. Para CREAP1 -3, estas regiones son particularmente los 200 aminoácidos amino terminales conservados y los 1 00 aminoácidos carboxi terminales, cada región de las cuales como varios dominios conservados. Los polipéptidos particularmente preferidos de la presente invención son aquéllos que comprenden secuencias de aminoácidos correspondientes a o contenidas dentro de las regiones evolucionariamente conservadas tales como, por ejemplo, los 75 aminoácidos terminales de cada proteína; por ejemplo, la región desde a. a. 1 hasta 75, más específicamente, el fragmento de aminoácidos 1 -68 para CREAP 1 , el fragmento de aminoácidos 1 -74 para CREAP2 y el fragmento de aminoácidos 1 -66 para CREAP3. De esta manera, estos fragmentos de péptido CREAP así como fragmentos de los ácidos nucleicos que codifican la porción activa de los polipéptidos CREAP descritos en la presente, y vectores que comprenden dichos fragmentos, también están dentro del alcance de la presente invención. Como se usa en la presente, un fragmento del ácido nucleico que codifica la porción activa de los polipéptidos de CREAP se refiere a una secuencia de nucleótidos que tiene menos nucleótidos que la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos completa de un polipéptido de CREAP y que codifica un péptido que tiene una actividad de una proteína CREAP (es decir, un péptido que tiene al menos una actividad biológica de una proteína CREAP) como se define en la presente. En general, el ácido nucleico que codifica un péptido que tiene una actividad de una proteína CREAP será seleccionado de las bases que codifican la proteína madura. Sin embargo, en algunos casos, puede ser deseable seleccionar todo o parte de un péptido de la porción de secuencia líder de los ácidos nucleicos de una proteína CREAP. Estos ácidos nucleicos también pueden contener secuencias eniazadoras, sitios de endonucleasa de restricción modificada y otras secuencias útiles para clonación molecular, expresión o purificación de péptidos recombinantes que tienen al menos una actividad biológica de una proteína CREAP. Los fragmentos de péptido CREAP así como ácidos nucleicos que codifican un fragmento de péptido teniendo una actividad de proteína CREAP pueden ser obtenidos de acuerdo con métodos convencionales. Además, los anticuerpos dirigidos a estos fragmentos de péptido pueden hacerse como se describe antes en la presente. Las modificaciones de estos fragmentos de polipéptido (por ejemplo, substituciones de aminoácidos) las cuales pueden aumentar la inmunogenicidad del péptido, también pueden ser empleadas. De manera similar, usando métodos familiares para alguien de habilidad en la técnica, dichos péptidos de las proteínas CREAP pueden ser modificados para contener secuencias de señal o líderes o conjugadas con un enlazador u otra secuencia para facilitar las manipulaciones moleculares. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser producidos mediante tecnología de DNA recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por lo tanto, se proporciona un método para producir un polipéptido de la presente invención, dicho método comprende cultivar una célula huésped que tiene incorporado en ella un vector de expresión conteniendo un polinucleótido derivado de manera exógena que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID Nos: 2, 16, 25, 27, 29 y 30, de preferencia SEQ ID NOS 2, 16 y 25, bajo condiciones suficientes para expresión del polipéptido en la célula huésped, provocando por ello la producción del polipéptido expresado. De manera opcional, dicho método comprende además recuperar el polipéptido producido por dicha célula. En una modalidad preferida de tal método, dicho polinucleótido derivado de manera exógena codifica un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ I D NO:2, 16, 25, 27, 29 y 30. De preferencia, dicho polinucleótido derivado de manera exógena comprende la secuencia de nucleotidos como se expone en cuaquiera de la SEQ ID Nos: 1 , 15, 24, 26, 28 y 31 . De esta manera, los métodos para preparar los polipéptidos y péptidos de la invención al expresar las secuencias de polipéptidos respectivas que codifican ácido nucleico son descritos en la presente. Los métodos que son bien conocidos para aquéllos expertos en la técnica pueden ser usados para construir vectores de expresión conteniendo secuencias que codifican proeína y señales de control de transcripción/traducción apropiadas. Estos métodos incluyen , por ejemplo, técnicas de DNA recombinantes in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo/recombinación genética. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al. , 1989, supra, y Ausubel et al. , 1989, supra. De manera alternativa, el RNA capaz de codificar secuencias de proteína de gene expresadas diferencialmente puede ser sintetizado químicamente usando, por ejemplo, sintetizadores. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en "Oligonucleotide Synthesis" (Síntesis de oligonucleótidos), 1984, Gait, M. J . ed., IRL Press, Oxford, el cual es incorporado por referencia en la presente en su totalidad. Una variedad de sistemas de huésped-vector de expresión puede ser utilizada para expresar las secuencias que codifican gene expresadas diferencialmente de la invención. Tales sistemas de huésped-expresión representan vehícuos mediante los cuales las secuencias de codificación de interés pueden ser producidas y subsecuentemente purificadas, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias de codificación de nucleótidos apropiada, exhiben la proteína de gene expresada diferencialmente de la invención in sítu. Estos incluyen pero no están limitados a microorganismos, tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plásmido o vectores de expresión de DNA de cósmido conteniendo secuencias codificadoras de proteína de gene expresadas diferencialmente; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinante conteniendo las secuencias codificadoras de proteína de gene expresadas diferencialmente; sistemas de células de insectos infectados o transfectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) conteniendo las secuencias codificadoras de proteína de gene expresadas diferencialmente; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) o transformados con vectores recombinantes, incluyendo plásmidos (por ejemplo, plásmido Ti) conteniendo secuencias codificadoras de prtoteína; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, COS, CHO, BH , 293, 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinante conteniendo promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mam ífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de 7.5K de virus vaccinia, o el promotor de C V). La expresión de las proteínas CREAP de la presente invención por una célula a partir de un gene que codifica CREAP que es natural para la célula también puede ser realizada. Los métodos para tal expresión son detallados en, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5,641 ,670; 5,733,761 ; 5,968,502; y 5,994, 127, todas las cuales son incorporadas expresamente por referencia en la presente en su totalidad. Las células que han sido inducidas a expresar CREAP mediante los métodos de cualquiera de las patentes estadounidenses, 5,641 , 670; 5,733,761 ; 5, 968,502; y 5,994, 127, pueden ser implantadas en un tejido deseado en un animal vivo con el fin de aumentar la concentración local de CREAP en el tejido. Tales métodos tienen implicaciones terapéuticas para, por ejemplo, condiciones neurodegenerativas en las cuales ocurre la pérdida de función de CREB y como tales agonistas y/o proteína CREAP exógena pueden ser útiles para prevenir, tratar o mejorar dichas condiciones. En sistemas bacterianos, una variedad de vectores de expresión puede ser seleccionada ventajosamente dependiendo del uso pretendido para la proteína que es expresada. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de tal proteína, para la generación de anticuerpos o para clasificar genotecas de péptido, por ejemplo, los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que son purificados fácilmente pueden ser deseables. A este respecto, las proteínas de fusión que comprenden etiquetas de hexahistidina pueden ser usadas (Sisk et al, 1994: J. Virol 68: 766-775) como se proporciona por una variedad de vendedores (por ejemplo, Qiagen, Valencia, CA). Tales vectores incluyen, pero no están limitados a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al. , 1983, EMBO J . 2: 1791 ), en la cual la secuencia que codifica proteína puede ligarse de manera individual al vector en el marco con la región codificadora lac Z, de manera que se produce una proteína de fusión; vectores pI N (Inouye & Inouye, 1 985, Nucleic Acids Res. 1 3:3101 -3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J . Biol. Chem . 264:5503-5509); y similares. Los vectores de pGEX también pueden ser usados para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatina S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden ser purificadas fácilmente a partir de células Usadas mediante adsorción a perlas de glutationa-agarosa seguido por levigación en la presencia de glutationa libre. Los vectores pGEX son diseñados para incluir trombina o sitios de corte de factor Xa proteasa, de manera que la proteína de gene objetivo clonado puede ser liberada de la porción GST. Las regiones promotoras pueden ser seleccionadas de cualquier gene deseado usando vectores que contienen una unidad de transcripción de reportador que carece de una región promotora, tal como una cloranfenicol acetil transferasa ("CAT"), o la unidad de transcripción de luciferasa, corriente debajo de sitio o sitios de restricción para introducir un fragmento de promotor candidato; es decir, un fragmento que puede contener un promotor. Por ejemplo, la introducción en el vector de un fragmento conteniendo promotor en el sitio de restricción corriente arriba del gene CAT engendra la producción de actividad de CAT, la cual puede ser detectada por ensayos de CAT estándares. Los vectores adecuados para este fin son bien conocidos y fácilmente disponibles. Dos de tales vectores son pKK232-8 y pCM7. Así, los promotores para expresión de polinucleótidos de la presente invención incluyen no solo promotores bien conocidos y fácilmente disponibles, sino también promotores que pueden ser obtenidos fácilmente por la técnica anterior, usando un gene reportador. Entre los promotores bacterianos conocidos adecuados para expresión de polinucleótidos y polipéptidos de acuerdo con la presente invención se encuentran los promotores lacl y lacZ de E. coli, los promotores T3 y T7, el promotor T5 tac, los promotores lambda PR, PL y el promotor trp. Entre los promotores eucarióticos conocidos adecuados a este respecto son el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de HSV timidina cinasa, los promotores de SV40 temprano y tardíao, los promotores de LTRs retrovirales, tales como aquéllos del virus de sarcoma Rous ("RSV") y los promotores de metalotioneína, tales como el promotor de metalotioneína-l de ratón. En un sistema de insecto, el virus de poihedrosis nuclear de Autographa californica (AcN PV) es uno de varios sistemas de insecto q ue pueden ser usados como un vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda . La secuencia de codificación puede ser clonada individualmente en las regiones no esenciales (por ejem plo, el gene pol ihedrina) del virus y ser colocada bajo control de un prom otor AcN PV (por ejem plo, el promotor de polihedrina). La inserción exitosa de la secuencia de codificación resultará en la inactivación del gene de polihedrina y la producción de virus recombinante no ocluido (es decir, virus q ue carece del recubrim iento proteínico codificado por el gene de poli hedrina) . Estos virus recom binantes son usados entonces para infectar células de Spodoptera frug ierda, en los cuales el gene insertado es expresado. (Por ejem plo, ver Smith et al. , 1 983, J. Virol . 56: 584; Smith , patente estadounidense no . 4,21 5 ,051 ) . En células huésped de mam ífero, puede utilizarse u na variedad de sistem as de expresión con base viral. En casos donde se usa un adenovirus como un vector de expresión la secuencia de codificación de interés puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, la secuencia de promotor tardío y líder tripartito . Este gene quimérico puede ser insertado entonces en el genoma de adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en u na región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región E 1 o E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la proteína deseada en huéspedes infectados. (Por ejemplo, ver Log'an & Shenk, 1 984, Proc. Nati. Acad . Sci. USA 81 :3655-3659) . Las señales de iniciación específicas también pueden ser requeridas para una traducción eficiente de secuencias de codificación de gene insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En casos donde un gene completo, incluyendo su propio codón de iniciación y secuencias adyacentes, sea insertado en el vector de expresión apropiado, ninguna señal de control de traducción adicional puede ser necesaria. Sin embargo, en casos dondo solo se inserta una porción de la secuencia de codificación de gene, las señales de control de traducción exógenas incluyendo, quizás, el codón de iniciación ATG, deben ser provistas. Adicionalmente, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traducción de la inserción completa. Estas señales de control de traducción exógenas y codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de expresión puede ser intensificada mediante la inclusión de elementos intensificadores de transcripción apropiados, terminadores de transcripción, etc. (ver Bittner et al. , 1 987, Methods in Enzymol. 153:516-544) . Otros sistemas comunes se basan en SV40, retrovirus o virus adeno-asociado. La selección de vectores apropiados y promotores para expresión en una célula huésped es un procedimiento bien conocido y las técnicas requeridas para construcción de vector de expresión, introducción del vector en el huésped y expresión en el huésped per se son habilidades de rutina en la técnica. En general, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación, un promotor derivado de un gene altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo y un marcador seleccionable para permitir el aislamiento de vector conteniendo células depués de la exposición al vector. Además, una cepa de célula huésped puede ser elegida, la cual module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto de gene en la manera específica deseada. A tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, corte) de productos de proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento post-traducción y modificación de proteínas. Las líneas de célula apropiadas o sistemas de huésped pueden ser elegidos para asegurar la correcta modificación y procesam iento para la proteína extraña expresada. Para este fin, pueden usarse las células huésped eucarióticas que poseen la maquinaria celular para procesamiento apropiado del transcripto primario, glicosilación y fosforilación del producto de gene. Tales células huésped de mamífero incluyen, pero no están limitadas a, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDC , 293, 3T3, W138, etc. La presente invención también incluye péptidos de CREAP recombinantes y fragmentos de péptido que tienen una actividad de una proteína CREAP. El término "proteína recombinante" se refiere a una proteína de la presente invención la cual es producida mediante técnicas recombinantes, en donde generalmente DNA que codifica un fragmento activo de CREAP es insertado en un vector de expresión adecuado, que a su vez es usado para transformar una célula huésped para producir la proteína heteróloga. En particular, los fragmentos de péptidos recombinantes que tienen una actividad de una proteína CREAP incluye fragmentos de proteína CREAP que comprenden los 200 aminoácidos amino terminales conservados o los 100 aminoácidos carboxi terminales de CREAP1 , 2 o 3. Dichos fragmentos incluyen fragmentos de aminoácidos 1 -267 y 575-650 para CREAP1 , fragmentos de aminoácidos 1 -280 y 615-693 para CREAP2 y fragmentos de aminoácidos 1 -279 y 545-619 para CREAP3, así como fragmentos que comprenden regiones de aminoácidos 1 -75 en CREAP1 -3 humanas como se discute antes. Las proteínas recombinantes de la presente invención también pueden ¡ncuir proteínas quiméricas o de fusión de CREAP y diferentes polipéptidos, los cuales pueden hacerse de acuerdo con las técnicas familares para alguien de habilidad en la técnica (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology; Eds Ausubel et al. John wiley & Sons; 1992; PNAS 85:4879 (1988)). Para la producción de alto rendimiento, de largo plazo, de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas de células que expresan de manera estable la proteína de gene diferencialmente expresado pueden ser diseñadas. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células huésped pueden ser transformadas con DNA controlado mediante elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, intensificador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Siguiendo la introducción del DNA extraño, puede permitirse que las células diseñadas crezcan durante 1 -2 días en un medio enriquecido y entonces sean cambiadas a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos, los cuales pueden a su vez, clonares y expandirse en líneas de células. Este método puede ser usado ventajosamente para diseñar líneas de células que expresen la proteína de gene expresado diferencialmente. Tales líneas de células diseñadas pueden ser particularmente útiles para clasificación y evaluación de compuestos que afectan la actividad endógena de la proteína expresada. Puede usarse una variedad de sistemas de selección, incluyendo pero no limitando a timidina cinasa de virus herpes simplex (Wigler, et al. , 1977, Cell 1 1 :223), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 48:2026) y genes de adenina fosforibosiltransferasa (Lowy, et al. , 1980, Cell 22:81 7) pueden ser empleados en células tk", hgprt" o aprt", respectivamente. Además, la resistencia antimetabolito puede ser usada como la base de selección para genes dhfr, que confiere resistencia ametotrexato (Wigler, et al. , 1980, Nati. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare, et al. , 1981 , Proc. Nati . Acad. Sci. USA 78: 1527) ; gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico ( ulligan & Berg, 1981 , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2071 ); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (CoIberr-eGarapin, et al. , 1 981 , J. Mol. Biol. 150: 1 ) ; e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre, et al. , 1 984, Gene 30: 147). Un sistema de proteína de fusión alterantivo permite la fácil purificación de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en líneas de células humanas (Janknecht, et al. , 1991 , Proc. Nati. Acad. Sci.

USA 88: 8972-8976). En este sistema, el gene de interés es succionado en un plásmido de recombinación de vaccinia, de manera que el marco de lectura abierto del gene es fusionado por traducción a una etiqueta amino-terminal que consiste de seis residuos de histidina. Los extractos de células infectadas con virus vaccinia recombinante son cargados en columnas de ácido Ni2+ nitriloacético-agarosa y proteínas etiquetadas con histidina son levigadas selectivamente con amortiguadores conteniendo imidazol. Cuando se usa como un componente en sistemas de ensayo, tales como aquéllos descritos más adelante, una proteína de la presente invención puede ser etiquetada, ya sea directa o indirectamente, para facilitar la detección de un complejo formado entre la proteína y una substancia de prueba. Cualquiera de una variedad de sistemas de etiquetado adecuados puede ser usada incluyendo, pero no limitando a radioisótopos, tales como 125l ; sistemas de etiquetado de enzimas que generan una señal o luz calorimétrica detectable cuando se expone a substrato; y etiquetas fluorescentes. Donde se usa tecnología de DNA recombinante para producir una proteína de la presente invención para tales sistemas de ensayo, puede ser ventajoso disñear proteínas de fusión que pueden facilitar el etiquetado, inmovilización, detección y/o aislamiento. El etiquetado indirecto involucra el uso de una proteína, tal como un anticuerpo etiquetado, el cual se une específicamente a un polipéptido de la presente invención. Tales anticuerpos incluyen pero no están limitados a fragmentos Fab, de cadena simple, quiméricos, monoclonales, policlonales y fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab. También se contempla en la presente que las proteínas CREAP aquí descritas sean objetivos de medicamento útiles para el desarrollo de terapéuticos para el tratamiento de condiciones patológicas relacionadas con la activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quimíocinas. Tales condiciones incluyen, pero no están limitadas a, osteoartritis, psoriasis, asma, COPD, psoriasis, asma, artritis reumatoide, cáncer, angiogénesis patológica, diabetes, hipertensión, dolor crónico y otras enfermedades inflamatorias y autoinmunes, así como condiciones neurodegenerativas, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington. Además de las quimiocinas, los datos también indican que las proteínas CREAP pueden inducir otros genes tales como PEPCK y anfirregulin. El anfirregulin es un factor de crecimiento similar a EGF asociado con cáncer. PEPCK es el factor limitante en la síntesis de glucosa y como otal es requerido para gluconeogénesis, el bloqueo de la cual se piensa comúnmente que es una aproximación terapéutica para tratar diabetes. Como tal, también se contempla en la presente que las condiciones patológicas que pueden ser tratadas por los moduladores de la presente invención incluyen condiciones asociadas con la actividad anormal o expresión de estas proteínas. Todavía en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para identificar moduladores útiles para tratar, prevenir o mejorar las condiciones patológicas discutidas antes, que comprende: a) ensayar la capacidad de un modulador candidato para inhibir o intensificar la actividad de CREAP y/o inhibir o intensificar la expresión de CREAP in vitro, ex vivo o in vivo y que puede incluir además b) ensayar la capacidad de un modulador de CREAP identificado para invertir los efectos patológicos observados en modelos in vitro, ex vivo o in vivo de dichas condiciones patológicas y/o en estudios clínicos con sujetos con dichas condiciones patológicas. Los ensayos de clasificación convencionales (por ejemplo, in vitro, ex vivo e in vivo) pueden ser usados para identificar moduladores que inhiben o intensifican la actividad de proteína CREAP y/o inhibir o intensificar la expresión de CREAP. La actividad de CREAP y niveles de CREAP pueden ser ensayados en un sujeto usando una muestra biológica del sujeto usando métodos de ensayo convencionales. La expresión de gene de CREAP (por ejemplo, niveles de mRNA) también puede ser determinada usando métodos familaires a alguien de habilidad en la técnica, incluyendo, por ejemplo, análisis Northern convencionales o microarreglos comercialmente disponibles. De manera adicional, el efecto de un compuesto de prueba en niveles de CREAP y/o niveles de proteína reguladores puede ser detectado con un ensayo con base en anticuerpo de ELISA o ensayo de reacción de etiquetado fluorescente. Estas técnicas están fácilmente disponibles para clasificación de alto rendimiento y son familiares a alguien experto en la técnica. Los datos reunidos de estos estudios pueden ser usados para identificar aquellos moduladores con utilidad terapéutica para el tratamiento de las condiciones patológicas discutidas antes; por ejemplo, substancias inhibitorias podrían ser ensayadas adicionalmente en modelos in vitro o in vivo convencionales de ciahs condiciones patológicas y/o en ensayos clínicos con humanos con dichas condiciones patológicas de acuerdo con métodos convencinales para valorar la capacidad de dichos compuestos para tratar, prevenir o mejorar dichas condiciones patológicas in vivo. La presente invención, al hacer disponible información crítica con respecto a las porciones activas de polipéptidos de CREAP, permite el desarrollo de moduladores de función de CREAP, por ejemplo, agonistas o antagonistas de molécula pequeña, al emplear diseño de medicamento racional familiar a alguien de habilidad en la técnica. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para prevenir, tratar o mejorar las condiciones patológicas descritas en la presente, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de la misma, una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un modulador de CREAP. Tales moduladores incluyen anticuerpos dirigidos a los polipéptidos de CREAP o fragmentos de los mismos. En ciertas modalidades particularmente preferidas, la composición farmacéutica comprende anticuerpos que son altamente selectivos para polipéptidos de CREAP humanos o porciones de polipéptidos de CREAP humanos. Los anticuerpos para proteínas CREAP pueden provocar la agregación de la proteína en un sujeto y así inhibir o reducir la actividad de la proteína. Tales anticuerpos también pueden inhibir o disminuir la actividad de CREAP, por ejemplo, al interactuar directamente con sitios activos o al bloquear el acceso de substratos a sitios activos. Los anticuerpos de CREAP también pueden ser usados para inhibir la actividad de CREAP al prevenir las interacciones proteína-proteína que pueden ser involucradas en la regulación de proteínas CREAP y necesarias para la actividad de proteína. Los anticuerpos con actividad inhibidora, tal como los descritos en la presente, pueden ser producidos e identificados de acuerdo con ensayos estándares familiares a alguien de habilidad en la técnica. Los anticuerpos de CREAP también pueden ser usados de manera diagnóstica. Por ejemplo, uno podría usar estos anticuerpos de acuerdo con métodos convencionales para cuantificar los niveles de una proteína de CREAP en un sujeto; los niveles incrementados podrían indicar, por ejemplo, excesiva activación de expresión de gene dependiente de CRE (por ejemplo, activación de genes que tienen CRE en sus regiones promotoras) y posiblemente podría indicar el grado de activación excesiva y severidad correspondiente de condición patológica relacionada. De esta manera, los diferentes niveles de CREAP podrían ser indicativos de varias formas clínicas o severidad de condiciones patológicas relacionadas con la expresión de gene dependiente de CRE anormal o activación anormal de quimiocinas. Tal información también sería útil para identificar subconjuntos de pacientes que sufren de una condición patológica que puede responder o no a tratamiento con moduladores de CREAP. Se contempla en la presente que monitorear los niveles o actividad de CREAP y/o detectar la expresión de CREAP (niveles de mRNA) puede usarse como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Por ejemplo, los pacientes a quienes se han administrado medicamentos serían evaluados y el clínico sería capaz de identificar aquéllos pacientes en quienes los niveles de CREAP, actividad y/o niveles de expresión son mayores que los deseados (es decir, los niveles mayores o menores que los niveles en pacientes de control que no experimentan un estado de enfermedad relacionado o en pacientes en quienes un estado de enfermedad ha sido aliviado lo suficiente por intervención clínica). Con base en estos datos, el clínico podría ajustar entonces la dosificación, régimen de administración o tipo de medicina prescrita. Los factores para consideración para optimizar una terapia para un paciente incluyen la condición particular siendo traída, el mamífero particular siendo tratado, la condición clínica del paciente individual, el sitio de entrega del compuesto activo, el tipo particular del compuesto activo, el método de administración, la programación de administración y otros factores conocidos para practicantes médicos. La cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto activo a ser administrada será gobernada por tales consideraciones y es la cantidad mínima necesaria para el tratamiento de una condición patológica dada. Como la familia de gene de CREAP contiene una región crítica de alta conservación, los imitadores de péptido de proteínas CREAP también serían predichos como que actúan como moduladores de CREAP. De esta manera, una modalidad de esta invención son péptidos derivados o diseñados a partir de proteínas de familia de CREAP los cuales puedan bloquear la función de CREAP. Se predice que estos imitadores serían capaces de bloquear la función de todas las proteínas CREAP altamente relacionadas. Los imitadores de péptido adecuados para proteínas CREAP pueden hacerse de acuerdo con métodos convencionales basados en un entendimiento de las regiones en los polipéptidos requeridos para la actividad de proteína CREAP. Brevemente, una secuencia de aminoácidos corta es identificada en una proteína mediante estudios de función de estructura convencional, tal como análisis de supresión o mutación de la proteína tipo natural. Una vez que las regiones críticas son identificadas, se anticipa que si corresponden a una porción altamente conservada de la proteína, que esta región será responsable de una función critica (tal como interacción proteína-proteína). Se predice que un imitador sintético pequeño que sea diseñado para verse como dicha región crítica competiría con la proteína intacta y así interferiría con su función. La secuencia de aminoácidos sintética podría estar compuesta por aminoácidos que igualan esta región toda o en parte. Tales aminoácidos podrían ser reemplazados con otras estructuras químicas que se asemejan a los aminoácidos originales pero que imparten propiedades farmacológicamente mejores, tales como mayor actividad inhibidora, estabilidad, vida media o biodisponibilidad. Los anticuerpos adecuados para proteínas CREAP o proteínas reguladoras relacionadas pueden obtenerse a partir de una fuente comercial o producirse de acuerdo con métodos convencionales. Por ejemplo, se describene n la presente métodos para la producción de anticuerpos capaces de reconocer específicamente uno o más epitopes de gene diferencialmente expresado. Tales anticuerpos pueden incluir, pero no están limitados a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos producidos pro una genoteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) y fragmentos de unión de epitope de cualquiera de los anteriores. Para la producción de anticuerpos para los polipéptidos de CREAP discutidos en la presente, varios animales huésped pueden ser inmunizados mediante inyección con los polipéptidos, o una porción de los mismos. Tales animales huésped pueden incluir, pero no están limitados a, conejos, ratones y ratas. Pueden usarse varios auxiliares para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped, incluyendo pero no limitando a, Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, substancias de superficie activa tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa de bocallave, dinitrofenol y auxiliares humanos potencialmente útiles tales com BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antígeno, tal como producto de gene objetivo, o un derivado funcional antigénico del mismo. Para la producción de anticuerpos policlonales, los animales huésped tales como aquéllos descritos antes, pueden ser inmunizados por inyección con los polipéptidos, o una porción de los mismos, complementados con auxiliares como también se describe antes. Los anticuerpos monoclonales, los cuales son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un antígeno particular, pueden ser obtenidos por cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas de células continuas en cultivo. Estos incluyen, pero no están limitados a la técnica de hibridoma de Kohler y Milstein (1 975, Nature 256:495-497; y la patente estadounidense no. 4, 376, 1 1 0), la técnica de hibridroma de células B humana (Kosbor et al. , 1983, Immunology today 4:72; colé et al. , 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) y la técnica de EBV-hibridoma (Colé et al. , 1985, Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy (Anticuerpos monoclonales y terapia de cáncer) , Alan R. Liss, Inc. , pp. 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de los mismos. El hibridoma que produce el mAB de esta invención puede cultivarse in vitro o in vivo. La producción de altos títulos de mABs in vivo hace esto el método de producción actualmente preferido. Además, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al. , 1 984, Proc. Nati. Acad. Sci. 81 :6851 -6855; Neuberger et al. , 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al. , 1 985, Nature, 314:452-454) al empalmar los genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad de antígeno apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual se derivan diferentes porciones de diferentes especies animales, tales como aquéllas que tienen una región variable o hipervariable derivada de un mAb de murino y una región constante de inmunoglobulina humana.

De manera alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple (patente estadounidense no. 4,946,778; Bird, 1 988, Science 242:423-426; Huston et al., 1 988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5870-5883; y Ward et al. , 1 989, Nature 334:544-546) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena simple de gene expresado diferencialmente. Los anticuerpos de cadena simple se forman al enlazar los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv vía un puente de aminoácidos, resultando en un polipéptido de cadena simple. Muy preferiblemente, las técnicas útiles para la producción de "anticuerpos humanizados" pueden ser adaptadas para producir anticuerpos para los polipéptidos, fragmentos, derivados y equivalentes funcionales descritos en la presente. Tales técnicas son descritas en las patentes estadounidenses nos. 5,932,448; 5,693,762; 5,693.761 ; 5,585,089; 5,530, 101 ; 5,910,771 ; 5,569,825; 5,625, 126; 5,633,425; 5, 789, 650; 5,545,580; 5,661 , 016; y 5,770,429, cuyas descripciones son incorporadas por referencia en la presente en su totalidad. Los fragmentos de anticuerpo que reconocen epitopes específicos pueden ser generados mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen pero no están limitados a: los fragmentos F(ab')2, los cuales pueden ser producidos por digestión de pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos, Fab los cuales pueden ser generados al reducir los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. De manera alternativa, las genotecas de exprsión Fab pueden ser construidas (Huse et al. , 1989, Science, 246: 1 275-1 281 ) para permitir una fácil y rápida identificación de fragmentos Fab monoclonaies con la especificidad deseada. La detección de los anticuerpos descrita en la presente puede lograrse usando ELISA estándar, análisis FACS y técnicas de imagenología estándares usadas in vitro o ¡n vivo. La detección puede ser facilitada al acoplar (es decir, enlazar físicamente) el anticuerpo a una substancia detectable. Ejemplos de substancias detectables incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, (3-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; ejemplos de com pl ej os de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, ¡sotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye lum inol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina, y ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen 125l, 131 l , 35S o 3H. Se prefiere particularmente, para facilidad de detección, el ensayo de sandwich, del cual existe una diversidad de variaciones, las cuales se pretende que todas sean abarcadas por la presente invención. Por ejemplo, en un ensayo adelantado normal, el anticuerpo sin marcar es inmovilizado en un substrato sólido y la muestra a ser probada es llevada a contacto con la molécula unida. Después de un periodo de incubación adecuado, durante un periodo suficiente para permitir la formación de un complejo binario de anticuerpo-antígeno, un segundo anticuerpo, marcado con una molécula reportadora capaz de inducir una señal detectable, es adicionado e incubado, permitiendo el tiempo suficiente para la formación de un complejo ternario de anticuerpo-antígeno-anticuerpo marcado. Cualquier material sin reaccionar es lavado entonces y la presencia del antígeno es determinada mediante la observación de una señal, o puede ser cuantificado al comparar con una muestra de control conteniendo cantidades conocidas de antígeno. Las variaciones en el ensayo adelantado incluyen el ensayo simultáneo, en el cual tanto la muestra como el anticuerpo son adicionados simultáneamente al anticuerpo unido, o un ensayo invertido en el cual el anticuerpo marcado y muestra a aser probada sean combinados primero, incubados y adicionados al anticuerpo unido a superficie sin marcar. Estas técnicas son bien conocidas para aquéllos expertos en la técnica y la posibilidad de variaciones menores será fácilmente evidente. Como se usa en la presente, "ensayo de sandwich" pretende abarcar todas las variaciones en la técnica de dos sitios básica. Para los inmunoensayos de la presente invención, el único factor limitante es que el anticuerpo marcado sea un anticuerpo el cual sea específico para los polipéptidos de CREAP o proteínas reguladoras relacionadas o fragmentos de los mismos. Las moléculas reportadoras muy comúnmente usadas son ya sea enzimas, moléculas conteniendo fluoróforo o radionúclido. En el caso de un inmunonesayo de enzima, una enzima es conjugada al segundo anticuerpo, usualmente por medio de glutaraldehído o periodato. Sin embargo, como se reconocerá fácilmente, existe una amplia variedad de diferentes técnicas de ligación, las cuales son bien concidas para el técnico experto. Las enzimas com ú nmente usadas incluyen peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina , entre otras. Los su bstratos a ser usados con las enzimas específicas son elegidos generalmente para la producción , sobre la h idról isis mediante la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Por ejemplo, p-nitrofenil fosfato es adecuado para usarse con conjugados de fosfatasa alcalina; para conjugados de peroxidasa, com únmente se usan 1 , 2-fenilendiamina o toluidina . También es posible emplear substratos fluorogénicos , los cuales producen unproducto fluorescente en lugar de los substratos cromogénicos notados antes. Una solución conteniendo el substrato apropiado es adicionado entonces a l complejo terciario. El substrato reacciona con la enzima enlazada al segundo anticuerpo, dando una señal visual cualitativa, la cual puede ser cuantificada adicionalmente, usualmente de manera espectrofotométrica, para dar una evaluación de la cantidad de polipéptido o fragmento de polipéptido de interés, el cual está presente en la muestra de suero. De manera alterativa, los compuestos fluroescentes , tales como fluoresceina y rodamina, pueden ser acoplados químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de unión . Cuando se activan por iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo absorbe la energ ía lum inosa, induciendo un estado de excitabilidad en la molécula, seg uido por emisión de la luz a una longitud de onda más larga característica. La emisión aparece como un color característico visualmente detectable con un microscopio luminoso. Las técn icas de inmunofluorescencia y EIA están ambas bien establecidas en la técnica y son particularmente preferidas para el presente método. Sin embargo, otras moléculas reportadoras, tales como radioisótopos, moléculas quimioluminiscentes o bioluminiscentes también pueden ser empleadas. Será fácilmente evidente para el técnico experto cómo variar el procedimiento para adecuarse al uso requerido. En otra modalidad, los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica una proteína de CREAP o derivado funcional de la misma, son administrados para fines terapéuticos, por medio de terapia de gene. La terapia de gene se refiere a terapia realizada mediante la administración de un ácido nucleico a un sujeto. En esta modalidad de la invención, el ácido nucleico produce su proteína codificada que media un efecto terapéutico al promover la expresión de gene dependiente de CRE normal o activación normal de quimiocinas. Cualquiera de los métodos para terapia de gene disponibles en la técnica pueden ser usados de acuerdo con la presente invención. Métodos ejemplares son descritos a continuación. En un aspecto preferido, el terapéutico comprende un ácido nucleico de CREAP que es parte de un vector de expresión que expresa una proteína CREAP o fragmento o proteína quimérica de la misma en un huésped adecuado. En particular, tal ácido nucleico tiene un promotor enlazado operablemente a la región de codificación de CREAP, siendo inducible o constitutivo dicho promotor, y de manera opcional, específico de tejido. En otra modalidad particular, una molécula de ácido nucleico es usada en la cual las secuencias de codificación de CREAP y cualquier otra secuencia deseada son flanqueadas por regiones que promueven la recombinación homologa en un sitio deseado en el genoma, proporcionando así la expresión intracromosómica de un ácido nucleico de CREAP (Koller y Smities, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al. , 1 989, Nature 342:435-438). La entrega del ácido nucleico en un paciente puede ser ya sea directa, en cuyo caso el paciente es expuesto directamente al ácido nucleico o vector que porta ácido nucleico, o indirecta, en cuyo caso las células son transformadas primero con el ácido nucleico in vitro, entonces son transplantadas al paciente. Estas dos aproximaciones son conocidas, respectivamente, como terapia de gene in vivo o ex vivo. En una modalidad específica, el ácido nucleico es administrado directamente in vivo, donde es expresado para producir el producto codificado. Esto puede lograrse por cualquiera de numerosos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, al construirlo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrarlo de manera que se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante infección usando un vector defectuoso o retroviral atenuado u otro vector viral (ver, por ejemplo, la patente estadounidense no. 4, 980,286 y otros mencionados infra), o mediante inyección directa de DNA desnudo, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont); o recubrimiento con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, o al administrarlo en enlace a un péptido el cual se sabe que entra al núcleo, al administrarlo en enlace a un ligando sujeto a endocitosis mediada por receptor (ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5, 166, 320; 5,728,399; 5,5874,297; y 6,030,954, todas las cuales son incorporadas por referencia en la presente en su totalidad) (los cuales pueden usarse para enfocar tipos de células expresando específicamente los receptores), etc. En otra modalidad, un complejo de ácido nucleico-ligando puede formarse, en el cual el ligando comprende un péptido viral fusogénico para romper endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosomal. Todavía en otra modalidad, el ácido nucleico puede ser enfocado in vivo para captación y expresión específica celular, al enfocar un receptor específico (ver, por ejemplo, publicaciones de PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO92/20316; W0937141 88; y WO 93/20221 ). De manera alternativa, el ácido nucleico puede ser introducido intracelularmente e incorporado dentro del DNA de célula huésped para expresión, mediante recombinación homologa (ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5,41 3,923; 5,416,260; y 5,574,205; y Zijlstra et al. , 1989, Nature 342:435-438). En una modalidad específica, se usa un vector viral que contiene un ácido nucleico de CREAP. Por ejemplo, puede usarse un vector retroviral (ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5,21 9,740; 5,604,090; y 5, 834, 182). Estos vectores retrovirales han sido modificados para suprimir las secuencias retrovirales que no son necesarias para empacar el genoma viral y la integración en DNA de célula huésped. El ácido nucleico de CREAP a ser usado en terapia de gene es clonado en el vector, lo cual facilita la entrega del gene a un paciente. Los adenovirus son otros vectores virales que pueden ser usados en terapia de genes. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para entregar genes a epitelios respiratorios. Los adenovirus infectan de manera nautral los epitelios respiratorios donde provocan una enfermedad suave. Otros objetivos para sistemas de entrega basados en adenovirus son hígado, el sistema nervioso central, células endoteliales y músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células no divisoras. Los métodos para conducir terapa de genes basada en adenovirus son descritos en, por ejemplo, patentes estadounidenses 5, 824, 544; 5,868,040; 5, 871 , 722; 5, 880, 102; 5,882, 877; 5,885,808; 5, 932,210; 5, 981 ,225; 5,994, 106; 5,994, 132; 5,994, 1 34; 6,001 ,557; y 6,033,8843, todas las cuales son incorporadas por referencia en la presente en su totalidad. También se ha propuesto virus adeno-asociado (AAV) para usarse en terapia de genes. Los métodos para producir y utilizar AAV se describen por ejemplo, en las patentes estadounidenses 5, 1 73,414; 5,252,479; 5, 552, 31 1 ; 5,658,785; 5,763,416; 5,773,289; 5,843,742; 5 ,869,040; 5, 942,496; y 5,948,675, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Otra aproximación a la terapia de genes involucra transferir un gene a cél ulas en cultivo de tejido mediante métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio o infección viral. Usualmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Las células son colocadas entonces bajo selección para aislar aquéllas células que han captado y están expresando el gene transferido. Esas células son entregadas entonces a un paciente.

En esta modalidad, el ácido nucleico es introducido en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Tal introducción puede ser realizada mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo pero no limitando a transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o bacteriófago conteniendo las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia de gene mediada por cromosoma, transferencia de gene mediada por microcélula, fusión de esferoplasto, etc. Numerosas técnicas son conocidas en la técnica para la introducción de genes extraños en la células y pueden usarse de acuerdo con la presente invención, siempre que las funciones de desarrollo y fisiológicas necesarias de las células receptoras no sean interrumpidas. La técnica debería proporcionar la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de manera que el ácido nucleico sea expresable por la célula y de preferencia heredable y expresable por su progenie celular. Las células recombinantes resultantes pueden ser entregadas a un paciente por varios métodos conocidos en la técnica. En una modalidad preferida, las células epiteliales son inyectadas, por ejemplo, de manera subcutánea. En otra modalidad, las células para la piel recombinantes pueden ser aplicadas como un injerto de piel sobre el paciente. Las células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, células progenitoras o troncales hematopoyéticas) son administradas de preferencia de manera intravenosa. La cantidad de células previstas para uso depende del efecto deseado, estado de paciente, etc., y puede determinarse por alguien experto en la técnica.

Las células en las cuales puede introducirse un ácido nucleico para fines de terapia de gene abarcan cualquier tipo celular disponible, deseado, e incluyen pero no están limitadas a células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas, tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; varias células troncales o progenitoras, en particular células troncales hematopoyéticas o progenitoras, por ejemplo, como se obtienen de médula ósea, sangre de cordón ubilical, sangre periférica, hígado fetal, etc. En una modalidad preferida, la célula usada para terapia de genes es autóloga al paciente. En una modalidad en la cual las células recombinantes son usadas en terapia de genes, un ácido nucleico de CREAP es introducido en las células de manera que es expresable por las células o su progenie, y las células recombinantes son administradas entonces in vivo para efecto terapéutico. En una modalidad específica, las células troncales o progenitoras son usadas. Cualquier célula troncal y/o progenitora que puede ser aislada y mantenida in vitro puede ser usada potencialmente de acuerdo con esta modalidad de la presente invención. Tales células troncales incluyen pero no están limitadas a células troncales hematopoyéticas (HSC), células troncales de tejidos epiteliales tales como la piel y el revestimiento de intestinos, células embriónicas de músculo de corazón, células troncales de hígado (ver, por ejemplo, WO 94708598) , células troncales neurales (Stemple y Anderson, 1992, Cell 71 : 973-985). Las células troncales epitelial (ESCs) o queratinocitos pueden ser obtenidas de tejidos tales como la piel y el revestimiento del intestino mediante procedimientos conocidos (Rheinwald, 1 980, Meth. Cell Bio.21 A:229). En tejido epitelial estratificado, tal como la piel, la renovación ocurre mediante mitosis de células troncales dentro de la capa germinal, la capa más cercana a la lámina basal. Las células troncales dentro del revestimiento del intestino proporcionan una rápida velocidad de renovación de este tejido. ESCs o queratinocitos obtenidos de la piel o revestimiento del intestino de un paciente o donador pueden culvitarse en cultivo de tejido (Pittelkow y Scott, 1 986, Mayo Clinic Prc. 61 :771 ). Si los ESCs son provistos por un donador, un método de supresión de huésped versus reactividad de injerto (por ejemplo, radiación , administración de medicamento o anticuerpo para promover la ¡nmunosupresión moderada) también puede usarse. Con respecto a las células troncales hematopoyéticas (HSC), cualquier técnica que proporcione el aislamiento, propagación y mantenimiento in vitro de HSC puede usarse en esta modalidad de la invención. Las técnicas por las cuales esto puede lograrse incluyen (a) el aislamiento y establecimiento de cultivos de HSC de células de médula ósea aisladas del huésped futuro, o un donador, o (b) el uso de cultivos de HSC de largo plazo previamente establecidos, los cuales pueden ser alogeneicos o xenogeneicos. Las células HSC no autólogas son usadas de preferencia en conjunción con un método para suprimir las reacciones inmunes de transplantes del futuro huésped/paciente. En una modalidad particular de la presente invención, pueden obtenerse células de médula ósea humana a partir de la cresta ilíaca posterior mediante aspiración con aguja (ver, por ejemplo, Kodo et al. , 1984, J. Clin. Invest. 73: 1 377-1384). En una modalidad preferida de la presente invención, las HSCs pueden hacerse altamente enriquecidas o en forma substancialmente pura. Este enriquecimiento puede lograrse antes, durante o después de cultivo a largo plazo, y puede hacerse mediante cualquier técnica conocida en la técnica. Los cutivos de largo plazo de células de médula ósea pueden establecerse y mantenerse al usar, por ejemplo, técnicas de cultivo de células Dexter modificadas (Dexter et al. , 1977, J. Cell Physiol. 91 :335) o técnicas de cultivo Witlock-Witte (Witlock y Witte, 1982, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:3608-3612). En una modalidad específica, el ácido nucleico a ser introducido para fines de terapia de genes comprende un promotor inducible enlazado operablemente a la región de codificación, de manera que la expresión de ácido nucleico es controlable al controlar la presencia o ausencia del inductor de transcripción apropiado. Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos de diagnóstico. En particular, la invención se refiere a un método para el diagnóstico de una condición patológica asociada con activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quimiocinas, el cual comprende: Detectar la transcripción elevada anormal, por ejemplo, de RNA mensajero transcrito de un gene humano endógeno natural que codifica un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Nos: 2, 16 , 25 en un tejido o célula apropiado de un humano, en donde dicha transcripción anormal es diagnosico de dicho humano que sufre de una condición descrita antes. En particular, dicho gene humano endógeno natural comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Nos: 1 , 15, 24. En una modalidad preferida, tal método comprende contactar una muestra de dicho tejido o célula apropiado o contactar una molécula de RNA o DNA aislada derivada de ese tejido o célula con una secuencia de nucleótidos aislada de al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud que híbrida bajo condiciones de alta severidad con la secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Nos:2, 16, 25. La detección de transcripción elevada indicaría que el sujeto es un candidato adecuado para tratamiento con uno o más moduladores de CREAP. La detección de una forma mutada de una proteína CREAP, la cual está asociada con una disfunción proporcionará una herramienta diagnóstica que puede adicionarse a, o definir, un diagnóstico de una enfermedad, o susceptibilidad a una enfermedad, lo cual resulta de la sub-expresión, sobre-expresión o expresión espacial o temporal alterada de un gene de CREAP. Los individuos que portan mutaciones en el gene pueden ser detectados en el nivel de DNA por una variedad de técnicas. Los ácidos nucleicos, en particular mRNA, para diagnóstico, pueden ser obtenidos de células del sujeto, tales como de sangre, orina, saliva, biopsia de tejido o material de autopsia. El DNA enómico puede ser usado directamente para detección o puede ser amplificado de manera enzimática al usar PCR u otras téncicas de amplificación antes del análisis. El RNA o cDNA también puede ser usado en una manera similar.

Las supresiones e inserciones pueden ser detectadas por un cambio en tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Hibridar el DNA amplificado a secuencias de nucleótidos marcadas que codifican un polipéptido de CREAP de la presente invención, puede identificar mutaciones puntuales. Secuencias perfectamente igualadas pueden ser distinguidas de duplos no igualados mediante digestión de RNasa o por diferencias en las temperaturas de fusión. Las diferencias de secuencias de DNA pueden ser detectadas además por alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de DNA en geles, con o sin agentes desnaturalizantes, o mediante secuenciación de DNA directa (por ejemplo, Myers et al. , Science (1985) 230: 1242). Los cambios de secuencia en ubicaciones específicas también pueden ser revelados mediante ensayos de protección de nucleasa, tal como proteción de RNasa y S1 o el método de corte químico (ver Cotton et al. , Proc Nati Acad Sci USA (1 985) 85: 4397-4401 ). En otra modalidad, un arreglo de sondas de oiigonucieótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de CREAP de la presente invención o fragmentos de tal secuencia de nucleótidos, puede ser construido para conducir una clasificación eficiente de, por ejemplo, mutaciones genéticas. Los métodos de tecnolog ía de arreglo son bien conocidos y tienen aplicabilidad general y pueden ser usados para dirigir una variedad de preguntas en genética molecular incluyendo expresión de genes, enlace genético y variabilidad genética (ver por ejemplo, M. Chee et al. , Science, vol 274, pp 610-613 (1 996)). Los ensayos diagnósticos ofrecen un proceso para diagnosticar o determinar una susceptibilidad a enfermedad a través de Ja detección de mutación en un gene de CREAP mediante los métodos descritos. Además, tales enfermedades pueden ser diagnosticadas por métodos que comprenden determinar de una muestra derivada de un sujeto, un nivel de polipéptido o mRNA anormalmente disminuido o incrementado. La expresión disminuida o incrementada puede medirse en el nivel de RNA usando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, PCR, RT-PCR, protección de RNasa, Northern blotting y otros métodos de hibridación. Las técnicas de ensayo que pueden ser usadas para determinar los niveles de una proteína, tal como polipéptido de la presente invención, en una muestra derivada de un huésped son bien concidos para aquéllos de habilidad en la técnica. Tales métodos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis Western Blot y ensayos ELISA. De esta manera, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un conunto diagnóstico el cual comprende: (a) un polinucleótido de la presente invención, de preferencia, la secuencia de nucleotidos de SEQ ID Nos: 1 , 1 5 o 24, o un fragmento de la misma; (b) una secuencia de nucleotidos complementaria a aquélla de (a); (c) un polipéptido de la presente invención, de preferencia el polipéptido de SEQ ID Nos: 2, 16,25 o un fragmento del mismo; (d) un anticuerpo para un polipéptido de la presente invención, de preferencia para el polipéptido de SEQ ID Nos:2, 16, 25; o (e) un imitador de péptido para una proteína CREAP, de preferencia de SEQ I D N02, 16 o 25. Se apreciará que en cualquiera de tales conjuntos, (a), (b), (c), (d) o (e) pueden comprender un componente substancial. Tal conjunto será de uso para diagnosticar una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad, en particular a una enfermedad o condición patológica asociada con la activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quimiocinas. También se contempla que dicho conjunto comprendería componentes (a)-(e) diseñados para detectar niveles de una proteína reguladora relacionada con CREAP o proteínas modificadas por CREAP como se discute en la presente. Las secuencias de nucleótidos de la presente invención también son valiosas para localización de cromosomas. La secuencia es enfocada específicamente a, y puede hibridar con, una ubicación particular en un cromosoma humano individual. El mapeo de secuencias relevantes a cromosomas de acuerdo con la presente invención es un primer paso importante para correlacionar esas secuencias con enfermedad asociada a gene. Una vez que una secuencia ha sido mapeada a una ubicación cromosómica precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma puede ser corrleacionada con los datas de mapa genético. Tales datos son encontrados en, por ejemplo, V. Mc usick, Mendelian Inheritance in Man (Herencia mendélica en el hombre) (disponible en línea a través de Johns Hopkins University Welch Medical Library). La relación entre los genes y las enfermedades que han sido mapeados a la misma región cromosómica son identificadas entonces a través de análisis de enlace (coherencia de genes físicamente adyacentes). Las diferencias en la secuencia de cDNA o genómico entre individuos afectados y no afectados también puede ser determinada. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados pero no en individuos normales, entonces es probable que la mutación sea el agente causante de la enfermedad. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender substancias que inhiban la expresión de proteínas CREAP al nivel de ácido nucleico. Tales moléculas incluyen ribozimas, oligonucleótidos antisentido, DNA de triple hélice, RNA aptámeros, siRNA y RNA de filamento doble o simple dirigidos a una secuencia de nucleótidos apropiada de un ácido nucleico de CREAP. Estas moléculas inhibidoras pueden ser creadas usando técnicas convencionales por alguien de habilidad en la técnica sin carga o experimentación indebida. Por ejemplo, las modificaciones (por ejemplo, inhibición) de expresión de gene puede obtenerse al diseñar las moléculas antisentido, DNA o RNA, a las regiones de control de un gene que codifica un polipéptido de CREAP discutido en la presente, es decir, a promotores, intensificadores e mirones. Por ejemplo, los oligonucleótidos derivados del sitio de iniciación de transcripción, por ejemplo, entre las posiciones -10 y +10 del sitio de inicio pueden usarse. No obstante, todas las regiones del gene pueden ser usadas para diseñar una molécula antisentido con el fin de crear aquéllas que dan hibridación más fuerte al mRNA y tales oligonucleótidos antisentido pueden ser producidos e identificados mediante procedimientos de ensayo estándares familiares a alguien de habilidad en la técnica.

De manera similar, la inhibición de la expresión de gene puede logarse usando metodiogía de pares de bases de "triple hélice". La formación de pares de triple hélice es útil debido a que provoca la inhibición de la capacidad de la doble hélice a abrirse lo suficiente para la unión de polimerasas, factores de transcripción o moléculas reguladoras. Recientes avances terapéuticos que usan DNA triple han sido descritos en la literatura (Gee, J.E. et al. (1994) En: Huber, B.E. y B.l. Carr, Molecular and Immunologic Approaches (Aproximaciones moleuclares e inmunológicas), Futura Publishing Co., Mt. isco, N.Y.). Estas moléculas también pueden ser diseñadas para bloquear la traducción de mRNA al prevenir que la transcripción se una a ribosomas. Las ribozimas, moléculas de RNA enzimáticas, también pueden ser usadas para inhibir la expresión de genes al catalizar el corte específico de RNA. El mecanismo de acción de ribozima involucra la hibridación específica de secuencia de la molécula de ribozima a RNA objetivo complementario, seguido por corte endonucleolítico. Ejemplos que pueden ser usados incluyen moléculas de ribozima de motifo de "cabeza de martillo" o "pasador del cabello" diseñadas, que pueden ser diseñadas para catalizar especifica y enficientemente el corte endonucleolítico de secuencias de gene, por ejemplo, el gene para CREAP1, CREAP2 o CREAP3. Los sitios de corte de ribozima específicos dentro de cualquier objetivo de RNA potencial son identificados ¡nicialmente al explorar la molécula objetivo para sitios de corte de ribozima, los cuales incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU y GUC. Una vez identificadas, las secuencias de RNA cortas de entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gene objetivo conteniendo el sitio de corte, pueden ser evaluadas para características estructurales secundarias, las cuales pueden hacer al oligonucleótido inoperable. La conveniencia de objetivos candidatos también puede ser evaluada al probar la accesibilidad a hibridación con oligonucleotidos complementarios usando ensayos de protección de ribonucleasa. Los métodos de ribozima incluyen exponer una célula a ribozimas o inducir la expresión en una célula de tales pequeñas moléculas de ribozima de RNA (Grassi y Marini, 1996, Annals of Medicine 28: 499-510; Gibson, 1996, Cáncer and Metástasis Reviews 1 5: 287-299). La expresión intracelular de ribozimas de cabeza de martillo y pasador del cabello enfocadas a mRNA correspondiente a al menos uno de los genes discutidos en la presente, puede utilizarse para inhibir la proteína codificada or el gene. Las ribozimas pueden ser ya sea entregadas directamente a células, en la forma de oligonucleotidos de RNA que incorporan secuencias de ribozima, o introducidos en la célula como un vector de expresión que codifica el RNA ribozimal deseado. Las ribozimas pueden ser expresadas rutinariamente in vivo en cantidad suficiente para ser catalíticamente efectivas para cortar mRNa y por ello modificar la abundancia de mRNA en una célula (Cotten et al. , 1989 EMBO J. 8:3861 -3866). En particular, una ribozima que codifica una secuencia de DNA, diseñada de acuerdo con reglas convencionales, bien conocidas y sintetizadas, por ejemplo, mediante química de fosforamidita estándar, puede ligarse en un sitio de enzima de restricción en el tallo anticodón y lazo de un gene que codifica un rTNA, que puede transformase entonces a y expresarse en una célula de interés mediante métodos de rutina en la técnica. De preferencia, un promotor inducible (por ejemplo, un glucocorticoide o elemento de respuesta a tetraciclina) también es introducido en esta construcción de manera que la expresión de ribozima pueda ser controlada selectivamente. Para uso de saturación, puede usarse un promotor alta y constitutivamente activo. Los genes de tDNA (es decir, genes que codifican tRNAs) son útiles en esta aplicación debido a su tamaño pequeño, alta velocidad de transcripción y expresión ubicua en diferentes clases de tejidos. Por lo tanto, las ribozimas pueden ser diseñadas rutinariamente para cortar virtualmente cualquier secuencia de mRNA y una célula puede ser transformada rutinariamente con DNA que codifica tales secuencias de ribozima, de manera que se expresa una cantidad controlable y catalíticamente efectiva de la ribozima. De acuerdo con esto, la abundancia de virtualmente cualquier especie de RNA en una célula puede ser modificada o alterada. Las secuencias de ribozimas pueden ser modificadas esencialmente en la misma manera que se describe para nucleótidos antisentido, por ejemplo, la secuencia de ribozima puede comprender una porción de base modificada. Los RNA aptámeros también pueden ser introducidos a o expresados en una célula para modificar la abundancia o actividad de RNA. Los RNA aptámeros son ligandos de RNA específicos para proteínas, tales como para Tat y Rev RNA (Good et al. , 1997, Gene Therapy 4:45-54) que pueden inhibir específicamente su traducción. La inhibición específica de gene de expresión de gene también puede lograrse usando tecnológicas de RNA de doble filamento. Una descripción de tal tecnología puede encontrase en WO 99/32610, la cual es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Además, la tecnología de siRNA también ha probado ser útil como un medio para inhibir la expresión de genes (Cullen, BR Nat. Immunol. 2002 Jul; 3(7):597-9). Las moléculas antisentido, DNA de triple hélice, RNA aptámeros y ribozimas de la presente invención pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de moléculas de ácido nucleico. Estas incluyen técnicas para sintetizar químicamente los oligonucleótidos, tales como síntesis química de fosforamiditia de fase sólida . De manera alternativa, las moléculas de RNA pueden ser generadas mediante transcripción in vitro e in vivo de secuencias de DNA que codifican los genes de los polipéptidos discutidos en la presente. Tales secuencias de DNA pueden ser incorporadas en una amplia variedad de vectores con promotores de RNA polimerasa adecuados, tales como T7 o SP6. De manera alternativa, las construcciones de cDNA que sintetizan RNA antisentido constitutiva o induciblemente pueden ser introducidas en líneas de células, células o tejidos. Además de los métodos descritos antes para inhibir la expresión de CREAP, se contempla en la presente que uno podría identificar y emplear pequeñas moléculas u otros productos naturales para inhibir la transcripción in vivo de los polipéptidos discutidos en la presente. Por ejemplo, alguien de habilidad en la técnica podría establecer un ensayo para CREAP1 , CREAP2 o CREAP3 que puede ser aplicada fácilmente a muestras de los medios de cultivo de una línea celular usando métodos convencionales. Usando este ensayo, las líneas celulares serían clasificadas para encontrar unas que expresen la proteína CREAP de interés. Estas líneas celulares podrían ser cultivadas en, por ejemplo, placas de 96 cavidades. Una comparación de los efectos de algunos modificadores conocidos de expresión de genes, por ejemplo, dexametasona, éster de forbol, choque térmico en cultivos de tejidos primarios y las líneas celulares permitirán la selección de la línea celular más apropiada a usar. La clasificación consistiría meramente entonces en cultivar las células durante un tiempo fijado con un compuesto diferente adicionado a cada cavidad y entonces ensayar la actividad de CREAP/nivel de mRNA. Con el fin de facilitar la detección de CREAP en el ensayo descrito antes, la luciferasa u otra proteína fluorescente comercialmente disponible podría ser fusionada genéticamente como una proteína marcadora apropiada al promotor de CREAP1 , CREAP2 o CREAP3. Las secuencias corriente arriba de ATG de, por ejemplo, el promotor de CREAP1 , pueden identificarse a partir de datos de secuencias genómicas al usar la secuencia de GenBank acceso número N _025021 para BLAST conra la secuencia genómica NCBI . (Actualmente el número de acceso GenBank para la secuencia contigua genómica para CREAP1 es NT_01 1295). Esto da al menos 5kb corriente arriba de ATG de CREAP 1 que no contiene alguna base desconocida. Dos pares de iniciadores de PCR anidados para amplificar un fragmento de 2kb o más de DNA genómico humano pueden ser diseñados y probados fácilmente. El fragmento promotor puede ser insertado fácilmente en cualquier vector de gene reportador menos promotor diseñado para la expresión en células humanas (por ejemplo, vector de proteína fluorescente intensificada menos promotor de Clontech pECFP-1 , pEGFP-1 , o pEYFP, Clontech, Palo Alto, CA). La clasificación consistiría entonces de cultivar las células durante un lapso apropiado con un diferente compuesto adicionado a cada cavidad y entonces ensayar la actividad de gene reportador. Los compuestos prometedores serían ensayados entonces por efectos sobre la actividad de CREAP1 y/o nivel de mRNA in vivo usando los modelos in vivo de las condiciones patológicas previamente descritas. Los detalles del método adicionales, tales como tiempo de cultivo apropiado, condiciones de cultivo, ensayos de reportador y otras metodologías que puedan ser usadas para identificar pequeñas moléculas u otros productos naturales útiels para inhibir la transcripción de proteínas CREAP in vivo serían familiares a alguien de habilidad en la técnica. Además, el cDNA que codifica proteínas CREAP y/o las proteínas CREAP por sí mismas, pueden usarse para identificar otras proteínas, por ejemplo, cinasas, proteasas o factores de transcripción, que son modificados o activados indirectamente en una cascada por proteínas CREAP. Las proteínas así identificadas pueden usarse, por ejemplo, para clasificación de medicamento para tratar las condiciones patológicas discutidas en la presente. Para identificar estos genes que están corriente debajo de proteínas CREAP, se contempla, por ejemplo, que uno podría usar métodos convencionales para tratar animales en modelos de estado de enfermedad con un inhibidor de CREAP específico, sacrificar los animales, remover los tejidos relevantes y aislar el RNA total de estas células y emplear tecnologías de ensayo de microarreglo estándares para identificar los niveles de mensaje que son alterados en relación a un animal de control (animal a quien ningún medicamento ha sido administrado). Además, los ensayos in vitro o in vivo convencionales pueden ser usados para identificar posibles genes que coducen a sobre expresión de proteínas CREAP. Estas proteínas reguladoras relacionadas codificadas por genes así identificados pueden usarse para clasificar medicamentos que pudieran ser potentes terapéuticos para el tratamiento de las condiciones patológicas discutidas en la presente. Por ejemplo, un ensayo de gene reportador convencional podría ser usado, en el cual la región promotora de una proteína CREAP es colocada corriente arriba de un gene reportador, la construcción transfectada en una célula adecuada (por ejemplo de ATCC, anassas, VA) y usando técnicas convencionales, las células ensayadas por un gene corriente arriba que provoca la activación del promotor de CREAP mediante la detección de la expresión del gene reportador. Se contempla en la presente que uno puede inhibir la función y/o expresión de un gene para una proteína reguladora relacionada o proteína modificada por una proteína CREAP como una manera para tratar las condiciones patológicas discutidas en la presente al diseñar, por ejemplo, anticuerpos para estas proteínas o imitadores de péptido y/o diseñar oligonucleótidos antisentido inhibidores, DNA de triple hélice, ribozimas, siRNA, RNA de filamento doble o simple y RNA aptámeros enfocados a los genes para tales proteínas de acuerdo con métodos convencionales. Las composiciones farmacéuticas que comprenden tales substancias inhibidoras para el tratamiento de dichas condiciones patológicas también son contempladas. Una modalidad adicional de la invención se refiere a la administración de una composición farmacéutica, en conjunción con un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, para tratamiento de cualquiera de las condiciones patológicas discutidas en la presente. Tales composiciones farmacéuticas pueden comprender proteínas CREAP, o fragmentos de las mismas, anticuerpos a polipéptidos de CREAP o fragmentos de péptido, imitadores y/o moduladores de CREAP (por ejemplo, agonistas, antagonistas o inhibidores de expresión y/o función de CREAP). Las composiciones pueden ser administradas solas o en combinación con al menos otro agente, tal como compuesto estabilizante, las cuales pueden ser administradas en cualquier portador farmacéutico biocompatible, estéril, incluyendo pero no limitando a, solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa y agua. Las composiciones pueden ser administradas a un paciente solas, o en combinación con otros agentes, medicamentos u hormonas. Las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas CREAP o fragmentos de las mismas pueden ser administradas cuando son consideradas médicamente benéficas por alguien de habilidad en la técnica, por ejemplo, en condiciones en donde los agonistas de función de CREAP tienen un efecto terapéutico, tal como desórdenes neurodegenerativos, tales como enfermedades de Alzheimer, Parkinson y Huntington. Tales composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la presente invención pueden ser formuladas en una manera convencional usando uno o más portadores o excipientes fisiológicamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente útiles para prevenir, tratar o mejorar condiciones patológicas relacionadas con la expresión de gene dependiente de CRE anormal o la activación anormal de quimiocinas, serán administradas a un paciente a dosis terapéuticamente efectivas. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a aquella cantidad del compuesto suficiente para resultar en la prevención, tratamiento o mejoramiento de dichas condiciones. Los compuestos y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables pueden ser formulados para administración mediante inhalación o insuflación (ya sea a través de la boca o la nariz) o administración tópica, oral, bucal, parenteral o rectal. Para administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas o cápsulas preparadas mediante medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes ligantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); rellenos (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato ácido de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); desintegradores (por ejemplo, almidón de papa o glicolato de almidón de sodio) ; o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio) . Las tabletas pueden ser recubiertas mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de usarse. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse mediante medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsificantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ásteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservadores (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico) . Las preparaciones también pueden contener sales amortiguadoras, agentes saborizantes, colorantes y endulzantes según sea apropiado. Las preparaciones para administración oral pueden ser formuladas convenientemente para dar liberación controlada del compuesto activo. Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas en una manera convencional. Para la administración mediante inhalación, los compuestos para uso de acuerdo con la presente invención son entregados convenientemente en la forma de una presentación de atomizador de aerosol a partir de empaques presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación pueden determinarse al proporcionar una válvula para entregar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para uso en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla de polvo del compuesto y una base en polvo adecuado, tal como lactosa o almidón. Los compuestos pueden ser formulados para administración parenteral por inyección, por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación de unidad, por ejemplo, en ampolletas o recipientes de múltiples dosis, con un conservador adicionado. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes formuladores, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o de dispersión. De manera alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógeno estéril, antes de usarse. Los compuestos también pueden ser formulados en composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, conteniendo bases de supositorio convencionales, tales como manteca de cacao u otros glicéridos. Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos también pueden ser formulados como una preparación de depósito. Tales formulaciones de acción larga pueden ser administrados mediante implante (por ejemplo, subcutáneo o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. De esta manera, por ejemplo, los compuestos pueden ser formulados con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble. Las composiciones pueden presentarse, si se desea, en un empaque o dispositivo dispensador, el cual puede contener una o más formas de dosificación de unidad conteniendo el ingrediente activo. El empaque puede comprender, por ejemplo, hoja de metal o plástico, tal como un empaque de ampolla. El empaque o dispositivo dispensador puede ser acompañado por instrucciones para la administración. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso en la invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos son contenidos en una cantidad efectiva para alcanzar el propósito pretendido. La determinación de una dosis efectiva está dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente ya sea en ensayos de cultivo celular, por ejemplo, de células neoplásticas, o en modelos animales, usualmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también puede ser usado para determinar el rango de concentración apropiado y ruta de administración. Una dosis puede ser formulada en modelos animales para alcanzar un rango de concentración de plasma circulante que incluye la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza una inhibición máxima media de síntomas). Tal información puede ser usada entonces para determinar las dosis y rutas de administración útiles en humanos. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a aquella cantidad de ingrediente activo útil para prevenir, tratar o mejorar una condición patológica particular de interés. La eficacia y toxicidad terapéutica puede ser determinada por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares y animales experimentales, por ejemplo, ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) y LD50 (la dosis letal para 50% de la población). La proporción de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la proporción, LD50/ED50. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que exhiben grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios animales se usan para formular un rango de dosificación para uso humano. La dosificación contenida en tales composiciones está de preferencia dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o nada de toxicidad. La dosificación varía dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada, sensibilidad del paciente y la ruta de administración. La dosificación exacta será determinada por el practicante, a la luz de factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. La dosificación y administración son ajustadas para proporcionar niveles suficientes de la porción activa o para mantener el efecto deseado. Los factores que pueden ser considerados incluyen la severidad del estado de enfermedad, salud general del sujeto, edad, peso y género del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de adm inistración, combinación o combinaciones de medicamentos, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a terapia. Las composiciones farmacéuticas de larga acción pueden ser administradas cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la vida media y la velocidad de evacuación de la formulación particular. Las cantidades de dosificación normal puede variar desde 0.1 hasta 100, 000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g , dependiendo de la ruta de administración. La guia en cuanto a dosificaciones particulares y métodos de entrega es provista en la literatura y generalmente disponible para practicantes en la técnica. Aquéllos expertos en la técnica emplearán diferentes formulaciones para nucleótidosque para proteínas o sus inhibidores. De manera similar, la entrega de polinucleótidos o polipéptidos será específica a células, condiciones, ubicaciones particulares, etc. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para administración oral de proteínas son descritas, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 5,008, 1 14; 5,505, 962; 5,641 ,515; 5,681 ,81 1 ; 5, 700,486; 5,766,633; 5, 792,451 ; 5,853, 748; 5,972,387; 5,976,569; y 6,051 ,561 . Los siguientes ejemplos ilustran de manera adicional la presente invención y no pretenden limitar la invención. Los siguientes materiales y métodos fueron realizados para conducir los Ejemplos 1 -5 a continuación: Montaje de una recolección de clones de cDNA de longitud completa humanos Hemos archivado y secuenciado, en el extremo 5', aproximadamente 1 70,000 clones de genotecas de cDNA de longitud completa, de alta calidad, múltiples, hechas a partir de mRNAs de 33 tipos de tejido humano. Usando una tubería de bioinformática propietaria, hemos identificado todos los clones de cDNA que tienen el codón ATG inicial para un ORF, ya sea definidos experimentalmente o predichos conceptualmente, y de esta manera representan potencialmente las transcripciones de longitud completa. Un total de 20,702 clones, dentro del vector pCMVSport6 (Invitrogen, Carlsbad, CA), se rearreglaron del conjunto de clones archivados usando un Q-bot (Genetix Limited, Hampshire, Reino Unido), en placas Genetix de 384 cavidades conteniendo 60 ul de caldo Luria (LB). Con base en el análisis de bioinformática de las secuencias 50 de estos 20,702 clones, se derivan de aproximadamente 1 1 , 000 genes con fuerte soporte para su estructura y existencia, aunque la mayoría de ellos no tienen función y 6, 000 novedosas secuencias potencaies no están todavía en las bases de datos de cDNA públicas. Los clones arreglados son repicados para producir múltiples copias para archivar. Una copia es usada para producir DNA de minipre usando un QIAGEN BioRobot 8000 (Qiagen, Valencia, CA). Las muestras de DNA son levigadas en placas UV de 96 cavidades (Corning, Acton, A) y su concentración y rendimiento es determinado al medir el valor OD260 en un SPECTRAmax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las 20,702 muestras de DNA resultantes son divididas en alícuotas entonces para producir múltiples copias para archivar (a 80 pg/cavidad en amortiguador TE) y ensayos basados en células en placas de 384 cavidades (a 50 ng/cavidad en medio de cultivo de célula OPTI- EM (I nvitrogen). Las placas son selladas y almacenadas a -20°C.

Clasificación de genoma amplio para activadores de elemento de respuesta de AMP cíclico Células Hela (ATCC, Manassas, VA) cultivadas en matraces de cultivo de tejido de 225 mi son tripsinizadas y diluidas a 105 células/ml en medio D EM (Invitrogen). La suspensión celular es dispensada entonces en placas de cultivo de tejido de 384 cavidades con un ulti-drop 384 (Thermo Labsystems, Beverly, MA) a 30 µ?/cavidad. Después de la incubación durante la noche, una mezcla compuesta por 0.25 ul de reactivo de transfeccion Fugene 6 (Roche Applied Biosciences), 6 µ? de medio OPTI-MEM conteniendo 50 ng de construcción de plásmido pCRE-Luc (Stratagene) y 50 ng de plásmido de cDNA individual de la colección de clones se adiciona a cada cavidad de placas de 384 cavidades usando un robot de manejo de líquido Biomek FX (Beckman Coulter). Cuarenta horas post-transfección, la actividad de luciferasa en cada cavidad es medida usando el sistema de ensayo de luciferasa BrightGlo (Promega, Madison, Wl) en un luminómetro LUMI NOSKAN Ascent (Thermo Labsystems) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los datos de luciferasa en bruto son procesados por unsistema de procesamiento y análisis de datos en-casa diseñado específicamente para manejar un proyecto de funcionalizaión de genes de alto rendimiento. Los ensayos completos son conducidos por duplicado para producir 41 ,404 puntos de datos, correspondiente cada uno a un experimento de transfeccion miniaturizado con un clon de cDNA individual en una sola cavidad.

Confirmación v validación de aciertos de HTS Para cada conjunto de los 20,702 puntos de datos duplicados, se calculan la calificación Z (calculada como veces de activación dividida por la desviación estándar de la población) y veces de activación contra la media de población y se depositan en una base de datos investigable anotada. Los activadores potenciales son seleccionados con base a dos criterios: (1 calificación Z mayores que 3.0 en cualquier ensayo, y (2) aumento en veces en luciferasa/media mayor que 8.0 en ambos ensayos. Un total de 85 clones (0.4% de clonres totals) se identificó con base en los criterios anteriores. Las muestras de DNA para estos aciertos son recuperadas del archivo de clones y re-transformadas en la cepa bacteriana XL-1 0 Gold (Stratagene). Las colonias individuales para cada muestra son recolectadas y las mini-preparaciones de DNA son realizadas. Una porción de muestras de DNA de mini-prep es secuenciada a partir del extremo 5' para verificación de clon. Las muestras restantes son usadas para la validación de aciertos, en la cual son transfectadas manualmente junto con la construcción de reportador pCRE-Luc y plásmido pRL-SV40 (Promega) que codifica luciferasa de Renilla bajo control del promotor temprano de SV40 en células Hela seguido por un ensayo Dual-luciferasa (Promega) de acuerdo con las sugerencias del fabricante.

Análisis de Northern blot y análisis de transcripción y traducción in vitro El plásm ido pC VSport6 conteniendo cDNA de CREAP1 es digerido por EcoRI y Notl, la inserción es purificada en gel usando un conjunto de exrtracción de gel QIAGEN DNA y etiquetada con sistemas de etiquetado de DNA de iniciador aleatorio Enzo al seguir el manual del vendedor (empaque Bio-1 1 -dCTP deoxynucleotide, Cat.#42723, Enzo Biochem , Farmingdale, NY). Brevemente, 200 ng de fragmento de CREAP1 o 100 ng de cDNA de actina ß (Clontech) son desnaturalizados a 100°C durante 10 minutos, enfriados en hielo durante 3-5 minutos y entonces mezclados con 5 ul de iniciador aleatorio de hexámero 10x, 5 µ? de mezcla dCTP-1 1 -Bio y 1 µ? de fragmento Klenow y se incubaron a 37°C durante 4 h. Las sondas son hibridadas a una membrana Múltiple Tissue mRNA Northern blot (Clontech) de acuerdo con los protocolos sugeridos. La detección de señal es lograda al utilizar un conjunto de detección de biotina (Ambion, Austin, TX). La membrana es expuesta a película de rayos X a partir de 10 hasta 30 segundos. Después de la exposición inicial, la membrana es extraída y re-sondeada con una sonda de beta actina (Clontech) para normalizar el nivel de expresión. La transcripción y traducción in vitro de proteína CREAP1 es conducida con TNT SP6 Quick Coupled Transcription and Translation system (Promega) siguiendo el manual del vendedor. Los productos de traducción son separados en un gel prevaciado Nupage (4-20%) (Invitrogen) , transferidos a una membrana de nitroceulosa y detectada por el sistema de detección no radioactivo Transcend (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Análisis de ruta de señalización de CREAP 1 -CREB Para ensayo de cinasa ¡n vivo, se usan los dominios de activación de factores de transcripción de CREB o ATF2 fusionados con las construcciones de dominio de unión de DNA GAL4 de levadura 81 -147 aminoácidos) (Stratagene, Path Detect In Vivo Signal Transduction Pathway trans-reporting Systems). La línea de células HLR que contiene un elemento de unión de DNA GAL4 5X y reportador de luciferasa de impulsión de casilla TATA se usa por protocolo del fabricante (Stratagene) . 104 células HLR son divididas en cada cavidad de placas de cultivo de tejido de 96 cavidades. Después de 16 horas, las células son transfectadas con 100 ng de construcciones de fusión Creb-GAL4 o ATF2-GAL4, 30 ng de plásmido de control de luciferasa de Renilla junto con 100 ng de plásmidos activadores pCMVSPORT6, pCMVSPORT-CREAPI , pFC-PKA o pFC-MEKK (Stratagene). La transfección es hecha con reactivo Fugene6 (Roche Molecular Biochemicals, Basilea, Suiza) de acuerdo con el manual del fabricante. Cuarenta horas depsués de la transfección, se conduce un ensayo Dual-Glo Luciferase (Promega) usando ei protocolo del fabricante. Para el ensayo de CREB negativo dominante, se usan construcciones negativas dominantes de CREB (muíante S 133A no fosforilable o K-Creb mutante 287L de dominio de unión de DNA) (Clontech, Cat.# K6014-1 ). El procedimiento de transfección y ensayo de luciferasa son seguidos con algunas modificaciones de acuerdo con el fabricante. Se utilizan para transfección células Hela, construcciones PCMVSPORT6, pCMV-CREAP1 , pS 1 33A-Creb o pK-Creb.

Análisis funcional de supresiones de proteína de CREAP1 Los aminoácidos de proteína de CREAP 1-170, 1-356, 1-580 y 170-650 son insertados en el vector de expresión pFlag-CMV4 (Sigma, St. Louis, MO) al utilizar la estrategia de PCR familiar para alguien de habilidad en la técnica. 104 células hela son divididas en cada cavidad de placas de cultivo de tejido de 96 cavidades. Las células son transfectadas 16 horas después con 100 ng de construcción de reportador pCRE-Luc, 30 ng de plásmido de control de luciferasa de Renilla junto con 100 ng de pCMVSPORT6, pC VSPORT-CREAPI y diferentes construcciones de fusión por supresión de Flag-CREAP1 respectivamente. La transfección es hecha con reactivo Fugene6 (Roche Applied Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ensayo Dual-Glo Luciferase (Promega) es conducido 40 h después de la transfección. Las cuentas de luciferasa de luciérnaga son normalizados a luciferasa de Renilla y son graficadas.

Ejemplo 1 Clasificación de genoma amplio para genes activadores de elementos de respuesta de A P cíclico Para identificar los cDNAs que codifican proteínas que podrían conducir a activación de CRE, hemos clasificado una colección anotada e indexada de 270,702 clones de cDNA humanos, los cuales se predice que representan transcripciones de longitud completa para 11,000-16,000 genes individuales en un sistema reportador de CRE-luciferasa miniaturizado. Los experimentos fueron conducidos por duplicado para producir un total de 41 ,404 puntos de datos, correspondiente cada uno a la actividad de luciferasa de un ensayo de sobre-expresión de proteína transiente, donde aproximadamente 3,000 céulas hela fueron transfectadas de m anera transiente con el clon de cDNA de interés y un plásmido conteniendo el gene de luciferasa de luciérnaga. Análsis estad ísicto de los dos conjuntos de datos ha generado una lista de 85 clones que conducen a al menos un aumento de 8 veces en la actividad de luciferasa comparado con la media de población en dos de los experimentos de clasificación primaria duplicados . En experimentos de verificación secundaria subsecuentes, cuando las colonias individuales para estos clones fueron recu peradas y sometidas a ensayos s im ilares pero con luciferasa de Renilla bajo el control de promotor SV40 para normalización de datos, 14 clones fueron confirmados (datos no mostrados) . Los aciertos obtenidos incluyeron una proteína de función hasta ahora desconocida, llamada KIAA0616 (nú mero de acceso: N M_025021 ) por el Kazusa DNA Research I nstitute. Con base en nuestro análisis funcional de esta proteína, hemos renombrado a esta proteína proteína activadora de CRE 1 o "CREAP 1 ", con base en su capacidad para activar CRE en el sistem a de ensayo de reportador de l ucifersasa de sobre-expresión transiente descrito en la presente. Para definir adicionalmente la ruta de especificidad de prom otor para CREAP 1 , se probó contra un grupo de varias construcciones de promotor-luciferasa en un sistem a de ensayo sim ilar en célu las Hela. Estas construcciones podrían probar la capacidad de CREAP 1 para activar elementos de un ión de factor de transcripción CREB, NAFT y NFkB así como promotores auténticos par IL-8, VCAM, I L-24 y NPY. Además, los 3 vectores de luciferasa fueron incluidos para prueba de soporte y como un control de especificidad. Los resultados indican que CREAP 1 es un activador específico de CREA (datos no mostrados).

Ejemplo 2 Secuencia de DNA y secuencia de am inoácidos para gene de CREAP1 La inserción de cDNA de 2.4 kb en el clon de CREAP1 activo fue secuenciada a partir de ambos filamentos de acuerdo con métodos convencionales. Los resultados indican que la región de codificación de este gene es de 1950 nucleótidos y la secuencia de aminoácidos es predicha como 650 aminoácidos. El análisis de bioinformática muestra que CREAP 1 no contiene dominio funcional de proteína conservado (por ejemplo, dominio de unión de ATP de cinasa o dominio de unión de DNA de factor de transcripción) diferente a un dominio rico en prolina desde el aminoácido 379 a 448 en el centro de la molécula. La secuencia de DNA y secuencia de am inoácidos se muestran a continuación. Secuencia de DNA confirmada de longitud completa de CREAP1 : CCCCATTGACGCSAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAG TGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACC GATCCAGCCTCCGGACTCTAGCCTAGGCCGCGGGACGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTAT GACCATTAGGCCTATTTAGGTGACACTATAGAACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGTACCGGT CCGGAATTCCCGGGAGGAGGAGGAGGTGGCGGCGAGAAGATGGCGACTTCGAACAATCCGCGGAAA TTCAGCGAGAAGATCGCGCTGCACAATCAGAAGCAGGCGGAGGAGACGGCGGCCTTCGAGGAGGTC ATGAAGGACCTGAGCCTGACGCGGGCCGCGCGGCTCCAGCTCCAGAAATCCCAGTACCTGCAACTG GGCCCCAGCCGAGGCCAGTACTATGGCGGGTCCCTGCCCAACGTGAACCAGATCGGGAGTGGCACC ATGGACCTGCCCTTCCAGCCCAGCGGATTTCTGGGGGAGGCCCTGGCAGCGGCTCCTGTCTCTCTG ACCCCCTTCCAATCCTCGGGCCTGGACACCAGCCGGACCACCCGGCACCATGGGCTGGTGGACAGG GTGTACCGGGAGCGTGGCCGGCTCGGCTCCCCACACCGCCGGCCCCTGTCAGTGGACAAACACGGA CGGCAGGCCGACAGCTGCCCCTATGGCACCATGTACCTCTCACCACCCGCGGACACCAGCTGGAGA AGGACCAATTCTGACTCCGCCCTGCACCAGAGCACAATGACGCCCACGCAGCCAGAATCCTTTAGC AGTGGGTCCCAGGACGTGCACCAGAAAAGAGTCTTACTGTTAACAGTCCCAGGAATGGAAGAGACC ACATCAGAGGCAGACAAAAACCTTTCCAAGCAAGCATGGGACACCAAGAAGACGGGGTCCAGGCCC AAGTCCTGTGAGGTCCCCGGAATCAACATCTTCCCGTCTGCCGACCAGGAAAACACTACAGCCCTG ATCCCCGCCACCCACAACACAGGGGGGTCCCTGCCCGACCTGACCAACATCCACTTCCCCTCCCCG CTCCCGACCCCGCTGGACCCCGAGGAGCCCACCTTCCCTGCACTGAGCAGCTCCAGCAGCACCGGC AACCTCGCGGCCAACCTGACGCACCTGGGCATCGGTGGCGCCGGCCAGGGAATGAGCACACCTGGC TCCTCTCCACAGCACCGCCCAGCTGGCGTCAGCCCCCTGTCCCTGAGCACAGAGGCAAGGCGTCAG CAGGCATCGCCCACCCTGTCCCCGCTGTCACCCATCACTCAGGCTGTAGCCATGGACGCCCTGTCT CTGGAGCAGCAGCTGCCCTACGCCTTCTTCACCCAGGCGGGCTCCCAGCAGCCACCGCCGCAGCCC CAGCCCCCGCCGCCTCCTCCACCCGCGTCCCAGCAGCCACCACCCCCGCCACCCCCACAGGCGCCC GTCCGCCTGCCCCCTGGTGGCCCCCTGTTGCCCAGCGCCAGCCTGACTCGTGGGCCACAGCCGCCC CCGCTTGCAGTCACGGTACCGTCCTCTCTCCCCCAGTCCCCCCCAGAGAACCCTGGCCAGCCATCG ATGGGGATCGACATCGCCTCGGCGCCGGCTCTGCAGCAGTACCGCACTAGCGCCGGCTCCCCGGCC AACCAGTCTCCCACCTCGCCAGTCTCCAATCAAGGCTTCTCCCCAGGGAGCTCCCCGCAACACACT TCCACCCTGGGCAGCGTGTTTGGGGACGCGTACTATGAGCAGCAGATGGCGGCCAGGCAGGCCAAT GCTCTGTCCCACCAGCTGGAGCAGTTCAACATGATGGAGAACGCCATCAGCTCCAGCAGCCTGTAC AGCCCGGGCTCCACACTCAACTACTCGCAGGCGGCCATGATGGGCCTCACGGGCAGCCACGGGAGC CTGCCGGACTCGCAGCAACTGGGATACGCCAGCCACAGTGGCATCCCCAACATCATCCTCACAGTG ACAGGAGAGTCCCCCCCCAGCCTCTCTAAAGAACTGACCAGCTCTCTGGCCGGGGTCGGCGACGTC AGCTTCGACTCCGACAGCCAGTTTCCCCTGGACGAACTCAAGATCGACCCCCTGACCCTCGACGGA CTGCACATGCTCAACGACCCCGACATGGTTCTGGCCGACCCAGCCACCGAGGACACCTTCCGGATG GACCGCCTGTGAGCGGGCACGCCGGCACCCTGCCGCTCAGCCGTCCCGACGGCGCCTCCCCAGCCC GGGGACGGCCGTGCTCCGTCCCTCGCCAACGGCCGAGCTTGTGATTCTGAGCTTGCAATGCCGCCA AGCGCCCCCCGCCAGCCCGCCCCCGGTTGTCCACCTCCCGCGAAGCCCAATCGCGAGGCCGCGAGC CGGGCCGTCCACCCACCCGCCCGCCCAGGGCTGGGCTGGGATCGGAGGCCGTGAGCCTCCCGCCCC TGCAGACCCTCCCTGCACTGGCTCCCTCGCCCCCAGCCCCGGGGCCTGAGCCGTCCCCTGTAAGAT GCGGGAAGTGTCAGCTCCCGGCGTGGCGGGCAGGCTCAGGGGAGGGGCGCGCATGGTCCGCCAGGG CTGTGGGCCGTGGCGCATTTTCCGACTGTTTGTCCAGCTCTCACTGCCTTCCTTGGTTCCCGGTCC CCCAGCCCATCCGCCATCCCCAGCCCGTGGTCAGGTAGAGAGTGAGCCCCACGCCGCCCCAGGGAG GAGGCGCCAGAGCGCGGGGCAGACGCAAAGTGAAATAAACACTATTTTGACGGCAAAAAAAAAAAA AAAGGGCGGCCGCTCTAGASTATCCCTCGAGGGGCCCAAG (SEQ ID NO 1) Secuencia de aminoácidos predicha de CREAP1 (650 aminoácidos): MATSNNPRKFSEKIALHNQKQAEETAAFEEVMKDLSLTRAARLQLQKSQYLQLGPSRGQYYGGSLP NVNQIGSGTMDLPFQPSGFLGEALAAAPVSLTPFQSSGLDTSRTTRHHGLVDRVYRERGRLGSPHR RPLSVDKHGRQADSCPYGTMYLSPPADTS RRTNSDSALHQSTMTPTQPESFSSGSQDVHQKRVLL LTVPG EETTSEADKNLSKQAWDTKKTGSRPKSCEVPGINIFPSADQENTTALIPATHNTGGSLPD LTNIHFPSPLPTPLDPEEPTFPALSSSSSTGNLAANLTHLGIGGAGQGMSTPGSSPQHRPAGVSPL SLSTEARRQQASPTLSPLSPITQAVAMDALSLEQQLPYAFFTQAGSQQPPPQPQPPPPPPPASQQP PPPPPPQAPVRLPPGGPLLPSASLTRGPQPPPLAVTVPSSLPQSPPENPGQPSMGIDIASAPALQQ YRTSAGSPANQSPTSPVSNQGFSPGSSPQHTSTLGSVFGDAYYEQQMAARQANALSHQLEQFNMME NAISSSSLYSPGSTLNYSQAAMMGLTGSHGSLPDSQQLGYASHSGIPNIILTVTGESPPSLSKELT SSLAGVGDVSFDSDSQFPLDELKIDPLTLDGLHMLNDPDMVLADPATEDTFR DRL (SEQ ID NO 2) Ejem plo 3 Nothern blot y traducción in vitro de proteína C REAP1 Para investigar la expresión de gene de CREAP1 en diferentes tejidos h umanos, cond ujimos un análisis Northern blot usando una sonda de CREAP 1 aleatoriamente etiquetada. De acuerdo con el análisis Northern blot, se observaron dos mRNAs, 2.4 Kb y 7 Kb. La banda de 2.4 Kb es consistente con el tamaño de región de codificación. La banda de 7.0 Kb puede reflejar u na forma de empalme alternativa de m RNA. Aunque se expresa en la mayoría de los tejidos humanos, mRNA de CREAP 1 es abundante en el cerebro, corazón , músculo esquelético y riñon (datos no m ostrados) . Para probar la precisión de la secuencia de aminoácidos predicha de CREAP 1 , usamos pCMVSPORT-CREAP I como la plantilla y condujimos una reacción de transcripción y trad ucción in vitro. Después de que los productos de traducción invitro fueron resueltos en S DS-PAGE, se observó una sola banda de proteína CREAP 1 alrededor de 80 Kd , consistente con la ¡dea de que contiene 650 aminoácidos (datos no mostrados) .

Ejemplo 4 C REAP 1 actúa a través de CREB Com o CREAP 1 activa fuertemente la transcripción de promotor de CRE , investigamos a continuación si CREAP 1 trabaja a través de la ruta de CREB. Para resolver este punto, se realizó un ensayo de cinasa in vivo usando construcciones de fusión hechas de dominios de transactivación de CREB o factores de transcripción de ATF2 y el dominio de unión de DNA GLA4 (aminoácidos 1 -147) y la línea celular HLR integrada de manera estable con el PathDetect Trans-Reporter Plasmid (Stratagene). En este sistema, solo aquéllos reguladores corriente arriba (presumiblemente cinasas) que activan los dominios de transactivación de CREB o ATF2 podrían impulsar la expresión de reportador de lubicerasa. Los resultados indican que CREAP1 estimula fuertemente la transactivación de la molécula de fusión de CREB-GAL4 en el promotor de GAL4 y su actividad es incluso más fuerte que aquélla de la subunidad catalítica PKA, una cinasa canónica que fosforita CREB. De manera interesante, CREAP1 es incapaz de activar la molécula de fusión ATF2-GAL4, mientras que MEKK (una cinasa corriente arriba para la ruta ATF2, manual del conjunto de Stratagene) podría estimular la fusión de ATF2 más de 100 veces. Para confirmar adicionalmente esta observación, se utilizaron dos construcciones negativas dominantes de CREB (muíante S133A no fosforilable o muíaníe de dominio de unión de DNA K287L (Clonfech)) para un ensayo de cofransfección. Los datos experimentales mostraron que ya sea el mutaníe S 133A de CREB o el muíante K287L podrían abolir completameníe la acíivación de CREAP1 en el promotor de CRE, sugiriendo que CREAP1 írabaje específícameníe corrieníe arriba de la ruía de transduccion de señal de CREB y que tanío la fosforilación como la actividad de unión de DNA de CREB son requeridas para la señalización de CREAP1 .

Ejem plo 5 Anál isis funcional de domin ios intramoleculares de proteína CREAP1 Para disecar los dominios funcionales dentro de la molécula de CREAP 1 , fragmentos de proteína CREAP 1 de los aminoácidos 1 -170, 1 -356, 1 -494, 1 -580 y 1 70-650 fueron subclonados en el vector pFlag-C V4 al util izar la estrategia basada en PCR y se probaron por función en un ensayo Dual Glo Luciferase como se describe antes. Los resultados indican que el fragmento amino terminal conteniendo los aminoácidos 1 -1 70 de CREAP 1 es importante para su función , ya que K5 (aa 1 70-650) el cual carece de este extremo amino, carece casi de toda actividad estimulante. Sin embargo, el fragmento de 1 -170 solo (K1 ) no es suficiente para su función . Por otra parte, el extremo C de CREAP1 es dispensable para su función, ya que la supresión de K4 (aminoácidos faltantes 581 -650) retiene casi toda su actividad de tipo natural. Una comparación de la actividad de K2 y 4 sugiere que los aminoácidos 356-580 (los cuales tienen un dominio rico en prolina) es muy importante para la función de CREAP 1 , debido a que la remoción de esta porción de K4 (lo cual resulta en K2) redujo la actividad funcional de CREAP 1 por 1 0 veces (ver Tabla 1 a continuación) .

Fragmento Aminoácidos de CREAP1 Actividad SEQ ID NO# K1 1-170 Inactivo 32 K2 1-356 Inactivo 33 K3 1-494 Parcialmente activo 34 K4 1-580 Completamente activo 35 K5 170-650 Inactivo 36 Tabla 1 . Fu nción de fragmentos de CREAP Los siguientes materiales y métodos son usados para realizar los experimentos listados más adelante en los Ejemplos 6-9: Construcciones de DNA pGL-2-IL-8P-Luc construido usando métodos convencionales (Roebuck, J. Inteferon and Cytokine Res. 19:429-438 (1999)), contiene un gene de iuciferasa de luciérnaga impulsado por una secuencia de 1.5 kb que contiene el promotor IL-8. pGL3B-IL-8P-Luc es construdio al ligar el DNA de promotor de IL-8 humano de 1.5 kb cortado por digestión con Hind 11 l/Xho I de pGL-2-IL-8P-Luc e inserción en pGL3Basic (Promega) diferido con Hindlll/Xhol. El reportador plL-8Luc fue construido mediante inserción de la región -1491 a +43 del gene de IL-8 humano en el vector pGL3Basic (promega, Inc.). Se usó PCR para generar un promotor de IL-8 mínimo tipo natural así como mutantes puntuales. Las mutaciones en AP-1, C/EBP, NF-?? fueron como se describió por Wu et al. (Wu et al. J. Biol. Chem., 272:2396-2403 (1997)). La secuencia de un sitio similar a CRE putativo TGACATAA fue mutada a TCGATCAA. Las construcciones de promotor que realizaron 6 copias concatamerizadas de elemento de respuesta simlar a CRE (pCREL-Luc) o 5 copias de elemento similar a CRE TGACACAA encontrado en promotores humanos PEPCK y CAPL (pCREL2-Luc), se prepararon al ligar secuencias amplificadas de PCR en pTAL-Luc (BD Biosciences). Toas las técnicas fueron realizadas usando métodos convencionales.

Construcción de variantes mutadas puntuales y supresión de promotor de 1L-8 La reacción en cadena de polimerasa (PCR) es usada para generar las variantes de promotor de IL-8. Los ciclos de amplificación de PCR consisten de: 2 min a 94°C, 5X[15 s a 94°C, 30 s a 55°C y 15 s a 72°C] y 20X[1 5 s a 94°C, 30 s a 65°C y 15 s a 72°C]. Se usa Advantage 2 DNA polymerase (BD Biosciences) para todos los pasos de amplificación. Todas las variantes son amplificadas con un iniciador antisentido común P2.1 con la secuencia de nucleótidos (5'-GCCCAAGCTTTGTGCTCTGCTGTCTCTGAAAG-3') (SEQ I D NO 3), correspondiente a la secuencia +13-+43 del gene de IL-8 humano (Roebuck, J. Inferieron y Cytokine Res. 19:429-438 (1 999). Un sitio de restricción de BamHI (subrayado) es incluido en la secuencia de todos los iniciadores de sentido. Los clones confirmados de secuencia son cortados por Hind l ll/BamH I de pCR-Blunt l l-TOPO y ligados en pGL3Basic digerido con Hind l ll/Bam H I . pl L-8p[deltaAP-1 ]-Luc, portando promotor de IL-8 m ínimo truncado que carece del sitio AP-1 es creado mediante amplificación con P2.1 y S3 (5'-GCCCTGAGGGGATGGGCCATCAG-3') (SEQ I D NO 4), los iniciadores para generar un producto de 157 nt correspondiente a la secuencia -1 14- +43 del gene de IL-8 humano. Los promotores de I L-8 mínimos que portan ya sea sitios AP-1 mutados o de tipo nautral son amplificados con wtAP-1 - (5'-CGCGGATCCAAGTGTGATGACTCAGGTTTGCCCTG-3') (SEQ I D NO 5), y mAP-1 (5'-CGCGGATTCCGAAGTGTGATATCTCAGGTTTGCCCTG-3") (SEQ ID NO 6), iniciadores de sentido respectivamente y el iniciador P2.1. Los nucleótidos mutados dentro del sitio AP-1 están subrayados. Ambos productos de 187 nt corresponden a la secuencia de -144- +43 del gene de IL-8 humano. Los mutantes de tipo natural y AP-1 son designados pIL-8p[wtAP-1]-Luc y plL-8p[mutAP-1 ]-Luc, respectivamente. Las variantes de promotor mínimo de IL-8 que portan Oct-1/C/EBP mutado y sitios NF-i Bmut son preparadas en dos pasos de PCR. Durante la primera PCR con ya sea SP3_NF-i Bmut (5'-GCCCTGAGGGGATGGGCCATCAGTTGCAAATCGTTAACTTTTCCTCTGACA TAAT-3') (SEQ ID NO 7) o SP3_Oct-1mut (5'-GCCCTGAGGGGATGGGCCATCAGCTACGAGTCGTGGAAT-3' (SEQ ID NO 8), iniciadores de sentido e iniciador antisentido P2-1, productos de 157 nt son amplificados portando sitios de unión NF-?? mutado y Oct-1/C/EBP, respectivamente. Los nucleótidos mutados dentro de los sitios NF-?? y Oct-1 están subrayados. Durante la segunda PCR, un iniciador de sentido AP-1_Bam (5'-CGCGGATCCGAAGTGTGATGACTCAGGTTTGCCCTGAGGGGATGGGC-3") (SEQ ID NO 9) y el iniciador antisentido P2.1 son usados para reamplificar ambos productos de la primera reacciónd e PCR (100 fmol por reacción) para producir un cDNA de 187 nt correspondiente a la secuencia -144- +43 del gene de IL-8 humano. Los mutantes de sitios de unión NF- ? y Oct-1/C/EBP son designados plL-8p[mutNF-KB]-Luc y plL-8p[mutOct-1-]-Luc, respectivamente. Una variante de promotor mínimo de IL-8 que porta un elemento de respuesta similar a CRE mutado es preparado en tres pasos de PCR.

Durante la primera PCR, un iniciador de sentido CREmut (5'-CAGTTGCAAATCGTGGAATTTCCTCTCGATCAATGAAAAGATG-3' (SEQ ID NO 10) e iniciador antisentido P2.1 se usa para producir un producto de 137 nt. Los nucleótidos mutados dentro del sitio similar a CRE están subrayados. Durante la segunda PCR con un iniciador de sentido SP3_Oct-1 wt (5'-GCCCTGAGGGGATGGGCCATCAGTTGCAAATCGTGGAAT-3') (SEQ ID NO 1 1 ), y el iniciador antisentido P2.1 , se usan para reamplificar el producto de la primera reacción de PCR (1 00 fmol por reacción) produciendo un producto de 157 nt correspondiente a la secuencia -1 14- +43 del gene de IL-8 humano. Finalmente, durante la tercera PCR con iniciador de sentido AP-1_Bam e iniciador de antisentido P2.1 y el producto de la segunda reacción de PCR usado como una plantilla (100 fmol por reacción), el extremo 5' de la variante de promotor mínimo de I L-8 es extendido a la posición de nucleótido -144 del gene de IL-8humano. La construcción resultante usada en este estudio es diseñada plL-8p[mutCRE_similar]-Luc.

Una construcción de promotor que porta un elemento de respuesta similar a CRE concatamerizado del promotor de I L-8 es preparado mediante PCR con CREIike_S (5'-CGCCTGGTACCGAGCTCTG-3') (SEQ ID NO 12), sentido y CRElike-AS (5'-ACCCAAGATCTCGAGCCCG-3') (SEQ ID NO 13) , los iniciadores antisentido con un oligonucleótido de plantilla (5'-CGCCTGGTACCGAGCTCTGACATAATGACATAATGACATAATGACATAATG ACATAATGACATAATTACGCGTGCTAGCCCGGGCTCGAGATCTTGGGT-3' (SEQ ID NO 14) (100 fmol por reacción) para la amplificación. Seis copias concatamerizadas de elemento de respuesta simlar a CRE (TGACATAA) están subrayadas. Los parámetros de amplificación de PCR son como se describe antes. Un producto de PCR de 99 nucleótidos es cortado por pn I y Bgl I I , purificado en gel y ligado en el vector pTAL digerido con Kpn l/Bgl I I (BD Biosciences) resultando en el reportador pTLA-6X[CRE_like].

Preparación de DNA para clasificación de alto rendimiento Los clones arreglados discutidos antes son replicados para producir múltiples copias para archivo. Una copia es usada para producir DNA de miniprep usando QIAGEN BioRobot 8000 (Qiagen, Valencia, CA) . Brevemente, para cada placa de 384 cavidades, 2 µ? del stock de glicerol se usan para inocular una placa de 384 cavidades profundas de Greiner conteniendo 1 00 µ? de caldo Luria (Gibco BRL)- 8% de gliceriol. La placa Greiner es cubierta entonces son una hoja de poro de aire (Qiagen) , envuelta con envoltura Sarán e incubada a 37°C, sin agitación, durante -22 horas. Subsecuentemente, 5 µ? del cultivo es transferido desde una placa Greiner de 384 cavidades hacia cuatro placas de 96 cavidades profundas Quiagen conteniendo 1 mi de Caldo Terrific (KD Medical) (+100ug/ml de amplicilina) en cada cavidad. Las cuatro placas Qiagen están cubiertas con hojas de poro de aire y agitadas a 250 rpm en una incubadora a 37°C durante -22 horas. Las células bacterianas son peletizadas mediante centrifugación a 4000 rpm durante 1 5 minutos, los sobrenadantes son decantados y las placas son procesadas usando un Qiagen BioRobot 8000 para producción de preparaciones de DNA. El protocolo usado es basado en el protocolo del frabricante 'QIAprep Turbo96 PB (1 a 4 placas)', con la única modificación siendo substituir placas transparentes de UV de 96 cavidades (Corning) como placas de levigación. La concentración y rendimiento de las muestras de DNA es determinada al medir el valor de OD260 en un SPECTRAmax 190 (molecular Devices). Las 20,702 muestras de DNA resultantes son divididas en alícuotas entonces para producir múltiples copias para archivar (a 80 pg/cavidad en amortiguador TE). Para ensayos usando colección de 2,368 clones de cDNA, se produjeron alícuotas de DNA en placas de PCR de 96 cavidades (ABGene, Rochester, NY) con 6 µ? por cavidad a 20 ng DNA/µ? en medio de cultivo celular OPTI-MEMI (Bico BRL, Carisbad, CA). Las alícuotas de DNA para clasificación con la colección de 20k702 cDNA son producidas en placas de PCR de 384 cavidades con 4 µ? por cavidad a 7.5 ng de plásmido/µ? en OPTI-MEM . Las placas son selladas con hoja de aluminio y almacenadas a -20°C.

Cultivo celular Se resuspendieron células HeLa tripsinizadas (ATCC, Manassas, VA) en medio de crecimiento completo (DME , Invitrogen) conteniendo 10% de suero bovino fetal (GIBCO BRL Carisbad, CA Cat#1 "82-147) y reactivo 1 X antibiótico-antimicótico (GIBCO BRL Carisbad, CA Cat# 1 5240-062) en medio Eagle modificado de Dulbecco (D-MEM) (GIBCO BRL Carisbad, CA Ca#1 031 7-022) a 1 05 células/ml y se distribuyeron en 24 placas de 96 cavidades blancas (Corning, Acton, MA) a 75 µ? por cavidad para la clasificación de colección de 2,368 clones de cDNA o en 51 placas de 384 cavidades blancas (Costar) a 30 µ? por cavidad para la clasificación de colección de 20,702 clones de cDNA usando un Multidrop 384 (ThermoLabsystems). Las células se dejaron durante la noche en una incubadora de cultivo de tejido a 37°C y 5% C02.

Procedimiento de transfeccion de alto rendimiento Para la clasificación de colección de 2,368 clones de cDNA, 330 µ9 de plásmido reportador pGL3B-I L-8p-Luc son resuspendidos en 33 mi de medio de suero bajo OptiMEM I en un tubo cónico de 50 mi con la cantidad final del reportador siendo 100 ng por transfeccion. El tubo es agitado y dividido en alícuotas 4x8 mi. Antes de la transfeccion, 0.8 mi de reactivo de transfeccion fugene 6 (Roche Applied Bioscience) es adicionado por alícuota de 8 mi (4 µ? de Fugene 6^g de DNA transfectado). Los contenidos se mezclan al pipetear arriba y abajo varias veces y se distribuyen en placas de PCR limpias de 96 cavidades (ABGene) a 75 µ?/cavidad. 10 µ? de mezcla [OptiMEM-reportador-Fugene 6] se adicionan por cavidad de cada laca hija conteniendo 6 µ? de cDNAs prediluídos usando una estación de pipeteado BiomekFX (Beckman Coulter, Fullerton, CA). La última fila de placa #24 es usada para alícuotas de vector vacío pCMV-Sport6 como un control negativo de pFC-MEKK una construcción de expresión que codifica la secuencia correspondiente a AA360-672 de MEKK1 humano (Stratagene) como un control positivo. Ambos plásmidos son prediluidos a 20 ng/µ? y divididos en alícuotas de 6 µ? por cavidad. Después de 15 minutos de incubacióna temperatura ambiente, 13 µ? de la mezcla final se transfieren a una placa de cultivo de HeLa de 96 cavidades. Las células son incubadas durante 48 horas a 37°C en la atmósfera con 5% C02.

Para la clasifcación de colección de 20,702 clones de cDNA, 1 .65 mg de plásmido reportador pGL3B-I L-8P-Luc es resuspendido en 1 00 mi de OptiMEM I en un matraz Erlenmeyer de 250 mi (Corning) con una cantidad final del reportador de 50 ng por transfección. El matraz es agitado y dividido en alícuotas de 8 mi. Antes de la transfección, 0.65 mi de reactivo de transfección Fugene 6 es adicionado por alícuota de 8 mi (3 µ? de de DNA transfectado). Los contenidos son mezclados al pipetear arriba y abajo varias veces y se distribuyen en placas de PCR limpias de 96 cavidades (ABGene) a 75 µ?/cavidad. 3 µ? de mezcla [OptiMEM-reportador-Fugene 6] se adicionan por cavidad de cada placa hija de 384 cavidades conteniendo 4 µ? de cDNAs prediluidos usando un BiomekFX (Beckman) . Después de 15 mintos de incubación a temperatura ambiente, 7 µ? de la mezcla de cada cavidad se transfieren a una placa de cultivo de tejido de 384 cavidades. Las células son incubadas durante 48 horas a 37°C en la atmósfera con 5% C02.

Ensayo de luciferasa 48 horas post-transfección, la actividad de luciferasa de luciérnaga es medida usando el BrightGlo Luciferase Assay System (Promega, Madison, Wl), siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante. Brevemente, 90 µ? o 40 µ? de reactivo de Luciferasa recién reconstituido son adicionados a cada cavidad de las placas de cultivo de tejido de 96 cavidades o 384 cavidades respectivamente, usando un Multidrop 384 (Thermo Labsystems, Beverly, MA): Después de 2 minutos de incubación, la luminiscencia es leída en un LUMI NOSKAN Ascent Luminometer (Thermo Labsystems) con un tiempo de integración de 400 ms por las instrucciones del fabricante.

Recuperación de clon para confirmación de acierto Para cada ensayo primario, se calcularon la calificación Z y veces de activación contra la media de población de acuerdo con los métodos convencionales y depositados en una base de datos investigable anotada. Los aciertos potenciales son seleccionados con base en dos criterios: (1 ) la calificación Z es mayor que 3.0 y (2) las veces de activación es mayor que 10 y 5 en las clasificaciones de colección de 2,368 y 20,702 clones de cDNA, respectivamente. Los clones que califican como aciertos en el ensayo primario del subarreglo de 2,368 clones son recuperados de los stocks de glicerol (copia 1 de las placas de rearreglo). Los aciertos del ensayo primario de la colección de 20,702 clones completa son recuperados por re-transformación de las alícuotas de DNA del archivo. Las tranformaciones son realizadas en bacterias XL-10 Gold (Stratagene). Cada clon es rayado en una placa de agar de caldo Luria + antibiótico (100 µg/ml de ampicilina) (KD Medical, Columbia, MD), se cultivó durante la noche a 37°C y se escogen tres colonias de cada laca, se cultivan en placas de 96 cavides de cavidad profunda, conteniendo cada cavidad 995 µ? de caldo Terrific (KD Medical) + 1 00 µg/ml de ampicilina. Estas placas de cavidad profunda son cubiertas con cintas de poro de aire y se incubaron durante la noche a 37°C, agitando a 300 rpm. Las minipreps de DNA son preparadas como se describe antes. Todas las preparaciones de DNA son diluidas entonces a 125 ng/µ? (en cavidades con concentraciones mayores que 125 ng/µ?) y 8 µ? son tomadas para confirmación de secuencia de DNA. El resto del DNA es diluido a 25 ng/µ? y 6 µ? de DNA son transferidos a placas hijas de PCR de 96 cavidades (ABGene) y son usadas para experimentos de validación usando el procedimiento de transfección descrito antes. Para normalizar la eficiencia de transfección, pRL-SV40 (Promega) que codifica el gene de luciferasa de Renilla bajo control del promotor temprano SV40 es incluido a 20 ng por transfección. La actividad de lucieferasa de luciérnaga y Renilla se mide usando DualGIo Luciferase Assay System (Promega), siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante. Brevemente, 90 µ? de reactivo de Luciferasa recién reconstituido es adicionado a cada cavidad de las placas de cultivo de tejido de 96 cavidades con un ultidrop 384 y, después de 1 5 mintuos de la incubación, la luminiscencia es leída en un LU INOSKAN Ascent Luminometer con un tiempo de integración de 400 ms. Subsecuentemente, se adicionan 90 µ? de reactivo Stop-and-Glo a cada cavidad de la placa de cultivo de tejido de 96 cavidades y, después de 15 minutos de incubación, la luminscencia es leída en un LUMI NSKAN Ascent Luminometer con un tiempo de integración de 200 ms. La especificidad de clones seleccionados es probada con diferentes construcciones de promotor basadas en luciferasa: pCRE-Luc, p MCS-Luc (Stratagene), pTAL-Luc (BD Biosciencis), pNF-kB-Luc (BD Biosciences) , plL-8P-Luc, pRHoBp-Luc (hecho en casa por métodos convencinales/BD Biosciences) y pVCAMp-Luc (preparado como se describe en lademarcom, M.F. , J.J . McQuillan , G.D. Rosen y D.C. Dean. 1 992. J. Biol Chem 267: 16323-9).

Ensayo Elisa de IL-8 en células HeLa Las células HeLa son transfectaadas con muestras de DNA seleccionadas del grupo de aciertos de secuencia verificados y confirmados a 1 00 ng por cavidad en placas de 96 cavidades (Costar) usando el protocolo descrito antes. Las muestras de DNA designadas como co-activadores son co-transfectadas a 25 ng por cavidad. PCMV-Sport6 de vector vacío es usado como un control negativo. 72 horas post-transfección, el contenido de IL-8 es medido en los medios de crecimiento celular en alícuotas prediluidas correspondienes a 1 a 5 µ? de medios de crecimiento acondicionados usando un conjunto Elisa de IL-8 (Sigma) siguiendo el protocolo provisto. Como un control positivo, los médicos de crecimiento son recolectados de las células transfectadas con vector vacío y tratados con í L- 1 ß y TNFa (R&D Systems) a 5 ng/ml y 50 ng/ml respectivamente, durante 16 horas antes de la recolección de los medios de crecimiento para el ensayo de IL-8.

Perfilado de expresión de genes con chips de microarreglo de DNA Affymetrix Las células HeLa son transfectadas con CREAP1 como se describe en la presente o construcciones de expresión conteniendo relA, (Rubén SM et al. , Science 1991 Mar 22;251 (5000): 1490-3), MAP3 1 1 (Hartkamp, J. et al. , (1999), Cáncer Res. 59, 2195-2202) o ANKRD3 (Muto, A. , et al. , (2002) J. Biol. Chem . 277, 31 871 -31 876) usando reactivo de transfección Targefect F1 (Targeting Systems, Santee, CA) de acuerdo con el protocolo suministrado con el producto. Brevemente, las células HeLa son usadas para la transfección a 70-80% de confluencia en matraces de cultivo de tejido T75 (Falcon). Las mezclas de transfección son preparadas como sigue: a un tubo cónico de 50 mi (Falcon) con 8 mi de Opti-MEM I, se adicionan 20 µ9 de DNA de plásmido seleccionado y se mezclan al dar golpecitos al tubo. Dos transfecciones se disponen con vector vacío pC V-Sport6. La solución madre de Targefect F-1 es agitada vortiginosamente a toda velocidad durante 20 segundos y se adicionan 40 µ? a cada tubo, se mezclan nuevamente al dar golpecitos al tubo y se incuban a tmeperatura ambiente durante 30 minutos para permitir la formación de complejos de transfección. Las células HeLa son lavadas dos veces con 20 mi de medio Opti-MEM I y 12 mi de cada complejo de transfección son adicionados por 1 matraz T75. Después de 4 horas de incubación a 37DC, se adicionan 8 mi de medio de crecimiento a cada matraz. El medio es reemplazado al siguiente día. 56 horas post-transfección, el medio es reemplazado nuevamente y a uno de los matraces transfectados con plásmido pCMV-Sport6 se adiciona TNFa (R&D Systmes) a 50 ng/ml y la incubación es continuada a 37°C durante las siguientes 16 horas. 72 horas post-transfección, las células son recolectadas en 10 mi de reactivo TRIzol (Gibco BRL) y son congleadas a -80°C. El RNA total es aislado de acuerdo con el protocolo suministrado con el reactivo TRIzol. El etiquetado de síntesis de sondas de cDNA de doble filamento, hibridación Affymetrix Gene-Chip y el análisis de datos se hacen de acuerdo con métodos convencionales (ver además Eberwine, J., et a!., J. Neurosci. 21, 8310-8314 y Hakak, Y., et al., (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A 98, 4746-4751).

Ejemplo 6 Caracterización de u n vector de luciferasa de I L8n U n reportador de luciferasa controlado por un promotor de I L-8 de 1 .5 kB conten iendo frag mento de promotor de IL-8 humano se probó por ind ucibil idad por reguladores conocidos de expresión de gene mediada por citocina. Los reportadores pNF-KB-Luc (BD Biosciences) y pGL2-l L-8p-Luc fueron cotransfectados en cél ulas H EK 293 con construcciones de expresión que codifican activadores conocidos de la ruta de N F- ?, MEKK truncado (AA 360-672) (Stratagene) y cDNA de TRAF6 de longitud completa de acuerdo con métodos convencionales usando una colección de clones propietaria . Las células cotransfectadas con vector pCMV-Sport6 vacío fueron ya sea dejadas sin tratar o tratadas con TNFa (50ng/ml , durante 1 6 horas) . La actividad de luciferasa fue medida 48 horas post-transfección . El reportador pN F-KB-Luc fue usado como un control positivo. Los datos indican que M EKK, TRAF6 y TN Fa activaron sig nificativamente el reportador de promotor de I L-8, aumentando la actividad de gene reportador por 16, 4.9 y 4.7 veces respectivamente . Para la clasificación funcional de alto rendimiento de nuestra colección de clones de cDNA propitaria, la secuencia de promotor de I L-8 fue su bclonada en un vector pGL3Basic (Promega) , un derivado del soporte de vector pGL2 original con especificidad y eficiencia mejoradas .

Ejemplo 7 Clas ificación fu ncional basada en promotor de IL-8 de la colección de 20,000 cDMA y verificación de actividad del acierto pGL3B-I L-8P-Luc se co-transfectó en placas de 384 cavidades con los 20, 702 clones de cDNA de longitud completa individuales como se describe antes. pCMV-Sport6 se cotransfectó con el reportador como un control negativo. La actividad de luciferasa fue medida usando el sistema BrightGlo Repórter Assay (Promega) Los valores absolutos de la actividad de reportador de promotor de I L-8 fueron determinados y los clones que calificaron más de 5 veces por arriba del control de plásmido pCMV-Sport6 fueron identificados (datos no mostrados). Para verificar la identidad y actividad de los aciertos, los clones se recuperaron como se describe antes y se aislaron 3 colonias independientes. Se usaron minipreps de DNA para la verificación de secuencia y ensayos secundarios con el reportador de IL-8P-Luc (datos no mostrados). Los aislados individuales de clones que producen una activación significativa del reportador de 1L-8P-Luc en el ensayo secundario fueron probados por su capacidad para activar siete construcciones de promotor-reportador de luciferasa: pTLA, NF-kB-Luc, I L-8P-Luc, RhoBP-Luc (BD Biosciences) (idéntico a pTAL con la adición de 4 elementos de respuesta de CRE). Los clones de cDNA fueron seleccionados con base en la presencia de un codón de inicio para un gene predicho o caracterizado de una sola secuencia de extremo 5' de los genes RefSeq igualados de 12,905 clones de cDNA de los cuales 5,463 fueron asignados una anotación funcional. Los 20,705 cDNAs fueron cotransfectados con un gene reportador de luciferasa de luciérnaga controlado por el promotor de IL-8 (plL-8-Luc).

Sesenta y cuatro cDNAs indujeron el reportador por más de 5 veces. Los cDNAs activos verificados incluyeron 1 -3 copias de 28 genes únicos. 22 cDNAs no reduntantes fueron elegidos para trabajo adicional. La colección completa también fue clasificada en ensayos para activación de reportador impulsado por elemento de respuesta de A P cíclico o elemento de respuesta de suero (SER). Los resultados obatenidos con los 22 cDNAs en la clasificación primaria son agrupados usando amontonamiento jerárquico (Eisen) para determinar si cualquier gene parece tener actividades relacionadas a través de tres ensayos. Una variedad de genes fueron relativamente específicos para el reportador de I L-8. Estos incluyeron inductores conocidos de NF-?? y fueron representados por relA(p65) - una subunidad de factor de transcripción de NF-??, el miembro de superfamilia de receptor de TNF 1 A, molécula relacionada a TNF TWEEAK/TNFSF12, RI PK2 y TRAF6, respectivamente, un activador de NF-KB recientemente identificado ACT1 y la cinasa PKK. El segundo grupo representó activadores de sitios de factor de transcripción AP-1 , incluyendo múltiples clones para JunD y las cinasas AP inductoras de JNK MAP3K12 y MAP3K1 1 . -C/???ß, conocido por unirse directamente al sitio NL-I L6 de promotor de IL-8 también fue identificado. De esta manera, la clasificación primaria identificó un número de inductores, los cuales fueron predichos para activar el gene IL-8 a través de una variedad de rutas distintas. CREAP1 estuvo entre los aciertos obtenidos. De esta manera, los datos indican que CREAP1 es un fuerte activador de ambas construcciones CRE-Luc e IL-8P-Luc. De hecho, esta proteína de función hasta ahora desconocida pareció no solo el activador más fuerte de CRE (aún más fuerte que los dos transactivadores de unión de CRE, CRE-BPa y CREB1 (datos no mostrados) y que confirman los resultados descritos en los ejemplos provistos antes), sino también fue el activador más fuerte del gene de IL-8 encontrado en estos ensayos secundarios.

Ejemplo 8 CREAP1 activa fuertemente un reportador que porta un tándem de elemento similar a CRE específico de protomor de II-8 Para determinar si los activadores fuertes también inducen el gene de IL-8 endógeno, la acumulación de proteína de IL-8 secretada de células HeLa se midió después de la transfección con construcciones relA y MAP3K11 como ejemplos de activadores NF-?? y AP-1. MAP3K11 y relA indujeron pequeños aumentos, pero las combinaciones de ambos indujeron niveles de IL-8 secretados comparables con aquél observado con IL-?ß, uno de los inductores más potentes de IL-8 conocidos. Estos datos sugieren que la regulación del gene de 11-8 endógeno requiere interjuego de múltiples rutas de transducción de señales. Varios cDNAs fueronidentificados cuyo mecanismo de acción todavía no está claro. Estos incluyeron dos factores intensificadores de GTP-GDP Rho-dependientes (Rho-GEFs), p114 y ARHGEF1, C16orf15 y factor embriónico de tirotrofo 1 (TEF1), fibronectina (FN1) y miembro de familia de receptor nuclear NR2F2. C16orf15 codifica una proteína rica en prolina de función desconocida, altamente expresada en el cerebro. TEF1 es un miembro de los factores de transcripción de cierre de leucina básico, el cual actúa directamente a través de un elemento de respuesta de TEF. FN 1 es una glicoproteína de matriz altamente expresada en tejidos lesionados y los cuales también inducen I L- 1 p vía mecanismo de AP-1 -dependiente. NF2F2 fue un activador muy fuerte en todos los ensayos y así su actividad pareció ser no específica. Varios de los activadores de IL-8 más fuertes fueron asociados con expresión de gene dependiente de CRE. C/???ß, JunD, c-jun, proteínas de unión de CRE CREB 1 , CRE-Bpa y XBP1 fueron encontradas como potentes inductores del reportador impulsado por CRE. Un cDNA que se translapa con las secuencias depositadas para KIAA0616 y MECT1 también fue identificado como el gene CREAP1 discutido antes. de manera interesante, nada es conocido sobre esta proteína, excepto que la secuencia que codifica los primeros 44 aminoácidos de MECT1 son transubicados en el gene similar a Mastermind MAML2 en carcinoma de mucoepidermoide (Tonon et al. , Nat. Genet. , 33:208-213 (2003)). La observación de que muchos de los activadores de IL-8 más fuertes también son activadores de CRE o proteínas de unión, sugiere que el promotor de I L-8 pudiera contener un CRE no reconocido. Esto se probó primero al examinar el efecto de niveles de cAMP elevados en el promotor de I L-8 usando forskolin de dieterpeno de planta (Sigma) - un activador no específico de adenilil ciclasa. Brevemente, células HEK 293 fueron co-transfectadas con ya sea pCRE-Luc o pl L-8-Luc con vector vacío o construcción de expresión de CRE-BPa como se describe antes usando reactivo de transfección Fugene6 (Roche). 16 horas post-transfección, se adicionó un volumen igual de medio de crecimiento conteniendo I BMX a 500 µ? a las cavidades. 8 horas después, se adicionó forskolin de una solución madre de 50µ? preparada en medio de crecimiento a las células pre-tratadas con IBMX para alcanzar 5µ? de concentración final. Las células se dejaron con forskolin durante 16 horas a 37°C. La actividad de luciferasa se determinó usando el conjunto de ensayo Dual-Glo (Promega) y se normalizó como se describió antes. Los datos fueron presentados como inducción de veces comparado con células sin tratar transfectadas con vector vacío. Los resultados indican que forskolin indujo débilmente el reportador de I L-8. La cotransfección de una proteína de unión de CRE encontrada en la claisificaciónBRE-Bpa activó sinérgicamente el promotor de 11-8 sobre tratamiento con forskolin. Usando técnicas estándares, la secuencia de promotor de IL-8 fue examinada entonces por la presencia de secuencias de CRE potenciales. Un CRE variante asimétrico potencial con la secuencia 5'-TGACATAA-3' se encontró entre -69 y -62 del promotor de I L-8, el cual había sido notado previamente como una secuencia de unión de AP-1 , pero su función no ha sido reportada (Roebuck, J. I nferieron y Cytokine Res. 1 9:429-438 (1 999)) . Designamos este sito como "elemento de respuesta similar a CRE". Los oligonucleótidos que portan una secuencia de DNA idéntica fue mostrada por estar bien unida por CREB2 y muy pobremente por CREB1 (Benbrook y Jones, Nucleic Acids Res. , 22: 1463-1469 (1994)). De manera interesante, CREB2 fue propuesto para jugar un papel dual como activador/represor de transcripción. Se pensó que CREB2 unido al "elemento de respuesta similar a CRE" deteriota la unión de proteínas activadoras tales como CREB y así reprime la transcripción dependiente de CRE ( arpinski, et al.

Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 89:4820-4824 (1 992)). Por otra parte, C EB2 fue capaz de activar la transcripción de varios genes que trabajan en estos casos en conjunción con otros factores de transcripción, tales como c-Rel, ATF-1 o la proteína viral Tax (Schoch, et al . Neurochem. Int. 38:601 -608 (2001 )). El mecanismo de inducción del promotor de IL-8 por MAP3K1 1 y CREAP1 fue perseguido. Para determinar si los elementos promotores requerieron activación por estos genes, se creó una serie de variantes de promotores que portan mutaciones en los sitios similares a CRE de I L-8 y otros sitios reguladores y se probaron por inducción mediante MAP3K1 1 , CREAP1 o relA. Los resultados indican que la mutación del sitio de unión C/EBP no tuvo efecto sobre la activación por cualquier proteína. La mutación de sitio NF-?? tuvo poco efecto sobre la inducción por MAP3K1 o CREAP1 , pero eliminó la inducción por relA. La mutación en el sitio AP-1 no alteró significativamente el efecto de relA pero redujo severamente la inducción por MAP3 1 1 . Esto es consistente con la capacidad de MAP3K1 1 para activar la ruta JNK/SAPK y AP-1 . De manera sorprendente, esta mutación también redujo significativmente la activación por CREAP 1 . La mutación del sitio similar a CRE disminuyó o eliminó dramáticamente la inducción tanto por CREAP 1 y por AP3K1 1 (datos no mostrados). Con el fin de determinar si el "elemento similar a CRE" fue directamente responsivo a CREAP1 o MAP3K1 , se examinó la capacidad de ambos genes para activar un promotor mínimo que otra sitio similar a CRE concatamerizado (pCREL-Luc) . Además, estudiamos el efecto del inductor conocido de PMA de AP-1 . Similar al reportador de CRE (pCRE- Luc) , pCREL-Luc fue fuertemente activado por CREAP1 pero ni por tratamiento con MAP3K1 1 ni por PMA (datos no mostrados). Estos datos sugieren que aunque ambos CREAP1 y MAP3K1 1 requieren sitios sim ilares a CRE y AP-1 intactos para su actividad, inducen el promotor de I-8 vía diferentes mecanismos usando los sitios similares a CRE o AP-1 respectivamente como sus elementos de respuesta primarios. Ensayamos adicionalmente si la actividad de reportador plL-8-Luc inducida por CREAP1 es dependiente de CREB. La co-expresión de CREA01 y KCREB - una forma negativa dominante de CREB- (BD Biosciences) condujo a una reducción signficiativa de actividad de promotor de I L-8 inducida por CREAP1 (datos no mostrados). En contraste, la actividad de CREAP1 no fue afectada por co-transfección con una forma constitutivamente activa de l-KBa - un potente inhibidor de ruta de NF-KB. Para determinar si la interacción de CREAP con sitios de unión CRE y AP-1 está asociada con los mismos o diferentes dominios, construímos diversas variantes de superesiones portando CREAP de extremo N y C usando métodos conveniconales y probamos la capacidad de estas variantes a afectar la activación del reportador pl L-8-Luc por ya sea CREAP 1 o MAP3K1 . Un muíante conteniendo una supresión de 59 aminoácidos N-terminales (delta59) redujo CREAP tipo natural e inhibió mayormente la capacidad de MAP3K1 1 paa inducir la expresión del reportador de I L-8 (datos no mostrados). La inhibición fue específica debido a que no hubo efecto de delta59 sobre la activación por relA. La activación de un reportador específico de AP-1 , pAP1 (PMA)-Luc, conteniendo sitios AP-1 reiterados, por ya sea PMA o MAP3K1 1 también fue bloqueada por delta59 (datos no mostrados). Al mismo tiempo, delta59 fue incapaz de bloquear el reportador pCRE-Luc estimulado por forskolin (datos no mostrados) . Estos datos sugieren que mientras que CREAP1 activa la expresión a través de CREs en manera dependiente de CREB, la proteína interactúa probablemente de manera directa o indirecta, con componentes esenciales para la activación de AP-1 .

Ejemplo9 Perfilado de expresión de gene en cél ulas He La transfectadas transientemente con C REAP1 Para determinar si CREAP1 regula la expresión de objetivos de CREB auténticos, se midió la expresión de gene celular usando microarreglos de DNA después de la sobre-expresión de CREAP 1 . Brevemente, las células HeLa fueron transfectadas transientemente con pCMV-Sport6, CREAP1 usando reactivo Targefect F1 (Targeting Systems). La mitad de células transfectadas con pCMV-Sport6 fueron dejadas sin tratar y se usaron como un control negativo. El aislamiento de RNA total, preparación de sondas etiquetadas y protocolo de hibridación de microchip de DNA se realizaron como se describe antes. Los resultados indican que, de manera interesante, el patrón de expresión de gene en células HeLa sobre la transfección de CREAP 1 es claramente distinto de los demás activadores con enriquecimiento particular de genes conocidos por ser dependientes en la ruta cAMP/CREB. De manera específica, la transfección de CREAP 1 indujo 7 genes por más de 10 veces (ver Tabla 2). Los demás genes incluyeron objetivos bien conocidos de CREB y cA P, incluyendo TSHalfa, fosfoenol piruvato carboxicinasa (PEPC ), alfa-B cristalina y anfirregulin de molécula simlar a EGF. CREM (otro gene conocido por ser inducido sobre la elevación de niveles de cAMP) también fue activado por CREAP1 a un menor grado. Este conjunto de genes no fue afectado por MAP3K11, que indujo PAI-2, un objetivo conocido de c-Jun y AP-1 (Arts, et al., 1996 Eur. J. biochem 241:393-402). De esa manera, CREAP1 es un inductor de genes objetivo de CREB auténticos. El gene de IL-8 endógeno también fue activado a un grado relativamente pequeño (2 a 5 veces) por cada activador identificado en la pantalla. La activación débil del gene de IL-8 endógeno comparado con una fuerte activación observada con la construcción de reportador artificial se debe probablemente a la necesidad de activación a través de las múltiples rutas como se discute antes. Hemos analizado también conjuntos de genes regulados diferencialmente sobre CREAP1 o subunidad catalítica de sobre-expresión de proteína cinasa A (PKA) en células HEK293 usando al algoritmo de amontonamiento jerárquico. Hemos encontrado que aunque ambas proteínas actúan a través de CREB, los depósitos de genes sobre- y sub-regulados no se traslapan completamente. Estos datos sugieren que CREAP1 puede proporcionar una alternativa al mecanismo dependiente de fosforilación bien conocido para activar la transcripción.

Gene Affymetrix ID Veces de activación IL-8 1369_s_at 2.5 KIAA0467 41458_at 12 Exodus-1 40385_at 15 Proteína CAPL 38088_r_a 19 Anfirregulin 34898_at 19 DKFZp566K192 32242_at 32 PEPCK 33702_f_at 32 TSHa 39352_at 57 Tabla 2: Inducción de genes resposivos de cAMP por CREAP1. Se muestra el incremento en veces en niveles de mRNA detectados por Affymetrix Gene-chips para los genes inducidos más fuertemente por CREAP. Para comparación, también se muestran los niveles de inducción de las transcripciones de IL-8. Estos fueron los únicos genes inducidos >10 veces por CREAP1 y todos fueron encontrados en experimentos por duplicado. El aumento en veces fue calcualdo como se compara con los niveles de expresión observados después de la transfección con el vector pCMV-Sport6 de control. Los dos genes inducidos más fuertemente por CREAP1 son objetivos conocidos de cAMP, fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK o PCK1) (Roesler, W.J. Cell Endocrinol. 162:1-7 (2000)) y hormona estimultante de tiroide alfa (TSHa) ((Kim, D.S. et al. Mol Endocrinol. 8:528-36 (1994)). Un tercer gene altamente regulado, anfirregulin, fue reportado como dependiente en PKA para la expresión en algunas líneas de cáncer (Bianco, C.G. et al. Clin. Cáncer res. 3:439-48 (1997)) y hemos identificado un sitio de CRE de consenso en el promotor de anfirregulin proximal que es conservado perfectamente en los genes de ratón y humano (datos no mostrados). Dos de los genes endógenos más altamente inducidos por CREAP1 no son objetivos conocidos de cAMP o proteínas CREB. El primero es CAPL, el segundo es la quimiocina Exodus-1 (también conocida como CCL27, IP-3a o LARC). De manera interesante, el gene de Exodus-1 también es una quimiocina y es regulada en una manera muy similar al gene de IL-8 en que el promotor proximal es reportado por contener sitios NF-kB, AP- y NF-IL6/C/EBP. El gene Exodus-1 también se indujo a un grado mucho mayor que el gene de IL-8 endógeno por CREAP1. También se debería notar que CREAP1 es un inductor más fuerte de Exodus-1 que TNF-cc o NF- ? (datos no mostrados). No se sabe si el promotor de Exodus-1 contiene un CRE no reconcido o si CREAP1 pudiera actuar a través de un sitio AP-1 variante como se discutió. Sin embargo, la activación de la expresiónde Exodus-1 por CREAP1 sugiere que el gene de Exodus-1 será regulado por cAMP o por otras rutas inductoras de CREB. Los promotores para los genes de CAPL, KIAA0467 y DKFZp566K192 no han sido descritos. Examinamos el promotor de CAPL, para el cual ningún CRE obvio ha sido reportado, por elementos de respuesta a CREAP1 potenciales. Una secuencia, designada CRE-like2, con la secuencia 5'-TGACACAA-3' se encontró tanto en el promotor PEPCK (nucieótidos -ñ249 y -256) y en el promotor CAPI ubicado (nucleótidos -385 y -392). El elemento Cre-like2 fue colocado corriente arriba de un promotor mínimo y se probó por inducción por CREAP1. Este elemento fue suficiente para mediar la inducción por CREAP1 . Tanto IL-8 CRE-like y las secuencias CRE-like2 fueron activadas modestamente por cAMP elevado y activadas sinérgicamente por cAMP y CRE-BPa, similar al promotor de IL-8. De esta manera, los elementos responsivos de CREAP 1 pueden ser activados vía la ruta de cAMP, sin embargo no vía CREB1 debido a que ambos elementos similares a CRE encontrados en el promotor de IL-8 y elementos CRE-like2 encontrados en los promotores de CAPL y PEPCK son poco probables de ser reconcidos por CREB1 . CREAPs representan objetivos atractivos para descubrimiento de medicaménto. Esto es particularmente cierto si la función de CREAPs es regular subconjuntos específicos de genes regulados con CREB mediante interacción de CREB con otros factores de transcripción. Cualquier antagonista o agnoista que afecta CREB directamente sría probable que tuviera demasiados efectos debido al gran número de genes responsivos de CREB. Los moduladores de función de CREAP por otra parte, pueden tener la capacidad de bloquear subconjuntos específicos de genes, tales como quimiocinas, por ejemplo, IL-8 y Exodus-1 para tratamiento de enfermedad autoinmune e inflamatoria, sugiriendo el anfirregulin el uso en desórdenes proliferativos, y PEPCK para tratamiento de diabetes ya que todos estos genes son altamente inducidos por CREAP1 .

Ejemplo 10 Identificación de CREAP2 La secuencia de aminioácidos completa para CREAP1 fue usada en una investigación BLASTP de una base de datos de NCBI pública.

Inicialmente dos cDNAs de dominio público (X _1 17201 y FLJ==364) fueron identificados teniendo homología significativa para la región de codificación de CREAP1 . La secuencia de nucleótidos de X _1 17201 se usó en una investigación BLASTN (Altschul S. F. et al. , Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (19979) de una base de datos EST de genoteca de cDNA propietaria y 4 clones se identificaron que representan la secuencia pública XM_1 1 720 . Los 4 clones fueron probados funcionalmente sobre co-transfección con los reportadores CRE-Luc e lL-8p-Luc encontrados inicialmente por ser inducidos por CREAP usando métodos similares a aquéllos descritos antes. Brevemente, las células HeLa tripsinizadas son resuspendidas en medio de crecimiento completo a 6x1 04 células/ml y distribuidos en placas de 96 cavidades blancas (Costar) en el volumen de 100 µ? por cavidad. Las células se dejaron durante la noche en una incubadora de cultivo de tejido a 37°C y 5% C02. El plásmido de reportador pGL3B-l l-iP-Luc o reportador de CRE-Luc (BD Bioscicenes) así como cDNAs probados son resuspendidos en medio de suero bajo OptiM EM I (GI BCO BRL) a 25 ng/ml. Los plásm idos reportadores y cDNAs son distribuidos entonces en placas de PCR limpias de 96 cavidades (ABGene) a 4 µ?/cavidad y 3 µ?/cavidad, respectivamente. La mezcla conteniendo reactivo Fugene 6 (Roche Applied Bioscience) a 1 .5 µ? por transfección y plásmido pRL-SV40 (Promega) 20 ng por transfección es adicionada en el volumen de 1 0 µ? por cavidad de la placa de PCR de 96 cavidades conteniendo cDNAs prediluídos. El contenido de cada cavidad es mezclado al pipetear y dejar durante 10 minutos a temperatura ambiente. 15 µ? de la mezcla de transfección de cada cavidad son transferidos a una placa de cultivo de tejido de 96 cavidades. Las céluals son incubadas durante 48 horas. La actividad de luciferasa de luciérnaga y de Renilla se mide usando el DualGIo Luciferase Assay system (Promega) siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante. Brevemente, 1 15 µ? de reactivo de luciferasa recién reconstituido es adicionado a cada cavidad de las placas de cultivo de tejido de 96 cavidades con un Multidrop 384 y, después de 15 minutos de incubación, la luminiscencia es leída en un LUMI NOSKAN Ascent Luminometer (Thermo Labsystems) con un tiempo de integración de 400 ms. Subsecuentemente, 1 1 5 µ? de reactivo Stop-and-Glo se adicionan a cada cavidad del cultivo de tejido de 96 cavidades y, después de 1 5 minutos de incubación, la luminscencia es leída en un LUMI NOSKAN Ascent Luminometer con un tiempo de integración de 200 ms. La actividad de cada cDNA probado es medida como una proporción de las actividades de luciferasa de luciérnaga y de Renilla correspondientes. De los 4 clones, un clon pareció ser activo. La inserción de este clon fue secuenciada completamente en una dirección y pareció codificar un ORF de 586 aminoácidos completamente traslapándose con la proteína de dominio públcio XP_1 172' 1 predica por cDNA de XM_1 17201 . Este clon fue anotado como CREAP2 y codifica una proteína predicha de 693 aminoácidos con un codón de inicio enel nucléotido 1 77 y un codón de paro codificado de TGA en 2256. Aunque una búsqueda de la literatura indica que existen cDNAs que codifican parte de CREAP2, ninguno contiene la secuencia completa de CREAP2 ni es una función para la proteína provista.

La secuencia de nucleótidos de CREAP2 h umana es mostrada a continuación . El codón de inicio ubicado en el n ucleótido 1 77 y un codón de paro codificado de TGA en 2256 se muestran en itál icas : ANTTTTTGTACANAAAAGCAGGCTGTTACCGGTCCGGATTCCCGGGATCTAGGCTGGGGC 60 CGGGTTCGCGGTGCTCGCTGAGGCGGCGGTGGCTACGGCTGGAGGAGCCGGGCCGAGGCC 120 GCGGCGGAGGCCGCGGCTGGTACTGGGAGGGTGGCAGGGAGGGACGGGGAAGGAAGATGG 180 CGACGTCGGGGGCGAACGGGCCTGGTTCGGCCACGGCCTCGGCTTCCAATCCGCGCAAAT 240 TTAGTGAGAAGATTGCGCTGCAGAAGCAGCGTCAGGCCGAGGAGACGGCGGCCTTCGAGG 300 AGGTGATGATGGACATCGGCTCCACCCGGTTACAGGCCCAAAAACTGCGACTGGCATACA 360 CAAGGAGCTCTCATTATGGTGGGTCTCTGCCCAATGTTAACCAGATTGGCTCTGGCCTGG 420 CCGAGTTCCAGAGCCCCCTCCACTCACCTTTGGATTCATCTCGGAGCACTCGGCACCATG 480 GGCTGGTGGAACGGGTGCAGCGAGATCCTCGAAGAATGGTGTCCCCACTTCGCCGATACA 540 CCCGCCACATTGACAGCTCTCCCTATAGTCCTGCCTACTTATCTCCTCCCCCAGAGTCTA 600 GCTGGCGAAGGACGATGGCCTGGGGCAATTTCCCTGCAGAGAAGGGGCAGTTGTTTCGAC 660 TACCATCTGCACTTAACAGGACAAGCTCTGACTCTGCCCTTCATACAAGTGTGATGAACC 720 CCAGTCCCCAGGATACCTACCCAGGCCCCACACCTCCCAGCATCCTGCCCAGCCGACGTG 780 GGGGTATTCTGGATGGTGAAATGGACCCCAAAGTACCTGCTATTGAGGAGAACTTGCTAG 840 ATGACAAGCATTTGCTGAAGCCATGGGATGCTAAGAAGCTATCCTCATCCTCTTCCCGAC 900 CTCGGTCCTGTGAAGTCCCTGGAATTAACATCTTTCCATCTCCTGACCAGCCTGCCAATG 960 TGCCTGTCCTCCCACCTGCCATGAACACGGGGGGCTCCCTACCTGACCTCACCAACCTGC 1020 ACTTTCCCCCACCACTGCCCACCCCCCTGGACCCTGAAGAGACAGCCTACCCTAGCCTGA 1080 GTGGGGGCAACAGTACCTCCAATTTGACCCACACCATGACTCACCTGGGCATCAGCAGGG 1140 GGCATGGGCCTGGGCCCGGCTATGATGCACCAGGACTTCATTCACCTCTCAGCCACCCAT 1200 CCCTGCAGTCCTCCCTAAGCAATCCCAACCTCCAGGCTTCCCTGAGCAGTCCTCAGCCCC 1260 AGCTTCAGGGCTCCCACAGCCACCCCTCTCTGCCTGCCTCCTCCTTGGCCTGCCATGTAC 1320 TGCCCACCACCTCCCTGGGCCACCCCTCACTCAGTGCTCCGGCTCTCTCCTCCTCCTCTT 1380 CCTCCTCCTCCACTTCATCTCCTGTTTTGGGCGCCCCCTCTTACCCTGCTTCTACCCCTG 1440 GGGCCTCCCCCCACCACCGCCGTGTGCCCCTCAGCCCCCTGAGTTTGCTCGCGGGCCCAG 1500 CCGACGCCAGAAGGTCCCAACAGCAGCTGCCCAAACAGTTTTCGCCAACAATGTCACCCA 1560 CCTTGTCTTCCATCACTCAGGGCGTCCCCCTGGATACCAGTAAACTGTCCACTGACCAGC 1620 GGTTACCCCCCTACCCATACAGCTCCCCAAGTCTGGTTCTGCCTACCCAGCCCCACACCC 1680 CAAAGTCTCTACAGCAGCCAGGGCTGCCCTCTCAGTCTTGTTCAGTGCAGTCCTCAGGTG 1740 GGCAGCCCCCAGGCAGGCAGTCTCATTATGGGACACCGTACCCACCTGGGCCCAGTGGGC 1800 ATGGGCAACAGTCTTACCACCGGCCAATGAGTGACTTCAACCTGGGGAATCTGGAGCAGT 1860 TCAGCATGGAGAGCCCATCAGCCAGCCTGGTGCTGGATCCCCCTGGCTTTTCTGAAGGGC 1920 CTGGATTTTTAGGGGGTGAGGGGCCAATGGGTGGCCCCCAGGATCCCCACACCTTCAACC 1980 ACCAGAACTTGACCCACTGTTCCCGCCATGGCTCAGGGCCTAACATCATCCTCACAGGGG 2040 ACTCCTCTCCAGGTTTCTCTA¾GGAGATTGCAGCAGCCCTGGCCGGAGTGCCTGGCTTTG 2100 AGGTGTCAGCAGCTGGATTGGAGCTAGGGCTTGGGCTAGAAGATGAGCTGCGCATGGAGC 2160 CACTGGGCCTGGAAGGGCTAAACATGCTGAGTGACCCCTGTGCCCTGCTGCCTGATCCTG 2220 CTGTGGAGGAGTCATTCCGCAGTGACCGGCTCCAArGAGGGCACCTCATCACCATCCCTC 2280 TTCTTGGCCCCATCCCCCACCACCATTCCTTTCCTCCCTTCCCCCTGGCAGGTAGAGACT 2340 CTACTCTCTGTCCCCAGATCCTCTTTCTAGCATGAATGAAGGATGCCAAGAATGAGAAAA 2400 AGCAAGGGGTTTGTCCAGGTGGCCCCTGAANTCTGCGCAAGGGATGGGCCTGNGGGGAAC 2460 CTCANGGNNAGGGCCCAANGGCCACTTNNAANCTTTGAACCGTCNGTCTGGNANGGTCNN 2520 (SEQ ID NO 15) La secuencia de aminoácidos pred icha de CREAP2 hum ana es mostrada a continuación: MATSGANGPGSATASASNPRKFSEKIALQKQRQAEETAAFEEVMMDIGSTRLQAQKLRL AYTRSSHYGGSLPNVNQIGSGLAEFQSPLHSPLDSSRSTRHHGLVERVQRDPRRMVSPL RRYTRHIDSSPYSPAYLSPPPESSWRRTMAWGNFPAEKGQLFRLPSALNRTSSDSALHT SVMNPSPQDTYPGPTPPSILPSRRGGILDGEMDPKVPAIEENLLDDKHLLKPWDAKKLS SSSSRPRSCEVPGINIFPSPDQPANVPVLPPAMNTGGSLPDLTNLHFPPPLPTPLDPEE TAYPSLSGGNSTSNLTHTMTHLGISRGHGPGPGYDAPGLHSPLSHPSLQSSLSNPNLQA SLSSPQPQLQGSHSHPSLPASSLACHVLPTTSLGHPSLSAPALSSSSSSSSTSSPVLGA PSYPASTPGASPHHRRVPLSPLSLLAGPADARRSQQQLPKQFSPTMSPTLSSITQGVPL DTSKLSTDQRLPPYPYSSPSLVLPTQPHTPKSLQQPGLPSQSCSVQSSGGQPPGRQSHY GTPYPPGPSGHGQQSYHRP SDFNLGNLEQFSMESPSASLVLDPPGFSEGPGFLGGEGP GGPQDPHTFNHQNLTHCSRHGSGPNIILTGDSSPGFSKEIAAALAGVPGFEVSAAGLE LGLGLEDELRMEPLGLEGLN LSDPCALLPDPAVEESFRSDRLQ (SEQ ID NO 16) Ejemplo 11 Identificación de CREAP3 Usando metodologías similares a aq uéllas descitas antes, se encontró un clon en nuestra base de datos EST de genoteca de cDNA propietara por com paración con la secuencia del clon de dom inio público, cDNA FLJ00364. La proteína predicha codificada por FLJ00364 carecía de un ATG iniciador y tuvo una secuencia N-terminal sin homolog ía a CREAP 1 . La com paración de la secuencia de clon de dominio público con un clon sim ilar en n uestra base de datos reveló que nuestra secuencia de clon propietaria contenía u n C extra en la secuencia CCGTCATTTCACCAAGC (SEQ I D NO 17) , donde el C extra es designado por una l ina inferior. Este C extra se confirmó mediante comparación con la secuencia genómica. Este cambio resultó en la elim inación de los primeros 63 aminoácidos predichos por el cDNA FLJ00364 y substituyó 81 aminoácidos alternos dentro del marco inicando en la secuencia de aminoácidos EETRAFE (SEQ I D NO 1 8) altamente conservada con la secuencia de proteína predicha CREAP1 , E23ETAAFE (S EQ I D N O 19). Una serie de tres Reacciones en Cadena de Polimerasa (PCR) se realizó al ORF completo del clon propietario. Los ciclos de amplificación de PCR consistieron de: 2 m in a 94°C, 23X[1 5 s a 94°C, 30 s a 68°C y 15 s a 72°C] y 2 min a 72°C. Se usó Advantage 2 DNA polymerase (BD Biosciences) para todos los pasos de amplificación . Los tres productos de PC R se am plificaron con un iniciador de sentido común KIAAhS3_R1 con la secuencia de n ucleótidos (5'- CCGGAATTCGCCATGGCCGCCTCGCCGGGCTCGGG-3') (SEQ I D NO 20) correspond iente al in icio de ORF. Un sitio de restricción EcoRI se incluyó en la secuencia de extremo iniciador 5 del iniciador usando métodos convencionales. Para la PCR inicial, el DNA genómico hum ano (BD Biosciences) se usó como una plantilla (2 mg por reacción) y los iniciadores antisentido KIAAhAS2 (5'- CCGCGACAGGGTGAGGTCGGTCATGAGCTGCTCGAAGGCCCGCG-3') (SEQ I D N O 21 ) . El producto de PC R de 142 nt se extrajo con mezcla de fenol-cloroformo y se precipitó mediante isopropanol . El precipitado se lavó con 70% etanol helado y se resuspendió en amortiguador TE. 5 ng del producto se usaron como una planti lla en la segunda PCR con iniciadores KIAAhS3_R1 de sentido y lAAHhAS3 (5'-GAAGCTTCTGAAATTGAACCCGCGACAGGGTGAGGTCGGTCATG-3') (SEQ I D NO 22) de anti-sentido . Un producto de PCR de 161 nt se procesó similar al producto de PCR orig inal y 5 ng de DNA resuspendido se usó como una plantilla en la PCR final con iniciadores KIAAhS3_R 1 de sentido y KIAAhAS4 (5'- TGGTAAGGATCCTCCATGGTACTGTGTAAGGCGCAGTTGCTGAAGCTTCTG AAATTGAACCCG-3') (SEQ I D NO 23) . Todos los in iciadores fueron obtenidos de S I GMA-Aldrich Corp. , (Saint Louis, MO, USA) o hechos de acuerdo con métodos convencionales. U n producto de 202 nt se purifió en gel y se cortó con EcoRI y BamH I y se insertó en un plásmido digerido con EcoRI/BamH I del clon propietario . Se verificó la secuencia de 1 6 clones individuales de cDNA FLJ00364 de longtid completa reconstruido y se probaron funcionalmente con reportadores de CRE-Luc e IL-8p-Luc como se describe antes . El clon #5 libre de desig ualaciones introd ucidas por PCR y que activa fuertemente ambos reportadores fue usado para al ineaciones de DNA y proteína y ha sido anotado como CREAP3. La secuencia de nucleótidos de CREAP3 es provista a contin uación . El codón de i nicio en el nucleótido 46 y un codón de paro TGA en 1 905 se muestran en itálicas. Notar que C en el residuo 288 mostrado subrayado en negritas ha sido adicionado debido a la comparación con la secuencia genómica y la secuencia de clon propietaria. La secuencia CGAGG subrayada indica el extremo 5' del clon propietario. La secuencia de nucleótidos corriente arriba de esta secuencia fue am plificada por PCR usando DNA genóm ico como una plantil la y se insertó nuevamente en el clon propietario como se describe antes.

Secuencia de nucleótidos de CREAP3: NTTTTTTGTACANAAAAGCAGGCTGTTACCGGTCCGGAATTCGCCATGGCCGCCTCGCCG 60 GGCTCGGGCAGCGCCAACCCGCGGAAGTTCAGTGAGAAGATCGCGCTGCACACGCAGAGA 120 CAGGCCGAGGAGACGCGGGCCTTCGAGCAGCTCATGACCGACCTCACCCTGTCGCGGGTT 180 CAATTTCAGAAGCTTCAGCAACTGCGCCTTACACAGTACCATGGAGGATCCTTACCAAAT 240 GTGAGCCAGCTGCGGAGCAATGCGTCAGAGTTTCAGCCGTCATTTCACCAAGCTGATAAT 300 GTTCGGGGAACCCGCCATCACGGGCTGGTGGAGAGGCCATCCAGGAACCGCTTCCACCCC 360 CTCCACCGAAGGTCTGGGGACAAGCCAGGGCGACAATTTGATGGTAGTGCTTTTGGAGCC 420 AATTATTCCTCACAGCCTCTGGATGAGAGTTGGCCAAGGCAGCAGCCTCCTTGGAAAGAC 480 GAAAAGCATCCTGGGTTCAGGCTGACATCTGCACTTAACAGGACCAATTCTGATTCTGCT 540 CTTCACACGAGTGCTCTGAGTACCAAGCCCCAGGACCCCTATGGAGGAGGGGGCCAGTCG 600 GCCTGGCCTGCCCCATACATGGGGTTTTGTGATGGTGAGAATAATGGACATGGGGAAGTA 660 GCATCTTTCCCTGGCCCATTGAAAGAAGAGAATCTGTTAAATGTTCCTAAGCCACTGCCA 720 AAACAACTGTGGGAGACCAAGGAGATTCAGTCCCTGTCAGGACGCCCTCGATCCTGTGAT 780 GTTGGAGGTGGCAATGCTTTTCCACATAATGGTCAAAACCTAGGCCTCTCACCCTTCTTG 8 0 GGGACTTTGAACACTGGAGGGTCATTGCCAGATCTAACCAACCTCCACTACTCGACACCC 900 CTGCCAGCCTCCCTGGACACCACCGACCACCACTTTGGCAGTATGAGTGTGGGGAATAGT 960 GTGAACAACATCCCAGCTGCTATGACCCACCTGGGTATAAGAAGCTCCTCTGGTCTCCAG 1020 AGTTCTCGGAGTAACCCCTCCATCCAAGCCACGCTCAATAAGACTGTGCTTTCCTCTTCC 1080 TTAAATAACCACCCACAGACATCTGTTCCCAACGCATCTGCTCTTCACCCTTCGCTCCGT 1140 CTGTTTTCCCTTAGCAACCCATCTCTTTCCACCACAAACCTGAGCGGCCCGTCTCGCCGT 1200 CGGCAGCCTCCCGTCAGCCCTCTCACGCTTTCTCCTGGCCCTGAAGCACATCAAGGTTTC 1260 AGCAGACAGCTGTCTTCAACCAGCCCACTGGCCCCATATCCTACCTCCCAGATGGTGTCC 1320 TCAGACCGAAGCCAACTTTCCTTTCTGCCCACAGAAGCTCAAGCCCAGGTGTCGCCGCCA 1380 CCCCCTTACCCTGCACCCCAGGAGCTCACCCAGCCCCTCCTGCAGCAGCCCCGCGCCCCT 1440 GAGGCCCCTGCCCAGCAGCCCCAGGCAGCCTCCTCACTGCCACAGTCAGACTTTCAGCTT 1500 CTCCCGGCCCAGGGCTCATCTTTGACCAACTTCTTCCCAGATGTGGGTTTTGACCAGCAG 1560 TCCATGAGGCCAGGCCCTGCCTTTCCTCAACAGGTGCCTCTGGTGCAACAAGGTTCCCGA 1620 GAACTGCAGGACTCTTTTCATTTGAGACCAAGCCCGTATTCCAACTGCGGGAGTCTCCCG 1680 AACACCATCCTGCCAGAAGACTCCAGCACCAGCCTGTTCAAAGACCTCAACAGTGCGCTG 1740 GCAGGCCTGCCTGAGGTCAGCCTGAACGTGGACACTCCATTTCCACTGGAAGAGGAGCTG 1800 CAGATTGAACCCCTGAGCCTGGATGGACTCAACATGTTAAGTGACTCCAGCATGGGCCTG 1860 CTGGACCCCTCTGTTGAAGAGACGTTTCGAGCTGACAGACTGrGAACAGAAGGCAGTGGA 1920 ACAGAAGAATGTTTTTCTGCAACAGCC?????AGAATGGAATAG???GAAGCCAGCTGAT 1980 ACCACGGGCTTTCGTTATCTTGACATAGAAGGAAGCAGTGCCACGGCTCCAGGGTTTCAG 2040 ATGAGATCCCATCTCAGACACTGTGGCTTCCTCCAGATCACACAGCTTTGTACTGCCTCT 2100 CCCGCCTGTGGCCAAAGTCGTGTTGCAGCAGGCAGGCTGCT GGAGCTTCCCATGAACTG 2160 GAAAGCTCACCTCCACTGCATCTTTTTACTGGCCATCCAGTCAGCCGATGTGTAAGAGTA 2220 GGAAATACTGTGTCACTGGAGGCCCTCCGTAGCATTGGG 2259 (SEQ ID NO 24) El cDNA de CREAP3 codifica u na proteína predicha de 61 9 aminoácidos como se muestra más adelante con u n codón de inicio en el nucleótido 46 y un codón de paro cod ificado TGA en 1 905. La secuencia correcta alternativa de aminoácidos codificada por CREAP3 diferente de la secuencia pred icha por el clon públ ico FLJ 00364 está subrayada . El ácido glutámico y la alanina en las posiciones de aminoácido 551 y 61 6 se m uestran en negritas.

MAASPGSGSANPR FSEKIALHTQRQAEETRAFEQLMTDLTLSRVQFQK LQQLRLTQYHGGSLPNVSQLRSNASEFQPSFHQADNVRGTRHHGLVERP SRNRFHPLHRRSGDKPGRQFDGSAFGANYSSQPLDESWPRQQPPWKDEK HPGFRLTSALNRTNSDSALHTSALSTKPQDPYGGGGQSAWPAPYMGFCD GENNGHGEVASFPGPLKEENLLNVPKPLPKQLWETKEIQSLSGRPRSCD VGGGNAFPHNGQNLGLSPFLGTLNTGGSLPDLTNLHYSTPLPASLDTTD HHFGSMSVGNSVNNI PAAMTHLGIRS SSGLQS SRSNPS IQATLNKTVLS SSLNNHPQTSVPNASALHPSLRLFSLSNPSLSTTNLSGPSRRRQPPVS P LTLS PGPEAHQGFSRQLS STS PLAPYPTSQMVSSDRSQLS FLPTEAQAQ VS PPPPYPAPQELTQPLLQQPRAPEAPAQQPQAAS SLPQSDFQILPAQG S SLTNFFPDVGFDQQS RPGPAFPQQVPLVQQGSRELQDS FHLRPS PYS NCGSLPNTILPEDS STSLFKDLNSALAGLPEVSLNVDTPFPLEEELQIE PLSLDGLNMLSDS SMGLLDPSVEETFRADRL ( SEQ I D NO 25 ) Debido al C extra descrito antes en la posición 288, los primeros 81 aminoácidos son diferentes entre los polipéptidos predichos por FLJ00364 y el clon propietario corregido. Creemos que la secuencia de aminoácidos codificada por CREAP3 mostrada es correcta porque muestra homología extensa con CREAP 1 Y CREAP2. Brevemente, las secuencias de familia de gene CREAP fueron comparadas usando ClustalW. Las identidades de aminoácidos fueron determinadas con Align , versión 2.0 (Myers E.W. y iller W. , Bull. Math Biol 51 :5-37 (1 989)) y la matriz de calificación Blosum 50 (CITE). La alineación con secuencias genómicas se hizo usando BlastN y las bases de datos Celera CHD (Celera Genomics, Rockville, MD) y se investigó usando la secuencia humana de consenso enmascarada (archivo: CHGD_masked_assembly_500k-i). Las secuencias de aminoácidos predichas por el clon propietario y los cDNAs FLJ00364 son diferentes en otras dos áreas. El clon propietario contiene u na terna GAA adicional que resulta en una adición de ácido gl utámico en la posición 551 como se meustra antes. Finalmente, un cam bio A/G de nucleótido simple en el cDNA de CREAP3 resu lta en un cambio de treon ina/alan ina en la posición de aminoácido 61 6 como se m uestra antes.

Ejem plo 12 Identificación de genes CREAP de otras es pecies Identificación de u n gene de CREAP de Drosop ila , dCREAP: Las búsq uedas BLASTP de bases de datos de secuencias de D NA y proteína Genebank realizadas de acuerdo con métodos convencionales con am bas regiones de codificación CREAP1 y CREAP3 identificaron un solo gene de Drosophila predicho, CG6064. Este gene ha sido designado dCREAP y su secuencia de am inoácidos es mostrada más adelante. Esta secuencia se encontró como un gene pred icho de función desconocida a partir de la secuenciación del genoma de D. melanogaster, entrada GenBank |7293954|gb|AAF4931 3.1 | CG6064-PA [Drosophila melanogaster] (Adams et al. , Science 287(5461 ) :2185-21 95 (2000)). El gene dCREAP CG6064 no contiene inserciones y predice una proteína de 797 am inoácidos, un tanto más grande que las CREAPs humanas.

Secuencia de DNA de dCREAP ATGGCCAATCCGCGCAAGTTCAGCGAGAAGATCGCTCTGCAGAAGCAGAAGCAGGCGGAGGGCACAGCGG AATTCGAGCGGATCATGAAGGAGGTGTATGCCACGAAGAGGGATGAGCCGCCTGCGAATCAGAAGATCCT AGACGGCCTTGTCGGCGGTCAGGAGGTAAGCCAATCCTCGCCAGGCGCAGGCAATGGGACGGGCGGAGGT GGCAGTGGTTCCGGCAGTGGAGCCAGCGGCGGAGGAGCCTCACCAGATGGCCTGGGAGGCGGCGGTGGTT CTCCGACGGCTTATCGAGAATCCCGAGGGCGCAGCGTAGGTGTGGGTCCCATGCGAAGACCGTCGGAGCG CAAGCAGGATCGTTCGCCCTACGGCAGCAGCAGTACGCAACAAACCTTAGACAACGGCCAGCTAAATCCG CATCTTCTTGGTCCACCTACGGCGGAGAGTTTGTGGCGGCGGTCCAGCTCCGATTCGGCGCTGCACCAAA GTGCGCTGGTGGCGGGCTTCAATAGCGACGTGAACTCGATGGGCGCCAACTATCAGCAGCAGCAACATCA GCAACAACAGCAACCGGGCCAGCCAAGATCTCACTCGCCGCACCATGGTATAAACAGGACCATGAGTCCG CAGGCGCAACGGAGGAAGTCGCCGCTACTGCAGCCCCATCAGCTGCAGTTGCAGCAACTGCAACAGCAGC AGCAACAGATGCAACATCAGCATCAGCTGCACCAGCAGCTCCAAATGCAGCAGCTGCAACAGCACCAGCA GCAACACCAGCAGCAGCAGCAACAACAGAACACGCCATACAACAACGCCAAATTCACGAATCCTGTGTTC CGGCCGCTGCAGGATCAGGTCAACTTTGCCAACACCGGCTCCCTGCCCGATCTCACGGCCCTTCAAAACT ATGGACCCCAGCAGCAGCAGCAGCAATCCCAGCAACAGCCGTCGCAGCAACAACAGCAGTTGCAGCAAAC CCTGTCGCCAGTCATGTCTCCGCACAATCACCGCCGCGAACGGGATCAGTCGCCCAGTCCGTTTAGTCCG GCGGGTGGAGGAGGGGGAGCAGGTCCCGGGTCGCCCTATCAGCAGCAACAGCACTCGCCCACCGGAAACA CGCAACAGCAGCAGCAGCAGCACCAACAGCCCAGCAACTCGCCGCACCTGTCCTTTACCAATCTGGCCAC CACGCAGGCAGCTGTTACCACATTTAACCCGCTCCCCACGCTGGGTCCGCACAATGCCACCGACTACCGC CAGCCACCGAATCCTCCTAGTCCACGCTCTTCGCCCGGCTTGCTGAGCAGCGTATCGGCCACGGATCTGC ACTCCAGTGCACCGGCCAGTCCCATACGCCAGCAGCAACAGGCCCATCAGCAGCAACAGCAGCAGCAACA GGCGCAGCAACAACAGCAACAGTTTGATAACTCCTACAACAGTCTGAATACCTCGTTTCACAATCAGTTT GAGATTTTCTCGCTGGGCGACAGCAATTCCTCGCCGGAACAGCAGGGCTTTGCAAATAATTTCGTGGCCC TCGACTTTGACGACCTGAGTGGCGGCGGAGGTGGTGGCCCAAGCGGGGGCGGCGGCAGCAATGGAGGAGG TCTGACCAACGGTTACAACAAGCCGGAGATGTTGGACTTCAGCGAGCTGAGCGGCAGCCCGGAGGCGAGT GGGAACAACAACCACATGCGGCGAGGAGTGAGCAACCTGAACAACAACGGGTTGAGCAATGGTGTGGTGG GATCCACGCACAACGGCAGCACAAATCTAAATGGAGCGGGAAACAACAATAGCAGTAGTGGAGGTGGCAC GGCGCAGGATCCTTTGGGAATAACCACTTCGCCTGTGCCCTCACCCTTGGGCTGCCCCAGTTCACCGCTG CCGATACCGATTCCGATGTCGGCGCAAAGCTCGCCACAGCAGCAGCACCACCATCATCAGCAGCAGCAAC AACAGCATCATCAGCAGCAACACCATCAGCAGCAGCAATTATCATTATCTCTGCACCATTCGCCGCATCA TTCGCCAATGCATTCGCCGCACCATGGGAATTCACCGCTTTCAAGCAGCTCGCCAGTGAGTCACAATGCC TGCTCCAACTCCAACGTGGTGATGAACCACCAGCAGCAGCAGCAACAACATCACCACCAGCAACACCATC ATCAGGGCTCCTCGCAAAGTCACACGCCGACCACAGCGAATATACCCTCTATTATCTTTAGTGATTACTC CTCCAACGCGGATTATACCAGGGAGATCTTCGACTCCCTCGATCTGGATCTGGGACAGATGGACGTAGCC GGTTTGCAGATGCTGTCCGACCAGAACCCCATCATGATCGCCGATCCCAACATCGAGGATAGTTTTCGAC GCGACCTCAACTGATACTATGAGGAGGCTGTTGCGGCCATTGAGAGCGGAGTGCTGCTGGAGGAGGACTA CCAGGCGCTGCTCGGATCAGAGGCGCTGGCGGATGAACAGGTGGTCACAGTCGAGGCCGCCGGAGCCGCA GCAGCAGTAGTAACAGTTGAAGAGGCAGCCACAGTTAGCGAGAAGGACAAAAAAGATTTGGAAGTTGTGG AACTTCTGGTGTCCGGTGTTATGGATGACCTGGTGGACTCCAGTGACCTGGACGAGGAAGTGCGCAATTT CTTTTTTTAGGCAGCCAGCAAGTCATTTTTGTCGTTAACACAACTGATGGAATTTTCGTTTTTAACACAG ATGAGGAAGTGAATTACGTTTTTTAAACGCATTCACTTGCCATTTCTCGATTAAATGCCATATTACTTAA GCTCAGGATTTACAAGCTTAATGCGAATTAAGTTAATTTCGGAAATGCTGACGAGAGTGATTGCAAAGTT CAAAATTGATACAAATTCACTTCCGCAAATTCATGCTGAAACTGAAAGTTTTCTAACAGTCCTCAATATT GTTATCTCGTTATCGTCCGTGCTTTCGTAGCTAGCTCCTACAACAAAAATAC (SEQ ID NO 26) La secuencia de aminoácidos predicha para dCREAP es mostrada a conti nuación: MANPRKFSEKIALQKQKQAEGTAEFERI KEVYATKRDEPPANQKILDGLVGGQEVSQSS PGAGNG TGGGGSGSGSGASGGGASPDGLGGGGGS PTAYRESRGRSVGVGPMRRPSERKQDRS PYGSSSTQQT LDNGQLNPHLLGPPTAESLWRRSSS DSALHQSALVAGFNSDVNS GANYQQQQHQQQQQPGQPRSH S PHHGINRTMS PQAQRRKS PLLQPHQLQLQQLQQQQQQMQHQHQLHQQLQMQQLQQHQQQHQQQQQ QQNTPYNNAKFTNPVFRPLQDQVNFANTGSLPDLTALQNYGPQQQQQQSQQQPSQQQQQLQQTLS P VMSPHNHRRERDQS PS PFSPAGGGGGAGPGSPYQQQQHSPTGNTQQQQQQHQQPSNSPHLS FTNLA TTQAAVTTFNPLPTLGPHNATDYRQPPNPPS PRSS PGLLSSVSATDLHSSAPAS PIRQQQQAHQQQ QQQQQAQQQQQQFDNSYNSLNTSFHNQFEI FSLGDSNS S PEQQGFANNFVALDFDDLSGGGGGGPS GGGGSNGGGLTNGYNKPEMLDFSELSGS PEASGNNNHMRRGVS LNNNGLSNGVVGSTHNGSTNLN GAGNNNSS SGGGTAQDPLGI TTSPVPS PLGCPS SPLPI PI PMSAQSS PQQQHHHHQQQQQQHHQQQ HHQQQQLSLSLHHS PHHSPMHS PHHGNS PL S S S S P VS HNAC SNS WMNHQQQQQQHHHQQHHHQG SSQSHTPTTANIPSIIFSDYSSNADYTREIFDSLDLDLGQMDVAGLQMLSDQNPIMIADPNIEDSF RRDLN (SEQ ID NO 27) La actividad de dCREAP es analizada de acuerdo con el siguiente método: El marco de lectura abierto de dCREAP que codifica 2.3kb de cDNA se amplificó por PCR usando iniciadores de sentido (SEQ ID 37) y antisentido (SEQ ID 38). El iniciador de sentido usado para amplificar cDNA de ORF de dCREAP: (la secuencia CAAC de Drosophila Kozak está subrayada) CAACATGGCCAATCCGCGCAAGTTCAGCGAG (SEQ ID 37) El iniciador antisentido usao para amplificar cDNA de ORF de dCREAP: TCAGTTGAGGTCGCGTCGAAAACTATCCTC (SEQ ID 38) El producto amplificado se insertó en el vector de transformación de elemento P de Drosophila, pUAST (Brand y Perrimon, Development 118:401-415 (1993)). La construción final pUAS-dCREAP se usó para experimentos de transfección en células Schneider de Drosophila melanogaster (S2). Se creó un reportador de luciferasa de luciérnaga, el cual contenía 4 copias del elemento intensificador de CRE de drosophila (SEQ ID 39) (Eresh, S. et al. E BO J. 16:2014-2022 (1997)) seguido por el promotor mínimo de hsp70. La secuencia de oligonucleótidos conteniendo 4 copias de la CRE de Drosophila. La secuencia de elementos de CRE están subrayaadas: GGAGCCTGGCGTCAGAGAGCCTGGCGTCAGAGAGCCTGGCGTCAGAGAG CCTGGCGTCAGAG (SEQ ID 39) Las células S2 fueron transfectadas en placas de 6 cavidades (Costar) mediante el método de CaP04 (Bunch, T. y Goldstein, L. Nucleic Acids Res. 17:9761-9782 (1989)). Un total de 25 ug de DNA se transfectó en un plato de 6 cavidades conteniendo 4 mi de células (~1 x 106 células/ml). La mezcla de transfección se removió después de 18 h y los ensayos de luciferasa se realizaron 48 h después. Los transgenes de UAS se activaron por co-transfección con el plásmido Gal4 promotor de actina provisto por Dr. Norbert Perrimon. La eficiencia de transfección fue co-transfección normalizada con luciferasa de Renilla hspmm impulsada por promotor de choque término mínimo (hecho de acuerdo con métodos convencionales). La actividad de luciferasa fue medida usando el conjunto Dual-luciferase assay (Promega). Como un control negativo, las células S2 fueron co-transfectadas con reportador CRE-hsp_Luc y vector pUAST vacío. Los datos fueron calculados como veces de inducción comparados con la actividad de gene reportador medida en las células designadas como control negativo. Los resultados indican (ver Tabla 3) que, igual que CREAPs humanas, dCREAP también pueden regular CREs en Drosophila, ya que ha inducido potentemente la actividad de reportador CRE-hsp-Luc cuando están presentes elementos de CRE. Veces de activación STDEV PUAST/CRE-hsp-Luc 1.02 0.28 dCREAP/hsp-Luc 0.96 0.15 dCREAP/CRE-hsp-Luc 136.04 37.13 Tabla 3 : dCREAP i nduce potentemente la actividad de reportador CRE-hsp-Luc. Las células S2 fueron co-transfectadas con vector pUAST vacío o construcción pUAST-dCREAP (dCREAP) y ya sea reportador hsp-Luc o reportador hsp-Luc portando 4 copias de CRE de Drosophila (CRE-hsp-Luc) . La actividad de luciferasa fue ensayada 48 horas post-transfección .

I dentificación de un gene de CREAP 1 de ratón (mCREAP P: Tam bién se identificó u na proteína CREAP 1 de ratón usando métodos convencionales. Brevemente , se ensambló cDNA de mCREAPI en el siguiente orden : Los n ucleótidos 1 - 483 fueron tomados de EST BY72080 de ratón (aquí y más adelante números de acceso GenBank) ; Los n ucleótidos 484 - 891 fueron tomados de EST M B950955 de ratón ; Los nucleótidos 892 - 909 fueron tomados de clon Celera de secuencia de DNA genómico de ratón Los nucleótidos 91 0 - 981 fueron tomados de EST CA326891 de ratón. Los n ucleótidos 982 - 1610 fueron tomados de EST BM935820 de ratón. Los n ucleótidos 1 61 1 - 241 6 fueron tomados de EST B I45351 0 de ratón .

La secuencia de nucleótidos resultante de mCREAP I : GGGACGAAGAGTAGGAGTAGGAGGAGGCGGCGAGAAGATGGCGACTTCGAACAATCCGCGGAAATT TAGCGAGAAGATCGCACTGCACAACCAGAAGCAGGCGGAGGAGACGGCGGCCTTCGAGGAGGTCAT GAAGGACCTGAGCCTGACGCGGGCCGCGCGGCTTCAGCTGCAGAAGTCCCAGTACCTGCAGCTGGG CCCCAGCCGTGGCCAGTACTACGGTGGGTCCCTGCCCAACGTGAACCAGATTGGAAGCAGCAGCGT GGACCTGGCCTTCCAGACCCCATTTCAGTCCTCAGGCCTGGACACGAGTCGGACCACACGACATCA TGGGCTTGTGGACAGAGTATATCGTGAGCGTGGCAGACTTGGCTCCCCGCACCGTCGACCCCTGTC AGTAGACAAGCATGGGCGACAGGCTGACAGCTGCCCCTATGGCACCGTGTACCTCTCGCCTCCTGC GGACACCAGCTGGAGGAGGACCAACTCTGACTCTGCCCTGCACCAGAGCACAATGACACCCAGCCA GGCAGAGTCCTTCACAGGCGGGTCCCAGGATGCGCACCAGAAGAGAGTCTTACTGCTAACTGTCCC AGGAAT G G AG G ACAC C G GGG C T G AGAC AG AC AAGAC C C T T T C T AAG C AG T C AT G G G ACT C AAAG AA GGCGGGTTCCAGGCCCAAGTCCTGTGAGGTCCCCGGAATCAACATCTTTCCGTCTGCAGACCAGGA GAACACAACAGCCCTGATCCCTGCCACCCACAACACAGGGGGCTCCCTTCCTGACCTCACCAACAT CCACTTCGCCTCCCCACTCCCGACACCACTGGACCCTGAGGAGCCTCCGTTCCCTGCTCTCACCAG CTCCAGCAGCACCGGCAGCCTTGCACATCTGGGCGTTGGCGGCGCAGGCGGTATGAACACCCCCAG CTCTTCTCCACAGCACCGGCCAGCAGTCGTCAGCCCCCTGTCCCTGAGCACAGAGGCCAGGCGGCA GCAGGCCCAGCAGGTGTCACCCACCCTGTCTCCGTTGTCACCCATCACTCAGGCCGTGGCTATGGA TGCCCTGTCCTTGGAGCAGCAGCTGCCCTATGCCTTCTTCACCCAGACTGGCTCCCAGCAGCCTCC CCCACAGCCCCAGCCACCGCCTCCACCTCCACCGGTATCCCAGCAGCAGCCACCACCTCCACAGGT GTCTGTGGGCCTCCCCCAGGGTGGTCCACTGCTGCCCAGTGCCAGCCTGACTCGGGGGCCCCAGCT GCCACCACTCTCAGTTACTGTACCATCCACTCTTCCCCAGTCCCCTACAGAGAACCCAGGCCAGTC ACCAATGGGGATCGATGCCACTTCGGCACCAGCTCTGCAGTACCGCACGAGTGCAGGGTCACCTGC CACCCAGTCTCCCACCTCTCCGGTCTCCAACCAAGGCTTCTCCCCTGGAAGCTCCCCACAGCACAC GTCCACCCTGGGCAGCGTGTTTGGGGATGCGTACTATGAGCAGCAGATGACAGCCAGGCAGGCCAA TGCTCTGTCNCGCCAGCTGGAGCAGTTCAACATGATGGAGAACGCCATCAGCTCCAGCAGCCTATA CAACCCGGGCTCCACACTCAACTATTCCCAGGCTGCCATGATGGGTCTGAGCGGGAGCCACGGGGG CCTACAGGACCCGCAGCAGCTCGGCTACACAGGCCACGGTGGAATCCCCAACATCATCCTCACGGT GACAGGAGAGTCACCACCGAGCCTCTCTAAGGAACTGAGCAGCACACTGGCAGGAGTCAGTGATGT CAGCTTTGATTCGGACCATCAGTTTCCACTGGACGAGCTGAAGATTGACCCTCTGACCCTGGACGG ACTCCATATGTTGAATGACGCAGACATGGTTITAGCCGACCCAGCCACCGAGGACACCTTCCGAAT GGACCGCCTGTGAGTGGCTGTGCCCACCAGCCGCCGCTGGTCAGTCTCCAACGGCGCTGCCCCAAA CCTGGGGACGGCAATGGCGTCCCCCTTTGCCAACGGCCAAGCTTGTGGTTCTGAGCTTGCAATGCT GCCCAGTGCCCCTGCCAGCCCCCCGCCACCCCGGTCGTTCACCTCCCATGATGCCTGGCGTGCGTG AGGCCGCTGTGTACTAGGCTGGCTATCTGTCTGTCCATCCATCTACCTGGGGTCAGGCTGATGGCC GAGGCTGTGAGTGCCTGGCCCCCATGGATGTTCCCCGTGCTCGCTCCCTCACCCCTCACTGGGGAT GTGAGAGCCCTCATCAGATACCCAAAGTGTCACTCACTTCCAGCATGTGCTGTGCAACGGAGGGCC GGGGCGTGGGTGTGGAGCGCCCAGAGGCTTAGGTGCGCCATCCATTCGACTGTTGTCAGCTGTCAC TGCCTTCCTCCATCCTGTCCCCCGTCCCACCGCCATCCCT (SEQ ID NO. 28) El marco de lectura abierto que codifica la secuencia de proteína de mC EAPI es codificado por los nucleótidos 25-1914.

Secuencia de proteína de mCREAPI: MATSNNPRKFSEKIALHNQKQAEETAAFEEVMKDLSLTRAARLQLQKSQYLQLGPSRGQYYGGSLP NVNQIGSSSVDLAFQTPFQSSGLDTSRTTRHHGLVDRVYRERGRLGSPHRRPLSVDKHGRQADSCP YGTVYLSPPADTSWRRTNSDSALHQSTMTPSQAESFTGGSQDAHQKRVLLLTVPGiiEDTGAETDKT LS QSWDSKKAGSRPKSCEVPGINIFPSADQENTTALIPATHNTGGSLPDLTNIHFASPLPTPLDP EEPPFPALTSSSSTGSLAHLGVGGAGGMNTPSSSPQHRPAVVSPLSLSTEARRQQAQQVSPTLSPL SPITQAVA DALSLEQQLPYAFFTQTGSQQPPPQPQPPPPPPPVSQQQPPPPQVSVGLPQGGPLLP SASLTRGPQLPPLSVTVPSTLPQSPTENPGQSPMGIDATSAPALQYRTSAGSPATQSPTSPVSNQG FSPGSSPQHTSTLGSVFGDAYYEQQMTARQANALSRQLEQFNM ENAISSSSLYNPGSTLNYSQAA MMGLSGSHGGLQDPQQLGYTGHGGIPNIILTVTGESPPSLSKELSSTLAGVSDVSFDSDHQFPLDE LKIDPLTLDGLHMLNDPDMVLADPATEDTFRMDRL (SEQ ID NO: 29) Identificación de una CREAP1 de Fuqu: Se identificó una CREAP 1 en Fugu rubripres. La secuencia se identificó al alinear la secuencia de proteína C REAP 1 humana contra el genoma de fugu (versión 3) usando TBLASTN. Las regiones altamente homologas fueron recuperadas de la al ineación . La secuencia recuperada fue ed itada a mano adicionalmente.

Secuencia de aminoácidos de CREAP 1 de Fug u : MAS SNNPRKFSEKIALHNQKQAEETA7 FEEVMKDLNVTRZ ARLQLQKTQYLQLGQNRGQYYGGSLP NVNQI GNGNI DLPFQVSNS VLDTSRTTRHHGLVERVYRDRNRI S S PHRRPLS VDKHGRQRTNS DS A LHQSAMNPKPHEVFAGGSQELQPKRLLLTVPGTEKSESNADKDSQEQSWDDKKSI FPSPDQELNPS VLPAAHNTGGSLPDLTNIQFPPPLSTPLDPEDTVTFPSLSS SNSTGSLTTNLTHLGISVASHGNNG EKNI FFLKTCTSCEDVYDFYFVGI PTS SQTTMTATAQRRQPPVVPLTLTSDLTLQQSPQQLSPTLS SPINITQSMKLSAS SLQQYRNQTGSPATQSPTS PVSNQGFSPGSSPQPQHIPWGSI FGDSFYDQQ LALRQTNALSHQVCEDGRRLEITHVRLSRLHAELCFCFSQLEQFNMIENPI SSTSLYNQCSTLNYT QAAMMGLTGSSLQDSQQLGYGNHGNI PNIILTISVTGESPPS1S ELTNSLAGVGDVSFDPDTQFP LDELKI DPLTLDGLHMLNDPDMVLADPATEDTFRMDRL ( SEQ I D NO . 30 ) Secuencia de DNA de CREAP 1 de Fugu: ATGGCGTCCTCTAACAATCCTCGCAAATTTAGCGAAAAAATCGCACTGCATAACCAGAAACAAGCA GAGGAGACTGCTGCGTTCGAAGAAGTGATGAAGGACCTGAACGTCACAAGGGCTGCCCGGGTAAGA CAGCTGCAGTTACAGAAGACCCAGTATTTGCAACTAGGGCAGAATCGTGGACAGTACTATGGAGGC TCACTGCCCAATGTCAATCAGATTGGAAATGGCAACATTGACCTGCCTTTTCAGGTGAGCAGGACA AACTCAGACTCAGCTTTACATCAGAGTGCCATGAATCCAAAGCCCCACGAAGTGTTTGCTGGGGGG TCGCAGGAGCTGCAGCCCAAACGACTGCTGCTAACAGTGCCTGGAACCGAAAAATCGGAATCAAAC GCAGACAAAGATTCGCAGGAGCAGTCGTGGGATGACAAAAAGAGTATTTTTCCATCACCAGACCAG GAGTTAAACCCCTCCGTGCTTCCAGCCGCGCACAACACCGGCGGTTCGCTCCCCGACCTGACCAAC ATCCAGTTCCCTCCTCCACTGTCCACCCCACTGGACCCCGAGGACACCGTCACCTTCCCCTCCCTC AGCTCCTCTAACAGCACAGGCAGTCTGACTACCAACCTCACCCACCTGGGCATCAGTGTGGCCAGC CATGGTAATAACGGAGAGAAAAATATATTTTTTTTAAAAACATGCACTTCATGCGAGGATGTTAAA TAATATTACGACTTTTATTTTGTAGGGATTCCCACTTCCTCTCAAACCACCATGACAGCAACAGCA CAGCGGCGGCAACCACCCGTGGTCCCCCTCACCCTCACCTCTGACCTGACTCTTCAACAGTCCCCC CAGCAGCTTTCACCCACCCTCTCCT C ACC C AT T AAC T CACAC AG AG C AT G AAG C T T AG T GCT AGC TAACATTCTTCCCTCCAACAGTACCGCAATCAGACTGGCTCACCAGCCACTCAGTCTCCAACCTCC CCAGTCTCCAATCAAGGCTTCTCCCCCGGCAGCTCGCCTCAACCACAGCACATTCCTGTGGTGGGC AGTATATTTGGGGACTCCTTCTATGATCAGCAGTTGGCTCTGAGGCAGACCAATGCCCTTTCTCAT CAGGTGTGTGAGGACGGCCGCAGGTTAGAAATAACACACGTACGTCTCTCACGACTTCACGCCGAG CTTTGTTTTTGTTTTTCTCAGCTGGAGCAGTTCAATATGATAGAGAACCCCATCAGCTCCACCAGC CTGTACAATCAGTGCTCCACCCTTAATTACACACAGGCAGCCATGATGGGCCTCACCGGGAGCAGC C T G C G GAC T C GCAG C G CTCGGCTAC GG C AT C AC G GCAAC T C C C C AC T C AT AC T GAC AAT T TCAGTCACAGGGGAGTCTCCGCCGAGCCTCTCCAAAGAGCTGACCAACTCATTGGCCGGCGTCGGC GACGTCAGCTTTGATCCAGACACGCAGTTTCCTCTGGACGAGCTGAAGATCGACCCGCTGACCTTG GACGGCCTGCACATGCTCAACGACCCAGACATGGTGCTGGCAGACCCCGCCACAGAGGACACGTTC AGGATGGACAGGCTGTAA ( SEQ I D No . 31 ) Ejemplo 13 Com paración de las reg iones de codificación de CREAP h umana con otras proteínas CREAP de otras es pecies Las tres secuencias de CREAP se compararon primero por una alineación global de sus regiones de codificación como se muestra en la Figura 1 . Cada proteína es de tamaño similar, con CREAP2 siendo un tanto más grande (693 aminoácidos comparados con 650 y 619 aminoácidos en CREAP1 y 3, RESPECTIVAMENTE). Las proteínas pueden dividirse en aproximadamente 3 dominios con base en la conservación. El primero es un tercio amino terminal conservado con un alto grado de identidad a través del aminoácido 267 de CREAP1 (es decir, aminoácidos 1-267). Esta región es aproximadamente 33% idéntico entre las tres CREAPs. El segundo dominio es una región central que se extiende a través de los aminoácidos 289-538 de CREAP1 que es altamente enriquecido en corridas de residuos de prolina, glicina y serina. Esto corresponde a los aminoácidos 289-529, 376-606, 235-533 de CREAP1, CREAP2 y CREAP3, respectivamente. Esta región tiene poca identidad de aminoácidos pero es similar en composición de aminoácidos. Finalmente, el tercio carboxi terminal de la proteína (aproximadamente correspondiente a los últimos 78 aminoácidos de CREAP1 (aminoácidos 575-650 de CREAP1) son otra vez altamente conservados con 38% de identidades de aminoácidos en las tres proteínas. De manera interesante, la parte más conservada de la proteína es el extremo amino. Una región de 80% de identidad sobre 24 aminoácidos existe en las tres proteínas. Esta región también es conservada en Drosophila y es esencial para la función de CREAP y probablemente representa una región clave que regula la función de CREAP. La conservación del extremo amino terminal de CREAPs sugiere que esta región es crítica para su función. Esta idea es soportada por los datos que muestran que la supresión de los 250 aminoácidos amino-terminales destruye la actividad de CREAP1 (ver ia Tabla 1 anterior).

Para identificar adicionalmente si los residuos más amino terminales eran críticos. Una supresión de los 59 aminoácidos más N-terminales en CREAP1 . El cDNA de CREAP1 se cortó del plásmido pCMV-SPORT6 original con las enzimas de restricción Sca l/Xhol (Roche Applied Science, I ndianapolis, I N, USA). El fragmento de cDNA de CREAP1 digerido con Seal de 2382 nt el cual suprimió 177 nucleótidos de ORF de CREAP1 se purificó en gel y subcionó en marco en el vector pFLAG-CMV6B (BD Biosciences) digerido con EcoRV/Sall . Los clones correctos fueron aislados y se verificó la secuencia de acuerdo con los métodos convencionales. Esta proteína (delta59) se probó en el ensayo de p ro m otor-reportador. Consistente con su conservación, la supresión de estos residuos resultó en una pérdida de 80-90% de actividad de CREAP (datos no mostrados). La similitud de CREAP 1 humana y homólogos de otras especies son mostrads en la Figura 1 . En general, los 3 dominios descritos paa CREAPs humanas también están contenidos en las otras secuencias de CREAP. El extremo amino terminal es altamente conservado. De manera notable, los aminoácidos conservados en el más amino-terminal de las CREAPs humanas también es altamente conservado en estas proteínas. El cDNA de CREAP 1 humano identificado en este estudio codifica una proteína de 650 aminoácidos predicha. El cDNA está traslapando parcialmente con un número de cDNAs antonado como KIAA0616 pero difiere en el extremo c-terminal predicho de la proteína codificada. Fuimos capaces de identificar el dominio bobina-bobina N-terminal (aminoácidos 8-54) , dominio rico en serina/glutamina (aminoácidos 289-559) y dominio C- terminal negativamente cargado fuerte (aminoácidos 602-643) (datos no mostrados). Junto con CREAP2 y CREAP3 humanas, los genes que codifican las proteínas altamente similares a CREAP1 fueron encontrados en los genomas de ratón y Fugu como se muestra. En conjunto, los genes de CREAP1 de humano y ratón son 90% idénticos. La proteína de Fugu predicha es de 566 aminoácidos de largo y es 66% idéntico a CREAP1 humana. También hemos identificado un gene similar a CREAP1 en el genoma de Drosophiia. Mientras que los genes de CREAP1 de mamífero y pez son solo aproximadamente 20% idénticas con la secuencia de Drosophiia, la secuencia de Drosophiia comparte una organización similar a las demás proteínas CREAP1. Cada proteína contiene regiones amino y carboxilo terminales altamente conservadas y un dominio central rico en residuos de prolina, glutamina y serina. Hemos llamado al gene predicho de Drosophiia dCREAP. Los primeros 22 de 28 aminoácidos de dCREAP son idénticos con CREAP1 humana. El extremo amino tiene un sitio de fosforilación de consenso de P A o PKC de consenso absolutamente conservado (RKFS) similares al sitio de fosforilación en proteínas de CREB. La fosforilación de esta serina en CREB (serina 133 en CREB1) es requerida para la inducción de expresión de gene dependiente de CREB por cAMP. Los primeros 32 aminoácidos de dCREAP son 69% y 84% idénticos y similares, respectivamente a CREAP1 humana, soportando nuevamente la idea de que el extremo amino terminal de CREAPs es crítico para su función. El dominio central de dCREAP nuevamente es una región de menor complejidad con poca homología. Aunque la región de codificación de dCREAP predicha no tiene algunas regiones ricas en glicina y prolina, es única en ser altamente rica en residuos de glutamina. Nuevamente, similar a las CREAPs humanas, el extremo más carboxi de la proteína es altamente conservado con CREAP1 humana (30% sobre los últimos 30 aminoácidos). La relación de los genes de CREAP se muestra en la Tabla 4. En general, los genes de CREAP humanos están más relacionados unos a otros que a dCREAP. CREAP2 es ligeramente más similar a CREAP1 y CREAP3 que son CREAP1 y CREAP3 uno a otro, pero todos son entre 34-39% idénticos. Todos los CREAPs humanos fueron encontrados como aproximadamente 20% idénticos al gene de dCREAP predicho, aunque la similitud como se muestra antes es mayormente debida a los extremos amino y carboxi altamente conservados de las proteínas. Se debería notar que los tres genes de CREAP son altamente conservados en los genomas de ratón y humano (datos no mostrados). Esto sugiere que las isoformas individuales tienen funciones únicas y críticas. La conservación evolucionaría de CREAP soporta la noción de que CREAP es un regulador crítico de actividad de CRE.

HCREAP1 HCREAP2 HCREAP3 MCREAP1 FCREAP1 dCREAP HCREAP1 32 32 89 63 19 HCREAP2 33 34 31 18 HCREAP3 30 60 15 MCREAP1 60 21 FCREAP1 20 dCREAP Tabla 4: S im ilitud de ami noácidos de genes CREAP de varias especies. Las cifras mostradas represetnan el porcentaje de aminoácidos idéntico a lo largo de la reg ión de codificación de proteína completa y fueron calculadas como se describe antes. El porcentaje de identidad se basa en una alineación automatizada usando ClustalW V1 .74 Ejemplo 14 Actividad de C REAP2 y CREAP3 La homolog ía entre los genes de CREAP humanos sugieren que están funcionalmente relacionadas. Para investigar esto , la capacidad de CREAP2 y CREAP3 para activar la expresión de gene impulsada por el promotor I L-8 y un promotor depend iente de CRE se probó en ensayos co-transfección como se describe antes. Brevemente, los niveles de expresión de un reportador de luciferasa impu lsada por ya sea el promotor de I L-8 o un promotor m ínimo enlazado a 4 copias de C RE se determinaron después de la cotransfección con ya sea u n vector de expresión de pCMV-SPORT6 vacío o con el mismo vector portando u n cD NA para CREAP 1 , CREAP2 o CREAP3. Los resu ltados ind ican que la cotransfección de CREAP 1 con ya sea un gene de luciferasa de luciérnaga impulsado dependiente de promotor I L-8 o dependiente de CRE resultó en u n aumento dramático en la actividad de luciferasa (ver Tabla 5) . La transfección de ya sea CREAP2 o CREAP3 también produjo activación similar a ambos reportadores. Otros experimentos mostraron que esta actividad es dependiente de la integridad de sitio de C RE o similar a CRE presentes en el promotor de I L-8 (datos no mostrados) . De manera interesante, CREAP3 ha mostrado consistentemente un nivel de 2-4 veces mayor de i nducción de expresión de gene comparado con CREAP 1 y CREAP2. De esta manera, CREAP2 y CREAP3 son potentes activadores de expresión de gene impulsada por CRE y la familia de CREAP representa una familia tanto de actividad y secuencia conservadas. Además, los tres miembros de familia de CREAP han mostrado la capacidad para activar la proteína de fusión CREB-GAL4 cuando se sobre expresó en una línea celular H LR-C REB (Stratagene) portando un reortador UAS-Luc integrado en genoma que soporta la evidencia de que las proteínas CREAP pudieran i nducir la expresión de gene a través de la i nteracción con la proteína CREB unida al promotor (datos no mostrados) .

CRE - I L-8 Control 1 1_ CREAP 1 28.6 175.8571 CREAP2 38.6 126.8571 CREAP3 71 .4 574.5714 Tabla 5. I nducción de un promotor im pulsado por C RE o el promotor de lnterleucin-8 por la familia de gene de CREAP. Las construcciones de expresión de luciferasa impulsadas por un promotor mínimo enlazado a múltiples copias de CRE o el promotor de lnterleucin-8 fueron cotransfectados con un vector vacío (control) o vectores de expresión que codifican los tres genes de CREAP. El nivel de expresión de luciferasa es indicado en relación a aquél obtenido con la cotransfeccion del vector vacío.

Ejemplo 15 Proteínas CREAP1 son activadores Varias observaciones sugieren que CREAP1 es un co-activador de transcripción. Primero, aunque hemos sido incapaces de identificar cualquier actividad de unión de DNA en CREAP1, en proteína CREAP contiene un dominio bobina-bobina N-terminal predicho (residuos 8-54 de hCREAPI), un dominio rico en serina/glutamina (residuos 289-559 de hCREAPI) y un extremo carboxilo negativamente cargado. Para determinar si las proteínas CREAP pueden actuar como activadores de transcripción, varias regiones de los 3 homólogos de CREAP (aminoácidos 300-650 de CREAP1, aminioácidos 296-294 de CREAP2 y aminoácidos 335-635 de CREAP3), se expresaron como proteínas de fusión con el dominio de unión de DNA de GAL4 y se probaron por la capacidad para activar la expresión de un gene reportador enlazado a secuencias de unión de proteína GAL4 (UAS-Luc (reportador pFR-Luc)). Brevemente, las regiones indicadas de CREAP1, CREAP2 y CREAP3 fueron amplificadas por PCR y subclonadas en marco en el vector pCMV-B D (Stratagene) que codifica el dom inio de unión de DNA de GAL4. Los plásmidos seleccionados y vector vacío (pCMV-SPO RT6) fueron transfectados en células H EK 293 a 75 ng/cavidad usando reactivo de transfección Fugene6 (Roche) como se descri be antes . El reportador pFR-Luc (Stratagene) q ue codifica gene de luciferasa de luciérnaga impulsado por promotor m ínim i en lazado a 5 sitios de unión de GAL4 concatamerizados (UAS) fue co-transfectado a 1 0 ng/cavidad. Como un control positivo, el reportador tam bién fue co-transfectado con un plásmido que codifica la proteína de fusión GAL4-CRE BA (Stratagene) sola o en la presencia de pFC-PKA u na construcción de expresión que codifica la subun id ad catalítica de proteína cinasa A (Stratagene) para activar el dominio de activación inducible por CREB cinasa. Las veces de inducción se compararon con la actividad de reportador medida en las células trasfectadas con pCMV-BD, un vector de expresión que porta solamente domin io de unión de D NA de GAL4. Mientras que l a actividad del reportador no fue afectada significativamente por las tres proteínas CREAP de long itud com pleta, las fusiones conteniendo la mitad carboxi-term inal de CREAP 1 -3 indujeron potentemente la expresión de UAS-Luc. Ver Tabla 6.

Veces de inducción STDEV Vector 1.00 0.21 CREAP1 2.467531 1.478808 CREAP2 2.47 0.41 CREAP3 1.58 0.74 GAL4-CREAP1.1 2692.60 556.19 GAL4-CREAP2.1 1373.88 222.52 GAL4-CREAP3.1 1364.17 263.62 GAL4-CREB 7.66 0.37 GAL4-CREB/PKA 351.4352 11.52481 TABLA 6: Demostración de que las proteínas CREAP1 son activadores de transcripción.

Las construcciones de expresión que codifican CREAP1, CREAP2 y CREAP3 de longitud completa así como un dominio de unión de DNA de Gal4 solo o fusionado con las porciones C-terminales de CREAP1, CREAP2 y CREAP3 fueron probadas por la capacidad para inducir la expresión de un gene de luciferasa controlado por un promotor mínimo enlazado a sitos de unión de DNA de GLA4 (pFRLuciferase). Los datos mostrados son nomalizados al valor visto con el vector pCMV-BD co-transfectado con el reportador pFR-Luc. Para determinar si las proteínas CREAP pueden activar directamente la proteína CREB1, las construcciones de expresión de CREAP1, CREAP2 y CREAP3 fueron transfectadas individualmente o con el plásmido GAL4-CREB (Stratagene) en la línea celular HLR (Stratagene) que porta copias integ radas de DNA genóm ico de reportador pFR-Luc. Brevemente, las cél ulas H LR fueron manten idas por instrucciones del fabricante. Los plásm id os seleccionados y ya sea el vector vacío (pCMV-BD) o el plásmido GAL4-CREB fueron transfectadas a 75 ng/cavidad usando el reactivo de transfección Fugene6 (Roche) como se describe antes. Como u n control positivo, pFC-PKA una construcción de expresión q ue codifica una subun idad catalítica de proteína cinasa A (Stratagene) también fue co-transfectada con GAL4-CRE. Las veces de activación se comparó con la actividad del reportador medida en las célu las transfectadas con el vector vacío. Aunque la actividad del reportador no fue afectada significativamente por las tres proteínas CREAP de longitud completa, la actividad de prote ína de fusión GAL4-CREB fue sobre-regulada cuando se co-transfectó con las tres C REAPs de longitud completa, sugiriendo que las proteínas CREAB y CREAP i nteractúan para formar u n com plejo transcripcional activo. Ver la Tabla 7 a continuación. Veces de inducción STDEV pCMV-SPORT6 1 1 .73205081 GAL4-CREB 75.54687245 4.42421 391 GAL4-CREB/PKA 676.3531 756 6.86497848 CREAP 1 6. 122284386 3.1 1 591 32 GAL4-CREB/CREAP1 233. 1430292 33.1 345737 CREAP2 2.435298629 2.05959793 GAL4-CREB7CREAP2 1 77.5539854 23.0678772 CREAP3 2.457796272 2.42452624 GAL4-CREB/CREAP3 447.635808 36.439389 Tabla 7: CREAP1 actúa al activar CREB. La capacidad de CREAP1, CREAP2 y CREAP3 de longitud completa para inducir la actividad de proteína de fusión GAL4-CREB (Stratagene) fue probada. Los datos presentados son normalizados al valor visto con el vector pCMV-BD. Todas las CREAps y PKA indujeron significativamente la activación mediada por GAL4-CREB. Notar que las veces de inducción obtenidas con el control positivo es menor cuando se compara con los datos de la Tabla 6, cuando todos los plásmidos incluyendo el reportador fueron transfectados transientemente. Para determinar si CREAP1 puede interactuar directamente con CREB, las variantes K1 y 5 de CREAP1 (ver la Tabla 1) fueron transfectadas en células HEK293 cultivadas en placas de 100 mm (Falcon) usando reactivo Fugene6 (Roche Applied Science) de acuerdo con el protocolo provisto por el fabricante. 40 horas después de la transfección, las células fueron raspadas de las placas en PBS y lisadas en 800 µ? de amortiguador de baja severidad conteniendo: 10 mM HEPES pH 7.6, 250 mM NaCI, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1% NP-40 e inhibidores de proteasa recién disultos. La inmuno-precipitación fue realizada usando perlas de M2-agarosa (Sigma). Las proteínas precipitadas fueron separadas en 4-20% de SDS-PAGE (Invitrogen) y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa (Invitrogen). Se realizaron Western blot usando anticuerpo contra CREB (Cell Signaling Technology). Como un control negativo, se usó una construcción de epxresión que codifica histona deacetilasa 1 humana etiquetada con FLAG (HDAC1). Encontrados que el fragmento de 170 aminoácidos N-terminal de CREAP1, conteniendo el dominio bobina- bobina altamente conservado, fue asociado con CREB 1 endógeno in vivo. Los datos mostrados en la tabla 1 demuestran que esta región es absolutamente esencial para la activación mediada por CREAP de CREs. La familia de CREAP puede representar una ramificación conservada evolucionaría de coactivadores de CREB además de la familia de proteína LI M-only recientemente identificada (Fimia, G. et al. 2000, Mol Cell Biol 20, 861 3-8622). De manera interesante, meintras que la proteína LIM-only asocia con CREM un represor de CRE conocido y proporciona una función de activación que es independiente de fosforilación y CBP, nuestros datos sugieren que CREAP pudiera interactuar con CREB1 unido al sitio de CRE canónico y CREB2 unido al elemento similar a CRE no reconocido por CREB 1 y así activan la expresión de diferentes depósitos de objetivos de gene. Más aún, CREAP1 parece permitir la sinergia entre las proteínas aparentemente unidas a los sitios de unión de CREs y AP-1 . La dilucidación de la acción de CREAP1 debería impartir luz a los mecanismos que gobiernan las respuestas selectivas de tejido a activadores de CREB. Los experimentos descritos aquí elevan la pregunta obvia de la importancia del sitio similar a CRE para regular la expresión de IL-8 durante la enfermedad. Aunque se demostró previamente que ningún sitio CRE o similar a CRE reside en el promotor de I L-8, agonistas ß2-adrenérgico (p2-AR) , los cuales actúan para aumentar los niveles de cAMP intracelular, inducen la secreción de IL-8 en células de músculo suave de vías respiratorias (Kavelaars A. et al. J. Neuroimmunol. 1997 Aug; 77(2):21 1 -6). Esto es particularmente importante ya que el uso de agonistas de 2-AR como broncodilatadores puede exacerbar el asma y debería usarse en conjunción con esteroides anti-inflamatorios (Cockcroft, D. et al., 1993; Lancet 342:833-837; Knox, A.J 2002; Curr. Pharm Des. 1863-1869; Vathenen et al., 1988 Lancet 1:554-558). Los datos presentados sugieren que este efecto puede deberse directamente a la activación de la transcripción de IL-8 a través del sitio similar a CRE y quizás CREAP1.

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Un método para prevenir, tratar o mejorar las condiciones patológicas relacionadas con la activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quimiocinas, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de los mismo, una cantidad efectiva de un modulador de CREAP. 2. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha condición patológica es una enfermedad neurodegenerativa. 3. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha condición patológica es una enfermedad autoinmune. 4. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha condición patológica es una enfermedad inflamatoria. 5. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha condición patológica es seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, osteoartritis, psoriasis, asma, COPD, artritis reumatoide, cáncer, diabetes, hipertensión y dolor crónico. 6. El método de la reivindicación 1 , en donde dicho modulador de CREAP inhibe la actividad de cualquiera de una o más proteínas CREAP seleccionadas del grupo que consiste de CREAP1 , CREAP2 o CREAP3. 7. El método de la reivindicación 6, en donde dicho modulador de CREAP comprende uno o más anticuerpos para una proteína CREAP, o fragmentos de los mismos, en donde dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden inhibir la actividad de dicha proteína CREAP. 8. El método de la reivindicación 6, en donde dicho modulador comprende uno o más imitadores de péptido para una proteína CREAP, en donde imitador de péptido puede inhibir la actividad de dicha proteína CREAP. 9. El método de la reivindicación 1 , en donde dicho modulador CREAP inhibe la expresión de cualquiera de una o más proteínas CREAP seleccionadas del grupo que consiste de CREAP 1 , CREAP2 o CREAP3. 1 0. El método de la reivindicación 9, en donde dicho modulador de CREAP comprende cualquiera de una o más substancias seleccionadas del grupo que consiste de oligonucleótidos antisentido, DNA de triple hélice, ribozimas, RNA aptámeros y RNA de filamento doble o simple, en donde dichas substancias son diseñadas para inhibir la expresión de una proteína CREAP. 1 1 . Un método para prevenir, tratar o mejorar las condiciones patológicas relacionadas con la activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quimiocinas, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un modulador de CREAP. 1 2. El método de la reivindicación 1 1 , en donde dicha condición patológica es una enfermedad neurodegenerativa. 1 3. El método de la reivindicación 1 1 , en donde dicha condición patológica es una enfermedad autoinmune, 14. El método de la reivindicación 1 1 , en donde dicha condición patolgóica es una enfermedad inflamatoria. 1 5. El método de la reivindicación 1 1 , en donde dicha condición patológica es seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, osteoartritis, psoriasis, asma, COPD, artritis reumatoide, cáncer, diabetes, hipertensión y dolor crónico. 16. El método de la reivindicación 11, en donde dicho modulador de CREAP inhibe la actividad de cualquiera de una o más proteínas CREAP seleccionadas del grupo que consiste de CREAP1, CREAP2 o CREAP3. 17. El método de la reivindicación 11 , en donde dicho modulador CREAP comprende uno o más anticuerpos para una proteína CREAP, o fragmentos de los msimos, en donde dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden inhibir la actividad de dicha proteína CREAP. 18. El método de la reivindicación 11, en donde dicho modulador de CREAP comprende uno o más imitadores de péptido para una proteína CREAP, en donde dicho imitador de péptido puede Inhibir la actividad de dicha proteína CREAP. 19. El método de la reivindicación 11, en donde dicho modulador de CREAP inhibe la expresión de cualquiera de una o más proteínas CREAP seleccionadas del grupo que consiste de CREAP1, CREAP2 o CREAP3. 20. El método de la reivindicación 19, en donde dicho modulador de CREAP comprende cualquiera de una o más substancias seleccionadas del grupo que consiste de oligonucleótidos antisentido, DNA de triple hélice, ribozimas, RNA aptámeros y RNA de filamento doble o simple, en donde dichas substancias son diseñadas para inhibir la epxresion de una proteína CREAP. 21. Un método para identificar moduladores útiles para prevenir, tratar o mejorar las condiciones patológicas relacionadas con activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación de quimiocina anormal, que comprende ensayar la capacidad de un modulador candidato para inhibir la actividad de una proteína CREAP. 22. El método de la reivindicación 21 , en donde dicha proteínaCREAP es seleccionada del grupo que consiste de CREAP1 , CREAP2 o CREAP3. 23. El método de la reivindicación 21 , en donde dicho método comprende adicionalmente ensayar la capacidad de un modulador inhibitorio de CREAP identificado para invertir los efectos patológicos observados en modelos in vitro, ex vivo o in vivo de dichas condiciones patológicas y/o en estudios clínicos con sujetos con dichas condiciones patológicas. 24. E! método de la reivindicación 21 , en donde dicha condición patológica es una enfermedad neurodegenerativa. 25. El método de la reivindicación 21 , en donde dicha condición patológica es una enfermedad autoinmune. 26. El método de la reivindicación 21 , en donde dicha condición patológica es una enfermedad inflamatoria. 27. El método de la reivindicación 21 , en donde dicha condición patológica es seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, osteoartritis, psoriasis, asma, COPD, artritis reumatoide, cáncer, diabetes, hipertensión y dolor crónico. 28. Un método para identificar moduladores útiles para prevenir, tratar o mejorar las condiciones patológicas relacionadas con activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación de quimiocina anormal, que comprende ensayar la capacidad de un modulador candidato para inhibir la expresión de una proteína CREAP. 29. El método de la reivindicación 28, en donde dicha proteína CREAP es seleccionado del grupo que consiste de CREAP1 , CREAP2 o CREAP3. 30. El método de la reivindicación 28, en donde dicho método comprende además ensayar la capacidad de un modulador inhibitorio de CREAP identificado para invertir los efectos patológicos observados en modelos in vitro, ex vivo o in vivo de dichas condiciones patológicas y/o en estudios clínicos con sujetos con dichas condiciones patológicas. 31 . El método de la reivindicación 28, en donde dicha condición patológica es una enfermedad neurodegenerativa. 32. El método de la reivindicación 28, en donde dicha condición patológica es una enfermedad autoinmune. 33. El método de la reivindicación 28, en donde dicha condición patológica es una enfermedad inflamatoria. 34. El método de la reivindicación 28, en donde dicha condición patológica es seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, osteoartritis, psoriasis, asma, COPD, artritis reumatoide, cáncer, diabetes, hipertensión y dolor crónico. 35. Una composición farmacéutica que comprende uno o más moduladores de CREAP en una cantidad efectiva para prevenir, tratar o mejorar una condición patológica relacionada con la activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación de quimiocina anormal en un sujeto en necesidad de lo mismo. 36. La composición farmacéutica de acuerdo con ia reivindicación 35, en donde dicha condición patológica es una enfermedad neurodegenerativa. 37. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 35, en donde dicha condición patológica es una enfermedad autoinmune. 38. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 35, en donde dicha condición patológica es una enfermedad inflamatoria. 39. La composición farmacéutica de acuerdocon la reivindicación 35, en donde dicha condición patológica es seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, osteoartritis, psoriasis, asma, COPD, artritis reumatoide, cáncer, diabetes, hipertensión y dolor crónico. 40. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 35, en donde dicho modulador de CREAP inhibe la actividad de una o más proteínas CREAP seleccionadas del grupo que consiste de CREAP1 , CREAP2 o CREAP3. 41 . La composición farmacéutica de la reivindicación 40, en donde dicho modular de CREAP inhibe la actividad de cualquiera de una o más proteínas CREAP seleccionadas del grupo que consiste de CREAP1 , CREAP2 o CREAP3. 42. La composición farmacéutica de la reivindicación 40, en donde dicho modulador de CREAP comprende uno o más imitadores de péptido a una proteína de CREAP, en donde dicho imitador de péptido puede inhibir la actividad de dicha proteína de CREAP. 43. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 35, en donde dicho mod ulador de CREAP i nhibe la expresión de cualquiera de una o m ás proteínas CREAP seleccionadas del g rupo que consiste de CREAP 1 , CREAP2 o CREAP3. 44. La com posición farmacéutica de la reivindicación 43, en donde dicho modular de CREAP comprende cualquiera de u na o más substancias seleccionadas del g rupo que consiste de oligon ucleótidos antisentido, DNA de triple hélice, ribozimas, RNA aptámero y RNA de filamento doble o simle, en donde dichas substancias son diseñadas para inhi bir la expresión de gene de CREAP. 45. U n método para diagnosticar sujetos que sufren de condiciones patol óg icas relacionadas con la activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación de q uimiocina anormal y quienes pueden ser cand idatos adecuados para tratamiento con moduladores de CREAP que comprende ensayar los niveles de mRNA de una proteína CREAP en una m uestra biológica de disho sujeto, en donde un sujeto con niveles de m RNA incrementados comparados con controles , sería un candidato adecuado para tratamiento con modulador de CREAP. 46. El método de la reivindicación 45 , en donde dich a proteína C REAP es seleccionada del grupo que consiste de CREAP 1 , CREAP2 o CREAP3. 47. U n método para diagnosticar sujetos que sufren de condiciones patológicas relacionadas con la activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quim iocinas, q uienes pueden ser candidatos adecuados para tratamiento con moduladores de CREAP, que comprende detectar n iveles de proteína CREAP en una muestra biológica de dicho sujeto, en donde los sujetos con niveles incrementados comparados con controles, serían candidatos adecuados para tratamiento con modulador de CREAP. 48. El método de la reivindicación 47, en donde dicha proteína CREAP es seleccionada del grupo que consiste de CREAP1 , CREAP2 o CREAP3. 49. Un método para prevenir, tratar o mejorar las condiciones patológicas relacionadas con la activación anormal de expresión de gene dependiente de CRE o activación anormal de quimiocinas, que comprende: (a) ensayar los niveles de m RNA de CREAPy/o proteína en un sujeto; y (b) administrar a un sujeto con niveles incrementados de niveles de mRNA de CREAP y/o proteína comparados con controles, un modulador de CREAP en una cantidad suficiente para prevenir, tratar o mejorar dichas condiciones patológicas. 50. El método de la reivindicación 49, en donde dicha condición patológica es una enfermedad neurodegenerativa. 51 . El método de la reivindicación 49, en donde dicha condición patológica es una enfermedad autoinmune. 52. El método de la reivindicación 49, en donde dicha condición patológica es una enfermedad inflamatoria. 53. El método de la reivindicación 49, en donde dicha condición patológica es seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson , enfermedad de Huntington, osteoartritis, psoriasis, asma, COPD, artritis reumatoide, cáncer, diabetes, hipertensión y dolor crónico. 54. Un conjunto diagnóstico para detectar los niveles de mRNA y/o niveles de proteína de una proteína CREAP en una muestra biológica, comprendiendo dicho conjunto: (a) un polinucleótido de CREAP o un fragmento del mismo; (b) una secuencia de nucleótidos complementaria con aquélla de (a); (c) un polipéptido de CREAP, o un fragmento del mismo; (d) un anticuerpo para un polipéptido de CREAP; o (e) un imitador de péptido para una proteína CREAP en donde los componentes (a), (b) , (c), (d) o (e) pueden comprender un componente substancial. 55. El método de la reivindicación 54, en donde dicha proteína CREAP es seleccionada del grupo que consiste de CREAP1 , CREAP2 o CREAP3. 56. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de CREAP seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 2, 16 y 25. 57. Una secuencia de ácidos nucleicos aislados que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la reivindicación 56. 58. Un polipéptido aislado que consiste de una secuencia de aminoácidos de CREAP seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 2, 1 6 y 25. 59. Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la reivindicación 58. 60. Un polipéptido de CREAP aislado codificado por un gene de CREAP de un organismo. 61 . Un DNA aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido CREAP de la reivindicación 60. 62. Una molécula de vector que comprende un fragmento del ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 57. 63. La molécula de vector de acuerdo con la reivindicación 62, que comprende cualquiera de una o más secuencias de control transcripcional. 64. Una célula huésped que comprende la molécula de vector de acuerdo con la reivindicación 63. 65. Un anticuerpo o un fragmento del mismo, el cual se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la reivindicación 56 o a un fragmento de dicho polipéptido. 66. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 65, el cual es un fragmento Fab o F(ab')2. 67. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 65, el cual es un anticuerpo policlonai. 68. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 65, el cual es un anticuerpo monoclonal. 69. Un método para producir un polipéptido como se define en la reivindicación 56, que comprende cultivar una célula huésped que tiene incorporado en ella un vector de expresión que comprende un polinucleótido derivado de manera exógena, que codifica un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 2, 16 y 25 bajo condiciones suficientes para la expresión del polipéptido en la célula huésped, provocando con ello la producción del polipéptido expresado. 70. El método de acuerdo con la reivindicación 69, dicho método comprende además, recuperar el polipéptido producido por dicha célula. 71 . El método de acuerdo con la reivindicación 69, en donde dicho polnucleótido derivado de manera exógena comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 1 , 15 y 24. 72. Un método para producir un polipéptido como se define en la reivindicación 56, que comprende cultivar una célula huésped que tiene incorporado en ella, un vector de expresión que comprende un polinucleotido derivado de manera exógena, que codifica un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D Nos: 2, 16 y 25 bajo condiciones suficientes para la expresión del polipéptido en la célula huésped, provocando por ello la producción del polipéptido expresado. 73. El método de acuerdo con la reivindicación 72, dicho método comprende además recuperar el polipéptido producido por dicha célula. 74. El método de acuerdo con la reivindicación 72, en donde dicho polinucleotido derivado de manera exógeno comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 1 , 15 y 24. 75. Una molécula de vector que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de secuencias de ácido nucleico que codifica fragmentos de proteína CREAP humana de regiones de aminoácidos 1 -267, 289-538, 356-580 y 575-650.