JP2001354697A - 毛様体神経栄養因子 - Google Patents

毛様体神経栄養因子

Info

Publication number
JP2001354697A
JP2001354697A JP2001128506A JP2001128506A JP2001354697A JP 2001354697 A JP2001354697 A JP 2001354697A JP 2001128506 A JP2001128506 A JP 2001128506A JP 2001128506 A JP2001128506 A JP 2001128506A JP 2001354697 A JP2001354697 A JP 2001354697A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cntf
protein
cells
neurons
rat
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001128506A
Other languages
English (en)
Inventor
Piotr Masiakowski
マシアコウスキー ピオトル
Vivien Wong
ウォン ヴィヴィアン
Nikos Panayotatos
パナヨテイトス ニコス
Hans Friedrich Erwin Thoenen
フリードリッヒ エルヴィン テーネン ハンス
Kurt A Stockli-Rippstein
エー シュトックリ−リップシュタイン クルト
Michael Sendtner
ゼントナー ミヒャエル
Yoshihiro Arakawa
アラカワ ヨシヒロ
Patrick Desmond Carroll
デスモンド キャロル パトリック
Rudolf Georg Gotz
ゲオルグ ゴッツ ルドルフ
Georg W Kreutzberg
ヴェー クロイツベルグ ゲオルグ
Dan B Lindholm
ビー リンドホルム ダン
Friedrich Lottspeich
ロットシュパイヒ フリードリッヒ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27410749&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2001354697(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV, Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Publication of JP2001354697A publication Critical patent/JP2001354697A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/10—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for impotence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）をコードす
る核酸配列およびそれから生産されるタンパク質、なら
びにＣＮＴＦを含む医薬組成物を提供すること。本発明
はＣＮＴＦのクローニング、配列決定および発現に関す
るものでありそしてヒトＣＮＴＦをコードする核酸配列
を利用してヒトＣＮＴＦを生産する方法を初めて提供す
るものである。さらに本発明のＣＮＴＦ核酸配列を用い
て種々の種および組織中におけるＣＮＴＦまたはＣＮＴ
Ｆ相同分子をコードする核酸配列を同定することができ
る。 【解決手段】 毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）をコー
ドする核酸配列、または少なくとも約１０ヌクエオチド
を包含するそのサブ配列を含んでなる組換えＤＮＡ分
子。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、毛様体神経栄養因
子（ＣＮＴＦ）をコードする組換えＤＮＡ分子、および
それに由来するペプチド及びタンパク質に関する。本発
明にしたがって生産されるＣＮＴＦ及び関連分子は種々
の神経学的障害の治療に使用できる。
【０００２】
【従来の技術】（１）神経栄養因子の生物学 神経系の成長および発達に影響を与える多数の因子が同
定されている。これらの因子は、未成熟な神経系のみな
らず成熟した神経系においても、ニューロン集団の生存
の維持に重要な役割を果たし得ると考えられている。
【０００３】多くのニューロン集団の正常な発達期間中
には、もとからあったニューロン集団の多くが死滅する
明確な細胞死の期間が存在する（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒお
よびＬｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ，１９４９，Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．ＩＩＩ：４５７−５０１；Ｈａｍｂ
ｕｒｇｅｒ，１９５８，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ａｎａｔ．１０
２：３６５−４１０；Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，１９７５，
Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１６０：５３５−５４
６；ＣｏｗａｎおよびＷｅｎｇｅｒ，１９６８，Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｚｏｏｌ．，１６８：１０５−１２４；Ｒｏｇｅ
ｒｓおよびＣｏｗａｎ１９７３，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕ
ｒｏｌ．１４７：２９１−３２０；Ｃｌａｒｋｅおよび
Ｃｏｗａｎ，１９７６，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．
１６７：１４３−１６４；Ｃｌａｒｋｅら，１９７６，
Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１６７：１２５−１４
２；ＨｏｌｌｙｄａｙおよびＨａｍｂｕｒｇｒｅ，１９
７６，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１７０：３１１−
３２０；ＶａｒｏｎおよびＢｕｎｇｅ，１９７８，Ａｎ
ｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１：３２７−３６
２；Ｃｏｗａｎら，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２
５：１２５８−１２６５）。ニューロンの生存は、神経
に支配される領域の大きさに比例することが示されてい
る。すなわち、当該ニューロン集団の標的領域が小さけ
れば小さいほど、細胞死の期間を生き延びるニューロン
の数も少ない。標的領域中に存在する神経栄養因子の量
が、ニューロン生存に関係する可能性があることが示唆
されている。
【０００４】神経成長因子（ＮＧＦ）は、これらの神経
栄養性分子のうちで断然最もよく特性決定されており、
そしてインビトロおよびインビボの両方でニワトリおよ
びラット両方の初期発達期間中の交感神経ニューロンお
よび神経堤−由来感覚性ニューロンの生存に必須である
ことが示されている（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ
およびＡｎｇｅｌｅｔｔｉ，１９６３，Ｄｅｖｅｌｏ
ｐ．Ｂｉｏｌ．７：６５３−６５９；Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎ
ｔａｌｃｉｎｉら，１９６８，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅ
ｖ．４８：５２４−５６９）。発達中のニワトリ胚に精
製ＮＧＦを注入すると、脊髄感覚性ニューロンおよび交
感神経ニューロンの高度の過形成および肥大が起きるこ
とが明らかにされている（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉ
ｎｉおよびＢｏｏｋｅｒ，１９６０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．４６：３７３−３
８４；Ｈａｍｂｕｒｇｅｒら，１９８１，Ｊ．Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉ．１：６０−７１）。逆に、新生児ラットに抗
−ＮＧＦ抗体を毎日注射することによって内因性ＮＧＦ
を除去または封鎖することは、交感神経系の事実上の破
壊に連がる（Ｌｅｖｉ−ＭｏｎｔａｌｃｉｎｉおよびＢ
ｏｏｋｅｒ，１９６０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．４６：３８４−３９１；Ｌｅ
ｖｉ−ＭｏｎｔａｌｃｉｎｉおよびＡｎｇｅｌｅｔｔ
ｉ，１９６６，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．１８：６
１９−６２８）。子宮内抗体注射によって、または経胎
盤的に母体の抗体の受動転移を受けることにより発達の
さらに早期にＮＧＦ抗体に曝すことは、脊髄および背中
線の三叉神経感覚性ニューロンのような神経堤−由来感
覚性ニューロンの実質的な損失をもたらすことが示され
ている（Ｇｏｅｄｅｒｔら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：１５８０
−１５８４；ＧｏｒｉｎおよびＪｏｈｎｓｏｎ，１９７
９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．７６：５３８２−５３８６）。最近まで、ＮＧＦ研
究のほとんどすべては末梢神経系におけるその役割に焦
点が合わされてきた。しかし現在では、ＮＧＦは中枢神
経系におけるニューロンの特定集団の発達および維持に
影響を与えることが明らかになっている（Ｔｈｏｅｎｅ
ｎら，１９８７，Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０９：１４５−１７８；
ＷｈｉｔｔｅｍｏｒｅおよびＳｅｉｇｅｒ，１９８７，
ＢｒａｉｎＲｅｓ．Ｒｅｖ．１２：４３９−４６４）。
【０００５】ＮＧＦほどには性質が明らかになっていな
い神経 栄養因子には、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮ
Ｆ）および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）が包含され
る。
【０００６】（２）毛様体神経栄養因子 毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）はニワトリ胚毛様体神
経節ニューロンのインビトロでの生存の特異的に必要と
されるタンパク質である（Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら、１９
８０，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．３４：６９−７５）。
毛様体神経節は解剖学的には眼窩腔内に位置し、側部と
直筋と視神経鞘の間にある。毛様体神経節は、毛様体筋
および瞳孔括約筋ならびにまた眼の脈絡膜層に存在する
平滑筋をも神経支配する動眼神経からの副交感神経線維
を受け入れる。
【０００７】毛様体神経筋ニューロンは明瞭な細胞死の
期間を示すニューロン集団のひとつであることが判明し
ている。ニワトリ毛様体神経節においては、胚日令８日
（Ｅ８）で存在するニューロンの半分がＥ１４までに死
滅することが観察されている（Ｌａｎｄｍｅｓｓｅｒお
よびＰｉｌａｒ，１９７４，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２４
１：７３７−７４９）。この同時期に、毛様体神経筋ニ
ューロンはその標的組織、すなわち眼の毛様体および脈
絡膜との結合を形成中である。Ｌａｎｄｍｅｓｓｅｒお
よびＰｉｌａｒ（１９７４，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２４
１：７１５−７３６）は、細胞死の期間に先立ち一方の
眼を除去すると、それと同じ側の神経節の毛様体神経節
ニューロンがほとんど失われることを観察した。逆に、
ＮａｒａｙａｎａｎおよびＮａｒａｙａｎａｎ（１９８
７，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．４
４：５３−７０）は、付加的にもう一つ眼の原基を移植
し、それによって利用可能な標的組織を増やすと、毛様
体神経節ニューロンの細胞死を減少させることを観察し
た。これらの結果は、毛様体神経節ニューロンに作用す
る神経栄養因子の存在と符合する。
【０００８】培養において、毛様体神経筋（ＯＧ）ニュ
ーロンが存在のために一つまたはそれ以上の因子を必要
とすることが判明している。毛様体神経栄養因子（ＣＮ
ＴＦ）活性は、ニワトリ筋肉細胞馴化培地（Ｂｅｎｎｅ
ｔｔおよびＮｕｒｃｏｍｅ，１９７９，Ｂｒａｉｎ Ｒ
ｅｓ．１７３：５４３−５４８；ＮｉｓｈｉおよびＢｅ
ｒｇ，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ，２７７：２３２−２３
４；Ｖａｒｏｎら，１９７９，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１
７３：２９−４５）、筋肉抽出物（ＭｃＬｅｎｎａｎお
よびＨｅｎｄｒｙ，１９７８，Ｎｅｕｒｓｃｉ．Ｌｅｔ
ｔ．１０：２６９−２７３；Ｂｏｎｈａｄｙら，１９８
０，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ．１８：１９７−２
０１）、ニワトリ胚抽出物（Ｖａｒｏｎら，１９７９，
Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１７３：２９−４５；Ｔｕｔｔｌ
ｅら、１９８０，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１８３：１６１
−１８０）、および心臓細胞によって馴化された培地
（考察のために、Ａｄｌｅｒら，１９７９，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２０４：１４３４−１４３６およびＢａｒｂｉｎ
ら，１９８４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４３：１４６
８−１４７８も参照）において同定されている。
【０００９】Ａｄｌｅｒら（１９７９，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２０４：１４３４−１４３６）は、ＣＧニューロンの
マイクロウェル培養に基づくアッセイ系を用いて、ＣＧ
ニューロンが神経支配する眼内の標的組織中にＣＮＴＦ
の非常に豊富な供給源が存在することを証明した。１２
日令胚に存在する８０００栄養単位（ＴＵ）のうちで、
２５００ＴＵが眼の組織中に存在することが判明した。
活性は毛様体および脈絡膜を含有する部分に存在し全胚
抽出物中に存在するより比活性がおよそ２０倍高いこと
が明らかとなった。
【００１０】次に、Ｂａｒｂｉｎら（１９８４，Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｃｈｅｍ．４３：１４６８−１４７８）はニワ
トリ胚の眼組織からＣＮＴＦを精製するための方法を報
告した。ＣＮＴＦ活性はラット座骨神経を含むＣＧ以外
の組織とも関連することが見出された（Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓら，１９８４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉ．２１８：４６０−４７０）。Ｍａｎｔｈｏ
ｒｐｅら （１９８６，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３６７：
２８２−２８６）は、ニワトリの眼からＣＮＴＦ活性を
単離するのに用いたと同様の分画操作を用いる、成体ラ
ット座骨神経抽出物からの哺乳動物ＣＮＴＦ活性の精製
について報告した。さらに、ＷａｔｔｅｒｓおよびＨｅ
ｎｄｒｙ（１９８７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４９：
７０５−７１３）は、ヘパリン−アフィニティクロマト
グラフィーを用い非変性性条件下でＣＮＴＦ活性をウシ
心臓組織から約２０，０００倍精製する方法について記
載した。ＣＮＴＦ活性はまた、損傷を受けた脳細胞から
も同定されている（Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら，１９８３，
ＢｒａｉｎＲｅｓ．２６７：４７−５６；Ｎｉｅｔｏ−
Ｓａｍｐｅｄｒｏら，１９８３，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ
ｉ．３：２２１９−２２２９）。
【００１１】Ｃａｒｎｏｗら（１９８５，Ｊ．Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉ．５：１９６５−１９７１）およびＲｕｄｇｅ
ら（１９８７，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．
３２：１０３−１１０）は、電気泳動により分離した細
胞抽出物をニトロセルロース紙にブロットし（ウェスタ
ンブロッティング）、ついでそのニトロセルロースにＣ
Ｇニューロンを接種し、生体染色を用いて生存する細胞
の領域を同定することによってＣＮＴＦ活性を有するタ
ンパク質バンドを同定した後、細胞抽出物からＣＮＴＦ
活性を同定する方法を記載している。このような方法は
粗製抽出物における活性ポリペプチドの見かけの分子量
を測定するために用いられた。この方法を用いて、Ｃａ
ｒｎｏｗら（１９８５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：１
９６５−１９７１）は、成体ラット座骨神経および脳由
来ＣＮＴＦ活性は明らかにニワトリＣＮＴＦ（２０．４
Ｋｄ）とは異なる分子量（２４Ｋｄ）を示すことを観察
した。
【００１２】（３）毛様体神経栄養因子の機能的性質 その活性の分子的性質はあまり充分かは理解されていな
いが、数多くの生物学的作用がＣＮＴＦによると考えら
れている。上記のように、ＣＮＴＦはもともとＥ８ニワ
トリ毛様体神経節（副交感神経系の一部である）のニュ
ーロンの生存を支える活性として記述された。ＣＮＴＦ
活性を含有することが知られている調製物の他の生物学
的性質に関する記載は以下の通りである。
【００１３】Ｓａａｄａｔら（１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．１０８：１８０７−１８１６）は、ラット
座骨神経ＣＮＴＦの最も高度に精製された調製物が培養
中の新生児ラットの上方頚部神経節ニューロンのコリン
作動性分化を誘導することを観察した。また、Ｈｏｆｆ
ｍａｎ（１９８８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５１：１
０９−１１３）は、ニワトリ眼に由来するＣＮＴＦ活性
が網膜単層培養物中におけるコリン−Ｏ−アセチルトラ
ンスフェラーゼ活性レベルを上昇させることを見いだし
た。
【００１４】Ｈｕｇｈｅｒら（１９８８，Ｎａｔｕｒｅ
３３５：７０−７３）は、周産期のラット視神経およ
び脳における二通りに発育する可能性のあるグリア前駆
細胞集団を研究した。この細胞集団は最初に希突起神経
膠細胞を生じ、次に、第二に、２型星状細胞を生じると
考えられる。研究によって、希突起神経膠細胞の分化は
特別な成長因子がまったく存在しない条件下で希突起神
経膠細胞−２型−星状細胞（０−２Ａ）前駆細胞から起
こるが、他方２型星状細胞の分化は明らかに特異的な誘
導タンパク質の存在を必要とすることが示唆されてい
る。Ｈｕｇｈｅｓらは、２型星状細胞を誘導するタンパ
ク質がＣＮＴＦに類似するかまたはこれと同一であるこ
とを観察した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９８９，Ｔｒｅｎ
ｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：８３−８５も参照のこ
と）。
【００１５】ＨｅｙｍａｎｎｓおよびＵｎｓｉｃｋｅｒ
（１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７７５８−７７６２）は、神経芽細
胞腫細胞抽出物の高速遠心上清がニワトリ眼またはラッ
ト座骨神経由来のＣＮＴＦ活性に関連した作用と同様の
効果を生じることを観察した。ＣＮＴＦに類似している
が同一ではない（分子量によれば）タンパク質の存在が
示された。
【００１６】Ｅｂｅｎｄａｌ（１９８７，Ｊ．Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１７：１９−２４）は、様々のラッ
トおよびニワトリ組織でＣＮＴＦ活性を探した。ラット
組織では非常に広い範囲で毛様体ニューロン生存促進活
性が観察されたが、ニワトリでは観察されなかった。ラ
ット肝臓、脾臓Ｔ細胞、および顎下腺細胞が低いＣＧ生
存促進活性と関連していることが判明したが、他方心
臓、脳、および骨格筋組織は、より高い生存促進活性と
結びついていた。調べた組織の中で、最も高いＣＮＴＦ
活性はラット腎臓と関連することが観察された。
【００１７】上記の研究は、多くの組織および細胞抽出
物がＣＮＴＦと同様の性質を有する活性を含有すること
を示しているが（すなわちそれらは組織培養アッセイに
於て、Ｅ８ニワトリ毛様体神経節ニューロンの生存を支
える）、単一の、または同一のタンパク質によってこれ
らの活性が生じると決めてかかることはできない。例え
ば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）群について示されて
いるように、多数の異なるポリペプチドまたはタンパク
質が、単一のバイオアッセイに於て同一の生物学的活性
を有することがある。
【００１８】ニワトリ眼およびラット座骨神経ＣＮＴＦ
のニューロン特異性は、ＮＧＦに応答するニューロン集
団と重なりあっていることが最初に明らかになった。し
かし発達中のニューロン集団におけるＣＮＴＦとＮＧＦ
の役割の研究において、ＣＮＴＦとＮＧＦを区別する著
しい特徴が最も明確になった。ＳｋａｐｅｒおよびＶａ
ｒｏｎ（１９８６，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３８９：３９
−４６）は、胚日令６．５日（Ｅ６．５）からＥ１５ま
でのニワトリ背根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの生存に
必要な要件を調べた。これらのＤＲＧニューロンは、始
めはＮＧＦにのみ応答したが、続いてＣＮＴＦにも同様
に応答性となることが観察され、そしてついには次第に
いずれの因子にも応答しなくなるように見えた。発達に
おける異なる役割に加え、ＣＮＴＦは、分子量、等電
点、ＮＧＦに対する抗体によって不活性されないこと、
およびＣＮＴＦがＣＧニューロンのインビトロ生存を支
持する能力によってもＮＧＦと区別できる（Ｂａｒｂｉ
ｎら，１９８４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４３：１４
６８−１４７８）。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は毛様体神経栄
養因子（ＣＮＴＦ）をコードする核酸配列およびそれか
ら生産されるタンパク質、ペプチドおよび誘導体に関す
る。本発明の種々の実施態様に於て、本発明の核酸配
列、タンパク質およびペプチドをアルツハイマー病やパ
ーキンソン病を含有するがそれらに限定されない種々の
神経学的疾患および障害の治療に使用できる。
【００２０】別の実施態様に於ては、本発明のＣＮＴＦ
核酸配列、タンパク質およびペプチドを、筋萎縮性側索
硬化症（Ｌｏｕ Ｇｅｈｒｉｇ病）を包含するがそれに
限定されない運動ニューロン疾患の治療に使用できる。
本発明の詳細な実施態様に於ては、ベル麻痺に於ける顔
面神経機能の回復にＣＮＴＦを使用することができる。
本発明のさらに詳細な実施態様に於ては、脊髄ニューロ
ンの成長を支えるためにＣＮＴＦを用いることができ、
それによって外傷、梗塞、感染、栄養不全または有毒薬
剤によって引き起こされた脊髄損傷の治療法が提供され
る。
【００２１】さらに、本発明は化学的に純粋なＣＮＴＦ
の新規製法を提供するものである。
【００２２】また本発明は種々の神経学的疾患および障
害の診断および治療に使用できる有効量のＣＮＴＦ遺伝
子産物を含んでなる医薬組成物にも関する。
【００２３】本発明はＣＮＴＦのクローニング、配列決
定および発現に関するものでありそしてヒトＣＮＴＦを
コードする核酸配列を利用してヒトＣＮＴＦを生産する
方法を初めて提供するものである。さらに本発明のＣＮ
ＴＦ核酸配列を用いて種々の種および組織中におけるＣ
ＮＴＦまたはＣＮＴＦ相同分子をコードする核酸配列を
同定することができる。本発明の別の詳細な実施態様に
於ては、ＣＮＴＦ活性を有するペプチドフラグメントを
同定しそしてＣＮＴＦ活性を中和する、ＣＮＴＦペプチ
ドに対する抗体を生産している。
【００２４】
【課題を解決するための手段】本発明は、毛様体神経栄
養因子（ＣＮＴＦ）をコードする核酸配列、または少な
くとも約１０ヌクレオチドを包含するそのサブ配列を含
んでなる組換えＤＮＡ分子に関する。
【００２５】１つの実施形態においては、上記組換えＤ
ＮＡ分子は、毛様体神経栄養因子をコードする核酸配列
またはそのサブ配列が実質的に図１（ｂ）に示されるも
のである。
【００２６】１つの実施形態においては、上記組換えＤ
ＮＡ分子は、毛様体神経栄養因子をコードする核酸配列
またはそのサブ配列が実質的に図１（ｂ）に示されるヌ
クレオチド約７９から約５８１までである。
【００２７】１つの実施形態においては、上記組換えＤ
ＮＡ分子は、毛様体神経栄養因子をコードする核酸配列
またはそのサブ配列が実質的に図８（ａ）に示される通
りであり、そしてヒト核酸配列である。
【００２８】１つの実施形態においては、上記組換えＤ
ＮＡ分子は、毛様体神経栄養因子をコードする核酸配列
またはそのサブ配列が実質的に図８（ａ）に示されるヌ
クレオチド約１２６〜約７２４までであり、そしてヒト
核酸配列である。
【００２９】１つの実施形態においては、上記組換えＤ
ＮＡ分子は、ｃＤＮＡ配列を含んでなる。
【００３０】１つの実施形態においては、上記組換えＤ
ＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡ配列を含んでなる。
【００３１】１つの実施形態においては、上記組換えＤ
ＮＡ分子は、ＡＴＣＣに寄託され、受託番号４０６５６
を有するプラスミドｐＣＭＶ−ｒＣＮＴＦ−Ｃ−１に含
有される。
【００３２】上記組換えＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣに寄託
され、受託番号４０６５７を有するバクテリオファージ
λｈＣＮＴＦ−Ｇ−１に含有される。
【００３３】本発明は、上記組換えＤＮＡ分子に相補的
な組換えリボ核酸分子に関する。
【００３４】本発明は、図１（ｂ）に示されるアミノ酸
配列と実質的に相同のタンパク質をコードする配列また
はその一部分を含んでなる核酸配列に関する。
【００３５】本発明は、図８に示されるヒトアミノ酸配
列と実質的に相同のタンパク質をコードする配列または
その一部分を含んでなる核酸配列に関する。
【００３６】本発明は、図１（ｂ）に示される核酸配列
と実質的に相同の配列、またはそのハイブリッド形成可
能な部分を含んでなる核酸配列に関する。
【００３７】本発明は、図８（ａ）に示される核酸配列
と実質的に相同の配列、またはそのハイブリッド形成可
能な部分を含んでなる核酸配列に関する。
【００３８】１つの実施形態においては、上記組換えＤ
ＮＡ分子は、毛様体神経栄養因子タンパク質またはペプ
チドフラグメントをコードする核酸配列の発現が第二の
核酸配列によって調節され、その結果その組換えＤＮＡ
分子で形質転換された宿主に於て毛様体神経栄養因子タ
ンパク質またはペプチドが発現されるものである。
【００３９】１つの実施形態においては、上記組換えＤ
ＮＡ分子は、ｐＣＭＶ−ｒＣＮＴＦ−Ｃ−１に含有され
る。
【００４０】本発明は、上記ＤＮＡ分子を含んでなる核
酸ベクターに関する。
【００４１】本発明は、上記ＤＮＡ分子を含有する組換
え微生物に関する。
【００４２】１つの実施形態においては、上記組換え微
生物は、細菌である。
【００４３】１つの実施形態においては、上記組換え微
生物は、酵母である。
【００４４】本発明は、上記組換えＤＮＡ分子を含有す
る細胞に関する。
【００４５】本発明は、上記組換えＤＮＡ分子を含有す
る細胞に関する。
【００４６】本発明は、実質的に図１（ｂ）に示される
アミノ酸配列、または抗原決定基を含有するそのサブ配
列をコードする配列を含んでなる核酸配列に関する。
【００４７】本発明は、実質的に図１（ｂ）に示される
アミノ酸配列、または抗原決定基を含有するそのサブ配
列を含んでなる精製タンパク質に関する。
【００４８】本発明は、実質的に図１（ｂ）に示される
アミノ酸配列、または機能的に活性なペプチドを含有す
るそのサブ配列を含んでなる精製タンパク質に関する。
【００４９】本発明は、実質的にＭＶＬＬＥＱＫＩＰＥ
ＮＥＡＤＧＭＰＡＴＶＧＤＧＧＬＦＥＫであるアミノ酸
配列、または機能的に活性なペプチドを含有するそのサ
ブ配列を含んでなる精製タンパク質に関する。
【００５０】本発明は、ヒトアミノ酸配列として実質的
に図８（ａ）に示されるアミノ酸配列、または抗原決定
基を含有するそのサブ配列を含んでなる精製タンパク質
に関する。
【００５１】本発明は、ヒト毛様体神経栄養因子として
実質的に図８（ａ）に示されるアミノ酸配列、または機
能的に活性なペプチドを含有するそのサブ配列を含んで
なる精製タンパク質に関する。
【００５２】本発明は、上記ＤＮＡ分子を含有する組換
え微生物を増殖させてそのＤＮＡ分子をその微生物に発
現させ、そして発現された毛様体神経栄養因子タンパク
質またはフラグメントを単離することを含んでなる、毛
様体神経栄養因子タンパク質またはそのフラグメントを
生産する方法に関する。
【００５３】１つの実施形態においては、上記方法は、
微生物が細菌である。
【００５４】本発明は、（ａ）上記ＤＮＡ分子を含有す
る組換え微生物を、その微生物がそのＤＮＡ分子を発現
するような条件下で増殖させ、そして（ｂ）発現された
毛様体神経栄養因子タンパク質またはフラグメントを単
離することを含んでなる、毛様体神経栄養因子タンパク
質またはそのフラグメントを生産する方法に関する。
【００５５】本発明は、（ａ）上記ＤＮＡ分子を含有す
る組換え宿主を、その宿主がそのＤＮＡ分子を発現する
ような条件下で増殖させ、そして（ｂ）発現された毛様
体神経栄養因子タンパク質またはフラグメントを単離す
ることを含んでなる、毛様体神経栄養因子タンパク質ま
たはそのフラグメントを生産する方法に関する。
【００５６】本発明は、（ａ）上記ＤＮＡ分子を含有す
る組換え宿主を、その宿主がそのＤＮＡ分子を発現する
ような条件下で増殖させ、そして（ｂ）発現された毛様
体神経栄養因子タンパク質またはフラグメントを単離す
ることを含んでなる、毛様体神経栄養因子タンパク質ま
たはそのフラグメントを生産する方法。
【００５７】１つの実施形態においては、上記方法に使
用する宿主は真核生物細胞である。
【００５８】１つの実施形態においては、上記方法に使
用する宿主はヒト以外のトランスジェニック動物であ
る。
【００５９】本発明は、上記方法の産物に関する。
【００６０】本発明は、界面活性剤を含有しない上記産
物に関する。
【００６１】本発明は、グリコシル化されている上記産
物に関する。
【００６２】本発明は、グリコシル化されていない上記
産物に関する。
【００６３】本発明は、製剤上好適な担体中における実
質的に純粋な毛様体神経栄養因子タンパク質の有効量を
含んでなる医薬組成物に関する。
【００６４】本発明は、製剤上好適な担体中における実
質的に純粋で、機能的に活性な毛様体神経栄養因子ペプ
チドフラグメントまたは誘導体の有効量を含んでなる医
薬組成物に関する。
【００６５】本発明は、製剤上好適な担体中における抗
原決定基を担持する実質的に純粋な毛様体神経栄養因子
ペプチドフラグメントまたは誘導体の有効量を含んでな
る医薬組成物に関する。
【００６６】１つの実施形態においては、上記医薬組成
物は、毛様体神経栄養因子ペプチドフラグメントまたは
誘導体が実質的に図１（ｂ）に示されるアミノ酸配列の
少なくとも一部分を含有する。
【００６７】１つの実施形態においては、上記医薬組成
物は、毛様体神経栄養因子ペプチドフラグメントまたは
誘導体が実質的にＭＶＬＬＥＱＫＩＰＥＮＥＡＤＧＭＰ
ＡＴＶＧＤＧＧＬＦＥＫであるアミノ酸配列の少なくと
も一部分を含有する。
【００６８】１つの実施形態においては、上記医薬組成
物は、毛様体神経栄養因子ペプチドフラグメントまたは
誘導体がヒトアミノ酸配列として実質的に図８（ａ）に
示されるアミノ酸配列の一部分を含有する。
【００６９】１つの実施形態においては、上記医薬組成
物は、毛様体神経栄養因子ペプチドフラグメントまたは
誘導体が実質的にＭＩＬＬＥＹＫＩＰＲＮＥＡＤＧＭＰ
ＩＮＶＧＤＧＧＬＦＥＫであるアミノ酸配列の少なくと
も一部分を含有する。
【００７０】１つの実施形態においては、上記医薬組成
物は、毛様体神経栄養因子タンパク質が実質的に図１
（ｂ）に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００７１】１つの実施形態においては、上記医薬組成
物は、毛様体神経栄養因子タンパク質がヒトアミノ酸配
列として実質的に図８（ａ）に示されるアミノ酸配列を
含有する。
【００７２】本発明は、製剤上好適な担体中における上
記産物の有効量を含んでなる医薬組成物に関する。
【００７３】本発明は、ニューロン生存を増大させうる
上記医薬組成物に関する。
【００７４】本発明は、分化した細胞機能を支持し得る
上記医薬組成物に関する。
【００７５】１つの実施形態においては、上記医薬組成
物は、タンパク質、ペプチドまたは誘導体がグリコシル
化されている。
【００７６】１つの実施形態においては、上記医薬組成
物は、タンパク質、ペプチドまたは誘導体がグリコシル
化されていない。
【００７７】本発明は、製薬上好適な担体中における実
質的に純粋な毛様体神経栄養因子タンパク質またはその
ペプチドフラグメントまたは誘導体および第二の薬剤と
の組合せ物の有効量を含んでなる医薬組成物に関する。
【００７８】１つの実施形態においては、上記医薬組成
物は、第二の薬剤が神経成長因子である。
【００７９】１つの実施形態においては、上記医薬組成
物は、第二の薬剤が脳由来神経栄養因子である。
【００８０】１つの実施形態においては、上記医薬組成
物は、第二の薬剤が塩基性線維芽細胞成長因子である。
【００８１】本発明は、（ａ）ハイブリッド形成を起こ
させうる条件下で、実質的に図１（ｂ）に示される少な
くとも１０ヌクレオチドを含有する検出可能に標識され
た核酸分子と組織とを接触させ、そして（ｂ）生じたあ
らゆるハイブリッド形成を検出する、ことを含有する神
経系の疾患または障害の診断法に関する。
【００８２】本発明は、（ａ）ハイブリッド形成を起こ
させうる条件下で、ヒト毛様体神経栄養因子配列として
実質的に図８（ａ）に示される少なくとも１０ヌクレオ
チドを含有する検出可能に標識された核酸分子と組織と
を接触させ、そして（ｂ）生じたあらゆるハイブリッド
形成を検出することを包含する神経系の疾患または障害
の診断法に関する。
【００８３】本発明は、（ａ）ハイブリッド形成を起こ
させうる条件下で、実質的に図１（ｂ）に示される少な
くとも１０ヌクレオチドを含有する検出可能に標識され
た核酸分子と組織から収集したＲＮＡとを接触させ、そ
して（ｂ）生じたあらゆるハイブリッド形成を検出する
ことを包含する神経系の疾患または障害の診断法に関す
る。
【００８４】本発明は、（ａ）ハイブリッド形成を起こ
させうる条件下で、ヒト毛様体神経栄養因子配列として
実質的に図８（ａ）に示される少なくとも１０ヌクレオ
チドを含有する検出可能に標識された核酸分子と組織か
ら収集したＲＮＡとを接触させ、そして（ｂ）生じたあ
らゆるハイブリッド形成を検出することを包含する神経
系の疾患または障害の診断法に関する。
【００８５】本発明は、（ａ）ハイブリッド形成を起こ
させうる条件下で、実質的に図１（ｂ）に示される少な
くとも１０ヌクレオチドを含有する検出可能に標識され
た核酸分子と組織から収集したＲＮＡから生産されるｃ
ＤＮＡとを接触させ、そして（ｂ）生じたあらゆるハイ
ブリッド形成を検出することを包含する神経系の疾患ま
たは障害の診断法に関する。
【００８６】本発明は、（ａ）ハイブリッド形成を起こ
させうる条件下で、ヒト毛様体神経栄養因子配列として
実質的に図８（ａ）に示される少なくとも１０ヌクレオ
チドを含有する検出可能に標識された核酸分子と組織か
ら収集したＲＮＡから生産されるｃＤＮＡとを接触さ
せ、そして（ｂ）生じたあらゆるハイブリッド形成を検
出することを包含する神経系の疾患または障害の診断法
に関する。
【００８７】１つの実施形態においては、上記方法は、
神経系の疾患または障害が腫瘍および変性性疾患からな
る群から選択される。
【００８８】本発明は、毛様体神経栄養因子タンパク質
またはその機能的に活性なペプチドフラグメントまたは
誘導体の有効量を患者に投与することからなる、神経系
の疾患または障害の治療法に関する。
【００８９】１つの実施形態においては、上記方法は、
活性ペプチドフラグメントが実質的にＭＶＬＬＥＱＫＩ
ＰＥＮＥＡＤＧＭＰＡＴＶＧＤＧＧＬＦＥＫであるアミ
ノ酸配列の少なくとも一部分を含有する。
【００９０】１つの実施形態においては、上記方法は、
活性ペプチドフラグメントが実質的にＭＩＬＬＥＹＫＩ
ＰＲＮＥＡＤＧＭＰＩＮＶＧＤＧＧＬＦＥＫであるアミ
ノ酸配列の少なくとも一部分を含有する。
【００９１】１つの実施形態においては、上記方法は、
神経系の疾患または障害が変性性疾患である。
【００９２】１つの実施形態においては、上記方法は、
神経系の疾患または障害が脊髄に関する変性性疾患であ
る。
【００９３】１つの実施形態においては、上記方法は、
神経系の疾患または障害が運動ニューロンに関する変性
性疾患である。
【００９４】１つの実施形態においては、上記方法は、
神経系の疾患または障害がベル麻痺のような顔面神経の
運動ニューロンに関する変性性疾患である。
【００９５】１つの実施形態においては、上記方法は、
神経系の疾患または障害が筋萎縮性側索硬化症、原発性
側索硬化症、進行性延髄麻痺、脊髄筋萎縮症およびポリ
オ後症候群からなる群から選択される運動ニューロン疾
患または変性である。
【００９６】１つの実施形態においては、上記方法は、
変性性疾患が末梢神経障害、パーキンソン病およびハン
チントン舞踏病からなる群から選択される。
【００９７】１つの実施形態においては、上記方法は、
神経系の疾患または障害が神経系への損傷からなる。
【００９８】１つの実施形態においては、上記方法は、
損傷が、外傷、手術、梗塞、感染および悪性腫瘍からな
る群から選択される事象によって引き起こされる。
【００９９】１つの実施形態においては、上記方法は、
神経系の疾患または障害が有毒薬剤への露出によって引
き起こされる。
【０１００】１つの実施形態においては、上記方法は、
神経系の疾患または障害が栄養不全によって引き起こさ
れる。
【０１０１】１つの実施形態においては、上記方法は、
神経系の疾患または障害が脊髄に関するものである。
【０１０２】１つの実施形態においては、上記方法は、
神経系の疾患または障害がコリン作動性ニューロンに関
するものである。
【０１０３】本発明は、毛様体神経栄養因子タンパク質
またはその機能的に活性なペプチドフラグメントまたは
誘導体と第二の薬剤との組み合わせ物の有効量を投与す
ることからなる、神経系の疾患または障害の治療法に関
する。
【０１０４】１つの実施形態においては、上記方法は、
第二の薬剤が神経成長因子である。
【０１０５】１つの実施形態においては、上記方法は、
第二の薬剤が脳由来神経栄養因子である。
【０１０６】１つの実施形態においては、上記方法は、
神経系の疾患または障害が変性性疾患である。
【０１０７】１つの実施形態においては、上記方法は、
変性性疾患が運動ニューロン病、アルツハイマー病およ
びハンチントン舞踏病からなる群から選択される。
【０１０８】１つの実施形態においては、上記方法は、
神経系の疾患または障害が神経系への損傷からなる。
【０１０９】１つの実施形態においては、上記方法は、
障害が外傷、手術、梗塞、感染および悪性腫瘍からなる
群から選択される事象によって引き起こされる損傷であ
る。
【０１１０】本発明は、（ａ）毛様体神経栄養因子を含
有することが知られているかまたは推定される組織の抽
出物を調製し、（ｂ）イオン交換クロマトグラフィーに
よって毛様体神経栄養因子活性を分画し、（ｃ）調製用
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動から毛様体神
経栄養因子活性を収集し、（ｄ）生物学的に不活性な逆
相ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣカラムを用いて毛様体神経栄
養因子を精製し、そして（ｅ）不活性雰囲気下で毛様体
神経栄養因子を濃縮する、ことを包含する、実質的に純
粋な毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を単離する方法に
関する。
【０１１１】１つの実施形態においては、上記方法は、
組織がニワトリ胚眼組織である。
【０１１２】１つの実施形態においては、上記方法は、
組織が座骨神経である。
【０１１３】１つの実施形態においては、上記方法は、
不活性逆相ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣカラムを不活性金属
で内張りする。
【０１１４】１つの実施形態においては、上記方法は、
不活性金属が金である。
【０１１５】１つの実施形態においては、上記方法は、
不活性逆相カラムがＢａｋｅｒｂｏｎｄ Ｇｏｌｄ Ｃ
４ Ｗｉｄｅ ｐｏｅｒカラムである。
【０１１６】１つの実施形態においては、上記方法は、
毛様体神経栄養因子をアルゴン雰囲気下で濃縮する。
【０１１７】本発明は、毛様体神経栄養因子を含有する
ことが知られているかまたは推定される組織の抽出物を
調製し、イオン交換クロマトグラフィーによって毛様体
神経栄養因子活性を分画し、そして調製用ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動から毛様体神経栄養因子活
性を収集することを包含する毛様体神経栄養因子の精製
方法において、生物 学的に不活性なＨＰＬＣまたはＦ
ＰＬＣカラムを用いるクロマトグラフィーによって毛様
体神経栄養因子をさらに精製することを包含する方法に
関する。
【０１１８】本発明は、毛様体神経栄養因子を含有する
ことが知られているかまたは推定される組織の抽出物を
調製し、イオン交換クロマトグラフィーによって毛様体
神経栄養因子活性を分画し、そして調製用ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動から毛様体神経栄養因子活
性を収集することを包含する毛様体神経栄養因子の精製
方法において、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ Ｇｏｌｄ Ｃ４
Ｗｉｄｅｐｏｒｅカラムを用いるクロマトグラフィーに
よって毛様体神経栄養因子をさらに精製することを包含
する方法に関する。
【０１１９】本発明は、ＮＲＲＬに寄託され、受託番号
Ｂ−１８７００を有する組換えベクターｐＲＰＮ３８、
またはその機能的に等価なベクターに関する。
【０１２０】本発明は、ＮＲＲＬに寄託され、受託番号
Ｂ−１８７０１を有する組換えベクターｐＲＰＮ４０、
またはその機能的に等価なベクターに関する。
【０１２１】本発明は、海馬細胞を有効濃度のＣＮＴＦ
に暴露することを含んでなる、海馬細胞中のＧＡＢＡと
り込みを増大させる方法に関する。
【０１２２】本発明は、海馬細胞を有効濃度のＣＮＴＦ
に暴露することを含んでなる、海馬細胞中のニューロフ
ィラメントタンパク質の発現を増大させる方法に関す
る。
【０１２３】本発明は、海馬細胞を有効濃度のＣＮＴＦ
に暴露することを含んでなる、海馬細胞の生存を増大さ
せる方法に関する。
【０１２４】本発明は、海馬星状細胞を有効濃度のＣＮ
ＴＦに暴露することを含んでなる、海馬星状細胞の生存
を増大させる方法に関する。
【０１２５】本発明は、運動ニューロンを有効濃度のＣ
ＮＴＦに暴露することを含んでなる、運動ニューロンの
生存を増大させる方法に関する。
【０１２６】本発明は、腹側脊髄ニューロンを有効濃度
のＣＮＴＦに暴露することを含んでなる、腹側脊髄ニュ
ーロンの生存を増大させる方法に関する。
【０１２７】本発明は、腹側脊髄ニューロンを有効濃度
のＣＮＴＦに暴露することを含んでなる、腹側脊髄ニュ
ーロンのコリンアセチルトランスフェラーゼの発現を促
進する方法に関する。
【０１２８】本発明は、アルツハイマー病の治療の必要
な患者に有効量のＣＮＴＦを投与することを含んでな
る、アルツハイマー病の治療法に関する。
【０１２９】本発明は、筋萎縮性側索硬化症の治療の必
要な患者に有効量のＣＮＴＦを投与することを含んでな
る筋萎縮性側索硬化症の治療法に関する。
【０１３０】本発明は、（ｉ）第一の抗−ＣＮＴＦ抗体
を固形支持体に結合させ、（ｉｉ）工程（ｉ）の固定化
第一抗体を、第一抗体へのＣＮＴＦの結合を可能にする
条件下で、ＣＮＴＦを含有する溶液に暴露させ、（ｉｉ
ｉ）第一の抗−ＣＮＴＦ抗体に結合されたＣＮＴＦを、
ＣＮＴＦへの第二の抗−ＣＮＴＦ抗体の結合を可能にす
る条件下で第二の抗−ＣＮＴＦ抗体に暴露させ、そして
（ｉｖ）ＣＮＴＦへの第二の抗−ＣＮＴＦ抗体の結合を
検出する、ことを包含し、該第一の抗体がＡＴＣＣに寄
託され、受託番号ＣＲＬ１０５３１を有するモノクロー
ナル抗体ＲＰ３−１２である、試料中のＣＮＴＦ量の測
定法に関する。
【０１３１】本発明は、（ｉ）第一の抗−ＣＮＴＦ抗体
を固形支持体に結合させ、（ｉｉ）工程（ｉ）の固定化
第一抗体を、第一抗体へのＣＮＴＦの結合を可能にする
条件下で、ＣＮＴＦを含有する溶液に暴露させ、（ｉｉ
ｉ）第一の抗−ＣＮＴＦ抗体に結合されたＣＮＴＦを、
ＣＮＴＦへの第二の抗−ＣＮＴＦ抗体の結合を可能にす
る条件下で第二の抗−ＣＮＴＦ抗体に暴露させ、そして
（ｉｖ）ＣＮＴＦへの第二の抗−ＣＮＴＦ抗体の結合を
検出する、ことを包含し、該第一抗体がＡＴＣＣに寄託
され、受託番号ＨＢ−１０５３２を有するモノクローナ
ル抗体ＲＰ１２−２である、試料中のＣＮＴＦ量の測定
法に関する。
【０１３２】本発明は、（ｉ）第一の抗−ＣＮＴＦ抗体
を固形支持体に結合させ、（ｉｉ）工程（ｉ）の固定化
第一抗体を、第一抗体へのＣＮＴＦの結合を可能にする
条件下で、ＣＮＴＦを含有する溶液に暴露させ、（ｉｉ
ｉ）第一の抗−ＣＮＴＦ抗体に結合されたＣＮＴＦを、
ＣＮＴＦへの第二の抗−ＣＮＴＦ抗体の結合を可能にす
る条件下で第二の抗−ＣＮＴＦ抗体に暴露させ、そして
（ｉｖ）ＣＮＴＦへの第二の抗−ＣＮＴＦ抗体の結合を
検出する、ことを包含し、該第二抗体がＡＴＣＣに寄託
され、受託番号ＣＲＬ１０５３１を有するモノクローナ
ル抗体ＲＰ３−１２である、試料中のＣＮＴＦ量の測定
法に関する。
【０１３３】本発明は、（ｉ）第一の抗−ＣＮＴＦ抗体
を固形支持体に結合させ、（ｉｉ）工程（ｉ）の固定化
第一抗体を、第一抗体へ のＣＮＴＦの結合を可能にす
る条件下で、ＣＮＴＦを含有する溶液に暴露させ、（ｉ
ｉｉ）第一の抗−ＣＮＴＦ抗体に結合されたＣＮＴＦ
を、ＣＮＴＦへの第二の抗−ＣＮＴＦ抗体の結合を可能
にする条件下で第二の抗−ＣＮＴＦ抗体に暴露させ、そ
して（ｉｖ）ＣＮＴＦへの第二の抗−ＣＮＴＦ抗体の結
合を検出する、ことを包含し、該第二抗体がＡＴＣＣに
寄託され、受託番号ＨＢ−１０５３２を有するモノクロ
ーナル抗体ＲＰ１２−２である、試料中のＣＮＴＦ量の
測定法に関する。
【０１３４】本発明は、（ｉ）第一の抗−ＣＮＴＦ抗体
を固形支持体に結合させ、（ｉｉ）工程（ｉ）の固定化
第一抗体を、第一抗体へ のＣＮＴＦの結合を可能にす
る条件下で、ＣＮＴＦを含有する溶液に暴露させ、（ｉ
ｉｉ）第一の抗−ＣＮＴＦ抗体に結合されたＣＮＴＦ
を、ＣＮＴＦへの第二の抗−ＣＮＴＦ抗体の結合を可能
に する条件下で第二の抗−ＣＮＴＦ抗体に暴露させ、
そして（ｉｖ）ＣＮＴＦへの第二の抗−ＣＮＴＦ抗体の
結合を検出する、ことを包含し、該第一抗体がＲＲ３−
１２であり、そして該第二抗体がＲＰ１２−２であり、
夫々がＡＴＣＣに寄託され、夫々受託番号ＣＲＬ１０５
３１およびＨＢ−１０５３２を有する、試料中のＣＮＴ
Ｆ量の測定法に関する。
【０１３５】本発明は、（ｉ）第一の抗−ＣＮＴＦ抗体
を固形支持体に結合させ、（ｉｉ）工程（ｉ）の固定化
第一抗体を、第一抗体へのＣＮＴＦの結合を可能にする
条件下で、ＣＮＴＦを含有する溶液に暴露させ、（ｉｉ
ｉ）第一の抗−ＣＮＴＦ抗体に結合されたＣＮＴＦを、
ＣＮＴＦへの第二の抗−ＣＮＴＦ抗体の結合を可能にす
る条件下で第二の抗−ＣＮＴＦ抗体に暴露させ、そして
（ｉｖ）ＣＮＴＦへの第二の抗−ＣＮＴＦ抗体の結合
を検出する、ことを包含し、該第一抗体がＲＰ１２−２
であり、そして該第二抗体がＲＰ３−１２であり、夫々
がＡＴＣＣに寄託され、夫々、受託番号ＨＢ−１０５３
２およびＣＲＬ１０５３１を有する、試料中のＣＮＴＦ
量の測定法に関する。
【０１３６】本発明は、ＡＴＣＣに寄託され、受託番号
ＣＲＬ１０５３１を有するハイブリドーマＲＰ３−１２
により生産されたモノクローナル抗体ＲＰ３−１２、ま
たはそのフラグメントまたは誘導体に関する。
【０１３７】本発明は、ＡＴＣＣに寄託され、受託番号
ＨＢ−１０５３２を有するハイブリドーマＲＰ１２−２
により生産されたモノクローナル抗体ＲＰ１２−２、ま
たはそのフラグメントまたは誘導体に関する。
【０１３８】本発明は、上記モノクローナル抗体の結合
を競合的に阻害するモノクローナル抗体、またはそのフ
ラグメントまたは誘導体に関する。
【０１３９】１つの実施形態においては、上記方法は、
顔面神経の運動ニューロンに関わる変性性疾患がベル麻
痺である。
【０１４０】１つの実施形態においては、上記方法は、
運動ニューロンを有効濃度の塩基性繊維芽細胞成長因子
に暴露することを更に含有する。
【０１４１】１つの実施形態においては、上記方法は、
運動ニューロンを有効濃度の塩基性繊維芽細胞成長因子
に暴露することを更に包含する。
【０１４２】
【発明の実施の形態】
（略号） ＢＲＣＮ 臭化シアン ＣＧ 毛様体神経節 ＣＮＴＦ 毛様体神経栄養因子 ＤＲＧ 脊根神経節 Ｅ８， Ｅ９など 胚日令８日、９日など ＧＦＡＰ グリア原線維酸性タンパク質 ＮＧＦ 神経成長因子 ＴＵ 栄養単位。１ｍｌ当り栄養単位１は、培地１ｍｌ
当り最大ニューロン生存の半分を支持するＣＮＴＦ活性
量に等しい。
【０１４３】図面について説明する。
【０１４４】図１は、ラットＣＮＴＦのｃＤＮＡクロー
ニング（ａ）、ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列
（ｂ）を示す。プライマーとして用いたオリゴヌクレオ
チドを（ｃ）に、またそれらの対応する位置を（ｂ）に
示す。（ｂ）の下線を付したアミノ酸はＣＮＴＦのトリ
プシンフラグメント（Ｔ１−Ｔ８）およびＢＲＣＮフラ
グメント（ＣＢ１−４）に対応するペプチド配列であ
る。ヌクレオチドレベルでは、コード領域に対応する配
列を肉太活字とし、ポリアデニル化シグナル配列に下線
を付す。ＣＮＴＦのアミノ酸組成は精製ＣＮＴＦから得
られ、そしてＣＮＴＦ ｃＤＮＡから推定された
（ｄ）。
【０１４５】図２は、以下の二通りの精製法を用いて得
られたＣＮＴＦの二次元ゲル電気泳動、すなわち（ａ）
ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーおよび調製用Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動；および（ｂ）
ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、調製用ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびＢａｋｅｒ
ｂｏｎｄＧｏｌｄ Ｃ４ Ｗｉｄｅｐｏｒｅカラムを用
いるクロマトグラフィーによるさらなる精製を示す。
【０１４６】図３は、トランスフェクションされたＨｅ
Ｌａ細胞の上清および抽出物の存在下における培養Ｅ８
ニワトリ毛様体ニューロンの生存を示す。胚日令８日の
毛様体ニューロンを、挿入物を含有しないプラスミド
（△）、およびセンス（○）およびアンチセンス（■）
方向にラットＣＮＴＦ ｃＤＮＡクローン７を含有する
プラスミドでトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の
上清（ａ）および抽出（ｂ）存在下で成長させた。
【０１４７】図４は、（ａ）成体ラット組織（使用した
略号は：ＢＲ、脳；ＬＩＶ、肝臓；ＫＩＤ、腎臓；Ｍ
Ｃ、筋肉；ＳＫ、皮膚；ＳＣＩ、座骨神経；ＳＰ、脊
髄）中のＣＮＴＦ−ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を
示す。（ｂ）ＲＮＡは新生（ＰＯ）、４日令（Ｐ４）、
および１３日令の子ラットの座骨神経から得た。
【０１４８】図５は、３種の異なるエシェリヒア・コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）株における組換えｒＣＮＴＦを示す。
レーンＭは標準タンパク質マーカーであり、３種のタン
パク質の分子量を示す。レーン１−３は、それぞれｐＣ
Ｐ−ｒＣＮＴＦ−Ｃ−１の宿主であるエシェリヒア・コ
リＷ３１１０ｑＦ−、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、
およびエシェリヒア・コリＭＣ１０６１から抽出された
全タンパク質である。抽出物を調製しそして既に（Ｐａ
ｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ．およびＦｏｎｔａｉｎｅ，
Ａ．，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３
１７３−３１７７）記載のようにして８−２５％ポリア
クリルアミド濃度勾配ゲル上で分析した。
【０１４９】図６は、ａ）ヒトおよびラットゲノムＤＮ
ＡのＥｃｏＲＩ消化物に対するサザンブロットハイブリ
ッド形成におけるＰＣＲ生成ヒトＣＮＴＦプローブ、な
らびに、ｂ）ヒトおよびラットゲノムＤＮＡのＥｃｏＲ
Ｉ消化物に対するサザンブロットハイブリッド形成に於
ける放射性ラットＣＮＴＦプローブを示す。
【０１５０】図７は、ＰＣＲによって増幅されたヒトゲ
ノムＤＮＡ由来ＣＮＴＦコード配列の一部を既知ラット
ＣＮＴＦコード配列との比較を示す。推定アミノ酸配列
におけるヒトとラットの相違を星印（＊）で示す。ＤＮ
Ａ配列の相違をノットイコール信号（≠）で示す。
【０１５１】図８は、ヒトＣＮＴＦの配列。（ａ）ヒト
核酸およびアミノ酸配列；（ｂ）ヒトおよびラットアミ
ノ酸配列の比較；（ｃ）ヒトおよびラットヌクレオチド
配列の比較；および（ｄ）ヒトゲノムＣＮＴＦ配列の完
全な制限地図を示す。
【０１５２】図９は、ＣＮＴＦ配列（Ｃ−末端領域）に
基づく合成ペプチド（１４アミノ酸−ＩＳＡＬＥＳＨＹ
ＧＡＫＤＫＱ）に対する抗体が免疫沈澱後の精製ラット
ＣＮＴＦの生物学的活性を阻害しうることを示す。
【０１５３】図１０は、２８アミノ酸合成ＣＮＴＦペプ
チドフラグメントの神経栄養活性を示す。
【０１５４】図１１は、固定されたラット座骨神経切片
に結合され次にローダミン標識抗−ウサギＩｇＧと反応
した、２８アミノ酸ＣＮＴＦ生物活性ペプチドに対する
ウサギ抗体を用いた間接的な免疫蛍光反応研究を示す。
大きな矢印は軸索周囲の染色を示し、小さい矢印は標識
された軸索小胞を指す。
【０１５５】図１２は、Ａ．対照培地；Ｂ．マウス神経
成長因子（ＮＧＦ）を添加した培地；Ｃ．エシェリヒア
・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に生産された組換えラット毛
様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を添加した培地の存在下
で、ポリオルニチン基質上７２時間成長させたＥ１４ラ
ット背中央脊髄細胞の解離培養物の位相差顕微鏡写真を
示す。ＣＮＴＦ存在下における広範なニューロン生存と
神経突起の伸びに注目すべきである。目盛りバー＝１０
０μｍ。
【０１５６】図１３は、片側性顔面神経損傷を有する新
生ラットの顔面神経核に於ける運動ニューロンおよびグ
リア細胞変化を示す。ＢＳＡ含有ゲルフォームインプラ
ントを担持する片側性神経損傷。（Ａ）損傷側の顔面神
経核におけるニッスル染色した運動ニューロン；（Ｂ）
損傷のない側の顔面神経核におけるニッスル染色した運
動ニューロン（対照）；（Ｃ）抗−ＧＦＡＰ抗体で染色
した損傷側の顔面神経核；および（Ｄ）抗−ＧＦＡＰ抗
体で染色した損傷のない側の顔面神経核。
【０１５７】図１４は、片側性顔面神経損傷を有する新
生ラットの顔面神経核に於ける運動ニューロンおよびグ
リア細胞の変化を示す。ＣＮＴＦ含有ゲルフォームイン
プラントを担持する片側性神経損傷。（Ａ）損傷側の顔
面神経核におけるニッスル染色した運動ニューロン；
（Ｂ）損傷のない側の顔面神経核におけるニッスル染色
した運動ニューロン（対照）；（Ｃ）抗−ＧＦＡＰ抗体
で染色した損傷側の顔面神経核；および（Ｄ）抗−ＧＦ
ＡＰ抗体で染色した損傷のない側の顔面神経核。
【０１５８】図１５は、コンピユーターで作成した
（ａ）ラットおよび（ｂ）ヒトＣＮＴＦの親水性、表面
確率、可撓性、抗原指数、両親媒性らせん、両親媒性シ
ートおよび二次構造のプロットを示す。
【０１５９】図１６は、発現プラスミドの主な特徴を示
す。プロモーター（ｌａｃ ＵＶ５）、リボソーム結合
部位（ｒｂｓ１）、ＣＮＴＦ、ａｍｐＲおよびｋａｎＲ
遺伝子、ならびにｃｏｐ１（Ｏ）およびｋａｎ１（Ｏ）
突然変異を示す。本文中に記載されるように、制限部位
ＡｓｅＩ、ＥａｇＩ、ＮｄｅＩおよびＰｖｕＩがプラス
ミドの作製に用いられた。
【０１６０】図１７は、ヒトＣＮＴＦの配列およびクロ
ーニングに用いられたＰＣＲプライマーを示す。タンパ
ク質コード領域のＤＮＡ配列を上の推定タンパク質配列
と共に太く示す。黒い矢印はエキソン１の最後のヌクレ
オチドおよびエキソン２の最初のヌクレオチドを示す。
５’−および３’−末端イントロン配列を矢印の上にカ
ッコで示す。選択されたオリゴデオキシヌクレオチド、
プライマーの位置および５’から３’への対比は矢印で
示す。プライマーのオリゴデオキシヌクレオチド配列
（５’→３’）は以下のとおりである。 ＣＮＴＦ．２３：ＧＣＴＴＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＴＴＣ
ＡＣＣＧ； ＣＮＴＦ．２１：ＡＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＣＴＴＣＡＣ
ＡＴＡＧＧＡＴＴＣＣＧＴＡＡＧＡＧ； ＣＮＴＦ．２２：ＣＴＣＴＴＡＣＧＧＡＡＴＣＣＴＡＴ
ＧＴＧＡＡＧＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴ； ＣＮＴＦ．２４：ＧＡＧＡＣＧＧＣＣＧＴＡＡＣＴＧＴ
ＴＡＣＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧＴＴＡＧ； ＣＮＴＦ．１０：ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣ
ＧＣＡＧＧＣＡＴＣＣＣＡＴＣＡＧＣＣＴ； ＣＮＴＦ．１１：ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ
ＧＡＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＧＣＡＧＡ。
【０１６１】図１８は、種々のベクターを用いるヒトお
よびラットＣＮＴＦ発現の比較を示す。指示される株か
らの総タンパク質を８−２５％ポリアクリルアミドゲル
で分析しそしてクーマシーブルーで染色した。マーカー
の分子量（１００単位）（Ｍ）ならびにヒトＣＮＴＦ、
ラットＣＮＴＦ、ａｍｐＲおよびｋａｎＲタンパク質に
相当するバンドの位置を示す。
【０１６２】図１９は、ＣＮＴＦの精製を示す。
（Ａ）：ラットＣＮＴＦ、（Ｂ）：ヒトＣＮＴＦ。溶解
物：総細胞タンパク質；８Ｍ ＧｕＨＣ１；透析した抽
出物；０．５、５、１０および５０：ＤＥＡＥ−セファ
セルまたはＦａｓｔ−Ｓ後に各レーンに負荷されたタン
パク質μｇ量。
【０１６３】図２０は、天然のおよび組み換えラットＣ
ＮＴＦに対する毛様体ニューロンの用量応答を示す。漸
増量のラットＣＮＴＦの存在下における解離Ｅ８ニワト
リ毛様体ニューロンの生存を第１２．７節記載のように
して測定した。
【０１６４】図２１は、Ｅ１０ニワトリ胚背根神経節
（ＤＲＧ）の外植培養物およびＥ８ニワトリ胚毛様体神
経節（ＣＧ）の解離ニューロン富化培養物（Ｃ，Ｄ，
Ｅ）の顕微鏡写真を示す。ＡＢは培養４８時間後のＤＲ
Ｇの対照（Ａ）およびＣＮＴＦ処理（Ｂ：５ｎｇ／ｍ
ｌ）外植片の暗視野顕微鏡写真。Ｃ，Ｄ，Ｅは毛様体神
経節ニューロンの対照（Ｃ）およびＣＮＴＦ処理（Ｄ．
１００ｐｇ／ｍｌ；Ｅ．５ｎｇ／ｍｌ）された解離培養
物の位相差顕微鏡写真。目盛りバー＝４００μｍ（Ａ，
Ｂ）および５０μｍ（Ｃ，Ｄ，Ｅ）。
【０１６５】図２２は、ＣＮＴＦタンパク質の整列させ
た配列を示す。ヒト（ｈｕ）、ラット（ｒｔ）およびウ
サギ（ｒｂ）ＣＮＴＦのアミノ酸配列を示す。これら分
子それぞれをコードする発現ベクターを右側に示す。
（Ａ）図において、ドットは野性型ヒトＣＮＴＦ配列と
同じ残基を示す。（Ｂ）図ではドットは同じ種からの野
性型配列と同一の残基を示す。野性型と異なる残基は大
文字で示す。外来ペプチドの一部分として融合した余分
の残基を小さいイタリックで示す。
【０１６６】図２３は、培養６日後の腹側脊髄細胞の位
相顕微鏡写真を示す。細胞を０．５×１０6／３５ｍｍ
培養皿、で塗布してＦ１２ＭＥＭＨＳ5ＦＣＳ5２０Ｘ中
で維持した。
【０１６７】図２４は、腹側脊髄ニューロン培養物中の
ニューロフィラメント（ＮＦ）を示す。培養物を塗布当
日にＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＮＧＦ（５０ｎ
ｇ／ｍｌ）で処理し、そして第７日目にＮＦレベルをア
ッセイした。ＮＦタンパク質をＮＦ−抗体（ＲＴ９７）
で検出し、反応生成物は基質として０ＰＤを用いて可視
化し、そして０Ｄ（平均±ＳＥＭ）を４９０ｎｍで測定
した（ｎ＝３）。
【０１６８】図２５は、ＡｃｈＥ含有ニューロンの生存
に及ぼすＣＮＴＦの作用。腹側脊髄ニューロンを７日間
培養液中で成長させ、次にＡｃｈＥ組織化学的処理を行
った。染色された細胞を３２Ｘの下に計測して３５ｍｍ
皿当りの総数として表わした（ｎ＝３）。
【０１６９】図２６は、Ａ：腹側脊髄培養物中のＣＡＴ
活性に及ぼす成長因子の作用を示す。培養物を塗布当日
ＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍ
ｌ）、ＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＰＢＳ／ＢＳＡ
（０．５ｍｇ／ｍｌ）で処理した。次にこれらを第７日
目に収穫してＣＡＴレベルについてアッセイした。ＣＡ
ＴはＣＰＭ／３５ｍｍ皿、で表わす（平均±ＳＥＭ）。
ｎ＝３。Ｂ：ＣＡＴ活性に及ぼす漸増量のＣＮＴＦの作
用。腹側角細胞を塗布当日に種々の量のＣＮＴＦ（ｎｇ
／ｍｌ）で処理した。７日目に培養物を収穫してＣＡＴ
活性を測定した（ｐモル／時間／３５ｍｍ皿、で表わ
す。平均±ＳＥＭ）。１用量当りｎ＝３。
【０１７０】図２７は、遅らせて添加した場合のＣＡＴ
活性に及ぼすＣＮＴＦの作用を示す。ＣＮＴＦ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）は第０，２または６日目のいずれかで培養物
に加えそしてそれぞれ第７，９および１３日目に収穫し
てＣＡＴ活性を測定した。ＣＡＴはＣＰＭ／μｇタンパ
ク質３３／ｍｍ皿で表わす（平均±ＳＥＭ）。ｎ＝３。
【０１７１】図２８は、グリア細胞を低下させた腹側脊
髄培養物中におけるＣＡＴ活性に及ぼすＣＮＴＦ（１０
ｎｇ／ｍｌ）の作用を示す。ＡｒａＣ（０．５μＭ）を
第２日目に培養物に加えた。７日目に細胞を収穫してＣ
ＡＴ活性をアッセイした（ＣＰＭ／３５ｍｍ皿で表わ
す；平均±ＳＥＭ）。ｎ＝３。
【０１７２】図２９は、メトリザミド（ｍｅｔｒｉｚａ
ｍｉｄｅ）グラジェント精製腹側脊髄ニューロンにおけ
るＣＡＴ活性に及ぼすＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およ
びＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の作用を示す。ＣＡＴ（平
均±ＳＥＭ）はｐモル／時間／１６ｍｍウェル、で表わ
す。ｎ＝３。
【０１７３】図３０は、ＣＮＴＦ処理された海馬培養物
における高フィニティＧＡＢＡとり込み増大の時間的経
過を示す。海馬ニューロンを培養物に付しそしてＣＮＴ
Ｆ（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下または非存在下に種々の期
間維持し、次にＧＡＢＡとり込み（Ａ）およびニューロ
フィラメントタンパク質レベル（Ｂ）を測定した。これ
らの結果は未処理対照培養物に比較した処理された培養
物の活性％を示す。
【０１７４】図３１は、ＣＮＴＦに対する海馬ニューロ
ンの用量応答曲線を示す。海馬ニューロンを種々の濃度
のＣＮＴＦ（０．００１〜１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下ま
たは非存在下に８日間培養した。培養期間の終りに、高
アフィニティＧＡＢＡとり込み（Ａ）、ニューロフィラ
メントタンパク質レベル（Ｂ）、およびＧＡＤ酵素活性
（Ｃ）を測定した。
【０１７５】図３２は、ＮＳＥ−、ＧＡＤ−およびカル
ビンディン（ｃａｌｂｉｎｄｉｎ）−陽性細胞の数に及
ぼすＣＮＴＦの作用を示す。海馬ニューロンをＣＮＴＦ
（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または 非存在下に８日間
培養した。ＡおよびＢに示されるようにＮＳＥ、ＧＡＤ
およびカルビンディンに関する免疫染色を行った。
【０１７６】図３３は、ＧＡＢＡ−およびＡｃｈＥ−免
疫陽性ニューロンの数に及ぼすＣＮＴＦの用量依存性応
答を示す。海馬ニューロンを種々の濃度のＣＮＴＦ
（０．００１〜１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下に培養した。
ＡおよびＢに示されるように、ＧＡＢＡおよびＡｃｈＥ
に関する免疫染色を行った。
【０１７７】図３４は、ＣＮＴＦにより誘導された、高
アフィニテイＧＡＢＡとり込み増大に及ぼすＣＮＴＦ遅
延添加の作用を示す。Ａ：海馬細胞の培養開始後０，
１，２，３，または４日遅らせてＣＮＴＦ（１０ｎｇ／
ｍｌ）を加えた。培養第８日目に高アフィニテイＧＡＢ
Ａとり込みを測定した。Ｂ：０または３日遅延してＣＮ
ＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を海馬細胞に加え、そして培養
１１日目に高アフィニテイＧＡＢＡとり込みを測定し
た。
【０１７８】図３５は、ＣＮＴＦにより誘導された、ニ
ューロフィラメントタンパク質レベルの増大に及ぼすＣ
ＮＴＦの添加遅延の作用を示す。Ａ：海馬細胞を培養開
始後種々の時点（０，１，２，または３日目）にＣＮＴ
Ｆ（１０ｎｇ ／ｍｌ）を加えた。第８日目にニューロ
フィラメントタンパク質レベルを測定した。Ｂ：０また
は３日遅延して海馬細胞にＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）
を加え、そして第１１日目にニューロフィラメントタン
パク質レベルを測定した。
【０１７９】図３６は、ニューロン富化培養物における
ＣＮＴＦの作用を示す。海馬培養物を種々の濃度のＣＮ
ＴＦ（０．００１〜１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非
存在下に８日間維持した。グリア細胞を減少させるため
にシトシンアラビノシド（０．３μＭ）を海馬培養物に
２４時間添加した。培養第８日目に高アフィニティＧＡ
ＢＡとり込みを測定した。
【０１８０】図３７は、ＧＡＢＡとり込みおよびニュー
ロフィラメントタンパク質レベルの、ＣＮＴＦにより誘
導された増大の密度依存性を示す。海馬細胞を密度７
１，４００／ｃｍ２で塗布した。細胞をＣＮＴＦ（１０
ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下に８日間維持し、
次にＧＡＢＡとり込み（Ａ）およびニューロフィラメン
トタンパク質レベル（Ｂ）を測定した。
【０１８１】図３８は、海馬培養物におけるグリタメー
ト誘導毒性に及ぼすＣＮＴＦの保護作用を示す。海馬ニ
ューロンをＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または
非存在下に７日間培養した。グルタメートを種々の濃度
（１００−１０００μＭ）で１５分間添加し、次に細胞
をグルタメートまたはＣＮＴＦの非存在下に２０時間培
養した。培養期間の終りに細胞の生存を、生存細胞によ
るＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イ
ル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）
の紫色生成物への変換に基づくＭＴＴアッセイにより評
価した。ＭＴＴ染料は最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌまで加
えた。生存細胞によりとり込まれた染料を５時間後イソ
プロパノール中の０．０８Ｎ ＨＣｌの添加により可溶
化させ、そしてＯ．Ｄ．（５７０−６５０ｎｍ）を測定
した。
【０１８２】図３９は、ラット海馬星状細胞分裂指数に
及ぼす漸増濃度のラットＣＮＴＦの作用を示す。星状細
胞を指示される濃度のＣＮＴＦに２４時間露出させ、イ
ンキュベーションの最後の２時間は３Ｈ−チミジン（１
ｍｃ／ウェル／１５０μｌ）で標識した。
【０１８３】図４０は、ＣＮＴＦに関する二抗体サンド
イッチアッセイを示す。ＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃ
ｏｎ３９１５プロバインド）を４μｇ／ｍｌヤギ抗−マ
ウスＩｇＧ ２ｂ（ＧａＭＩｇＧ ２ｂ、Ｃａｌｔａ
ｇ）の５０μｌ／ウェルで被覆した。プレートを４℃で
一夜インキュベートし、洗浄しそして５０ｍＭ重炭酸塩
緩衝液、ｐＨ９．６、中室温で２時間遮断した。洗浄
後、５０μｌ／ウェルの捕捉抗体ＲＰ３−１２（ハイブ
リドーマ培養上清の１：５希釈物）を加え、室温で１時
間インキュベートした。洗浄後、ヒトＣＮＴＦ標準物の
連続希釈物（範囲１０ｎｇ／ｍｌ〜７ｐｇ／ｍｌ）また
は試験試料の連続希釈物を加えた。室温で１時間、次に
洗浄、そして５０μｌ／ウェルのレポーター抗体ＲＰ１
２−２（培養上清の１：５希釈物）を加え、室温で１時
間インキュベートした。洗浄後、アルカリホスファター
ゼ標識ヤギ抗−マウスＩｇＧ１（ＧａＭ ＩｇＧｌ、Ｃ
ａｌｔａｇ）試薬の１：１０００希釈物 ５０μｌ／ウ
ェルを加えた。プレートを室温で１時間インキュベート
し、洗浄し、ｐＮＰＰで発色させ、そしてＥＬＩＳＡ読
みとり器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｔｈ
ｅｒｍｏＭａｘ）中４０５ｎｍで読みとった。
【０１８４】図４１は、ヒトＣＮＴＦに関する二抗体サ
ンドイッチアッセイの結果を示す。漸増量の組み換えヒ
トＣＮＴＦを第４０図記載の反応で、モノクローナル抗
体ＲＰ３−１２およびＲＰ１２−２を用いてアッセイし
た。
【０１８５】図４２は、ローダミンイソチオシアネート
で逆行的に標識したニワトリ胚脊髄運動ニューロンを示
す。細胞を培養５時間後４％ホルムアルデヒドで固定し
た。同じ視野の（Ａ）位相差および（Ｂ）蛍光写真であ
る。目盛りバー＝２５μｍ。右の比較的小さい細胞は標
識されていないことに注目されたい。
【０１８６】図４３は、組み換えラットＣＮＴＦ ５ｎ
ｇ／ｍｌの存在下（黒丸）または非存在下（白丸）にお
けるニワトリ胚脊髄運動ニューロンの生存の時間的経過
を示す。
【０１８７】図４４は、組み換えラットＣＮＴＦ １ｎ
ｇ／ｍｌの非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）における
培養６日後のニワトリ胚脊髄運動ニューロン。目盛りバ
ー＝１００μｍ。
【０１８８】図４５は、培養中のニワトリ胚脊髄運動ニ
ューロンに関する組み換えラットＣＮＴＦの生存活性
（Ａ）およびＣＮＴＦ（Ｂ）およびＦＧＦ（Ｃ）に関す
る濃度応答線を示す。生存活性は培養３日後にアッセイ
した。Ｂにおいては、ヘパリン（１μｇ／ｍｌ）は過剰
のヘパリンにより誘導される細胞の脱着を回避するため
に初めの２４時間だけ培養物に加え、一方酸性ＦＧＦは
３日間存在した。
【０１８９】本発明は、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴ
Ｆ）をコードする核酸配列、並びにそれから大量に生産
されるＣＮＴＦタンパク質、ペプチドフラグメントおよ
び誘導体に関する。さらに、本発明は毛様体神経栄養因
子の医薬組成物および治療上および診断上の利用に関す
る。
【０１９０】限定するためではなく説明を明確にする目
的で、本発明を以下の部分に分けて説明することとす
る： ｉ）ＣＮＴＦの精製 ｉｉ）ＣＮＴＦバイオアッセイ ｉｉｉ）ＣＮＴＦの配列決定 ｉｖ）ＣＮＴＦをコードするＤＮＡのクローニング ｖ）ＣＮＴＦ遺伝子の発現 ｖｉ）ＣＮＴＦ遺伝子およびタンパク質 ｖｉｉ）抗ＣＮＴＦ抗体の生成 ｖｉｉｉ）本発明の利用。
【０１９１】（１）毛様体神経栄養因子の精製 ＣＮＴＦはニワトリ胚の眼、座骨神経および心筋を包含
するがそれらに限定されない利用可能なあらゆる起源か
ら、当業上知られた技法を用いて精製できる。
【０１９２】限定するためではなく例を挙げると、ＣＮ
ＴＦはニワトリ胚の眼からＢａｒｂｉｎら（１９８４，
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４３：１４６８−１４７８、
これは参照としてその全体がここにとり込まれる）に記
載される方法にしたがって調製できる。簡単に説明する
と、脈絡膜、虹彩−毛様体、および付着性色素上皮、こ
れらをまとめてＣＩＰＥと称するが、これらを１５日令
ニワトリ胚の眼からＭａｎｔｈｏｒｐｅ（１９８０，
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．３４：６９−７５）の記載の
ように切開して取り出しそして平衡塩類溶液中に集め
る。抽出物は約３００の胚の眼から得るのが好ましく、
約７６ｍｌの冷水中でテフロン（登録商標）ガラスホモ
ジナイザーを用いてホモジナイズし、約４℃で１時間１
０５×ｇで遠心分離する。次に上清を集め、ｐＨ７のＮ
ａＨ2ＰＯ4で０．０１Ｍとなし、ついでイオン交換カラ
ム（すなわち、リン酸塩緩衝液で平衡化したＷｈａｔｍ
ａｎＤＥ５２セルロース）にかける。次にこのカラム
を、約３０ｍｌ／時間の流速で、リン酸塩緩衝液中の
０．０７，０．０２および０．５Ｍ ＮａＣｌ各２０ｍ
ｌを用いて溶離できる。次に０．２５Ｍ ＮａＣｌ溶出
液を限外濾過（例えば、５０ｍｌアミコンセルおよびＰ
Ｍ１０（１０，０００ダルトンカットオフ）限外濾過膜
を使用）により約２ｍｌ量まで濃縮できる。残った滞留
物を集め、０．２５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液０．５ｍｌずつ
で２回セルを洗浄した液を合わせて、さらに０．４ｍｌ
まで濃縮できる（例えば、３ｍｌアルコンセルおよびＰ
Ｍ１０フィルター使用）。精製された抽出物を次にスク
ロースグラジェントに重層し（例えば、４．６ｍｌの５
−２０％直線状スクロースグラジェント上に２００ｍｌ
の抽出物）、ついで遠心分離することができる（例えば
ＳＷローターを用いて４℃で１５時間、６５，０００ｒ
ｐｍで）。４．８ｍｌグラジェントを５個のフラクショ
ンに収集することができる；フラクションＩ（２ｍ
ｌ）、フラクションＩＩ（０．３ｍｌ）、フラクション
ＩＩＩ（１．２ｍｌ）、フラクションＩＶ（０．３ｍ
ｌ）、およびフラクションＶ（１．０ｍｌ）。フラクシ
ョンＩＩＩをトリトンＸ−１００中に０．１％とした
後、上記のように限外濾過を用いて０．２ｍｌまで濃縮
することができる。
【０１９３】分析用ゲル電気泳動に関しては、精製ＣＮ
ＴＦを、１５％分離用および４．５％試料添加用スラブ
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて分析できる。
精製ＣＮＴＦまたは分子量標準物を電気泳動し、ゲルを
切断しそして以下のように処理する：ゲルを０．２５Ｍ
ＫＣｌ中でインキュベートする間にタンパク質関連ＳＤ
Ｓを沈澱させ、標準物とＣＮＴＦバンドの位置を記録す
ることによって、固定せずにポリペプチドを可視化する
ことができる。次にレーンを固定し、クマシーブルーで
染色することができる。他のレーンを薄く切断し、トリ
トンＸ−１００とインキュベートして溶出し、その溶出
物をＣＮＴＦ活性についてアッセイすることができる。
【０１９４】ニワトリ眼ＣＮＴＦの精製（上記）で用い
たのと同じ工程（ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィ
ー、スクロースグラジェント遠心および調製用ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）により座骨神経抽出物を分画できる。ただし
その操作に以下の３点の改変を行うことが望ましい：す
なわち（ｉ）神経抽出物を負荷した後、（０．０７ＭＮ
ａＣｌによる洗浄および０．２５Ｍ ＮａＣｌによる溶
出を行わずに）ＤＥＡＥイオン−交換カラムを直接０．
１５ＭＮａＣｌでバッチ溶出させることができる；（ｉ
ｉ）調製用ＳＤＳゲルの（２０Ｋｄ領域の代わりに）２
４Ｋｄ領域から薄片を切り出す；そして（ｉｉｉ）（尿
素ゲルを用いて一晩電気泳動的に溶出するよりもむし
ろ）０．１％界面活性剤トリトンＸ−１００中でホモジ
ナイズし、続いて４℃で一晩インキュベートすることに
よって、ＣＮＴＦ活性を個々のゲルスライスから溶出す
ることができる。つぎにその上清をＥｘｔｒａｃｔａｇ
ｅｌ（Ｐｏｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ，ＩＬ）ビーズの１００μｌ懸濁液と４℃で２時
間インキュベートすることによって、界面活性剤トリト
ンＸ−１００を除去できる。次に当業者に知られた任意
の方法に従ってタンパク質濃度を測定できる。
【０１９５】上記の方法をさらに以下のように改良する
ことが好ましい：調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから溶出
した後、ＣＮＴＦを均質となるまで精製しそして不活性
カラムに含有される生体適合性液体システムを構成する
ＦＰＬＣまたはＨＰＬＣカラムを用いる逆相クロマト
グラフィーによってＣＮＴＦからＳＤＳを除去できる。
最も好ましい実施態様に於ては、ＦＰＬＣカラムは、０
から６０％アセトニトリルグラジェントで溶出が行われ
るＢａｋｅｒｂｏｎｄ Ｇｏｌｄ Ｃ４ Ｗｉｄｅｐｏ
ｒｅカラム（金で内張りした７．７５ｍｍ×１０ｃｍカ
ラムで、水性移動相中２００−２５０ｐｓｉのバッグ圧
で１．０ｍｌ／分で操作しうる）である。ＣＮＴＦは単
一のピークとして５０−５５％アセトニトリルで溶出す
ることが観察されている（下記実施例１参照）。ＣＮＴ
Ｆを含有する単一ピークを、アルゴンのような不活性ガ
スで空気を流し出したＳｐｅｅｄ Ｖａｃ内で濃縮でき
る。不活性ガスはＣＮＴＦ活性の損失を防ぐのに重要で
あると思われるが、この活性損失は一またはそれ以上の
メチオニン残基が酸化されることによって起こる。ＣＮ
ＴＦは、それがもはや溶液中にない場合には、酸化に対
して最も弱いと思われる。
【０１９６】同様に、ＷａｔｔｅｒｓおよびＨｅｎｄｒ
ｙ（１９８７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−ｃｈｅｍ．４９：７０
５−７１３、その全体を参照としてここにとり込むもの
とする）に記載されるように、毛様 体ニューロン生存
促進活性を心臓組織からヘパリンアフィニティクロマト
グラフィーを用いて調製できる。
【０１９７】（２）毛様体神経栄養因子のバイオアッセ
イ 当業上知られた任意のインビボまたはインビトロのＣＮ
ＴＦ感受性システムを用いて、毛様体神経栄養因子活性
を評価することができる。限定するためではなく例とし
て挙げると、単層培養物中の２４時間生存した胚（Ｅ
８）ニワトリ毛様体神経節（ＣＧ）ニューロンを定量す
ることによってＣＮＴＦ活性を測定するインビトロシス
テムが開発された。
【０１９８】例えば、Ｖａｒｏｎら（１９７９，Ｂｒａ
ｉｎ Ｒｅｓ．１７３：２９−４５）の記載のように、
毛様体神経節をＥ８ニワトリ胚から集め、細胞に分離し
（神経節当り約２０，０００個の細胞を生じる）、次に
２０％ウマ血清を含有するＨＥＢＭ培地で希釈すること
ができる。１，０００ニューロン（２，０００細胞）を
含有する約５０μｌの細胞懸濁液をマイクロタイタープ
レート内に接種し、ＣＮＴＦ活性が予想されるものを添
加できる。次に培養プレートを５％ＣＯ2中で３０℃で
４時間維持し、その後培養物を２００μｌの２％グルタ
ルアルデヒド／ＨＥＢＭ培地の添加によって固定し、そ
して生存するニューロン数を位相差顕微鏡下での直接計
数によって視覚的に測定できる。
【０１９９】（３）毛様体神経栄養因子タンパク質の配
列決定 ＣＮＴＦタンパク質は直接配列決定することができるし
または最初に、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８、トリ
プシン、および臭化シアンを包含するがそれらに限定さ
れない当業者に知られた任意のプロテアーゼまたは他の
化合物によって切断することができる。Ｈｅｗｉｃｋら
（１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：７９９
０−７９９７）およびＨｕｎｋａｐｉｌｌａｒら（１９
８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：３９９
−４１７）の方法にしたがって、気相微量シークエンサ
ーでの自動化エンドマン分解によってペプチドを配列決
定することができる。次にＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈ（１９
８５，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ３２６：３２１
−３２７）にしたがって、フェニルチオヒダントインア
ミノ酸の検出を行うことができる。アミノ酸配列の重な
りあうフラグメントを決定し、それを用いてもっと長い
一続きの連続した配列を推定することができる。
【０２００】（４）毛様体神経栄養因子をコードするＤ
ＮＡのクローニング 微量配列決定を可能にするに好適な量のラット座骨神経
由来ＣＮＴＦタンパク質の精製によって、ＣＮＴＦ ｃ
ＤＮＡのクローニングが可能になった。かかるクローニ
ングの標準的な方法は、既知アミノ酸配列のセグメント
に基づいて相補的オリゴヌクレオチドプローブを生成さ
せ、そしてこのプローブを用いて、ＣＮＴＦをコードす
るｍＲＮＡを合成すると予想される組織から作成したｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることであろ
う。しかしながら、この方法は、ｍＲＮＡが比較すると
それほど多くないゆえに、および特定のアミノ酸残基に
対してありうるすべてのコドン選択に合わせるためには
微量配列決定（図１）によって決定されたＣＮＴＦペプ
チドの実際の配列が、オリゴヌクレオチドプローブにお
いて、不都合に高度な縮重をあらゆる場合に必要とする
であろうゆえに、問題であった。本発明は、ｃＤＮＡの
合成による遺伝子のクローニング、ＣＮＴＦペプチドの
微量配列決定に基づく、一対の縮重オリゴヌクレオチド
プライマーの誘導、ＣＮＴＦコード配列のセグメントを
増幅するためにこれらプライマーの誘導、ＣＮＴＦコー
ドの配列のセグメントを増幅するためのこれらプライマ
ーの使用、増幅されたセグメントの同定を確認するため
の第三の縮重オリゴヌクレオチドの使用、そのセグメン
トの正確なヌクレオチド配列の決定、および残りのＣＮ
ＴＦ遺伝子を増幅するための正確なオリゴヌクレオチド
プライマーの合成および使用、を提供するものである。
本発明の本方法に於て、好ましい増幅操作は、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による組織核酸配列の増幅を利
用する（Ｓａｉｋｉら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
３０：１３５０−１３５４）。好ましい方法の詳細な説
明は以下の通りである。
【０２０１】最初に、精製ＣＮＴＦタンパク質から得ら
れたアミノ酸配列を用いて、ＰＣＲに使用するためのオ
リゴヌクレオチドプライマーを推定することができる。
遺伝暗号の縮重ゆえに、すなわちいくつかのトリプレッ
トが同じアミノ酸を指定することができるため、多数の
有効なヌクレオチド配列の組合せを提供するためには、
一つの特定のアミノ酸配列に対して数通りのオリゴヌク
レオチドを合成しなければならない。その結果生成する
オイゴヌクレオチドは縮重プライマーと称される。
【０２０２】ＰＣＲはセンス鎖並びにアンチセンス鎖プ
リイマーを必要とする。従って、ＣＮＴＦアミノ酸配列
の一つのセグメントに対応する縮重オリゴヌクレオチド
プライマーを、一方のＤＮＡ鎖（例えばセンス）に対す
るプライマーとして用い、そしてＣＮＴＦアミノ酸配列
の第二のセグメントに相同なもう一つのオリゴヌクレオ
チドプライマーを、第二のＤＮＡ鎖に対するプライマー
として用いることができる（例えばアンチセンス）。好
ましくは、これらのプライマーは一続きの既知のアミノ
酸配列に基づいて選択されるべきで、それによってＰＣ
Ｒでこれらのプライマーを使用して得られた当該のＤＮ
Ａ反応産物は予想可能な分子量を有することができる
（すなわち産物の長さは、塩基対の数で、二つのプライ
マーとその二つのプライマーに対応するセグメントによ
り結合されたタンパク質のセグメント中のアミノ酸残基
数の三倍とを加えた総計と等しくなるはずである）。こ
れらのプライマーを次に、ゲノムＤＮＡ、または好まし
くは、ＣＮＴＦを合成すると予想される組織または細胞
から集められたｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡのよう
な、ＣＮＴＦコード配列を含有することが推定される核
酸鋳型を用いるＰＣＲに使用できる。そのＤＮＡ反応産
物を次に、電気泳動によって分析し、そのＤＮＡ反応産
物が予想通りの分子量を有するかどうかを判定すること
ができる。そのＤＮＡ反応産物を、ＰＣＲに用いた二つ
のプライマーのセグメント間のアミノ酸配列に対応する
縮重オリゴヌクレオチドから調製した標識プローブとの
ハイブリッド形成によってさらに分析することができ
る。予想された分子量を有するＤＮＡ反応産物の配列分
析を確認されたアミノ酸配列と比較して、増幅された核
酸配列が実際にＣＮＴＦペプチドフラグメントをコード
することを確証することができる。当業上知られた任意
の核酸配列決定法を利用できるが、ジデオキシヌクレオ
チド チェインターミネーション法の使用が好ましい
（Ｓａｎｇｅｒら，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２：３９１８−３９２
１）。ゲルで精製されたかまたは好ましくはクローン化
されたＤＮＡ反応産物を用いて配列決定することができ
る。ＤＮＡ反応産物のクローニングを促進するためには
選択された制限エンドヌクレアーゼに関する既知標識配
列を含有する「尾」を、ＰＣＲに利用される各オリゴヌ
クレオチドプライマーの５’末端に組み込むことができ
る。
【０２０３】次に、ＤＮＡ反応産物の配列を利用して正
確なＣＮＴＦコード配列に対応するオリゴヌクレオチド
プライマーを設計することができる。次にこのプライマ
ーをＰＣＲに於て第二のプライマーとともに使用してＣ
ＮＴＦコード配列の量を、最初に決定された正確な配列
のフラグメントの相当する量を越えて伸張させることが
できる。限定するためではなく例として挙げると、「ｃ
ＤＮＡ末端の迅速な増幅」（ＲＡＣＥ）（Ｍ．Ａ．Ｆｒ
ｏｈｍａｎ，Ｍ．Ｋ．Ｄｕｓｈ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉ
ｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８９９８−９００２）のための
プロトコールを用いて、それぞれ ｃＤＮＡ分子の５’
および３’末端に対する知られた正確な配列領域内から
セグメントをクローニングすることができる。３’末端
方向に伸長したクローンを得るためには、センス鎖プラ
イマーは正確なＣＮＴＦヌクレオチド配列に対応するこ
とができ、一方、アンセチンス鎖プライマーは配列決定
されたフラグメントの下流に容易に見いだされる可能性
のある既知配列、例えばｃＤＮＡに於て逆転写されるｍ
ＲＮＡの３’ポリアデノシン尾部のセグメントに相同で
あることができる。この場合プライマーは一続きのオリ
ゴ−ｄＴを包含するであろう。次に、配列決定されたフ
ラグメントの上流の配列を回復するために同様の方法を
使用することが必要であろう。例えば、アンチセンス鎖
プライマーは正確なＣＮＴＦヌクレオチド配列に対応で
き、そして、センス鎖プライマーは配列決定されたフラ
グメント、例えば、ターミナルデオキシヌクレオチドト
ランスフェラーゼを用いてｃＤＮＡの５’末端に付加し
た５’ポリグアノシン尾部の上流領域と相同であること
ができる（この場合、プライマーはオリゴ−ｄＣ連鎖を
包含するであろう）。
【０２０４】増幅したフラグメントを次に配列決定する
ことができるし、また好ましくはクローン化した後配列
決定することができる。ひとたびｃＤＮＡの５’および
３′末端からの正確なオリゴヌクレオチド配列が決定さ
れると、その正確なヌクレオチドをＰＣＲ反応に使用し
て、間にある核酸配列を得ることができ、そのＰＣＲ反
応の産物を次にクローン化することができる。
【０２０５】当業者に知られた任意の方法を用いてＤＮ
Ａ反応産物をクローン化できる。当業者に知られた多数
の宿主ベクター系を用いることができる。使用可能なベ
クターにはコスミド、プラスミドまたは改変されたウイ
ルスが包含されるがそれらに限定されず、またそのベク
ター系は使用される宿主細胞と適合しなければならな
い。かかるベクターには、ラムダ誘導体のようなバクテ
リオファージ、またはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、またはＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
プラスミド誘導体のようなプラスミドが包含されるがそ
れらに限定されない。形質転換、トランスフェクショ
ン、感染、エレクトロポレーション、などによって組換
え分子を宿主細胞内に導入することができる。
【０２０６】ＣＮＴＦ遺伝子を、その遺伝子配列の多コ
ピーが生成されるように、適当な宿主細胞の形質転換、
トランスフェクションまたは感染に使用できるクローニ
ングベクター内に挿入する。これは、相補的な付着末端
を有するクローニングベクターにそのＤＮＡフラグメン
トを結合することにより行うことができる。しかしなが
ら、ＤＮＡを分解するために用いられる相補的な制限部
位がクローニングベクター中に存在しない場合は、その
ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾できる。ベクターへの
挿入を容易にするためにポリメラーゼ連鎖反応に用いら
れるオリゴヌクレオチドプライマーに制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位を組み込むことが好都合と判明しよう。
あるいはまた、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ
端末に連結することによって、任意の所望の部位を生成
させることができる。これらの連結されたリンカーは制
限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な化
学合成オリゴヌクレオチドを含んでなることができる。
これに代わる方法に於ては、切断されたベクターおよび
ＣＮＴＦ遺伝子をホモポリマーを末端につなぐことによ
って修飾できる。
【０２０７】詳細な実施態様に於ては、単離されたＣＮ
ＴＦ遺伝子、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列を組み込ん
だ組換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換によっ
て、その遺伝子の多コピーを生成させることができる。
従って、形質転換体を増殖させ、その形質転換体から組
換え、ＤＮＡ分子を単離しそして必要ならば単離した組
換えＤＮＡから挿入した遺伝子を回収することによって
その遺伝子を大量に得ることができる。
【０２０８】本発明の好ましい実施態様によれば、ひと
たびＣＮＴＦをコードするｃＤＮＡ由来クローンが生成
されると、当業者に知られた標準的な技法を用いてＣＮ
ＴＦをコードするゲノムクローンを単離できる。たとえ
ば、標識した核酸プローブをＣＮＴＦクローンから誘導
でき、このプローブを用いて、核酸ハイブリッド形成に
よりゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするこ
とができる。これに用いる方法は例えば、バクテリオフ
ァージライブラリーについてはＢｅｎｔｏｎおよびＤａ
ｖｉｓ（１９７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０）
に、またプラスミドライブラリーについてはＧｒｕｎｓ
ｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ（１９７５，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２：３９
６１−３９６５）に記載されている。次に回収したクロ
ーンを当業者に周知の方法にしたがって制限フラグメン
トマッピングおよび配列決定法によって分析することが
できる。さらに、本発明にしたがって得られた配列を用
いてｃＤＮＡライブラリーから付加的なｃＤＮＡクロー
ンを同定できる。
【０２０９】（５）毛様体神経栄養因子遺伝子の発現 ＣＮＴＦタンパク質またはその一部分をコードするヌク
レオチド配列を、適当な発現ベクター、すなわち挿入し
たタンパク質−コード配列の転写および翻訳に必要なエ
レメントを含有するベクターに挿入することができる。
必要な転写および翻訳シグナルは天然型ＣＮＴＦ遺伝子
および／またはその側面領域から供給されることもでき
る。タンパク質コード配列を発現させるのに種々の宿主
ベクター系を使用できる。これには、ウイルス（たとえ
ばワクシニアウイルス、アデノウイスル、など）に感染
した哺乳動物細胞系；ウイルス（たとえばバキュロウイ
ルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する
酵母、またはバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤ
ＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌のよ
うな微生物が包含されるがそれらに限定されない。これ
らのベクターの発現エレメントはその強さや特異性が異
なる。使用する宿主ベクター系に応じて、多くの好適な
転写および翻訳エレメントのうちいずれを使用してもよ
い。
【０２１０】ＤＮＡフラグメントのベクターへの挿入に
ついて既述の任意の方法を、適当な転写／翻訳制御シグ
ナルおよびタンパク質コード配列からなるキメラ遺伝子
を含有する発現ベクターの構築に用いることができる。
これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成
技法、およびインビボ組換え （遺伝子組換え）が包含
されうる。ＣＮＴＦタンパク質またはペプチドが組換え
ＤＮＡ分子で形質転換された宿主中で発現されるよう
に、ＣＮＴＦタンパク質またはペプチドフラグメントを
コードする核酸配列の発現を第二の核酸配列によって調
節できる。例えば、ＣＮＴＦの発現を、当業上知られた
任意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって
制御することができる。ＣＮＴＦ発現を制御するのに使
用できるプロモーターには以下が包含されるがそれらに
限定されない。すなわちＳＶ４０初期プロモーター領域
（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，
Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウ
イルスの３’長末端重複に含まれるプロモーター（Ｙａ
ｍａｍｏｔｏら、１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−
７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗ
ａｇｎｅｒら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４−１４４５）、
メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ
ら、１９８２，Ｎａｔｕｒｅ２９６：３９−４２）；β
−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−ｋａｍａｒ
ｏｆｆら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、ま
たはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ら、１９８
３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．８０：２１−２５）のような原核生物発現ベクタ
ー、ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ，１９８
０，２４２：７４−９４における「組換え細菌からの有
用タンパク質」も参照；ノパリンシンセターゼプロモー
ター領域（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３０３：２０９−２１３）またはカリフラワ
ーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（Ｇａ
ｒｄｎｅｒら、１９８１，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．９：２８７１）、および光合成酵素リブロースビス
ホスフェートカルボキシラーゼのためのプロモーター
（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら，１９８４，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１０：１１５−１２０）を包含する植物
発現ベクター；例えばＧａ１４プロモーター、ＡＤＣ
（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ
（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカ
リフォスファターゼプロモーターのような酵母およびそ
の他の真菌由来のプロモーターエレメント、および組織
特異性を示し、トランスジェニック動物に於て利用され
ている以下の動物転写制限領域：膵臓腺房細胞に於て活
性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１
９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔ
ｚ ら、１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｈａｒｂｏ
ｒ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−
４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐｅｔｏ
ｌｏｇｙ７：４２５−５１５）；膵臓ベータ細胞に於て
活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１
９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）、リ
ンパ系細胞に於て活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域
（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４，Ｃｅｌｌ３８：
６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ
ら、１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４
３６−１４４４）、精巣、乳房、リンパ系およびマスト
細胞に於て活性なマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Ｌ
ｅｄｅｒら、１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９
５）、肝臓に於て活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐ
ｉｎｋｅｒｔら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅ
ｖｅｌ．１：２６８−２７６）、肝臓に於て活性なアル
ファーフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａ
ｕｆら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：
１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）、肝臓に於て活性な
アルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌ
ｓｅｙら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅ
ｌ．１：１６１−１７１）、骨髄細胞に於て活性なベー
ターグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，１９８
５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌ
ｉａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；
脳の希突起神経膠細胞に於て活性なミエリン塩基性タン
パク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８
７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）；骨格筋に於て
活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１
９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１４：２８３−２８６）、およ
び視床下部に於て活性な性腺刺激ホルモン放出遺伝子制
御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
３４：１３７２−１３７８）。
【０２１１】ＣＮＴＦ遺伝子挿入物を含有する発現ベク
ターは三種の一般的な方法により同定できる。すなわち
（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成、（ｂ）「マー
カー」遺伝子機能の有無、および（ｃ）挿入配列の発
現。第一の方法に於ては、発現ベクターに挿入された外
来遺伝子の存在を、挿入されたＣＮＴＦ遺伝子に相同な
配列を含んでなるプローブを用いるＤＮＡ−ＤＮＡハイ
ブリッド形成によって検出できる。第二の方法に於て
は、外来遺伝子のベクターへの挿入によって引き起こさ
れる特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジン
キナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュ
ロウイルスにおける閉塞体 形成、など）の有無に基づ
いて、組換えベクター／宿主系を同定および選択するこ
とができる。たとえば、もしＣＮＴＦ遺伝子がベクター
のマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、ＣＮＴＦ挿
入物を含有する組換え体はマーカー遺伝子機能が存在し
ないことによって同定できる。第三の方法に於ては、組
換え体によって発現される外来遺伝子産物をアッセイす
ることによって、組換え発現ベクターを同定できる。か
かるアッセイは、例えば上記（２）節記載のバイオアッ
セイ系に於けるＣＮＴＦ遺伝子産物の物理的または機能
的性質に基づくことができる。
【０２１２】ひとたび特定の組換えＤＮＡ分子が同定お
よび単離されると、当業者に知られたいくつかの方法に
よりそれを増幅させることができる。ひとたび適当な宿
主系および増殖条件が確立されると、組換え発現ベクタ
ーを増幅して大量に調製することができる。既に説明し
たように、使用可能な発現ベクターには少数例をあげれ
ば以下のベクターまたはその誘導体が包含されるがそれ
に限定されない。すなわちワクシニアウイルスまたはア
デノウイル スのようなヒトまたは動物ウイルス；バキ
ュロウイルスのような昆虫ウイルス；酵母ベクター；バ
クテリオファージベクター（例えばラムダ）、およびプ
ラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターなど。
【０２１３】さらに、挿入された配列の発現を調節する
か、または特定の望ましい様式で遺伝子産物を修飾しプ
ロセシングするような宿主細胞系を選択することができ
る。特定のプロモーターからの発現を特定のインデュー
サーの存在によって高めることができ、このようにして
遺伝子工学的に作成されたＣＮＴＦタンパク質の発現を
制御することができる。さらに、それぞれ異なる宿主細
胞はタンパク質の翻訳時および翻訳後のプロセシングお
よび修飾（例えば、グリコシル化、切断）に関する特徴
的で特異的なメカニズムを有する。発現される外来タン
パク質の望ましい修飾およびプロセシングを確実にする
ために適当な細胞系または宿主系を選択できる。例え
ば、細胞系に於ける発現をグリコシル化されていないコ
アタンパク質産物の生産に用いることができる。酵母で
の発現はグリコシル化された産物を生じよう。非相同Ｃ
ＮＴＦタンパク質の天然型のグリコシル化を保証するた
めに、哺乳動物細胞に於ける発現を用いることができ
る。さらに、種々のベクター／宿主発現系が種々の程度
にタンパク分解的切断のようなプロセシング反応を行う
ことができる。
【０２１４】本発明の詳細な実施態様に於いては、ＣＮ
ＴＦをコードするＤＮＡをｐＣＭＶプラスミドにクロー
ン化し、増幅させ、そして次にＤＥＡＥ−デキストラン
法によってＨａｌａ細胞の形質転換に使用できる。次ぎ
にＣＮＴＦ活性を細胞抽出物から収集することができる
（下記実施例１参照）。
【０２１５】本発明の他の詳細な実施態様に於ては、Ｃ
ＮＴＦをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに組み
込みそしてエシェリヒア・コリの形質転換に使用でき、
その結果生物学的に活性なＣＮＴＦが生成される（下記
実施例２参照）。
【０２１６】本発明の特定の態様においては、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ中におけるＣＮＴＦの発現は以下の１種を含有する
ベクターを用いて行われるのが好ましい。すなわち、ラ
クトースオペロンリプレッサーにより制御されうる１ａ
ｃ ＵＶ５プロモーター；強力なリボソーム結合部位、
例えばバリテリオファージＴ７のリボソーム結合部位；
コピー数を増大させうるプラスミドの複製制御領域の突
然変異；または抗生物質抵抗性タンパク質の発現を限定
する突然変異。本発明の好ましい詳細な態様において
は、ＣＮＴＦの発現はベクターｐＲＰＮ１２を用いて行
われ、それにより他のベクターに比較しＣＮＴＦの発現
が３０〜５０倍増大しうる（下記１２節参照）。本発明
の他の好ましい態様においては、発現ベクターｐＲＰＮ
３８を用いてＣＮＴＦをＥ．ｃｏｌｉ中に生成させるこ
とができる。本発明の他の好ましい態様においては、ベ
クターｐＲＰＮ４０を用いてＥ．ｃｏｌｉ中にヒトＣＮ
ＴＦを発現させることができる。本発明はまた、匹敵し
うるレベルのＣＮＴＦの発現を生じる等価のエレメント
（プロモーター、リボソーム結合部位、その他）を含有
するプラスミドｐＲＰＮ１２、ｐＲＰＮ３８、ｐＲＰＮ
３９およびｐＲＰＮ４０と機能的に等しい分子も提供す
る。
【０２１７】（５．１）発現された遺伝子産物の同定お
よび精製 ひとたびＣＮＴＦ遺伝子を発現する組換え体が同定され
ると、その遺伝子産物を分析しなければならない。産物
の物理的または機能的性質に基づくアッセイによってこ
の分析を行うことができる。
【０２１８】ＣＮＴＦタンパク質が同定されると、クロ
マトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、
およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分
離、溶解度の差による分離を包含する標準的な方法、ま
たはタンパク質の精製に関する任意の他の標準的な技法
によってそのタンパク質を単離および精製できる。ニワ
トリ胚毛様体神経節ニューロンを包含するがそれに限定
されない任意の知られたＣＮＴＦアッセイを用いて機能
的性質を評価できる。
【０２１９】重要なことは、座骨神経組織からＣＮＴＦ
を調製するために用いた方法が、最終段階として調製用
ゲル電気泳動を含むため、残存ＳＤＳのせいで完全には
活性でないＣＮＴＦを生じる可能性がある。対照的に、
本発明はＦＰＬＣカラムを用いて、最適の生物学的活性
を有しタンパク質の配列決定に適したＣＮＴＦを精製す
る方法を提供するものである。また本発明によって、組
換え核酸分子によって生成されたかまたは化学的に合成
された、したがってＳＤＳを含まず完全に活性な組換え
ＣＮＴＦを単離することができる。
【０２２０】（６）毛様体神経栄養因子遺伝子およびタ
ンパク質 上記で、および下記実施例１および３で詳述する方法を
用いて、以下の核酸配列を決定し、それに対応するアミ
ノ酸配列を推定した。ラットＣＮＴＦｃＤＮＡ配列を決
定しこれを図１に示す。ヒトゲノムＣＮＴＦ配列を決定
し、これを図８に示す。これらの配列またはこれらと機
能的に等価なものを、それぞれ本発明にしたがって使用
することができる。さらに本発明は、ブタ、ヒツジ、ウ
シ、ネコ、トリ、ウマまたはイヌ、並びに霊長類起源お
よびＣＮＴＦ活性が存在する他の任意の種から単離され
たＣＮＴＦ遺伝子およびタンパク質に関する。本発明は
さらに、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなる
ＣＮＴＦ核酸サブ配列に関する。このような配列 はＣ
ＮＴＦのハイブリッド形成可能な部分を含んでなり、そ
の用途としては、例えば、核酸ハイブリッド形成アッセ
イ、サザンおよびノーザンブロット分析などがある。ま
た本発明は、第１および８図に示したアミノ酸配列によ
るＣＮＴＦタンパク質、フラグメントおよびその誘導体
またはそれらと機能的等価物を提供する。本発明はま
た、抗原決定基を含んでなるかまたは機能的に活性であ
るＣＮＴＦタンパク質のフラグメントまたは誘導体も提
供する。ここで用いられる「機能的に活性」とは、例え
ばニワトリ胚毛様体神経節アッセイのような知られたＣ
ＮＴＦ機能に関するアッセイに於て陽性の活性を有する
ことを意味することとする。
【０２２１】例えば、図１および図８に示した核酸配列
を機能的に等価な分子を生ずる置換、付加、または欠失
によって変化させることができる。ヌクレオチドコード
配列の縮重ゆえに、実質的に第１および８図に示すと同
一のアミノ酸配列をコードする異なったＤＮＡ配列を本
発明の実施に使用できる。これらは、配列内で機能的に
等価のアミノ酸残基をコードする異なるコドンによる置
換によって変化され従ってサイレントな変化を生ずる、
図１および図８に示されるＣＮＴＦ遺伝子の全体または
一部を含んでなるヌクレオチド配列を包含するがそれに
限定されない。同様に、本発明のＣＮＴＦタンパク質ま
たはそのフラグメントまたは誘導体は、一次アミノ酸配
列として、機能的に等価のアミノ酸残基で配列内の残基
を置換し、その結果サイレントな変化を生じた。変化さ
れた配列を含めた実質的に第１および７図に示すアミノ
酸配列の全体または一部を含有するものを包含するがそ
れらに限定されない。例えば、配列内の一またはそれ以
上のアミノ酸残基を機能的に等価物として作用する同様
の極性を有する別のアミノ酸で置換してその結果サイレ
ントな変化を生成させることができる。配列内でのアミ
ノ酸の代替物は、そのアミノ酸が属するクラスの他のア
ミノ酸から選択できる。例えば無極性（疎水性）アミノ
酸にはアラニン、ロイシン、シソロイシン、バリン、プ
ロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチ
オニンが包含される。極性中性アミノ酸にはグリシン、
セリン、トリオニン、システイン、チロシン、アスパラ
ギンおよびグルタミンが包含される。プラスに荷電した
（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジンおよびヒス
チジンが包含される。マイナスに荷電した（酸性）アミ
ノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が包含され
る。また、本発明の範囲内には、例えばグリコシル化、
タンパク分解的切断、抗体分子や他の細胞性リガンドへ
の連結などによって翻訳中または翻訳後に示差的に修飾
されたＣＮＴＦタンパク質またはそのフラグメントまた
は誘導体も含まれる。下記実施例２は、生物学的に活性
な組換えＣＮＴＦエシェリヒア・コリに於ける発現を例
示し、それによってグリコシル化されていないＣＮＴＦ
が生物学的に活性であることが示される。
【０２２２】さらに、本発明の核酸配列をコードする組
換えＣＮＴＦを、ＣＮＴＦのプロセシングまたは発現を
修飾するように、工学的に作成することができる。限定
するためではなく例を挙げると、シグナル配列をＣＮＴ
Ｆコード配列の上流に挿入してＣＮＴＦを分泌させ、そ
れによって収集または生物学的利用脳を促進することが
できる。
【０２２３】さらに、特定のＣＮＴＦをインビトロまた
はインビボで突然変異させて、翻訳、開始および／また
は終止配列を生成および／または破壊するか、またはコ
ード領域に変異を生成させそして／または新たな制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を形成させるかまたは既にある部
位を破壊して、インビトロ修飾をさらに促進することが
できる。当業上に知られた突然変異誘発のための任意の
技法を使用することができ、それにはインビトロ特定部
位の突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９７
８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１）、Ｔ
ＡＢ（商標）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用な
どが包含されるがそれに限定されない。
【０２２４】（７）抗−毛様体神経栄養因子抗体の生成 本発明によれば、ＣＮＴＦタンパク質またはそのフラグ
メントまたは誘導体を免疫原として使用して抗−ＣＮＴ
Ｆ抗体を生成させることができる。タンパク質合成のた
めの組換え技法（本発明のＣＮＴＦ核酸配列に基づく）
を用いる比較的大量のＣＮＴＦタンパク質の製法を提供
することによって、ＣＮＴＦの量が限られているという
問題は取り除かれた。
【０２２５】抗−ＣＮＴＦ免疫応答を生成させる可能性
をさらに向上させるために、免疫原性の増加と結びつく
可能性のある分子の部分を同定することを目的として、
ＣＮＴＦのアミノ酸配列を分析することができる。例え
ば、アミノ酸配列をコンピューター分析にかけて、第１
５（ａ）および（ｂ）図に示される表面エピトープを同
定することができる。これらの図はコンピューターで作
成したそれぞれラットおよびヒトＣＮＴＦの親水性、表
面確率、可撓性、抗原指数、両親媒性らせん、両親媒性
シートおよび二次構造のプロットを示す。あるいはま
た、様々な種に由来するＣＮＴＦの推定アミノ酸配列を
比較し、そして比較的非相同な領域を同定することがで
きよう。これらの非相同領域は様々な種にわたって免疫
原性である可能性がより高いと思われる。
【０２２６】ＣＮＴＦに対するモノクローナル抗体を調
製するには、培養中の連続細胞系による抗体分子の生産
を提供する任意の技法を使用できる。例えば、Ｋｏｈｌ
ｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５−４９７）によって本来開発されたハ
イブリドーマ法、ならびにトリオーマ法、ヒトＢ細胞ハ
イブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３，Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）、およびヒトモ
ノクローナル抗体を生成させるためのＥＢＶ−ハイブリ
ドーマ法（Ｃｏｌｅら、１９８５，ｉｎ「Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎ
ｃ．ｐｐ．７７−９６）などが本発明の範囲に包含され
る。
【０２２７】治療用モノクローナル抗体はヒトモノクロ
ーナル抗体またはキメラヒト−マウス（または他種）モ
ノクローナル抗体であることができる。当業上知られた
多数の技法のいずれによってもヒトモノクローナル抗体
を生成させることができる（例えばＴｅｎｇら、１９８
３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．８０：７３０８−７３１２；Ｋｏｚｂｏｒら、１９
８３，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ４：７２−７
９；Ｏｌｓｓｏｎら、１９８２，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．９２：３−１６）。マウス抗原−結合ドメインと
ヒト定常領域を含有するキメラ抗体分子を調製できる
（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５−
１；Ｔａｋｅｄａら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１
４：４５２）。
【０２２８】ＣＮＴＦのエピトープに対するポリクロー
ナル抗体を生成させるには、当業上知られた種々の方法
を用いることができる。抗体の生成には、ＣＮＴＦタン
パク質またはそのフラグメントまたは誘導体を注入する
ことによって種々の宿主動物を免疫することができる。
これらの動物にはウサギ、マウス、ラットなどが包含さ
れるがそれらに限定されない。免疫応答を高めるために
宿主の種に応じて種々のアジュバントを使用できる。こ
のようなアジュバントにはフロイント（完全および不完
全）、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシ
チンのような界面活性物質、プルロックポリオール、ポ
リアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホー
ルリンペット、ヘモシアニン、ジチオスレイトールおよ
びＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃｅｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅ
ｒｉｎ）やコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍＰａｒｖｕｍ）のような有用な可
能性のあるヒトアジュバントが包含されるがそれらに限
定されない。
【０２２９】ＣＮＴＦエピトープに対する抗体の分子ク
ローンを既知技法によって調製できる。組換えＤＮＡ技
法（例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、１９８２，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）を用いて、
モノクローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコー
ドする核酸配列を構築することができる。
【０２３０】既知の技法、例えば免疫吸着クロマトグラ
フィーまたはイムノアフィニティクロマトグラフィー、
ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）の様なクロ
マトグラフィー手法、またはそれらの組合せなどによっ
て抗体分子を精製することができる。
【０２３１】分子のイディオタイプを含有する抗体フラ
グメントを既知の技法により生成させることができる。
例えばかかるフラグメントには抗体分子のペプシン消化
によって生成させることができるＦ（ａｂ’）２フラグ
メント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド橋
の還元によって生成できるＦａｂ’フラグメント、およ
び抗体分子をパパインと還元剤で処理することによって
生成できる２ＦａｂまたはＦａｂフラグメントが包含さ
れるがそれらに限定されない。
【０２３２】実施例４では、ＣＮＴＦタンパク質の１４
個のアミノ酸からなるペプチドフラグメントに対するポ
リクローナル抗血清の調製について説明する。
【０２３３】実施例１２は、本発明により提供される４
種の抗−ＣＮＴＦモノクローナル抗体、すなわちＲＰ３
−１２、ＲＰ１２−１、ＲＰ１２−２、およびＲＰ１２
−９について記載する。
【０２３４】（８）本発明の利用 本発明はＣＮＴＦの核酸配列およびそれから生成された
実質的に純粋なタンパク質、ペプチドフラグメントまた
は誘導体に関する。ＣＮＴＦタンパク質、ペプチドおよ
び誘導体、抗体−ＣＮＴＦ抗体、およびＣＮＴＦ核酸プ
ローブを診断および治療上の応用に利用できる。たいて
いの目的には、同一種に由来するＣＮＴＦ遺伝子または
遺伝子産物を診断上または治療上の目的に使用すること
が望ましいが、種を越えたＣＮＴＦ利用も本発明の詳細
な実施態様に於いて有用でありうる。
【０２３５】（８．１）診断上の応用 本発明はＣＮＴＦをコードする核酸、およびそれらから
生成されるタンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘
導体、並びにＣＮＴＦタンパク質、ペプチドまたは誘導
体に対に抗体に関するが、本発明をＣＮＴＦの発現パタ
ーンの変化と関連すると思われる神経系の疾患および障
害の診断に利用することができる。
【０２３６】本発明の種々の実施態様に於いては、ＣＮ
ＴＦ遺伝子および関連核酸配列およびサブ配列（相補的
配列を包含する）を診断用ハイブリッド形成アッセイに
使用できる。ＣＮＴＦ核酸配列または少なくともおよそ
１０ヌクレオチドを含んでなるそのサブ配列をハイブリ
ッド形成用プローブとして使用できる。ハイブリッド形
成アッセイを用いて、特に、副交感神経ニューロン、コ
リン作動性ニューロン、脊髄ニューロン、神経芽細胞腫
細胞および副腎髄質細胞のような、ＣＮＴＦに応答する
ことが知られているニューロンの損傷や変化を生ずる状
態を包含する、ＣＮＴＦの発現の変化にともなう状態、
障害または疾病の状態を検出、予知、診断、または監視
することができる。このような疾病および状態には中枢
神経外傷、梗塞、感染、変性神経疾患、悪性腫瘍、また
は術後変化が包含されるがそれらに限定されない。ま
た、これらにはアルツハイマー病、パーキンソン病、ハ
ンチントン舞踏病および筋萎縮性側索硬化症が包含され
るがそれらに限定されない。例えば、患者の組織試料中
の全ＲＮＡを、ＣＮＴＦ ｍＲＮＡの存在についてアッ
セイすることができ、ここにおいてＣＮＴＦ ｍＲＮＡ
量の減少はニューロンの変性を示す。
【０２３７】本発明の別の実施態様に於いては、ＣＮＴ
Ｆタンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体に対
する抗体、特に上記に挙げたニューロン集団および臨床
疾患および障害を包含する神経系の疾患および障害を診
断するのに使用することができる。本発明のＣＮＴＦタ
ンパク質に対する抗体は、例えば、このような評価を必
要とする患者からの組織切片またはバイオプシーにおけ
るＣＮＴＦ活性の免疫組織化学的同定に使用できる。さ
らに他の例に於いては、本発明の抗体をＥＬＩＳＡ法に
使用して、組織または液体試料中に存在するＣＮＴＦ量
を検出および／または測定することができる。同様に、
本発明の抗体をウェスタンブロット分析に使用して組織
または液体試料中に存在するＣＮＴＦを検出および／ま
たは測定することができる。ＣＮＴＦに結合しこれを免
疫沈澱させる本発明の抗体を下記実施例６で説明する。
【０２３８】本発明のさらに他の実施態様に於いては、
ＣＮＴＦタンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導
体を神経系の疾患および障害を診断するのに使用でき
る。特別の実施態様に於いては、これは限定を意味する
のではないが、ＣＮＴＦレセプター発現異常、従ってあ
りうる組織または細胞のＣＮＴＦに対する応答の異常を
同定するために、標識したＣＮＴＦタンパク質またはペ
プチドフラグメントを用いて、ＣＮＴＦレセプターを発
現する組織または細胞を同定することができる。
【０２３９】本発明はまた、液体試料中におけるＣＮＴ
Ｆ量を測定するための免疫学的アッセイをも提供する。
この方法は、第１の抗−ＣＮＴＦ抗体を固形支持体に結
合させ、この結合された第１の抗体を、第１の抗体のＣ
ＮＴＦへの結合を可能にする条件下にＣＮＴＦを含有す
る溶液に露出させ、そして次に第１抗体に結合したＣＮ
ＴＦを、ＣＮＴＦの第２抗体への結合が可能な条件下
に、好ましくは第１の抗−ＣＮＴＦ抗体以外のＣＮＴＦ
エピトープに対する第２の抗−ＣＮＴＦ抗体に露出さ
せ、そして次に第２抗体のＣＮＴＦへの結合を蛍光化合
物、または放出性同位体、または酵素、または比色アッ
セイにおいてシグナルを生成しうる物質のような指示物
質に接合された抗−イムノグロブリン抗体への第２抗体
の結合を含むがそれに限定されない当業上知られた技法
を用いて検出することからなる抗体サンドイッチ法であ
る。
【０２４０】本発明の好ましい態様においては、モノク
ローナル抗体ＲＰ３−１２およびＲＰ１２−２をヒトＣ
ＮＴＦのかかる二抗体サンドイッチアッセイに使用でき
る（下記実施例１２参照）。かかる技法はＣＮＴＦレベ
ルを測定するための感度の良いアッセイとして使用で
き、そしてＣＮＴＦ発現における異常と関連した神経学
的障害の診断に使用できる。
【０２４１】（８．２）治療上の応用 本発明はＣＮＴＦをコードする核酸、およびそれらから
生成されるタンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘
導体、並びにＣＮＴＦタンパク質、ペプチドまたは誘導
体に対する抗体に関するが、本発明をＣＮＴＦの発現パ
ターンの変化と関連するかまたはＣＮＴＦまたは抗−Ｃ
ＮＴＦ抗体への暴露から利益を得ることができる神経系
の疾患および障害の治療に利用することができる。
【０２４２】本発明の種々の実施態様に於いては、ＣＮ
ＴＦタンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体
を、神経系が外傷、手術、虚血、感染（例、ポリオまた
はエイズ）、代謝性疾患、栄養不足、悪性腫瘍、有毒薬
剤またはまだ知られていない原因による変性性疾患によ
って損傷を受けた患者に投与することができる。本発明
の種々な詳細な実施態様に於いては、例えば、外傷、梗
塞、感染、変性性疾患または外科的障害によって損傷を
受けた脊髄ニューロンにＣＮＴＦを投与することができ
る。実施例５は脊髄ニューロンの生存促進に於けるＣＮ
ＴＦの使用について説明する。
【０２４３】本発明のＣＮＴＦ核酸、ペプチドおよび誘
導体は運動ニューロンの障害の治療に用いることができ
る。実施例６は切断された顔面神経の運動ニューロンの
生存促進におけるＣＮＴＦの著しい有効性を示す。従っ
て、本発明の特定の実施態様に於いては、ＣＮＴＦまた
はそれに由来するペプチドまたは誘導体をベル麻痺（顔
面神経に関する麻痺）並びに他の運動系の疾患の治療に
用いることができる。ここで、このような疾患には筋萎
縮性側索硬化症、進行性脊髄性筋萎縮症、進行性球麻
痺、原発性側索硬化症、および幼児型筋萎縮症（ウェル
ドニッヒ・ホフマン病およびクーゲルバーグ−ウェラン
ダー（Ｋｕｇｅｌｂｅｒｇ−Ｗｅｌａｎｄｅｒ）病）、
およびポリオ後症候群が包含されるがそれらに限定され
ない。
【０２４４】脊髄の腹側角中における運動ニューロンの
変性および死が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；Ｌｏｕ
Ｇｅｈｒｉｇ病）、脊髄損傷および関連疾患における病
理生理学的過程の主要局面である。下記実施例５および
９の結果は、ＣＮＴＦがこれら疾患の治療において脊髄
運動ニューロンの生存を高めそしてコリン作動性発現を
促進しうることを示している。
【０２４５】さらに、下記実施例１３に示されるデータ
により支持されるように、塩基性線維芽細胞増殖因子ま
たは最も好ましくはＣＮＴＦおよび塩基性線維芽細胞増
殖因子を含有する医薬組成物を運動ニューロンの生存の
促進に使用でき、かつ前記運動ニューロン疾患の治療に
使用できる。
【０２４６】また、本発明を例えば、多発性単神経障害
やインポテンスのような糖尿病性神経障害を患う患者の
回復を促進するのに用いることができる。本発明の他の
実施態様に於いては、ＣＮＴＦタンパク質またはそれに
由来するペプチドフラグメントまたは誘導体を用いて先
天性状態または神経変性性障害を治療することができ
る。これらには、アルツハイマー病、老化、末梢神経障
害、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病および運動ニ
ューロンの疾患および障害が包含されるがそれらに限定
されない。本発明を用いて特に、コリン作動性ニューロ
ン機能障害に関連する先天性または神経変性障害を治療
することができる。アルツハイマー病は前脳基底部にお
けるコリン作動性ニューロンの選択的損失に関係がある
ことが示されており、パーキンソン病患者の約３５パー
セントがアルツハイマー型痴呆を病むことが示されてい
る。本発明により生成されたＣＮＴＦがこの症候群に対
する有用な単一薬剤療法であることが判明しよう。同様
に、本発明により生成されたＣＮＴＦを治療に用いて、
ダウン症候群とともにアルツハイマー病を治療すること
ができる。本発明により生成されたＣＮＴＦは、様々な
痴呆並びに先天性学習障害の治療に使用できる。
【０２４７】下記実施例１０および１１に例示するよう
に、ＣＮＴＦはＧＡＢＡとり込み増大、ニューロンフィ
ラメントタンパク質およびＧＡＤ酵素の発現増大、ＧＡ
ＢＡ作動性ニューロンの生存増大、海馬ニューロンの生
存増大、および海馬星状細胞の生存増大を含む海馬細胞
に及ぼす多数の活性を示すことが観察されている。従っ
て、本発明の種々の態様においては、ＣＮＴＦはこれら
の作用をインビトロまたはインビボで海馬細胞に及ぼす
のに使用でき、そしてアルツハイマー病、梗塞および毒
性障害を含むがそれらに限定されない、海馬が関与する
神経学的障害の治療に使用できる。
【０２４８】本発明のＣＮＴＦ、ＣＮＴＦペプチド、抗
体、または誘導体は、神経系組織から生じた腫瘍の治療
に使用することもできる。このような腫瘍には膠芽腫お
よびメラノーマが包含され、後者は神経堤由来メラノサ
イトから生ずる。
【０２４９】損傷を受けた神経の近傍に植え込むことが
できるシラスティック膜のような膜、ゲル、またはフォ
ームへの吸着によってＣＮＴＦ−関連ペプチドまたはＣ
ＮＴＦタンパク質を投与するのが望ましいであろう。本
発明の詳細な実施態様に於いては、アルツハイマー病、
筋萎縮性側索硬化症および他の運動ニューロン疾患（例
えば、ウェルドニッヒ・ホフマン病を包含する）、およ
びパーキンソン病の治療に際してＣＮＴＦタンパク質、
ペプチドフラグメントまたは誘導体の投与を、組織、ま
たは他の徐放性組成物（極小球、マイクロカプセル、ま
たは合成インプラントを包含する）の外科的移植ととも
に用いることができる。
【０２５０】さらに別の実施態様に於いては、ＣＮＴＦ
タンパク質、フラグメントまたは誘導体を他のサイトカ
インと使用して、望ましい神経栄養効果を達成すること
ができる。限定するためではなく例を挙げると、本発明
にしたがって、ＣＮＴＦをＮＧＦとともに使用して、ニ
ューロンの成長および生存に刺激効果を与えることがで
きる。ＣＮＴＦが、中枢および末梢神経系の広範なニュ
ーロンサブ集団の増殖、発達および生存に関してまだ十
分には性質が解明されていない他のＣＮＳ由来ペプチド
因子と相乗作用する可能性のあることが想像される。
【０２５１】さらに、ＣＮＴＦ分子の完全な性質解明に
基づいて、ＣＮＴＦの生物学的機能の一部または全体の
アゴニストまたはアンタゴニストとして作用することが
できるＣＮＴＦの新規ペプチドフラグメント、誘導体ま
たは突然変異体を開発することができる。
【０２５２】本発明のさらに別の実施例に於ては、ＣＮ
ＴＦタンパク質、またはそのペプチドフラグメントまた
は誘導体に対する抗体は種々の神経学的障害および疾病
に罹患してかかる治療を要する患者に投与することがで
きる。例えば、ＣＮＴＦの過剰生産を病む患者はかかる
治療を必要とするであろう。抗−ＣＮＴＦ抗体は感覚性
ニューロンの異常再生（例えば、術後に）を防ぐため
に、または慢性痛症候群の治療に用いることができる。
【０２５３】（８．３）医薬組成物 本発明の活性組成物は、タンパク質、ペプチドフラグメ
ントまたはそれらから生成される誘導体を包含するＣＮ
ＴＦ遺伝子産物の全体または一部分、またはＣＮＴＦタ
ンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体に対する
抗体（または抗体フラグメント）、またはＣＮＴＦとＮ
ＧＦのような第二の薬剤の組合せを包含でき、そして食
塩水、緩衝食塩水、デキストロースおよび水を包含する
がそれに限定されない任意の滅菌生体適合性薬剤担体中
で投与することができる。
【０２５４】ＣＮＴＦタンパク質、ペプチドフラグメン
トまたは誘導体は実質的に図１（ラット）または図８
（ヒト配列）に示されるアミノ酸配列またはそのサブ配
列を含んでなることができる。ＣＮＴＦは任意の好適な
種のＣＮＴＦ遺伝子に相当する配列から誘導することが
でき、これらの種にはヒト、ブタ、ラット、ニワトリ、
ウシ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、ウサギなどが包含さ
れるがそれらに限定されない。
【０２５５】特定の疾患または状態の治療に有効であろ
うＣＮＴＦタンパク質、ペプチドフラグメント、誘導
体、または抗体の量は、その疾患や状態の性質による
が、標準的な臨床技法によってこれを決定することがで
きる。可能ならば、最初に、たとえば上記のＣＮＴＦバ
イオアッセイ系のようなインビトロで、そして次に有用
な動物モデル系で、さらにその後ヒトでテストして、用
量応答曲線および本発明の医薬組成物を決定するのが望
ましい。インビトロデータに基づけば、本発明の詳細な
実施態様に於ては、毛様体神経節ニューロンの生存を促
進するのに有効な医薬組成物は約２μｇ／ｍｌの局所的
ＣＮＴＦタンパク質濃度を付与できる。本発明の付加的
な詳細な実施態様に於ては、コリン作動性ニューロンの
成長および生存を促進するのに有効な医薬組成物は、ミ
リタッター当り約４０栄養単位の局所的ＣＮＴＦタンパ
ク質濃度を付与することができる。
【０２５６】導入方法は内皮、筋肉内、腹腔内、静脈
内、皮下、経口および鼻内を包含するがそれらに限定さ
れない。さらに、本発明の医薬組成物は、脳室内および
硬膜内注射を包含する任意の適当な経路で中枢神経系に
導入するのが望ましい。例えば、Ｏｍｍａｙａ貯留器の
ような貯留器に接続された脳室内カテーテルによって脳
室内注射を容易にすることができる。
【０２５７】さらに、本発明の医薬組成物を治療が必要
な領域に局所的に投与することが望ましい。限定するた
めでなく例として挙げると、手術中の局所注入により、
注射により、カテーテルを用いて、またインプラントを
用いてかかる投与を行うことができる。ここで該インプ
ラントはシアラスティック膜のような膜または繊維を包
含する多孔質、非多孔質、またはゼラチン状の物質から
なる。
【０２５８】本発明はまた、リポゾーム、微粒子または
マイクロカプセルを介して投与されるＣＮＴＦタンパク
質、ペプチドフラグメントまたは誘導体を含んでなる医
薬組成物も提供する。本発明の種々の実施態様に於て
は、かかる組成物をＣＮＴＦおよびＣＮＴＦ−関連産物
の徐放を達成するために使用することは有用でありう
る。
【０２５９】ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦ−関連物質、ＣＮＴＦ
−アンタゴニスト、またはＣＮＴＦ−アゴニスト、抗−
ＣＮＴＦ抗体を活発に生産する細胞を、ＣＮＴＦ濃度の
増大または低下が必要な領域に導入することが可能であ
ろうと考えられる。
【０２６０】（８．４）本発明の分子プローブを新規Ｃ
ＮＴＦ−相同分子の同定に使用することができる ニワトリ胚眼、ラット座骨神経、損傷を受けた脳組織、
心臓細胞、神経芽細胞腫細胞上清（Ｈｅｙｍｎｎｓおよ
びＵｎｓｉｃｋｅｒ，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７７５８−７７
６２）および副腎髄質細胞（Ｕｎｓｉｃｋｅｒら、１９
８５，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．６０：１２７−１
３２）を包含する種々の種および組織の中から、ＣＮＴ
Ｆ様活性を示すが分子量の異なる分子が同定されてい
る。これらのうちの幾つかがここで記載するＣＮＴＦと
同一であるかまたは異なるのかはわからない。ＣＮＴＦ
の別の起源および種類が発見される可能性がある。本発
明の組換えＤＮＡ分子、または本発明のＣＮＴＦタンパ
ク質またはペプチドフラグメントに対する抗体を用い
て、新規ＣＮＴＦ−相同性分子を特性決定することがで
きる。
【０２６１】限定するためではなく例として挙げると、
ＣＮＴＦをコードする組換えＤＮＡ分子をプローブとし
て用いて、第１および８図に示すＣＮＴＦ分子と相同で
あるが同一では新規分子を同定できる。これらの相同分
子はＣＮＴＦ活性を示すかも知れないかもしれないし示
さないかもしれない。そして第１および８図に示した分
子と比較して同一のまたは異なるゲノム配列から生じる
可能性がある。これらの新規分子は、第１または８図に
示すＣＮＴＦコード配列の一部分をオリゴヌクレオチド
プライマーとして用い、鋳型としてはＣＮＴＦ相同物を
発現すると考えられる細胞由来のゲノムＤＮＡまたはＲ
ＮＡのいずれかを用いるＰＣＲ反応で同定できる。同様
に、ＣＮＴＦ相同タンパク質を合成するリポゾームを沈
澱させるのに、抗−ＣＮＴＦ抗体を使用できよう。次に
このようにして集められたＲＮＡに、本発明のオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅にかけること
ができる。この方法を用いて、多数のＣＮＴＦ−関連分
子を同定しクローン化できると考えられる。
【０２６２】
【実施例】（実施例１．ラット毛様体神経栄養因子（Ｃ
ＮＴＦ）の分子クローニング、発現および領域分布） （１）材料および方法 （１．１ ＣＮＴＦの精製およひ切断）ＣＮＴＦは記載
（Ｓａａｄａｔら、１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．，１０８：１８０７−１８１６）のようにして精製
した。さらに調製用ポリアクリルアミドゲルから電気的
に溶出した後、ＣＮＴＦを７．７５×１００ｍｍ Ｂａ
ｋｅｒｂｏｎｄ Ｇｏｌｄ Ｃ４ Ｗｉｄｅｐｏｒｅカ
ラムにかけ、０．１％トルフルオロ酢酸および０から６
０％グラジェントのアセトニトリルを用いて溶出した。
生物学的に活性なタンパク質はアセトニトリル５０から
５５％の単一ピークで溶出した。精製ＣＮＴＦ４μｇの
２Ｄ−ゲル分析（一次元目はｐＨ勾配３．５−１０．０
の等電点電気泳動からなり、二次元目は１２％ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動からなる）において、こ
のタンパク質が単一スポットとして移動することが示さ
れた（Ｓａａｄａｔ，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．，１０８：１８０７−１８１６）（第２図）。Ｂａ
ｋｅｒｂｏｎｄ Ｇｏｌｄ Ｃ４ Ｗｉｄｅｐｏｒｅカ
ラム上での付加的な精製工程にかけなかったＣＮＴＦの
２Ｄ−ゲル分析を平行して行った。
【０２６３】ＣＮＴＦを含有する単一ピークをアルゴン
で空気を追い出したＳｐｅｅｄ Ｖａｃで濃縮した。Ｃ
ＮＴＦ活性の損失を防ぐためにはアルゴンが重要である
ことが判明した。この活性損失は一またはそれ以上のメ
チオニン残基の酸化によって生じる。ＢＲＣＮによる切
断には、ギ酸（最終濃度７０％）およびＢＲＣＮ（１０
％）を３０μｇの精製ＣＮＴＦに添加した。室温で３時
間後、５００μｌの水を添加して５０μｌまで濃縮し、
そしてただちにＢａｋｅｒｂｏｎｄ ＧｏｌｄＣ４ Ｗ
ｉｄｅｐｏｒｅカラムに添加した。トリプシン分解に
は、３０μｇのクロマトグラフィー精製ＣＮＴＦを乾燥
し、１０ｍＭ ＣａＣｌ２および３μｇＴＰＫ−処理ト
リプシン（Ｓｉｇｍａ）を含有する５０μｌの０．１Ｍ
ＴＲＩＳ／ＨＣＬ（ｐＨ８．０）に再溶解しそして３
７℃で一夜インキュベートした。生成するフラグメント
をＢａｋｅｒｂｏｎｄ Ｇｏｌｄ Ｃ４ Ｗｉｄｅｐｏ
ｒｅカラムに負荷して同一条件で溶離した（流速１ｍｌ
／分、０−６０％アセトニトリルグラジェント、６０分
間、２１４ｎｍで検査）。ピークを手作業で集めた。そ
のペプチドのアミノ酸配列は、自動化Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓシークエンサーを用いて決定した
（Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎら、１９８８，Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓ，９：８３０−８３８）。
【０２６４】精製ＣＮＴＦのアミノ酸組成は５μｇのＣ
ＮＴＦの加水分解およびニンヒドリンとの誘導体形成に
よって決定した（Ｔｓｕｇｉｔａら、１９８７，Ｂｉｏ
ｌｃｈｅｍ．，１０２：１５９３−１５９７）。
【０２６５】（１．２ ｃＤＮＡ ＣＮＴＦクローンの
生成）ｃＤＮＡは、オリゴプライマー５（オリゴヌクレ
オチドプライマーは第１Ｃ図に示す）および逆転写酵素
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）を用いて培養ラット星状細胞の全ＲＮＡ
から合成した（Ｏｋａｙａｍａら、１９８７，Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３−２９）。ｃＤＮ
Ａの最初の鎖はＰＣＲを用いるＣＮＴＦの特異的セグメ
ントを増幅させるための鋳型として用いられた（Ｓａｉ
ｋｉ ら、１９８８，Ｓｃｉｎｃｅ，２３９：４８７−
４９１）。クローンＡを縮重プライマー−オリゴ１およ
び２を用いて生成させ、そしてＰＣＲ産物をオリゴ１１
で同定し、サブクローニングしそして配列決定した。こ
の部分的なクローンの配列を用いて、記載された方法
（Ｆｒｏｈｍａｎｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８９９８−
９００２）に従いｃＤＮＡ末端増幅のためのプライマー
３および４を合成した。得られたｃＤＮＡをＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ベクターにサブクローニングしそし
て配列決定した（クローンＢおよびＣ）。オリゴヌクレ
オチド７はゲノムクローンの配列から誘導した（Ｃａｒ
ｒｏｌ，未発表結果）。このプライマーを用いて、クロ
ーンＣと同じＲＡＣＥプロトコールを用い、クローンＤ
を生成させた。真核生物細胞における発現のための完全
な長さのｃＤＮＡクローンは、プライマー９および１０
をＰＣＲに用いて得られた。
【０２６６】（１．３ ノーザンブロット分析）グアニ
ジニウムチオシアネート抽出法（Ｃｈｏｍｃｚｙｓｋ
ｉ，Ｐ．およびＳａｃｃｈｉ，Ｎ．，１９８７，Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｌｃｈｅｍ．，（１６２：１５６−１５９）
を用いて、ＲＮＡを種々のラット組織から抽出した。等
量の全ＲＮＡ（筋肉由来のｍＲＮＡが５０μｇである以
外３０μｇＲＮＡ）をグリオキシル化しそして１．２％
アガロースゲルで電気泳動した（Ｌｉｎｄｈｏｌｍら、
１９８８，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１６３４８−
１６３５１）。ラットの座骨神経に於けるＣＮＴＦ ｍ
ＲＮＡの発達上の発現を評価するために、ラット座骨神
経由来の２５μｇの全ＲＮＡを上記のようにして電気泳
動した。第４（ｂ）図のＰ０，Ｐ４およびＰ１３は、そ
れぞれ新生、４日齢、および１３日齢ラットの座骨神経
由来ＲＮＡを表す。予め量のわかっている８４７ｂｐ
ＣＮＴＦ転写物（リボプローブシステム、ＰＲＯＭＥＧ
Ａを用いてインビトロで合成）も同時に別のレーンで電
気泳動し、それによって試料中のＣＮＴＦ−ｍＲＮＡの
定量ができるようにした。電気泳動後、ＲＮＡをナイロ
ンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）
にバキュームブロットし、そのフィルターをＣＮＴＦの
コード領域（６００ｂｐ）に関する二本鎖３２Ｐ−標識
ｃＤＮＡプローブを用いて５０％ホルムアミド中５０℃
でハイブリッド形成させた（Ｌｉｎｄｈｏｌｍら、上
記）。続いて、このフィルターを洗浄し、Ｘ線フィルム
に６０時間暴露させそしてオートラジオグラムを撮影し
た。
【０２６７】（１．４ 組換えＣＮＴＦの発現）サイト
メガロウイスルプロモーター（Ｄａｖｉｄ ＲｕｓＳｅ
ｌｌ氏から贈与）を有する発現ベクターを、両方向での
完全長ＣＮＴＦクローンのサブクローニングに使用し
た。ＨｅＬａ細胞は、ニワトリ胚毛様体ニューロンの生
存促進活性の何ら基本的発現が検出できなかったので、
これをトランスフェクションに用いた。各培養皿（直径
１００ｍｍ）をＤＥＡＥデキストラン法により１０μｇ
のベクターでトランスフェクションした（Ｓｐａｎｄｉ
ｄｏｓ，Ｄ．Ａ．およびＷｉｌｈｉｅ，Ｎ．Ｍ．，１９
８４，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎ
ｓｌａｔｉｏｎ−−ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ，１−４８）。４８時間培養後、上清を除去し、
細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄しそして３０ｍＭＮａＣｌ含
有５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に溶解させた。
溶解物は超遠心分離（１００，０００×ｇ，３０分）
後、タンパク質濃度を測定し、そして種々の濃度のその
上清を培養Ｅ８−毛様体ニューロンに加えた。既述（Ｈ
ｕｇｈｅｓら、１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３５：７０
−７３）のようにして２４時間培養後、生存ニューロン
を計数した。第３図の各点は三回の測定の平均を示し、
棒線は標準誤差を示す。
【０２６８】（２ 結果） （２．１ ＣＮＴＦアミノ酸配列の決定）ＣＮＴＦを上
記のようにしてラット座骨神経から精製した。アミノ酸
定量には、臭化シアン（ＢＲＣＮ）およびトリプシンフ
ラグメント（Ｎ末端がブロックされている）の生成、さ
らにＢａｋｅｒｂｏｎｄ Ｇｏｌｄ精製工程が必要であ
った。気相微量配列決定によって決定された種々のフラ
グメントのアミノ酸配列は、全配列の５０％以上に相当
し、ｃＤＮＡから推定される配列と完全に一致する。こ
れらの配列をヌクレオチド配列とともに図１に示す。精
製ＣＮＴＦのアミノ酸組成を第１（ｄ）図に示す。
【０２６９】（２．２ ＣＮＴＦ ｃＤＮＡクローンの
生成および配列分析）ラット脳星状膠細胞培養物を分子
クローニングのＲＮＡ源として用いた。これらの細胞は
以前に相当量のＣＮＴＦを生産することが明らかにされ
ている（Ｌｉｌｌｉｅｎら、１９８８，Ｎｅｕｒｏｎ，
１：４８５−４９４）。種々のＰＣＲ工程（プライマー
として、上記（２．１）節に記載のようにして得られた
アミノ酸配列データから誘導した合成オリゴヌクレオチ
ドを使用）の後、 クローンＡ、Ｂ、Ｃのヌクレオチド
配列は、７７ｂｐの短い５’非翻訳領域および６００ｂ
ｐの解読枠を示し、このことはポリ（Ａ）尾部で終わる
４３６ｂｐの３′非翻訳領域を有する２００アミノ酸か
らなるタンパク質を予測させた。解読枠が一致する翻訳
開始部位は一つのヌクレオチド配列の７８−８０位に存
在した。この開始部位の５’側の７２−７４位にある終
止コドンおよび７５と８１位のＧは、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．
Ｊ．（１９８９，ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０８：２２９−
２４１）による好都合な翻訳開始部位の要件を満たして
いる。６７８−６８０位にある終止コドンはペプチドＣ
Ｂ２のコード配列の後にある。微量配列決定によって同
定された最後のアミノ酸はホモセリンであり、このこと
は、ヌクレオチド配列から予想されるメチオニンが翻訳
後に修飾されていたこと、そしてそれがＣ−末端である
ことを示している。
【０２７０】予想される配列の１３および１４位の二塩
基性（Ａｒｇ−Ａｒｇ）配列は翻訳後切断部位である可
能性を示すが、精製ＣＮＴＦのアミノ酸組成（図１
（ｄ）図）は、かかる切断を否定する。Ｎ−末端領域に
存在するア ミノ酸フェニルアラニン、アルギニンおよ
びアラニンは、この領域に存在しない他のアミノ酸
（例、イソロンシン）と比べて減少してはいない。さら
に、２００アミノ酸配列の予想分子量（２２．８ＫＤ）
はＰＡＧＥ分析から算出した値（２２．５ＫＤ）と完全
に一致する（Ｓａａｄａｔら、上記）。従ってＣＮＴＦ
のアミノ酸配列は、細胞質ゾルタンパク質の特徴を示
す、すなわちシグナルペプチドおよびグリコシル化のた
めのコンセンサス配列を何ら有せず、そして１７位に唯
一のシステイン残基を有する。決定したＣＮＴＦ配列と
ＦＩＲおよびＥＭＢＬデータベースの配列とを比較して
も、いかなる他の既知タンパク質とも有意な類似性を示
さなかった。特に、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神
経栄養因子（ＢＤＮＧ）、または線維芽細胞増殖因子
（ＦＧＦ）およびプリプリン（Ｐｕｒｐｕｒｉｎ）との
相同性は存在しなかった。これらはそれぞれＣＮＴＦと
類似した生存活性に関わる（Ｕｎｓｉｃｋｅｒら、１９
８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．８４：５４５９−５４６３；Ｓｃｈｕｂｅｒｔ
ら、１９８６，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１０２：２２
９５−２３０１）。
【０２７１】（２．３ 組換えＣＮＴＦ発現）完全な長
さのｃＤＮＡクローンがＨｅＬａ細胞内で発現された結
果、活性なＣＮＴＦが発現されたが、培地中には放出さ
れなかった（第３図）という観察によって、ＣＮＴＦが
細胞質タンパク質であるという可能性が支持された。そ
れゆえ、ＣＮＴＦは細胞上に深在性の影響を及ぼすが細
胞質ゾルタンパク質であるＦＧＦおよびインターロイキ
ン−１（ＩＬ−１）に類似した分子であると思われる。
ＦＧＦに関しては、放出メカニズムは確立されていない
（Ａｂｒａｈａｍら、１９８６，Ｓｃｉｎｃｅ，２３
３：５４５−５４８）。対照的にＩＬ−１は、特異的酵
素（コンバーターゼ）による切断の後、通常とは異なる
メカニズムによって刺激を受けたマクロファージから放
出されることが示されている（Ｋｏｓｔｕｒａら、１９
８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．８６：５２２７−５２３１）。とりわけ興味深
いのは、巨大分子が哺乳動物細胞に於ける多剤耐性糖タ
ンパク質と構造的な相同性を示す担体によって酵母の細
胞質ゾルから運び出される可能性があるという最近の発
現である（ＭｃＧｒａｔｈおよびＶａｒｓｈａｋｙ，１
９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：４００−４０４）。こ
の糖タンパク質も哺乳動物細胞に於てタンパク質担体と
して作用しうるか否かはまだ確立されていない。
【０２７２】（２．４ ノーザンブロット分析）成体ラ
ットの組織に於けるＣＮＴＦ−ｍＲＮＡ分布のノーザン
ブロット分析（第４図）では、分子量で約１．２ｋｂの
単一バンドが示された。断然最強のシグナルが座骨神経
のノーザンブロット中に存在しそして脊髄抽出物には弱
いバンドが存在した。しかしながら、筋肉および皮膚に
は検出可能なシグナクは存在しなかった。すなわち５０
μｇの全ＲＮＡ中にＣＮＴＦ−ｍＲＮＡは＜２ｐｇであ
った。筋肉および皮膚の低レベルのＣＮＴＦ−ｍＲＮＡ
は、座骨神経に存在する大量のＣＮＴＦが、ＮＧＦの場
合におけるように末梢から逆行して選ばれたＣＮＴＦを
表わすものでなく、局所的に合成されたＣＮＴＦである
ことを示している。さらに、ＣＮＴＦ−ｍＲＮＡ発現の
発達上の時間的経過はＮＧＦのそれと異なる（Ｔｈｏｅ
ｎｅｎら、１９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌ．，１０９：１４５−１７８）。ＣＮＴＦ−ｍＲＮ
Ａは新生ラットの座骨神経中には検出されず、３日目で
はじめて現れてくる（第４図（ｂ）図）。標的により調
節されたニューロン細胞死はＣＮＴＦ合成の増加が始ま
る時までには既に終わっているので、ＣＮＴＦ−ｍＲＮ
Ａ発現の発達上の時間的経過ではＣＮＴＦが周産期にお
けるニューロン生存の調節に関与しないことを示唆して
いる（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，１９８６，Ｊ．Ｃｏｍｐ．
Ｎｅｕｒｏｌ．２４６：２８１−２８６；Ｊｏｈｎｓｏ
ｎら、１９８０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１０：９１６−９
１８）。
【０２７３】（３ 考察）上記のＣＮＴＦ精製法はアミ
ノ酸配列決定に適したＣＮＴＦを調製する手段を初めて
提供するものである。最終段階のＢａｋｅｒｂｏｎｄ
Ｇｏｌｄ Ｃ４Ｗｉｄｅｐｏｒｅカラムによる精製がな
いと、第２（ａ）図に示されるようにＣＮＴＦ調製物中
に多くのペプチドの混入がある。しかしながら、Ｂａｋ
ｅｒｂｏｎｄ Ｇｏｌｄ Ｃ４ Ｗｉｄｅｐｏｒｅ Ｆ
ＰＬＣ／ＨＰＬＣカラムでの精製後には、ただ一つのス
ポットが２Ｄゲル電気泳動により同定され（第２図
（ｂ）図）、このことは事実上完全な精製であることを
示している。Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ Ｇｏｌｄ Ｃ４ Ｗ
ｉｄｅｐｏｒｅカラムが有効であることが判明する以前
は、ＣＮＴＦ精製のために 多数のＨＰＬＣカラムの使
用が試みられて不成功に終わったことは注目すべきであ
る。金被覆の不活性な性質がＣＮＴＦ精製を容易にした
と仮定される。
【０２７４】ＣＮＴＦ活性はもともとインビトロのニワ
トリ毛様体ニューロンに関する生存因子として特徴付け
られたが（Ａｄｌｅｒら、１９７９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２０４：１４３４−１５３６２）、もっと最近になっ
て、ニワトリまたはラット組織のいずれに由来するＣＮ
ＴＦも、ＣＮＴＦとして記載される活性は、種々の他の
種類のニューロン細胞の生存を促進することが示されて
おり（Ｂａｒｂｉｎら、１９８４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈ
ｅｍ．，４３：１４６８−１４７８；Ｍａｎｔｈｏｒｐ
ｅら、１９８６，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，３６７：２８
２−２８６）、そしてラット座骨神経ＣＮＴＦはその精
製を遮断することにより、およびバソインテスティナル
ペプチド（ＶＩＰ）免疫反応性およびコリンアセチルト
ランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）活性を誘導することによ
って（Ｅｒｎｓｂｅｒｇｅｒら、１９８９，Ｎｅｕｒｏ
ｎ ２：１２７５−１２８４）Ｅ７ニワトリ交感神経ニ
ューロンおよび新生ラット交感神経鎖神経節ニューロン
（Ｓａａｄａｔら、１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．１０８：１８０７−１８１６）の分化に影響を及ぼ
すことが示されている。さらに、精製ラット座骨神経Ｃ
ＮＴＦは、インビトロで、二つの可能性を持つ０２Ａ前
駆細胞の２型星状細胞への分化を促進した（Ｈｕｇｈｅ
ｓ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３５：７０−７３）。
ＣＮＴＦが、インビボで、もしあるとすればこれらの機
能のうちどれを発揮するのかを確認するのを助けるため
に、その一次構造、細胞発現、発達調節および存在場所
を決定する必要がある。ｃＤＮＡにより推定されるアミ
ノ酸配列、続いてＨｅＬｅ細胞における完全な長さのｃ
ＤＮＡクローン発現により今やＣＮＴＦが細胞質ゾルタ
ンパク質であることが示される。このことは、ＣＮＴＦ
の領分的分布および発達上の発現と一緒になって、ＣＮ
ＴＦが標的由来神経栄養因子ではないかもしれないこと
を示唆している。このように、ＣＮＴＦは細胞の損傷ま
たは未知の放出メカニズムのいずれかによって利用可能
になった後に初めて神経栄養性質および分化性質を示す
と思われる。
【０２７５】要約すると、ＣＮＴＦは既知の神経栄養因
子ＮＧＦおよびＢＤＮＦとは以下の点で異なる、すなわ
ち既知の構成的な放出機構がないこと、発達期間中の発
現の時間的経過、および領域分布の点である。ＣＮＴＦ
は分化因子として生理学的役割を有すると考えられ、そ
の神経栄養機能はおそらく胚発達の期間ではなくむしろ
病態生理学的状態のもとで発揮されるのであろう。
【０２７６】（実施例２：エシェリヒア・コリに於ける
ＣＮＴＦの発現） （１ 材料および方法） （１．１ ＣＮＴＦ発現ベクターの作製）ラットＣＮＴ
Ｆ（ｒＣＮＴＦ）遺伝子の５’末端を包含する配列に相
補的な合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
および反対側のＤＮＡ鎖で遺伝子の３’末端を包含する
配列に相補的な第二のプライマーを用いて、ｒＣＮＴＦ
遺伝子を発現ベクターｐＣＰ９３に挿入した。両方のプ
ライマーは制限酵素ＢｓｐＭＩの認識配列を包含するよ
う設計され、それらの配列を以下に示す。 ５’ＣＡＧＴＴＡＣＣＴＧＣＧＧＧＧＡＴＧＧＣＴＴＴ
ＣＧＣＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＣ ３’ ５′ＣＡＧＡＧＧＴＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣ
ＡＴＣＴＧＣＴＴＡＴＣＴＴＴＧＧ ３’。
【０２７７】これらのプライマーは、鋳型としてｐＣＭ
Ｖ−ｒＣＮＴＦ −Ｃ−１ ＤＮＡを用い、市販のキッ
トを用いた標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
おいて、６％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動およ
びそれに続く電気的溶出によって精製された数マイクロ
グラムの６３７ｂｐフラグメントを生成した。溶出され
たフラグメントを次にＢｐｓＭＩで消化し、そして生成
する６１９ｂｐフラグメントを同じ方法で再び精製し
た。突出したＢｐｓＭＩ末端をクレノウＤＮＡポリメラ
ーゼを用いる標準的な反応でブラントとなした後そのフ
ラグメントを、標準的な反応でＳ１ヌクレアーゼ処理に
よってすでにブラントにしてあるｐＣＰ９３ベクターの
特有のＳａＩＩ制限部位に連結させた。
【０２７８】（１．２ ＣＮＴＦ発現ベクターを含有す
る細菌の同定）コンピテントなエシェリヒア・コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０ｉｑＦ細胞を上記の連結さ
れたＤＮＡによって形質転換し、プラスミドの大きさで
スクリーニングし、続いて制限分析および標準的方法を
用いるＤＮＡ配列決定によって特性決定した（Ｐａｎａ
ｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ．，１９８７，Ｉｎ Ｐｌａｓｍｉ
ｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈ
ａｒｄｙ，Ｋ．Ｇ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ）。
【０２７９】（２ 結果と考察）プラスミドの一つ（ｐ
ＣＰ−ｒＣＮＴＦ−Ｃ−１）は、正しい方向およびベク
ターのリポゾーム結合シグナルと同じ翻訳読み枠で融合
された完全なｒＣＮＴＦ遺伝子を担持することが判明し
た。このプラスミドのコピー数はベクターＤＮＡの１４
００ｂｐの欠失ゆえに親プラスミドより３倍高かった。
【０２８０】Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｉｑＦ−／ｒＣ
ＮＴＦ−Ｃ−１細胞をラクトース存在下の液体培養で増
殖させ（ｒＣＮＴＦ遺伝子によって活性な転写および翻
訳が生じるように）、このＥ．ｃｏｌｉが有意な量（全
細胞タンパク質の２−５％）の生物活性ｒＣＮＴＦを含
有することを見いだした。このことは第４図に示される
ように、８−２５％グラジェントポリアクリルアミドゲ
ルでの電気泳動とそれに続くクマシー染色によって示さ
れた。さらに、タンパク質抽出物を、リゾチーム処理に
続いて凍結融解を三回繰り返すことによって溶解して同
じ細胞から調製した。数マイクロリッターの培養物から
この方法によって抽出されたタンパク質は、インビトロ
で２４および４８時間後に、Ｅ１０ラット毛様体神経節
ニューロンの５０％まで、およびＥ８背根神経節ニュー
ロンの約３０％の生存および神経突起の伸びを促進する
ことが判明した。最大活性は１０ナノグラム以下のｒＣ
ＮＴＦで観察された。ｒＣＮＴＦ遺伝子を持たないプラ
スミドベクターを担持する同じ宿主細胞からの対照抽出
物ではこのような活性はまったく検出されなかった。イ
ントロン配列を工学的に欠失させたヒトＣＮＴＦ配列を
ｐＣＰ９３ベクターに挿入しそしてコンピテントなＥ．
ｃｏｌｉを形質転換するのに使用した。組換えヒトＣＮ
ＴＦ配列を担持する形質転換細菌はヒトＣＮＴＦに適合
する分子量のタンパク質を発現することが判明した。こ
の培養物のタンパク質抽出物はＤＲＧアッセイでＣＮＴ
Ｆ活性を有することが判明した。
【０２８１】（実施例３：ヒトＣＮＴＦ遺伝子のクロー
ニング） （１ 材料および方法） （１．１ ＤＮＡプラスミドおよびファージベクター）
ヒトゲノムＤＮＡはヒト胎盤ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）から得た。ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミドベク
ターはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手した。バクテリオ
ファージベクターＥＭＢＬ−３ ＳＰ６／Ｔ７はＣｌｏ
ｎｔｅｃｈから入手した。
【０２８２】（１．２ ポリメラーゼ連鎖反応）ＰＣＲ
は、試薬キット製造元の指示通りの標準条件で４０サイ
クル行った。各サイクルは、９４℃で１分、４０℃か５
０℃のいずれかで２分、そして７２℃で２分のインキュ
ベーションで構成される。
【０２８３】（２ 結果および考察） （２．１ ヒトＣＮＴＦ遺伝子の存在に関する証拠）Ｅ
ｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化したヒトゲノム
ＤＮＡを厳格な条件下でサザンブロットハイブリッド形
成させると、約１０ｋｂの単一のＤＮＡフラグメントが
ラットＣＮＴＦプローブと弱い相同性を示すことが示さ
れた（第６図、パネルＢ）。推定ヒトＣＮＴＦ遺伝子を
分子クローニングするために、ラットＣＮＴＦ遺伝子の
正確な配列に相当する、対をなすオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いてかかる遺伝子セグメントをポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させる努力がなされ
た。この方法を成功させるためには、ラットおよびヒト
ＣＮＴＦ遺伝子の短いセグメントがＤＮＡ配列に関して
同一であるかまたはほとんど同一であることが必要であ
ろう。
【０２８４】全ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用い、Ｐ
ＣＲによりＤＮＡフラグメント増幅合成を開始する能力
に関して、それぞれ１７から２１塩基までの長さの５対
のオリゴヌクレオチドを検査した。５対のオリゴヌクレ
オチドのすべてがラットＣＮＴＦ遺伝子の第二のエキソ
ン内から選択された。ヒトＣＮＴＦ遺伝子はラット遺伝
子と同様のイントロン−エキソン構造を有するであろう
と仮定された。ＣＮＴＦ．１０およびＣＮＴＦ．１１で
示される一対のプライマーのみがラットＤＮＡ鋳型（２
７０ｂｐ）を用いて同じプライマーで得られるとほぼ同
じ大きさのＤＮＡフラグメントをヒトゲノムＤＮＡから
増幅させた。より高い（もっと厳格な）温度（５０℃）
でＤＮＡ合成が起こるＰＣＲを行った場合は、増幅の程
度が増加しバックグラウンドが低下する現象がみられ
た。ＣＮＴＦ．１０およびＣＮＴＦ．１１の配列は以下
の通りである。
【０２８５】ＣＮＴＦ．１０（３６−マー、アミノ酸Ｅ
ＡＤＧＭＰＡに関しアンチセンス；末端アミノ酸に関し
それぞれ２塩基；多重クローニング部位を有する末
端）。 ５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＧ
ＣＡＴＣＣＣＡＴＣＡＧＣＣＴ−３’ ＣＮＴＦ．１１（３４−マー、アミノ酸ＥＭＴＥＡＴに
関しセンス；末端アミノ酸に関し２塩基；最後にＡ；オ
リゴヌクレオチドの５’末端に多重クローニング部
位）。 ５’−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＧＡＧＡＴ
ＧＡＣＴＧＡＧＧＣＡＧＡ−３’ （ラットＣＮＴＦに相当する配列に下線を付す：付加的
なヌクレオチドを加えて、以後のクローニング工程のた
めの多重クローニング部位を付与した）。
【０２８６】ＰＣＲ反応の産物を２％アガロースゲルで
の電気泳動によって（低い融解温度；Ｎｕｓｉｅｖｅ）
分解した。約２７０ｂｐの陽性バンドを切り出しそして
同じプライマー対を用いる３５サイクルのＰＣＲによっ
て再増幅した（９３℃で３０秒、５０℃で１分、７２℃
で１分）。再増幅したＤＮＡフラグメントを再び２％ア
ガロースゲルでの電気泳動によって精製し、市販のキッ
ト（ＩＢＩの「ＦＡＳＴａｑ」キット）を用いるジデオ
キシヌクレオチドチェインターミネーション法によるＤ
ＮＡ配列決定のための鋳型として用いた。配列決定のた
めのプライマーはＣＮＴＦ．１０およびＣＮＴＦ．１
１、ならびに末端プライマーを用いて得られた最初の配
列データに基づいて選ばれた二つの内部プライマーであ
った。ヒトＤＮＡの増幅されたセグメントの完全な配列
を第６図に示す。その配列は、ラットＣＮＴＦに非常に
よく似ているが同一ではないポリペプチドセグメントに
関する一つの解読枠を含有していた。
【０２８７】（２．２ ＰＣＲにより増幅されたヒトＣ
ＮＴＦ遺伝子フラグメントのクローニング）増幅された
ヒトＣＮＴＦ遺伝子フラグメントは、ＥｃｏＲＩおよび
ＸｈｏＩによる切断および同じ２酵素で切断されたベク
ターＤＮＡへの連結によって、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ
プラスミドベクター中にサブクローニングした。ＤＮＡ
をＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬｌ−Ｂｉｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）のコンピテントな細胞に導入し、そして形質転換
体をアンピシリン耐性で選択した。プラスミドＤＮＡは
標準的な方法によって精製し、挿入されたヒトＤＮＡフ
ラグメントをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切り出し、単
離し、そしてハイブリッド形成用プローブとして用いる
ために標識した。標識化は約２０ｎｇのＤＮＡを鋳型と
して用い、またオリゴヌクレオチド ＣＮＴＦ．１０お
よびＣＮＴＦ．１１をプライマーとして用い、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅ
ｔｕｓ）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および３２
Ｐ−ｄＣＴＰを含有する反応混合物中で、９４℃で１
分、５０℃で２分そして７２℃で３分の６サイクルのＰ
ＣＲを用いて実施した。標識されたフラグメントは標準
的なクロマトグラフィーの方法によって、取り込まれな
かったｄＣＴＰから分離した。
【０２８８】ラットＣＮＴＦプローブを用いてヒトゲノ
ムＤＮＡ中に検出されたＤＮＡフラグメントが、プライ
マーＣＮＴＦ．１０およびＣＮＴＦ．１１を用いるＰＣ
Ｒによって増幅されうる配列を含有するか否か判定する
ために、放射性標識ヒトフラグメントを、ＥｃｏＲＩで
消化したヒトおよびラットゲノムＤＮＡに関するサザン
ブロットハイブリッド形成におけるプローブとして用い
た（第６図パネルａ）。このプローブは約１０ｋｂバン
ドに強くハイブリッド形成し、ラットＣＮＴＦプローブ
と弱くハイブリッド形成したバンドと区別できなかっ
た。逆に、ヒトプローブはラットゲノムＤＮＡ中の約４
ｋｂのバンドに弱くハイブリッド形成し、ラットＣＮＴ
Ｆプローブによって強くハイブリッド形成されたバンド
とは区別できなかった。配列データに加えて、これらの
結果は、ヒトＤＮＡがラットＣＮＴＦ遺伝子の相同物を
含有することを強く示唆している。
【０２８９】（２．３ ゲノムライブラリーからのヒト
ＣＮＴＦ遺伝子のクローニング）上記の放射性標識した
ヒトＣＮＴＦプローブを利用して、バクテリオファージ
ベクターＥＭＢＬ−３ ＳＰ６／Ｔ７に於けるヒトＤＮ
Ａのゲノムライブラリーをスクリーニングした。そのラ
イブラリーは、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３ａで部
分消化して得られたヒト胎盤ＤＮＡのフラグメントをそ
のベクターのＢａｍＨＩ部位に挿入されて含有してい
た。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＬＥ３９２の上にバクテリオファー
ジを塗布し、そして本質的にＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖ
ｉｓ（１９７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０−１
８２）、およびＭａｈｍｏｕｄｉおよびＬｉｎ（Ｍａｈ
ｍｏｕｄｉ，Ｍ．およびＬｉｎ，Ｖ．Ｋ．，１９８９，
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １：３３１−３３３）に
記載される条件下に約７５０，０００個のプラークをそ
のプローブとハイブリッド形成させることによ って二
通りにスクリーニングした。一つの陽性のプラークを同
定し、そして陽性を同定するためにヒトＣＮＴＦプロー
ブとのハイブリッド形成を用いる単一プラーク単離を３
回繰り返すことによって組換えファージを精製した。ヒ
トＣＮＴＦ遺伝子を担持する組換えバクテリオファージ
λｈＣＮＴＦ−Ｇ−１で表わした。さらに分析するため
に、宿主としてＬＥ３９２菌を用いる液体培養で増殖さ
せることにより標準品を調製した。
【０２９０】λｈＣＮＴＦ−Ｇ−１に存在するヒトＣＮ
ＴＦ配列をＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定によってさ
らに分析した。最初に配列決定された２７０ｂｐヒトフ
ラグメント（上記参照）の内部の一対のプライマーを用
いる増幅を使用して、正確なフラグメントが精製ファー
ジクローン中に存在することを確認した。このオリゴヌ
クレオチドはＣＮＴＦ．１３およびＣＮＴＦ．１６（配
列は以下）で表わした。予想通り、鋳型としてλｈＣＮ
ＴＦ−Ｇ−１を用い、そしてこれらのプライマーを用い
たＰＣＲに於て、約１２８ｂｐの生成物バンドが増幅さ
れた。ＰＣＲは９４℃で１分、５０℃で２分、７２℃で
２分からなる３５インキュベーションサイクルとした
以外は前記と同様にして実施した。 ＣＮＴＦ．１３：５’−ＧＣＡＧＣＧＡＣＴＴＧＧＡＧ
ＡＡＧ−３’［アンチセンス］ ＣＮＴＦ．１６：５’−ＴＡＣＣＴＴＣＣＡＴＧＴＴＴ
ＴＧＴＴＧＧ−３’［センス］ （このプライマーも、多重クローン部位のための配列を
含有する５’「末端」を含有した。配列のＣＮＴＦ部分
のみをここに示す）。
【０２９１】λｈＣＮＴＦ−Ｇ−１クローンがＣＮＴＦ
コード配列の５’および３’末端を含有するか否かを判
定するために、ラットＣＮＴＦコード配列の末端に相当
する正確な配列（すなわち縮重なし）のプライマーを用
いてＰＣＲ反応を行った。ヒトゲノムクローン由来のＤ
ＮＡを増幅する能力は、ヒト遺伝子の相当する領域の存
在を示すが、ＤＮＡを増幅できないのはそのクローン由
来のコード配列の末端がないことによるか、またはラッ
トとヒトとの間の配列の相違のいずれかによることに注
意すべきである。
【０２９２】ヒトＣＮＴＦコード配列の可能性のある
５’末端の存在を検査するのに用いられるプライマー
は、ＣＮＴＦ．１３（上記）およびＣＮＴＦ．１４であ
った。後者のオリゴヌクレオチドは、ラットＣＮＴＦコ
ード配列の５’末端に相当する２２塩基を含有し（セン
ス鎖）、そしてまた増幅されたフラグメントの可能なク
ローニングを容易にするために、多数の制限エンドヌク
レアーゼ認識部位を含有する無関係の付加的な配列を
５’−末端に有していた（示されず）。 ＣＮＴＦ．１４ ５’−ＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＡＧＡ
ＧＣＡＡＡＣＡＣ−３’。
【０２９３】ＣＮＴＦ．１３およびＣＮＴＦ．１４オリ
ゴヌクレオチド対を用いると、約１．４ｋｂのフラグメ
ントがλｈＣＮＴＦ−Ｇ−１鋳型から増幅された。これ
は、もしヒトＣＮＴＦ遺伝子がラットＣＮＴＦ遺伝子で
見られるとだいたい同じ分子量（約１ｋｂ）のイントロ
ンを含有するならば、予想通りの分子量である。
【０２９４】ヒトＣＮＴＦ遺伝子の既知の内部配列とコ
ード配列の３’末端の間の領域を同様にして増幅する試
みは成功しなかった。プライマーはＣＮＴＦ．１６（上
記）およびＣＮＴＦ．１５であり、後者はラットコード
配列の３’末端の配列を含有する（アンチセンス）； ＣＮＴＦ．１５ ５’ＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＴＴＡＴＣ
ＴＴＴＧＧ−３’。
【０２９５】クローニングしたヒトＣＮＴＦ遺伝子の部
分について配列分析を行い、ラットＣＮＴＦ遺伝子に対
する類似性を確認したが、コードされたタンパク質にお
ける多数のアミノ酸置換が明らかになった。ヒトＣＮＴ
Ｆコード領域内のＤＮＡ配列分析の結果およびラット配
列との比較を図８に示す。そのデータは、ラットＣＮＴ
Ｆ遺伝子と同じ位置で単一のイントロンを有するヒト遺
伝子と一致する。イントロン−エキソン結合部にまたが
る長い一続きのアミノ酸配列の一致（ＥＳＹＶＫＨＱＧ
ＬＮＫＮ）が存在する。イントロン内では、ヒト配列は
ラットとはかなり異なっており、コード配列が事実上保
存されていることと著しい対比を示した。６アミノ酸の
うち５個がヒトとラットＣＮＴＦの間で異なる一続きの
配列（ヒト：ＨＶＬＬＡＲ；ラット：ＱＧＭＬＴＫ）、
および４個のアミノ酸のうち３個が異なる別の二つの配
列（ヒト：ＴＥＨＳ；ラット：ＡＥＱＴ、４位から７位
まで；および１９６位から１９９位までのヒト：ＮＮＫ
Ｋ；ラット：ＫＱＫＱ；図８（ｂ））が存在する。
【０２９６】（実施例４：ＣＮＴＦ−由来ペプチドフラ
グメントの利用） （１ 材料および方法） （１．１ ペプチドの合成）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ固相ペプチドシンセサイザーでｆ−ｍｏｃ
法を用いてペプチドを合成した。
【０２９７】（１．２ 細胞培養物）ニワトリ胚毛様体
神経節培養物は、記載（Ｈｕｇｈｅｓら、１９８８，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３５：７０−７３）の方法にしたがって
生成および維持された。
【０２９８】（１．３ 免疫化プロトコル）１４アミノ
酸ＣＮＴＦペプチド（ＳＡＬＥＳＨＹＧＡＫＤＫＱ）に
対する抗体を、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシア
ニン）に接合させたそのペプチドを用いてウサギを免疫
することにより調製した。ＫＬＨに結合させるために
は、１４アミノ酸ペプチドをＣｙｓ残基を用いてＣ−末
端側で延長した。ＫＬＨとペプチドの結合は１００倍過
剰のペプチドおよび結合試薬としてのＭＢＳ（ｍ−マレ
イミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエ
ステル）を用いて行われた。フロイント完全アジュバン
ト中の１ｍｇの接合体（ペプチド−ＫＬＨ）でウサギを
追加免疫した。３週間後、ウサギをさらにフロイント不
完全アジュバント中の接合体１ｍｇで追加免疫した。２
週間後、動物を再び追加免疫した。さらに２週間後、動
物から採血しそして、血清を調製した。この血清は免疫
原および精製ラット座骨神経ＣＮＴＦの両者と免疫沈降
することが判明した。
【０２９９】（２ 結果および考察） （２．１ 合成ペプチドに対する抗体のＣＮＴＦ活性中
和能力）飽和量のＣＮＴＦを免疫前の血清または１４ア
ミノ酸合成ペプチド（ＩＳＡＬＥＳＨＹＧＡＫＤＫＱ）
で免疫したウサギ由来の免疫血清のいずれか一方から得
られ、プロテインＡ−セファロースに結合された抗体と
インキュベートした。インキュベーションおよび遠心
後、上清をＥ８ニワトリ毛様体神経節ニューロンの成長
を支持する能力に関してアッセイした。正常なＣＮＴＦ
の用量応答が対照上清中で観察された。抗−ＣＮＴＦペ
プチドフラグメント抗体とのインキュベーション後で
は、ＣＮＴＦ活性は実質的に検出されなかった（図
９）。
【０３００】（２．２ 合成ＣＮＴＦペプチドフラグメ
ントの神経栄養活性）Ｅ８ニワトリ胚毛様体神経節ニュ
ーロンを、ＣＮＴＦ一次配列データから作成された一定
濃度範囲の２８アミノ酸合成ペプチドフラグメントの存
在下に２日間培養し、そしてニューロンの生存を定量し
た。用量−応答関係が、ペプチド濃度と神経栄養活性と
の間で観察された（図１０）。使用したペプチド配列
は、ＭＶＬＬＥＱＫＩＰＥＮＥＡＤＧＭＰＡＴＶＧＤＧ
ＧＬＦＥＫであった。
【０３０１】（２．３ 合成ペプチドに対する抗体がＣ
ＮＴＦ含有細胞を同定する能力）２８アミノ酸ペプチド
に対する抗体を、ラット座骨神経組織の免疫蛍光反応調
査に使用した。この２８アミノ酸ペプチドに対するウサ
ギ抗体をラット座骨神経の固定された切片とインキュベ
ートし次にその神経切片をローダミン標識抗−ウサギＩ
ｇＧ抗体と反応させた。図１１に示されるとおり、軸索
周囲の染色が観察され、このことはＣＮＴＦがシュワン
細胞によって合成されうることを示唆している。さら
に、軸索細胞質に存在する構造物が可視化され（図１
１、小矢印）、このことはＣＮＴＦの軸索での合成また
はＣＮＴＦの軸索への輸送のいずれかと一致しよう。標
識化は過剰なＣＮＴＦペプチド（ＭＶＬＬＥＱＫＩＰＥ
ＮＥＡＤＧＭＰＡＴＶＧＤＧＧＬＦＥＫ）の添加によっ
て遮断できた。
【０３０２】（実施例５：毛様体神経栄養因子は脊髄ニ
ューロン の生存を促進する） （１ 材料および方法） （１．１ 実験動物）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラ
ット（ＨＳＤ）をすべての実験に用いた。妊娠ラットを
二酸化炭素窒息により屠殺しそして胚を速やかにとり出
して氷冷したＰｕｃｋ食塩水Ｇに入れ、さらに切開し
た。
【０３０３】（１．２ 組織培養法）脊髄を妊娠１４日
目のラット胚から無菌的に取り出した。脊髄を延髄に対
して尾側に切り放し、知覚神経節および髄膜を取り除い
た。次にその脊髄を別々に培養するために、腹側および
正中背側セグメントにさらに分割した。脊髄組織を細か
く刻み、そして下記の所定の培地中でバスツールピペッ
ト操作により粉砕して機械的に解離させた。該培地は、
グルコース（３３ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、Ｎａ
ＨＣＯ３（１５ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、イン
スリン（２５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００
μｇ／ｍｌ）、プトレッシン（６０μＭ）、プロゲステ
ロン（２０ｎＭ）、亜セレン酸ナトリウム（３０ｎ
Ｍ）、ペニシリンＧ（０．５μｇ／ｍｌ）、ストレプト
マイシン（０．５μｇ／ｍｌ）、およびウシ血清アルブ
ミン（２．５μｇ／ｍｌ）を添加した５０％イーグル基
礎培地（ＢＭＥ；Ｇｉｂｃｏ）および５０％ハム栄養混
合物Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）から成っていた。粉砕を２回
繰り返し、上清をプールしそしてナイロン（Ｎｉｔｅ
ｘ，Ｔｅｔｋｏ）フィルター（４０μｍ）を通して濾過
した。得られた全細胞数をトリパンブルーの存在下に血
球計数器により測定した。次に解離した腹側細胞をポリ
−Ｄ−リジン（１０μｇ／ｍｌ）を被覆した３５ｍｍ皿
１個当り０．５×１０6細胞の密度で塗布した。解離し
た正中背側の細胞はポリ−Ｄ−リジン（１０μｇ／ｍ
ｌ）、ポリ−Ｌ−オルニチン（１０μｇ／ｍｌ）、また
はラミニンを含有するポリ−Ｌ−オルニチン（５μｇ／
ｍｌ）で被覆した３５ｍｍ皿１個当り１．５×１０６細
胞の密度で塗布した。これらの培養物に対する処理は塗
布時に加えられた。３７℃で９５％空気／５％ＣＯ2雰
囲気下ほぼ１００％の相対湿度で培養物を維持した。培
地は３〜４日毎に交換した。１週間で、これらの培養物
は主にニューロンを含有した（ニューロフィラメントモ
ノクローナル抗体ＲＴ９７を用いて染色；Ｗｏｏｄおよ
びＡｎｄｅｒｔｏｎ，１９８１，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅ
ｐ．１：２６３−２６８）、ほんの少し星状細胞がまじ
っている（グリア質線維酸性タンパク質抗体で染色；Ｂ
ｉｇｎａｍｉおよびＤａｈｌ，１９７３，Ｂｒａｉｎ
Ｒｅｓ．４９：３９３−４０２）ことが免疫細胞化学的
に示された。
【０３０４】（２ 結果および考察） （２．１ 正中背側（ＭＤ）脊髄ニューロンに及ぼす毛
様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）の作用）正中背側（Ｍ
Ｄ）培養物は所定の培地で最初の４８−７２時間後に生
存しなかった。細胞は凝集塊を形成し始め、結局基質か
ら脱着した。しかしながら、塗布時にＣＮＴＦ（培養物
１ｍｌ当りＥ．ｃｏｌｉ抽出物２μｌ中の組み換えラッ
トＣＮＴＦ ２０ｎｇ）で１回処理後、 ＭＤニューロ
ンは４８時間まで生存の増加を示した。これらのニュー
ロンは基質によく付着しそして神経突起を広げた（図１
２）。対照培養物およびＣＮＴＦ処理培養物のいずれに
おける細胞も塗布後３時間ではよく付着していたので、
この相違は細胞付着の程度に差があったせいではなさそ
うであった。さらに、異なる基質を用いても同様の結果
が生じた。このことからＣＮＴＦはこれらの培養物に於
てＭＤニューロンの生存を増加させうることが示唆され
る。タンパク質レベルも測定した。ＣＮＴＦ処理培養物
は非処理対照およびＮＧＦ処理（５０ｎｇ／ｍｌ）培養
物より培養皿１個当り６倍のタンパク質を含有していた
（表１）。培養物は主にニューロンを含有していたの
で、タンパク質レベルの増大はニューロン生存の増大を
も示唆している。
【０３０５】（２．２ 腹側脊髄ニューロンに及ぼすＣ
ＮＴＦの作用）腹側脊髄セグメントの培養物はコリンア
セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）抗体を用いる免疫
細胞化学法によって示されるように、体細胞運動ニュー
ロンに富んでいる。所定の培地に於ては、腹側のニュー
ロンは非常によく生存したが、１週間後に結局劣化し
た。これはおそらくグリア細胞により分泌される因子の
欠如によると思われる（なぜならば、これらの培養物は
相対的に少数しかグリア細胞を含有していなかったから
である）。ＣＮＴＦ（２μｌ／ｍｌ）の存在下では腹側
ニューロンは１週間以上生存し、タンパク質およびＣＡ
Ｔ酵素レベルも対照と比較して少し増加した（表２）。
【０３０６】表１ 正中背側ニューロンを塗布時にＣＮ
ＴＦ（２μｌ／ｍｌ）またはＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）
で処理し、または未処理とした。７日目に培養物を収集
してＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，１９７
６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５
４）を用いてタンパク質を測定した。
【０３０７】
【表１】 。
【０３０８】表２ 腹側ニューロンを塗布時にＣＮＴＦ
（２μｌ／ｍｌ）またはＮＧＦ（５９ｎｇ／ｍｌ）で処
理し、または未処理とした。７日目に培養物を収集しＣ
ＡＴ酵素レベル測定（ＨａｒｉｔｋａおよびＨｅｆｔ
ｉ，１９８８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：２９６７−
２９８５）およびタンパク質を測定した。
【０３０９】
【表２】 。
【０３１０】（実施例６：精製ラット座骨神経ＣＮＴＦ
は新生ラットの顔面神経（第ＶＩＩ脳神経）における損
傷に起因する運動ニューロンの細胞死を防止する） （１ 材料および方法）ラット新生仔の顔面神経の片側
だけを切開し、５μｇウシ血清アルブミンまたは５μｇ
のＣＮＴＦのいずれか一方を含有する小さなゲルフォー
ムインプラントを損傷側に置いた。ゲルフォームインプ
ラントを受容しない損傷動物群を対照として用いた。一
週間後、動物を屠殺し、損傷を与えた神経と同じ側の
（損傷に対して同側の）顔面神経核および損傷に対して
反対側の（損傷に対して反対側の）顔面神経核を含有す
る脳幹の切片を作成した。対側顔面神経核は内部対照と
して用いられた。ニッスル染色（運動ニューロンを染色
するため）またはグリア原線維酸性タンパク質に対する
抗体（損傷に対するグリア細胞の応答を検出するため）
のいずれかを用いて、顔面神経核切片を染色した。
【０３１１】（２ 結果および考察）図１３（ａ）およ
び（ｂ）に示すように、顔面神経の損傷およびＢＳＡ含
有ゲルフォームインプラントの設置では運動ニューロン
の数が減少した。さらに、残った運動ニューロンは凝縮
して縮んでいるように見えた。しかしながら、顔面神経
の損傷およびＣＮＴＦ含有ゲルフォームインプラントの
設置では、実質的により多くの運動ニューロンの生存に
結びつくことが判明した（第１４図（ａ）および
（ｂ））。さらに第１４図（ａ）の運動ニューロンは、
第１３図（ａ）の縮んで変性した運動ニューロンよりも
非損傷側の健康な運動ニューロン（第１４図（ｂ））に
ずっと近接して似ているように見えた。さらに、ＣＮＴ
Ｆの影響は、神経膠症を防ぐことよりむしろ運動ニュー
ロンの生存を増加させることに大きく関与していること
が観察された。ＢＳＡ処理およびＣＮＴＦ処理ラットに
於ては、同程度の神経膠症が、神経損傷に対して同側の
顔面神経核で観察された（第１３図（ｃ）および第１４
図（ｃ））。
【０３１２】未処理ラット、ＢＳＡ−ゲルフォーム処理
ラットおよびＣＮＴＦ−ゲルフォーム処理ラットの顔面
神経核における運動ニューロンの数を計測した。データ
は表１０に示す。
【０３１３】未処理の、またはゲルフォーム＋ＢＳＡで
処理した損傷を受けた動物に於ては、損傷に対して同側
の運動ニューロンの９０％が失われることが観察され
た。ＣＮＴＦを含浸させたゲルフォームインプラントで
処理した動物は、損傷と同側の運動ニューロンプールは
正常の７０％であった（約３０％減）。
【０３１４】結論として、新生ラットの顔面神経損傷
後、顔面神経核の運動ニューロンの９０％が１週間以内
で変性することが判明した。新生ラット顔面神経断端へ
のＣＮＴＦの適用により、図１４（ａ）および表３に示
すように、神経切断により細胞の損失が劇的に低下し
た。ＣＮＴＦは通常であれば軸索切断後に死ぬであろう
顔面神経運動ニューロンの少なくとも６０％を生存させ
ることが見出された。このように、ＣＮＴＦはインビボ
における運動ニューロンの生存因子であることが例証さ
れる。
【０３１５】表３ ＣＮＴＦは新生ラットにおいて軸索
切断によって引き起こされる細胞死から顔面神経運動ニ
ューロンを救う
【０３１６】
【表３】 。
【０３１７】（実施例７：組換えヒトおよびラット毛様
体神経栄養因子の大腸菌における高レベルでの発現およ
び精製） （１ 材料および方法） （１．１ 菌株およびプラスミド）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３
１１０１ ａｃｌｑＦ−，ラクトースオペロンリプレッ
サー過剰生産株およびその親プラスミドベクターのｐＣ
Ｐ９３，ｐＣＰ１１０，ｐｂ１Ｋ０およびｐｂ１Ｋ１
は、従前の研究において使用されてきたＰａｎａｙｏｔ
ａｔｏｓ，Ｎ，１９８８，Ｇｅｎｅ ７４：３５７−３
６３；Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら、１９８９，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５０６６−１５０６９）。
ＣＮＴＦの発現を操作するベクターは次のようにして生
成され、その関連する特性は第ＩＶ表に要約されてい
る。
【０３１８】（１．１．１ ラットＣＮＴＦベクター） （１．１．１．１ ｐＲＰＮ１１）完全なラットＣＮＴ
Ｆタンパクをコードする６２２ｂｐ ＤＮＡ断片はポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｃＤＮＡクローン
（Ｓｔｏｃｋｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：９２０−
９２３）から得られた。この断片を得るために使用され
た 合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは
タンパクのアミノ末端にアラニンをコードする５’末端
を産生し、そして３’末端においてＴＡＧ停止コードを
１９６ｂｐ越えて停止することが意図された。発現ベク
ターｐＣＰ９３はＳａｌＩで線形化され、Ｓ１ヌクレア
ーゼ処理により平滑にされ、そして生成した３９２０ｂ
ｐ断片はアガロースゲル電気泳動法により精製した。こ
うして製造されたベクターおよびＰＣＲ断片はＥ．ｃｏ
ｌｉ Ｗ３１１０１ ａｃＩｑＦ−中で結合され、そし
て形質転換された。トランスフォーマントは大きさおよ
び所望のプラスミドに対する制限酵素地図（第１６図）
によりスクリーンし、陽性の候補（ｐＲＰＮ １１）は
正しい読みとり枠中の翻訳開始シグナルに融合した所望
の全長の遺伝子を担持することが、ＤＮＡ配列決定法に
より確認された。しかしながら、以下に記述するよう
に、元のラットｃＤＮＡに関して１個のｂｐ突然変異が
ｐＲＰＮ１１中のＣＮＴＦ遺伝子中で見出され、これは
タンパクの配列において１９３位のチロシンの代わりに
アスパラギンが組み込まれていた。この突然変異はＰＣ
Ｒ遺伝子増幅の間に生じたものに違いなく、これはラッ
トＣＮＴＦ遺伝子を有する他のすべてのベクターに持ち
込まれた。
【０３１９】（１．１．１．２ ｐＲＰＮ１２）このプ
ラスミドは宿主細胞においてコピー数を約５倍増加させ
るコピー調節領域（ｃｏｐｌ）における１個のｂｐ突然
変異を除いて、ｐＲＰＮ１１と同一である。これはＥａ
ｑＩとＰｖｕＩ部位の間のＤＮＡ（時計まわり）をｐＣ
Ｐ１１０からの同一配列で置換することにより形成され
る（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら、１９８９，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５０６６−１５０６９）。
【０３２０】（１．１．１．３ ｐＲＰＮ３７）ｐＲＧ
１２においてｂ−ラクタマーゼ遺伝子の両端につながる
２個のＡｓｅＩ制限部位の間のＤＮＡ領域をカナマイシ
ン抵抗性を付与するＤＮＡセグメント（ＫａｎＲ）で置
換した。このベクターにおいてＫａｎＲ遺伝子はその固
有プロモーターの転写コントロールの下にある。
【０３２１】（１．１．１．４ ｐＲＰＮ３８）このプ
ラスミドはＫａｎＲプロモーターの強さを最小にする４
塩基対の部位特異的突然変異を除き、ｐＲＰＮ３７と同
一である（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ．，１９８８，
Ｇｅｎｅ ７４：３５７−３６３）。
【０３２２】（１．１．２ ヒトＣＮＴＦベクター） （１．１．２．１ ｐＲＰＮ３２）このプラスミドは、
それがラット遺伝子の代わりにヒト遺伝子を担持するこ
とを除いて、ｐＲＰＮ１１と類似している。ヒトＣＮＴ
Ｆタンパクを細菌内で発現させるためには、タンパクコ
ード化配列を分離しているイントロンを除くことが必要
である。これは次のように、イントロンにフランキング
する領域を増幅させ、そして連結する（ｊｏｉｎ）ため
に、ＰＣＲを使用することにより達成される。鋳型とし
てそれぞれ１００ｎｇのｇｅｎＣ．１ ＤＮＡを使う二
つの反応が行われた（図１７）：一方は１ Ｍ ＣＮＴ
Ｆ．２３プライマーと１０ｎＭ ＣＮＴＦ．２１プライ
マーを含んでおり、他方は１μＭ ＣＮＴＦ．２４プラ
イマーと１０ｎＭ ＣＮＴＦ．２２プライマーを含んで
いた。１０ＰＣＲ周期（各周期は９４℃における１分、
５０℃における２分、７２℃における２分の各インキュ
ベーションから成る）の後で、２個の試料を一緒にして
ＤＮＡサーマルサイクラー（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ）に、さらに２５周期かけた。内部プライ
マーＣＮＴＦ．２１とＣＮＴＦ．２２は互いに完全に相
補的であるため、第一段のＰＣＲ反応の生成物はその後
アニールさせることができる。さらに、第二段の反応に
おいて、実質的により高い濃度の外部プライマーＣＮＴ
Ｆ．２３およびＣＮＴＦ．２４の存在は、所望の全長さ
の目的物を大量に合成させる。内部プライマーはコード
領域の２個のセグメントを架橋するために選ばれ、これ
はイントロンの欠除につながった。最後のＰＣＲ反応の
生成物はアガロースゲル電気泳動により分析され、そし
て唯一の主バンドを臭化エチジウム染色により検出し
た。約６００ｂｐの大きさおよび一部分のヌクレオチド
配列は、このバンドがヒトＣＮＴＦの精密にスプライス
されたコード領域であることを示した。
【０３２３】５’外部プライマーＣＮＴＦ．２３（図１
７）はタンパクのアミノ末端においてアラニンをコード
する平滑末端を産生するように意図された。３’外部プ
ライマーＣＮＴＦ．２４（図１７）は、ＣＮＴＦコード
領域の末端を越えるＥａｑＩ制限部位１２ｂｐを提供し
た。このプライマーも、自然に生じるＴＡＧ停止コドン
をＴＡＡに置換するために意図されたものであり、これ
はＥ．ｃｏｌｉにおける翻訳読み過しを少なくする。Ｐ
ＣＲ断片はＥａｇＩで制限され、そして生成した６１２
ｂｐ断片はポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製
した。ＡＴＧ開始コドンを提供する発現ベクターｐＣＰ
９３は、ＳａｌＩで直鎖状にし、Ｓ１ヌクレアーゼ処理
により平滑にし、ＥａｇＩで消化し、そして生成した
３，６３６ｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動により精
製した。このようにして調製されたベクターとＰＣＲ断
片はつながれ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０１ ａｃＩｑ
Ｆ−内で形質転換された。所望の分子を担持するトラン
スフォーマントは制限酵素地図により同定され、誘導の
際に予定した大きさのタンパクが存在するか否かを試験
した。
【０３２４】候補となるプラスミド（ｐＲＰＮ３２）の
１つを担持するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０１ ａｃＩｑ
Ｆ−の誘導培養におけるゲル電気泳動によるタンパク合
成の分析では、ｐＣＰ９３プラスミドベクターを担持す
る細菌の誘導コントロール培養の際には欠除していた約
２７，０００ＭＷのタンパクのバンドが存在することが
示された。これらの培地からの急速タンパク抽出は、生
物学的に活性なＣＮＴＦの存在を示した。
【０３２５】（１．１．２．２．ｐＲＰＮ３３，ｐＲＰ
Ｎ３９およびｐＲＰＮ４０）ラットＣＮＴＦ遺伝子の代
わりにヒトの遺伝子が存在することを除いて、これらの
プラスミドはｐＲＰＮ１２，ｐＲＰＮ３７およびｐＲＰ
Ｎ３８にそれぞれ類似しており、親プラスミドとしてｐ
ＲＰＮ３２を使用して同様に形成された。ｐＲＰＮ３２
におけるＥａｑＩとＰｖｕＩ部位の間のコピー調節領域
（時計まわり）は、ｐＲＰＮ３３を調製するためにｐＣ
Ｐ１１０からの同一の配列で置換された。次いで、ｐＲ
ＰＮ３３内のＡｓｅＩ制限部位の間のβ−ラクタマーゼ
コード領域は、ｐＲＰＮ４０を調製するためにｂｐ１Ｋ
１の突然変異ＫａｎＲ領域で置換された（Ｐａｎａｙｏ
−ｔａｔｏｓ，Ｎ，１９８８，Ｇｅｎｅ ７４：３５７
−３６３）。最後に、ｐＲＰＮ４０およびｐｂ１Ｋ０の
ＮｄｅＩとＢｇ１ＩＩ制限部位の間の領域が（Ｐａｎａ
ｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ，１９８８，Ｇｅｎｅ ７４：３５
７−３６３）ｐＲＰＮ３９を形成するために置換され、
この場合ＫａｎＲ遺伝子はその野性型プロモーターの下
に存在する。
【０３２６】（１．２ タンパク合成の誘導）細胞を０
Ｄ590＝１となる迄３７℃にてＬＢ培養液中で振とうさ
せた。ラクトースを加えて最終濃度を１％とし、インキ
ュベーションを１６〜２０時間続けた。
【０３２７】（１．３ 「急速」タンパク抽出）ゲル電
気泳動のための試料は、０Ｄ590＝２の培養物０．５ｍ
ｌからの細胞ペレットを０．１６ｍｌの溶解緩衝液（１
００ｍＭトリス−ＨＣ１，１０％グリセロール，４％ド
デシル硫酸ナトリウム、１ｍＭジチオトレイトール，
０．５ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー，ｐＨ６．
８）に再懸濁させ、５分間沸とうさせて製造した。
【０３２８】選択的抽出／可溶化−−組換えヒト白血球
インターフェロンα２に関して最初に記載された方法
（Ｔｈａｔｃｈｅｒ，ＤおよびＰａｎａｙｏｔａｔｏ
ｓ，Ｎ，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１
１９：１６６−１７７）を次のように変更して使用し
た。誘導培養からの細胞を再懸濁し、−２０℃以下で保
存した。リゾチーム処理したのち、粘性の懸濁液をＦｒ
ｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ（ＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ）に８，
０００ｐｓｉを通過させ、１１，０００×ｇで遠心分離
し、次いでペレットを処理した（Ｔｈａｔｃｈｅｒ，
Ｄ．および Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ，１９８６，
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１９：１６６−１
７７）。８Ｍグアニジニウムクロライドで可溶化した物
質を緩衝液Ｄ（１０ｍＭトリス−ＨＣ１，ｐＨ８．０，
５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１ｍＭジチオトレイトール）に
対して徹底的に透析し、１１，０００×ｇで遠心分離し
た後、透明な上清をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｔｅｒｉｆ
ｉｌ Ｄ−ＧＶフィルターに無菌的に通過させた。
【０３２９】（１．４ クロマトグラフィー）濾液を２
５ｍＭ ＮａＣｌとなるように調整し、これを０．５ｍ
ｌ／分の速度で、緩衝液Ｅ（２０ｍＭトリス−ＨＣ１，
ｐＨ８．０，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１ｍＭジチオ
トレイトール，２５ｍＭ ＮａＣｌ）にて平衡化した５
×１０ｃｍのＤＥＡＥ Ｓｅｈｐａｃｅｌカラム（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）に適用した。カラムを１ベッド容積の
同じ緩衝液で洗い、同じ緩衝液中の線形勾配の２５−５
００ｍＭ ＮａＣｌ ３ベッド容積にて溶出させた。組
換えラットＣＮＴＦは２５０−３５０ｍＭ ＮａＣｌで
溶出したのに対し、ヒトＣＮＴＦは５０−１００ｍＭで
溶出した。
【０３３０】ラットＣＮＴＦについては、プールしたピ
ーク分画を緩衝液Ｅに対して透析し、滅菌濾過し、−７
０℃て保存した。
【０３３１】ヒトＣＮＴＦについては、ＤＥＡＥ Ｓｅ
ｐｈａｃｅｌカラムからのプールしたピーク画分を４０
ｍＭ ＭＥＳ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）ｐＨ６．０，
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１ｍＭジチオトレイトール
（緩衝液Ｇ）となる様に調整し、０．２２μｍ Ｍｉｌ
ｌｅｘＧＦフィルターに通し、そして１．０ｍｌ／時で
５×１０ｃｍ Ｆａｓｔ−Ｓカラムに適用した。２５０
ｍＭ ＮａＣｌを含有する２ベッド容積の緩衝液Ｇで洗
った後、緩衝液Ｇ中の勾配２５０−１０００ｍＭＮａＣ
ｌ３ベッド容積を適用した。ヒトＣＮＴＦは約６００ｍ
Ｍ ＮａＣｌで溶出した。ピーク画分を緩衝液Ｅに対し
て透析し、滅菌濾過し、−７０℃で保存した。
【０３３２】（１．５ ペプチド分析） （１．５．１ ラットＣＮＴＦ）組換えラットＣＮＴＦ
（５０μｇ）を記載（Ｓｔｏｃｋｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ
３４２：９２０−９２３）されている様にして、ＢｒＣ
Ｎで切断した。生成したペプチドをＲＲ Ｃ４を使用し
て逆相ＨＰＬＣで分離し、そのクロマトグラフィーパタ
ーンをＢｒＣＮで切断したラット坐骨神経ＣＮＴＦのも
のと比較した。Ｃ−末端としてあらかじめ同定したペプ
チドをアミノ酸分析にかけた。加えて、Ｎ−末端を同定
し、アミノ酸分析を行った。
【０３３３】（１．５．２ ヒトＣＮＴＦ）０．１％Ｔ
ＦＡ／５０％アセトニトリルの１．５ｍｌ中の組換えヒ
トＣＮＴＦ（４００ピコモル）をＳｐｅｅｄｖａｃで３
００μｌの最終容積に濃縮した。試料をミニカラム（Ｖ
ｙｄａｃ Ｃ−４，２１４ ＴＰＢ，３００Ａ，１０μ
ｍ）にかけ、 ０．１％ ＴＦＡ／１０％アセトニトリ
ルで２回洗い、０．１％ ＴＦＡ／７０％アセトニトリ
ルで溶出した。この溶出物をＳｐｅｅｄｖａｃで約１０
μｌに濃縮した。２％カルボキシペプチダーゼＹおよび
Ｐ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，配列決
定品質）を用いて、クエン酸ナトリウムを添加して調整
されたｐＨ３．７９，５．０および６．１２において全
容積２０μｌ中で（最終濃度は０．０２５から０．０５
Ｍ）３３℃にてＣ−末端の切断を行った。１０分および
６５分のインキュベーション間隔で３μｌの９９％ギ酸
および２００ｐｍｏｌのアミノエタノール（内部標準と
して使用）を添加し、試料を上述のようにしてミニカラ
ムに適用した。切断したアミノ酸を溶出し、カラムを
０．１％ ＴＦＡ／１０％アセトニトリルで２回洗浄し
た。アミノ酸を乾燥し、ｏ−フタル −ジアルデヒドに
て誘導体に変えた後で分析した。ＣＮＴＦを０．１％Ｔ
ＦＡ／７０％アセトニトリルでカラムから溶出させ、１
０μｌに濃縮し、次いで切断を繰り返した。
【０３３４】（１．６ 生物学的活性）ニワトリ胚の脊
髄神経節（ＤＲＧ）の外植片および毛様体神経筋（Ｃ
Ｇ）ニューロンの解離した培養物において、Ｌｉｎｄｓ
ａｙおよびＲｏｈｒｅｒが記載したようにして（１９８
５，Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ １１２：３０−４８）、組
換えＣＮＴＦの生物学的活性をアッセイした。簡単に述
べると、１０日間インキュベーションしたニワトリ胚
（Ｅ１０）からＤＲＧを切りとり、そして５〜６個の神
経節を３５ｍｍの組織培養皿中の１ｍｌのコラーゲンゲ
ルマトリックス中に移植した。ゲルが固定した後、５％
の加熱不活性したウマ血清（ＧＩＢＣＯ）が補充された
１ｍｌの組織培養成育培地Ｆ１４（Ｉｍｐｅｒｉａｌ
Ｌａｂｓ，Ｕ．Ｋ．）を、ヒトＣＮＴＦ（１〜２０ｌ）
を添加する前に加えて最終濃度を１００ｐｑから１００
ｎｇ／ｍｌとした。Ｅ８ニワトリ胚からＣＧを切りと
り、カルシウム不含およびマグネシウム不含のリン酸緩
衝塩溶液中の０．２５％トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇ
ｔｏｎ）中にて３０分間インキュベートした。次いで神
経節を、パスツールピペットの内腔を通過させる摩砕に
より端離細胞浮遊液に解離させる前に、５％のウマ血清
含有Ｆ１４培地中で３回洗浄した。ＣＧ神経節の富化は
６０ｍｍ皿に細胞浮遊液を３．５時間置くことによりな
され、この間に非ニューロン性細胞（線維芽細胞および
シュワン細胞）はプラスチックに強固に付着したが、明
視野のニューロンは浮遊液中にとどまった。精製ニュー
ロンをポリオルニチン−ラミニンでコーティングされた
３５ｍｍ培養皿上に８，０００−１０，０００ニューロ
ン／皿の量で載置した。外植した培養物においてＣＮＴ
Ｆ活性を、処理培養物における繊維の伸びの程度を対照
のものに対して比較評価することにより決定した。繊維
の伸びは外植したＤＲＧおよびＮＧＦの用量−応答に関
する写真と培養物を比較することにより、０から５＋の
スケールで評価した。解離したＣＧニューロン培養物に
おいて、ＣＮＴＦ活性は４８時間の時点で対照およびＣ
ＮＴＦ処理培養物における処理に耐えたニューロンのパ
ーセントを計算することにより決定した。すべての場合
において、結果は３通りの培養物から導かれた。 （１．７ 他の方法)この研究において使用された酵素
反応、ＤＮＡ電気泳動法および他の技術の条件は詳細に
記載されている（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ，１９８
７，Ｉｎ Ｋ．Ｇ．Ｈａｒｄｙ（編），Ｐｌａｓｍｉｄ
ｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲ
ＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．，ｐｐ．６３−
１７６）。ＤＮＡの配列決定は鋳型として４ｍｇのスー
パーコイルプラスミドを使用して、Ｓｅｑｕｅｎａｓａ
Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０キット（ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ）で行った。
【０３３５】（２ 結果および考察）Ｅ．ｃｏｌｉ中の
外来タンパク発現についての従来からの研究は、高レベ
ル発現に寄与することができ、そして生物学的に活性の
産生物の回収を容易にしうる幾つかのパラメーターを同
定した。我々は数個の重要な特性を用いる発現ベクター
を使用したが、これらの特性には次のものが包まれる；
ラクトースオペロンリプレッサーによる１ａｃＵＶ５プ
ロモーターの制御；バクテリオファージＴ７からの強力
なリボゾーム結合部位；コピー数を増加させるためのプ
ラスミドの複製制御領域における突然変異；および抗生
物質抵抗性タンパクの発現を制限するための突然変異。
我々はＥ．ｃｏｌｉにおけるＣＮＴＦの産生についての
後から２つの特性の効果を詳細に探究した。
【０３３６】（２．１ ラットＣＮＴＦの発現） （２．１．１ コピー数の作用）ゲル電気泳動による
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０１ ａｃＩｑＦ−／ｐＲＰＮ
１１のラクトース誘導培養物におけるタンパク合成の分
析は、ラットＣＮＴＦについて予期された大きさである
約２４，０００ＫＤａのポリペプチドの比較的に弱い発
現を明らかにし、これはｐＣＰ９３ベクターを担持する
細菌の誘導コントロール培養物においては存在しなかっ
た（第１８図）。ｐＲＰＮ１１を担持する細胞の抽出物
も有意なレベルのＣＮＴＦ活性を有していた。Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｗ３１１０１ ａｃＩｑＦ−／ＲＰＮ１２の誘導
培養物において、これはコピー数突然変異ｃｏｐｌの存
在によってのみｐＲＰＮ１１と異なるものであるが、Ｃ
ＮＴＦ産生は全細胞タンパクの約３０−５０％に増加さ
れた（図１８）。このようにｐＲＰＮ１１に対するｐＲ
ＰＮ１２のコピー数における５倍の増加は、組換えタン
パクのレベルにおいて３０−５０倍の増加を生じさせた
（表４）。ｃｏｐｌ突然変異のこの作用は他の組換えタ
ンパクに関しても報告されている（Ｂｕｅｌｌ，Ｇ．お
よびＰａｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ．１９８７，ｉｎ「Ｆ
ｒｏｍ Ｇｅｎｅｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｓｔｅｐｓ
Ｄｉｃｔａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｏｌ Ｌｅｖ
ｅｌｓｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，Ｒφ
ｚｎｉｋｏｆｆ，Ｗ．Ｓ．およびＧｏｌｄ，Ｌ．編 Ｂ
ｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，Ｍａｓ
ｓ）。
【０３３７】（２．１．２ 抗生物質抵抗性の作用）
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパクの発現に関する従
前の研究において、ベクターによりコードされた抗生物
質抵抗性タンパクの合成は至適組換えタンパクの産生を
干渉することが観察された。この干渉は、細胞の限定さ
れた合成機構に関する２個の遺伝子が競合することに帰
因していた（Ｐａｎａｙｏ−ｔａｔｏｓ，Ｎ，１９８
８，Ｇｅｎｅ ７４：３５７−３６３）。この仮説をさ
らに試験し、潜在的にＣＮＴＦ産生レベルを改善するた
めに、ｐＲＰＮ１２中のＢ−ラタクマーゼ遺伝子をその
天然プロモーターの転写調節の下（ｐｒｐｎ３７）又は
より弱い突然変異プロモーター（ｐＲＰＮ３８）の下の
いずれかで、カナマイシン抵抗性（ｋａｎＲ）遺伝子で
置換した。
【０３３８】ｐＲＰＮ３７の宿主である誘導細胞におけ
るタンパクレベルの分析は、ラットＣＮＴＦは全細胞タ
ンパクの１０−２０％を構成し、そしてｋａｎＲタンパ
クはそのレベルの約１／２で合成されたことを示した。
一方、突然変異体のｋａｎＲプロモーターを産生するｐ
ＲＰＮ３８の宿主細胞においては、ＣＮＴＦは全細胞タ
ンパクの５０−７０％を構成するにもかかわらず、ｋａ
ｎＲタンパクは検出されなかった（図１８および表
４）。ｐＲＰＮ３８に関して観察されたＣＮＴＦの有意
に高い発現は、抗生物質抵抗性遺伝子の発現レベルの減
少から直接生ずるものであろう。これらのベクターにお
いて高レベルで発現される他の組換えタンパクに関して
観察され考察されたように（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，
Ｎ．，１９８８，Ｇｅｎｅ ７４：３５７−３６３）、
ｋａｎＲプロモーターの強度を最小にすれば、明らかに
限定された細胞の合成能の競合が最小になる。
【０３３９】（２．２ ヒトＣＮＴＦの発現）数個のベ
クターを用いて得られたヒトＣＮＴＦ発現の相対レベル
は図１８に示されており、そして表４に要約されてい
る。各ベクターによる最大レベルはラット遺伝子を担持
する類似のベクターについて観察されるレベルよりは小
さかったが、全体のパターンは同一であった；より高い
コピー数の（ｃｏｐｌ）プラスミドに関し３０−５０倍
の増加が再度観察され、そしてここでも最大レベルは高
コピー数とカナマイシン抵抗性の低発現の組み合わせに
より得られた。ヒトＣＮＴＦの発現については、弱めら
れたｋａｎＲの作用（ｐＲＰＮ３９対ｐＲＰＮ４０）は
ラット ＣＮＴＦ発現における作用（ｐＲＰＮ３７対ｐ
ＲＰＮ４８）よりもいく分顕著ではなかった。細胞の合
成機構が制限されると、即ち、組換えタンパクの極めて
高いレベルでは、２個の転写単位の競合のみが明らかに
なるので、このことは予期されたことであった。
【０３４０】ここで報告されたＥ．ｃｏｌｉにおけるラ
ットＣＮＴＦ産生レベルは例外的に高い。これは、適度
に強いプロモーターの使用、強力なリボゾーム翻訳開始
シグナル、比較的高いコピー数に安定に維持されるベク
タープラスミド、および選択的な抗生物質抵抗性タンパ
クの最小の合成を含む幾つかの因子の好適な組みあわせ
から明らかに生じたものである。加えて、組換えタンパ
ク産生はタンパク自体の物理的性質および宿主内での安
定性により決定される。この点でラットＣＮＴＦはＥ．
ｃｏｌｉ内での発現に特になじみやすいものであると思
われる。ヒトＣＮＴＦも幾分低いレベルではあるが、極
めて効率的に発現される。
【０３４１】（２．３ ラットおよびヒトのＣＮＴＦの
精製）Ｅ．ｃｏｌｉ内で高レベルで発現される他の組換
えタンパクと同様に、ＣＮＴＦは大部分が不溶性の封入
体中で見出された；ラットタンパクの８５−９０％およ
びヒトタンパクの６０−７０％は中性の緩衝液による抽
出に抵抗性であった。封入体中にとじこめられたＣＮＴ
Ｆおよび他の（大部分の疎水性）タンパクの抽出および
可溶化は８Ｍのグアニジニウムクロライドにより影響さ
れた。その後での透析によるグアニジニウムのゆっくり
とした除去は疎水性の宿主タンパクの沈澱を生じ、そし
て溶液中にラットＣＮＴＦを９５％より高い純度で、ま
たヒトＣＮＴＦを９０％より高い純度で残した（図１
９）。この時点において、意図的に過負荷をかけたポリ
アクリルアミドゲルの相対的強度およびＨＰＬＣ分析に
より決定した場合、組換えラットＣＮＴＦを９９％以上
に精製するのに一つのクロマトグラフィー工程（ＤＥＡ
Ｅ Ｓｅｐｈａｃｅｌ）で十分であった。一部にあって
は、ヒトタンパクのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｃｅｌに対す
る弱い親和性のために、９９％以上の純度を達成させる
ためには第２のクロマトグラフィー工程（Ｆａｓｔ
Ｓ）を付加することが必要であった（図１９Ｂ）。
【０３４２】（２．３．１ 収量）推定の発現レベルが
与えられ、そして湿潤細胞ペレットの全タンパク含量が
５−１５重量％であると仮定すると、１ｇの湿潤細胞ペ
レット当りの理論的収量はラットＣＮＴＦについて３０
−９０ｍｇで、ヒトＣＮＴＦでは１５−４５ｍｇであろ
う。実際の収量はラットＣＮＴＦについては約２０ｍｇ
で、ヒトＣＮＴＦについては約６ｍｇであった。ヒトタ
ンパク質の場合における損失の大部分は、封入体を生成
する間に抽出されて捨てられた「可溶性」ＣＮＴＦによ
る。
【０３４３】（２．３．２ 特性決定）上記方法により
製造された組換えＣＮＴＦは、ラットおよびヒトの双方
で９９％以上の純度であった。このタンパク質は、リム
ルス・アメボサイト（ＬｉｍｕｌｕｓＡｍｅｂｃｙｔ
ｅ）溶解物試験（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐ
ｅＣｏｄ）によれば、極めて低い発熱性（１５ｎｇ／ｍ
ｌタンパク質）を有した。さらに、以下で考察するよう
に、これらはピコモルレベルで生物学的に活性であるこ
とが見出された。
【０３４４】組換えラットおよびヒトＣＮＴＦタンパク
質をＢｒＣＮで処理し、Ｎ−末端およびＣ−末端ペプチ
ドを同定し、アミノ酸組成および／又は配列決定分析に
かけた。Ｎ−末端ペプチド分析はラットおよびヒトタン
パク質の両方においてＮ−末端アミノ酸がアラニンとし
て定量的に回収されたことを示した。このことは、２番
目の残基がかさ高くないアミノ酸アラニンである場合に
Ｅ．ｃｏｌｉ中で一般的であるように、最初のメチオニ
ンが定量的に除去されたことを意味する。これとは対照
的に、ラット坐骨神経から精製されたＣＮＴＦのＮ−末
端はブロックされ、そして恐らくは末端のメチオニン残
基を保持するであろう。
【０３４５】カルボキシル末端においては、末端ＢｒＣ
Ｎペプチドの予想された配列が組換えヒトＣＮＴＦに対
して得られた。一方、ラットＣＮＴＦのＣ−末端ペプチ
ドのアミノ酸組成分析は、それが予想された組成は有す
るものの、予期されたチロシンが欠除し、余分のアスパ
ラギンを有することを示した。ＤＮＡ配列決定法は、コ
ドン１９３におけるチロシンのアスパラギンへの置換と
いう点突然変異を示した；これは、オリジナルな発現ベ
クターｐＲＰＮ１１を作製するためにクローン化ラット
ＣＮＴＦ ｃＤＮＡをＰＣＲによってコピーする間に明
らかに生じた。我々はこの突然変異が生物学的活性にと
っては必須でないＣＮＴＦ領域に存在することを確定し
た。
【０３４６】ラットおよびヒトＣＮＴＦは同数のアミノ
酸を有しており、（Ｎ−末端メチオニンを除去した後の
計算ＭＷはそれぞれ２２，７８０および２２，７０
０）、そしてその配列の広範囲の部分を共有する。しか
し還元および非還元のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
の両方において、ヒトＣＮＴＦはラットＣＮＴＦよりも
幾分ゆっくりと移動する（第１９図）。構造が類似し長
さが同一の２個の分子間の移動のこの差異は、恐らくヒ
トタンパクにおける異常な構造上の制約を反映する。
【０３４７】（２．４ 生物学的活性）上述の方法によ
り精製された組換えラットＣＮＴＦは完全に活性であっ
た。図２０は、ラット坐骨神経から精製したＣＮＴＦ
（Ｓｔｏｃｋｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：９２０−
９２３）および組換えラットＣＮＴＦを用いて得られた
Ｅ８ニワトリ胚毛様体神経節の解離した富ニューロン培
養物の用量−応答曲線を示す。坐骨神経から精製したタ
ンパク質の活性は５ｐｇ／ｍｌで検出され、そして最大
のニューロン生存は１〜２ｎｇ／ｍｌでみられた（ＥＣ
50＝８０ｐｇ／ｍｌ）。同じアッセイにおいて、精製組
換えラットＣＮＴＦは２ｐｇ／ｍｌで活性であることが
認められ、飽和は０．５−１．０ｎｇ／ｍｌで観察され
た（ＥＣ50＝３５ｐｇ／ｍｌ又は１．５ｐＭ）。このよ
うに、精製組換えラットＣＮＴＦは坐骨神経から精製し
た天然のタンパクと少なくとも同程度に活性であった。
【０３４８】平行実験において、精製組換えヒトＣＮＴ
Ｆの生物学的活性をアッセイした。最初に、胚日数１０
（Ｅ１０）のニワトリＤＲＧの外植片を、Ｅ．ｃｏｌｉ
の溶菌液中における急速かつ半定量的なＣＮＴＦ活性検
出のために使用した。ＣＮＴＦの存在時において繊維の
伸びが観察されたが、外来性の神経栄養因子が存在しな
い場合には対照の神経節からの伸びはほとんど又は全く
生じなかった。ＣＮＴＦの飽和レベルにおける繊維の最
大の伸びは、ＮＧＦの飽和レベルで観察されるものの約
５０−７５％であった。
【０３４９】より特異的なアッセイにより、Ｅ８ニワト
リ毛様体神経節の解離した富ニューロン培養物において
測定がなされた。対照培養物において４８時間後にはほ
とんどすべてのニューロンが変性したが（第２１Ｃ
図）、ＣＮＴＦが飽和レベルで存在する中に置かれたニ
ューロンは少なくともその６０−７０％が生存し、そし
て長い神経突起を発達させた（図２１Ｄ，Ｅ）。毛様体
ニューロンに及ぼす特異的なこの作用は、ナノグラム以
下の量の細菌細胞の粗溶菌液および精製組換えタンパク
で観察された。漸増量の純粋なタンパクを用いて行われ
たこの様な実験から、組換えヒトＣＮＴＦはニワトリ毛
様体ニューロンに対してラットＣＮＴＦと同程度に活性
であることが見出された。
【０３５０】ここに記載したＣＮＴＦの発現および精製
は、医薬の製造のために容易に拡大しうるであろう。実
験動物においてＣＮＴＦが傷ついた運動性ニューロンの
生存を促進することができるという最近の発表に照らし
て、このことは意義があろう（Ｓｅｎｄｔｎｅｒら、１
９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４５：４４０−４４１）。
【０３５１】
【表４】 ＊ｌａｃ：ｌａｃＵＶ５プロモーター；ｒｂｓ１：リボ
ゾーム結合部位；ｒａｔＣＮＴＦ，ｈｕｍＣＮＴＦ：ラ
ット又はヒトＣＮＴＦ遺伝子；ａｍｐ：アンピシリン抵
抗性遺伝子；ｋａｎ０，ｋａｎ１：野性型又は突然変異
したｋａｎＲ遺伝子；ｃｏｐ＋，ｃｏｐ１：通常又は高
コピー数プラスミド。 ＊＊全細胞タンパクのパーセントとして。
【０３５２】（実施例８：生物学的活性に及ぼす修飾し
た、および、端部を切りとった毛様体神経栄養 因子の
作用） （１ 材料および方法） （１．１ 親の発現ベクターの形成）親のｒＣＮＴＦ発
現ベクターのｐＲＰＮ１１，ｐＲＰＮ３７およびｐＲＰ
Ｎ４０の遺伝子操作は、実施例７の（１．１．１．
１）、（１．１．１．３）および（１．１．２．２）に
記載されている。
【０３５３】（１．２ 修飾したヒト毛様体神経栄養因
子ベクターの形成）プラスミドｐＲＰＮ１０８はｐＲＰ
Ｎ３３内のユニークなＡａＴ ＩＩとＮｈｅ１制限部位
の間のＤＮＡ配列を、Ｎｈｅ１部位から１５ｂｐ上流に
位置する２個の位置が修飾された全く同一の配列を担持
する断片で置換することにより産生された。これは、Ｎ
ｈｅ１部位を包含しそしてＴＧＴシステインのコドンを
アラニンに関するＧＣＡコドンで置換した３個の残基を
含有する合成オリゴデオキシリボヌクレオチドである
「３’プライマー」で達成された。この３’プライマー
はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｐＲＰＮ３３
から所望の 配列を得るために、Ａａｔ ＩＩ部位を包
含する５’プライマーと組合わせて使用した。従って、
ｐＲＰＮ１０８はｈＣＮＴＦのアミノ酸１７に関するア
ラニンコドンを除いて、ｐＲＰＮ３３と同一である（図
２２）。
【０３５４】プラスミドｐＲＰＮ１０９は、Ｎｈｅ１部
位を包含する３’プライマーがＴＧＴシステインコドン
とセリンに対するＡＧＴコドンに変える２個の残基を含
んでいることを除いて、ｐＲＰＮ１０８と全く同様の手
段でｐＲＰＮ３３から産生された。従ってｐＲＰＮ１０
９は、ｈＣＮＴＦのアミノ酸１７に対するセリンコドン
を除いて、ｐＲＰＮ１０８と同一である（第２２図）。
【０３５５】プラスミドｐＲＰＮ５９は、ｐＲＰＮ３３
中のユニークな制限部位はＢａｍＨＩとＮｒｕ１の間の
ＤＮＡ配列を除去することにより産生された。ｐＲＰＮ
５９において、ｈＣＮＴＦ遺伝子配列は、１８５番目の
コドンの後で中断されており、それに続く配列はｈＣＮ
ＴＦに対応しない１０個の追加のアミノ酸および翻訳停
止コドンについてコードする（第２２図）。
【０３５６】プラスミドｐＲＰＮ１１２はＡｓｅ１部位
の間のｈＣＮＴＦ遺伝子の一部を担持する制限フラグメ
ントの方向を逆転した場合に、ｐＲＰＮ３３（ＭＳ２）
からのｐＲＰＮ４０の操作の過程で産生された。ｐＲＰ
Ｎ１１２においてｈＣＮＴＦ遺伝子は１４５番目のコド
ンのすぐ後で中断されており、それに続く配列は２個の
コドンｈＣＮＴＦに対応しないアミノ酸（ロイシン）に
対するものおよび翻訳停止コドンを導入する（第２２
図）。
【０３５７】プラスミドｐＲＰＮ８２は、ＢｓｔＸ１部
位で終了しｈＣＮＴＦ最後のアミノ酸１３３個をコード
するＰＣＲフラグメントを、ＣＮＴＦとは相同でないタ
ンパクをコードする遺伝子のＢｓｔＸ１部位に挿入する
ことにより産生された。ｐＲＰＮ８２において、生成し
た融合タンパクは２個のグリシン基が続く外来タンパク
の初めの３５個のアミノ酸およびｈＣＮＴＦの１３３残
基から構成されている（第２２図）。
【０３５８】（１．３ 修飾されたラット毛様体神経栄
養因子ベクターの作製）プラスミドｐＲＰＮ６５は、ｐ
ＲＰＮ１２のユニークな制限部位Ｓａｃ１とＮｒｕ１の
間に、ｒＣＮＴＦの１６５番目のコドンの直後に翻訳停
止コドンを導入するために意図されたＰＣＲフラグメン
トを挿入することにより産生された。
【０３５９】プラスミドｐＲＰＮ１１０は、ｐＲＰＮ１
２中のユニークなＮｈｅ１とＥａｇ１制限部位の間のＤ
ＮＡ配列を、ＴＡＴチロジンコドンをアスパラギンに対
するＡＡＴコドンに変える１個のヌクレオチドにおいて
修飾された全く同じ配列を担持するフラグメントで置換
することにより産生された。これは突然変異させようと
する位置からｒＣＮＴＦ遺伝子の３’末端にＥａｑ１に
より認識される配列が後に続く３’プライマーにて達成
された。この３’プライマーは、ｐＲＰＮ１２からＰＣ
Ｒにより所望の配列を得るために、Ｎｈｅ１部位を包含
する５’プライマーと組みあわせて使用された。ｐＲＰ
Ｎ１１０において、ｒＣＮＴＦ遺伝子はラットＤＮＡに
よりコードされるものと同一のタンパクをコードする
（第２２図）。
【０３６０】（１．４ 毛様体神経栄養因子活性の生物
学的アッセイ）背根神経節において生物学的活性をアッ
セイし、および／又は解離した毛様体ニューロンを実施
例７（１．６）に記載したようにして測定した。可溶性
タンパク質は実施例７（１．３）に記載された「急速」
タンパク質抽出法により、各プラスミドの宿主である誘
導細菌から抽出した。
【０３６１】（２ 結果および考察）生物学的活性のた
めのアッセイの結果は、ｐＲＰＮ１０８およびｐＲＰＮ
１０９内にコード化された修飾ｈＣＮＴＦタンパク質な
らびにｐＲＰＮ５９内にコード化された端部を切りとっ
たタンパク質が、親のプラスミドｐＲＰＮ３３内でコー
ド化された完全な長さのタンパク質と同程度に活性であ
ることを示した。一方、ｐＲＰＮ１１２内でコード化さ
れた端部の切りとられたタンパク質は不活性であった。
【０３６２】この結果は、ヒト、ラットおよびウサギＣ
ＮＴＦ配列の第１７位において共通に保持されているユ
ニークなシステイン残基を活性の明白な損失をもたらす
ことなく修飾できることを示している。同様にｈＣＮＴ
Ｆの最後に１５個のアミノ酸も活性のためには必要でな
い。対照的にｈＣＮＴＦのカルボキシル末端から最後の
５５個のアミノ酸を除去すると活性が失なわれる。それ
ゆえ、活性なｈＣＮＴＦのための決定的な領域はアミノ
酸１４６ないし１８６の間の領域に存在する。
【０３６３】端を切りとった、および修飾したラットＣ
ＮＴＦタンパク質に関する結果はこの解釈と一致し、さ
らに、ＣＮＴＦ活性に決定的な領域を狭める。ｐＲＰＮ
６５によりコード化されたタンパク質における最後の３
５アミノ酸を除去するとタンパク質は不活性となった
が、１９３位のチロシンをアスパラギン残基で置換して
も活性に何らの影響も有しなかった。これらの結果はさ
らに、ＣＮＴＦ活性に決定的な領域の限界をアミノ酸１
６６と１８６の間の配列に定義する。
【０３６４】（実施例９：腹側脊髄ニューロンに及ぼす
ＣＮＴＦの付加的な作用） （１ 材料および方法） （１．１ 実験動物）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラ
ット（ＨＳＤ又はＺｉｖｉｃ−Ｍｉｌｌｅｒ）をすべて
の実験で使用した。妊娠したラット（Ｅ１４）を実施例
５（１．１）の記載のようにして殺した。
【０３６５】（１．２ 組織培養法）脊髄を実施例５
（１．２）に記載のようにしてラッ ト胚から無菌的に
とり出した。脊髄組織を小片に細断し、０．１％トリプ
シン（ＧＩＢＣ０）および０．０１％デオキシリボヌク
レアーゼタイプ１（Ｓｉｇｍａ）中で３７℃で２０分間
インキュベートした。次いでトリプシン溶液を除去し、
４５％イーグル最少必須培地（ＭＥＭ）、４５％ハム
（Ｈａｍ’ｓ）栄養混合物Ｆ１２（Ｆ１２）、５％ウシ
胎児血清（ＧＩＢＣ０）、５％ウマ血清（ＧＩＢＣ
０）、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリンＧ（０．５単
位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（０．５μｇ／ｍ
ｌ）から成る培地でリンスし、置換した。
【０３６６】これをパスツールピペットを通して緩やか
に粉砕することにより同じ培地中で２回機械的に解離さ
せ、上清をプールし、そしてナイロンフィルター（Ｎｉ
ｔｅｘ Ｔｅｔｋｏ；４０μｍ）を通して濾過した。得
られた全細胞数をトリパンブルーの存在下で計測する血
球計数器により決定した。解離した腹側細胞を約５０，
０００細胞個／ｃｍ２の密度でポリ−Ｌ−オルニチン
（１０μｇ／ｍｌ）およびラミニン（５μｇ／ｍｌ）で
被覆された皿上に載置した。載置したその日に処理を行
い、ただし遅れた添加実験では２日又は６日目に処理を
行った。培養物をほぼ１００％の相対湿度において９５
％空気／５％ＣＯ2中で３７℃にて保持した。培養培地
を３日又は４日毎に交換した。分裂阻止剤シトシンアラ
ビノシド（Ａｒａ Ｃ；０．５μＭ）を、非ニューロン
性細胞の数を減らすために２日目に加えた。７日目に細
胞を収集してコリンアセチルトランスフェラーゼレベル
（ＣＡＴ；Ｆｏｎｎｕｍ，１９７５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃ
ｈｅｍ．２４：４０７−４０９）およびタンパク質レベ
ル（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，１９７６，Ａｎｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）を測定し、または４
％パラホルムアルデヒド中に固定してＮＦアッセイ（Ｄ
ｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ，１９８４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｃｈｅｍ．４２：１１１６−１１２２）を行い、免疫細
胞化学的に調べた。幾つかの培養物を、５０％Ｆ１２お
よび５０％ ＭＥＭ、グルタミン（２ｍＭ）、インスリ
ン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００μｇ／
ｍｌ）、プロゲステロン（２０ｎＭ）、プトレッシン
（１００μＭ）および亜セレン酸ナトリウム（３０ｎ
Ｍ）から成る特定の培地中で成長させた（Ｂｏｔｔｅｎ
ｓｔｅｉｎおよびＳａｔｏ，１９７９，ＰＮＡＳ，７
６：５１４−５１７）。これらの培養物において、血清
含有培地は第１日目に特定の媒地で置換された。
【０３６７】（１．３ ニューロフィラメント（ＮＦ）
アッセイ）４％パラホルムアルデヒド中に４℃で２時間
細胞を固定した後、培養物をＤｏｈｅｒｔｙらにより記
載された方法（１９８４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４
２：１１１６−１１２２）にしたがって透過性となし、
ブロックした。ニューロフィラメントタンパクは１：１
０００に希釈したモノクローナル抗体ＲＴ９７（Ｗｏｏ
ｄおよびＡｎｄｒｔｏｎ，１９８１，Ｂｉｏｓｃｉ Ｒ
ｅｐ．１：２６３−２６８）を使用して検出した。反応
生成物は基質としてｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）
を用いて可視化し、光学濃度を４９０ｎｍで測定した。
【０３６８】（１．４ コリンアセチルトランスフェラ
ーゼ（ＣＡＴ）アッセイ）０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００を含有する２０ｍＭトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８．
６）溶液中で細胞を溶解することにより培養物を収集し
た。２マイクロリットルの細胞溶解物を取り出し、マイ
クロ−フォナム法（ｍｉｃｒｏ−Ｆｏｎｎｕｍ）にした
がってＣＡＴをアッセイした（Ｆｏｎｎｕｍ，１９７
５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２４−４０７−４０
９）。最終的な基質組成物は、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4
（ｐＨ７．４）緩衝液中の ０．２ｍＭ［１−14Ｃ］ア
セチル−ＣｏＡ（ＮＥＮ，５４．４ｍＣｉ／ｍｍｏ
ｌ），３００ｍＭ ＮａＣｌ，８ｍＭコリンブロミド，
２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１ｍＭネオスチグミンか
ら構成された。これらの酵素および基質濃度において、
酵素反応は９０−１２０分の間線状であった。ＣＡＴに
対する誘導の特異性は、アッセイ中にＣＡＴ活性の特異
的阻害剤であるＮ−ヒドロキシエチル−４−（１−ナフ
チルビニル）ピリジウム（ＨＮＰ）を添加することによ
り試験した（ＷｈｉｔｅおよびＣａｖａ ｌｌｉｔｏ，
１９７０，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１７：１５７９−
１５８９）。
【０３６９】（１．５ アセチルコリンエステラーゼ
（ＡｃｈＥ）の組織化学的染色）コリン作動性細胞は、
Ｇｅｎｅｓｅｒ−ＪｅｎｓｅｎおよびＢｌａｃｋｓｔａ
ｄｔの染色方法（１９７１，Ｚ．Ｚｅｌｌｆｏｒｓｃ
ｈ．１１４：４６０−４８１）を改変したものにより、
ＡｃｈＥを組織化学的に染色することにより同定した。
４％パラホルムアルデヒド中に培養物を固定した後、細
胞を次の成分から成るＡｃｈＥ基質の存在下に４℃で５
〜６日間インキュベートした：５０ｍＭアセテート緩衝
液（ｐＨ５．０）中の４ｍＭアセチルチオコリンヨーダ
イド、２ｍＭ硫酸銅、１０ｍＭグリシンおよび１０μｇ
／ｍｌゼラチン。反応生成物の可視化は既述のように実
施した（ＨａｒｔｉｋｋａおよびＨｅｆｔｉ，１９８
８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：２９６７−２９８
５）。
【０３７０】（１．６ 腹側角細胞のメトリザミド密度
勾配による分画）分画方法（Ｄｏｈｒｍａｎら、１９８
６，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１１８：２０９−２２１）はＳ
ｃｈｎａａｒおよびＳｃｈａｆｆｎｅｒにより記載され
た方法（１９８１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１：２０４
−２０７）を改変したものであった。メトリザミドをＦ
１２：ＭＥＭ（１．１）培地中に溶解し、３ｍｌの１７
％メトリザミド、３ｍｌの１２％メトリザミドおよび３
ｍｌの８％メトリザミドから成るステップ勾配を製造し
た。以下の工程はすべて４℃で実施した。前記のように
して得られた腹側角細胞（ｖｅｎｔｒａｌ ｈｏｒｎ
ｃｅｌｌ）浮遊液（２．５ｍｌ）をステップ勾配上に層
状に置き、この管をスウィング−アウトローターを使用
して２０分間２５００×ｇで遠心分離した。遠心は０−
８％（分画▲）、８−１２％（分割▲▲）および１２−
１７％（分画▲▲▲）の界面で３層の細胞を生じた。各
界面から得られた細胞を少量ずつ（約１ｍｌ）集め、プ
レートにおき、処理し、そして既述のようにアッセイし
た。分画▲からニューロンは培養した脊髄細胞に由来す
るコンディション化された培地中に保持した。
【０３７１】（２ 結果および考察） （２．２ 培養物の一般的形態学）血清含有媒地中で成
長させた腹側角細胞は、混合ニューロン−グリア細胞培
養物を生じた。２４時間後にグリアは平らになり増殖し
始めたが、わずかに２〜３のニューロンが神経突起を広
げ始めただけであつた。しかしながら、４８時間後には
多くのニューロンが神経突起を形成し、そして、特徴的
な明視野細胞体を示した（第２３図）。２日目にＡｒａ
Ｃを添加した後で、非ニューロン性細胞は死に初め、
そして浮き上がり、約５％のグリアを含有するニューロ
ンに富んだ培養物を残した。所定の培地において、培養
物はＡｒａ Ｃ処理によつてさらに減少させることがで
きる約５％グリアを含んでいた。メトリザミド勾配で精
製した運動性ニューロン角培養物において（分画▲）、
グリアは実際上に存在せず、９０％以上のニューロンは
大きなコリン作動性ニューロンであった。
【０３７２】（２．２ ニューロフィラメント（ＮＦ）
レベルに及ぼすＣＮＴＦの作用）ニューロンに及ぼすＣ
ＮＴＦの作用を評価する為に、ＮＦレベルを測定した。
ＣＮＴＦで処理（１０ｎｇ／ｍｌ）した腹側角培養物で
は未処理のコントロールに比較して、ＮＦ含量が２倍増
加することが見出された。ＮＦＧは有意な作用を生じな
かった（第２４図）。これは、ＣＮＴＦが培養腹側ニュ
ーロンにおいて、生存および／又は神経突起の伸びを促
進することを示唆している。
【０３７３】（２．３ ＡｃｈＥ含有ニューロンの生存
におよぼすＣＮＴＦの作用）ＮＦレベルの増大がニュー
ロンの生存又は神経突起の伸びの増大を反映するか否か
を決定するために、ＡｃｈＥに対する組織化学的染色を
実施した。なぜならば、腹側角培養物中の大多数のニュ
ーロンはコリン作動性の運動性ニューロンであるからで
ある。ＣＮＴＦ処理（１０ｎｇ／ｍｌ）培養物におい
て、未処理のコントロールに比較してＡｃｈＥ−陽性の
ニューロンが２．５倍増加することが見出された。ＮＧ
Ｆはわずかな作用を持つようにみえた。これらの結果は
ＣＮＴＦがニューロンの生存を高めることを示唆してお
り、この理由はＮＦレベルの増大のためであろう。
【０３７４】（２．４ ＣＡＴ活性におけるＣＮＴＦの
作用）トランスミッター表現型発現に対するＣＮＴＦの
影響を評価するために、ＣＡＴ活性のレベルを測定し
た。ＣＡＴはＡｃｈ合成のための律速酵素である。第２
６図に示すように、ＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の添加
は培養７日後においてＣＡＴ活性を平均４．０倍増加し
たが、ＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ（５０ｎ
ｇ／ｍｌ）のような他の成長因子の添加は作用を生じな
かった。コリン作動性活性のこの増加は、用量に依存し
ており、そして１ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦ濃度で最大応答
に達した（第２６Ｂ図）。この増加は処理後３日の速さ
で明らかであり、培養物の密度により影響を受けないよ
うに見えた。これらの結果はＣＮＴＦもコリン作動性ト
ランスミッターの発現を刺激することを示唆している。
なぜならばＣＡＴ活性の増加はコリン作動性ニューロン
数の増加の１．６倍であり；すなわち生存したコリン作
動性ニューロンはＡｃｈ／ニューロンをより多く発現し
ているからである。
【０３７５】（２．５ 遅れて添加する実験）腹側角細
胞を第２７図に示すように３グループに分けた。第２７
Ａ図において、ＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）をプレート
時に細胞に添加し、細胞をＣＮＴＦの存在下に７日間保
存した。第２７Ｂ図およびＣ図では、培養物をＣＮＴＦ
なしに２日または６日間保存し、次いでＣＮＴＦ（１０
ｎｇ／ｍｌ）でさらに７日間処理した。２日目にＣＮＴ
Ｆを遅れて添加すると、ＣＡＴ活性の増加は１．２倍に
減少した。しかしながら６日の遅れでは、ＣＮＴＦはも
はやＣＡＴ活性に影響を与えることができない（第２７
図）。このことは、ＣＮＴＦの非存在下では塗布してか
ら２〜３日以内に通常死ぬＣＮＴＦ−感受性ニューロン
の集団が存在することを示唆している。ＣＮＴＦの存在
時には、これらの細胞は生存し、増加した量のＡｃｈを
発現する。
【０３７６】（２．６ グリアの非存在下での腹側角培
養物に及ぼすＣＮＴＦの作用）腹側角培養物におけるグ
リア細胞の存在は２つの方法で減少された。すなわち
ａ）抗分裂剤（ＡｒａＣ；０．５μＭ）での処理、およ
びｂ）無血清増殖培地の使用。どちらの場合において
も、グリア集団は全細胞の約５％まで低下したが、ＣＮ
ＴＦのＣＡＴ活性に及ぼす作用は不変であった（図２
８）。これらの結果は、ＣＡＴ活性に及ぼすＣＮＴＦの
作用はグリアを介して仲介されるのではなく、ニューロ
ンからの直接応答であることを示している。
【０３７７】（２．７ メトリザミドグラジェント精製
運動ニューロンにおよぼすＣＮＴＦの作用）腹側角培養
物はすでにコリン作動性ニューロンで富化されていた。
培養物の均一性を確保するために、運動ニューロンをさ
らに密度勾配により腹側脊髄培養物から精製した。段階
的メトリザミドグラジェントに上り、より軽い浮揚性密
度に基づいて運動ニューロンの選択ができる。生成する
培養物はＳｃｈｎａａｒおよびＳｃｈａｆｆｎｅｒによ
り以前示されたように、９０％以上の運動ニューロンを
含有していた（１９８１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１：
２０４−２０７）。精製した運動ニューロン培養物にお
いては、ＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）は未処理のものに
比べてＣＡＴ活性の１０倍上昇を刺激した（図２９）。
メトリザミドグラジェントは、多量の運動ニューロンか
ら少量のコリン作動性神経節前交換神経ニューロンのあ
りうる夾雑プールを分離しうる。この結果はＣＮＴＦが
運動ニューロンの生存を促進しそしてコリン作動性の発
現を刺激することを示している。
【０３７８】（実施例１０：海馬培養物におよぼす毛様
体神経栄養因子の作用） （１ 材料および方法） （１．１ 海馬細胞培養物）Ｓｐｒａｎｇｕｅ−Ｄａｗ
ｌｅｙ系ラットのＥ１８−１９ラット胚から海馬を切り
出し、Ｆ１０培地中に集めた。組織を細断し、Ｆ１０培
地（Ｇｉｂｃｏ）で２回すすぎ、そして３７℃で０．２
５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いて２０分間トリプ
シン処理した。トリプシンは、ウシ胎児血清（ＦＣＳ，
１０％）、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（２５単
位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（２５μｇ／ｍ
ｌ）を補添した最小必須培地（ＭＥＭ）とから成る血清
含有の培地を添加して不活化した。おだやかに粉砕して
得られる解離細胞を集め、低速（５００ｒｐｍ）で３０
秒間遠心分離した。遠心分離を２回反復し、細胞ペレッ
トを血清含有培地に再懸濁させた。次いで、細胞をポリ
オルニチン（１０μｇ／ｍｌ）およびラミニン（１０μ
ｇ／ｍｌ）を被覆した６ｍｍのウェル又は３５ｍｍの皿
上に塗布した。実験の大部分において、細胞は約７１，
０００細胞／ｃｍ２の低密度で塗布した。細胞を塗布し
て５−６時間後に培地を１％Ｎ３およびペニシリン−ス
トレプトマイシン（それぞれ、２５単位／ｍｌおよび２
５μｇ／ｍｌ）を含有する無血清培地と交換し、その時
点でＣＮＴＦを添加した。培地は３〜４日毎に交換し、
因子を再添加した。ニューロン富化された培養物を得る
ためには、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ，０．３
μＭ）を２４時間添加した。この条件下で海馬培養物は
ＧＦＡＰ免疫組織化学法によりアッセイして約５〜１０
％のグリア細胞を含有していた。
【０３７９】（１．２ ＧＡＤ酵素活性のためのアッセ
イ）ＧＡＤ酵素活性はＫｉｍｕｒａおよびｋｕｒｉｙａ
ｍａの方法（１９７５，Ｊｐｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍａ，２
５：１８９−１９５）に従いＬ−［１−14Ｃ］グルタミ
ン酸からの14ＣＯ2の放出を計測することにより測定し
た。３５ｍｍ皿上の細胞を５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ
７．２）および０．２５％トリトン Ｘ−１００を含有
する３０μｌの溶液を用いて溶解させ、こすりおとしそ
して集めた。細胞溶解物５ｍｌをＧＡＤ酵素活性に関し
てアッセイした。代表的なアッセイにおいては、反応混
合物は０．５７ｍＭのＬ−［１−14Ｃ］グルタミン酸
（ＮＥＮ，ＮＥＣ−７１５，５２．６ｍ Ｃｉ／ミリモ
ル）、グルタミン酸（３ｍＭ）、ピリドキサールリン酸
（０．２ｍＭ）およびＡＥＴ（１ｍＭ）をＫＨ2ＰＯ4緩
衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．２）中に含有していた。これ
ら反応条件下において、酵素反応は２．５時間まで直線
状であることが判明した。インキュベーションは３７℃
で２時間行ない、反応混合物に２５μｌの８Ｎ Ｈ2Ｓ
Ｏ4を注入することにより終了させた。次にインキュベ
ーションをさらに６０分間続けた。放出された１４ＣＯ
２はハイアミン（Ｈｙａｍｉｎｅ）塩基溶液中に補集し
そして計測した。
【０３８０】（１．３ ニューロフィラメントタンパク
質の測定）ニューロフィラメントタンパク質は実施例９
記載のようにしてＤｏｈｅｒｔｙらの方法（１９８４，
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，４２：１１１５−１１２２）
に従って定量した。
【０３８１】（１．４ 高アフィニティＧＡＢＡとり込
みの測定）高アフィニティＧＡＢＡとり込みは、Ｔｏｍ
ｏｚａｗａおよびＡｐｐｅｌの改変方法（１９８６，Ｂ
ｒａｉｎ Ｒｅｓ．３９９：１１１−１２４）を用いて
測定した。細胞を、１４０ｍＭ ＮａＣｌ，２．６ｍＭ
ＫＣｌ，１ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，１ｍＭ Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4，６ｍｇ／ｍｌのグルコース、１ｍＭ ＭｇＣｌ2，
１ｍＭ ＣａＣｌ2， ０．１％ ＢＳＡを含有するＧ
ＡＢＡとり込み用緩衝液中で洗浄した。洗浄後、細胞を
ＧＡＢＡとり込み用緩衝液と共に３７℃で５分間インキ
ュベートした。次に3Ｈ−Ｇａｂａ（ＮＥＮ，ＮＥＸ−
１９１Ｘ，１１１．４Ｃｉ／ミリモル）を１２ｎＭの最
終濃度で添加し、インキュベーションを３７℃で１０分
間行った。その後、細胞を氷上に持し、とり込み用緩衝
液で３回洗浄した。細胞を０．１４Ｎ ＮａＯＨと室温
で２時間インキュベートし、抽出物中の３Ｈ−ＧＡＢＡ
を計数した。3Ｈ−ＧＡＢＡとり込みは、少なくとも３
０分間にわたって直線状であることがわかった。非ニュ
ーロン中へのＧＡＢＡのとり込みは、２ｍＭ Ｂ−アラ
ニンの添加により阻害され、一方、ニューロンに特異的
なとり込みは１ｍＭのニペコチン酸（ｎｉｐｅｃｏｔｉ
ｃ ａｃｉｄ）による阻害により証明された。
【０３８２】（１．５ ＧＡＤまたはＧＡＢＡに関する
免疫組織化学的染色）細胞を４％パラホルムアルデヒド
を用い室温で３０分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。ＧＡ
Ｄ染色に関しては、細胞を５０％、７０％および５０％
のエタノールで逐次すすぐことにより透過性とした。培
養物は、５％の正常ウサギ血清を含有するＰＢＳで１時
間にわたって連続的にすすぐことにより遮断し、ヒツジ
抗−ＧＡＤ抗体１４４０（１：６０００に希釈）と４℃
で一夜インキュベートした。ＰＢＳで３回すすいだ後、
細胞を１：４００の希釈度のビオチニル化ウサギ抗−ヒ
ツジ抗体と室温で少なくとも９０分間インキュベートし
た。ＧＡＢＡ染色に関しは、細胞をトリス−ＨＣｌ
（０．１Ｍ，ｐＨ７．３）中のトリトンＸ−１００
（０．２５％）で透過性とし、１０％正常ヤギ血清で９
０分間遮断し、次にウサギ抗−ＧＡＢＡ抗体（１：５０
００）と４℃で一夜 インキュベートした。ＰＢＳで３
回すすいだ後、細胞を１：２００の希釈度のビオチニル
化ヤギ抗−ウサギ抗体と室温で少なくとも９０分間イン
キュベートした。ＧＡＧまたはＧＡＢＡ免疫反応性細胞
を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏ
ｒ Ｌａｂｓ）を用いることにより可視化した。
【０３８３】（１．６ ニューロン特異的エノラーゼ
（ＮＳＥ）に関する免疫組織化学的染色）４％パラホル
ムアルデヒドによる固定後に、細胞を、０．１％のトリ
トンＸ−１００を含有するＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血
清（ＮＧＳ）で遮断した。次に細胞を一次抗体（ウサギ
抗ＮＳＥ、１：５０００）と４℃で一夜インキュベート
した。次に、細胞を二次抗体（ヤギ抗−ウサギ、１：２
００希釈）と室温で少なくとも９０分間インキュベート
した。ＮＳＥ−免疫陽性細胞を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ
ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を用いて可
視化した。
【０３８４】（１．７ カルビンジンに関する組織化学
的染色）細胞をＰＢＳで２回すすぎ、４％パラホルムア
ルデヒドを用いて室温で３０分間固定した。１％正常
ウマ血清（ＮＨＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中の５％ＮＨＳを
用いて室温で１時間遮断した後、細胞を１％ＮＨＳ中の
マウス抗−カルビンジン抗体（１：１０００希釈）と４
℃で一夜インキュベートした。次に細胞を１％ＮＨＳで
３回すすぎ、二次抗体（ウマ抗−マウス、１：４００希
釈）と室温で９０分間インキュベートした。カルビンジ
ンに関する免疫反応性細胞を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ
ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用するこ
とにより可視化した。
【０３８５】（１．８ アセチルコリンエステラーゼに
関する組織化学的染色）アセチルコリンエステラーゼに
関する組織化学的染色を、Ｇｅｎｅｓｅｒ−Ｊｅｎｓｅ
ｎおよびＢｌａｃｋｓｔａｄｔの方法（１９７１，Ｚ．
Ｚｅｌｌ−ｆｏｒｓｃｈ １１４：４６０−４８１）に
従って行った。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホ
ルムアルデヒドを用いて室温で３０分間固定した。固定
された細胞を、次に５０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．
０）、４ｍＭアセチルチオコリンヨーダイド、２ｍＭ硫
酸銅、１０ｍＭグリシン、および１０μｇ／ｍｌゼラチ
ンを含有する反応混合物と共にインキュベートした。非
特異 的コリンエステラーゼはインキュベーション培地
中に０．２ｍＭエトプロパジンを含めることにより阻害
した。コリンエステラーゼの染色の特異性は、ネオスチ
グミン５μＭを添加することにより確かめた。７日間の
インキュベーションの終了後に、ゼラチンを３７℃で短
時間インキュベーションすることにより溶解させた。細
胞を水洗し、１．２５％Ｎａ２Ｓで１分間処理し、再度
水洗した。次にそれらを１％ＡｇＮＯ3で１分間処理
し、水およびＰＢＳで洗浄した。
【０３８６】（１．９ 毛様体神経栄養因子）全ての分
析に使用されたＣＮＴＦは、上記の実施例７に記載され
るようにして発現され精製された組換えラットＣＮＴＦ
であった。
【０３８７】（２ 結果）海馬をＥ１８の発育齢で採取
して培養した場合、ニューロン集団の大部分は分裂終了
錐体ニューロンからなっていた。塗布５〜６時間後、ニ
ューロンは既に神経突起を伸ばしておりそして培養１日
後に細胞間の接触の形跡があった。長い突起を有する明
視野（ｐｈａｓｅ−ｂｒｉｇｈｔ）細胞が明らかであっ
た。
【０３８８】海馬ニューロンを、種々の期間にわたって
ＣＮＴＦの存在下、または不在下で低密度（約７１，０
００細胞／ｃｍ２）で培養した。ＣＮＴＦ（１０ｎｇ／
ｍｌ）による海馬培養物の連続処理により、細胞が３Ｈ
−ＧＡＢＡを摂取する能力が高まった（図３０）。詳細
なニューロンＧＡＢＡとり込みの、ＣＮＴＦにより誘導
された増大の時間的経過は、図３０Ａに示されるように
遅かった。ＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）処理は、培養６
日目まではＧＡＢＡとり込みをわずかに増大させ、未処
理の対照に較べて約４倍の最大増加は、ＣＮＴＦ添加８
日後に観察された。１１日までの比較的長い培養期間で
それ以上大きな増大を生じなかった。培養中の海馬ニュ
ーロンに及ぼすＣＮＴＦの作用を更に評価するために、
ニューロフィラメントタンパク質を、ニューロフィラメ
ントタンパク質に対する抗体（ＲＴ９７）に続いてＥＬ
ＩＳＡアッセイを使用することにより定量した。ニュー
ロフィラメントは培養６日目まではごくわずか増大し、
８日目に最高約５倍まで増大することが測定された（第
３０Ｂ図）。また、ＧＡＢＡとり込みおよびニューロフ
ィラメントタンパク質の両方に関する同様の時間経過が
１ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦで観察された。
【０３８９】ＣＮＴＦの作用は、図３１に示されるよう
に、用量依存型であることが明らかとなった。詳細なニ
ューロンＧＡＢＡとり込みは、０．０１ｎｇ／ｍｌで増
大しそして０．１ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦで８日間処理し
た細胞に於いて最高約３倍まで増大した（第３１Ａ
図）。５０ｇ／ｍｌまでの比較的高濃度のＣＮＴＦを用
いてもＧＡＢＡとり込みをそれ以上増大させなかった。
また、同様に、ＣＮＴＦ処理培養物中のニューロフィラ
メントタンパク質は、用量依存性様式で増大し、０．１
ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦでプラトーに達した（第３１Ｂ
図）。５０ｎｇ／ｍｌまでの比較的高濃度のＣＮＴＦを
用いてもニューロフィラメントタンパク質の量をそれ以
上増大させなかった。
【０３９０】ＧＡＢＡ作動性ニューロンに及ぼすＣＮＴ
Ｆの作用を調べる別法として、ＧＡＤ酵素活性を、ＣＮ
ＴＦの存在下で８日間インキュベートされた培養物中で
測定した。ＣＮＴＦは海馬ニューロン中のＧＡＤ酵素活
性を用量依存様式で増大させることがわかった（図３１
Ｃ）。得られた用量−応答曲線の形状は、ＧＡＢＡとり
込みおよびニューロンフィラメントタンパク質に関して
観察されたものと同様であった。ＧＡＤ酵素活性の３．
８倍の最大増大が、０．１ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦで観察
された。
【０３９１】ＧＡＤ酵素活性に及ぼすＣＮＴＦの作用が
酵素活性の誘導によるものであるか、またはＧＡＢＡ作
動性ニューロンに及ぼす生存作用によるものであるかを
調べるため、ＧＡＤ−免疫反応性ニューロンの数を、Ｃ
ＮＴＦの存在下または非存在下に成長させた細胞で測定
した。１０ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＣＮＴＦは、ＮＳＥお
よびＧＡＤ陽性ニューロンの数をそれぞれ２．２倍およ
び２．３倍に増大させた。ＧＡＢＡに対する抗体を用い
る免疫組織化学的染色では、同様の結果を生じた（図３
３Ａ）。カルビンジンは、歯状回、ＣＡ１錐体ニューロ
ンおよびいくつかの介在ニューロンを含む海馬ニューロ
ンのサブ集団に局在した（Ｂａｌｍｂｒｉ−ｄｇｅおよ
びＭｉｌｌｅｒ，１９８２，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，２４
５：２２３−２２９）。低密度の海馬培養物をＣＮＴＦ
（１０ｎｇ／ｍｌ）処理すると、カルビンジン免疫陽性
細胞が３倍増大した（図３２Ｂ）。培養８日後に、アセ
チルコリンエステラーゼ陽性細胞の数も対照と較べてＣ
ＮＴＦ処理培養物中では約１７倍増大した（図３３
Ｂ）。
【０３９２】ＣＮＴＦはＧＡＢＡ作動性表現型形質を誘
導する作用をするよりもむしろ培養中のＧＡＢＡ作動性
ニューロンを救うための生存因子として作用していたこ
とを更に証明するために、遅延添加実験を行った。ＣＮ
ＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を塗布後種々の時点で添加しそ
してＧＡＢＡとり込みまたはニューロフィラメントタン
パク質の量を培養８日目に測定した。第３４Ａ図に示さ
れるようにＣＮＴＦの添加を１日遅延させた場合、７日
後にアッセイした場合の、ＣＮＴＦにより誘導されたＧ
ＡＢＡとり込みの増大は低下した。ＣＮＴＦの添加を塗
布後３日間に行った場合、ＣＮＴＦはもはやＧＡＢＡと
り込みを増大させなかった。ニューロフィラメントタン
パク質のＣＮＴＦ誘導による増加は、ＣＮＴＦの添加を
３日遅延した場合に同様に減少した（図３５Ａ）。この
観察は、その因子にさらす時間が不充分なためという可
能性を除外するために、以下の実験を行った。ＣＮＴＦ
（１０ｎｇ／ｍｌ）を培養３日目に添加し、細胞を、Ｇ
ａｂａとり込みおよびニューロフィラメントタンパク質
の測定に先立ち８日間その因子で処理した。かかる条件
下で、ＣＮＴＦ因子はＧａｂａとり込みの増大を誘導し
得ず、ニューロフィラメントタンパク質に及ぼす作用
は、大幅に減少した（図３４Ｂ、図３５Ｂ）。
【０３９３】星状細胞は、ＮＧＦを含む多くの神経栄性
因子の豊富な起源であることが示されている。ＣＮＴＦ
の作用がニューロンに直接作用することよりむしろグリ
ア細胞からのかかる因子の放出を媒介するものであった
という可能性を調べるために、ＣＮＴＦ誘導によるＧＡ
ＢＡとり込みの増大をニューロン富化培養物中で調べ
た。図３６に示されるように、ＡｒａＣ処理培養物中に
おいてＣＮＴＦは未処理対照に較べて、２．４倍のＧａ
ｂａとり込み増大を生じた。ＧＡＢＡとり込みの刺激
は、ニューロン−グリア混合培養物（−Ａｒａｃ）中、
またはニューロン富化培養物（＋Ａｒａｃ）中で同様で
あった。加えて、ＡｒａＣ処理培養物中のＣＮＴＦに関
する用量応答曲線は、最大応答に必要なＣＮＴＦの濃度
がさらに低い（０．１ｎｇ／ｍｌに較べて０．０３ ｎ
ｇ／ｍｌ）という点で左側にわずかにシフトした。
【０３９４】ＧＡＢＡ作動性ニューロンに及ぼすＣＮＴ
Ｆの作用は細胞が塗布される密度に依存していた。７
１，０００細胞／ｃｍ2の低い塗布密度で、ＣＮＴＦ
（１０ｎｇ／ｍｌ）は Ｇａｂａとり込みの約２．６倍
の増加を生じた（図３７Ａ）。比較的高い塗布密度（１
４３，０００細胞／ｃｍ２）では、ＣＮＴＦは飽和濃度
（１０ｎｇ／ｍｌ）でＧａｂａとり込みの有意な増大を
誘導し得なかった。ニューロフィラメントタンパク質の
レベルに及ぼすＣＮＴＦの作用は、同様に細胞密度に依
存していた（図３７Ｂ）。これは、高密度の培養物中に
おける神経栄養因子のレベル上昇によるのかも知れな
い。培養中の海馬ニューロンは、既にグルタメート神経
毒性を受け易いことが以前に示されている（Ｍａｔｔｓ
ｏｎ，Ｍ．Ｐ．ら、（１９８８）Ｊ．Ｎｒｕｒｏｓｃ
ｉ．８：２０８７−２１００）。我々は図３８に示すよ
うに、比色ＭＴＴアッセイにより、種々の濃度（１０〜
１０００μＭ）のグルタメートの神経毒性作用を評価し
た。１ｍＭの濃度のグルタメートは細胞生存率を約１０
％まで減少させた。ＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在
下では、グルタメートにさらした後の細胞生存率が高ま
った。
【０３９５】（３ 考察）ＣＮＴＦは培養中の幾つかの
異なったニューロン集団の生存および成長を増進するこ
とが示されている。加えて、ＣＮＴＦ様活性は、培養中
のグリア前駆細胞から２型星状細胞の分化を誘導するこ
とが示されている（Ｈｕｇｈｅｓら、１９８８，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３５５：７０−７３；Ｌｉｌｌｉｅｎら、１９
８８，Ｎｅｕｒｏｎ １：４８５−４９４）。本発明者
らは、ＣＮＳ中のＣＮＴＦの新規な作用に関する事実を
提供した。即ち、ＣＮＴＦはインビトロでＥ１８海馬か
ら単離したニューロンの生存を支持する。ＣＮＴＦで海
馬ニューロンを処理すると、ＧＡＤ酵素活性の増大に伴
うＧａｂａ摂取の増大がもたらされる。海馬培養物のニ
ューロフィラメントタンパク質レベルは、ＣＮＴＦの存
在下で同様に増加した。用量応答の研究では、これらの
種々のマーカー間の相関関係および０．１ｎｇ／ｍｌの
ＣＮＴＦで得られるＣＮＴＦの最大効果を示す。比較的
高濃度のＣＮＴＦではより大きな効果を生じないことが
明らかであった。
【０３９６】ＣＮＴＦの作用は、ＣＮＴＦ作動表現型マ
ーカーの選択 的誘導により説明できよう。しかしなが
ら、遅延添加の結果は、ＧＡＢＡの生存作用を強く支持
するものである。本発明者らは、ＣＮＴＦの添加を３日
遅延させた場合、最早ＧＡＢＡ作動性細胞にその作用を
及ぼせないことがわかった。ニューロフィラメントタン
パク質の量は依然として有意に増加したが、その作用は
ＣＮＴＦが０日目に添加された場合に観察された作用よ
りも大幅に小さかった。
【０３９７】ＣＮＴＦの密度依存性作用では、高濃度で
は細胞が生存にＣＮＴＦをを必要とするとは思わないこ
とが示される。これは、ニューロンまたは星状細胞から
の内在性の神経栄養因子の局所的放出によるか、または
細胞間の相互作用によるものであり得よう。海馬ニュー
ロンの生存は星状細胞の存在下で増進されることが示さ
れている（ＢａｎｋｒｅおよびＣｏｗａｎ，１９７７，
Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１２６：３９７−４２５）。関与
する因子は、ＣＮＴＦまたはニューロトロフィン群の一
員である可能性がある。ニューロン富化培養物中では、
ＧＡＢＡとり込みおよびニューロフィラメントタンパク
質に及ぼすＣＮＴＦの作用は影響されなかった。そのデ
ータは、ＣＮＴＦの作用に於ける星状細胞の役割に強く
反対するものであり、そしてその作用がニューロンに対
する直接の作用により媒介されることを示唆している。
ｍｙｃ−標識ＣＮＴＦリガンドおよびｍｙｃに対する抗
体を用いて、我々はニューロンにＣＮＴＦのレセプター
が存在する証拠を有する。
【０３９８】海馬ニューロンに対するＣＮＴＦの存在促
進活性はＧＡＢＡ作動性ニューロンに限定されないと思
われた。本発明者らは、アセチルコリンエステラーゼ免
疫陽性細胞の数もＣＮＴＦの存在下で増大する証拠を有
する。ＡｃｈＥ−組織化学的染色の強さは、ＣＮＴＦ処
理培養物中でははるかに顕著であった。これは、内側隔
膜中のコリン作動性ニューロンに関する逆行性の生存因
子および分化因子としてのＣＮＴＦのありうる役割に重
要な意味をもち得よう。
【０３９９】神経表現型の二つの一般的なマーカー、即
ちＮＳＥおよびＮＦの発現はＣＮＴＦの存在下で増大し
た。ＮＦタンパク質蓄積の測定は酵素結合免疫吸着アッ
セイを用いて行った。使用したモノクローナル抗体（Ｒ
Ｔ９７）は、ＮＦタンパク質トリプレットの主に ２０
０ＫＤａ形態、そしてわずかに１５０ＫＤａサブユニッ
トを認識した。ＲＴ９７の結合レベルは、培養に関して
は神経突起の伸び、特に、軸索の伸びの自由裁量による
指数として役立ちうることが既に示されている（Ｄｏｈ
ｅｒｔｙら、１９８４，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．
５１：５５−６０）。ＣＮＴＦで維持された８日令海馬
培養物は、一層緻密で複雑な突起のネットワークを示し
た。ＮＦタンパク質の相対量のこの増加は単に改良され
たニューロン生存に対する二次的であり得よう。また、
ＣＮＴＦは神経突起の伸びの誘導に選択的な作用を有し
よう。
【０４００】ＣＮＴＦの生存促進活性の特異性は、海馬
中に存在することが知られているその他の神経栄養因子
の作用を調べることにより提示されていた（Ｍａｉｓｏ
ｎ−ｐｉｅｒｒｅら、１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
７：１４４６−１４５１）。ＮＧＦが海馬ニューロンの
生存因子ではないという以前の観察と合致して、我々は
ＧＡＢＡ作動性ニューロンに及ぼすＮＧＦのいかなる作
用も検出できなかった。また、ニューロトロフィン群の
もうひとつの一員であるＢＤＮＦも培養中のＧＡＢＡ作
動性ニューロンの生存を促進しないようである。一方、
ｂＦＧＦは、海馬中の重要な生存因子であることが示さ
れており（Ｗａｌｌｉｃｋｅら、１９８６，ＰＮＡＳ
ＵＳＡ ８３：３０１２−３０１６）、ＣＮＳ中の神経
栄養因子として作用することが示されていた（Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎら、１９８６，ＰＮＡＳＵＳＡ ８３：７５３
７−７５４１；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８８，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３３２：３６０−３６１）。ｂＦＧＦと同様
に、ＣＮＴＦは非常に低濃度で活性である。
【０４０１】海馬は、アルツハイマー病を含む幾つかの
神経変性性疾患で冒されることが示されている。海馬様
体の選択的変性をもたらす原因をなすメカニズムは理解
されていない。興奮性アミノ酸神経伝達物質グルタメー
トが疾患過程にある役割を果たし得ることが仮定されて
いる。ＣＮＴＦがインビトロで海馬ニューロン生存を支
持し得るという実証は、神経変性性疾患の治療的な手段
を設計するのに重要な意味をもち得る。ＦＧＦに関して
観察されているように（Ｍａｔｔｓｏｎら、１９８６，
ＰＮＡＳ ８３：７５３７−７５４１）、ＣＮＴＦがグ
ルタメート神経毒性に対して海馬ニューロンを保護し得
るか否かを決定することは重要である。ＣＮＴＦに関す
るメッセンジャーＲＮＡが、ノーザンブロット分析（Ｍ
ａｓｉａｋｏｗｓｋｉ，個人的通信）により海馬で最近
検出されている。インビボでのＣＮＴＦ合成の細胞型特
異性はまだ決定されていない。インビボ発達中の海馬に
おけるＣＮＴＦの生理学的役割は不明なままであるが、
本発明での所見に鑑みて、ＣＮＴＦは海馬中のニューロ
ン生存を調節する役割を有する可能性のある内在性の神
経栄養因子であり得る。
【０４０２】（実施例１１：ラットＣＮＴＦは培養中の
ラット海馬星状細胞の成長速度を増大させる） （１ 材料および方法） （１．１ ラット海馬星状細胞の調製）海馬をＥ１８ラ
ット胚から切り出し、２４ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する
Ｆ１０培地（Ｇｉｂｃｏ）中に収集した。組織を小さな
かたまりに細断し、そして０．２５％トリプシン（１３
海馬／５ｍｌの０．２５％トリプシン）で３７℃で２０
分間トリプシン処理した。ＤＮＡアーゼを０．２ｍｇ／
ｍｌの最終濃度となるまで添加し更に１０分間おいた。
反応は、１０％のウシ胎児血清を補添した同量のＤＭＥ
用いて停止させそして組織を２回洗浄した。穏やかに砕
いて得られた解離細胞をＤＭＥ／ＦＣＳ中に収集し、こ
の懸濁液を２０ｍｍ Ｎｉｔｅｘスクリーン（Ｔｅｔｋ
ｏ）に通してかたまり物を除去した。細胞生存度を、ト
リパンブルー排除法を用いて測定した。次に細胞を組織
培養プラスチックＴ７５フラスコに４．８２×１０6細
胞／フラスコで塗布した。塗布後１日目、３日目、５日
目、７日目および９日目に培地をＤＭＥ−ＦＣＳ（１０
ｍｌ）と交換した。７日目および９日目に、フラスコを
手で振って希突起膠細胞および生存するニューロンを除
去した。１０日目に、星状細胞を０．２５％のトリプシ
ンを用いて除去しそして９６ウェルプレートに塗布して
アッセイした。
【０４０３】（１．２ ラット海馬星状細胞に関するＣ
ＮＴＦ分裂アッセイ）分裂アッセイを行うには、星状細
胞を１０％ウシ胎児血清を含有する培地（ＤＭＥＭ）中
に１６，０００細胞／ウェルの密度で塗布して４時間付
着させた。次に、細胞をすすぎ、１５０μｌの特定培地
（ＤＭＥＭ、０．５％ＢＳＡ）を添加した。上記の実施
例２記載のようにして調製された組換えラットＣＮＴＦ
を添加し２４時 間おいた。細胞の標識化は、１μＣ／
ウェルの3Ｈ−チミジン（ＮＥＮ，２０Ｃｉ／ｍＭ）を
用いて２４時間のインキュベーション時間の最後の２時
間で行った。インキュベーション後、細胞を以下のよう
に処理した。ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、１０％トリ
クロロ酢酸（ＴＣＡ）５０ｍｌ中４℃で一夜インキュベ
ートした。ＴＣＡを除去後、細胞を冷水中で洗浄し、１
Ｎ ＮａＯＨ１００μｌに可溶化させそして１０ｍｌの
アクアゾル（ａｑｕａｓｏｌ）中で液体シンチレーショ
ン計数器で計数した。
【０４０４】（１．３ （125Ｉ）ＣＮＴＦ結合アッセ
イ）海馬星状細胞を３７ｍｍ２の皿中で約８０〜９０％
集密となるまで成長させた。星状細胞単層を、まず、Ｈ
ａｍのＦ−１２培地中で２回（２ｍｌ）すすいだ。次
に、Ｆ−１２（１ｍｌ）を添加し、細胞を氷上で１５分
間インキュベートした。次に培地を同量の冷Ｈａｍ培地
と交換した。非競合的結合測定に用いられる予定のウェ
ルに未標識ＣＮＴＦ（非標識ＣＮＴＦの１００倍過剰）
を添加しそして培養物を更に６０分間４℃でインキュベ
ートした。125Ｉ−ＣＮＴＦ（１ナノモノ当り１１２μ
Ｃｉで約２８０，０００ｄｐｍを含有する１０μｌ、Ｂ
ｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬を用いて調製）を各培養
物に添加し、そして６０分までの種々の時間にわたって
４℃でインキュベーションを続けた。非結合ＣＮＴＦ
は、細胞を１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する冷ＰＢＳ
（２ｍｌずつ）を用いて３回洗浄することにより除去し
た。次に０．５ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ
７．２，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１％トリトン、０．１
％ＳＤＳ、１％デオキシコレート中で室温で少なくとも
２０分間培養物をインキュベートすることにより、細胞
を可溶化させた。細胞溶解物を除去し、培養物を１０μ
ｌ／ｍｌのＢＳＡ含有ＰＢＳで２回（２５０μｌずつ）
すすいだ。洗液を細胞溶解物と一緒に集め、ガンマー計
数器で計測した。
【０４０５】（２ 結果）図３９に示される増殖アッセ
イの結果は、ラット海馬星状細胞に関する漸増濃度のＣ
ＮＴＦを用いた場合の二相性用量応答曲線を示す。ＣＮ
ＴＦは０．０１ｎｇ／ｍｌの用量までは3Ｈ−チミジン
とり込みの増加を生じる。０．１ｎｇ／ｍｌより高い濃
度では、ＣＮＴＦは細胞増殖を刺激する能力を失なう。
【０４０６】ＣＮＴＦに対する星状細胞の生物学的応答
では、これらの細胞が機能性ＣＮＴＦレセプターを有す
ることが示される。更に二つの実証資料では、１型の星
状細胞がそれらの細胞表面でＣＮＴＦレセプターを発現
するという初期の知見が支持される。単層培養物に関す
る（125Ｉ）ＣＮＴＦとの結合実験では、競合しうるリ
ガンド−レセプター部位が例証された。すなわち観察さ
れた１２５Ｉ−ＣＮＴＦの最大の特異的結合は、各培養
物に添加された全ＣＮＴＦの約１％に相当した。更に、
ノーザンブロット分析では、ＣＮＴＦが極初期遺伝子ｃ
−ｆｏｓの発現を強く誘導することが示された。最大の
ｍＲＮＡ誘導が１時間まで観察され、そして２時間まで
に正常な基準量に戻った。
【０４０７】（実施例１２：毛様体神経栄養因子に対す
る新規なモノクローナル抗体およびヒト毛様体神経栄養
因子に関する二抗体サンドイッチアッセイ） （１）材料および方法 （１．１ 毛様体神経栄養因子に対するモノクローナル
抗体の生成） （１．１．１ 免疫化プロトコル）ＣＢ６Ｆ１／Ｊ雌マ
ウスに、完全にフロイントアジュバント中の１０〜４０
μｇの組換えヒトＣＮＴＦ（実施例７記載のようにして
調製）を接種し、次に約６ケ月まで３週間毎に完全フロ
イントアジュバント中のｒＣＮＴＦを再接種した。
【０４０８】（１．１．２ ハイブリドーマ形成）免疫
化マウスからの脾臓細胞を、ＰＥＧ ４０００を用いＳ
Ｐ２／０ミエローマ細胞と２：１の比率（リンパ球：ミ
エローマ細胞）で融合させ、次に２％ＨＡＴ（ヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、およびチミジン）を含有する
完全ＲＰＭＩ中で１ウェル当り約１０５リンパ球の細胞
密度で培養してハイブリドーマを選択した。
【０４０９】（１．１．３ ＣＮＴＦ反応性に関してハ
イブリドーマのスクリーニング）ヒトＣＮＴＦ（ｈＣＮ
ＴＦ）と反応性の抗体を、初めにプラスチックアッセイ
皿に結合された組換えｈＣＮＴＦを用いる酵素結合免疫
吸着分析（ＥＬＩＳＡ）により同定した。抗体は組換え
ｈＣＮＴＦ、組換えラットＣＮＴＦ（ｒＣＮＴＦ）、お
よび下記のｈＣＮＴＦの変化形態と反応する能力に関す
るＥＬＩＳＡおよびウェスタンイムノブロッティングに
より更に特性決定した。
【０４１０】（１．２ ヒトＣＮＴＦの変異体の調製）
ヒトＣＮＴＦの変異体形態の実施例８の（１．２）に記
載されるベクターの発現および精製により生成させた。
簡単に云えば、ヒトＣＮＴＦ変異体タンパク質▲１２
は、ベクターｐＲＰＮ１１２の発現により得られ、ヒト
ＣＮＴＦのカルボキシル末端の５５アミノ酸残基を欠い
ている。タンパク質▲４９は、ｐＲＰＮ５９を用いて生
成され、ｈＣＮＴＦのカルボキシル末端の１５アミノ酸
を欠いている。タンパク質▲８２は融合タンパク質であ
り、ここではヒトＣＮＴＦの最初の６６アミノ酸が欠失
され、残りの分子は未確認ヒトタンパク質に融合してい
る（図２２）。
【０４１１】（１．３ 二分位イムノアッセイのための
方法）生物学的物質の試料中のＣＮＴＦ量を測定するた
めには、タンパク質に関するイムノアッセイを開発する
ことは有益であろう。一つの高感度で便利なイムノアッ
セイは、二抗体サンドイッチ法である（例えば、Ｅ．Ｈ
ａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８
８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，
ＮＹ．５７８−５８３頁）。この方法に於いては、一次
抗体を固形支持体に結合させ、目的の抗原を含有する溶
液と反応せしめる。次に、通常その抗原の異なるエピト
ープに対する第二の抗体を、一次抗体に結合した抗原と
反応させ、結合した第二抗体の量（これは結合された抗
原量に正比例すべきである）を定量する。この方法の一
つの実施態様に於いては、一次抗体および二次抗体はモ
ノクローナル抗体である。
【０４１２】ヒトＣＮＴＦに関して開発された二部位ア
ッセイを図４０に示す。実質的には、マウス免疫グロブ
リンＧの一つのサブクラス（図示される場合では、Ｉｇ
Ｇ２ｂ）に特異的なアフィニティ精製二次抗体をアッセ
イレートに吸着させ、そしてハイブリドーマ細胞の使用
済の培養上清から第一のモノクローナル抗体（ＲＰ３−
１２、マウスＩｇＧ２ｂ）を捕捉するのに使用した。次
にヒトＣＮＴＦを添加して第一のモノクローナル抗体に
結合させた。次に、第一抗体とは異なるサブクラスの、
これも未分画ハイブリドーマ細胞上清由来の第二の抗Ｃ
ＮＴＦモノクローナル抗体（ＲＰ１２−２、マウスＩｇ
Ｇ１）を添加し、そして第一のモノクローナル抗体によ
り捕捉されたＣＮＴＦに結合させた。次に、結合された
ＲＰ１２−２分子を、アルカリホスファターゼに接合さ
れたマウスＩｇＧに特異的なアフィニティ精製第二抗体
を用いて、ホスファターゼ基質パラ・ニトロフェニルホ
スフェート（その開裂は着色反応生成物を生ずる）との
インキュベーション後に検出した（４０５ｎｍでの吸光
度により測定）。
【０４１３】（２ 結果および考察）ＲＰ３−１２およ
びＲＰ３−１７により代表されるクラスのモノクローナ
ル抗体を、単一の免疫化マウスからの脾臓細胞を使用し
て同じ融合実験により生成させた。ＲＰ３−１２および
ＲＰ３−１７の両方とも試験したｈＣＮＴＦの二つのカ
ルボキシ末端欠失のいずれとも反応できず、また表５に
示されるラットＣＮＴＦを結合しない。しかしながら、
それらはｈＣＮＴＦカルボキシル末端が保持された融合
タンパク質▲８２とは反応する。したがって、これらの
抗体は、ｈＣＮＴＦタンパク質▲５９中の欠失した１５
カルボシル−末端アミノ酸残基のセグメント内、または
そのセグメントと重なるｈＣＮＴＦのカルボキシル末端
近くに位置するエピトープ（または近くに隔置されたエ
ピトープ）を認識する。それとは対照的に、モノクロー
ナル抗体ＲＰ１２−２およびＲＰ１２−９は、融合タン
パク質▲８２のみならずｈＣＮＴＦタンパク質▲５９お
よびｈＣＮＴＦタンパク質の▲１１２の両方と反応す
る。したがってこれら抗体の両方共ｈＣＮＴＦのアミノ
酸のおよそ６６と１４５との間に位置するエピトープを
認識する筈である。したがって、遺伝子地図データで
は、ＲＰ１２−２およびＲＰ１２−９により認識される
エピトープがＲＰ３−１２またはＲＰ３−１７により認
識されるエピトープの少なくとも約４０アミノ酸残基上
流にあるに違いないことが示される（図２２）。ＲＰ１
２−２およびＲＰ１２−９抗体はラットＣＮＴＦ（表
５）を認識する能力が異なっており、このことはそれら
が別個のエピトープを認識することを意味しており、一
方（ＲＰ１２−９により認識される）はげっ歯類および
霊長類の間で良く保存されている確率が高い。全てのこ
れらのモノクローナル抗体がウェスタンイムノブロッテ
ィングアッセイにおいて変性ＣＮＴＦに結合しうること
は、それらが、配座エピトープよりむしろ、連続するか
または非常に近くに隔置されたアミノ酸残基を含んでな
る単純なエピトープを認識することを示唆している。
【０４１４】ｈＣＮＴＦに対するモノクローナル抗体の
対がこのリガンドに関する二抗体サンドイッチの開発に
適するか否かを判定するために、最初の実験を行った。
試薬の大規模な生産または精製に先立ち抗体を早い段階
で評価するために、サブクラス特異的な抗−マウス免疫
グロブリン試薬を利用して一つのモノクローナル抗体を
固形支持体に固定させ、そして第２の「レポーター」モ
ノクローナル抗体を示差的に検出するアッセイを設計し
た。二つのモノクローナル抗体が異なるサブクラスのも
のである必要があるために、モノクローナル抗体の或
種の対のみをこの方法で評価できた。ここに記載の二部
位イムノアッセイにおいては、ＲＰ３−１２およびＲＰ
１２−２の対を用いて優れた結果が得られた。第４１図
は、１アッセイ当り７．８ピコグラム（０．１５６ｎｇ
／ｍｌで５０μｌ）から１アッセイ５００ピコグラム
（１０．０ｎｇ／ｍｌで５０μｌ）までの漸増量（２の
因子による）組換えヒトＣＮＴＦを用いる滴定における
二抗体サンドイッチアッセイの結果を示す。バックグラ
ウンドをこえると確信できるシグナル（０．０４４±
０．０１０吸光度単位）が１５．６ピコグラムのヒトＣ
ＮＴＦで検出可能であり、そしてアッセイは試験した最
高値まで直線状であった。モノクローナル抗体のいずれ
かを適当なサブクラスの関連のないマウスミエローマタ
ンパク質で置換すること（ＲＰ３−１２に代えてＭＯＰ
Ｃ−１４１，ＩｇＧ２ｂの１種；またはＲＰ１２−２に
代えてＭＯＰＣ−２１，ＩｇＧ１の１種）は、信号をバ
ックグラウンドレベルまでシグナルを低下させた。
【０４１５】したがって、未精製培養上清を使用してさ
え、ひとＣＮＴＦに関する優れた二抗体サンドイッチア
ッセイが、モノクローナル抗体ＲＰ３−１２およびＲＰ
１２−２を用いて例証できた。これらのモノクローナル
抗体は無血清培地中で増殖されたハイブリドーマ細胞の
上清から慣用の方法により精製できる。一方のモノクロ
ーナル抗体を固形支持体に直接結合でき、第二のモノク
ローナル抗体はレポーター（例えば、125Ｉのような放
射性同位元素；またはアルカリホスファターゼ、セイヨ
ウワサビペルオキシダーゼ、もしくはβ−ガラクトシダ
ーゼのような酵素；または標識されたアビジンもしくは
ストレプトアビジンを用いて検出できるビオチンのよう
なハプテンに直接接合でき、こうして種特異的二次抗体
の必要をなくすという一層簡単なサンドイッチアッセイ
を開発することは全く容易なことが予想される。
【０４１６】ここに記載された高度に特異的な高感度の
抗体サンドイッチアッセイは、ヒトＣＮＴＦの存在を定
量的に測定することが所望される多くの状況に有用であ
ろう。例えば、それは精製操作中のヒトＣＮＴＦを監視
するのに使用し得る。同様に、このアッセイは、実験動
物に注射後にＣＮＴＦを監視しそれが局 在する組織を
判定するのに使用できる。最後に、このアッセイは、健
康な個体および疾患のある個体におけるヒト組織および
／または体液（例えば血清または脳脊髄液）中のＣＮＴ
Ｆレベルを測定するのに使用できる。ＣＮＴＦは神経中
の細胞内に見出されそして神経栄養活性を有するので、
このタンパク質が種々の種類のニューロン損傷または疾
患に応答して放出される可能性が示唆されている。した
がって、適当な細胞外液体中のＣＮＴＦのレベルは、神
経障害およびニューロン変性のような状態の定量的な診
断手段を提供できよう。
【０４１７】
【表５】 。
【０４１８】（実施例１３：毛様体神経栄養因子は培養
中の脊髄運動ニューロンの生存を促進する） （１ 物質および方法） （１．１ 組織培養技術）運動ニューロン柱を、胚発生
６日目のニワトリ胚の脊髄の腰部から立体顕微鏡下に切
り出し、そしてグルコース（４ｇ／ｌ）を補添した低温
のカルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス平
衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中に貯蔵した。組織をＨＢＳＳ
を洗浄しそして穏やかに振とうしながらＨＢＳＳ中の
０．０３％トリプシンで３７℃で２０分間処理し、冷Ｈ
ＢＳＳですすぎ、そしてＨＢＳＳ中の低温の０．１％大
豆トリプシンインヒビター（Ｓｉｇｍａ）１ｍｌ中で火
炎磨きシリコーン処理パスツールピペットに８回通過攪
拌させる操作を３回行って穏やかにすりくだいた。上清
の細胞懸濁液それぞれを５０μｍナイロンメッシュで濾
過し、プールしそして１２ｍｌのシリコーン処理円錐形
ガラス管中でＨＢＳＳ−２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ
７．４）中の低温の６．８％のメトリサミド（ｍｅｔｒ
ｉｚａｍｉｄｅ）（Ｆｌｕｋａ）４ｍｌに重層させた。
管を４００ｇで４℃で１５分間遠心分離し、中間層
（０．５ｍｌ）を、低温培地（グルコース（４ｇ／ｌ）
補添ＬｅｉｂｏｖｉｔｚＬ−１５培地（Ｇｉｂｃｏ）、
０．１５Ｍ重炭酸ナトリウム、熱失活し濾過したウマ血
清およびペニシリンＧ（１０5単位／ｍｌ）の７５：１
５：１０：０．１の比の混合物であって、新しく調製さ
れ５％ＣＯ 2で緩衝された混合物）６．５ｍｌを有する
別のシリーコン処理管中に回収した。１００ｇで４℃で
７分間遠心分離した後、上清を除去し、細胞を培地に穏
やかに再懸濁しそしてＧｒｅｉｎｅｒ４−ウェル培養皿
（ウェル直径１０ｍｍ；Ｃ．Ａ．（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｕ
ｎｄ Ｓｏｈｎｅ ＧｍｂＨ，ＮｕＴｒｉｎｇｅｎ，西
ドイツ）中で１０００〜２０００細胞／ウェルで塗布し
た。培養皿は、ポリ−ＤＬ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ，
０．１５Ｍホウ酸胞ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）中
０．５ｍｇ）で４℃で一夜下塗りし、リン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ）で２回すすぎ、続いてラミニン（Ｇｉｂｃ
ｏ；血清を含まない培地中１０μｇ／ｍｌ）で被覆しそ
して細胞塗布まで５％ＣＯ2インキュベーター中に置い
た。細胞を湿度調節した５％ＣＯ2−９５％空気インキ
ュベーター中３７℃でインキュベートした。試料を塗布
１時間後に添加し、培地は２４時間後および７２時間後
に交換した。当初の細胞数を塗布３時間後に数えた。
【０４１９】（１．２ 運動ニューロンの逆行性標識化
および運動ニューロンの培養物の純度の概算）幾つかの
実験に於いて、運動ニューロンを細胞調製（Ｕ．Ｄｏｈ
ｒｍａｎら、１９８６，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１１８：２
０９−２２１）に先立ちインビボで蛍光染料で逆行的に
標識し、運動ニューロン細胞集団を同定した。５日間イ
ンキュベートした卵の殻に小さな穴をあけた。ローダミ
ンイソチオシアネート結晶（Ｓｉｇｍａ）の小片を、後
脚の腿部に２箇所または３箇所で挿入しそして卵の穴を
セロハンテープで封じた。卵を更に２４時間インキュベ
ートした。その後、手術した胚の幾つかをホルムアミド
固定後に凍結切片となした。脊髄中で、外側の運動ニュ
ーロン柱のみが標識されたことがわかった。その他の胚
は上記の方法（１．１）を用いる細胞調製に使用した。
【０４２０】培養５時間後に、細胞を温かいＨＢＳＳで
すすぎ、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドを用い室温で
２０分間固定し、ＰＢＳですすぎ、次にカバーグラスを
用いてグリセロール−ＰＢＳ（１：１）中に据えた。全
細胞のうち、約８３％が標識されそして運動ニューロン
として同定された（第４２図）。これらの標識された運
動ニューロンの殆どは大きな細胞であり、残りは中間寸
法の細胞であった。小さな細胞は標識されなかった。一
方、細胞を蛍光染料で標識しなかった実験に於いては、
全細胞のうちの約７０％が丸い細胞体を有する大きな明
視野細胞であり、約２０％が中間の大きさのニューロン
（それらの殆ど が運動ニューロンであり得る）であ
り、そして約１０％が小さな未成熟ニューロン（それら
は成長円錐を伴なうニューロン様の過程を有するが、暗
視野半フラット細胞体を有する）であった。非ニューロ
ン細胞は存在しないか、あるいは２％未満であった。併
せて考えると、細胞の少なくとも８３％が運動ニューロ
ンであり、一方、残りは標識されない運動ニューロン
で、少数の未同定の中間サイズのニューロンおよび約１
０％の未成熟な小さいニューロンからなると結論し得
る。また、本発明者らは、標識された細胞をニワトリ胚
筋肉抽出物（Ｕ．Ｄｏｈｒｍａｎら、１９８６，Ｄｅ
ｖ．Ｂｉｏｌ，１１８：２０９−２１１）で培養した場
合、蛍光陽性細胞数が数日中に減少することを見い出し
た。全細胞または大きな細胞の数はずっとゆっくり減少
したことから、これは細胞の死よりむしろ蛍光の損失お
よび／または退失である。それ故、ルーチン実験で試料
の生存活性を概算するためには、蛍光陽性細胞よりむし
ろ、大きな明視野細胞を運動ニューロンとして計数し
た。
【０４２１】（２ 結果および考察） （２．１ 培養中のニワトリ胚脊髄運動ニューロンに及
ぼす毛様体神経栄養因子ＣＮＴＦの作用）運動ニューロ
ンの大部分はブランク対照に於いて培養３日以内に死滅
した。組換えラットＣＮＴＦの存在下では、約７０％は
培養３日後に生存しそして約６０％は培養６日後に生存
していた（第４３図および第４４図）。大部分の運動ニ
ューロンはブランク対照では３日以内に死滅したことか
ら、生存活性を３日目に概算した。ＣＮＴＦの濃度応答
曲線（第４５図）では、ＣＮＴＦのＥＣ５０（５０％生
存に必要な濃度）が約２０ｐｇ／ｍｌ（１ｐＭ）程度の
低さであり、これは毛様体ニューロンのそれとほぼ同じ
であることが示された。非常にＥＣ５０が低いＣＮＴＦ
の相当な生存活性は、ＣＮＴＦが示されているように
（上記の実施例６；Ｓｅｎｄｔｎｅｒら、１９９０，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４５：４４０−４４１）、インビボにお
ける運動ニューロン生存に決定的に重要な役割を果たし
ている可能性を強く示唆している。
【０４２２】（２．２ 特異的な神経栄養性分子および
サイトカインの生存効果）試験した全ての分子の中で、
ＣＮＴＦおよび塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が
最も有効な分子であることが判明した（第ＶＩ表）。培
養液にヘパリン（これは酸性ＦＧＦのタンパク分解的壊
変を妨害する）を補添した場合には、酸性ＦＧＦの生存
活性が増大し得た。インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）Ｉ
およびＩＩ、並びにインスリンはマイナーな効果しか示
さなかった。これらの活性分子に関する濃度−応答曲線
（第４６図）は、最高の生存効果が、下記の（ａ）〜
（ｇ）により得られうることを示した。すなわち（ａ）
ＣＮＴＦ＝１ｎｇ／ｍｌで６４％生存；（ｂ）塩基性
ＦＧＦ＝３０ｎｇ／ｍｌで５１％；（ｃ）酸性ＦＧＦ＝
３００ｎｇ／ｍｌで １８％；（ｄ）１μｇ／ｍｌのヘ
パリンの存在下の酸性ＦＧＦ＝１００ｎｇ／ｍｌで３５
％；（ｅ）ＩＧＦ−Ｉ＝１００ｎｇ／ｍｌで１５％；
（ｆ）ＩＦＧ−ＩＩ＝３００ｎｇ／ｍｌで１５％；
（ｇ）インスリン＝２５μｇ／ｍｌで１６％。ＥＣ50値
は、ＣＮＴＦに関して０．０２３ｎｇ／ｍｌでありそし
て塩基性ＦＧＦに関して０．２６ｎｇ／ｍｌであった。
ＩＧＦ−ＩおよびＩＩ並びにインスリンに関しては、最
大の効果が対照に較べて非常に小さかったので、信頼
できるＥＣ50値は測定できなかった。
【０４２３】ヘパリンの濃度は、酸性ＦＧＦの活性の増
強にとって決定的に重要であった。これらの実験で用い
られた濃度（１μｇ／ｍｌ）は、酸性ＦＧＦの生存活性
の増強にとって最大であるとは思われなかった。しかし
ながら、比較的高濃度のヘパリンは培養皿からのニュー
ロンの脱着を生じた。１μｇ／ｍｌのヘパリンでさえ
も、ニューロンの脱離がインキュベーション３日後には
始まった。βＮＧＦ，ＢＤＮＦ，ＰＤＧＦ，ＥＧＦ，Ｔ
ＧＦ α，ＴＦＧβ１，ＩＬ−１β，１Ｌ−３もしくは
１Ｌ−６またはＩＦＮｃは、最高濃度（その他の種類の
細胞におよぼす生物学的作用に関して）以上を使用した
場合でさえも、何ら認められうる作用を有しなかった。
また、ＮＧ−３、即ちＮＧＦ−ＢＤＮＦ遺伝子群の新し
い神経栄養性分子もこれらの実験に使用した。トランス
フェクションされたＣＯＳ細胞（これは培養中の胚結節
性神経節ニューロンの生存を支持した）により生産され
たＮＴ−３タンパク質の幾通りかの濃度のものは運動ニ
ューロンに対し生存作用を有するとは思われなかった。
【０４２４】（２．３ ＣＮＴＦ、塩基性ＦＧＦおよび
ＩＧＦ−Ｉの組合せ）最適濃度のＣＮＴＦと塩基性ＦＧ
Ｆとの組合せ物は、１週間の期間にわたって運動ニュー
ロンを１００％生存させた（表７）。同じことが、ＣＮ
ＴＦ、塩基性ＦＧＦおよびＩＧＦ−Ｉの組合せに関して
も当てはまった。ＩＧＦ−Ｉの作用はそれのみでは小さ
い（表６）が、それをＣＮＴＦおよび／または塩基性Ｆ
ＧＦと組合せた場合には、ずっと明確となった（表
７）。
【０４２５】
【表６】 ａ：生存活性は、培養中３日後に測定し、−〜＋＋＋で
評価した。−、対照からの有意差なし（生存率：８．３
±３．８％、平均±ＳＤ、ｎ＝１８）；±、約１５〜２
０％（それぞれのプランク対照か ら統計上有意差あ
り、ｐ＜０．０１）；＋＋、約３５ 〜５５；＋＋＋、
約５５〜７５％。結果を異なる実験から組合せた。ｒｅ
ｃ．は組換え体を表わす。
【０４２６】
【表７】 ａ：運動ニューロン生存率は、各ウェル底部の２３％に
相当する領域中の細胞を計数することにより、培養３日
後に測定した。平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）。 ＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；ＮＳ，有意差
なし。 ＩＧＦ−Ｉの効果は比較的小さいので、ｔ−試験の結果
はＩＧＦ−Ｉの有無の場合の値間の比較に関してのみ示
した。その他の意味のある比較の差違は有意である（ｐ
＜０．０１）。
【０４２７】（微生物の寄託）下記の組換えバクテリオ
ファージおよび組換えプラスミドＤＮＡは米国、メリー
ランド州２０８５２、ロックビル、Ｐａｒｋｌａｗｎ
Ｄｒｉｖｅ１２３０１にあるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し
た。
【０４２８】
【表８】 下記の組換えプラスミドＤＮＡは、イリノイ州６１６０
４，Ｐｅｏｒｉａ，Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｓｔｒｅｅｔ １８１５にあるＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｒ
ｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ内の
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓａｅｒｃｈ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｎ）（ＮＲＲＬ）に寄託し
た。
【０４２９】
【表９】 本発明はここに記載した詳細な実施態様によって範囲を
限定されない。事実、ここに記載した本発明の実施態様
に加え他の種々の変更態様が上述の説明および添付の図
面から当業者には明白であろう。このような変更態様は
添付の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【０４３０】種々の刊行物をここに引用しているが、そ
の開示は参照としてその全体がとり込まれるものとす
る。
【０４３１】
【発明の効果】本発明によれば、毛様体神経栄養因子
（ＣＮＴＦ）をコードする核酸配列およびそれから生産
されるタンパク質、ペプチドおよび誘導体が提供され
る。さらに、本発明の核酸配列、タンパク質およびペプ
チドを、アルツハイマー病やパーキンソン病を含有する
がそれらに限定されない種々の神経学的疾患および障害
の治療に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１は、ラットＣＮＴＦのｃＤＮＡクローニ
ング（Ａ）、ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列
（Ｂ）、プライマーとして用いたオリゴヌクレオチド
（Ｃ）、アミノ酸組成（Ｄ）を示す。
【図１Ｂ】図１は、ラットＣＮＴＦのｃＤＮＡクローニ
ング（Ａ）、ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列
（Ｂ）、プライマーとして用いたオリゴヌクレオチド
（Ｃ）、アミノ酸組成（Ｄ）を示す。
【図１Ｃ】図１は、ラットＣＮＴＦのｃＤＮＡクローニ
ング（Ａ）、ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列
（Ｂ）、プライマーとして用いたオリゴヌクレオチド
（Ｃ）、アミノ酸組成（Ｄ）を示す。
【図１Ｄ】図１は、ラットＣＮＴＦのｃＤＮＡクローニ
ング（Ａ）、ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列
（Ｂ）、プライマーとして用いたオリゴヌクレオチド
（Ｃ）、アミノ酸組成（Ｄ）を示す。
【図２Ａ】図２は、特定の精製法を用いて得られたＣＮ
ＴＦの二次元ゲル電気泳動を示す。
【図２Ｂ】図２は、特定の精製法を用いて得られたＣＮ
ＴＦの二次元ゲル電気泳動を示す。
【図３Ａ】図３は、トランスフェクションされたＨｅＬ
ａ細胞の上清および抽出物の存在下における培養Ｅ８ニ
ワトリ毛様体ニューロンの生存を示す。
【図３Ｂ】図３は、トランスフェクションされたＨｅＬ
ａ細胞の上清および抽出物の存在下における培養Ｅ８ニ
ワトリ毛様体ニューロンの生存を示す。
【図４Ａ】図４は、成体ラット組織中のＣＮＴＦ−ｍＲ
ＮＡのノーザンブロット分析を示す。
【図４Ｂ】図４は、成体ラット組織中のＣＮＴＦ−ｍＲ
ＮＡのノーザンブロット分析を示す。
【図５】図５は、３種の異なるエシェリヒア・コリ（Ｅ
ｃｏＲＩ）における組換えｒＣＮＴＦを示す。
【図６】図６は、ヒトおよびラットゲノムＤＮＡのＥｃ
ｏＲＩ消化物に対するサザンブロットハイブリッド形成
におけるＰＣＲ生成ヒトＣＮＴＦプローブ、（ｂ）はヒ
トおよびラットゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化物に対す
るサザンブロットハイブリッド形成に於ける放射性ラッ
トＣＮＴＦプローブを示す。
【図７】図７は、ＰＣＲによって増幅されたヒトゲノム
ＤＮＡ由来ＣＮＴＦコード配列の一部を既知ラットＣＮ
ＴＦコード配列との比較を示す。
【図８Ａ】図８は、ヒトＣＮＴＦの配列を示す。
【図８Ｂ】図８は、ヒトＣＮＴＦの配列を示す。
【図８Ｃ】図８は、ヒトＣＮＴＦの配列を示す。
【図８Ｄ】図８は、ヒトＣＮＴＦの配列を示す。
【図９】図９は、ＣＮＴＦ配列に基づく合成ペプチドに
対する抗体の生物学的活性を示す。
【図１０】図１０は、２８アミノ酸合成ＣＮＴＦペプチ
ドフラグメントの神経栄養活性を示す。
【図１１】図１１は、２８アミノ酸ＣＮＴＦ生物活性ペ
プチドに対するウサギ抗体を用いた間接的な免疫蛍光反
応を示す。
【図１２】図１２は、Ｅ１４ラット背中央脊髄細胞の解
離培養物の位相差顕微鏡写真である。
【図１３】図１３は、片側性顔面神経損傷を有する新生
ラットの顔面神経核に於ける運動ニューロンおよびグリ
ア細胞変化を示す。
【図１４】図１４は、片側性顔面神経損傷を有する新生
ラットの顔面神経核に於ける運動ニューロンおよびグリ
ア細胞変化を示す。
【図１５Ａ】図１５は、（Ａ）ラットおよび（Ｂ）ヒト
ＣＮＴＦの親水性、表面確率、可撓性、抗原指数、両親
媒性らせん、両親媒性シートおよび二次構造のプロット
図を示す。
【図１５Ｂ】図１５は、（Ａ）ラットおよび（Ｂ）ヒト
ＣＮＴＦの親水性、表面確率、可撓性、抗原指数、両親
媒性らせん、両親媒性シートおよび二次構造のプロット
図を示す。
【図１６】図１６は、発現プラスミドの主な特徴を示
す。
【図１７】図１７は、ヒトＣＮＴＦの配列およびクロー
ニングに用いられたＰＣＲプライマーを示す。
【図１８】図１８は、種々のベクターを用いるヒトおよ
びラットＣＮＴＦ発現の比較を示す。
【図１９】図１９は、ＣＮＴＦの精製の程度を示す。
【図２０】図２０は、天然のおよび組み換えラットＣＮ
ＴＦに対する毛様体ニューロンの用量応答を示す。
【図２１】図２１は、Ｅ１０ニワトリ胚背根神経節（Ｄ
ＲＧ）の外植培養物およびＥ８ニワトリ胚毛様体神経節
（ＣＧ）の解離ニューロン富化培養物（Ｃ，Ｄ，Ｅ）の
顕微鏡写真である。
【図２２】図２２は、ＣＮＴＦタンパク質の整列させた
配列を示す。
【図２３】図２３は、培養６日後の腹側脊髄細胞の位相
顕微鏡写真である。
【図２４】図２４は、腹側脊髄ニューロン培養物中のニ
ューロフィラメント（ＮＦ）を示す。
【図２５】図２５は、ＡｃｈＥ含有ニューロンの生存に
及ぼすＣＮＴＦの作用を示す。
【図２６】図２６Ａは、腹側脊髄培養物中のＣＡＴ活性
に及ぼす成長因子の作用を示す。図２６Ｂは、ＣＡＴ活
性に及ぼす漸増量のＣＮＴＦの作用を示す。
【図２７】図２７は、遅らせて添加した場合のＣＡＴ活
性に及ぼすＣＮＴＦの作用を示す。
【図２８】図２８は、グリア細胞を低下させた腹側脊髄
培養物中におけるＣＡＴ活性に及ぼすＣＮＴＦの作用を
示す。
【図２９】図２９は、メトリザミド（ｍｅｔｒｉｚａｍ
ｉｄｅ）グラジェント精製腹側脊髄ニューロンにおける
ＣＡＴ活性に及ぼすＣＮＴＦおよびＮＧＦの作用を示
す。
【図３０Ａ】図３０は、ＣＮＴＦ処理された海馬培養物
における高アフィニティＧＡＢＡとり込み増大の時間的
経過を示す。
【図３０Ｂ】図３０は、ＣＮＴＦ処理された海馬培養物
における高アフィニティＧＡＢＡとり込み増大の時間的
経過を示す。
【図３１Ａ】図３１は、ＣＮＴＦに対する海馬ニューロ
ンの用量応答曲線を示す。
【図３１Ｂ】図３１は、ＣＮＴＦに対する海馬ニューロ
ンの用量応答曲線を示す。
【図３１Ｃ】図３１は、ＣＮＴＦに対する海馬ニューロ
ンの用量応答曲線を示す。
【図３２】図３２は、ＮＳＥ−、ＧＡＤ−およびカルビ
ンディン（ｃａｌｂｉｎｄｉｎ）−陽性細胞の数に及ぼ
すＣＮＴＦの作用を示す。
【図３３】図３３は、ＧＡＢＡ−およびＡｃｈＥ−免疫
陽性ニューロンの数に及ぼすＣＮＴＦの用量依存性応答
を示す。
【図３４】図３４は、ＣＮＴＦにより誘導された、高ア
フィニティＧＡＢＡとり込み増大に及ぼすＣＮＴＦ遅延
添加の作用を示す。
【図３５】図３５は、ＣＮＴＦにより誘導された、ニュ
ーロフィラメントタンパク質レベルの増大に及ぼすＣＮ
ＴＦの添加遅延の作用を示す。
【図３６】図３６は、ニューロン富化培養物におけるＣ
ＮＴＦの作用を示す。
【図３７】図３７は、ＧＡＢＡとり込みおよびニューロ
フィラメントタンパク質レベルの、ＣＮＴＦにより誘導
された増大の密度依存性を示す。
【図３８】図３８は、海馬培養物におけるグルタメート
誘導毒性に及ぼすＣＮＴＦの保護作用を示す。
【図３９】図３９は、ラット海馬星状細胞分裂指数に及
ぼす漸増濃度のラットＣＮＴＦの作用を示す。
【図４０】図４０は、ＣＮＴＦに関する二抗体サンドイ
ッチアッセイを示す
【図４１】図４１は、ヒトＣＮＴＦに関する二抗体サン
ドイッチアッセイの結果を示す。
【図４２】図４２は、ローダミンイソチオシアネートで
逆行的に標識したニワトリ胚脊髄運動ニューロンを示
す。
【図４３】図４３は、組み換えラットＣＮＴＦ５ｎｇ／
ｍｌの存在下または非存在下におけるニワトリ胚脊髄運
動ニューロンの生存の時間的経過を示す。
【図４４】図４４は、組み換えラットＣＮＴＦ１ｎｇ／
ｍｌの非存在下または存在下における培養６日後のニワ
トリ胚脊髄運動ニューロンを示す。
【図４５Ａ】図４５は、培養中のニワトリ胚脊髄運動ニ
ューロンに関する組み換えラットＣＮＴＦの生存活性
（Ａ）およびＣＮＴＦ（Ｂ）およびＦＧＦ（Ｃ）に関す
る濃度応答線を示す。
【図４５Ｂ】図４５は、培養中のニワトリ胚脊髄運動ニ
ューロンに関する組み換えラットＣＮＴＦの生存活性
（Ａ）およびＣＮＴＦ（Ｂ）およびＦＧＦ（Ｃ）に関す
る濃度応答線を示す。
【図４５Ｃ】図４５は、培養中のニワトリ胚脊髄運動ニ
ューロンに関する組み換えラットＣＮＴＦの生存活性
（Ａ）およびＣＮＴＦ（Ｂ）およびＦＧＦ（Ｃ）に関す
る濃度応答線を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１３年６月２７日（２００１．６．２
７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１Ａ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ｂ】
【図４Ａ】
【図５】
【図９】
【図２５】
【図４Ｂ】
【図６】
【図１０】
【図２０】
【図２４】
【図７】
【図１６】
【図４０】
【図８Ａ】
【図２８】
【図３０Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図１１】
【図２７】
【図２９】
【図３１Ａ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１７】
【図３１Ｂ】
【図４５Ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２１】
【図２６】
【図３０Ｂ】
【図２２】
【図２３】
【図３１Ｃ】
【図３５】
【図４５Ａ】
【図３２】
【図３３】
【図３６】
【図３４】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４１】
【図４５Ｃ】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/16 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (71)出願人 597160510 リジェネロン・ファーマシューティカル ズ・インコーポレイテッド ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵ ＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ. アメリカ合衆国10591−6707ニューヨーク 州タリータウン、オールド・ソー・ミル・ リバー・ロード777番 (72)発明者 ピオトル マシアコウスキー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 01591, タリイタウン，チャーチストリート 13 (72)発明者 ヴィヴィアン ウォン アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10502, アーズレー，ウッド アベニュー 55 (72)発明者 ニコス パナヨテイトス アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10962, オレンジバーグ， モンマウス コート 95 (72)発明者 ハンス フリードリッヒ エルヴィン テ ーネン ドイツ連邦共和国 8000 ミュンヘン 40，クレーペリンシュトラーセ ４Ａ (72)発明者 クルト エー シュトックリ−リップシュ タイン ドイツ連邦共和国 8000 ミュンヘン 70， シュティフツボーゲン 106 (72)発明者 ミヒャエル ゼントナー ドイツ連邦共和国 8000 ミュンヘン 21，キルヒマイヤシュトラーセ 37 (72)発明者 ヨシヒロ アラカワ ドイツ連邦共和国 8000 ミュンヘン 71，アイデンバッハシュトラーセ 213 (72)発明者 パトリック デスモンド キャロル ドイツ連邦共和国 8000 ミュンヘン ２，マティールデンシュトラーセ ５ (72)発明者 ルドルフ ゲオルグ ゴッツ ドイツ連邦共和国 8000 ミュンヘン 60，ゲルナーシュトラーセ 20 (72)発明者 ゲオルグ ヴェー クロイツベルグ ドイツ連邦共和国 8000 ミュンヘン 60，シュテルフーベンヴェーク 11 (72)発明者 ダン ビー リンドホルム ドイツ連邦共和国 8000 ミュンヘン 60，オットー ディシュナー ヴェーク 13 (72)発明者 フリードリッヒ ロットシュパイヒ ドイツ連邦共和国 8021 ノイリート，ド ロッセルヴェーグ １ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 HA19 4C084 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 CA53 ZA02 ZA16 ZA22 ZA81 ZB21 4H045 AA10 BA10 CA45 DA21 EA21 FA74 GA01 GA10 GA15 GA22

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 実質的に以下の配列： 【化１】 で示されるヒト毛様体神経栄養因子のアミノ酸配列、ま
    たは機能的に活性なペプチドを含有するそのサブ配列を
    含む、精製タンパク質。
JP2001128506A 1989-09-15 2001-04-25 毛様体神経栄養因子 Pending JP2001354697A (ja)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40817289A 1989-09-15 1989-09-15
US42951789A 1989-10-31 1989-10-31
US57065190A 1990-08-20 1990-08-20
US07/000,000 1990-08-20
US07/408,172 1990-08-20
US07/429,517 1990-08-20

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP90246008A Division JPH05199879A (ja) 1989-09-15 1990-09-14 毛様体神経栄養因子

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2001354697A true JP2001354697A (ja) 2001-12-25

Family

ID=27410749

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP90246008A Pending JPH05199879A (ja) 1989-09-15 1990-09-14 毛様体神経栄養因子
JP2001128506A Pending JP2001354697A (ja) 1989-09-15 2001-04-25 毛様体神経栄養因子

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP90246008A Pending JPH05199879A (ja) 1989-09-15 1990-09-14 毛様体神経栄養因子

Country Status (11)

Country Link
US (1) US6602687B1 (ja)
EP (1) EP0448707B1 (ja)
JP (2) JPH05199879A (ja)
AT (1) ATE130365T1 (ja)
AU (1) AU705371B2 (ja)
CA (1) CA2040404A1 (ja)
DE (1) DE69023637T2 (ja)
ES (1) ES2084045T3 (ja)
IE (1) IE903130A1 (ja)
LV (1) LV10308A (ja)
WO (1) WO1991004316A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160097303A (ko) * 2013-12-11 2016-08-17 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤 모양체 주연부-유사 구조체의 제조 방법
JP2021531328A (ja) * 2018-06-19 2021-11-18 セラ セラピューティクス エルエルシー 神経栄養剤、アポトーシスシグナリング断片化阻害剤（ＦＡＳ）もしくはＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）阻害剤、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）もしくはＴＮＦ受容体阻害剤、ミトコンドリアペプチド、オリゴヌクレオチド、ケモカイン阻害剤、またはシステイン−アスパラギン酸プロテアーゼを含む薬剤送達系

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT405835B (de) * 1989-01-05 1999-11-25 Synergen Inc Aufgereinigter ziliärer neurotropher faktor
US5141856A (en) * 1989-01-05 1992-08-25 Synergen, Inc. Expression of purified ciliary neurotrophic factor
IL98304A (en) * 1990-06-01 2008-08-07 Regeneron Pharma The ciliary neurotrophic factor receptor
IT1247150B (it) * 1991-01-21 1994-12-12 Fidia Spa Processo per la sintesi e la purificazione del fattore neuronotroficociliare umano (cntf) da escherichia coli.
CA2113083A1 (en) * 1991-07-10 1993-01-21 Vivien Wong Methods of treatment of motor neuron diseases using members of the bdnf/nt-3/ngf family of molecules
JPH07500725A (ja) * 1991-07-23 1995-01-26 シンテックス−シナージェン　ニューロサイエンス　ジョイント　ベンチャー 組換え毛様体向神経因子およびｃ−末端切断毛様体向神経因子の精製ならびに末梢神経障害の処置方法
US5593857A (en) * 1991-08-23 1997-01-14 Scios Inc. Production of homogeneous truncated CNTF
WO1993007270A1 (en) * 1991-10-01 1993-04-15 Genentech, Inc. Production of gpa neurotrophic factor
CA2123234A1 (en) * 1991-11-11 1993-05-27 Lanfranco Callegaro Synthesis and purification of truncated and mutein forms of human ciliary neuronotrophic factor
AU4995193A (en) * 1992-08-04 1994-03-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of enhancing differentiation and survival of neuronal precursor cells
EP0669987B1 (en) * 1992-09-25 2008-08-13 Aventis Pharma S.A. Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, particularly in brain
US6472178B1 (en) 1998-02-27 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding a modified ciliary neurotrophic factor and method of making thereof
WO1994017818A1 (en) * 1993-02-08 1994-08-18 The Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture Methods for treating amyotrophic lateral sclerosis with cntf
AU6284194A (en) * 1993-03-12 1994-09-26 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Treatment of motor neuron diseases with fibroblast growth factor-5 (fgf-5)
FR2705361B1 (fr) * 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
DK0632008T3 (da) 1993-06-01 1998-09-23 Ono Pharmaceutical Co Pentansyrederivater
US6143714A (en) * 1994-10-24 2000-11-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of using hepatocyte growth factor to promote survival, growth and differentiation of motor neurons
ES2301178T3 (es) 1996-04-05 2008-06-16 Novartis Vaccines & Diagnostic Vectores basados en alfavirus recombinantes con inhibicion reducida de la sintesis macromolecular celular.
FR2753379B1 (fr) * 1996-09-13 1998-10-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Methode de traitement de la sclerose laterale amyotrophique
IT1288388B1 (it) 1996-11-19 1998-09-22 Angeletti P Ist Richerche Bio Uso di sostanze che attivano il recettore del cntf ( fattore neurotrofico ciliare) per la preparazione di farmaci per la terapia
US6313089B1 (en) * 1997-08-20 2001-11-06 Duke University Complexes of apolipoprotein E and ciliary neurotrophic factor (CNTF) and methods of use
EP0999270A1 (en) * 1998-10-09 2000-05-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Method of regulating SMN gene expression
WO2001089550A2 (en) * 2000-05-24 2001-11-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of ciliary neurotrophic factor
PT1458888E (pt) * 2001-12-10 2011-06-01 Novartis Ag Métodos para tratar a psicose e a esquizofrenia baseados em polimorfismos no gene do cntf
JP2005073592A (ja) * 2003-09-01 2005-03-24 Yukiguni Maitake Co Ltd マイタケ由来のレクチンをコードする遺伝子
US8592374B2 (en) 2007-03-16 2013-11-26 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Neurotrophic peptides
EP2009103A1 (en) * 2007-03-16 2008-12-31 Ebewe Pharma Ges.m.b.H. Nfg. KG Neurotrophic peptides

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4923696A (en) 1987-05-04 1990-05-08 Baylor College Of Medicine Method to prepare a neurotrophic composition
US5141856A (en) * 1989-01-05 1992-08-25 Synergen, Inc. Expression of purified ciliary neurotrophic factor
US4997929A (en) 1989-01-05 1991-03-05 Synergen, Inc. Purified ciliary neurotrophic factor
US5011914A (en) 1989-01-05 1991-04-30 Collins Franklin D Purified ciliary neurotrophic factor
WO1990010647A1 (en) * 1989-03-15 1990-09-20 The Regents Of The University Of California Purified ciliary neurotrophic factor
KR910016921A (ko) * 1990-03-14 1991-11-05 파디아 에스. 피. 에이 인간의 모양체 신경원영양 인자, 그를 코딩하는 dna 서열 및 재조합 기술에 의한 그의 제조방법

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160097303A (ko) * 2013-12-11 2016-08-17 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤 모양체 주연부-유사 구조체의 제조 방법
KR102318706B1 (ko) 2013-12-11 2021-10-28 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤 모양체 주연부-유사 구조체의 제조 방법
JP2021531328A (ja) * 2018-06-19 2021-11-18 セラ セラピューティクス エルエルシー 神経栄養剤、アポトーシスシグナリング断片化阻害剤（ＦＡＳ）もしくはＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）阻害剤、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）もしくはＴＮＦ受容体阻害剤、ミトコンドリアペプチド、オリゴヌクレオチド、ケモカイン阻害剤、またはシステイン−アスパラギン酸プロテアーゼを含む薬剤送達系

Also Published As

Publication number Publication date
EP0448707A1 (en) 1991-10-02
WO1991004316A2 (en) 1991-04-04
EP0448707B1 (en) 1995-11-15
AU6740290A (en) 1991-04-18
DE69023637D1 (de) 1995-12-21
ES2084045T3 (es) 1996-05-01
ATE130365T1 (de) 1995-12-15
US6602687B1 (en) 2003-08-05
WO1991004316A3 (en) 1991-04-18
DE69023637T2 (de) 1996-10-17
CA2040404A1 (en) 1991-03-16
AU705371B2 (en) 1999-05-20
JPH05199879A (ja) 1993-08-10
IE903130A1 (en) 1991-03-27
EP0448707A4 (en) 1992-11-19
LV10308A (lv) 1994-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2001354697A (ja) 毛様体神経栄養因子
US5453361A (en) Method for producing biologically active human brain derived neurotrophic factor
US5438121A (en) Brain derived neurotrophic factor
US5512661A (en) Multitrophic and multifunctional chimeric neurotrophic factors
Henderson et al. Localization of CNTF immunoreactivity to neurons and astroglia in the CNS
CA2040437C (en) Neurotrophin-3, a novel neurotrophic factor related to nerve growth factor and brain derived neurotrophic factor
US20090124543A1 (en) Activity dependent neurotrophic factor iii (adnf iii)
JP2012213406A (ja) Ｎｏｇｏ遺伝子のヌクレオチド配列およびタンパク質配列、ならびにそれに基づく方法
AU728559B2 (en) Novel tyrosine kinase receptors and ligands
JP2003159083A (ja) 新規な神経栄養因子
JP4649602B2 (ja) 活性依存性向神経第▲ｉｉｉ▼因子（ａｄｎｆ▲ｉｉｉ▼）
US6436673B1 (en) Polynucleotides encoding a novel neuronal cell growth factor
JP3266611B2 (ja) 毛様体神経栄養因子レセプター
US6933276B1 (en) Methods of treating peripheral neuropathies using neurotrophin-3
PT95322A (pt) Processo de producao e isolamento de factor neurotrofico ciliar,de composicoes farmaceuticas e de preparacao de molecula de adn recombinante que codifica o mesmo
Henderson et al. Localization of CNTF immunoreactivity to neurons and astroglia
DD298133A5 (de) Ziliarer neurotroper faktor
HU211318A9 (hu) Multitróf és multifunkcionális kiméra neurotróf faktorok és a kimérákát kódoló nukleinsavak és plazmidok Az átmeneti oltalom a(z) 1-34. igénypontra vonatkozik.

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20040708

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20050111