JP2001335490A - 多硫酸化ムコ多糖類の新規薬理作用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】血管内膜の肥厚や炎症反応の抑制並びに炎症性
疾患の抑制。 【解決手段】多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とする、セ
レクチン依存性細胞接着阻害剤、皮膚角化細胞の接着分
子発現阻害剤、血管内膜肥厚及び血管狭窄阻害剤、又は
皮膚細菌感染症等の予防又は治療薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、多硫酸化ムコ多糖
類を有効成分とするセレクチン依存性細胞接着阻害剤、
皮膚角化細胞の接着分子発現阻害剤等に関する。

【０００２】

【従来の技術】サルに高コレステロール食を負荷する
と、その大動脈血管内皮に白血球が接着し、浸潤してい
る像が認められる。また、若年者の部検例においても同
様の像が観察されることから、この白血球の血管内皮へ
の接着、浸潤が動脈硬化形成の初期病変として重要であ
ると考えられている。

【０００３】血液中に循環する白血球は、炎症が惹起さ
れるとサイトカイン等で活性化された血管内皮細胞上を
転がりはじめ（ローリング（rolling））、やがて強固
に接着し（firm adhesion）、血管間隙を通り抜け（tra
nsmigration）、血管内膜を肥厚させたり、炎症反応を
増長させたりする。この一連のローリングには、白血球
又は血管内皮細胞上に発現しているセレクチンと、白血
球又は血管内皮細胞上に発現しているシリアルルイスX
等の糖鎖（セレクチンリガンド）とが関与することが知
られている。次の接着には、白血球上に発現しているイ
ンテグリンと、内皮細胞上に発現している免疫グロブリ
ンスーパーファミリーと呼ばれる分子群が関与すること
が知られている。従って、これらの現象をブロックし、
白血球の血管内皮細胞への接着を阻害すれば、白血球の
血管外への浸潤を抑制し、血管内膜の肥厚や炎症反応を
抑制することが期待されている。

【０００４】また、接着分子であるＩＣＡＭ−１（inte
rcellular adhesion molecule-1）は、ＬＦＡ−１（lym
phocyte function associated antigen-1）のリガンド
として最初に同定された分子である。炎症時に白血球は
ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１を介して血管内皮細胞と接着
し、炎症局所に浸潤する。とくに表皮の炎症性疾患（扁
平苔癬、乾癬、接触皮膚炎など）における表皮角化細胞
（ＫＣ）のＩＣＡＭ−１発現がＬＦＡ−１陽性リンパ球
の表皮への浸潤に誘導的役割をしている可能性が報告さ
れていた（皮膚臨床 35(8)特：33；1343-1356，199
3）。従って、ＫＣのＩＣＡＭ−１発現を阻害すること
により、炎症性疾患の抑制が期待されている。

【０００５】一方、多硫酸化ムコ多糖類の１種である多
硫酸化コンドロイチン硫酸（ヘパリン類似物質）は、血
液凝固抑制作用、末梢血液循環促進作用、繊維芽細胞増
殖抑制作用を有することが知られている。また、多硫酸
化コンドロイチン硫酸は、皮膚保湿作用を有し、乾皮
症、皮脂欠乏症、進行性指掌角皮症などの乾燥性皮膚疾
患にも有用性が知られている。しかしながら、上記機序
による動脈硬化抑制作用、皮膚細菌感染阻害作用等は知
られていなかった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、多硫酸化
ムコ多糖類に着目し、その新たな用途について研究した
結果、多硫酸化コンドロイチン硫酸などの多硫酸化ムコ
多糖類が優れたセレクチン依存性細胞接着阻害作用及び
皮膚角化細胞の接着分子発現阻害作用等を有することを
見出した。

【０００７】すなわち、本発明は、以下の阻害剤及び予
防又は治療薬を提供するものである。 項１．多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とするセレクチン
依存性細胞接着阻害剤。 項２．多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とする血管内膜肥
厚及び血管狭窄阻害剤。 項３．多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とする動脈硬化の
予防又は治療薬。 項４．多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とする皮膚角化細
胞の接着分子発現阻害剤。 項５．多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とする皮膚細菌感
染症の予防又は治療薬。 項６．多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とする移植片対宿
主病の予防又は治療薬。 項７．多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とする扁平苔癬症
の予防又は治療薬。 項８．多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とする、皮膚角化
細胞の接着分子発現阻害作用に基づく乾癬の予防又は治
療薬。

【０００８】さらに、本発明は、多硫酸化ムコ多糖類を
有効成分とする、白血球と血管内皮との接着阻害作用に
基づく血管疾病の予防又は治療薬を提供するものであ
る。また、本発明は、多硫酸化ムコ多糖類を有効成分と
する、皮膚角化細胞の接着分子発現阻害作用に基づく皮
膚疾病の予防又は治療薬を提供するものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明で使用する多硫酸化ムコ多
糖類は、ヘキソサミンとウロン酸又はガラクトースより
なる二糖の繰り返し単位を有する長鎖多糖類に、化学的
に硫酸基を導入することによって合成されたものを意味
する。天然由来のムコ多糖類には、硫酸基を持つものも
存在するので、それらをさらに化学的に多硫酸化したも
のも本発明の多硫酸化ムコ多糖類に包含される。

【００１０】また、本発明の多硫酸化ムコ多糖類は、必
要に応じ、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の水
酸化物若しくは炭酸塩、又はアミン類等を用いる造塩反
応により得られる生理学的に許容される塩形態として使
用することもできる。

【００１１】本発明において、ヘキソサミンとは、広
く、ヘキソースのヒドロキシル基がアミノ基で置換され
た化合物を意味するが、具体的には、Ｄ−グルコサミ
ン、Ｄ−ガラクトサミン等が挙げられる。

【００１２】また、ウロン酸とは、アルドースの第一ア
ルコールが酸化されてカルボキシル基となったものを広
く意味するが、具体的にはＤ−グルクロン酸、Ｌ−イズ
ロン酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸、Ｌ−
グルロン酸等の天然由来のウロン酸が例示される。

【００１３】ムコ多糖類の具体例としては、コンドロイ
チン硫酸（コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６
−硫酸等）、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン
硫酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン等が挙げられる。

【００１４】また、多硫酸化ムコ多糖類としては、多硫
酸化コンドロイチン硫酸、多硫酸化ヘパラン硫酸、多硫
酸化ケラタン硫酸、多硫酸化デルマタン硫酸、多硫酸化
ヒアルロン酸等が挙げられ、日本薬局方外医薬品規格に
記載のヘパリン類似物質（以下、ＭＰＳという）、コン
ドロイチン硫酸Ｄやコンドロイチン硫酸Ｅなどの多硫酸
化コンドロイチン硫酸及びケラタンポリ硫酸が好まし
い。さらに好ましくは、ＭＰＳなどの多硫酸化コンドロ
イチン硫酸である。

【００１５】本発明の多硫酸化ムコ多糖類はその由来を
特に限定するものではないが、より好適なものとして
は、例えば前述のムコ多糖類に対して人為的に硫酸化処
理を施すことによって硫酸化してなるものが挙げられ
る。

【００１６】また、本発明の多硫酸化ムコ多糖類が有す
る硫酸基の数は特に限定されないが、単糖当たり、通常
平均０．５５〜５個、好ましくは平均０．６〜２．９
個、より好ましくは平均０．７〜２個の割合で有する。

【００１７】本発明で用いられる多硫酸化ムコ多糖類又
はその塩の分子量は、多糖の種類によっても異なり限定
されるものではないが、その平均分子量が、数平均分子
量で１０００〜１０００００００程度であり、好ましく
は、５０００〜１００００００程度、より好ましくは１
００００〜１０００００程度、更に一層好ましくは１０
０００〜５００００であることが望ましい。

【００１８】ムコ多糖類に硫酸基を導入する方法として
は、既知の方法、例えば、ムコ多糖類と硫酸化剤を適当
な溶媒中で加温し、反応させる方法が挙げられる。硫酸
化剤としては、多硫酸化の目的を達成することができる
ものであれば特に限定されるものではないが、無水硫酸
とピリジン若しくはトリエチルアミン等の錯体を使用す
るのが好ましい。ムコ多糖類と硫酸化剤の使用割合は、
所望の多硫酸化ムコ多糖類の硫酸化率（又は硫黄含有
率）及び反応条件に従って任意に選択することができる
が、一般に、ムコ多糖類１重量部に対して２〜１０重量
部となるような割合で使用する。溶媒としては、例え
ば、ジメチルホルムアミド等の親プロトン性溶媒を挙げ
ることができる。反応温度、反応時間としては、所望の
硫酸化率が達成できる限り特に限定されないが、例え
ば、４０〜９０℃で３０分〜２０日間程度反応させる。

【００１９】上述のようにして生成した多硫酸化ムコ多
糖類は、各種修飾多糖類で常用されている精製操作によ
り精製することができる。例えば、中和、透析による脱
塩、有機溶媒添加による沈殿を回収する操作、凍結乾燥
による回収操作などが挙げられる。

【００２０】本発明の阻害剤及び予防又は治療薬は、多
硫酸化ムコ多糖類を含むことを特徴とするものであり、
本発明の効果を損なわない限り、通常使用し得る生理学
的若しくは薬学的に許容され得る担体、賦形剤、増量
剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、
分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味・
矯臭剤又は安定剤等を包含することもできる。

【００２１】また、本発明の阻害剤及び予防又は治療薬
は、医薬製剤としての各種形態、例えば軟膏剤、硬膏
剤、錠剤、ローション剤、液剤、懸濁剤、注射剤、エア
ゾール剤等の形態を治療目的に応じて選択できる。そし
て、患者の年齢、疾病の種類及び程度、並びに剤型及び
投与様式により、例えば、局所、粘膜、皮膚、皮下、静
脈内、動脈内、筋肉内、経口、経肺等により投与するこ
とができる。

【００２２】軟膏剤に配合される添加剤としては、基
剤、乳化剤、保存剤等が挙げられる。基剤としては白色
ワセリン、流動パラフィン等の炭化水素、大豆等の油脂
類、ミツロウ、ラノリン等のロウ類、ステアリン酸、オ
レイン酸等の脂肪酸、ラノリンアルコール、セトステア
リルアルコール等の高級アルコール及びそのエステル
類、マクロゴール等が挙げられる。乳化剤としては、非
イオン性界面活性剤等が挙げられる。保存剤としては、
チモール、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息
香酸プロピル等が挙げられる。

【００２３】硬膏剤ないし貼付剤に配合される添加剤と
しては、増粘剤、保湿剤、充填剤、架橋剤、溶解剤、乳
化剤等が挙げられる。増粘剤としては、アルギン酸ナト
リウム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシビニ
ルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム等が挙げられ
る。保湿剤としては、グリセリン、マクロゴール類等が
挙げられる。充填剤としては、カオリン、二酸化チタ
ン、亜鉛華等が挙げられる。架橋剤としては、アセトア
ルデヒド、ジメチルケトン、硫酸アルミニウム等が挙げ
られる。溶解剤としては、エタノール、２−プロパノー
ル等のアルコール類、マクロゴール類等が挙げられる。
乳化剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界
面活性剤等が挙げられる。

【００２４】注射剤に配合される添加剤としては、ｐＨ
調整剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤など
が挙げられる。

【００２５】経口剤として調整する場合の添加剤として
は、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、矯臭剤、矯味剤
などが挙げられる。

【００２６】本発明の阻害剤及び予防又は治療薬の投与
量は、患者の年齢、性別、疾病の種類及び程度、並びに
剤型及び投与様式により、適宜決定される。

【００２７】製剤中の多硫酸化ムコ多糖類の含有量は、
剤型によって適宜決定されるが、好ましくは、０．００
１〜５０重量％程度、さらに好ましくは０．００１〜１
０重量％程度、より一層好ましくは０．０５〜１重量％
程度である。

【００２８】本発明において、白血球と血管内皮との接
着阻害作用に基づいて、予防又は治療される血管疾病と
しては、動脈硬化等が挙げられる。

【００２９】本発明において、皮膚角化細胞の接着分子
発現阻害作用に基づいて、予防又は治療される皮膚疾病
としては、皮膚細菌感染症、移植片対宿主病、扁平苔癬
症、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎等が挙げられ
る。

【００３０】

【実施例】以下、本発明の内容を実施例を用いて具体的
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００３１】実施例１ ヒト表皮角化細胞の培養 25cm²フラスコ中、10⁶個のヒト表皮角化細胞（オリエン
タル酵母(株)製；以下、ＫＣとする）を、ＫＣ用無血清
培地（ＧＩＢＣＯ社製；以下ＫＢＭとする）に50μg/mL
の牛脳抽出物（ＧＩＢＣＯ社製）と5ng/mLのヒト遺伝子
組換え上皮成長因子（ＧＩＢＣＯ社製；以下、ＥＧＦと
する）とを含有させた5mLの培養液（以下ＫＧＭとす
る）で培養した。ＫＣの継代はプロナーゼ処理により行
い、2継代したＫＣを96ウェルプレートに播種、培養
し、サブコンフルエントになった状態で供試した。

【００３２】実施例２ ＫＣにおけるインターフェロン
γ（ＩＦＮ−γ）刺激によるＩＣＡＭ−１発現に対する
ＭＰＳ等の作用検討 96ウェルプレートにおける培養でサブコンフルエントに
なったＫＣの培養上清を除去し、200μL/wellのＫＢＭ
で緩やかに洗浄した。次に、下記表１に示す濃度のＭＰ
Ｓ等の薬剤の存在下又は非存在下、100ng/mLのＩＦＮ−
γを含有させた200μL/wellのＫＧＭを、ＫＣに加えて4
8時間培養した。陰性対照群には200μL/wellのＫＧＭの
みを加えた。

【００３３】

【表１】

【００３４】培養終了後、上清を除去し、200μL/well
のリン酸緩衝生理食塩液（以下、ＰＢＳとする）でＫＣ
を1回洗浄した。ＫＣに100μL/wellのＰＬＰ溶液（2％
パラホルムアルデヒド、75mM L-リシン、10mM メタ過ヨ
ウ素酸ナトリウム、37.5mMリン酸、pH6.2）を加えて室
温で15分間放置することにより固定した後、200μL/wel
lのＰＢＳで3回洗浄し、さらにＢＳＡ（ウシ血清アルブ
ミン）を2％含有させたＰＢＳ（以下、ＢＳＡ／ＰＢＳ
とする）を100μL/well添加して室温で20分間放置する
ことによりブロッキングを行った。次に、ブロッキング
液を除去後、一次抗体（抗ヒトＩＣＡＭ−１ mAb；Upst
ate Biotechnology社製）を10μg/mL含有させた0.2％Ｂ
ＳＡ／ＰＢＳを50μL/well添加して、室温で30分間放置
した。ブランクウェルにはＢＳＡ／ＰＢＳのみを添加し
た。ＫＣを200μL/wellのＰＢＳで3回洗浄後、二次抗体
（ビオチン標識された抗マウスＩｇＧ(H+L)；Vector社
製）を10μg/mL含有させた0.2％ＢＳＡ／ＰＢＳを50μL
/well添加して室温で30分間放置した。200μL/wellのＰ
ＢＳで3回洗浄後、ＡＢＣ−ＡＰ（ビオチン化アルカリ
フォスファターゼ−アビジン複合体）溶液を50μL/well
添加して室温で30分間放置した。さらに200μL/wellの
ＰＢＳで3回洗浄し、100μL/wellのｐＮＰＰ（ｐ−ニト
ロフェニルホスフェート）溶液（5mM）を加えて室温で1
0分間放置後、405nmにおける吸光度をマイクロプレート
リーダーで測定した。測定結果を図１及び２に示す。

【００３５】ＩＦＮ−γ刺激したＫＣのＩＣＡＭ−１発
現は無処置群に比べて顕著に増加した。ＭＰＳは、ＩＦ
Ｎ−γによるＩＣＡＭ−１の発現を濃度依存的に有意に
抑制した（図１）。また、有意な作用を認めた100μg/m
LのＭＰＳのＩＣＡＭ−１発現抑制作用を同濃度の他の
ムコ多糖（ヘパリン、コンドロイチン4-硫酸、コンドロ
イチン6-硫酸）と比較したところ、ＭＰＳは最も強くＩ
ＣＡＭ−１発現を抑制した（図２）。

【００３６】これらの結果から、ＭＰＳは、炎症時に、
ＩＦＮ−γで誘導されるＩＣＡＭ−１を介した細胞湿潤
抑制作用を有し、さらには炎症性皮膚疾患に有用である
ことが示唆される。

【００３７】実施例３ ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の培養 ＨＵＶＥＣを、I型コラーゲンコートしたF-75フラスコ
中にて、ＦＢＳ（仔ウシ胎児血清）を10％及びＥＣＧＦ
（endothelial cell growth factor；100倍希釈）を含
むＭＣＤＢ１３１培地で培養し、0.025％トリプシン／
0.01％ＥＤＴＡ処理により適宜継代培養した。I型コラ
ーゲンコートした24ウェルプレートに、4×10⁴セル/mL
の細胞密度で播種し、24時間培養後、細胞を接着の試験
に供試した。供試された細胞は継代数5であった。

【００３８】ＥｏＬ−１細胞（好酸球様株化細胞）の培
養 ＥｏＬ−１細胞を、ＦＢＳを10％含むＲＰＭＩ−１６４
０培地で培養し、2×10⁵〜2×10⁶セル/mLの細胞密度で
適宜継代培養し（継代数：13〜15以上）、下記の蛍光ラ
ベル処理を施した後、接着の試験に供試した。

【００３９】供試細胞の蛍光ラベル 前記のとおりに培養されたＥｏＬ−１細胞をＰＢＳで洗
浄した後、約5×10⁶セル/mLの細胞密度で、ＢＣＥＣＦ
−ＡＭ（2',7'-bis(carboxyethyl)-4又は5-carboxyfluo
rescein）(5μM)とＢＳＡ（0.1％）とを含むＨＢＳＳ
（Hanks' balancedsalts）に懸濁し、5％CO₂／95％air
中で（37℃）30分インキュベートした。インキュベート
終了後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＦＢＳを1％含む
ＲＰＭＩ−１６４０培地に希釈し、接着の試験に使用し
た。

【００４０】接着試験 24ウェルプレート上で培養したＨＵＶＥＣに、ＴＮＦα
(100U/mL)とＦＢＳ（10％）とを含むＭＣＤＢ１３１培
地を添加し、4時間インキュベートした。インキュベー
ト終了後、ＨＵＶＥＣをＰＢＳで１回洗浄し、ＭＰＳ
（0.1％及び1％）と1cm²あたり4×10⁵個の蛍光ラベル化
ＥｏＬ−１細胞とを添加した。5％CO₂／95％air中で（3
7℃）、プレートシェーカー上で水平に回転振盪(150rp
m)しながら30分インキュベートした。インキュベート終
了後、ＨＵＶＥＣに接着していないＥｏＬ−１細胞をＰ
ＢＳで１回洗浄することにより除去した。ＨＵＶＥＣに
接着しているＥｏＬ−１細胞をNaOH(1M)で溶解し、残存
している蛍光強度を測定した（励起;485nm、蛍光;530n
m)。測定結果を図３に示す。

【００４１】図３より明らかなように、ＭＰＳは、Ｅｏ
Ｌ−１細胞とＨＵＶＥＣの接着反応を抑制し、セレクチ
ン依存性細胞接着阻害作用を示すことがわかる。

【００４２】

【発明の効果】多硫酸化ムコ多糖類は、セレクチン依存
性細胞接着阻害作用、皮膚角化細胞の接着分子発現阻害
作用等により、セレクチン依存性細胞接着阻害剤、皮膚
角化細胞の接着分子発現阻害剤、血管内膜肥厚及び血管
狭窄阻害剤として、又は皮膚細菌感染症等の予防又は治
療薬として有用である。

【００４３】特に、セレクチン依存性細胞接着阻害作用
に基づく血管疾病の予防又は治療薬として有用であり、
とりわけ動脈硬化の予防又は治療薬として有用である。

【００４４】さらに、皮膚角化細胞の接着分子発現阻害
作用に基づく、乾癬、皮膚細菌感染症、移植片対宿主
病、扁平苔癬症等の皮膚疾患の予防又は治療薬として有
用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＩＦＮ−γ刺激したＫＣのＩＣＡＭ−１発現に
対するＭＰＳ（0.1％及び1％）の影響を示すグラフであ
る。

【図２】ＩＦＮ−γ刺激したＫＣのＩＣＡＭ−１発現に
対する各種ムコ多糖の影響を示すグラフである。

【図３】ＥｏＬ−１細胞とＨＵＶＥＣとの接着に対する
ＭＰＳの影響を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/04 Ａ６１Ｐ 17/04 17/06 17/06 // Ｃ０８Ｂ 37/08 Ｃ０８Ｂ 37/08 Ｚ 37/10 37/10 Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 EA26 EA27 MA01 MA04 NA14 ZA44 ZA45 ZA89 ZA90 ZA91 ZB21 ZC41 4C090 AA09 BA64 BA65 BA66 BA67 BA68 BB54 DA09 DA23

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とするセレ
   クチン依存性細胞接着阻害剤。
2. 【請求項２】多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とする血管
   内膜肥厚及び血管狭窄阻害剤。
3. 【請求項３】多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とする動脈
   硬化の予防又は治療薬。
4. 【請求項４】多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とする皮膚
   角化細胞の接着分子発現阻害剤。
5. 【請求項５】多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とする皮膚
   細菌感染症の予防又は治療薬。
6. 【請求項６】多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とする移植
   片対宿主病の予防又は治療薬。
7. 【請求項７】多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とする扁平
   苔癬症の予防又は治療薬。
8. 【請求項８】多硫酸化ムコ多糖類を有効成分とする、皮
   膚角化細胞の接着分子発現阻害作用に基づく乾癬の予防
   又は治療薬。