JP2001311732A - ヒトの生物学的流体中のｎｅｕ関連タンパク質の検出及び定量 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ヒトの生物学的流体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｆｌｕｉｄ）、例えば血液、血清、血漿、尿、脳脊髄
液、正常細胞溶解物の上清、前腫瘍清（ｐｒｅｎｅｏｐ
ｌａｓｔｉｃ）細胞溶解物の上清、腫瘍細胞溶解物の上
清、組織培養状態に維持されている癌細胞系の上清及び
胸部吸引物（ｂｒｅａｓｔ ａｓｐｉｒａｔｅｓ）の中
に検出できるヒトｎｅｕ関連タンパク質に関し、より特
定的には、ヒトｎｅｕ遺伝子産物の細胞外領域に実質的
に対応する約９７，０００ダルトン〜約１１５，０００
ダルトンの範囲の分子量を有するヒトｎｅｕ関連タンパ
ク質である実質的に精製したｐ１００に関する。 【解決手段】 ヒトの前腫瘍性細胞又は腫瘍細胞を検出
する方法であって、（ａ）被験者に由来する生物学的流
体をｐ１００と結合できる少なくとも１つのモノクロー
ナル抗体と接触させ、且つ（ｂ）抗体結合が生起したか
否かを調べることによって、前記生物学的流体中のｐ１
００の存在を検査することからなる方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願 この出願は、１９８６年６月４日出願の米国特許出願第
０６／８７１，１０２号の一部継続出願である１９８８
年４月１８日出願の米国特許出願第０７／１８２，５０
１号の一部継続出願である１９８９年１月１３日出願の
米国特許出願第０７／２９７，１８８号の一部継続出願
である。

【０００２】産業上の利用分野 本発明は実質的に精製されたヒトｎｅｕ遺伝子関連産物
ｐ１００、より詳細にはこのタンパク質に結合すること
が可能なモノクローナル抗体を使用するヒトの生物学的
流体中のｐ１００の検出及び／又は定量に係る。

【０００３】発明の背景 エチルニトロソ尿素の経胎盤注入により誘導されるラッ
ト神経／多形性神経膠芽細胞腫は、マウスＮＩＨ ３Ｔ
３細胞へのトランスフェクションにより検出可能な腫瘍
遺伝子を有する（Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕ
ｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ２９０： ２６１−２６４
（１９８１）， Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ２４９： ２２４−
２２７（１９７４））。この遺伝子はｎｅｕと命名され
た（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ ｅｔａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ
（Ｌｏｎｄｏｎ） ３１２： ５１３−５１６ （１
９８４））。ｎｅｕ遺伝子は上皮成長因子レセプター
（ＥＧＦＲ）をコードする遺伝子と異なるが、これに関
連することが知見された。トランスフェクトしたＮＩＨ
３Ｔ３細胞は、他の腫瘍遺伝子により形質転換した場
合には検出されない新規の１８５０００ダルトンの腫瘍
抗原（ｐ１８５）を示した（Ｐａｄｈｙｅｔ ａｌ．，
Ｃｅｌｌ ２８： ８６５−８７１ （１９８
２））。

【０００４】ラットｎｅｕ腫瘍遺伝子のヒト相同体は単
離され、ヒトＥＧＦレセプター遺伝子（ｃ−ｅｒｂＢ−
１遺伝子としても知られる）との密接な関係に基づいて
ｃ−ｅｒｂＢ−２又はＨＥＲ−２と命名された（Ｙａｍ
ａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１９：
２３０−２３４ （１９８６）， Ｃｏｕｓｓｅｎｓ
ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０： １１３２
−１１３９ （１９８５））。ヒトｎｅｕタンパク質は
約１９００００ダルトンのやや大きい見かけの分子量を
有することが報告されている（Ｇｕｌｌｉｃｋ ｅｔ
ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４０： ２４
６−２５４ （１９８７））。単離されたラット及びヒ
トクローンのＤＮＡ配列に基づき、共直線性であり且つ
ＥＧＦレセプターの予想アミノ酸配列に約５０％一致す
るｎｅｕ遺伝子の１２６０アミノ酸タンパク質産物が予
想される。ヒトＥＧＦＲ及びｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外
領域の配列相同性のレベルは約４３％である。

【０００５】ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、ＥＧＦＲ遺伝子が
染色体７のバンドｐ１１−ｐ１３に位置するのに対して
染色体１７のバンドｑ２１に見いだされるという点にお
いてＥＧＦＲと異なる。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子は、
ＥＧＦＲ遺伝子の５．８−１０ｋｂ転写産物と異なる
４．８ｋｂのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を生成
する。最後に、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子によりコード
されるタンパク質は、ＥＧＦＲ遺伝子によりコードされ
る１７００００ダルトンタンパク質に比較して約１８５
０００〜約１９００００ダルトンの範囲の分子量を有す
ることが知見された。

【０００６】ＥＧＦＲとの類似により、ｎｅｕ遺伝子産
物は、約６５０アミノ酸のシステイン高含有細胞外領域
と、トランスメンブラン領域と、部分的にチロシンキナ
ーゼ領域から構成される約５８０アミノ酸の細胞内部分
とから構成されるトランスメンブランタンパク質である
と考えられる。

【０００７】生化学研究の結果、ｐ１８５タンパク質は
グリコシル化されており、また、無傷の細胞においては
抗血清を容易に受容することができ、これは該タンパク
質がその細胞表面に局在することと一致することが判明
した。ｐ１８５は従来未同定のリガンドのレセプターで
あると考えられる。

【０００８】バリン残基をグルタミン酸に転化させる、
タンパク質のトランスメンブラン領域に生じる単一の点
突然変異はラットｎｅｕ腫瘍遺伝子の活性化に関与する
が、このような突然変異はヒトｎｅｕ遺伝子では生じる
ことが認められていない。ヒトｎｅｕ遺伝子のトランス
メンブラン領域で同一の突然変異を形成するためには２
つの隣接するヌクレオチド変異が必要であるので、この
ような突然変異がヒト相同体で生じることは統計的には
考えられない。しかしながら、ヒト相同体で二重突然変
異が誘導されると、腫瘍遺伝子活性が誘導される。従っ
て、他の点突然変異がヒト相同体を活性化させる可能性
を否定することはできない。

【０００９】ヒトｎｅｕ遺伝子の腫瘍遺伝子潜在性は点
突然変異以外のメカニズムにより得られる。突然変異し
ない場合には如何なる発現レベルでも非形質転換性であ
るラットｎｅｕ遺伝子と異なり、ヒトｎｅｕ遺伝子は突
然変異の不在下でも過剰発現時には形質転換性である。
発現の制御の改変は、既存遺伝子の発現の増加又は遺伝
子のコピーの数を増加（遺伝子増幅）させることにより
達せられる。ｃ−ｅｒｂＢ−２の遺伝子増幅は、原発性
乳腺癌及び唾液腺癌で同定されている。研究者は、ヒト
ｎｅｕ遺伝子がヒト乳癌細胞系で比較的高頻度で増幅さ
れることを知見した。ｎｅｕは乳房腫瘍の３０％で２〜
２０倍以上まで増幅された。ｎｅｕ増幅の存在は、全生
存時間及び再発までの時間の両方の重要な指標であった
（Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
３５： １７７−１８２ （Ｊａｎｕａｒｙ ９， １
９８７））。このように、これらの知見は、ｎｅｕ過剰
発現が増幅によるか又は何らかの他のメカニズムによる
かに関係なく新生物増殖に寄与する可能性を示唆してい
る。

【００１０】ヒトｎｅｕタンパク質はヒト腫瘍悪性度に
関与すると考えられるので、研究者はヒト組織における
その発現及び構造を研究することを試みた。

【００１１】Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８：１２３８−１２４３
（１９８８）は、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子増幅及びタン
パク質発現を、リンパ節状態、核の類別、及び腋窩リン
パ節関与に相関させることを試みた。ｃ−ｅｒｂＢ−２
オープンリーディングフレームの残基１２１５−１２５
５に対応する合成ペプチドから産生されたｃ−ｅｒｂＢ
−２特異抗体を使用して、５１個の原発性ヒト乳房腫瘍
でｃ−ｅｒｂＢ−２腫瘍原遺伝子（ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅ）の増幅を分析した。 Ｄｒｅｂｉｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ５４５−５４８
（１９８４）は、１群のラット神経芽細胞腫腫瘍遺伝子
（ラットｎｅｕ腫瘍遺伝子）でトランスフェクトするこ
とにより形質転換したＮＩＨ ３Ｔ３細胞で見いだされ
る細胞表面抗原決定基と特異的に反応するモノクローナ
ル抗体の産生について記載している。

【００１２】Ｄｒｅｂｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ
４１：６９５−７０６ （Ｊｕｌｙ １９８５）は、
ラットｎｅｕ遺伝子産物と反応性のモノクローナル抗体
に暴露されたラットｎｅｕ腫瘍遺伝子で形質転換したＮ
ＩＨ ３Ｔ３細胞の細胞表面及び全細胞のｐ１８５の両
方の迅速且つ可逆的消失を記載している。

【００１３】Ｄｒｅｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅ ２： ２７３−２７７ （１９８８）は、ｉｎ
ｖｉｖｏで相乗的抗腫瘍効果を発揮するラットｎｅｕ
腫瘍遺伝子でコードされたｐ１８５分子の別々の領域と
反応性のモノクローナル抗体を記載している。

【００１４】Ｄｒｅｂｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏ
ｇｅｎｅ ２： ３８７−３９４（１９８８）は、ラッ
トｎｅｕ遺伝子でコードされた産物の細胞表面領域に結
合するモノクローナル抗体を記載している。

【００１５】正常及び形質転換細胞におけるｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２タンパク質の発現は、Ｇｕｌｌｉｃｋ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４０： ２４６−
２５４ （１９８７）により、ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２タ
ンパク質の予想配列からの２種の合成ペプチドに対して
産生された抗血清及びラットｎｅｕタンパク質に特異的
なモノクローナル抗体を使用して検討された。

【００１６】同様に、Ｖｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ， ｉｉ，ｐａｇｅｓ ６９−７
２ （Ｊｕｌｙ １１， １９８７）は、免疫組織学的
染色及びウェスタンブロッティングにより測定した、ｃ
−ｅｒｂＢ−２タンパク質の発現レベルの増加と結びつ
いた、ヒト乳房腫瘍の３６例のうちの１２例におけるヒ
ト原腫瘍遺伝子ｃ−ｅｒｂＢ−２の増幅を記載してい
る。免疫組織学的染色では、ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク
質のオープンリーディングフレームの残基１２１５〜１
２２５から構成されるペプチドに対するアフィニティー
精製ウサギ抗体が使用された。

【００１７】Ｔａｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ ＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ，
ｐａｇｅｓ １１２０−１１２８， Ｖｏｌ．７， Ｎ
ｏ．８ （Ａｕｇｕｓｔ １９８９）は、潜在的予後重
度を調べるためにウェスタンブロット分析を使用して７
２８個のヒト乳房腫瘍試料でＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパ
ク質レベルを定量する方法を記載している。この研究で
使用するために、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質のカル
ボキシ末端合成ペプチド（予想アミノ酸配列からの残基
ＧＴＰＴＡＥＮＰＥＹＬＧＬＤＶＰＶ）に対するウサギ
ポリクローナル抗血清が調製された。

【００１８】更にＡｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ， ｐａｇｅｓ １６４４−１６４６，
Ｖｏｌ． ２３２ （Ｊｕｎｅ ２７， １９８６）
は、ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２ヌクレオチド配列からの予想
アミノ酸配列のカルボキシ末端の１４アミノ酸残基に対
応する合成ペプチドに対する抗体の作製について記載し
ている。抗体は、ＭＫＮ−７腺癌細胞から１８５０００
ダルトン糖タンパク質を免疫沈降させることが報告され
ている。

【００１９】最も最近では、キナーゼ領域でなくＥＧＦ
結合部位を含む１００キロダルトンの截頭（ｔｒｕｎｃ
ａｔｅｄ）レセプターによる上皮成長因子レセプターの
チロシンキナーゼ活性の調節が、Ｂａｓｕ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｐａｇｅｓ ６７１−６７７（Ｆ
ｅｂｒｕａｒｙ １９８９）により報告されている。こ
の文献によると、血小板由来成長因子レセプター、イン
シュリンレセプター及びｎｅｕレセプターのような構造
的に関連するレセプターキナーゼは、１００ｋＤａの截
頭レセプターにより阻害されないことが記載されてい
る。

【００２０】発明の要約 本発明は、ヒトｎｅｕ遺伝子産物の細胞外領域に実質的
に対応する約９７０００ダルトン〜約１１５０００ダル
トンの範囲の分子量を有するヒトｎｅｕ関連タンパク質
である実質的に精製されたｐ１００に係り、該タンパク
質は生物学的流体で検出可能である。

【００２１】本発明は更にこのタンパク質を検出するた
めのアッセイに係る。

【００２２】最後に、本発明はｐ１００に結合すること
が可能なモノクローナル抗体にも係る。

【００２３】図面の簡単な説明 図１は、指示したヒトｎｅｕ遺伝子ｃＤＮＡをｐＬＪΔ
発現ベクターに挿入することにより作製されるプラスミ
ドベクターｐＬＪΔｎｅｕの概略説明図である。

【００２４】図２Ａ，２Ｂ，２Ｃ及び２Ｄは、本発明の
モノクローナル抗体がヒトｎｅｕ関連タンパク質を認識
することを示す免疫沈降結果を示す。

【００２５】図３は、モノクローナル抗体ＯＤ３及びＰ
Ｂ３のイムノブロットの結果を示す。

【００２６】図４Ａ，４Ｂ，４Ｃ及び４Ｄは、免疫蛍光
結果を示す。

【００２７】図５Ａ，５Ｂ，５Ｃ及び５Ｄは、流動細胞
計測の結果を示す。

【００２８】図６は、ビオチニル化ＴＡ−１の結合に競
合させるためにＴＡ−１及びＮＢ−３を使用した場合の
結合曲線を示す。

【００２９】図７は、ビオチニル化ＮＢ−３の結合に競
合させるためにＴＡ−１及びＮＢ−３を使用した場合の
結合曲線を示す。

【００３０】図８は、捕獲ＥＬＩＳＡシステムを使用し
て種々のヒト乳癌細胞系からの溶解物をｎｅｕ関連タン
パク質の存在に関して試験した捕獲イムノアッセイの結
果を示す。抗ヒトｎｅｕモノクローナル抗体（ＴＡ−
１）を使用してｎｅｕ関連タンパク質を捕獲し、抗ヒト
ｎｅｕモノクローナル抗体ＮＡ−３をビオチニル化し、
ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓ
Ａ−ＨＲＰ）を用いて検出した。

【００３１】図９は、ｎｅｕを発現するヌードマウス腫
瘍の細胞溶解物（Ｘ−３−５）と、ｎｅｕ陰性腫瘍の腫
瘍溶解物（３Ｔ３／ｒａｓ）との比較の結果（腫瘍溶解
物μｇと光学密度の関係）を示す。アッセイは捕獲試薬
として抗ヒトｎｅｕモノクローナル抗体ＮＢ−３を用い
て実施し、抗ヒトｎｅｕモノクローナル抗体ＴＡ−１を
ビオチニル化し、ＳＡ−ＨＲＰを用いて検出した。

【００３２】図１０は、ヒト乳房組織の正常試験片（２
７４７−０１−０５０）又は乳癌（２７４７−０１−０
５０）から調製し、捕獲フォーマットを使用してｎｅｕ
関連タンパク質の存在を試験した細胞溶解物の捕獲イム
ノアッセイの結果を示す。アッセイは捕獲試薬として抗
ヒトｎｅｕモノクローナル抗体ＴＡ−１を用いて実施
し、モノクローナル抗体ＢＤ−５をビオチンに結合し、
ＳＡ−ＨＲＰを用いて検出した。

【００３３】図１１は、１８−３−７細胞（ヒトｎｅｕ
遺伝子で形質転換され且つ細胞表面にｐ１８５タンパク
質を発現するＮＩＨ ３Ｔ３細胞）、３Ｔ３ｒａｓ細胞
（ｒａｓ遺伝子で形質転換され且つ細胞表面にヒトｐ１
８５タンパク質を発現しないＮＩＨ ３Ｔ３細胞）、及
びＳＫ−ＢＲ−３ヒト乳癌細胞からの上清流体、並びに
１０％ウシ胎児血清を補充した培養培地ＤＭＥＭの捕獲
イムノアッセイの結果を示す。捕獲イムノアッセイで
は、抗ｎｅｕモノクローナル抗体ＮＢ−３を捕獲試薬と
して使用し、ビオチニル化した抗ヒトｎｅｕモノクロー
ナル抗体ＴＡ−１を検出システムの一部として使用し
た。

【００３４】図１２は、乳癌細胞系ＨＳ０５７８ｔから
得た活性化ｒａｓ遺伝子に由来するｒａｓ形質転換ＮＩ
Ｈ ３Ｔ３細胞系であるＴ１４４に由来する腫瘍を有す
るマウスから採取した血清、ｐ１８５タンパク質を発現
する腫瘍を有するマウス（１８−３−７マウス）から採
取した血清、及びｐ１８５タンパク質を発現しない腫瘍
を有するマウス（３Ｔ３（ｒａｓ））から採取した血清
を使用した捕獲イムノアッセイの結果を示す。捕獲抗体
として抗ヒトｎｅｕモノクローナル抗体ＴＡ−１を使用
してこれらの血清をアッセイし、ビオチニル化した抗ヒ
トｎｅｕモノクローナル抗体ＢＤ−５を検出システムの
一部として使用した。

【００３５】図１３は、抗ヒトｎｅｕモノクローナル抗
体ＴＡ−１を捕獲試薬として使用し、ビオチニル化ＢＤ
−５を検出システムの一部として使用した捕獲イムノア
ッセイの結果を示す。分析用サンプルは、正常ヒト血漿
と２人の乳癌患者から採取した血漿とした。

【００３６】図１４は、ｐ１００とｐ１８５の関係を示
す免疫沈降結果を示す。

【００３７】図１５〜１８は、乳癌、胃癌及び卵巣癌患
者から採取したヒト血漿サンプルにおけるｐ１００の検
出を示すイムノブロットの結果を示す。

【００３８】寄託一覧表 下記のハイブリドーマ細胞系を、ブダペスト条約に従っ
て、12305 Parklawn Drive，Rockville，Maryland，208
52のAmerican Type Culture Collection(ATCC)に下記の
受託番号で寄託した。

【００３９】ハイブリドーマ細胞系BD5-2d：1988年4月1
8日にATCC受託番号HB 9689で寄託。

【００４０】ハイブリドーマ細胞系OD3：1989年8月11日
にATCC受託番号HB10204で寄託。

【００４１】ハイブリドーマ細胞系NB-3：1989年8月11
日にATCC受託番号HB 10205で寄託。

【００４２】ハイブリドーマ細胞系TA-1：1989年8月11
日にATCC受託番号HB 10206で寄託。

【００４３】発明の詳細 ヒトneu、c-erbB-2、HER-2/neu及びHER-2という用語は
本明細書では互換性をもって使用される。

【００４４】本明細書で使用する腫瘍遺伝子という用語
は、何等かの形であるいは何等かのメカニズムによっ
て、正常細胞から癌細胞への変換に関与するように変化
した遺伝子を意味する。例えば、ラットneu腫瘍遺伝子
は、トランスメンブラン領域で発生する点変異を通して
ラットの悪性腫瘍に関与すると思われる。一方、ヒトne
u腫瘍遺伝子という用語は、何等かの方法で、ヒトneu遺
伝子産物の過剰発現(over-expression)を通してヒトの
悪性腫瘍に関与するように変えられると考えられるヒト
neuプロト腫瘍遺伝子(proto-oncogene)をさすのに使用
されてきた。正常なヒトc-erbB-2タンパク質の過剰発現
はNIH/3T3細胞の形質転換につながることが判明してい
る（Di Fioreら、Science,237:178-182(1987))。

【００４５】「ヒトneu遺伝子産物」という用語は、細
胞内チロシンキナーゼ領域とトランスメンブラン領域と
細胞外領域とを有しヒトneu遺伝子によって産生される
成長因子レセプター様糖タンパク質を意味する。このタ
ンパク質は約185又は190キロダルトンの分子量を有する
と報告されている。本明細書では、略号“p185”をヒト
neu遺伝子産物と互換的に使用する。

【００４６】「実質的に精製した」という表現は、通常
は随伴している他の細胞成分を含まないように合成した
こと、又は天然のものであれば単離したことを意味す
る。

【００４７】細胞の正常な増殖及び分化におけるヒトc-
erbB-2タンパク質の機能は未知であるが、ヒトc-erbB-2
遺伝子でコードされた成長因子レセプター様タンパク質
の発現の増加は、腫瘍（新生物）の発生又は進行で重要
な役割を果たすように思われる。

【００４８】本発明の重要な目的の１つは、ヒトの生物
学的流体(biological fluid)、例えば血液、血清、血
漿、尿、脳脊髄液、正常細胞溶解物の上清、前腫瘍性(p
reneoplastic)細胞溶解物の上清、腫瘍細胞溶解物の上
清、組織培養状態に維持されている癌細胞系の上清及び
胸部吸引物(breast aspirates)の中に検出できるヒトne
u関連タンパク質に関する。

【００４９】より特定的には、本発明は、ヒトneu遺伝
子産物の細胞外領域に実質的に対応する約97,000ダルト
ン〜約115,000ダルトンの範囲の分子量を有するヒトneu
関連タンパク質である実質的に精製したp100に関する。
このタンパク質は前述のような生物学的流体中で検出で
きる。

【００５０】「実質的に対応する」という表現は、多少
の付加、欠失及び／又は置換を配慮したものである。

【００５１】p100はp185の開裂／分解産物であると考え
られる。しかしながら、p100は独立して合成することも
可能である。p100は更に修飾及び/又は開裂することも
可能である。

【００５２】p100の分子量範囲は、後述のイムノブロッ
トフォーマット又は免疫沈降フォーマットを用いて測定
した。

【００５３】本発明は、ヒトの前腫瘍性細胞又は腫瘍細
胞の検出方法にも関する。この方法は、ヒトに由来する
生物学的流体中のp100の存在を検査するために、（ａ）
前記タンパク質と結合できる少なくとも１つのモノクロ
ーナル抗体に前記流体を接触させ、且つ（ｂ）抗体結合
が生起したか否かを調べることからなる。

【００５４】本発明は、別の実施態様では、p100の存在
を検出又は定量するためのイムノアッセイに関する。こ
のイムノアッセイは、（ａ）p100に結合できる少なくと
も１つの第１のモノクローナル抗体に前記流体を反応さ
せ、（ｂ）ステップ（ａ）の産物を、第１の抗体が結合
したエピトープとは異なるエピトープでp100に結合でき
る少なくとも１つの検出可能なように標識した第２のモ
ノクローナル抗体と反応させ、（ｃ）ステップ（ｂ）の
産物を検出又は定量する操作を含む。

【００５５】本発明は、p100の検出に使用できるモノク
ローナル抗体にも関する。

【００５６】これらの抗体の免疫反応性フラグメントも
本発明の実施に使用できる。

【００５７】これらのモノクローナル抗体又はその免疫
反応性フラグメントは、後述のようにp185の細胞外領域
に特異的なものである。簡単に説明すれば、これらの抗
体は、NIH 3T3細胞系、シクロホスファミド及び完全な
長さを有するヒトneu遺伝子産物を発現したトランスフ
ェクションしたNIH 3T3細胞系を投与することからなる
プロトコルを用いてマウスを免疫することにより産生し
た。この方法は後でより詳細に説明する。

【００５８】本発明では、抗体又は抗体混合物を検出に
使用できる。これらの抗体は、一般的な方法を用いて、
レポーターで直接標識するか又は特異的結合対(specifi
c binding pair)の一員で間接的に標識し得る。

【００５９】特異的結合対は免疫タイプ又は非免疫タイ
プであってよい。免疫性の特異的結合対は例えばハプテ
ン／抗ハプテンシステムの抗原−抗体システムである。
具体例としては、フルオレセイン／抗フルオレセイン、
ジニトロフェニル／抗ジニトロフェニル、ビオチン／抗
ビオチン、ペプチド／抗ペプチド等が挙げられる。特異
的結合対の抗体員(anti-body member）は当業者に良く
知られた一般的方法によって産生できる。これらの方法
は、特異的結合対の抗原員(antigen member)で動物を免
疫するものである。特異的結合対の抗原員が免疫原性で
ない場合、例えばハプテンの場合には、これを担体タン
パク質に共有結合して免疫原性にすることができる。

【００６０】非免疫性の結合対は例えば、２つの構成員
が互いに対して生来の親和性を示すが抗体ではないよう
なシステムである。非免疫性結合対の具体例としては、
ビオチン-ストレプタビジン、内因子-ビタミンＢ_１２、
葉酸-葉酸塩結合タンパク質等が挙げられる。

【００６１】特異的結合対の構成員で抗体を共有結合的
に標識するための方法は色々ある。これらの方法は、特
異的結合対の構成員の性質、所望の結合のタイプ、及び
種々の結合に際しての化学作用(conjugation chemistr
y)に対する抗体の耐性に基づいて選択する。ビオチンは
市販の活性誘導体を用いて抗体に共有結合することがで
きる。これらの誘導体の具体例としては、タンパク質上
のアミン基に結合するビオチン-N-ヒドロキシ-スクシン
イミド；カルボジイミド結合を介して炭水化物部分、ア
ルデヒド及びカルボキシル基に結合するビオチンヒドラ
ジド；並びにスルフヒドリル基に結合するビオチンマレ
イミド及びヨードアセチルビオチンが挙げられる。フル
オレセインはフルオレセインイソチオシアネートを用い
てタンパク質アミン基に結合できる。ジニトロフェニル
基は2,4-ジニトロベンゼンスルフェート又は2,4-ジニト
ロフルオロベンゼンを用いてタンパク質アミン基に結合
できる。特異的結合対の一員にモノクローナル抗体を結
合するためには、ジアルデヒド、カルボジイミド結合、
同種官能性(homofunctional)架橋及び異種二官能性(het
erobifunctional)架橋を含む他の標準的結合方法を使用
し得る。カルボジイミド結合は、ある物質上のカルボキ
シル基を別の物質上のアミン基に結合させるのに有効な
方法である。カルボジイミド結合は、市販の試薬１-エ
チル-3-(ジメチル-アミノプロピル)-カルボジイミド(ED
AC)を用いれば容易に実施できる。

【００６２】二官能性イミドエステル及び二官能性N-ヒ
ドロキシ-スクシンイミドエステルを含む同種二官能性
架橋剤は市販されており、ある物質上のアミン基を別の
物質上のアミン基に結合するのに使用される。異種二官
能性架橋剤は異なる官能基を有する試薬である。最も一
般的な市販の異種二官能性架橋剤は、１つの官能基とし
てアミン反応性N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを
有すると共に第２の官能基としてスルフヒドリル反応基
を有する。最も一般的なスルフヒドリル反応基はマレイ
ミド、ピリジルジスルフィド及び活性ハロゲンである。
これらの官能基の１つは、照射によって種々の基と反応
する光活性アリールニトレンであってよい。

【００６３】1つもしくは複数の検出可能な標識を付し
た抗体、又は特異的結合対の検出可能な標識を付した構
成員は、放射性アイソトープ、酵素、蛍光発生物質(flu
orogenic material)、化学ルミネセント物質又は電気化
学物質からなり得るリポーターに結合する。一般的に使
用されている２つの放射性アイソトープは^１２５Ｉ及び
^３Ｈである。標準的な放射性アイソトープ標識方法は例
えば、^１２５Ｉの場合がクロラアミンＴ、ラクトペルオ
キシダーゼ及びBolton-Hunter法、^３Ｈの場合が還元メ
チル化である。

【００６４】本発明で使用するのに適した酵素の非限定
的具体例としては、ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β-ガラクトシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β-ラ
クタマーゼ、ウレアーゼ及びリゾチームが挙げられる。
酵素標識は、抗体を特異的結合対の一員と結合するため
の前述のようなジアルデヒド、カルボジミド結合法、同
種二官能性架橋剤及び異種二官能性架橋剤を用いて容易
に実施できる。

【００６５】選択する標識方法は、酵素上及び標識すべ
き物質上に存在し得る官能基と、結合条件に対する両者
の耐性とに依存する。本発明で使用する標識方法は、限
定的ではないが、一般に使用されている任意の公知の方
法、例えばImmuno-chemistry8,871(1971)に記載のEngva
ll及びPearlmannの方法、Immunochemistry 8,1175(197
5)に記載のAvrameas及びTernynckの方法、J.Immunoassa
y 4(3):209-327(1983)に記載のIshikawaらの方法、並び
にAnal.Biochem.148:199(1985)に記載のJablonskiの方
法の1つであってよい。

【００６６】標識は、スペーサ又は特異的結合対の別の
構成員を用いるような間接的方法によって実施し得る。
その一例としては、非標識ストレプタビジン及びビオチ
ニル化酵素でのビオチニル化抗体の検出が挙げられる。
ストレプタビジン及びビオチニル化酵素は逐次加えるか
又は同時に加える。このように、本発明では、検出に使
用する抗体をリポーターで直接的に検出可能なように標
識するか、又は特異的結合対の第１の構成員で間接的に
検出可能なように標識し得る。抗体を特異的結合対の第
１の構成員に結合する場合は、抗体と特異的結合対の第
１の構成員との複合体を、前述のような標識した又は標
識していない第２の結合対構成員と反応させることによ
って検出を行う。

【００６７】また、非標識検出抗体(detector antibod
y)は、この非標識抗体を該非標識抗体に特異的な標識抗
体と反応させることによって検出できる。このような抗
抗体は、前述の方法のうち任意の方法を用いて直接に又
は間接的に標識し得る。例えば、前述のストレプタビジ
ン-ホースラディッシュペルオキシダーゼシステムと反
応させることによって検出されるビオチンにこの抗抗体
を結合することができる。

【００６８】本発明の好ましい実施態様の１つではビオ
チンを使用する。ビオチニル化した抗体はストレプタビ
ジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体と反
応させる。発色検出(chromogenic detection)を行うた
めには、オルトフェニレンジアミン、4-クロロ-ナフト
ール又はテトラメチルベンジジン(TMB)を使用し得る。

【００６９】本発明を実施するための好ましいイムノア
ッセイフォーマットは、通常の方法でキャプチャー試薬
(capture reagent)を支持体の表面に固定しておくフォ
ーワードサンドイッチアッセイ(forward sandwitch ass
ay)である。

【００７０】アッセイで使用する適当な支持体として
は、ポリプロピレン、ポリスチレン、置換ポリスチレ
ン、例えばアミノ化もしくはカルボキシル化ポリスチレ
ン、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリビニルクロ
リド等のような合成ポリマー支持体、ガラスビーズ、ア
ガロース、ニトロセルロース等が挙げられる。

【００７１】

【実施例】以下に非限定的実施例を挙げて本発明をより
詳細に説明する。

【００７２】実施例１ neu特異的モノクローナル抗体の産生 Ａ．ハイブリドーマの形成 neu遺伝子がコードするタンパク質即ちp185の全長を発
現する生存細胞(後述する18−3−7細胞系)でマウスを免
疫感作することによって、後述するハイブリドーマを生
じさせた。上記生存細胞がもたらす完全なタンパク質を
免疫原として用いると、該タンパク質の細胞外ドメイン
全体に対して特異性を有するモノクローナル抗体の集団
を生じさせることができる。このことは、元のタンパク
質から限られた数のエピトープしかもたらさず、従って
限られた特異性の免疫応答しか惹起しないペプチド免疫
原、もしくは原核細胞系が産生する短いポリペプチドを
用いる場合とは対照的である。そのうえ、上記タンパク
質抗原をその自然状態に有ると考えられるものに与える
ことによって免疫系を、後に抗体を診断または治療に適
用した場合に認められる抗原にきわめて類似する抗原に
対して応答性にできる。

【００７３】Ｂ．18−3−7細胞の生成 18−3−7細胞は、全長正常ヒトneuタンパク質を発現す
る、トランスフェクションしたNIH 3T3細胞系である。
ヒトneu遺伝子をマウス白血病ウイルスLTRで発現させる
(プロモーター及びエンハンサー)。この細胞系は、形質
転換したNIH 3T3細胞のあらゆる特徴を示す。前記細胞
は軟質寒天中で成長し、ヌードマウスに腫瘍を発生さ
せ、かつ変化した形態的特徴を現わす。上記細胞系を、
抗ヒトneu特異的モノクローナル抗体単離のための免疫
原として用いた。

【００７４】pLJレトロウイルスベクターを改変してポ
リオーマ初期領域を除去し、それによってpLJベクター
の内因性形質転換活性を排除した。改変ベクターの構成
を第1図に示す。改変は、pLJをApaＩで制限し、6300塩
基対フラグメントを単離してからT4リガーゼで環を回復
することによって行なった。得られたプラスミド(第1図
に示したpLJΔもしくはpAbT5009)を唯一のBamHＩ部位で
消化し、Klenowを組み込み、かつ、完全なヒトneuタン
パク質コード領域を含むKlenow処理済みのNcoＩ−HindI
IIフラグメントに連結した。得られたプラスミド(第1図
に示したpLJΔneuもしくはpAbT577)をカルシウムホスフ
ェート沈澱法でトランスフェクションして、NIH 3T3細
胞とした。トランスフェクションした細胞をG418におい
て選択した(pLJΔはsv40をプロモーターとするneo^Ｒ遺
伝子を有する)。コロニーを、RNAドットブロットにより
neu発現に関してスクリーニングした。18−3−7は、ス
クリーニングした約50の発現細胞系のなかで最高のもの
の一つであった。

【００７５】Ｃ．マウスの免疫感作 雌の成体Balb/cマウス2匹を、1匹当たり1.4×10^６個の
生存NIH 3T3細胞を腹腔内(IP)注射して免疫感作した。
その直後に、H_２O中のシクロホスファミド30mg/kgをIP
注射した。このシクロホスファミド処理を、最初の処理
の24時間後及び48時間後に繰り返した。免疫感作から14
日目に、1.5×10^６個の生存18−3−7細胞をマウスにIP
注射した。その後14日間マウスを休ませてから再びNIH
3T3細胞、シクロホスファミド及び18−3−7細胞を逐次
注射した。18−3−7細胞を2度目に注射した4日後にマウ
スを殺し、その脾臓を第一の融合のために取得した。同
じ実験を4匹の雌のBalb/cマウス及び4匹の雌のCB6(Balb
/c×C57BL/6)マウスでも行ない、その際免疫感作の第1
ラウンドでは1匹当たり1.8×10^６個のNIH 3T3細胞と4.8
×10^６個の18−3−7細胞とを、また第2ラウンドでは1匹
当たり8.5×10^６個のNIH 3T3細胞と2.7×10^６個の18−3
−7細胞とを用いた。

【００７６】Ｄ．ハイブリドーマ形成方法 免疫感作マウス由来の細胞をSP2/Oミエローマ細胞(ATCC
CRL 1518)とポリエチレングリコール(PEG)法で融合させ
てハイブリドーマを形成した。免疫感作したマウスから
脾臓を無菌状態下に取り出し、この脾臓を無血清培地(D
ME)で灌流することによって脾臓細胞の単一細胞懸濁液
を得た。脾臓細胞とSP2/O細胞(対数増殖期の培養物から
収穫)とを、脾臓細胞対ミエローマ細胞比を5：1として
混合した。細胞を4℃で10分間200×gで遠心分離し、上
澄み液を吸引によって除去した。試験管底を穏やかに叩
いて細胞ペレットをほぐした後、PEG10％含有の無菌37
℃DMEを1ml滴下し加えた。PEGを1.5分間にわたって添加
している間、試験管を穏やかに振り動かした。その後更
に10mlの37℃無血清培地DMEを滴下し加え、続いて20ml
の培地を追加した。得られた懸濁液を室温で10分間200
×gで遠心分離した。細胞ペレットから培地を吸引して
から、20％ウシ胎児血清、0.2mMヒポキサンチン、0.4μ
Mアミノプテリン及び0.032mMチミジンの存在下に腹膜マ
クロファージ(2×10^４細胞/ml)を含有する培地(HAT培
地)を用いて細胞ペレットを再懸濁させた(腹膜マクロフ
ァージは免疫感作していないマウスから取得したが、こ
のマウスをBalb/cとするかCB6とするかは融合にいずれ
のマウスに由来する脾臓細胞を用いたかに依った。この
細胞の取得は、安楽死させたマウスの腹膜に無血清培地
を注射し、この培地を直ちに回収することによって行な
った)。融合完了細胞を再び懸濁させて、最終細胞濃度
(腹膜マクロファージは含まず)を5×10^５細胞/mlとし
た。この細胞混合物1mlを、24個のウェルプレートの各
ウェルに分配した。

【００７７】Ｅ．ELISA法及び予備スクリーニング 融合後に成長したハイブリドーマを、まず18−3−7細胞
の細胞溶解物におけるELISAアッセイによって抗ヒトneu
抗体の分泌に関してスクリーニングした。細胞溶解物
は、新たに収穫した18−3−7細胞を低張溶解緩衝液(10m
M Tris、10mM KCl、5mM EDTA、pH8.0)の存在下にインキ
ュベートし、その後Triton X100を添加して最終濃度を1
％とすることによって製造した。負の対照として用いる
べく、NIH3T3細胞の溶解物も同様に製造した。マイクロ
タイタープレート(NuncのImmunoplate II)を室温で一
晩、全タンパク質濃度500μg/mlの細胞溶解物50μlで被
覆した。結合しなかった抗原を吸引除去後にELISAを実
施し、その際まず抗原で覆われたマイクロタイターウェ
ル内の生存ハイブリドーマコロニーから得られる培養上
澄み液50μlをインキュベートした。37℃で3時間インキ
ュベート後、洗浄緩衝液(0.05％Tween 20、20mM Tris、
pH7.6)で3回洗浄してから、セイヨウワサビペルオキシ
ダーゼ50μlで標識したヤギ抗マウスIgG＋IgA＋IgM(HRP
−GAM−GAM)と共に37℃で1時間インキュベートした。再
びウェルを洗浄緩衝液で3回洗浄し、50μlのテトラメチ
ルベンジジン(TMB)溶液を添加することによって評価を
行なった。TMB溶液は、10mgのTMBを1mlのジメチルスル
ホキシド(DMSO)に溶解させ、得られた溶液100μlを5ml
のTMB緩衝液(0.1Mクエン酸でpH6.0以下とした0.1M酢酸
ナトリウム)に10μlの3％過酸化水素と共に添加するこ
とによって製造した。5分間発色させた後、50μlの2N H
_２SO_４を添加することによって酵素反応を停止させた。
得られた黄色の光学密度(OD)は、マイクロタイタープレ
ート読み取り機で450nmにおいて読み取った。18−3−7
細胞で覆われたウェルにおいて発色した黄色の方がNIH
3T3細胞で覆われたウェルにおいて発色した黄色より濃
いことが正の反応の生起を示唆し、それによって培養上
澄み液中にヒトneu遺伝子産物を識別する抗体が存在す
ることが判明した。

【００７８】Ｆ．ハイブリドーマのサブクローニング 最初のスクリーニングで正の結果をもたらしたハイブリ
ドーマを、細胞及び得られる抗体が真にモノクローナル
となることを確実にするべく限界希釈法で希釈及びクロ
ーニングした。まず、免疫感作していない6週齢マウス
から胸腺リンパ球を得、これをHAT培地中に懸濁させて
濃度2×10^４細胞/mlの単一細胞懸濁液を製造することに
よって支持細胞集団を形成した。ヒトneu遺伝子産物に
対する抗体の存在についての試験結果が正であったハイ
ブリドーマコロニーを胸腺リンパ球含有培地で希釈し
て、濃度を5ハイブリドーマ細胞/mlとした。この希釈液
200μlを、96個のウェルマイクロタイタープレートの各
ウェルに分配した。コロニーが成長したところで、今度
もまた上澄み液をヒトneu遺伝子産物に対する抗体の存
在について試験した。先に述べたようなELISAアッセイ
で試験して、その結果が正であれば再度コロニーを限界
希釈法でクローニングした。

【００７９】上述のような処理に続いて第一の融合を実
現することによって得られたハイブリドーマは、BD5-2
d、TA-1-1c、RC1-4c、NA3-6a及びOD3-10jと呼称されて
いるモノクローナル抗体を分泌する。第二の融合後に
は、PB3、RC6-2、NB-3、ID5及びIB3-4と呼称される抗体
を分泌するハイブリドーマが得られた。

【００８０】Ｇ．抗体のイソタイプ及びサブクラスの確
定 ELISAアッセイを実施して、ハイブリドーマが産生する
抗体のイソタイプ及びL鎖クラスの確定と、IgGサブクラ
スの確定とを行なった。そのために、必要な免疫試薬を
総て含有したキットをBoehringer Mannheim(Indianapol
is, IN)から購入した。クローニングしたハイブリドー
マコロニーから得られた組織培養上澄み液を、先に述べ
たように18−3−7細胞の溶解物上でインキュベートし
た。続いて、マウスの免疫グロブリンイソタイプ、L鎖
クラス及びIgGサブクラスに特異的なヤギ抗血清と共に
インキュベートし、その後第二の抗体としてセイヨウワ
サビペルオキシダーゼで標識したブタ抗ヤギIgGを加え
てインキュベートした。製造者の指示によりABTS[2,2′
−アジノ−ビス−(3−エチルベンズチアゾリン−6−ス
ルホン酸)]を用いて評価を行ない、得られた緑色のODを
405nmで読み取った。

【００８１】この方法を用いて、第一の融合から得られ
る3種のモノクローナル抗体BD5-2d、RC1-4c及びTA-1-1c
はIgG1/Κ抗体であり、またNA3-6a及びOD3-10jはIgM/Κ
抗体であることを確定した。第二の融合から得られるモ
ノクローナル抗体RC6-2、NB-3、ID5及びIB3-4はIgG1/Κ
であり、抗体PB3はIgG2a/Λである。

【００８２】Ｈ．放射免疫沈降法 抗体が185kd分子量、即ちヒトneu遺伝子産生物の予測分
子量の蛋白質を識別したかどうかを検出するために、各
モノクローナル抗体を用いて放射活性標識18-3-7細胞を
免疫沈降した。10cmペトリ皿内の18-3-7細胞(またはNIH
3T3)の近似集密的細胞単層を、^３５Ｓ-標識システイン
500μCiを含む培地内で一晩インキュベートした。翌
朝、細胞を集め、プロテアーゼ阻害剤PMSF及び大豆トリ
プソン阻害剤を含む界面活性剤緩衝液（IP緩衝液：１%
Triton X-100，１% デオキシコール酸ナトリウム、0.1%
SDS、10mM Tris、0.65M NaCl、pH7.2）に溶解させた。
標識細胞調製物約１μCiを、各ハイブリドーマ由来の培
養上清500μlと４℃で一晩インキュベートした。このイ
ンキュベーション中に、精製したウサギ抗-マウスＩgＧ
（Kirkegaad＆Perry Labs)50μgを、プロテインＡ-セフ
ァロース（Pharmacia）のIP懸濁液中１:１スラリー50μ
lと一晩４℃で混合した。プロテインＡ-セファロースを
一度IP緩衝液で洗浄することにより、過剰のウサギ抗体
を除去し、このスラリーを、標識細胞とモノクローナル
抗体を含むインキュベーション混合物に添加した。この
混合物を、一晩４℃で反応させた。プロテインＡ-セフ
ァロースを遠心分離してペレットとし、IP緩衝液で４
回、次いでTBS(10mM Tris、150mMNaCl、pH8.2)で１回洗
浄し、ペレットを乾燥させた。各ペレットをSDSゲル（1
0mM Tris、４% SDS、20% グリセロール、10% 2-メルカ
プトエタノール、0.04% ブロムフェノールブルー）用に
サンプル緩衝液50μl中に再び懸濁させた。各サンプル
の２分の１を、4.5% アクリルアミドスタッキングゲル
及び７%分離ゲルを含むSDSポリアクリルアミドゲルにか
けた。このゲルを乾燥させ、次いでオートラジオグラフ
にかけた。免疫沈降法の結果は、モノクローナル抗体の
総てが、NIH 3T3細胞内には存在しない、18-3-7細胞内
の約185kdの分子量の蛋白質(p185)を識別したことを示
した。これは、標準蛋白質マーカーにより表されるよう
に、オートラジオグラフ上の185kd分子量の蛋白質に対
応する距離をゲル中移動した濃いバンドがあることによ
り決定した。SKBR-3細胞(ヒト乳癌)及びA431細胞(ヒト
表皮癌)を用いて同様の実験を実施した。SKBR-3細胞
は、高レベルのヒトneu遺伝子産生物を発現し、上述の
モノクローナル抗体を用いる免疫沈降法により確実な結
果が出ることは他の研究者により明らかにされている。
検出バンドは、標識18-3-7細胞から沈降したバンドと同
一距離に移動した。これらの実験及び以下に記載する免
疫ブロット分析を元にすると、18-3-7細胞に対して産生
されたモノクローナル抗体は、ヒトneu遺伝子産生物に
特異的で、且つヒトEGFRと交差反応しなかったと結論で
きる。

【００８３】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ及び２Ｄは、免疫沈降
法の結果を示す。

【００８４】図２Ａは、ＩgＧモノクローナル抗体を用
いた18-3-7及びNIH/3T3細胞溶解物の免疫沈降を示すパ
ネルＡである。レーン１は、分子量基準を含む。レーン
２、４、６、８、及び10は、18-3-7溶解物を含み、レー
ン３、５、７、９及び11は、NIH/3T3溶解物を含んでい
る。レーン２及び３は、TA１で沈降させたものである。
レーン４及び５は、BD5で沈降させたものである。レー
ン６及び７は、NB3で沈降させたものである。レーン８
及び９は、PB3で沈降させたものである。レーン10及び1
1は、MOPC-21で沈降させたものである。

【００８５】図２Ｂは、ＩgＭモノクローナルを用いた1
8-3-7及びNIH/3T3細胞溶解物の免疫沈降を示すパネルＢ
である。レーン１は、分子量基準を含む。レーン２、４
及び６は、18-3-7溶解物を含む。レーン３、５及び７
は、NIH/3T3溶解物を含む。レーン２及び３は、OD3で沈
降させたものである。レーン４及び５は、NA3で沈降さ
せたものである。レーン６及び７は、TEPC183で沈降さ
せたものである。図２Ｃは、ＩgＧモノクローナルを用い
たSKBR-3及びA-431細胞溶解物の免疫沈降を示すパネル
Ｃである。レーン１は、分子量基準を含む。レーン２、
４、６、８、10及び12は、SKBR-3溶解物を含む。レーン
３、５、７、９、11及び13は、A-431溶解物を含む。レ
ーン２及び３は、TA1で沈降させたものである。レーン
４及び５は、BD5で沈降させたものである。レーン６及
び７は、PB3で沈降させたものである。レーン８及び９
は、NB3で沈降させたものである。レーン10及び11は、M
OPC21で沈降させたものである。レーン12及び13は、ウ
サギ抗-EGFRで沈降させたものである。

【００８６】図２Ｄは、ＩgＭモノクローナルを用いたS
KBR-3及びA-431細胞溶解物の免疫沈降を示すパネルＤで
ある。レーン１は、分子量基準を含む。レーン２、４、
６及び８は、SKBR-3溶解物を含む。レーン３、５、７及
び９は、A-431溶解物を含む。レーン２及び３は、OD3で
沈降させたものである。レーン４及び５は、NA3で沈降
させたものである。レーン６及び７は、TEPC183で沈降
させたものである。レーン８及び９は、ウサギ抗-EGFR
で沈降させたものである。 Ｉ．免疫ブロット 4.5%スタッキングゲルを用いて、SKBR-3細胞（ATCC HTB
30）及びA-431細胞（ATCC CRL 1555）の溶解物を、1.5
mm厚さのSDS-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にか
けた。分離した蛋白質を、BioRadトランスブロット装置
を用いてニトロセルロース（Schleicher＆Schuell）上
に移した。次いでニトロセルロースフィルターをBlotto
（PBS中3% ドライミルク、２% 正常ヤギ血清、0.1% Twe
en-20）中で１時間ブロックし、0.5μg/ml OD3若しくは
２μg/ml PB3（両方ともBlottoで希釈）、または20μg/
ml 291-3A（培養上清中）を用いて室温で３時間インキ
ュベートした。291-3Aは、EGFRのチロシンキナーゼドメ
インから誘導したペプチドを用いて産生した抗-EGFRモ
ノクローナル抗体である。（291-3Aは、Randall Schatz
mann,Syntex Reserch,Palo Alto,CA.より贈呈されたも
のである。）フィルターを高濃度塩洗浄緩衝液（20mM T
ris-HCl、１M NaCl、0.05% Tween-20、pH7.6)で３回濯
ぎ、次いでアルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗-マウ
スＩgＧ＋ＩgＡ＋ＩgＭ(Kirkegaad＆Perry Labs)と、室
温で１時間インキュベートした。これらを再び高濃度塩
緩衝液で３回濯ぎ、バンドをBCIP NBT基質キット(Kirke
gaad＆Perry Labs)を使用して視覚化した。

【００８７】総ての場合に於いて、7.5% SDS-ポリアク
リルアミドゲル上でSDS-PAGEにより分離し、次いでニト
ロセルロースに電気泳動により移動させた、SKBR-3細胞
溶解物80μgをレーン１に含み、A-431溶解物80μgをレ
ーン２に含む。免疫ブロットの結果を図３に示す。パネ
ル(ａ)は、0.5μg/ml 精製OD3を用いて検出した結果で
ある。パネル(ｂ)は、２μg/ml 精製PB3を用いて検出し
た結果である。パネル(ｃ)は、20μg/ml 精製291-3Aを
用いて検出した結果である。 Ｊ．免疫蛍光検査法 細胞系を8-チャンバLab Tek組織培養スライド（Miles S
cientific）上で一晩成長させて集密とした。これらを
ダルベッコのPBS（Ｃa^＋＋及びＭg^＋＋を含む）でかる
く洗浄し、次いで室温で30分間３% ホルマリンで固定し
た。TA-1腹水液の1:50希釈液（50% 正常ヤギ血清中で希
釈）を、室温で１時間この細胞とインキュベートした。
スライドを再びPBSで洗浄し、次いでフルオレセイン標
識ヤギ抗-マウスＩgＧ(Cappel)を用いて室温で１時間イ
ンキュベートした。

【００８８】免疫蛍光検査法の結果を、図４Ａ、４Ｂ、
４Ｃ及び４Ｄに示した。パネル(ａ)は、18-3-7細胞であ
る。パネル(ｂ)は、NIH3T3細胞である。パネル(ｃ)は、
SKBR-3細胞であり、パネル(ｄ)は、A-431細胞である。
陽性の蛍光染色が、18-3-7細胞及びSKBR-3細胞で観察さ
れた。NIH3T3及びA-431細胞に於いては、染色は観察で
きなかった。

【００８９】Ｋ．流動細胞計測法 １度洗浄した、培地から集めた細胞を、Leibovitz L-15
中のサンプル当たり生存細胞２×10^６個の濃度に再び懸
濁させた。これらを精製TA-1 １μgまたはイソタイプに
合わせた対照MOPC-21と、４℃で１時間インキュベート
した。この細胞をPBSで３回洗浄し、ヤギ抗-マウスＩg-
FITC １μgと、４℃で１時間インキュベートした。この
インキュベート後、さらにPBSで３回洗浄した。細胞
を、488nmに調整したアルゴンレーザーを備えたEPICS
Ｖ流動細胞計測器を用いて分析した。細胞の＜５%がイ
ソタイプに合わせた対照抗体に対し陽性であるように、
弁別器をセットした。陽性細胞の割合及び各ヒストグラ
ム毎の平均蛍光強度を、Easy 88 ソフトウェア(Coulte
r)を用いて測定した。総てのパネルに於いて、MOPC21(M
21)は……で、TA1は――で表した。

【００９０】流動細胞計測法の結果を、図５Ａ、５Ｂ、
５Ｃ及び５Ｄに示した。左上の図５Ａは、NIH/3T3/ra
s、即ちラス腫瘍遺伝子でトランスフェクトしたNIH/3T3
細胞系である。上右の図５Ｂは、17-7-8、即ちラス及び
ヒトneu腫瘍遺伝子で共-トランスフェクトしたNIH/3T3
細胞系である。下左の図５Ｃは、X-3-5、即ちras及びヒ
トneu腫瘍遺伝子で共-トランスフェクトしたNIH/3T3細
胞系である。下右の図５Ｄは、18-3-7、即ちヒトneu腫
瘍遺伝子のみでトランスフェクトしたNIH/3T3細胞系で
ある。p185-陽性細胞系は、バックグラウンドよりも約1
0倍以上平均蛍光強度を示した。

【００９１】表１は、上述の測定から得られた結果をま
とめたものである。

【００９２】

【表１】

【００９３】実施例２ モノクローナル抗体ＴＡ−１及びＮＢ−３がｐ１８５分
子上の別個のエピトープを認識することの証明 抗ヒトｎｅｕモノクローナル抗体ＴＡ−１及びＮＢ−３
がｐ１８５の細胞外ドメイン上の異なるエピトープに結
合することを示すために、競合酵素免疫測定法を実施し
た。これは、２種の抗体をｐ１８５と一緒に同時インキ
ュベートし、いずれも他方の特異的結合を阻害し得ない
ことを示すことにより明らかにした。

【００９４】方法 マイクロタイタープレートを、ｐ１８５の資源として使
用した１７−３−１−３細胞の溶解物５０μｌを用い、
全タンパク質濃度１０μｇ／ｍｌで被覆した（Ｍｃｋｅ
ｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ.，１９８９ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
４：５４３−５４８）。１７−３−１−３細胞系は、全
長ヒトｎｅｕ遺伝子で安定にトランスフェクトされたＮ
ＩＨ ３Ｔ３細胞系である。プレートを室温で一晩被覆
しておき、次いでＥＬＩＳＡ洗液（リン酸緩衝溶液中の
０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０，ｐＨ７.４）で３回洗浄し
た。競合抗体を２倍ずつ段階的に４μｇ／ｍｌ〜０.０
３μｇ／ｍｌに希釈した液をウェルに加え、３７℃で１
時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、ビオ
チニル化試験抗体を各ウェルに加えた。１ｍｇ／ｍｌビ
オチニル化ＴＡ−１の１：８００希釈液または１ｍｇ／
ｍｌ ビオチニル化ＮＢ−３の１：５００希釈液を使用
した。３７℃で３時間インキュベートした後、プレート
を再びＥＬＩＳＡ洗液で３回洗浄し、アビジン標識西洋
ワサビペルオキシダーゼ（アビジン−ＨＲＰ；Ｓｉｇｍ
ａ）の１：４０００希釈液を加え、３７℃で１時間イン
キュベートした。最後にプレートを３回洗浄し、テトラ
メチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｓｉｇｍａ；１ｍｌのジメ
チルスルホキシド中の１０ｍｇＴＭＢを５０ｍｌの０.
１Ｍ 酢酸緩衝液，ｐＨ６.０に加え、更に１００μｌの
３％Ｈ_２Ｏ_２を加えたもの）を使用して発色させ、５分
後に２.５Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を使用して反応を停止させた。
得られた黄色を、ＥＬＩＳＡプレート読取り装置で４５
０ｎｍにおいて読取った。

【００９５】結果 図６は、ＴＡ−１及びＮＢ−３をビオチニル化ＴＡ−１
の結合と競合させたときの結合曲線を示す。ＯＤ ４５
０シグナルの低下によって示されるように、非標識ＴＡ
−１の量が増大するとビオチニル化ＴＡ−１の結合は完
全に阻害されることが判る（白い四角形）。ＮＢ−３の
量が増えても影響はない（黒い三角形）。図７は、ＴＡ
−１及びＮＢ−３をビオチニル化ＮＢ−３と競合させた
ときの曲線を示す。この場合、ＮＢ−３の量が増大する
とビオチニル化ＮＢ−３の結合を完全に阻害するが（黒
い三角形）、ＴＡ−１は影響しない（白い四角形）。

【００９６】上記結果は、両抗体が、ヒトｎｅｕ遺伝子
産物上の２つの別個のエピトープを認識したことを示し
た。

【００９７】実施例３ 生物学的流体中に検出される物質がｐ１８５に関連する
ことの証明 ＳＫＢＲ−３細胞系は、ヒト乳腺腫瘍に由来する連続細
胞系であり、高レベルのヒトｎｅｕ遺伝子産物ｐ１８５
を発現することが公知である（Ｋｒａｕｓ，ｅｔ ａｌ.
（１９８７），Ｅｍｂｏ Ｊ．６：６０５−６１０）。
上述のごときｐ１８５に特異的なモノクローナル抗体
は、かかる細胞から採取された培地中で約１００,００
０ダルトンのタンパク質を検知することが判っている。
ｐ１００がヒトｎｅｕ遺伝子産物ｐ１８５に関連するこ
とを確認するために競合結合アッセイを実施した。

【００９８】ｎｅｕ遺伝子をトランスフェクトした細胞
の溶解物中に存在するｐ１８５を使用し、ＳＫＢＲ−３
上清中で放射性標識ｐ１００と結合する抗体と競合させ
た。下記の２点を立証するために、競合アッセイに使用
する抗ｎｅｕ抗体の量を力価測定した。

【００９９】１．抗体の量はアッセイにおける制限試薬
（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）であって、非標
識ｐ１８５及び放射性標識ｐ１００は実際に結合におい
て競合する。

【０１００】２．使用した抗体の量は、オートラジオグ
ラフィーに従って放射性標識ｐ１００のバンドを可視化
するのに十分である。

【０１０１】準集密（約５×１０^６）のＳＫＢＲ−３細
胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ ３０）を含む１つの１０ｃｍペト
リ皿を、システインを含まない培地中で５００μＣｉの
^３５Ｓ−システイン（Ｄｕ Ｐｏｎｔ）と一緒に３７
℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。培養上清を
放射性標識ｐ１００の資源として使用した。

【０１０２】全長ヒトｎｅｕ遺伝子を安定にトランスフ
ェクトしたＮＩＨ ３Ｔ３細胞系を１７−３−１−３と
称し、これをｐ１８５の資源として使用した。１０個の
（１５ｃｍ）ペトリ皿から１０ｍｌのリン酸緩衝溶液
（ＰＢＳ）中に細胞を掻き集めることにより、細胞溶解
物を調製した。２００×ｇで１０分間遠心分離すること
により細胞をペレット化し、このペレットを５ｍｌの低
張溶解緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ，１０ｍＭ ＫＣｌ，
５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８.０）中に再懸濁させ、次いで
Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いてホモジナイズし
た。ホモジネートを２００×ｇで１０分間遠心分離し、
得られた上清を１５秒間超音波処理した。残り全ての細
胞砕片をマイクロ遠心機中で遠心分離することにより除
去し、最終的な上清を細胞溶解物として使用した。同様
に、トラスフェクトしていないＮＩＨ３Ｔ３細胞の溶解
物も調製した。各溶解物の全タンパク質濃度を、Ｂｒａ
ｄｆｏｒｄ法（ＢｉｏＲａｄ）に基づくキットを使用
し、ＢＳＡを標準として用いて測定した。１７−３−１
−３溶解物の全タンパク質濃度は２.６９ｍｇ／ｍｌで
あり、ＮＩＨ ３Ｔ３溶解物は１.０１ｍｇ／ｍｌである
と決定された。１７−３−１−３溶解物は、かかるアッ
セイにおいては１：３に希釈して使用した。

【０１０３】ＳＫＢＲ−３上清及び１７−３−１−３溶
解物中に存在するヒトｎｅｕ関連タンパク質の量をＥＬ
ＩＳＡによって決定した。モノクローナル抗体ＴＡ−１
を使用してＮｕｎｃイムノプレートのウェルを被覆し
た。次いで、上清または溶解物と一緒にインキュベート
し、更にビオチニル化ＰＢ３抗体（ＩｇＧ_２κ）と一緒
にインキュベートした。最後に、アビジン標識西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びＨＲＰのための比色
基質としてのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と一緒
にインキュベートすることによりアッセイを発色させ
た。この捕獲ＥＬＩＳＡによって、ＳＫＢＲ−３細胞由
来の培養上清中では３.７２ ＯＤ単位／ｍｌの、また１
７−３−１−３溶解物中では１２９５ ＯＤ単位／ｍｌ
のｎｅｕ関連タンパク質が検出された。ＮＩＨ ３Ｔ３
細胞溶解物における活性はゼロであった。

【０１０４】プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）を免疫沈降緩衝液（ＩＰ緩衝液：１％ Ｔｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウ
ム，０.１％ドデシル硫酸ナトリウム，１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ，６５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７.２）で膨潤させ且つ
洗浄し、ＩＰ緩衝液中に１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で再
懸濁させた。

【０１０５】１０３μｌの１７−３−１−３溶解物
（１：３希釈物；約４５ ＯＤ単位のｎｅｕ活性）を１
μｇ、０.３μｇ、０.０１μｇまたは０.００３μｇの
精製ＰＢ３抗体と混合することにより試料を調製し、そ
れらを混合しながら４℃で一晩インキュベートした。２
７７μｌのＮＩＨ ３Ｔ３溶解物をＰＢ３と一緒に前記
同様にインキュベートすることにより、対照試料を調製
した。一晩インキュベートした後、１.０２８ｍｌの放
射性標識ＳＫＢＲ−３上清（約４ ＯＤ単位のｎｅｕ及
び４μＣｉの標識材料全量）を各試料に加えた。次いで
全ての試料をもう一度、静かに混合しながら４℃で一晩
インキュベートした。この２回目のインキュベーション
後、５０μｌのプロテインＡ−セファローススラリーを
各試料に加え、各々を混合しながら４℃で１時間インキ
ュベートした。マイクロ遠心機内で１分間遠心分離する
ことによりセファロースをペレット化し、セファロース
を１ｍｌのＩＰ緩衝液中に再懸濁し、簡単に撹拌し、マ
イクロ遠心機内で３０秒間遠心分離することにより４回
洗浄した。最後に試料をＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝溶液，ｐ
Ｈ７.５）中で洗浄した。試料を空気乾燥し、３０μｌ
のＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中に再懸濁させ、１００
℃で５分間インキュベートした。試料全体を７％ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、泳動させた。ゲ
ルを固定し、それをＥｎ^３Ｈａｎｃｅ（Ｄｕ Ｐｏｎ
ｔ）で濯ぎ、乾燥した。Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲフィルム
（Ｋｏｄａｋ）を乾燥ゲルに増感スクリーンの存在下に
−７０℃で６日間暴露することによりオートラジオグラ
ムを作製した。

【０１０６】結果は図１４に表わす。 レーン１: １μｇのＰＢ３＋１７−３−１−３溶解物＋
ＳＫＢＲ−３上清 レーン２: ０.３μｇのＰＢ３＋１７−３−１−３溶解
物＋ＳＫＢＲ−３上清 レーン３: ０.１μｇのＰＢ３＋１７−３−１−３溶解
物＋ＳＫＢＲ−３上清 レーン４: ０.０３μｇのＰＢ３＋１７−３−１−３溶
解物＋ＳＫＢＲ−３上清 レーン５: ０.０１μｇのＰＢ３＋１７−３−１−３溶
解物＋ＳＫＢＲ−３上清 レーン６: ０.００３μｇのＰＢ３＋１７−３−１−３
溶解物＋ＳＫＢＲ−３上清 レーン７: １μｇのＰＢ３＋ＳＫＢＲ−３上清 レーン８: ０.００３μｇのＰＢ３＋ＳＫＢＲ−３上清 レーン９: １μｇのＰＢ３＋ＮＩＨ ３Ｔ３溶解物＋Ｓ
ＫＢＲ−３上清 レーン１０: ０.３μｇのＰＢ３＋ＮＩＨ ３Ｔ３溶解物
＋ＳＫＢＲ−３上清 レーン１１: ０.１μｇのＰＢ３＋ＮＩＨ ３Ｔ３溶解物
＋ＳＫＢＲ−３上清 レーン１２: ０.０３μｇのＰＢ３＋ＮＩＨ ３Ｔ３溶解
物＋ＳＫＢＲ−３上清 レーン１３: ０.０１μｇのＰＢ３＋ＮＩＨ ３Ｔ３溶解
物＋ＳＫＢＲ−３上清 レーン１４: ０.００３μｇのＰＢ３＋ＮＩＨ ３Ｔ３溶
解物＋ＳＫＢＲ−３上清

【０１０７】ゲルの右半分は、競合物質としてＮＩＨ
３Ｔ３溶解物の存在下のＰＢ３抗体の力価測定を示す。
３Ｔ３溶解物中に存在する分子とｐ１００タンパク質と
の間に競合はないはずなので、抗体が力価測定されたと
きに１００,０００ダルトンにおけるバンドが消失した
ことは、抗体が制限試薬になっていることを示してい
る。

【０１０８】ゲルの左側半分は、１７−３−１−３溶解
物の存在下のＰＢ３抗体の力価測定を示す。１μｇのＰ
Ｂ３試料を除く全てのレーンにおいて、ｐ１００のバン
ドは不在であった。これは特に、ＮＩＨ ３Ｔ３溶解物
を競合物質として使用したときの比較試料中に尚明らか
なバンドが存在することから、０.３μｇ及び０.１μｇ
のＰＢ３を含むレーンにおいては重要である。１μｇの
ＰＢ３試料中にｐ１００が幾らか存在することは、抗体
が、放射性標識材料と、加えられた非標識ｐ１８５とに
結合し得るほど過剰であることを示している。

【０１０９】１７−３−１−３溶解物を加えたときのｐ
１００バンドの消失は、ｐ１００分子が実際にｐ１８５
に関連していることを示している。このサイズは、ヒト
ｎｅｕ遺伝子産物の細胞外ドメインの推定分子量と相関
した。

【０１１０】実施例４ 生物試料中のｐ１００の検出 この実施例は、細胞溶解物、腫瘍溶解物、ヒト血漿及び
血清中のヒトｎｅｕ関連タンパク質の検出を示す。

【０１１１】Ａ．捕獲イムノアッセイ：一般プロトコル ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ）を２０μｇ／ｍｌの
抗ｎｅｕモノクローナル抗体（Ｍａｂ）、抗ｎｅｕＭａ
ｂの組合せ、または種々の生物試料由来のヒトｎｅｕタ
ンパク質を捕獲するためのポリクローナル抗体で被覆し
た。Ｍａｂは０.１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９.６）で希釈
し、１００μｌをマイクロタイタープレートの各ウェル
に加えた。次いでプレートを４℃で一晩インキュベート
した。

【０１１２】インキュベーション後、被覆材料をプレー
トからデカントし、２５０μｌのブロック用緩衝液（２
％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０％ β−ラクト
ース及び０.０１％チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａ
ｌ）を含むＰＢＳ）を各ウェルに加えた。ブロック用緩
衝液をデカントし、抗ヒトｎｅｕ抗体で被覆されていな
いマイクロタイターウェルの部位をブロックするため
に、２５０μｌの新しいブロック用緩衝液を各ウェルに
加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。ブ
ロック用緩衝液をデカントし、プレートをペーパータオ
ルで吸い取って乾かした。プレートを室温のフード内で
一晩乾燥し、次いで、使用するまで覆いをして４℃に保
管した。

【０１１３】ヒトｎｅｕタンパク質について評価すべき
試料は、正常、腫瘍発現前もしくは腫瘍細胞から調製し
た溶解物、または、血清、血漿もしくは尿といったヒト
体液からなった。試料からヒトｎｅｕタンパク質を捕獲
するために、試料を抗体被覆ウェルに加えた。プレート
を室温で一晩インキュベートした。インキュベーション
後、プレートをＤｕ Ｐｏｎｔ Ｐｌａｔｅ Ｗａｓｈ Ｂ
ｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ，０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）及
びＤｙｎａｔｅｃｈ Ｐｌａｔｅ Ｗａｓｈｅｒを用いて
６回洗浄して未結合の生物試料を除去した。

【０１１４】ビオチンに結合させた別の抗ヒトｎｅｕＭ
ａｂを各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベート
した。次いでプレートをＤｕ Ｐｏｎｔ Ｐｌａｔｅ Ｗ
ａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで６回洗浄した。ビオチニル化抗
ｎｅｕ Ｍａｂを検出するために、ストレプトアビジン
−西洋ワサビペルオキシダーゼを１：２５００希釈液で
加え、室温で１５分間インキュベートした。次いでプレ
ートをＤｕ Ｐｏｎｔ Ｐｌａｔｅ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅ
ｒで６回洗浄した。反応を完了させるため、基質のオル
トフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を室温で１時間かけて
加えた。硫酸を用いて反応を停止させ、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを使用
して波長４９０ｎｍにおける光学密度を測定した。

【０１１５】Ｂ．捕獲アッセイを用いた細胞溶解液及び
腫瘍溶解液からのｐ１８５の検出 生物学的材料に対してこのアッセイが有効であるか否か
を判断するために、いくつかの捕獲イムノアッセイを実
施した。図８は、ＴＡ−１を第１抗体として用いビオチ
ニル化ＮＡ−３を第２抗体として用いた捕獲イムノアッ
セイの結果を示す。いくつかのヒト腫瘍細胞系から細胞
溶解液を調製した。これらの細胞系のいくつか（ＳＫ−
ＢＲ−３、ＺＲ−７５−１、ＭＣＦ−７）に関しては、
夫々のｎｅｕＲＮＡレベルが公表されている。このアッ
セイによって検出されたヒトｎｅｕの相対レベルは、公
表されているＲＮＡデータと一致する。既知レベルのヒ
トｎｅｕを含む細胞系を用いたこのアッセイ及び（図示
しない）別のアッセイの結果から、このアッセイを使用
して、細胞溶解液中のヒトｎｅｕの相対レベルを決定し
得ることが判明した。また、図８に示すように、ヒトｎ
ｅｕ関連タンパク質の発現の違いを利用して癌細胞系を
識別できることも判明した。

【０１１６】このアッセイが腫瘍溶解液中のヒトｎｅｕ
を検出できるか否かを判断するために、ヒトｎｅｕを発
現した腫瘍細胞（Ｘ−３−５）及びヒトｎｅｕを発現し
なかった腫瘍細胞（３Ｔ３ ｒａｓ）をヌードマウスで
増殖させた。ＮＩＨ ３Ｔ３由来の２つの細胞系は、Ｘ
−３−５がヒトｎｅｕ遺伝子を発現させたこと以外は同
質遺伝子系であった。図９は、ＮＢ−３を捕獲抗体とし
て用いビオチニル化ＴＡ−１を検出抗体として用いた捕
獲イムノアッセイの結果を示す。ヒトｎｅｕ関連遺伝子
産物は、Ｘ−３−５腫瘍細胞の溶解液中で検出された
が、３Ｔ３−ｒａｓ腫瘍細胞の溶解液中で検出されなか
った。これは、アッセイが腫瘍溶解液中のヒトｎｅｕを
特異的に検出し得ることを示す。

【０１１７】何人かの研究者は、多くのヒト乳腺腫瘍が
ヒトｎｅｕを高レベルで発現することを示した。ヒトｎ
ｅｕがヒト乳腺腫瘍中で検出されるか否かを判断するた
めに、１人の人間に由来の２つのサンプルを調製した。
１人の患者から採取したヒト乳腺腫瘍（２７４７−０１
−０５０）及び正常乳組織（２７４７−０１−０５０）
の溶解液を調製した。このアッセイでは、ＴＡ−１を第
１抗体として用いビオチニル化ＢＤ−５を検出抗体とし
て用いた。図１０は腫瘍中でヒトｎｅｕが検出されたこ
とを示す。

【０１１８】これらのアッセイは、ｎｅｕ捕獲イムノア
ッセイによって、細胞溶解液または腫瘍溶解液からヒト
ｎｅｕ関連遺伝子産物が特異的に検出され得ることを示
した。これらのデータはまた、該アッセイによって、サ
ンプル間の相対的なｎｅｕレベルを決定し得ることを示
す。

【０１１９】１人の患者から採取したヒト乳腺腫瘍及び
正常乳組織（２７４７−０１−０５０）の溶解液をイム
ノブロット法で評価した。イムノブロットの結果は、乳
癌溶解液から検出されたｎｅｕ関連タンパク質がｐ１８
５であることを示した。

【０１２０】Ｃ．血漿及び血清中のｐ１００の検出 これらの実施例は、新生物型腫瘍を有するマウス及びヒ
トの血清及び血漿中のヒトｎｅｕの検出を示す。

【０１２１】ヒトｎｅｕがヒト血清または血漿中で特異
的に検出できるか否かを判断するために、いくつかの対
照実験を行なった。これらの実験では、高レベルのヒト
ｎｅｕを発現する細胞系の培養上清中及び腫瘍を有する
ヌードマウスの血清中のヒトｎｅｕを検出した。

【０１２２】図１１は、ＮＢ−３を捕獲抗体として用
い、ビオチニル化ＴＡ−１を検出抗体として用いた細胞
系の培養上清中のヒトｎｅｕ捕獲イムノアッセイの結果
を示す。これらの結果は、ヒトｎｅｕ関連遺伝子産物
は、高レベルのヒトｎｅｕを発現するマウス細胞系（１
８−３−７）またはヒト細胞系（ＳＫ−ＢＲ−３）の上
清中で検出されるが、ヒトｎｅｕを発現しない細胞系
（３Ｔ３−ｒａｓ）の上清中または培地単独中では検出
されないことを示す。これらの細胞系のうちの２つ（１
８−３−７及び３Ｔ３−ｒａｓ）はヌードマウスで腫瘍
として増殖し得る。これらの細胞系をヌードマウスに皮
下注射して生じさせた腫瘍を有するマウスを瀉血させ、
ＴＡ−１を捕獲抗体として用いビオチニル化ＢＤ−５を
検出抗体として用いた捕獲イムノアッセイによってその
血清中のヒトｎｅｕの存在を分析した。このアッセイの
結果を図１２に示す。このアッセイでも、細胞または腫
瘍の溶解液並びに細胞の培養上清と同様に、ヒトｎｅｕ
を発現した腫瘍を有するヌードマウスの血清だけが反応
した。正常ヌードマウス血清及びヒトｎｅｕを発現しな
い腫瘍を有するヌードマウスの血清は反応しなかった。

【０１２３】これらの実験は、ヒトｎｅｕ関連タンパク
質が、ヒトｎｅｕを発現する腫瘍を有するヌードマウス
の血清及びヌードマウス腫瘍を生じさせる細胞系中で検
出され得ることを示した。ヒトｎｅｕは、ｎｅｕを発現
するヒト細胞系（ＳＫ−ＢＲ−３）の上清中で検出され
た。

【０１２４】高レベルのヒトｎｅｕを発現する腫瘍を有
する患者がヒトｎｅｕ関連タンパク質を含む血清を有す
るであろうという仮説を試験するためのアッセイを設計
し該アッセイを実施した。一連のアッセイでは、抗ｎｅ
ｕ Ｍａｂ ＴＡ−１を捕獲試薬として用い、ビオチニ
ル化ＢＤ−５を検出試薬として用いた。分析用サンプル
として、正常ヒト血漿、及び２人の乳癌患者の血漿を使
用した。結果は、正常血漿及びＡＪＡＣ患者の血漿はこ
の特定アッセイに対して実質的に非反応性であったが、
ＰＳＵＬ患者の血漿はこのアッセイに対して有意な反応
性を示した。これは、ＰＳＵＬ乳癌患者の血漿中にヒト
ｎｅｕ関連タンパク質が存在することを示唆する（図１
３）。

【０１２５】捕獲試薬として（固体支持体に定着させ
た）Ｍａｂ ＮＢ−３を用い、検出試薬としてビオチニ
ル化ＭＡＢ ＴＡ−１を用いて多数の患者にこの実験を
繰り返した。約２２５の異なる血漿サンプルのｎｅｕ特
異的モノクローナル抗体に対する反応性をこのアッセイ
で評価した。サンプルは、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃ
ａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＤｒ．Ｄａｎｉｅｌ
Ｈａｙｅｓ及びＤｒ．Ｄｏｎ Ｋｕｆｅから提供され
た。正常被験者の血漿サンプルと、良性乳腺症患者の血
漿サンプルと、乳癌患者の血漿サンプルと、胃癌患者の
血漿サンプルと、卵巣癌患者血漿サンプルとから試験試
料を構成した。この特定試験におけるヒトｎｅｕの平均
値は、正常血漿サンプル即ち正常被験者及び正常（良
性）乳腺症患者のサンプルでは約６００であった。表２
は各サンプル毎に得られた個々のデータを示す。表３
は、ｎｅｕ特異的モノクローナル抗体に対する反応性を
評価した卵巣癌患者の約６６の血漿サンプルに関する追
加データを示す。表中のヒトｎｅｕ値をｆｍｏｌ／ｍｌ
に代えてもよい。

【０１２６】

【表２】

【０１２７】

【表３】

【０１２８】Ｄ．血漿のイムノブロット標価 上記のＥＬＩＳＡ法によって標価したサンプルのいくつ
かを、ＯＤ−３と命名された抗ヒトｎｅｕ関連モノクロ
ーナル抗体を用いたイムノブロット法によって以下のご
とく標価した。図１５〜１７に示すイムノブロットの結
果を、ヒトｎｅｕＥＬＩＳＡによって測定した対応する
ヒトｎｅｕ値と共に表４に示す。

【０１２９】イムノブロット法では以下の手順で処理し
た。

【０１３０】約１０μｌの血漿サンプルを、ウサギ抗マ
ウスプロテインＡアガロースと共に、回転盤（ｒｏｔａ
ｔｉｎｇ ｗｈｅｅｌ）または揺動器（ｒｏｃｋｅｒ）
に４℃で３０分間維持して予め清澄化した。サンプルを
エッペンドルフ遠心管で遠心した。上清を傾瀉して保存
した。約５０μｌのドデシル硫酸ナトリウム還元バッフ
ァ（サンプルローディングバッファ、ＳＬＢ）をメチル
グリーンと共に各サンプルに添加した。５０μｌのＳＬ
Ｂを高分子量標準に添加した。次いで、サンプルを高温
油浴中で１００℃で５分間加熱した。

【０１３１】３.０％のスタッキングゲルを使用し、１.
５ｍｍまたは３.０ｍｍ厚の５％ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルでサンプルを電気泳動させた。ＢｉｏＲａｄ
Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ装置を用いて、分離したタンパ
ク質をニトロセルロースに移した。次に、Ｂｌｏｔｔｏ
（ＰＢＳ中の３％ドライミルク、２％正常ヤギ血清、
０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中でニトロセルロースフィ
ルターを１時間ブロックし、約１０μｇ／ｍｌのＯＤ
３、または、５０ｍｌのＢｌｏｔｔｏによって１０μｇ
／ｍｌに希釈した同クラスの対照と共に室温で３時間イ
ンキュベートした。高塩分洗浄バッファ（２０ｍＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、０.０５％のＴｗｅｅ
ｎ−２０、ｐＨ７.５）中でフィルターを３回洗浄し、
次いでアルカリホスファターゼ標識したヤギ抗マウスＩ
ｇＭ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂ
ｓ）と共に室温で１時間以上インキュベートした。これ
らを、高塩分洗浄バッファで３回洗浄し、ＢＣＩＰ Ｎ
ＢＴ基質キット（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒ
ｙ Ｌａｂｓ）を用いてバンドを可視化した。

【０１３２】図１５（Ｎ１０）は、ＯＤ３が、授乳中の
女性、良性乳腺症患者及び乳癌患者から得られたヒト血
漿中で、概算分子量約１００,０００ダルトンを有する
ヒトｎｅｕ関連タンパク質をレーン２、４、６及び８に
検出したことを示す。レーン３、５、７及び９ではかか
るタンパク質（ｐ１００）が全く検出されなかった。レ
ーン１は、分子量マーカーを含んでいた。レーン２及び
３は、授乳中の女性の血漿を含んでいた。レーン４及び
５は対照を含んでいた。レーン６及び７は乳癌患者＃１
０９の血漿を含んでいた。（患者＃１０９から採取した
血漿は、ＥＬＩＳＡで測定したヒトｎｅｕ値１,８７７.
８を示した）。レーン８及び９は乳癌患者＃２８３の血
漿を含んでいた。（患者＃２８３から採取した血漿はＥ
ＬＩＳＡで測定したヒトｎｅｕ値１,５１５.５を示し
た）。レーン２、４、６及び８に、モノクローナル抗体
ＯＤ３をブロットした。レーン３、５、７及び９に同ク
ラスの陰性の対照モノクローナル抗体ＴＥＰＣ １８３
（Ｌｉｔｔｏｎ Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓから購入したミエ
ローマＩｇＭ）をブロットした。

【０１３３】図１６（Ｎ１２）は、ＯＤ３が、良性乳腺
症患者及び乳癌患者から得られたヒト血漿中で概算分子
量約１００,０００ダルトンを有するｎｅｕ関連タンパ
ク質をレーン１、５及び７に検出したことを示す。レー
ン２、３、４、６及び８ではかかるバンドが全く検出さ
れなかった。レーン１及び２は、良性乳腺症患者の血漿
を含んでいた。レーン３及び４は、胃癌患者の血漿を含
んでいた。レーン５及び６は、乳癌患者＃２６６１の血
漿を含んでいた。（患者＃２６６１から採取した血漿は
ＥＬＩＳＡで測定したヒトｎｅｕ値２１,６６８.５を示
した）。レーン７及び８は、乳癌患者＃２９０４の血漿
を含んでいた。（患者＃２９０４から採取した血漿はＥ
ＬＩＳＡで測定したヒトｎｅｕ値３１,００８.０を示し
た）。レーン１０は分子量マーカーを含んでいた。レー
ン１、３、５及び７にモノクローナル抗体ＯＤ３をブロ
ットした。レーン２、４、６及び８に陰性の対照抗体Ｔ
ＥＰＣ １８３をブロットした。

【０１３４】図１７（Ｎ１３）は、ＯＤ３が、良性乳腺
症患者及び乳癌患者から得られたヒト血漿中で概算分子
量約１００,０００ダルトンを有するヒトｎｅｕ関連タ
ンパク質をレーン４、６及び８に検出したことを示す。
レーン２、３、５、７及び９ではかかるバンドが全く検
出されなかった。レーン１は分子量マーカーを含んでい
た。レーン２及び３は、胃癌患者の血漿を含んでいた。
レーン４及び５は、良性乳腺症患者の血漿を含んでい
た。レーン６及び７は、乳癌患者＃１４０の血漿を含ん
でいた。（患者＃１４０から採取した血漿は、ＥＬＩＳ
Ａで測定したヒトｎｅｕ値８１,９１５.０を示した）。
レーン８及び９は、乳癌患者＃３０５の血漿を含んでい
た。（患者＃３０５から採取した血漿はＥＬＩＳＡで測
定したヒトｎｅｕ値１７５,５７３.３を示した）。レー
ン２、４、６及び８に、抗ヒトｎｅｕモノクローナル抗
体ＯＤ３をブロットした。レーン３、５、７及び９に、
陰性の対照モノクローナル抗体ＴＥＰＣ １８３をブロ
ットした。

【０１３５】図１８（ＮＢ８）は、ＯＤ３が、卵巣癌患
者から得られたヒト血漿中で、概算分子量約１００,０
００ダルトンを有するヒトｎｅｕ関連タンパク質を、レ
ーン２、３、６及び７に検出したことを示す。レーン
４、５、８、９及び１０にはかかるバンドが全く検出さ
れなかった。レーン２、４、６及び８は、卵巣癌患者＃
４５の血漿を含んでいた。（患者＃４５から採取した血
漿はＥＬＩＳＡで測定したヒトｎｅｕ値＞１０,０００
を示した）。レーン３、５、７及び９は、卵巣癌患者＃
３５の血漿を含んでいた。（患者＃３５から採取した血
漿はＥＬＩＳＡで測定したヒトｎｅｕ値１,７０３を示
した）。レーン１０は血漿サンプルを含んでいなかっ
た。レーン１０は、ヒトｎｅｕ ｐ１８５を含むことが
分かっている細胞系１７−７−８由来の電気泳動した腫
瘍抽出物から成る対照を含んでいたと言ったほうがよ
い。レーン２及び３に、抗ヒトｎｅｕモノクローナル抗
体ＯＤ３を１時間ブロットした。レーン４及び５に、陰
性の対照モノクローナル抗体ＴＥＰＣ １８３を１時間
ブロットした。レーン６及び７に、抗ヒトｎｅｕモノク
ローナル抗体ＯＤ３を３時間ブロットした。レーン８及
び９に、陰性の対照抗体ＴＥＰＣ １８３を３時間ブロ
ットした。レーン１０には、腫瘍抽出物中でヒトｎｅｕ
関連遺伝子産物ｐ１８５を検出したＯＤ３をブロットし
た。

【０１３６】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】指示したヒトｎｅｕ遺伝子ｃＤＮＡをｐＬＪΔ
発現ベクターに挿入することにより作製されるプラスミ
ドベクターｐＬＪΔｎｅｕの概略説明図である。

【図２】図２Ａ，２Ｂ，２Ｃ及び２Ｄは、本発明のモノ
クローナル抗体がヒトｎｅｕ関連タンパク質を認識する
ことを示す免疫沈降結果を示す。

【図３】モノクローナル抗体ＯＤ３及びＰＢ３のイムノ
ブロットの結果を示す。

【図４】図４Ａ，４Ｂ，４Ｃ及び４Ｄは、免疫蛍光結果
を示す。

【図５Ａ】流動細胞計測の結果を示す。

【図５Ｂ】流動細胞計測の結果を示す。

【図５Ｃ】流動細胞計測の結果を示す。

【図５Ｄ】流動細胞計測の結果を示す。

【図６】ビオチニル化ＴＡ−１の結合に競合させるため
にＴＡ−１及びＮＢ−３を使用した場合の結合曲線を示
す。

【図７】ビオチニル化ＮＢ−３の結合に競合させるため
にＴＡ−１及びＮＢ−３を使用した場合の結合曲線を示
す。

【図８】捕獲ＥＬＩＳＡシステムを使用して種々のヒト
乳癌細胞系からの溶解物をｎｅｕ関連タンパク質の存在
に関して試験した捕獲イムノアッセイの結果を示す。

【図９】ｎｅｕを発現するヌードマウス腫瘍の細胞溶解
物（Ｘ−３−５）と、ｎｅｕ陰性腫瘍の腫瘍溶解物（３
Ｔ３／ｒａｓ）との比較の結果（腫瘍溶解物μｇと光学
密度の関係）を示す。

【図１０】ヒト乳房組織の正常試験片（２７４７−０１
−０５０）又は乳癌（２７４７−０１−０５０）から調
製し、捕獲フォーマットを使用してｎｅｕ関連タンパク
質の存在を試験した細胞溶解物の捕獲イムノアッセイの
結果を示す。

【図１１】１８−３−７細胞（ヒトｎｅｕ遺伝子で形質
転換され且つ細胞表面にｐ１８５タンパク質を発現する
ＮＩＨ ３Ｔ３細胞）、３Ｔ３ｒａｓ細胞（ｒａｓ遺伝
子で形質転換され且つ細胞表面にヒトｐ１８５タンパク
質を発現しないＮＩＨ ３Ｔ３細胞）、及びＳＫ−ＢＲ
−３ヒト乳癌細胞からの上清流体、並びに１０％ウシ胎
児血清を補充した培養培地ＤＭＥＭの捕獲イムノアッセ
イの結果を示す。

【図１２】乳癌細胞系ＨＳ０５７８ｔから得た活性化ｒ
ａｓ遺伝子に由来するｒａｓ形質転換ＮＩＨ ３Ｔ３細
胞系であるＴ１４４に由来する腫瘍を有するマウスから
採取した血清、ｐ１８５タンパク質を発現する腫瘍を有
するマウス（１８−３−７マウス）から採取した血清、
及びｐ１８５タンパク質を発現しない腫瘍を有するマウ
ス（３Ｔ３（ｒａｓ））から採取した血清を使用した捕
獲イムノアッセイの結果を示す。

【図１３】抗ヒトｎｅｕモノクローナル抗体ＴＡ−１を
捕獲試薬として使用し、ビオチニル化ＢＤ−５を検出シ
ステムの一部として使用した捕獲イムノアッセイの結果
を示す。

【図１４】ｐ１００とｐ１８５の関係を示す免疫沈降結
果を示す。

【図１５】乳癌、胃癌及び卵巣癌患者から採取したヒト
血漿サンプルにおけるｐ１００の検出を示すイムノブロ
ットの結果を示す。

【図１６】乳癌、胃癌及び卵巣癌患者から採取したヒト
血漿サンプルにおけるｐ１００の検出を示すイムノブロ
ットの結果を示す。

【図１７】乳癌、胃癌及び卵巣癌患者から採取したヒト
血漿サンプルにおけるｐ１００の検出を示すイムノブロ
ットの結果を示す。

【図１８】乳癌、胃癌及び卵巣癌患者から採取したヒト
血漿サンプルにおけるｐ１００の検出を示すイムノブロ
ットの結果を示す。

フロントページの続き (72)発明者 ポーラ・ジーン・マークス アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01754、メイナード、コンコード・ストリ ート・107 (72)発明者 ゲイル・パトリシア・マザラ アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01890、ウインチエスター、マンチエスタ ー・ロード・10 (72)発明者 サラ・ジーン・マツケンジー アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01902、リン、オーシヤン・ストリート・ 201 (72)発明者 ジヨナサン・ハート・モーガン アメリカ合衆国、メーン・04843、カムデ ン、ユニオン・ストリート・33 (72)発明者 デブラ・アン・ペテイツト アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02379、ウエスト・ブリツジウオーター、 クレセント・ストリート・179 (72)発明者 ロバート・アラン・ウエインバーグ アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02146、ブルツクライン、コツプリー・ス トリート・25

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトの前腫瘍性細胞又は腫瘍細胞を検出
   する方法であって、（ａ）被験者に由来する生物学的流
   体をp100と結合できる少なくとも１つのモノクローナル
   抗体と接触させ、且つ（ｂ）抗体結合が生起したか否か
   を調べることによって、前記生物学的流体中のp100の存
   在を検査することからなる方法。
2. 【請求項２】 癌が卵巣癌、乳癌、胃癌、膵癌、結腸癌
   又は肺癌である請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 生物学的流体を、血液、血清、血漿、
   尿、脳脊髄液、正常細胞溶解物の上清、前腫瘍性細胞溶
   解物の上清、腫瘍細胞溶解物の上清及び胸部吸引物から
   選択する請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 ヒト由来の生物学的流体中のp100の存在
   を検出又は定量するアッセイ法であって、（ａ）p100に
   結合できる少なくとも１つの第１のモノクローナル抗体
   を前記流体と接触させ、（ｂ）ステップ（ａ）の産物
   を、第１の抗体が結合したエピトープとは異なるエピト
   ープでp100に結合できる少なくとも１つの検出可能な標
   識を付した第２のモノクローナル抗体と反応させ、且つ
   （ｃ）ステップ（ｂ）の産物を検出又は定量する操作を
   含むアッセイ法。
5. 【請求項５】 免疫反応性フラグメントを使用する請求
   項４に記載のアッセイ法。
6. 【請求項６】 検出可能な標識を、放射性アイソトー
   プ、酵素、蛍光発生物質、化学ルミネセント物質及び電
   気化学物質から選択する請求項４に記載のアッセイ法。
7. 【請求項７】 第２の抗体をビオチンに結合する請求項
   ４に記載のアッセイ法。
8. 【請求項８】 ビオチニル化複合体をまずストレプタビ
   ジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼと反応さ
   せ、次いでオルトフェニレンジアミンと反応させること
   によってビオチン結合抗体を検出する請求項７に記載の
   アッセイ法。
9. 【請求項９】 第１の抗体を、ATCC受託番号HB 10205及
   びHB 10206のハイブリドーマ細胞系によって産生される
   抗体から選択する請求項４に記載のアッセイ法。
10. 【請求項１０】 第２の抗体を、ATCC受託番号HB 10205
    及びHB 10206のハイブリドーマ細胞系によって産生され
    る抗体から選択する請求項４に記載のアッセイ法。