JP2000175692A - ｎｅｕ遺伝子産物の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 腫瘍細胞中のｎｅｕプロトオンコジーンまた
はオンコジーンの増幅および過剰発現の検出方法を提供
する。 【解決手段】 哺乳類起源のｎｅｕプロトオンコジーン
またはオンコジーン中に存在するヌクレオチド配列と特
異的に反応する核酸プローブを用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【従来の技術】ヒト発癌の誘導に於て、体細胞の変異が
重要な原因となつていることを示唆する証拠が増加しつ
つある。これらの体細胞の変異は、それまで正常であつ
た細胞のゲノムに蓄積し、そのうちいくつかは悪性の増
殖につながる表現型を示す。このような癌遺伝子の変異
は、欠失、転座、増幅及び点ヌクレオチド変化など多く
の異なるタイプのＤＮＡ構造変化を含み得る。点ヌクレ
オチド変化は点突然変異とも言われ、そのような変異を
引きおこす変異原性の化学物質による発癌に、しばしば
関与している。さらに、このような変異はＤＮＡ複製に
於けるミスによつて、自発的にも生じ得る。

【０００２】点突然変異はヒト腫瘍の１０−１５％の原
因に直接関与していることが示されている。これらの腫
瘍は、正常な細胞のプロトオンコジーンがその遺伝子内
のいくつかの場所に生じた点突然変異によつて変化し
た、ｒａｓ遺伝子フアミリーの癌遺伝子を持つ。これら
の突然変異は腫瘍細胞ゲノムの質的変化として示され、
これによつて腫瘍細胞は正常細胞と区別され、又、腫瘍
の遺伝的起源を診断する基礎となる。活性型癌遺伝子を
生じさせた変異を同定することは、腫瘍発生の診断上及
び予後の手がかりとなる。例えば、ｒａｓ癌遺伝子の１
２番目のコドンには多くの変異が見つかつているが、こ
れは通常あるべきグリシンが他の様々なアミノ酸残基に
置換したことによる。これらのアミノ酸置換はそれぞれ
等価ではない。ある置換（例えばバリン）は強いトラン
スフオーム活性をもつ一方、他の置換（例えばプロリ
ン）は細胞の表現型にごく限られた影響を及ぼすのみで
ある。このように、特定のヌクレオチド置換が腫瘍細胞
のふるまいを強く決定付ける（例えば、増殖速度、侵襲
性など）。以上のことから、変異癌遺伝子のＤＮＡプロ
ーブは臨床腫瘍学に於ける診断用試薬として裏付けがあ
る。

【０００３】このようなプローブは有用ではあるが、注
目している遺伝子中の、点突然変異が生じ易い領域のみ
が同定されている。もしこのような領域が同定されなか
つた場合、限られた大きさ（例えば１０−２０ヌクレオ
チド長）のヌクレオチドプローブを用いて、優に３０，
０００塩基対又はそれ以上の長さをもつ遺伝子全体を検
索するのは実際的ではない。例えば、もし全長３３，０
００塩基対の遺伝子を１５ヌクレオチドのプローブで検
索した場合、３０００−５０００の別個のプローブが必
要である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】このように、変異癌遺
伝子のＤＮＡプローブは診断上の手段としての素質を持
つてはいるが、癌遺伝子機能活性化の原因に関係した別
個の変異領域が同定されている場合を除いては、有効に
用いることはできない。変異による活性化の領域が決定
されていなければ、点突然変異に対するＤＮＡプローブ
の利用は非実用的である。

【０００５】プロトオンコジーンの増幅及び（又は）過
剰発現もヒト腫瘍の原因として示唆されている。プロト
オンコジーンＣ−ｍｙｃ及びＮ−ｍｙｃはそれぞれ肺及
び神経芽細胞での小細胞腫で増幅されている。Ｎ−ｍｙ
ｃプロトオンコジーンは多くの第ＩＩ、第ＩＩＩ、及び
第ＩＶ段階の腫瘍に於て３−３００倍に増幅しているこ
とが見い出された。Ｎ−ｍｙｃプロトオンコジーンの増
幅は、その増幅の度合いとは必ずしも比例しない、遺伝
子産物の発現増加を常に伴う。より重要なことに、一次
的な、未処理の神経芽細胞中のＮ−ｍｙｃ遺伝子のコピ
ー数は、段階にかかわらず、予後の要素として臨床上重
要である。（シーガーら（Ｓｅｅｇｅｒｅｔ ａ
ｌ．）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，１９８５；３１
３：１１１１−６）ゲノム内での増幅と腫瘍の進行の早
さの間には顕著な相関がある。このように、核酸ハイブ
リダイゼーシヨン技術を用いたプロトオンコジーンの増
幅又はそのｍＲＮＡ発現の検出、或いは免疫学的手法を
用いた癌遺伝子産物蛋白質の過剰発現の検出は予後のた
めの重要な価値をもつことは明白である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】この発明は細胞ＤＮＡの
評価に関連し、ｎｅｕ遺伝子の過剰発現又はプロトオン
コジーンの活性化及び癌遺伝子への変化をもたらす遺伝
子の損傷或いは増幅を含む変化が生じているかを決定す
るものである。活性化変異を含む領域のヌクレオチド配
列に特異的な核酸プローブが記述され、その利用法とし
て、ｎｅｕフアミリー癌遺伝子の存在を決定するのに用
いられることが示される。さらに、ｎｅｕプロトオンコ
ジーンｍＲＮＡ及び遺伝子産物の発現レベルの決定に用
いることができる。ｎｅｕプロトオンコジーン又はｎｅ
ｕ遺伝子産物をそれぞれ認識する核酸プローブ及びモノ
クローナル抗体と、それらの使用法が記述される。

【０００７】

【発明の実施の形態】 点ヌクレオチド変化又は点突然
変異によつて癌遺伝子に変化した、増殖因子受容体類似
の蛋白質をコードするラツトｎｅｕプロトオンコジーン
が決定された。この点突然変異は当初、胎盤を通じて発
癌性物質（例えばエチルニトロソウレア）を作用させた
ラツトの神経芽細胞に見られ、そのＤＮＡがコードする
ｐ１８５の膜貫通領域のアミノ酸配列に影響しているこ
とが見い出された。それは、正常蛋白質のバリンがグル
タミン酸残基に置換されていた。

【０００８】同様な点突然変異を検査するために用いた
核酸プローブから、それぞれ別個に発生し、独立に腫瘍
を生じさせた、さらに７つのｎｅｕ癌遺伝子の存在が推
測されたが、７つすべてのｎｅｕ癌遺伝子に同じ活性化
変異が存在することが証明された。これらの細胞では、
同じアミノ酸置換（バリンからグルタミン酸への置換）
が生じていた。さらに、ｎｅｕ遺伝子と相同な核酸を用
いて分析を行つたところ、変異原のメチルニトロソウレ
アは神経系の腫瘍形成を誘導し、エチルニトロソウレア
により誘導された腫瘍と同じ位置でｎｅｕ遺伝子の活性
化を起こしていることが証明された。

【０００９】ヒトｎｅｕ遺伝子ホモログ（ｃ−ｅｒｂＢ
２又はＨＥＲ２としても知られる）は同様な機構を通じ
て癌遺伝子化状態になると思われる。即ち、正常な細胞
のＤＮＡ塩基配列（プロトオンコジーン）の点ヌクレオ
チドの変化が癌遺伝子の活性化をもたらす。ラツトとヒ
トのｎｅｕ遺伝子の塩基配列には違いがあるため、同じ
変異（バリンからグルタミン酸へ）は１塩基の変化では
生じない。このバリンからグルタミン酸への置換は２塩
基の変化を必要とし、確率的には非常に起こりにくい。
ヒトｎｅｕ遺伝子のこの位置で一塩基の変化によりグル
タミン酸以外のアミノ酸へ置換を起こした時の影響は、
知られてはいないが、あると期待される。一方、ｎｅｕ
プロトオンコジーンの癌遺伝子としての活性は、遺伝子
の増幅又は他の要因によるｎｅｕプロトオンコジーンの
過剰発現によつて活性化されるであろう。

【００１０】自然に生ずるヒト腫瘍の多様なＤＮＡに於
て活性化を引き起こす変化は、ヒトｎｅｕ遺伝子領域に
特異的に反応し、かつラツトｎｅｕ癌遺伝子に於て活性
化を起こす変異を含む領域に対応するよう構築された核
酸プローブを使うことによつて同定され得る。ヒト腫瘍
細胞に於てプロトオンコジーンからｎｅｕ癌遺伝子への
変化の原因となる活性化点突然変異を同定することは、
ヒト腫瘍ＤＮＡにｎｅｕ癌遺伝子活性化の原因となる点
突然変異が存在するか否かを検査するのに有効な核酸ハ
イブリダイゼーシヨンプローブを作成する基礎となり得
る。これらのハイブリダイゼーシヨンプローブは細胞内
でｎｅｕプロトオンコジーンやｎｅｕ癌遺伝子が生じて
いるのを検出したり、ヒト腫瘍試料での癌遺伝子活性化
の概要を決定するのに用いることができる。このような
核酸プローブが通常のヌクレオチドプローブ同様に記述
され、それを用いて腫瘍細胞中にｎｅｕ癌遺伝子が存在
するか否かを検出する方法が示される。さらに、ｎｅｕ
プロトオンコジーン又は癌遺伝子の増幅及び（或いは）
過剰発現を検出するための核酸プローブも記述されてい
る。ｎｅｕ癌遺伝子又はプロトオンコジーンの出現を検
出するのに利用できる、ｎｅｕ癌遺伝子にコードされる
ｐ１８５蛋白質に特異的な抗体も記述されている。ヒト
血清、血しよう又は尿、或いは正常な前腫瘍形成細胞又
は腫瘍形成細胞のような生理溶液中でヒトｎｅｕ抗原を
検出するための特別な“補捉”イミユノアツセイ法が記
述されている。

【００１１】ｎｅｕ癌遺伝子は最初、胎盤を通して発癌
物質エチルニトロソウレアを作用させて誘導したラツト
神経芽細胞腫から単離された。活性化はプロトオンコジ
ーンのバリンからグルタミン酸残基に置換させる１つの
点突然変異である。ｎｅｕ癌遺伝子のヒトホモログもク
ローニングされ、その癌遺伝子としての能力は、２つの
隣接した点突然変異が必要ではあるが、活性化したラツ
トの遺伝子で見い出されたのと同じ変異を生ずることに
よつて活性化される。さらに、ヒトの遺伝子は変異によ
る変化が全く無い場合でも、過剰発現により癌原性を示
す。このことは、変異を生じていないラツトのｎｅｕ遺
伝子がいかなるレベルで発現してもトランスフオーミン
グ活性を示さないのとは著しく異なる。ヒトｎｅｕ遺伝
子活性化の第３の機構は、トランケーシヨンによるもの
である。ヒトｎｅｕプロトオンコジーンのアミノ末端が
欠失した場合、トランスフオーミング活性を示す。

【００１２】ヒトの腫瘍形成に於けるプロトオンコジー
ンの関与は十分に証明されている。プロトオンコジーン
が悪性過程に寄与する機構は多様である。これらの機構
には、プロトオンコジーン本来の塩基配列の変化や発現
の制御も含まれる。発現制御の変化は以前から存在して
いた遺伝子の発現増加や、遺伝子コピー数の増加（遺伝
子増幅）によつて起こり得る。関与している癌遺伝子及
びその活性化の様式を決定することは、診断、予後及び
療法上重要な意味をもつ。最近、ヒト胸部癌に於てｎｅ
ｕプロトオンコジーンが増幅していることが示された。
３０％の胸部腫瘍で２倍から２０倍以上のｎｅｕが増幅
されていた。増幅したｎｅｕの存在は全体的な生存期間
と病状のぶり返しの時間を予知する重要な指標となる
（スレイモンら（Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ１９８７；２３５：１７７−１８２）。

【００１３】突然変異による活性化 今日ではｒａｓ遺伝子を除く細胞性遺伝子が点突然変異
によつて癌遺伝子に変わり得ることが知られている。最
近、増殖因子受容体類似の蛋白質をコードするラツトの
ｎｅｕプロトオンコジーンも１個のヌクレオチド変化に
より癌遺伝子に変化し得ることが示された。このよう
に、ｎｅｕプロトオンコジーン（すなわち、正常な非腫
瘍細胞の正常なゲノムに存在するヌクレオチド配列）
は、１個のヌクレオチド置換から、変異による活性化を
経て、対応する癌遺伝子（すなわち、細胞内での発現に
よつて正常細胞から腫瘍細胞へと変化させるようなヌク
レオチド配列）となることが示された。この点突然変異
は当初、胎盤を通じてエチルニトロソウレアを作用させ
ることにより誘導されたラツト神経芽細胞腫で証明され
たものであるが、個別にエチルニトロソウレアを作用さ
せることにより独立して誘導された７個の別のｎｅｕオ
ンコジーンでも生じていることが示された。点突然変異
の検出は、活性化変異を含むことが初めに示された領域
に特異的な核酸プローブの利用によつた。すべてのケー
スで、同じアミノ酸置換が起こつており、コードされる
ｐ１８５蛋白質の膜貫通部に通常存在するバリンがグル
タミン酸残基に置換されていた。この発見は、ｎｅｕプ
ロトオンコジーンの限られた数のサイトでのヌクレオチ
ド置換の結果、活性型癌遺伝子を生ずることを示唆して
いる。

【００１４】メチルニトロソウレアにより誘導された、
１０個の神経系腫瘍から調製したＤＮＡより生じたトラ
ンスフエクタントは活性型ｎｅｕ遺伝子を含み、トラン
スフオーミング活性をもつ遺伝子に対応するオリゴヌク
レオチドプローブに対するハイブリダイゼーシヨンの差
から判断するとそれらはＤＮＡ中に同じ変化を持ち、エ
チルニトロソウレアによつて誘導された腫瘍に存在する
のと同じ塩基配列の変化を持つと考えられた。このよう
に、ｎｅｕ遺伝子と相似な核酸プローブはメチルニトロ
ソウレアを作用させることによつて誘導された腫瘍中の
活性型ｎｅｕ遺伝子の検出にも使用できることが示され
た。さらにこのことはどちらの変異原も同じ位置でｎｅ
ｕ遺伝子を活性化し、活性化ｎｅｕ遺伝子はＢＤＩＸラ
ツト（エチルニトロソウレアで誘導した腫瘍）及びＢｕ
ｆｆａｌｏ ラツト（メチルニトロソウレアで誘導した
腫瘍）の両方に生ずることが証明された。

【００１５】ラツトｎｅｕ遺伝子に対応するヒト遺伝子
が単離され、ｃ−ｅｒｂＢ２又はＨＥＲ２と呼ばれてい
る。ヤマモト，Ｔ．ら（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ
ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ，３１９：２３０−２３４（１
９８６）；コーセンス，Ｌ．ら（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，
Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１１３２
−１１３９（１９８５）ラツト及びヒトのクローンのＤ
ＮＡ塩基配列から、いずれもｎｅｕ遺伝子産物の１２６
０アミノ酸の蛋白質が予想される。ここではヒトｎｅｕ
癌遺伝子と呼ぶが、ラツトｎｅｕ遺伝子のヒトホモログ
の変異による活性化は同様な機構、即ちヒトｎｅｕ遺伝
子内での１つのヌクレオチド置換又は点突然変異によつ
て生ずるらしい。１つのヌクレオチド置換は、ラツトｎ
ｅｕ癌遺伝子に於て活性化変異を含むことが示された領
域に対応するヒトｎｅｕプロトオンコジーンの領域で起
きているということがかなり確実である。ｎｅｕ癌遺伝
子に特有の領域又はそれに対応するｎｅｕプロトオンコ
ジーンに特有な領域にそれぞれ特異的に反応する核酸プ
ローブの利用により、多様な、自発的に生じたヒト腫瘍
のＤＮＡに活性化をもたらす損傷が存在するか否かを決
定することが可能である。つまり、ｎｅｕ癌遺伝子又は
それに対応するプロトオンコジーンのそれぞれに（しか
し、両方にではなく）生じているヌクレオチド配列と反
応（ハイブリダイズ）するハイブリダイゼーシヨンプロ
ーブを作成できる。そのようなプローブはヒト腫瘍ＤＮ
Ａに於てｎｅｕ癌遺伝子を活性化する点突然変異を検査
するのに用いることができる。例えば、臨床上対象とし
ているヒト腫瘍のｎｅｕ癌遺伝子活性化を検出するの
に、サザンブロツトハイブリダイゼーシヨン法で放射線
標識した核酸プローブを用いることができる。

【００１６】増幅／過剰発現 ヒトｎｅｕプロトオンコジーンの増幅は、ヒトｎｅｕプ
ロトオンコジーンの癌遺伝子としての性質を活性化する
もう一つの機構であろう。ヒトｎｅｕプロトオンコジー
ンの増幅は、ｎｅｕ遺伝子のいずれの部分由来のハイブ
リダイゼーシヨンプローブを用いても検出できる。これ
らのプローブは癌遺伝子とプロトオンコジーンを区別す
る必要はない。このような手法は神経芽細胞腫中でのヒ
トＮ−ｍｙｃ遺伝子の増幅を検出するのに有効に利用さ
れている。いくつかの種類の腫瘍で、ヒト癌遺伝子の増
幅が見い出されている。最も良く報告されているのは、
神経芽細胞腫に於けるＮ−ｍｙｃの増幅である。この遺
伝子は多くの第ＩＩ、第ＩＩＩ及び第ＩＶ段階の腫瘍で
３−３００倍の増幅が見い出された。さらに重要なこと
に、一次的な、未処理の神経芽細胞腫中のＮ−ｍｙｃコ
ピー数は、段階とは無関係に予後の要素として臨床上重
要である。（シーガーら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．
１９８５；３１３：１１１１−６）ゲノムの増幅と腫瘍
の進行の早さとの間には顕著な相関関係がある。遺伝子
増幅を伴わないＮ−ｍｙｃ遺伝子の過剰発現も予後に同
様な関係があることを示す証拠もある。癌遺伝子の増幅
は、他の種々の腫瘍でも検出されている。その中には網
膜芽細胞腫（Ｎ−ｍｙｃ）、急性前骨髄球白血病、結
腸、胸部、肺及び胃の癌腫（ｃ−ｍｙｃ）がその他多く
のものと同様に含まれる。

【００１７】ｎｅｕ遺伝子の増幅及び／又は過剰発現の
検出はホニユウ類細胞中の癌の存在を検査するのに利用
できる。増幅や過剰発現はＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白質レ
ベルで測定できる。このような検査の１つの具体例は、
テストされる細胞から調製した核酸（ＤＮＡ又はＲＮ
Ａ）について、ｎｅｕ遺伝子のヌクレオチド配列に相補
的な、放射線標識した核酸プローブとを結合させること
である。プローブは試料に存在する相補的塩基配列のｎ
ｅｕ遺伝子とハイブリダイズする。このようなハイブリ
ダイゼーシヨンの程度は、オートラジオグラフイーとそ
の後の濃度計測定のような、良く知られた技術によつて
測定される。対照と比較して高いレベルのハイブリダイ
ゼーシヨンはｎｅｕ遺伝子の増幅を示唆し、腫瘍の原因
として示唆されてきた。このように、ハイブリダイゼー
シヨンのレベルは細胞中の癌の存在を暗示する。以下に
示されるｎｅｕ遺伝子の１．６キロベースのＥｃｏＲＩ
制限酵素断片は、ｎｅｕ遺伝子の他のどの部分とも同様
に、ハイブリダイゼーシヨンプローブとして用いること
ができる。過剰発現の検出は、蛋白質レベルでも行われ
る。ｎｅｕ癌遺伝子にコードされるｐ１８５蛋白質はそ
れに対応するプロトオンコジーンにコードされる蛋白質
とは異なり、このため、これらの蛋白質中の、変化した
又は正常なアミノ酸配列に特異的なポリクローナル抗体
やモノクローナル抗体などの血清学的試薬を開発するこ
とが可能である。これらの試薬は、変異や変化を起こし
た遺伝子産物を検出することにより、ｎｅｕ癌遺伝子が
存在するか否かを高感度で検査するのに用いられ得る。
血清学的試薬を用いて、免疫組織化学技術により細胞表
面の、又、イミユノアツセイ技術により生理学溶液中の
ｎｅｕ遺伝子にコードされる蛋白質を検出できる。これ
らの検査には、前述のアミノ酸配列又はｎｅｕがコード
する産物のアミノ酸配列の一部に特異的な抗体が用いら
れる。免疫ペルオキシダーゼ染色法のような免疫組織化
学技術により、ヒト組織標本（例えば生検試料）のｎｅ
ｕ遺伝子の発現を検査できる。或いは、免疫螢光法も用
いられる。これらの検査では、ｎｅｕ遺伝子産物に特異
的な抗体は、抗体がｎｅｕ遺伝子産物に結合するのに適
当な条件下で、組織試料（細胞）と接触する。好ましい
抗体はｎｅｕ遺伝子産物の細胞外ドメインに特異的なも
のである。細胞に対する結合の程度（標準的な免疫組織
化学又は免疫螢光技術により決定できる）は、ｎｅｕ遺
伝子産物の発現レベルを示唆する。

【００１８】免疫学的検査法で、生理的溶液中でｎｅｕ
遺伝子産物を検出できる。それらはコンペテイテイブア
ツセイや免疫学的計量法（放射免疫計量法又は酵素計量
法）による検査を含む。生理的溶液（即ち、血液、唾
液）はテストするべき検体から調製する。試料中の抗体
とｎｅｕ遺伝子産物の複合体形成ができる条件下で、試
料をｎｅｕ遺伝子産物に特異的な抗体と接触させる。複
合体形成（抗体／抗原反応）の程度は試料中のｎｅｕ遺
伝子産物の量を示唆する。抗体−抗原複合体の量は広く
知られている方法によつて測定する。例えば、免疫計量
法では、抗体／抗原複合体の定量に二次標識抗体が使わ
れる。

【００１９】血清や体液中のヒトｎｅｕ抗原を検出する
免疫計量法検査は、正常な前腫瘍形成及び腫瘍形成細胞
中のものと同様に、実施例７Ａから７Ｃに記述されてい
る。“捕捉”免疫検査法は、実施例に詳細に記述されて
いるように行い、概略的には、その方法に従つて行つた
ヒト生理溶液中のヒトｎｅｕ抗原を検出するための捕捉
イミユノアツセイは次のようなものを含む。 ａ．モノクローナル又はポリクローナルの抗ｎｅｕ一次
抗体で固相のインキユベーシヨン混合液を用意する。 ｂ．抗ｎｅｕ抗体が固相に結合するのに適した条件で混
合液をインキユベーシヨンする。 ｃ．液体試科から固相を分離し、抗ｎｅｕ抗体を含まな
い固相上のサイトを排除（即ち、ブロツキング）する。 ｄ．抗ｎｅｕ抗体を含む免疫吸収剤とｎｅｕ抗原を含
む、ヒト生理溶液のインキユベーシヨン混合液を用意す
る。 ｅ．溶液中のヒトｎｅｕ抗原が免疫吸収剤と結合するの
に十分な時間、適当な条件でインキユベートする。 ｆ．液体試料から免疫吸収剤を分離する。 ｇ．免疫吸収剤を標識した抗ｎｅｕモノクローナル二次
抗体とインキユベートし、 ｈ．良く知られた技法を用いて免疫吸収剤に結合したラ
ベルの量を検出する。

【００２０】特に、ｎｅｕ抗原は実施例７に詳述される
新しい捕捉イミユノアツセイにより検出できる。簡単に
述べれば、生物標本からｎｅｕ抗原を捕捉する目的で、
ポリスチレンプレートを抗ｎｅｕモノクローナル抗体又
は抗ｎｅｕモノクローナル抗体の化合物でコートする。
一度コートした後は、捕捉抗体と結合しないサイトは緩
衝液のウシ血清アルブミンでブロツクされる。ｎｅｕ抗
原を含む又は含む疑いのある試料をインキユベートし、
ビオチン標識した抗ｎｅｕ抗体が加えられる。ビオチン
を検出するため、ストレプトアビジンホースラデイツシ
ユペルオキシダーゼ溶液を酵素の基質と共に加え、反応
産物の光学密度を測定する。ｎｅｕ抗原の量は試料の光
学密度を、予め測定しておいた標準ｎｅｕ抗原の量とそ
の光学密度との関係と比較することにより決定する。こ
の検査法により、三重の複合体が形成され、それらは、
１）抗ｎｅｕ一次抗体 ２）ｎｅｕ遺伝子産物（“ｎｅ
ｕ抗原”）及び ３）抗ｎｅｕ二次抗体から成る。この
二次抗体は複合体形成前又は後で標識される。標識は良
く知られたいずれかの方法で抗体に直接又は間接に付け
られる。例えば、抗体とビオチンの複合体を形成させ得
る。本発明のイミユノアツセイは一次抗体が抗ｎｅｕモ
ノクローナル抗体でも、抗ｎｅｕモノクローナル抗体の
混合物でも或いは抗ｎｅｕポリクローナル抗体でもｎｅ
ｕ抗原を検出できる。

【００２１】複合体はそれが固相に固定される以前に形
成され得る。他の体系を用いれば、複合体は形成される
と同時に固相に固定され得る。好ましい検査に於いて
は、ｎｅｕ遺伝子産物は、それを特異的に“捕捉”又は
結合する免疫吸着剤に固定される。この免疫吸着剤はｎ
ｅｕ遺伝子産物のあるイデイオトープに特異的な抗体の
付着によつて形成される。このように、ほとんどの目的
で、免疫吸着剤及び標識抗体の形成に２つの異なる抗ｎ
ｅｕ抗体が用いられる。

【００２２】捕捉アツセイはフオワード、リバース及び
同時のモードで行える。ｎｅｕ遺伝子産物に対するフオ
ワード捕捉アツセイでは、抗ｎｅｕ抗体は固相に付けら
れる。テストされる液体試科は免疫吸着剤とインキユベ
ートされる。インキユベーシヨンは液体試料中のｎｅｕ
遺伝子産物が、免疫吸着剤上に固定された抗ｎｅｕ抗体
に結合するのに十分な時間行われる。この最初のインキ
ユベーシヨンの後、固相の免疫吸着剤を試料から分離す
る。液体試料中に存在する可能性がある非結合抗原や非
特異的結合蛋白質のような阻害物質を除去するため、免
疫吸着剤を洗浄する。固定された抗体に結合した、ｎｅ
ｕ抗原を含む免疫吸着剤は、続いて、標識抗ｎｅｕ抗体
とインキユベートされ、固定化抗体−ｎｅｕ抗原−標識
抗体の三重の複合体を形成する。インキユベーシヨンは
標識抗ｎｅｕ抗体がｎｅｕ抗原に確実に結合する時間と
条件で行われる。二度目のインキユベーシヨンの後、固
相の免疫吸着剤から結合していない標識を除くため、も
う一度洗浄する。固相の免疫吸着剤に結合した標識抗ｎ
ｅｕ抗体を測定し、検出されたラベルの量は液体試料中
に存在したｎｅｕ抗原の量の直接の測定結果を与える。

【００２３】このサンドウイツチ型のイミユノアツセイ
はリバース及び同時のモードでも行うことができる。リ
バースモードでは、インキユベーシヨン混合液は検査さ
れる液体試料と可溶性の標識抗ｎｅｕ抗体から成る。混
合液をインキユベートし、同じ或いは異なる抗体を持つ
固相の免疫吸着剤に接触させる。さらにインキユベート
した後、混合液から免疫吸着剤を分離し、液体試料中に
存在したｎｅｕ抗原の量を示す、免疫吸着剤に結合した
ラベルを測定する。同時モードでは、インキユベーシヨ
ン混合液は測定されるｎｅｕ抗原を含む液体試料と、標
識抗ｎｅｕ抗体、及び固相の免疫吸着剤より成る。三重
の複合体を形成させる適切なインキユベーシヨンの後、
混合液から固相の免疫吸着剤を分離し、免疫吸着剤に結
合したラベルを測定して液体試料中のｎｅｕ抗原の量の
データを得る。

【００２４】腫瘍の治療 ｎｅｕ 遺伝子産物に特異的な抗体は腫瘍の治療に用いる
ことができる。治療としては、抗体は単独で受動免疫療
法に、又は免疫毒の一成分として用いることができる。
受動免疫療法では、腫瘍に対抗する量のモノクローナル
抗体を生理学的に適切な媒体（例えば、通常の塩水）に
入れて、ｎｅｕ遺伝子産物を発現する腫瘍に苦しむ患者
に投与する（実施例８を見よ）。例えば、ｎｅｕ遺伝子
産物の細胞外ドメインに特異的な抗体が腫瘍の治療に用
いられる。免疫毒療法では、抗体は抗癌剤やサイトトキ
シンと結合させて免疫毒を作る。多様な医薬、細胞毒性
をもつ試薬が共有結合又は非共有結合で抗体と結合でき
る。便利な治療用試薬の例としては、放射性化合物（例
えばホウ素やレニウムの同位元素）、アルキル化剤や抗
生物質のようなＤＮＡ結合試薬（例えばダウノマイシ
ン、アドリアマイシン、クロラムブチル）、代謝阻害剤
（例えば、メトトレキサート）、及び蛋白質合成阻害剤
（例えば、ジフテリア毒素、毒性植物蛋白質）などを含
む。 ここに記述した治療上の利用には、ｎｅｕ遺伝子
産物に対する抗体はキメラ抗体として設計することもで
きる。キメラ抗体はヒト以外（例えばマウス）の可変領
域（抗原結合領域）とヒト由来の不変領域をもつ。キメ
ラ抗体はヒト由来の部分が優勢なため、ヒト体内で免疫
原性は低く、ヒトへの外来蛋白質の投与に伴う諸問題を
解消し得る。

【００２５】この発明は、さらに以下の実施例で説明さ
れる。

【実施例】実 施 例 １：ｎｅｕ ｃＤＮＡクローン
とｎｅｕ遺伝子産物の単離 Ａ．ｎｅｕ遺伝子族 周産期のＢＤＩＸラツトに、アルキル化剤であるエチル
ニトロソウレアを１回投与する事により神経外胚葉性腫
瘍が高い効率で生起される。ラジユースキー，Ｍ．Ｆ．
ら、Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅ
ｒ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，
７０９−７２６（１９７７）；ラジユースキー，Ｍ．
Ｆ．，Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃ
ｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ ８４：６３−７６（１９８
３）。妊娠１５日後に胎盤経由で変異処理を行うか、誕
生後１０日間にわたつてエチルニトロソウレアを直接注
射した動物の９５％は、投与量および株ごとの潜伏期を
経た後、中枢および末梢神経系の腫瘍を誘起するだろ
う。これらの腫瘍由来のこれらの腫瘍および細胞系列
は、広範な種類の神経細胞およびグリア細胞タイプの特
徴を示す。シユバート，Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９４：
２２４−２２７（１９７４）。この細胞タイプの、独立
に由来した４つの腫瘍細胞系列から単離したＤＮＡはＮ
ＩＨ３Ｔ３フオーカス形成アツセイにおいて検出され得
る活性化されたガン遺伝子を含んでいる。このアツセイ
で検出されるガン遺伝子の大部分は、ｒａｓ遺伝子に密
接に関連した３つのうちのひとつが、遺伝的に変化した
ものである事が示されている（バーマス，１９８４）。
しかし、これらの神経／グリア芽腫由来の遺伝子はｒａ
ｓ遺伝子に関連しておらず、ｎｅｕと呼ばれている。ｎ
ｅｕは、はじめ、トランスフエクトした細胞表面に示さ
れる１８５０００Ｄａの腫瘍抗原ｐ１８５との結合よ
り、特異な遺伝子である事が認められた。ｎｅｕは、上
皮成長因子（ＥＧＦ）受容体をコードする。ｅａｒＢ遺
伝子のＤＮＡ配列に関連しており、ＥＧＦ受容体に対す
る抗血清がｐ１８５といくらかの交差反応性を示す。し
かし、詳細な分析により、ｎｅｕは、ｅａｒＢに対して
ごく限られた相同性しかもつておらず、この２つの遺伝
子が異なる染色体上に位置する事が示されている。シエ
クター，Ａ．Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：９７６
−９７８（１９８５）。したがつて、ｎｅｕ遺伝子は、
ＥＧＦ受容体をコードする遺伝子に関連しているが、異
なるものである。ｎｅｕガン遺伝子のｃＤＮＡクローン
は、この遺伝子によりトランスフオームされた細胞系列
から単離した。バーグマン，Ｃ．Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒ
ｅ，３１９：２２６−２３０（１９８６）。ヒトのこれ
と同じ遺伝子も単離されており、ｃ−ｅｒｂＢあるいは
ＨＥＲ２など、様々に呼ばれている。これらラツトおよ
びヒトクローンのＤＮＡ配列は、ｎｅｕ遺伝子のタンパ
ク質産物が１２６０アミノ酸からなることを推定し、こ
れは、ＥＧＦ受容体で推定されるアミノ酸配列に対し並
列的であり、５０％同一である。ＥＧＦ受容体からの類
推により、ｎｅｕ産物は、６５０アミノ酸のシステイン
が豊富な細胞外領域および、膜貫通ドメイン、チロシン
キナーゼドメイン部分を含む５８０アミノ酸の細胞内領
域からなる膜貫通タンパク質と考えられる。ｐ１８５タ
ンパク質に関する生化学的研究はこの結論を支持してい
る。ｐ１８５は、グリコシル化されており、無傷の細胞
においても抗血清と反応する事ができ、これは、このタ
ンパク質が細胞表面に局在する事に合致する。また、こ
のタンパク質は、関連するチロシン特異的タンパク質リ
ン酸化活性を有している。しかし、ｐ１８５はＥＧＦを
結合せず、そのため未同定の成長因子に対する受容体で
はないかと考えられる。 Ｂ． ラツトｎｅｕ遺伝子の正常型およびトランスフオ
ーム型アリルクローンの単離 ラツトｎｅｕ遺伝子の正常型およびトランスフオーム型
アリルの、生物学的に活性のあるゲノムクローンが最近
単離された。ハングＭ．−Ｃ，ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇｓ ｏｆ ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３：２６
１−２６４（１９８６）。これらのクローンの構造的比
較からは、大幅な組換えが起きたという証拠は一切示さ
れず、このことは、わずかな遺伝的改変がｎｅｕガン遺
伝子の活性化の原因である事を示唆している。正常型ア
リルを含むトランスフオームされていない細胞および、
変異型アリルを含むトランスフオームされた細胞系列に
おいて発現されたｐ１８５の 相対的 レベルが示さ
れ、これは、ｎｅｕの活性化の原因となる改変は、この
遺伝子の発現の調節を失わせないことを示唆するもので
ある。この結果はトランスフオームの原因がコードされ
ているｐ１８５タンパク質内にあり、それはこの遺伝子
のｃＤＮＡにおいて示されるであろう。 Ｃ． 正常型ｎｅｕ遺伝子のｃＤＮＡクローンとトラン
スフオーム型ｃＤＮＡクローンの比較 ｎｅｕ 遺伝子の活性化の原因となる改変の効果を調べる
ために、すでに単離されていたトランスフオーム型ｃ
ＤＮＡクローン、エチルニトロソウレアにより誘導され
た３種の異なる活性型ｎｅｕ遺伝子由来のＤＮＡ、およ
びｎｅｕ正常型アリルのｃＤＮＡクローンの比較が行わ
れた。正常型ｎｅｕ ｃＤＮＡクローンの単離 まず、正常型ｎｅｕ ｃＤＮＡクローンを単離すること
が必要とされた。そのために、細胞系列ＤＨＦＲ Ｇ８
由来のＲＮＡを用いてｃＤＮＡを構築した。ハングＭ．
−Ｃ，ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ
ａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ
ｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３：２６１−２６４（１９８
６）。ＤＨＦＲ細胞系列は、ラツトのＢＤＩＸ株由来の
完全な正常型ｎｅｕ遺伝子を含むゲノムコスミドクロー
ンを、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞にトランスフエクトすること
により作成された。これらの細胞は、トランスフエクト
した遺伝子から高レベルのｎｅｕ遺伝子産物であるｐ１
８５と高レベルのｎｅｕＲＮＡを発現する。ｃＤＮＡク
ローンはＳ１スナツプバツク法で、ターミナル・トラン
スフエラーゼを用いてｄＣＴＰによりテイリングし、ｄ
ＧテイルをもつたｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位に挿入す
ることにより作成された。ｎｅｕプローブと反応する３
０個の組換え体プラスミドが単離された。これらのプラ
スミドクローンは、制限酵素地図により、活性型ｎｅｕ
ガン遺伝子の全長ｃＤＮＡクローンと比較された。これ
らの正常型ｃＤＮＡクローンは、すでに同定されている
トランスフオーム型ｃＤＮＡクローンと共通の配列をも
つているが、どれもｎｅｕの全コード領域を含んではい
なかつた。しかし、ｎｅｕの全コード領域を含むクロー
ンは、ユニークなＮａｅＩ部位を共通にもつ、部分的に
重複した２つのクローンをｉｎ ｖｉｔｒｏで組換える
ことにより構築された。これにより生じたクローンの
５′末端について、ｎｅｕがコードするｐ１８５タンパ
ク質に対する開始コドンの存在を調べるためにその配列
を決定した。第１図に示されるように、この正常型ｎｅ
ｕクローンをｐＳＶ２発現ベクターに挿入してｐＳＶ２
ｎｅｕＮを作成した。マリガン，Ｒ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ，２７７：１０８−１１４（１９７９）Ｂ１０４−
１−１細胞系列由来のトランスフオーム型ｎｅｕｃＤＮ
Ａクローンは、活性型ラツトｎｅｕ遺伝子の２次トラン
スフエクタントであるが、これをｐＳＶ２に挿入してｐ
ＳＶ２ｎｅｕＴと呼ばれるプラスミドを構築した（第１
図）。ｐＳＶ２ｎｅｕＴは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞あるいは
Ｒａｔ１繊維芽細胞におけるフオーカス形成アツセイに
おいて高い活性を示した。このアツセイは、トランスフ
エクシヨンによつて細胞に導入されたＤＮＡ分子が、単
層で生育しているこれらの細胞をトランスフオームした
状態に転換し、その子孫が、細胞単層上に形態的にトラ
ンスフオームした細胞の集塊あるいはフオーカスを形成
せしむ能力を測定するものである。しかし、同様にｐＳ
Ｖ２ベクターに挿入された正常型ｎｅｕ ｃＤＮＡを同
一の条件でＮＩＨ ３Ｔ３細胞にトランスフエクトした
場合、フオーカスはいつさい観察されなかつた。トラン
スフオーム型細胞および非トランスフオーム型細胞によ
る、ｐ１８５産生の比較。ｐＳＶ２ｎｅｕＮおよびｐＳ
Ｖ２ｎｅｕＴ プラスミドを含む細胞系列は、ｐＳＶ２
ｎｅｏ（以下、ｎｅｏ−ｒマーカーと呼ぶ）とのコトラ
ンスフエクシヨンおよびＧ４１８の選択により単離され
た。サザン，Ｐ．Ｊ．とＰ．バーグ，Ｊｏｕｒｎａｌｏ
ｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ， １：３２７−３４１（１９８２）。
ｐＳＶ２ｎｅｕＴを発現している細胞系列は、形態的に
トランスフオームし、レフラクタイルになる；ｐＳＶ２
ｎｅｕＮを含む細胞系列は、形態的には偏平で非トラン
スフオーム型である。これらの細胞系列る³²Ｐ正リン酸
により代謝的に標識し、その細胞破砕液をラツトｎｅｕ
遺伝子産物を特異的に沈澱させるモノクローナル抗体と
ともにインキユベーシヨンした。第２Ｂ図のレーンｃ，
ｄおよびｉに示されているように、標識されたｐ１８５
のレベルは、トランスフオーム型細胞と非トランスフオ
ーム型細胞とで同等であつた。この結果は、ｎｅｕは発
現の非調節化というよりはむしろ、コード領域における
突然変異によつて活性化されることを示唆する初期の研
究と合致するものである。ハングＭ．−Ｃ，ら、Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ Ａ
ｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，
８３：２６１−２６４（１９８６）。

【００２６】実 施 例 ２： ｎｅｕ遺伝子の遺伝的
解析 Ａ．ｎｅｕ遺伝子の活性化の原因となるＤＮＡ配列の同
定 ｐＳＶ２ｎｅｕＴクローンのトランスフオーム活性を担
う配列の同定は、このクローンと正常型アリルを担うｐ
ＳＶ２ｎｅｕＮとの組換え体を用いることにより行われ
た。この組換え体は、クローン化された適当なＤＮＡ断
片をライゲーシヨンする事によつて構築された。第１図
は、活性化型変異を担うｎｅｕの領域を明らかにする一
連のクローンの構造を示している。ここに示されるそれ
ぞれの組換え体クローンの構造は、制限酵素地図によつ
て評価された。各例において、少なくとも２つの単離さ
れたプラスミドに関して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形態的に
トランスフオームする能力を試験した。全ての組換え体
クローンは、ｎｅｏ−ｒマーカーとともにコトランスフ
エクシヨンされ、得られたＧ４１８耐性コロニーの形態
が記録された。形態的にトランスフオームしていないコ
ロニーは、獲得したｃＤＮＡクローンから、構造的に無
傷のｐ１８５タンパク質を発現していることを確認する
ために試験された。クローンｐＳＶ２ｎｅｕＦおよびｐ
ＳＶ２ｎｅｕＢは、 正常型クローンの残りの部分の配
列に融合したトランスフオーム型クローンの、それぞ
れ、はじめの７１９と１８９９ヌクレオチドを含んでお
り（第１図）、それらはｐ１８５の合成を指示すること
ができるにもかかわらずトランスフオーム活性を示さな
かつた。この遺伝子の５′末端からヌクレオチド２３８
７まではトランスフオーム型ｎｅｕ配列を含み、それ以
後は正常型ｎｅｕ配列を含むクローンｐＳＶ２ｎｅｕＨ
は、トランスフエクシヨンによりフオーカスを形成し、
もとのｐＳＶ２ｎｅｕＴクローンによつて形成されるコ
ロニーと区別できないトランスフオームしたコロニーを
生ずる。ｐＳＶ２ｎｅｕＣもまた、トランスフオーム能
をもつていた。これは正常型ｎｅｕ遺伝子のヌクレオチ
ド２３３７からヌクレオチド３５３４までのＸｂａＩ断
片を含み、これにより対応するトランスフオーム型ｃＤ
ＮＡの部分が置換されている。この結果は、正常型ｃＤ
ＮＡとトランスフオーム型ｃＤＮＡが、ヌクレオチド１
８８９から２３３７の間の配列において異なつており、
トランスフオーム型クローン中にこの配列が存在するこ
とがトランスフオーメーシヨンに必須であることを示し
ている。この配列がトランスフオーメーシヨンの生起に
充分であることを証明するために、相互的コンストラク
トであるｐＳＶ２ｎｅｕＴＮとｐＳＶ２ｎｅｕＮＴ（第
１図）が構築され、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＲａｔ Ｉ
繊維芽細胞へのトランスフエクシヨンによつて試験され
た。ｐＳＶ２ｎｅｕＴＮは、Ｎｄｅ ＩとＢｇｌＩによ
り規定される、正常型ｎｅｕクローン由来のヌクレオチ
ド１８９９から２３８７を除いてはトランスフオーム型
ｃＤＮＡ全長を含んでいる。ｐＳＶ２ｎｅｕＮＴは、ト
ランスフオーム型クローン由来の配列により置換され
た、対応する４８８ヌクレオチドを除く全長の正常型ｎ
ｅｕ ｃＤＮＡ配列を含んでいる。比較実験において、
ｐＳＶ２ｎｅｕＮＴはもとのトランスフオーム型クロー
ンであるｐＳＶ２ｎｅｕＴと同等の数のフオーカスを与
え；ｐＳＶ２ｎｅｕＴＮ、ｐＳＶ２ｎｅｕＮ および偽
トランスフエクシヨンでは、フオーカスはいつさい見ら
れなかつた。この実験は、正常型とトランスフオーム型
クローンの間の、基本的な遺伝的差異はこの４８８ヌク
レオチドからなる断片に存在することを示している。第
２図に示されているデータはこれらの結論を指示するも
のである。ｐｓＶ２ｎｅｕプラスミドと選択ｎｅｏ−ｒ
遺伝子のコトランスフエクシヨンにより単離されたＧ４
１８耐性細胞系列は、第２Ａ図に示されている。ｐＳＶ
２ｎｅｕＴＮおよびｐＳＶ２ｎｅｕＮを含む系列は、形
態的に偏平で、ｎｅｏ−ｒ遺伝子のみでトランスフエク
シヨンした系列と区別することができない。それとは対
照的に、ｐＳＶ２ｎｅｕＮＴおよびｐＳＶ２ｎｅｕＴを
含む細胞は、非常にレフラクタイルで、形態的にお互い
極めて類似している。これらの細胞系列は³²Ｐ正リン酸
により代謝的に標識し、その細胞破砕液を抗ｐ１８５モ
ノクローナル抗体１６．４とともにインキユベーシヨン
した。ドレビン，Ｊ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１２：
５４５−５４８（１９８４）。第２Ｂ図は、ｐＳＶ２ｎ
ｅｕＮ（レーンｃとｄ）、ｐＳＶ２ｎｅｕＴ（レーン
ｉ）、ｐＳＶ２ｎｅｕＴＮ（レーンｅとｆ）およびｐＳ
Ｖ２ｎｅｕＮＴ（レーンｇとｈ）を含む典型的な細胞系
列で発現しているｐ１８５のレベルを示している。正常
型およびトランスフオーム型ｃＤＮＡが単離された細胞
系列であるＤＨＦＲＧ８とＢ１０４−１−１細胞（レー
ンｂとｊ）由来の細胞破砕液についても分析を行つた。
それぞれの細胞クローンは広範なｐ１８５レベルを示す
が、正常型およびトランスフオーム型細胞両方において
ｐ１８５発現が似た範囲にあることは明かである。ｎｅ
ｏ−ｒマーカークローンのみでトランスフエクシヨンし
た系列において、ｐ１８５は全く見いだされない（レー
ンａ）。したがつて、これらの細胞における相違は、そ
れらが発現しているｐ１８５の性質に関する。内在性の
違いによると説明されねばならない。 Ｂ．正常型ｎｅｕアリルと活性型ｎｅｕ遺伝子を区別す
る変異の定義 トランスフオーム型ｎｅｕ ｃＤＮＡの コード領域の
完全なＤＮＡ配列が決定されている。バーグマン，Ｃ．
Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１９：２２６−２３０（１９
８６）。この２つのアリルを区別する厳密な変異を定義
するために、ヌクレオチド１８９９から２３８７の間の
領域のＤＮＡ配列が正常型ｎｅｕ ｃＤＮＡについて決
定された。この配列とすでに決定されていたトランスフ
オーム型クローンの配列の間には、ただ１つの違いしか
見つからなかつた。ヌクレオチド１０１２の位置に、発
ガン遺伝子型クローンではＡが存在するが、一方、正常
型はこの位置にＴをもつていた。この結果、コードされ
るｐ１８５の残基６４４に存在することが推定されるア
ミノ酸が影響を受ける；正常型タンパク質で見られるバ
リンが発ガン型では、グルタミン酸によつて置換されて
いる。第３図は、正常型ｎｅｕ 遺伝子とトランスフオ
ーム型ｎｅｕ遺伝子両方について、ヌクレオチド１９６
８から２０７３のＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸
配列を示している。予想される変異は、ｎｅｕ遺伝子産
物ｐ１８５で推定される膜貫通ドメイン内に帰属してい
る。ｎｅｕの正常型およびトランスフオーム型アリルの
ゲノムクローンは、すでに単離されている。これらのク
ローンはｃＤＮＡにみられるヌクレオチドの相違を見る
ために独立に用いられた。このような共同研究からのデ
ータは、ｃＤＮＡで観察される差異が、ｃＤＮＡクロー
ニングにおいて生じたものである可能性を除外するため
に役だつている。この２つのアリルをゲノムからサブク
ローニングし、配列を決定することにより、同様なＴか
らＡへの置換がこれらのゲノムクローンにおいても存在
することを確証した。これは、ＴからＡへの変換という
変異がＢ１０４神経芽細胞腫瘍あるいは細胞系列を生成
する際に、体細胞において生起することを示している。

【００２７】実 施 例 ３：ｎｅｕガン遺伝子の活性
化 Ａ．独立のｎｅｕガン遺伝子活性化の決定。 初期の結果は、６つの神経／グリア芽種細胞系列の内、
４つから調製したＤＮＡがＮＩＨ ３Ｔ３フオーカス形
成アツセイにおいて活性型のｎｅｕガン遺伝子を示すこ
とを明らかにしていた。シー，Ｃ．ら：Ｎａｔｕｒｅ，
２９０：２６１−２６４（１９８１）。これら６つの細
胞系列はエチルニトロソウレアを用いて、ＢＤＩＸラツ
ト胚を胎盤を介して変異源処埋することによつて得られ
たものである。これらの独立な活性型ｎｅｕ遺伝子は、
それらが同じ活性型変異を含んでいるかで評価された。
これらのｎｅｕ遺伝子を含むコランスフエクタント由来
のＤＮＡについて、ｎｅｕ遺伝子のひとつあるいは他の
アリルを優先的に認識する核酸プローブを用いてハイブ
リダイゼーシヨンを行つた。この方法は、ｒａｓ遺伝子
の種々の活性型アリルを同定する際に用いられ、成功し
ている。ボス，Ｊ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５：７
２６−７３０（１９８５）；ザーブル，Ｊ．ら、Ｎａｔ
ｕｒｅ，３１５：３８２−３８５（１９８５）。ｎｅｕ
遺伝子の野生型あるいは変異型ｎｅｕいずれかの配列に
対応する核酸が合成された。これらの２つの２０−ｍｅ
ｒの配列が第４図に示されている。これらの２０−ｍｅ
ｒを、次に、適当な制限酵素で切断したＤＮＡを含む、
乾燥したアガロースゲルに対して厳しい条件（完全な２
重鎖について計算されたＴｍよりも２℃低い温度）下で
ハイブリダイゼーシヨンさせた。野生型配列に対応する
２０−ｍｅｒは、ｐＳＶ２ｎｅｕＴにハイブリダイゼー
シヨンする場合に比べ、ｐＳＶ２ｎｅｕＮ に対し約１
０倍強くハイブリダイゼーシヨンした。それとは対照的
に、トランスフオーム型アリル由来の配列をもつ核酸
は、同じ比率で優先的にｐＳＶ２ｎｅｕＴ とハイブリ
ダイゼーシヨンした。ＤＮＡは、上述の４つの独立な活
性型ｎｅｕガン遺伝子をもつたトランスフエクタントか
ら単離され、ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。それにより生
じた断片を１％アガロースゲルで分離した。このアガロ
ースゲルを、第４図で示される、上述のクローン化され
たＤＮＡの分析で用いられたものと同一の条件下でイン
キユベーシヨンした。ＤＨＦＲ Ｇ８からのＤＮＡは、
正常のゲノムｎｅｕ遺伝子をゲノムあたり約５０コピー
含んでおり、対照として含まれている。第５Ａ図は、ト
ランスフエクタントＤＮＡと野生型配列に対応する核酸
とのハイブリダイゼーシヨンを示している。ＤＨＦＲ
Ｇ８ ＤＮＡに強いシグナルが現れ、これは導入された
正常型ｎｅｕ遺伝子のものである（レーンｂ）。ｎｅｕ
でトランスフオームしたトランスフエクタントＤＮＡ
（レーンｃ−ｆ）および、トランスフエクシヨンしてい
ないＮＩＴ ３Ｔ３細胞（レーンａ）を含むレーンに有
意な弱いシグナルがみられた。第５Ｂ図は、変異配列を
含む核酸をプローブとして、同じゲルについてハイブリ
ダイゼーシヨンを行つた結果を示している。ＤＨＦＲ
Ｇ８ ＤＮＡはこのプローブとわずかに弱く反応したが
（レーンｂ）、ｎｅｕによりトランスフオームしたトラ
ンスフエクタントＤＮＡ（レーンｃからｆ）は、いずれ
もこのプローブにより強いシグナルを生じた。レーンｄ
に示されているトランスフエクタントＤＮＡは、トラン
スフオームに用いた遺伝子の３′末端が欠けているため
に、他のトランスフエクタントよりも小さいｎｅｕ−相
同ＨｉｎｄＩＩＩ断片をもつている。野生型のプローブ
とトランスフエクタントとの反応性の低さは、同じプロ
ーブを用いたクローン化ｐＳＶ２ｎｅｕＴの分析の際に
見られるシグナルと同程度であるため、（第４図のレー
ンｂとｄを、第５Ａ図および第５Ｂ図にあるレーンｃ−
ｆと比較のこと）このプローブの交差反応性に起因する
ものであろう。ＤＮＡのロード量とトランスフエクタン
トのコピー数によるシグナル強度の違いを調節するため
に、５Ｂのゲルからプローブをはがし、ｎｅｕ遺伝子の
異なる部分由来の核酸プローブを用いて再びハイブリダ
イゼーシヨンを行つた。トランスフエクタント細胞系列
はトランスフエクシヨンの際の種々の増幅により、異な
るコピー数のラツトｎｅｕ遺伝子を含んでいるかもしれ
ない。このハイブリダイゼーシヨンの結果は第５Ｃ図に
示されている。第５Ａ図、第５Ｂ図、第５Ｃ図におい
て、それぞれ対応するレーンを比較すると、全てのｎｅ
ｕガン遺伝子トランスフエクタントは、野生型プローブ
に比べ変異型プローブと強いハイブリダイゼーシヨンを
示し、変異型プローブとそれらのハイブリダイゼーシヨ
ンの程度は、種々のＤＮＡ中に存在するｎｅｕ遺伝子の
コピー数と良い相関を見せることが判る。このデータ
は、調べられた活性型ｎｅｕ遺伝子は、全て同一のヌク
レオチドの位置で改変をもつていることを強く示唆する
にもかかわらず、全ての例において変異が同一のＴから
Ａへの転換を含んでいるのかは明かではなかつた。Ｔか
らＧへの転換は、それにより野生型核酸とＡ／Ｇのミス
マツチを生じ、変異型核酸とは比較的安定なＧ／Ｔミス
マツチを生ずるために、おそらく同じハイブリダイゼー
シヨンのパターンを与えるだろう。この可能性を調べる
ため、第４図に示される配列をもつた第３の２０−ｍｅ
ｒを合成した。この核酸は、第５Ａ図で分析したゲルか
ら初めに用いたプローブを除去した後に、このゲルとハ
イブリダイゼーシヨン条件下でインキユベーシヨンし
た。この核酸は、厳しい条件下ではトランスフエクタン
トＤＮＡと優先的にハイブリダイゼーシヨンしなかつた
（第５Ｄ図）。したがつて、これらの活性型ｎｅｕ遺伝
子それぞれにおける改変は、おそらく同じＴからＡへの
転換であろう。点突然変異は腫瘍形成時に生じ、そのた
め、ラツトゲノムに最初から存在していた多型性、ある
いはトランスフエクシヨン過程における活性化を反映し
ているわけではないこともまた確証された。ＤＮＡは、
ＢＤＩＸラツト肝および、ＢＤＩＸラツトに由来し、ト
ランスフエクシヨンアツセイにおいて活性型ｎｅｕ遺伝
子を与える４種のラツト腫瘍細胞系列から単離された。
２連でゲルを作成し、野生型核酸あるいは変異型核酸い
ずれかをプローブとして用いた（第６図）。ＢＤＩＸ肝
ＤＮＡは野生型核酸と良く反応したが、変異型核酸とは
反応しない（第６図、レーンａとｆ）。これとは対照的
に、４つの腫瘍細胞系列は変異型核酸とのみ反応した
（第６図、レーンｂ−ｅおよびｉ−ｌ）。このことは、
ヌクレオチド２０１２でのＴからＡへの転換は、腫瘍あ
るいは腫瘍細胞系列の生成時に生起したことを示してい
る。また、腫瘍細胞系列は、ｎｅｕ遺伝子の活性型アリ
ルに関してヘミ接合あるいはホモ接合型のようである。
正常型アリルの欠失が腫瘍形成時あるいは、腫瘍細胞系
列の途上で起こるのかも知れない。正常型ｒａｓアリル
の同じ様な欠失あるいは発現の低下はこれらのｒａｓ遺
伝子の発ガン型を含むいくつかの腫瘍、および腫瘍細胞
系列で観察されている。カボンらＮａｔｕｒｅ，３０
４：５０７−５１３（１９８３）：ジエレロ，ＩらＰｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ ｔｈｅ ＮａｔｉｏｎａｌＡ
ｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．
Ａ．，８２：７８１０−７８１４（１９８５）。ｎｅｕの多様な独立の活性化 見かけ上ランダムに作用する試薬により刺激することに
よる化学的発ガンは、それにより生じた腫瘍細胞中に特
異的な遺伝的変化をしばしばもたらす。ｎｅｕは、分析
されたトランスフオーム型ｎｅｕアリルの４種それぞれ
において、同一のヌクレオチドの変化によつて活性化さ
れているようである。これらのアリルはそれぞれ、アル
キル化試薬であるエチルニトロソウレアを胎盤経由で与
えることにより生じた、神経芽細胞腫あるいはグリア芽
細胞腫から単離された。シユバート，Ｄ．ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ，２４９：２２４−２２７（１９７４）。ｎｅｕ
は、関連したアルキル化試薬メチルニトロソウレアによ
つて生じた、４種の独立の神経系腫瘍においても同じ残
基で活性化されている。メチルニトロソウレアによる、
Ｂｕｆ／Ｎラツトにおける乳ガンの生起に関する、同じ
様な広範な研究により、約１００例の独立に生起した腫
瘍にはすべて、残基３５で同一のＧからＡへの転換によ
つて活性化されたＨ−ｒａｓ発ガン遺伝子が含まれてい
ることが示されている。スクマー，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒ
ｅ，３０６：６５８−６６１（１９８３）；ザーブル，
Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３８２−３８５（１９
８５）。活性化の特異性に関するそのほかの例には、遺
伝的に感受性のＳｅｎｃａｒマウスにおける、ジメチル
ベンザトラセンにより誘導された乳頭腫が活性型Ｈ−ｒ
ａｓ遺伝子を有していることや、ガンマ線照射あるいは
メチルニトロソウレアにより誘導される胸腺リンパ腫
が、それぞれトランスフエクシヨン能をもつＫ−ｒａｓ
およびＮ−ｒａｓを生ずるなどの例が含まれている。バ
ルメイン，ＡとＩ．Ａ．プラグネル、Ｎａｔｕｒｅ，３
０３：７２−７４（１９８３）；グレロ，Ｉ．ら、Ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．
Ａ．，８１：２０２−２０５（１９８４）。前者で検出
されるＫ−ｒａｓ発ガン遺伝子は調べた４つの腫瘍のう
ち少なくとも３つにおいて同じ活性型変異を有している
ようである。異なる条件下での、同じ変異誘起剤、つま
りメチルニトロソウレアの投与が、乳腺腫瘍ではＨ−ｒ
ａｓを特異的に活性化し、胸腺リンパ腫ではＮ−ｒａｓ
を、神経外胚葉腫ではｎｅｕを特異的に活性化する点は
興味深い。グレロ，Ｉ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２５：
１１５９−１１６２（１９８４）。これらの腫瘍をそれ
ぞれ誘導する催奇剤は、はじめ、細胞のＤＮＡに広範な
損傷を与えるはずである。しかし、最終的に検出される
変異は極めて特異的である。明らかに、多段階のガン化
過程において、強力な生物学的な圧力が、確立した腫瘍
中で観察される遺伝的損傷を坦つた細胞の成長に選択的
に働くはずである。細胞内の遺伝子のわずかな部分のみ
が生物学的に活性な発ガン遺伝子に転換され得るようで
ある。これらの遺伝子のひとつでは、多くの可能な変異
のいくつかのみがトランスフオーム活性をもつた発ガン
遺伝子を生ずる。発ガン遺伝子を生ずる相対的にまれな
変異は、まず腫瘍に対し選択的な優位性をもつていなく
てはならないために、また後に、フオーカス形成アツセ
イにおいて検出され得るために濃縮されるのである。ひ
とつの腫瘍型における特異的な損傷が繰り返し現れるこ
とにより、可能な活性型変異の間で他の選択圧も存在す
ることが示唆される。活性型変異の性質は、催奇剤の化
学的反応性によつて強い影響を受ける。例えば、胸腺腫
を誘起するために用いられた異なる変異誘起剤は、生じ
た腫瘍において異なる遺伝子の活性化を引き起こす。同
様に、ジメチルベンズアントラセンによつて誘起された
乳ガンは、メチルニトロソウレアによつて誘起されたも
のとは異なる特異的な改変を含んでいる。前述の神経芽
細胞腫を誘起する薬剤である、エチルニトロソウレアの
反応性はＤＮＡに多数の異なる副次的障害を形成させ
る。シンガー，Ｂ．とＪ．Ｔ．カスマーレク、Ａｎｎｕ
ａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，５２：６５５−６９３（１９８２）。これらのう
ち、ＧからＡへの転移を起こす障害については、詳しい
記載がなされている。ラジユースキー，Ｍ．Ｆ．，Ｒｅ
ｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ＣａｎｃｅｒＲｅｓ
ｅａｒｃｈ，８４：６３−７６（１９８３）。 こうい
つた変異は、関連した催奇剤であるメチルニトロソウレ
アによつて誘起された乳ガンの、Ｈ−ｒａｓ発ガン遺伝
子中の活性型障害として繰り返し見いだされている。ザ
ーブル，Ｈ．ら、Ｎａｒｕｒｅ，３１５：３８２−３８
５（１９８５）。しかし、ここで述べている変異はＴか
らＡへの転換であり、その生起は、これらのアルキル化
剤の投与の後に形成される多くの別の損傷を含む、他の
機構によつて説明されねばならない。この種の変異は先
例がないわけではない：生殖系列の変異誘起処理後に単
離された、他の２つのエチルニトロソウレアによつて生
じた変異もまた、ＴからＡへの転換であることが示され
ている。ポツプ，Ｒ．Ａ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０
５：１５７−１６７（１９８３）；ルイス，Ｓ．Ｅ．
ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ａｃ−ａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：５８２９−５８３１（１９８
５）。メチルニトロソウレアによつて誘導されたリンパ
腫から単離したＮ−ｒａｓ発ガン遺伝子は、ＣからＡへ
の転換によつて活性化されていることが見いだされてお
り、これは、アルキル化剤によつて誘起されるいくつか
の異なる付随的障害が、変異を起こし得ることを示唆し
ている。グレロ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏ
ｆ ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：７８１０−７
８１４（１９８５）。

【００２８】実 施 例 ４：核酸プローブを用いたｎ
ｅｕ発ガン遺伝子の検出 Ａ．ｎｅｕ遺伝子に相同な核酸プローブを用いたバツフ
アロー・ラツト 由来の腫瘍ＤＮＡに関する検討 スクマーとバーバシツド（米国国立ガン研究所、ベセス
ダ）は、活性型ｎｅｕ遺伝子を含む１０種のメチルニト
ロソウレアによつて誘起された述経系腫瘍を単離した。
これらの腫瘍ＤＮＡから得られたトランスフエクタント
は、これらのｎｅｕ遺伝子中の変異が、すでに記載のあ
る腫瘍で見つかるものと同じであるか決定するために検
定された。これは以下のようにして行われた；１０種の
独立な活性型ｎｅｕ遺伝子を含む１４のトランスフエク
タントが第７図に示されている（トラツク１−１４）。
ゲルを２連で作成し、上述の核酸プローブにより検索し
た。すなわち、それらは、正常型（第７図、上）あるい
はトランスフオーム型遺伝子に相当する核酸（第７図、
下）により検索された。ＮＩＨ ＤＮＡ（トラツク
Ｎ）、ＤＨＦＲＧ８ ＤＮＡ（トラツクＧ）（高コピー
の正常型ｎｅｕ遺伝子）、Ｂ１０４−１−１ ＤＮＡ
（トラツクＢ）（高コピーのトランスフオーム型ｎｅｕ
遺伝子）および、活性型ｎｅｕ遺伝子を含まない２つの
バツフアロー・ラツト腫瘍（トラツクｃ１とｃ２）が対
照として含まれていた。トランスフエクシヨンされたｎ
ｅｕ遺伝子は全て、上述のトランスフオーム型ｎｅｕｃ
ＤＮＡクローンが取られた細胞系列である、Ｂ１０４−
１−１ ＤＮＡ と同じ改変をもつていた。トランスフ
オーム型遺伝子に対応した核酸に対するハイブリダイゼ
ーシヨンの違いに基づいて、トランスフエクシヨンした
ｎｅｕ遺伝子は、Ｂ１０４−１−１ ｎｅｕ遺伝子と同
じ配列の変化を有していると推定される。これらの結果
は、この核酸によつて検出される活性型ｎｅｕ遺伝子に
関する、１０種の独立な事例を与えるものであり；第２
の変異誘起剤であるメチルニトロソウレアが、エチルニ
トロソウレアと同様な機作でこの位置においてｎｅｕ遺
伝子を活性化に導いたことを示し；活性型ｎｅｕ遺伝子
がＢＤＩＸラツトと同様に、バツフアロー・ラツトにお
いても生じることを示している。 Ｂ．オリゴヌクレオチドによる変異導入 オリゴヌクレオチドによる変異導入は、通常アミノ酸の
第６６４番目に見いだされるバリン残基をグルタミン残
基に置換するために用いられた。この変異ｎｅｕ遺伝子
を発現ベクターに挿入し、受容細胞にトランスフエクシ
ヨンあるいは感染させると、生じた安定な細胞系列は１
００％ガン化した。（それとは対照的に、アミノ酸第６
６４番目にバリン残基を含むタンパク質をコードする正
常型ｎｅｕ遺伝子（ガン原遺伝子）でトランスフオーム
した受容細胞は、０．１％がガン化しただけである。）
したがつて、グルタミン酸と同様に、第６６４番目のグ
ルタミンもまたトランスフオーム型ｎｅｕ遺伝子を生
じ、グルタミンを認識する核酸プローブで検出される変
異は、トランスフオーム型変異であることが予想され
る。第６６４番目におけるアスパラギン酸への置換は、
ガン化していない細胞へトランスフエクシヨンあるいは
感染することにより、受容細胞の２−３％にガン化した
形質を生ずる。これは、ガン化を生起するためには、そ
の変異と共に、過剰発現を伴わねばならないような弱い
トランスフオーム型のｎｅｕ遺伝子アリルを表している
と考えられる。 Ｃ．ヒトｎｅｕ遺伝子における活性型変異の同定 すでに記載された実験と同様に、この点に関する議論
は、ラツトｎｅｕ発ガン遺伝子の活性化の原因となる点
突然変異に関連しているが、ヒト腫瘍細胞ＤＮＡにあ
る、それに相当するヒトｎｅｕ遺伝子における活性型変
異の同定と、ｎｅｕ発ガン遺伝子（あるいは、それに相
当するガン原遺伝子）の存在の検出に同様な研究法を用
いることは可能である。例えば、ラツトｎｅｕ発ガン遺
伝子の活性化の原因である点突然変異を含むことが示さ
れている領域に相当する、ヒトｎｅｕ遺伝子の領域と特
異的に反応する核酸プローブを構築することが可能であ
る。構築可能なプローブの例としては、ｎｅｕ発ガン遺
伝子とそのガン原遺伝子の間で異なる、１ヌクレオチド
に基づいたものであり、この１ヌクレオチドの改変は、
ｎｅｕガン原遺伝子を活性型発ガン遺伝子に転換する原
因である。これらのプローブは、どのような長さのもの
も可能であるが、一般に１５から２０ヌクレオチド長で
あり、ラツトｎｅｕ発ガン遺伝子について上述されたよ
うに、腫瘍細胞ゲノムを分析し、ｎｅｕ発ガン遺伝子中
に損傷（変異）があるかを決定し、またその正確な配置
を決定するために用いることができる。 Ｄ．ｎｅｕ発ガン遺伝子の存在の検出 ｎｅｕ ガン原遺伝子からｎｅｕ発ガン遺伝子への変異を
引き起こすガン化を検出するためのアツセイは、ガン原
遺伝子あるいは発ガン遺伝子中に存在し、他のものには
存在しない（あるいは転写される）ヌクレオチド配列に
対し特異的な、標識された核酸を用いることからなるも
のである。ヒト細胞におけるガン化のアツセイは、検定
する細胞からＤＮＡを単離し、このＤＮＡを、発ガンあ
るいはガン原遺伝子のＤＮＡ配列のいずれかに特異的
な、標識したポリヌクレオチドプローブと接触させ、そ
の後、どちらのプローブがＤＮＡにハイブリダイゼーシ
ヨンしたかを決定することによつて行うことができる。
放射性同位体により標識すると、これらのプローブは、
例えば点突然変異の生起などについて、腫瘍細胞ＤＮＡ
を検定するためのサザンブロツト法に用いることができ
る。このタイプのアツセイは、ヒト腫瘍ＤＮＡ中で活性
化されている発ガン遺伝子の性質を決定するための診断
法として、臨床的に用いることができる。このアツセイ
法は、ｎｅｕ族遺伝子の１ヌクレオチドの改変を検出す
ることができ、アツセイされる腫瘍細胞に関して極めて
決定的な情報を供給することができるため、非常に特異
的なものとなるだろう。これらのプローブを用いるため
の試薬は、キツトに収めることが可能である。したがつ
て、キツトは、プローブに加え１種以上の緩衝液、プロ
ーブの標識試薬および、サザンあるいは他のブロツトに
用いる試薬などを含むだろう。発ガン遺伝子によりコー
ドされる産物から、ガン原遺伝子によつてコードされる
産物タンパク質のアミノ酸配列へ変化するために、特異
的な血清試薬によつてもそれぞれを検出することが可能
である。この血清試薬は、タンパク質のこの部位におい
て、正常型のｎｅｕガン原遺伝子に特定されるアミノ酸
配列に特異的なものか、あるいはタンパク質のこの部位
において、改変された発ガン遺伝子を特定するアミノ酸
配列に特異的なものを用いることができる。改変されて
いないタンパク質の領域と反応し、その結果、コードさ
れたタンパク質の正常型あるいは異常型と反応できるよ
うな、他の血清学的試薬も用いることができる。クロー
ニング技術を用いることにより、ガン原遺伝子の正常な
部位、あるいは発ガン遺伝子の改変された部位によつて
コードされる、有意な量のタンパク質を単離することが
できる。このような部分的タンパク質は、通常の抗体生
産法によつて抗体を生産するために用いることができ
る。したがつて、ポリクローナル抗体を生産するため
に、このようなタンパク質が、ウサギあるいはラツトな
どの宿主を免疫するために用いられ、このタンパク質に
対する抗体は宿主から得られる血清から回収されるだろ
う。別の用法としては、ハイブリドーマ細胞を形成する
典型的な細胞融合法により、単離された遺伝子部分によ
つて産生されるタンパク質に対する抗体を生産する細胞
を用いることによつて、モノクローナル抗体を生産する
ことができる。基本的には、これらの技術は、抗体産生
細胞を不死性を有するミエローマ細胞などと融合し、不
死性と求められる抗体（この場合、単離された遺伝子部
分によつてコードされる、正常型あるいは改変型タンパ
ク質部分に対する抗体）を産生することのできる融合雑
種細胞を与えることを含んでいる。この雑種細胞は、次
に抗体産生を促す条件下で培養され、その後、抗体は細
胞培養液から回収される。モノクローナル抗体産生のた
めのこのような技術は、文献に詳しく記載されている。
参照するものとしては、例えば、ヒラリー・コプロウス
キーらによつて提出された、米国特許第４，１７２，１
２４号明細書および第４，１９６，２６５号明細書など
があり、これから得られた点については参考文献に加え
られている。

【００２９】実 施 例 ５：ヒトｎｅｕ遺伝子のクロ
ーニング ヒトｎｅｕ遺伝子は、高レベルのｎｅｕＲＮＡを発現し
ている２つの頸部ガン細胞系列（ＳＷ１７１０、ＭＥ１
８０）のｐｏｌｙ Ａ＋ ＲＮＡ由来のラムダｇｔ１１
ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。ラツ
トｎｅｕチロシンキナーゼドメインの１３００ｂｐ Ｐ
ｓｔ Ｉ断片を、ＳＷ１７１０ｃＤＮＡライブラリーを
検索するためにプローブとして用いた。２つの組換え体
プラークが、制限酵素部位の分析と部分的な配列決定に
より、ヒトｎｅｕとして同定された。組換え体配列は、
ヌクレオチド８４９から始まり、ｎｅｕタンパク質のは
じめの２２５から１２５５アミノ酸全てをコードしてい
る。ヒトｎｅｕ遺伝子の、この欠けた領域は、ＳＷ１７
１０ ｎｅｕ ｃＤＮＡクローンの５′Ｅｃｏ ＲＩ断
片をプローブとして用いて、ＭＥ１８０ ｃＤＮＡライ
ブラリーから単離された。この２つのクローンの、サブ
クローニングされた領域とヒトｎｅｕ遺伝子の全長の構
成を表した図は、第８図に示されている。 Ａ． ｎｅｕ発現ベクターの構築 ｎｅｕ をコードする全配列を、発現ベクターｐＬＪ（ロ
バートら、１９８５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５６：４０４
−４１３）および、ｐＭａｘ（無条件でバーナード・マ
シユー−プレボツトから譲り受けた、第９図に示されて
いる）にクローニングした。これらのベクターはどちら
も、ｎｅｕ遺伝子をモロニー・ミユーリン・白血病ウイ
ルスプロモーターおよびエンハンサー（ＬＴＲ）による
転写調節下に置いている。ｐＬＪベクターでは、ＳＶ４
０プロモーターからｎｅｏ^Ｒも発現されている。 Ｂ．膜貫通領域の点突然変異の構築 オリゴによる変異の導入は、アマシヤム社のサイトーデ
イレクテツド・ミユータゲネシス・キツトを用い、以下
のオリゴヌクレオチドを用いて、キツトの指示にしたが
つて行い、 ＣＴＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＧＣＡＴＴＣＴＧ この中で、下線を施したヌクレオチドは正常型ヒトｎｅ
ｕアリルと異なるものである。点突然変異の存在は、デ
イフアレンシヤル・ハイブリダイゼーシヨンおよび、プ
ロメガ社の２重鎖配列決定キツトを用い、キツトの指示
にしたがつて配列を分析することによつて決定された。 Ｃ．短縮されたｎｅｕアリルの構築 ｐＭαｘベクターは、第９図に示されるように、ポリリ
ンカーに唯一の切断部位を有するＮｃｏ Ｉにより切断
し、クレノーにより末端を埋めて平滑末端とした。ＣＡ
ＴＧＣＡＴＣＧＡＴＣ の配列をもつ１２塩基対のＳｐ
ｈ Ｉリンカー（Ｎ．Ｅ．Ｂ＃１１１５）をこの部位に
挿入し、ポリリンカー中に唯一のＰｐｈＩ部位を導入し
た。この特定のリンカーは、３つの読み枠全てに翻訳開
始シグナル（ＡＴＧ）を与えるために選ばれた。これに
よつて生じたベクターは、ｐＭａｘ−Ｓｐｈとして第９
図に示されている。ｐＭａｘ−Ｓｐｈは、Ｓｐｈ−Ｉ部
位とＸｈｏ Ｉ部位（いずれもポリリンカー内）で切断
された。遺伝子のまさに５′の膜貫通領域から、３′末
端のｎｅｕ ｃＤＮＡを含む、２２２５塩基対のＳｐｈ
Ｉ／ＳａｌＩ断片が、ヒトｎｅｕ ｃＤＮＡ全体を含
むプラスミド（第９図ではｐＡｂＴ５６５として示され
ている）から単離された。制限酵素によつて切断された
ベクターおよび単離された断片は、ライゲーシヨンさ
れ、バクテリア株ＨＢ１０１にトランスフオーメーシヨ
ンされた。これにより生じたプラスミドは第９図に示さ
れており、ｐＭαｘデルタｎｅｕあるいはｐＡｂＴ５０
１１と呼ばれている。 Ｄ．細胞のトランスフエクシヨン ｎｅｕ を発現するベクターは、通常のリン酸カルシウム
法によつてＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフエクシヨンさ
れた。簡単に述べると、第１日目は、細胞を１０ｃｍの
組織培養皿当たり、５×１０^５プレーテイングする。２
日目は、細胞に再び栄養を与え、４時間後にＤＮＡの沈
澱を加え、細胞を６時間インキユベーシヨンし、再度栄
養を与える。後日、細胞をＧ４１８を含む培地に分配
し、１０−１４時間インキユベーシヨンする。ＮＩＨ３
Ｔ３ＤＮＡをキヤリアーとして用い、ｐＳＶ−２ ｎｅ
ｏ を選択マーカーとして用いた。 Ｅ．ＲＮＡの単離 細胞の全ＲＮＡは、グアニジウム・イソチオシアネート
／ＣｓＣｌ法により単離された。培養中の細胞からＲＮ
Ａを単離する際には、溶解緩衝液（４Ｍグアニジウム・
イソチオシアネート、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ザルコシル、
０．１Ｍ ＢＭＥ）を組織培養皿に直接加えた。凍結組
織を開始材料とするときは、組織を溶解緩衝液中で、組
織ホモジナイザー（バイオスペツク・プロダクツ ＩＮ
Ｃ．）によつて直接ホモジナイズした。次に、細胞溶解
液を１８ゲージの注射針に通し、ＳＷ５０．１ベツクマ
ン・ポリアロマー・チユーブに作成した１．２ｍｌの
５．７Ｍ ＣｓＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液上に重層
した。これを、３５，０００ｒｐｍで最低１２時間遠心
する。つぎに、ＲＮＡペレツトを１％ＳＤＳを含むＴＥ
に再溶解する。 Ｆ．ハイブリダイゼーシヨンプローブ 細胞外ドメインの一部と、膜貫通ドメインおよびチロシ
ン・キナーゼドメインのわずかな部分を含む１．６ｋｂ
のＥｃｏＲＩ断片を、第１０図に示されるように、プロ
メガ社のｐＧＥＭデユアル・トランスクリプシヨン・ベ
クターにサブクローニングした。ハイブリダイゼーシヨ
ンに用いるための標識したＲＮＡ転写物は、プロメガ社
の指示にしたがつて作成した。 Ｇ．ＲＮＡスロツト・ブロツト分析 ＲＮＡ試料は、６×ＳＳＣ、７．４％ホルムアミドによ
り１μｇ／ｍｌに希釈され、６５℃で１５分間加熱し、
その後氷上に置かれた。スロツト・ブロツトは、ＳＳＳ
スロツト・ブロツト装置と、制作社の指示にしたがつて
供給されているプレカツトＢＡ ８５ニトロセルロース
・シートを用いて行われた。フイルターは、あらかじめ
水、次に１０×ＳＳＣで浸潤させ、２００μｌの容量に
おいて、２００ｎｇ／スロツトから開始して、２倍希釈
系列としてＲＮＡを加えた。スロツトを次に２００μｌ
の１０×ＳＳＣで洗い、フイルターを真空オーブン中、
８０℃で２時間加熱した。次に、このフイルターを１０
×ＳＳＣで浸潤させ、ハイブリダイゼーシヨン緩衝液
（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナ
トリウム、２５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、５×デン
ハルト）中で２時間プレハイブリダイゼーシヨンを行つ
た。次に、ハイブリダイゼーシヨン溶液をヒトｎｅｕに
特異的な、１−２×１０^６ｃｍｐ／ｍｌの、変性させた
^３２Ｐ標識ＲＮＡプローブを含む新しい溶液と交換し
た。このフイルターを次に、６５℃で一晩インキユベー
シヨンした。翌朝、このフイルターを、０．１×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ、８０℃、２０分間、３回洗つた。 Ｈ．ヒトｎｅｕアリルのクローニングとトランスフオー
ム活性試験 高レベルのｎｅｕＲＮＡを発現する頸部ガン細胞系列か
ら作成された２つのｃＤＮＡライブラリーは、ラツトｎ
ｅｕｃＤＮＡのチロシン・キナーゼドメイン由来のプロ
ーブによりスクリーニングされた。制限酵素地図およ
び、部分的な配列データと発表されたデータとの比較か
ら、このスクリーニングから単離された、もともとのク
ローンから構築された、本来のヒトｎｅｕクローンの同
一性が確証された。このヒトｎｅｕｃＤＮＡは、つぎに
ＬＴＲにより発現されるベクターに移された。このヒト
ｎｅｕコンストラクトによりトランスフエクシヨンされ
た細胞は、ヒト乳ガン細胞系列ＳＫＢＲ−３によつて発
現されたヒトの本来のｎｅｕと区別できない、１８５，
０００Ｄａのタンパク質を発現した。この正常型ヒトｎ
ｅｕクローン（第１０図に示されるｐＭａｘ ｎｅｕ）
をＮＩＨ ３Ｔ３細胞にトランスフエクシヨンすると、
それらはガン化した。これは、ラツトｎｅｕ遺伝子につ
いて記載されたデータと完全に対照的なものである。ラ
ツトでは、発現レベルにかかわらず、正常型ラツトｎｅ
ｕアリルはトランスフオーム活性をもたなかつた。これ
より低いレベルでｎｅｕを発現する、他の発現ベクター
における正常型ヒトｎｅｕ遺伝子の発現は、ＮＩＨ ３
Ｔ３細胞にガン化を引き起こさなかつた。しかし、も
し、ヒトｎｅｕ遺伝子が、ラツトにおいてグルタミン酸
に転換されたバリンと相同なアミノ酸に変異を生じたな
ら、この遺伝子はどの発現ベクターにおいても細胞をガ
ン化するだろう。短縮したヒトｎｅｕアリルをどちらか
の発現ベクターにより発現すると、これもまたＮＩＨ
３Ｔ３細胞をガン化する。これらの結果は、デイ・フイ
オリら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７；２３７：１７８−
１８２によつて報告されたものと一致する。要約する
と、正常型ｎｅｕに関してはより高い発現レベルが必要
とされるが、正常型および変異型ヒトｎｅｕアリルはい
ずれも、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞をガン化することができ
る。 Ｉ．ヒト細胞系列および乳ガンにおけるｎｅｕＲＮＡレ
ベルの分析 細胞の全ＲＮＡは、グアニジウム・イソチオシアネート
法により、種々のヒト細胞系列および乳ガンから単離さ
れた。次に、ＲＮＡをヒトｎｅｕに特異的なプローブ、
すなわち、細胞外ドメインの一部、膜貫通ドメインおよ
びチロシン・キナーゼドメインの一部を含む１．６ｋｂ
のＥｃｏＲＩ断片を用いたスロツト・ブロツト分析にか
けた。また、全てのＲＮＡ試料は、フイルター上にある
ＲＮＡ量を補正するために、アルフア・チユーブリンを
用いてハイブリダイゼーシヨンした。ヒト乳細胞系列Ｈ
ＢＬ１００（ＡＴＣＣ ＨＴＢ １２４）は、対照とし
て用いられ、全ての結果は、ＨＢＬ１００との相対的な
レベルを表している。Ｅ．ガフニー、Ｃｅｌｌ Ｔｉｓ
ｓｕｅ Ｒｅｓ．，２２９：５６３−５６８（１９８
２）。ｎｅｕの発現レベルは、ＨＢＬ１００のレベルの
１から６４倍まで変動した。これらの結果は第１表に示
されている。

【００３０】 ＨＢＬ−１００は、授乳期の母親の母乳由来の上皮細胞
系列である。ＭＥ１８０は、頸部ガン細胞系列である。
ＳＷ１７１０は、頸部ガン細胞系列である。ＭＫＮ−７
は、腸ガン細胞系列である。ＳＫ−ＢＲ−３は、胸部の
腺腫である。Ａ−４３１は、上皮性ガン細胞系列であ
る。ＢＴ−４８３は、胸部の輸送管腫である。１８−３
−７は、ｎｅｕでトランスフエクシヨンしたＮＩＨ３Ｔ
３細胞である。この結果は、すでに発表されている結果
（クラウスら、ＥＭＢＯ，１９８７；６：６０５−６１
０）と同様であつた。われわれはまた、ヒトの一連の初
期乳ガンにおけるｎｅｕのＲＮＡレベルも分析した。わ
れわれは再び、第２表に示されるように、対照の１から
１２８倍の範囲にわたる広範なｎｅｕの発現レベルを見
いだした。 ハイブリダイゼーシヨンの結果は、^３２Ｐ ｎｅｕプロ
ーブを用いたドツト・ブロツトハイブリダイゼーション
における、全細胞ＲＮＡの連続的希釈を用いて決定し
た。数値は、チユーブリンプローブを用いたハイブリダ
イゼーシヨンにより、全ＲＮＡ量に対して補正を施し
た。レベルは、正常な乳細胞系列ＨＢＬ−１００を１倍
とした相対値である。上述のように、レベルはＨＢＬ−
１００に対する相対値で表され、チユーブリンの発現に
関して補正されている。

【００３２】実 施 例 ６．：ｎｅｕ特異的モノクロ
ーナル抗体の作製 Ａ．ハイブリドーマの作製 後に記すハイブリドーマは、ｎｅｕ癌遺伝子にコードさ
れた全長のタンパク質を発現している生細胞（後に記す
１８−３−７細胞系統）を用いてマウスを免疫処理する
ことにより得られた。このことはモノクローナル抗体産
生に関して、他のアプローチとは重要な違いである。生
細胞により提示された全長タンパク質を免疫原として用
いることで、そのタンパク質の細胞質外ドメインの全体
に及ぶ特異性をもつモノクローナル抗体を収集すること
ができるのである。このことは、もとのタンパク質か
ら、限られた数のエピトープしか、提示できず、それ故
に限られた特異性の免疫反応を上げるという、ペプチド
の免疫原や、原核生物のシステムにより作られた短いポ
リペプチドを用いるのとは反対のものである。更にタン
パク質の抗原を本来の状態で提示することにより、その
免疫システムは、後にその抗体を診断あるいは治療上の
応用に用いる時に見られるであろうものと非常によく似
た抗原とも反応してくれることだろう。 Ｂ．１８−３−７細胞の作製 １８−３−７細胞は、ヒト乳癌細胞系統のＳＫＢＲ−３
と同じかそれ以上の水準で、全長の通常のヒトｎｅｕを
発現しているトランスフエクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞
系統である。ヒトｎｅｕ遺伝子はネズミ白血病ウイルス
ＬＴＲ（プロモーター及びエンハンサー）によつて発現
している。この細胞系統は形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３
細胞の全ての特徴を示す。それは、軟寒天でも成長し、
ヌード・マウス（ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ）で腫瘍を形成
するし、変わつた形態学的特徴も示す。この細胞系統
を、抗ｎｅｕ特異的モノクローナル抗体の単離のための
免疫原として用いた。ｐＬＪレトロウイルスのベクター
（ｐＬＪ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ）を改変
して、ポリオーマ（Ｐｏｌｙｏｍａ）の初期領城を取り
除くことで、ｐＬＪ ベクターの内因的な形質転換活性
を排除した。改変したベクターの構成を図１１に示す。
改変は、ｐＬＪをＡｐａＩで制限酵素処理して、６３０
０塩基対の断片を分離して、それをＴ_４リガーゼ（Ｔ_４
ｌｉｇａｓｅ）で再び環状にすることでなされた。そ
の結果できたプラスミド（ｐデルタＬＪ＝ｐ△ＬＪもし
くはＡｂＴ５００９；図１１参照）を唯一のＢａｍＨＩ
サイトで分解し、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）でフイル
・イン（ｆｉｌｌｉｎ）して、ヒトｎｅｕタンパク質の
コーデイング領域全体をもつＮｃｏ Ｉ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉをフイル・インした断片とライゲーシヨンさせた。そ
の結果できたプラスミド（ｐ△ＬＪｎｅｕもしくはｐＡ
ｂＴ５７７；図１１参照）をカルシウムリン酸−沈澱法
によりＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフエクトした。トラ
ンスフエクトされた細胞をＧ４１８（ｐ△ＬＪはＳＶ４
０でプロモートされるネオマイシン耐性遺伝子（ＳＶ４
０ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｎｅｏ^Ｒ）を持つている）で選択
した。そのコロン−をＲＮＡドツトブロツト（ＲＮＡ
ｄｏｔｂｌｏｔｓ）によりｎｅｕ発現性に対し、スクリ
ーニングにかけた。１８−３−７はスクリーニングした
およそ５０のうちで最も高い発現細胞の１つであつた。 Ｃ．マウスの免疫処理 一匹あたり、１．４×１０^６のＮＩＨ３Ｔ３生細胞を用
いて、雌バルブ・シーマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｍｏｕｓ
ｅ）の成体２匹を腹膜組織内で（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔ
ｏｎｅａｌｌｙ＝Ｉ．Ｐ．）免疫処理した。これに続
き、すぐにシクロホスフアミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐ
ｈａｍｉｄｅ）水溶液（３０ｍｇ／ｋｇＨ_２Ｏ）をＩ．
Ｐ．に注射した。シクロホスフアミド処理は最初の注射
から２４、４８時間後にくり返された。免疫処理後１４
日目に、１．５×１０^６の１８−３−７生細胞をマウス
にＩ．Ｐ．で注射した。更に１４日間休ませた後、再
び、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、シクロホスフアミドそして１８
−３−７細胞の注射という一連の操作をくり返した。２
回目の１８−３−７細胞の注射後４日後にその動物は犠
牲にされ、その脾臓が、最初の融合用に採られた。これ
とはまた別に、４匹の雌バルブ・シーマウスと４匹の雌
のＣＢ６（Ｂａｌｂ／ｃ×Ｃ５７ＢＬ／６）マウスを用
いて初めのラウンドは一匹あたり１．８×１０^６のＮＩ
Ｂ３Ｔ３細胞、４．８×１０^６の１８−３−７細胞を２
回目では８．５×１０^６のＮＩＨ３Ｔ３細胞、２．７×
１０^６の１８−３−７細胞を免疫処理に用いて、全く同
じ実験を行なつた。 Ｄ．ハイブリドーマの方法論 ハイブリドーマは、免疫処理されたマウスからの細胞を
ＳＰ２／０骨髄腫細胞（ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ）と
をポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ
ｇｌｙｃｏｌ＝ＰＥＧ）法に従つて融合させることに
より作られた。脾臓を免疫処理したマウスから無菌的に
採取して、脾臓を無血清培地（ＤＭＥ）で培養すること
により、脾臓細胞の単一細胞懸濁液（ｓｉｎｇｌｅ ｃ
ｅｌｌｓｕｓｐｃｎｓｉｏｎ）を得た。脾臓細胞とＳＰ
２／０細胞（対数相（ｌｏｇｐｈａｓｅ）培養液より採
取）を、脾臓細胞：骨髄腫細胞＝５：１の比でまぜあわ
せた。それを２００×ｇで４℃下１０分間遠心して上清
を吸引により取り除いた。チユーブの底を軽くたたくこ
とで、細胞のペレツトを緩めた後、１ｍｌの滅菌した３
７℃の１０％ ＰＥＧ／ＤＭＥ 溶液を一滴ずつ加え
た。１．５分以上の間隔で、ＰＥＧを加えながら、チユ
ーブを穏やかに振つた（ｓｗｉｒｌ）。更に３７℃の無
血清ＤＭＥ１０ｍｌを一滴ずつ加えて、その後、更に２
０ｍｌの培地を加えた。それから懸濁液を２００×ｇで
室温下１０分間遠心した。培地を吸引により、細胞のペ
レツトから取り除き、２０％の胎児ウシ血清、０．２ｍ
Ｍヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎ−ｔｈｉｎｅ）、
０．４μＭアミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉ
ｎ）、０．０３２ｍＭチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）
の存在下で腹膜のマクロフアージを含む（２×１０^４細
胞／ｍｌ）培地（ＨＡＴ培地）を用いて、細胞のペレツ
トを再び懸濁した。（腹膜のマクロフアージは、融合し
て用いられる細胞に従つて、Ｂａｌｂ／ｃまたはＣＢ６
の免疫処理をしていないマウスから得た。注射してすぐ
に無血清培地を安楽死させた動物の腹膜へ移すことで、
こうした細胞が得られた。）融合後の細胞を（腹膜マク
ロフアージを含めないで）最終細胞濃度で５×１０^５細
胞／ｍｌに再び懸濁した。この細胞混合液の１ｍｌを２
４ウエル・プレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）の各ウエ
ル（ｗｅｌｌ）に分配した。 Ｅ．エライザ（ＥＬＩＳＡ）の手順と予備のスクリーニ
ング 融合操作後、成長したハイブリドーマについて、１８−
３−７細胞の細胞ライセート（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔ
ｅ）上でエライザアツセイにより、抗ｎｅｕ抗体の分泌
に対するスクリーニングを先ず行なつた。新しく採取し
た１８−３−７細胞を低張性の溶解緩衝液（１０ｍＭト
リス、１０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．
０）存在下で培養することにより、ライセートを調製
し、その後トライトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００）を最終濃度１％になるように加えた。ＮＩＨ３
Ｔ３細胞のライセートを負のコントロールとして用いる
ため、同様に調製した。マイクロタイタープレート（ｍ
ｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）（ヌンク，イムノプ
レートＩＩ；Ｎｕｎｃ，Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ Ｉ
Ｉ）を、総タンパク質濃度５００μｇ／ｍｌなるライセ
ート５０μｌを用いて室温で夜通しコートした。結合し
ていない抗原を吸引して取り除いた後抗原でコートした
マイクロタイターウエル中のハイブリドーマの生コロニ
ーから得た培養液の上清５０μｌをまずインキユベート
することから、エライザを行なつた。３７℃で３時間保
温した後、洗浄緩衝液（０．５％ツイーン２０；Ｔｗｅ
ｅｎ２０、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．６）で３回洗いそ
れから、ホースラデイツシユ ペルオキシダーゼ（ｈｏ
ｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識し
たヤギ抗マウスイムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇ＋ＩｇＡ＋
ＩｇＭ（ＨＲＰ−ＧＡＭ−ＧＡＭ）５０μｌ と共に３
７℃で１時間保温した。ウエルを洗浄緩衝液で再度、３
回洗つて、更にテトラメチルベンジヂン（ｔｅｔｒａｍ
ｅｔｈｙｌ ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ＝ＴＭＢ）溶液を５０
μｌ加えることでアツセイを展開した。この溶液は、ジ
メチルサルフオキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏ
ｘｉｄｅ＝ＤＭＳＯ）１ｍｌにＴＭＢ１０ｍｇを溶か
し、その内１００μｌ をＴＭＢ緩衝液（０．１Ｍ酢酸
ナトリウム；クエン酸でｐＨ６．０にしたもの）５ｍｌ
に、３％過酸化水素１０μｌと共に加えることで調製さ
れた。発色を５分間行ない、次いで２Ｎ硫酸（Ｈ_２ＳＯ
_４）５０μｌを加えることで酵素反応を止めた。その結
果現れた黄呈色の光学密度（ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉ
ｔｙ＝ＯＤ）をマイクロタイタープレートリーダー（ｍ
ｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）で４
５０ｎｍにて読んだ。ＮＩＨ３Ｔ３細胞でコートされた
ウエル上でよりも、１８−３−７細胞でコートされたウ
エル上の方が、黄発色が強いことで示されるように、正
反応は培養液上清中に、ｎｅｕ癌遺伝子産物を認識する
抗体があることを表していた。 Ｆ．ハイブリドーマのサブクローニング 最初のスクリーニングで正の結果を得たハイブリドーマ
を、限界希釈により広げてクローン化して、細胞及びそ
の抗体を確実にモノクローナルなものとした。生後６週
の免疫処理していないマウスから胸腺細胞を得て、ＨＡ
Ｔ培地で２×１０^４細胞／ｍｌの濃度になるよう単一細
胞懸濁液を作ることでフイーダー細胞群（ｆｅｅｄｅｒ
ｃｅｌｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を最初に調製した。
ｎｅｕ遺伝子産物に対する抗体の有無での試験で正とさ
れたハイブリドーマのコロニーを、胸腺細胞を含んだ培
地に５ハイブリドーマ細胞／ｍｌの濃度になるように希
釈した。それから、この液２００ｕｌを、９６ウエルマ
イクロタイタープレートの各ウエルに分けた。一度コロ
ニーを成長させてから、その上清を再び、ｎｅｕ癌遺伝
子産物の有無に関して試験した。先に記したエライザア
ツセイで試験して、その結果が正であれば、そのコロニ
ーを再度限界希釈してクローン化した。初めの融合につ
いて上記の方法で得られたハイブリドーマは、モノクロ
ーナル抗体を分泌しており、ＢＤ５−２ｄ、ＴＡ１−１
ｃ、ＲＣ１−１ｃ、ＮＡ３−６ａ、ＯＤ３−１０ｊと名
付けられている。２回目の融合についても、ハイブリド
ーマが得られ、ＰＢ−３、ＲＣ６−２、ＮＢ３、ＩＤ
５、ＩＢ３−４と名のついた抗体を分泌している。 Ｇ．抗体のアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）及びサブク
ラス （ｓｕｂｃｌａｓｓ）の決定 ハイブリドーマによつて生産される抗体のアイソタイプ
及び軽鎖のクラスを決定するため、また、ＩｇＧサブク
ラスを決定するため、エライザ・アツセイを行なつた。
この目的のため、ボエリンガー マンハイム（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒＭａｎｈｓｉｍ）（インデイアナポリス；
Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ＝ＩＮ）より、 必要な免疫
試薬全てが入つているキツトを調達した。クローン化し
たハイブリドーマのコロニーから得た組織培養液の上清
を、先に記した様に、１８−３−７細胞のライセート上
で保温した。この後、種々のマウスイムノグロブリンア
イソタイプ、軽鎖クラス、ＩｇＧサブクラスに特異的な
種々のヤギ抗血清と共に保温してから、２次抗体として
のホースデイツシユペルオキシダーゼで標識したブタ抗
ヤギＩｇＧと共に保温した。メーカーの教えにより、Ａ
ＢＴＳ（２，２′−アジノ−ビス−〔３−エチルベンズ
チアゾリン−６−スルホン酸〕；２，２′−ａｚｉｎｏ
−ｂｉｓ−〔３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉ
ｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｏｉｄ〕）を用いてア
ツセイを展開して、その結果生じた緑呈色のＯＤを４０
５ｎｍで読んだ。この方法を用いることで、最初の融合
からのモノクローナル抗体のうち、３つ（ＢＤ５−２
ｄ、ＲＣ１−４ｃ、ＴＡ１−１ｃ）が、ＩｇＧ_１／カツ
パ（ｋａｐｐａ）抗体であり、ＮＡ３−６ａ、ＯＤ３−
１０ｊはＩｇＭ／カツパ抗体であることが決定された。
また、２回目の融合で得られたＲＣ６−２、ＮＢ３、Ｉ
Ｄ５、ＩＢ３−４のモノクローナル抗体は、ＩｇＧ_１／
カツパであり、抗体ＰＢ３はＩｇＧ_２ａ／ラムダ（ｌａ
ｍｂｄａ）である。 Ｈ．放射免疫沈降反応 ｎｅｕ 癌遺伝子産物の予想される分子量である１８５ｋ
ｄの分子量のタンパク質を抗体が認識するか否かを決め
るために、各モノクローナル抗体を用いて、放射性標識
された１８−３−７細胞の免疫沈降を行なつた。１０ｃ
ｍペトリ皿（ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈ）内の１８−３−７
細胞（もしくはＮＩＨ３Ｔ３細胞）のほとんど混じ合つ
ている単層を、５００μＣｉの^３５Ｓで標識したシステ
インを含む培地で、夜通し、培養した。翌朝、細胞を採
取し、プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ及び、大豆トリプソ
ン阻害剤の入つた洗浄性緩衝液（ＩＰ緩衝液：１％トラ
イトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、
０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭトリス、０．６５Ｍ ＮａＣ
ｌ、ｐＨ ７．２）中で溶解させた。およそ、１μＣｉ
の標識細胞標本を各ハイブリドーマ由来の培養液上清５
００μｌと共に４℃で夜通しインキユベートした。この
間に、精製したウサギ抗マウスＩｇＧ（キルケガード及
びペリー ラボ；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ ｐｅｒｒ
ｙＬａｂｓ）５０μｇ をＩＰ緩衝液中のプロテイン
Ａ−セフアロース（ＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）（フアルマシア；Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）１：１
のスラリー（ｓｌｕｒｒｙ）５０μｌと４℃で夜通し混
ぜた。過剰のウサギ抗体をＩＰ緩衝液でプロテイン Ａ
−セフアロースを１回洗うことで取り除き、それから、
標識細胞と、モノクローナル抗体を含んだ培養混合液
に、そのスラリーを加えた。この混合液を４℃で夜通し
反応させた。プロテイン Ａ−セフアロースを遠心して
ペレツトにし、ＩＰ緩衝液で４回洗い、次いでＴＢＳ
（１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．
２）で１回洗つてからペレツトを乾かした。ＳＤＳゲル
用の試料用緩衝液（１０ｍＭ トリス、４％ＳＤＳ、２
０％グリセロール、１０％ ２−メルカプトエタノー
ル；２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａ−ｎｏｌ、０．０４
％ ブロモフエノール ブルー；ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ
ｂｌｕｅ）５０μｌに各ペレツトを再び懸濁した。４．
５％アクリルアミド重層用ゲル及び７％分離用ゲルを用
いて、各試料の半分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル
（ＳＤＳｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）にか
けた。ゲルを乾かし、オートラジオグラフイーにかけ
た。全てのモノクローナル抗体はＮＩＨ３Ｔ３細胞には
見られない。１８−３−７細胞中の約１８５ｋｄ の分
子量を持つタンパク質を認識することが、免疫沈降反応
の結果から示された。このことは、標準タンパク質マー
カーにより示される様に１８５ｋｄ の分子量を持つタ
ンパク質がゲル内で移動する距離に相当するバンドが、
オートラジオグラフで存在したことにより決定された。
同様の実験が、ＳＫＢＲ−３細胞（ヒト肺癌）及びＡ４
３１細胞（ヒトの類表皮性癌）を用いてなされた。ＳＫ
ＢＲ−３細胞は他の研究者たちにより、ヒトｎｅｕ癌遺
伝子産物を高水準で発現していることが示されていた
が、上に記したモノクローナル抗体を用いた免疫沈降反
応では、これを確かなものとする結果を得た。観察され
たバンドは、１８−３−７標識細胞から、沈降されたバ
ンドと等しい距離だけ移動していた。一方、Ａ４３１細
胞系統は、ヒト表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を非常
に高い水準で発現していることで知られているが、ＥＧ
ＦＲは１７０ｋｄのタンパク質で、ヒトｎｅｕ癌遺伝子
産物と、タンパク質のチロシンキナーゼドメインで、重
要な相同性を持つている。これは、もし抗体が、チロシ
ンキナーゼ領域を認識していれば、ｎｅｕ遺伝子産物と
交差反応を起こすかもしれないタンパク質なのである。
しかしながら、上記のモノクローナル抗体を用いたＡ４
３１細胞の免疫沈降反応は、１８５ｋｄの所も１７０ｋ
ｄの所も反応性を示さなかつた。ヒトＥＧＦＲに特異的
な、コントロールの抗体は予想通り、Ａ４３１細胞のタ
ンパク質とうまく反応して、観察されたバンドは、１７
０ｋｄの分子量に相当した。１８−３−７細胞に対して
生じたモノクローナル抗体を用いるとＡ４３１との反応
性が見られなかつたことから、抗体はヒトｎｅｕ癌遺伝
子産物に特異的であり、ヒト表皮成長因子受容体とは交
差反応しないということが、結論づけられた。

【００３３】実 施 例 ７：生物学的試料におけるｐ
１８５ ｎｅｕ抗原の検出 今までの実施例は、血清、血漿、尿といつたヒトの体液
あるいは前新生細胞、新生細胞におけるヒトｎｅｕ抗原
（約１８５０００ダルトンの分子量；ｐ１８５と呼ぶ）
の検出を説明している。 Ａ．キヤプチヤーイムノアツセイ 多様な生物標本からｎｅｕ抗原を奪取（キヤプチヤー）
する目的で、ポリスチレンプレート（コスター社、ケン
ブリツジ、ＭＡ）を１マイクログラム（μｇ）の抗ｎｅ
ｕモノクローナル抗体（Ｍａｂ）、複数の抗ｎｅｕモノ
クローナル抗体の混合物、またはポリクローナル抗ｎｅ
ｕ抗体のいずれかでコートした。Ｍａｂは炭酸緩衝液
（ｐＨ＝９．６）で希釈し、マイクロタイタープレート
の各ウエルに１００ｕｌを加えた。次に、プレートを３
７℃で一晩インキユベートした。インキユベート後、プ
レートを０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。続
いて抗ｎｅｕ抗体でコートされていないマイクロタイタ
ープレートのウエル部分をブロツクするために、２．５
％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を加えてプレートをインキ
ユベートした。プレートを３７℃で１時間インキユベー
トし、再度ＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡで３回洗浄した。
プレートを使用しない場合には使用時まで４℃で保存し
た。ｎｅｕ抗原の評価を行う標本は、正常細胞、前腫瘍
細胞、腫瘍細胞、または血清、血漿、あるいは尿などの
体液である。標本からｎｅｕ抗原を奪取するために、標
本をマイクロタイタープレートのウエル上にコートされ
た抗ｎｅｕＭａｂとインキユベートした。標本を２５℃
で一晩インキユベートした。一晩のインキユベーシヨン
後、プレートをＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡで６回洗浄し
て過剰の生物標本を除去した。ビオチンで標識した別の
抗ｎｅｕ Ｍａｂを各ウエルに加え、３７℃で１時間イ
ンキユベートした。プレートをＰＢＳ／０．１％ ＢＳ
Ａで６回洗浄した。ビオチン標識した抗ｎｅｕＭａｂを
検出するために、１：４０００に希釈したストレプトア
ビジンホースラデイツシユ−ペルオキシダーゼ溶液を加
えて３７℃で１時間インキユベートした。プレートをＰ
ＢＳ／０．０１％ＢＳＡで６回洗浄した。反応を完了さ
せるために、基質であるＯＰＤを加えて３７℃で１５分
インキユベートした。反応は硫酸で停止させ、ヌンク
（Ｎｕｎｃ）プレート読み取り機を用いて波長４９０ｎ
ｍでの吸光度を決定した。 Ｂ．キヤプチヤーアツセイを用いた細胞および腫瘍抽出
液由来のｎｅｕの検出 生体物質における本アツセイの有用性を評価するため
に、幾つかのキヤプチヤーイムノアツセイを行つた。第
１２図は、１次抗体にＴＡ−１、２次抗体にビオチン化
ＮＡ−３を用いたキヤプチヤーイムノアツセイの結果を
示している。細胞抽出液は幾つかのヒト細胞系から調製
した。ｎｅｕＲＮＡレベルは、これらの細胞系の幾つか
（ＳＫ−ＢＲ−３、ＺＲ−７５−１、ＭＣＦ−７）に関
して報告されている。本アツセイで検出されるｎｅｕ抗
原の相対的レベルは、報告されているＲＮＡデータと一
致する。ｎｅｕ抗原のレベルが既知の細胞系を用いたこ
れらのアツセイおよび他の幾つかのアツセイ（ここには
示していない）の結果から、本アツセイは細胞抽出液中
のｎｅｕ抗原の相対レベルを決定するために使用可能で
あることが示唆される。ｎｅｕ抗原の発現の違いを第１
２図に示されている腫瘍細胞系の分類に使用できること
も、この結果は示唆している。本アツセイが腫瘍抽出液
中のｎｅｕ抗原を検出できるかどうかを決定するため
に、ヌードマウス中でｎｅｕを発現している腫瘍細胞
（Ｘ−３−５）またはｎｅｕを発現していない腫瘍細胞
（３Ｔ３−ｒａｓ）を増殖させた。この二つのＮＩＨ３
Ｔ３由来細胞系は、Ｘ−３−５が発現されているヒトｎ
ｅｕ遺伝子を含むことを除いてはアイソジエニツクであ
る。第１３図は、ＮＢ−３を１次抗体とし、ビオチン化
されたＴＡ−１を検出用抗体として用いたキヤプチヤー
イムノアツセイの結果を示している。ｎｅｕ抗原はＸ−
３−５腫瘍抽出液で検出されたが、３Ｔ３ ｒａｓ腫瘍
抽出液では検出されず、本アツセイは腫瘍抽出液中のヒ
トｎｅｕ抗原を特異的に検出できることを示唆する。何
人かの研究者が、多くのヒト乳癌で高レベルで発現され
ていることを示した。ヒト乳癌中でｎｅｕが検出され得
るかどうかを決定するために、１個体から２つの試料を
調製した。抽出液を１人の患者のヒト乳癌（２７４７−
０１−０５０）および正常胸組織（２７４７−０１−０
５０）から調製した。本アツセイにおいて、ＴＡ−１を
１次抗体として、ビオチン化したＢＤ−５を検出用抗体
として使用した。第１４図はｎｅｕが腫瘍では検出され
るが、正常胸組織では検出されないことを示す。これら
のアツセイから、ｎｅｕキヤプチヤーイムノアツセイは
細胞または腫瘍抽出液からヒトｎｅｕ特異的に検出でき
ることが示された。これらのデータはまた、試料間の相
対的なｎｅｕレベルもこのアツセイで決定できることを
示唆している。 Ｃ．血漿および血清中のｎｅｕの検出 これらの実施例は、マウスおよびヒトの有する腫瘍由来
の血清および血漿中のｎｅｕ抗原の検出を例示するもの
である。ｎｅｕ抗原がヒト血清または血漿中で特異的に
認識されるかどうかを決定するために、幾つかのコント
ロール実験を行つた。ｎｅｕ抗原がヒト血清または血漿
中で特異的に検出され得るかどうかを決定するために、
幾つかのコントロール実験を行つた。これらには、ｎｅ
ｕを高レベルで発現する細胞系の培養液上清、および腫
瘍を有するヌードマウスの血清中のｎｅｕ抗原の検出が
含まれる。第１５図は、ＮＢ−３を１次抗体、ビオチン
化したＴＡ−１を検出抗体として用いて細胞系の培養液
上清のｎｅｕのキヤプチヤーイムノアツセイの結果を示
している。この結果から、ｎｅｕを高レベルで発現する
マウス細胞系（１８−３−７）あるいはヒト細胞系（Ｓ
Ｋ−ＢＲ−３）の上清にはｎｅｕ抗原が検出されたが、
ｎｅｕを発現していない細胞系である３Ｔ３−ｒａｓ、
あるいは培地のみには検出されないことが示された。こ
れらの細胞系のうち２つ（１８−３−７および３Ｔ３−
ｒａｓ）はヌードマウス中で腫瘍として増殖可能であ
る。これらの細胞系をヌードマウスに皮下注射して生じ
た腫瘍を有するマウスを継代し、ＴＡ−１を１次抗体、
ビオチン化したＢＤ−５を検出抗体として用いるキヤプ
チヤーイムノアツセイによつてその血清中のｎｅｕ抗原
の存在を解析した。本アツセイの結果を第１６図に示
す。細胞や腫瘍抽出液、および培養液上清のみと同様
に、腫瘍を持つヌードマウスの血清中にｎｅｕが存在す
ることがこのアツセイで示された。正常なヌードマウス
の血清および、ｎｅｕを発現しない腫瘍を持つヌードマ
ウスの血清は、ｎｅｕ抗原の存在は認められなかつた。
これらの実験から、ｎｅｕ抗原はｎｅｕ抗原を発現する
腫瘍を持つヌードマウスの血清中で検出されることが示
唆される。ｎｅｕ抗原はｎｅｕを発現するヒト細胞系
（ＳＫ−ＢＲ−３）およびヌードマウスの腫瘍を引き起
こす細胞系の上清で検出される。ｎｅｕを高レベルで発
現する腫瘍の患者はｎｅｕ抗原を含む血清を持つであろ
うという仮説を確かめるために、一連のアツセイをおこ
なつた。一つのアツセイ群では、抗ｎｅｕ Ｍａｂ Ｔ
Ａ−１をキヤプチヤー抗体として、ビオチンで標識した
ＢＤ−５を検出抗体として用いた。分析試料としては、
正常なヒト血漿および２人の乳癌患者からの血漿を用い
た。この結果から、正常な血漿および患者ＡＪＡＣから
の血漿は、本アツセイでは実質的に反応しなかつたが、
患者ＰＳＵＬからの血漿は本アツセイで顕著な反応性を
示し、ｐ１８５抗原は乳癌患者ＰＳＵＬの血清中に存在
することが示唆された（第１７図）。この実験をＭａｂ
ＮＢ−３をキヤプチヤー抗体（固相支持体に固定され
た物）、ビオチンで標識したＭａｂ ＴＡ−１を検出抗
体として、多数の患者に関して反復して行つた。このア
ツセイを用いて、３７の独立な血漿試料がｎｅｕ特異的
モノクローナル抗体との反応性に関して評価された。こ
れらの標本は、正常な人からの１２の血漿試料、良性胸
部疾患患者からの６血漿試料、乳癌患者からの１９血漿
試料が含まれた。第１８図は３グループの平均値（ｎｅ
ｕユニツト）を示している。正常および良性の場合は１
００−１１０の平均値を有し、１９の乳癌患者は約２０
０のｎｅｕ平均値を持つていた。表３は各試料に関して
得られた個々のデータを示している。乳癌患者の幾つか
のｎｅｕ値は、アツセイの上限を越えており、表３では
“５００＋”として示してある。これらの場合、試料を
さらに２倍に希釈し、アツセイを繰り返した。結果は括
弧で示してある。

【００３４】

【００３５】実 施 例 ８：軟寒天中のｎｅｕでトラ
ンスフオームされた細胞のＴＡ−１阻害 本実施例は抗ｎｅｕモノクローナル抗体がトランスフオ
ームされた細胞に細胞安定化効果がある可能性があるこ
とについて示すものである。ヒトｎｅｕ遺伝子をトラン
スフエクトされ、ｎｅｕを高レベルで発現しているマウ
ス繊維芽細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３）は軟寒天中でコロニー
を形成する。この性質はｎｅｕタンパク質の量およびそ
れの持つチロシンキナーゼ活性と直接関連する。ヒトｎ
ｅｕタンパク質の細胞外部分を認識するモノクローナル
抗体（Ｍａｂ）は、これらのタンパク質を細胞表面上で
クラスター化し、パツチを作らせ、続いて細胞中に内在
化させて、それによつてチロシンキナーゼ活性を減少さ
せると考えられる。我々は、Ｍａｂ ＴＡ−１を軟寒天
中で増殖しているｎｅｕでトランスフオームしたＮＩＨ
３Ｔ３細胞系（１７−３−１−３）に加えることによ
り、濃度に依存してこの細胞系で形成されるコロニー数
が減少することを示した。特に、ここで用いた最高濃度
のＴＡ−１（１５０μｇ／ｍｌ）では、形成されるはず
のコロニー数の５％以下しか形成されなかつた（未処理
のコントロール群では１５０のコロニーが形成されたの
に対し、７コロニー）。ＴＡ−１と同じマウスサブタイ
プ（いずれもＩｇＧ_１）に適合する非特異的なＭａｂは
１５０μｇ／ｍｌでも形成されるコロニーの数には影響
がなかつた。軟寒天中でコロニーを形成しない細胞は依
然として生育可能であることから、この増殖阻害効果は
細胞毒性のものではなく、細胞安定化するものだと考え
られる。この結果から、ヒトｎｅｕタンパク質を過剰発
現する腫瘍細胞にたいする抗体による毒性治療が示唆さ
れる。

【００３６】寄託 抗体産生細胞系ＢＤ−５−２ｄは、米国メリーランド州
ロツクビルのアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレク
シヨンに寄託されている。ＡＴＣＣ番号はＨＢ９６９８
である。

【００３７】同等のもの 本分野の技術者には理解されるように、通常の実験技術
を用いて、ここで特に述べた本発明の個々の態様と同等
の多くのものが可能である。このような同等物は以下の
請求の範囲に含まれることが意図されるものである。

【００３８】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は指示されているｎｅｕ遺伝子ｃＤＮＡを
ｐＳＶ２発現ベクターに挿入して構築したｐＳＶ２ ｎ
ｅｕの概略図である。

【図２】図２にはｐＳＶ２ｎｅｕを含む細胞株に特有な
電気泳動ゲルのパターンが示される。

【図３】図３は正常なラツトｎｅｕ遺伝子及び形質転換
したラツトｎｅｕ遺伝子の１９６８から２０７３のヌク
レオチド及び予想されるアミノ酸の配列を示す。

【図４】図４はａ）野生型（正常）、ｂ）正常ｎｅｕ遺
伝子の変異ｎｅｕ遺伝子、ｃ）ＤＨＦＲ Ｇ８から調製
したＤＮＡ、ｄ）ＴからＧへのトランスバージヨンが存
在する変異ｎｅｕ遺伝子の修飾型の塩基配列に対応する
核酸プローブのヌクレオチド配列を示す。

【図５】図５はｎｅｕトランスフエクタントから調製し
たＤＮＡに核酸プローブをハイブリダイゼーシヨンさせ
た後の電気泳動ゲルのパターンを示す。

【図６】図６は腫瘍細胞株及び正常なＢＤＩＸ ＤＮＡ
にオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーシヨ
ンさせた後の電気泳動ゲルのパターンを示す。

【図７】図７は１０個の独立した活性化ｎｅｕ遺伝子を
含む１４のトランスフエクタントを正常遺伝子（プロト
オンコジーン）に対応するオリゴヌクレオチド（上）又
はトランスフオーム能をもつ遺伝子（癌遺伝子）に対応
するオリゴヌクレオチド（下）で探査した後の電気泳動
ゲルのパターンを示す。

【図８】図８は２種類の頸部癌腫細胞株（ＭＥ１８０及
びＳＷ１７１０）のｃＤＮＡから構築した全長のｎｅｕ
ｃＤＮＡクローンの概略図である。

【図９】図９は２つのヒトｎｅｕベクター、指示された
ｎｅｕ遺伝子ｃＤＮＡをそれぞれｐＭａｘ発現ベクター
及びｐＭａｘ−Ｓｐｈ発現ベクターに挿入して構築した
ｐＭａｘｎｅｕ及びｐＭａｘ ｄｅｌｔａ ｎｅｕの概
略図である。

【図１０】図１０は指示されているｎｅｕ遺伝子の部分
をｐＧＥＭ発現ベクターに挿入して作成したハイブリダ
イゼーシヨンプローブの概略図である。

【図１１】図１１は指示されているｎｅｕ遺伝子ｃＤＮ
ＡをｐＬＪｄｅｌｔａ発現ベクターに挿入して作成した
プラスミドベクターｐＬＪ ｄｅｌｔａ ｎｅｕの概略
図である。

【図１２】図１２は捕捉ＥＬＩＳＡシステムを使つて、
多様なヒト胸部腫瘍細胞株からのライセートについてｎ
ｅｕ抗原の存在を検査した捕捉イミユノアツセイの結果
を示す。抗ｎｅｕモノクローナル抗体（ＴＡ−１）がｐ
１８５ｎｅｕ抗原の捕捉に、検出試薬としてビオチン標
識した抗ｎｅｕモノクローナル抗体ＮＡ−３が用いられ
た。

【図１３】図１３はｎｅｕを発現しているヌードマウス
の腫瘍のライセート（Ｘ−３−５）及びｎｅｕ陰性の腫
瘍のライセート（３Ｔ３／ｒａｓ）、ｐ１８５ｎｅｕ抗
原特異的な抗ｎｅｕモノクローナル抗体（ＮＢ−３）を
比較した結果（腫瘍ライセートのマイクログラム対光学
密度）を示す。

【図１４】図１４は正常なヒト胸部組織片（２７４７−
０１−０５０）又は胸部腫瘍（２４２７−０１−０５
０）から細胞のライセートを調製し、捕捉システムを用
いてｎｅｕ抗原の存在を検査した結果を示す。アツセイ
は捕捉用試薬として抗ｎｅｕモノクローナル抗体ＴＡ−
１を、ビオチン標識検出試薬としてモノクローナル抗体
ＢＤ−５を用いて行つた。

【図１５】図１５は１８−３−７細胞（ヒトｎｅｕ遺伝
子でトランスフオームし、細胞表面にｐ１８５蛋白質を
発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞）、３Ｔ３ ｒａｓ細胞
（ｒａｓ遺伝子でトランスフオームし、細胞表面にヒト
ｐ１８５蛋白質を発現していないＮＩＨ３Ｔ３細胞）及
びＳＫ−ＢＲ−３ヒト胸部腫瘍細胞の培養上澄と１０％
ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地の分析結果を示
す。捕捉イミユノアツセイでは、捕捉用試薬として抗ｎ
ｅｕモノクローナル抗体ＮＢ−３を、検出試薬としてビ
オチン標識したＴＡ−１を用いた。

【図１６】図１６は正常なマウスの血清（Ｔ１４４）、
ｐ１８５蛋白質を発現している腫瘍をもつマウスの血清
（１８−３−７マウス）及びｐ１８５蛋白質を発現して
いない腫瘍をもつマウスの血清（３Ｔ３（ｒａｓ））に
ついて、捕捉抗体として抗ｎｅｕモノクローナル抗体Ｔ
Ａ−１を、検出試薬としてビオチン標識した抗ｎｅｕモ
ノクローナル抗体ＢＤ−５を用いて捕捉イミユノアツセ
イを行つた結果を示す。

【図１７】図１７は捕捉試薬として抗ｎｅｕモノクロー
ナル抗体ＴＡ−１を、検出試薬としてビオチン標識した
ＢＤ−５を用いて捕捉イミユノアツセイを行つた結果を
示す。検査を行つた試料は正常なヒト体液及び二人の胸
部腫瘍患者から調製した体液を含む。

【図１８】図１８は三例のヒト患者から調製したｎｅｕ
癌遺伝子値の平均（ｎｅｕの単位）を図示したものであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/574 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/574 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 500028973 ホワイトヘッド・インスティチュート・フ ォア・バイオメディカル・リサーチ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02142, ケンブリッジ，ナイン・ケンブリッジ・セ ンター（番地なし) (72)発明者 ウェインバーグ，ロバート・エイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02146, ブルックリン，コプレイ・ストリート 25 (72)発明者 マザラ，ゲイル・ピー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02890, ウィンチェスター，マンチェスター，マン チェスター・ロード 10 (72)発明者 モーガン，ジョナサン・エイチ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02038, フランクリン，アローヘッド・レイン ３ (72)発明者 マッケンジー，サラ・ジェイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州01902, リン，オーシャン・ストリート 201 (72)発明者 マークス，ポーラ・ジェイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02146, ブルックリン，エバンス・ロード 93

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】哺乳類起源のｎｅｕプロトオンコジーンま
   たはオンコジーン中に存在するヌクレオチド配列と特異
   的に反応する核酸プローブ。
2. 【請求項２】（ａ）細胞からの核酸を、ｎｅｕプロトオ
   ンコジーンまたはオンコジーンのヌクレオチド配列に特
   異的な核酸プローブと、該プローブが特異的な核酸との
   ハイブリダイゼーションに適する条件下で接触させ；そ
   して （ｂ）核酸およびプローブの間のハイブリダイゼーショ
   ンのレベルを、細胞中の癌の存在の指標として調べる、
   ことよりなる、哺乳類細胞中の癌のアッセイ。
3. 【請求項３】（ａ）腫瘍細胞からのＤＮＡを単離し； （ｂ）該ＤＮＡを、ｎｅｕプロトオンコジーンまたはオ
   ンコジーン中に存在するヌクレオチド配列と反応する核
   酸プローブと、該プローブに特異的なＤＮＡとハイブリ
   ダイズするのに適する条件下で接触させ；そして （ｃ）ｎｅｕプロトオンコジーンまたはオンコジーンの
   ＤＮＡ増幅の指標として、ＤＮＡとプローブとのハイブ
   リダイゼーションの程度を調べる、ことよりなる、腫瘍
   細胞中のｎｅｕプロトオンコジーンまたはオンコジーン
   の増幅の検出方法。
4. 【請求項４】（ａ）腫瘍細胞からＲＮＡを単離し； （ｂ）該ＲＮＡを、ｎｅｕプロトオンコジーンまたはオ
   ンコジーン中に存在するヌクレオチド配列と反応する核
   酸プローブと、該プローブに特異的な核酸とハイブリダ
   イゼーションするのに適する条件下で接触させ；そして （ｃ）ｎｅｕプロトオンコジーンまたはオンコジーンの
   ＲＮＡ過剰発現の指標として、ＲＮＡとプローブとのハ
   イブリダイゼーションの程度を調べる、ことよりなる、
   腫瘍細胞中のｎｅｕプロトオンコジーンまたはオンコジ
   ーンの過剰発現の検出方法。