JP2001252068A - 培養細胞凍結用マルチウェルプレート - Google Patents
培養細胞凍結用マルチウェルプレートInfo
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- JP2001252068A JP2001252068A JP00757699A JP757699A JP2001252068A JP 2001252068 A JP2001252068 A JP 2001252068A JP 00757699 A JP00757699 A JP 00757699A JP 757699 A JP757699 A JP 757699A JP 2001252068 A JP2001252068 A JP 2001252068A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】マルチウェルプレート上で培養した細胞を凍
結、保存可能にし、解凍時の細胞接着率を高める。 【解決手段】マルチウェルプレートの肉厚を薄くし、か
つ細胞接着因子を細胞培養面に塗布、又は化学的に固定
し細胞との親和性、接着性を高める。
結、保存可能にし、解凍時の細胞接着率を高める。 【解決手段】マルチウェルプレートの肉厚を薄くし、か
つ細胞接着因子を細胞培養面に塗布、又は化学的に固定
し細胞との親和性、接着性を高める。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査や創薬、
バイオテクノロジーの分野で主に利用される、培養細胞
を用いたアッセイシステムに使用する凍結培養細胞にお
いて、培養基質上に培養された形態的特徴を維持したま
ま細胞を凍結し、長期保存可能になっている状態の動物
細胞を凍結解凍し細胞を用いた測定系に使用する細胞培
養用マルチウェルプレートに関するものである。
バイオテクノロジーの分野で主に利用される、培養細胞
を用いたアッセイシステムに使用する凍結培養細胞にお
いて、培養基質上に培養された形態的特徴を維持したま
ま細胞を凍結し、長期保存可能になっている状態の動物
細胞を凍結解凍し細胞を用いた測定系に使用する細胞培
養用マルチウェルプレートに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、臨床検査や創薬、バイオテクノロ
ジーの分野において、培養細胞を利用した細胞障害性や
毒性に関するテストが多く実施されている。こうしたテ
ストに用いられる細胞は、動物の組織から直接採取され
た初代細胞や、市販されている経代が可能な株細胞など
が用いられる。特に経代が可能な株細胞はその細胞の特
性を維持したままの凍結保存が可能であり、多数の種類
があるので良く使用されている。こうした培養細胞を用
いた細胞障害性や毒性に関するテストは、多数の検体を
一度に処理できるウェルを多数持つマルチウェルプレー
ト、特に９６ウェルのマルチウェルプレート（図１）を
培養容器として実施される場合が多い。
ジーの分野において、培養細胞を利用した細胞障害性や
毒性に関するテストが多く実施されている。こうしたテ
ストに用いられる細胞は、動物の組織から直接採取され
た初代細胞や、市販されている経代が可能な株細胞など
が用いられる。特に経代が可能な株細胞はその細胞の特
性を維持したままの凍結保存が可能であり、多数の種類
があるので良く使用されている。こうした培養細胞を用
いた細胞障害性や毒性に関するテストは、多数の検体を
一度に処理できるウェルを多数持つマルチウェルプレー
ト、特に９６ウェルのマルチウェルプレート（図１）を
培養容器として実施される場合が多い。
【０００３】一般的には、試験に用いる細胞を培養用シ
ャーレや培養用フラスコなどの培養容器上で多量に培養
した後、試験用の９６ウェルのマルチウェルプレートに
細胞数を調製して播種し直し、細胞がマルチウェルプレ
ートに接着、伸展して通常の培養形態を取ってから実際
のテストに用いられる。培養細胞を用いたテストでは、
細胞を必要量まで増殖させることに時間がかかり必要な
ときにすぐにテストが出来ない、また、いつでもテスト
を出来るようにするには常に多量の細胞を培養し維持し
てなければならない、といった問題点がある。まず第一
の問題点のすぐにテストが出来ないという点は、素早く
結果を出さなければならない臨床検査や創薬において重
要な問題である。また、第二の問題点であるすぐにテス
トするために多量の細胞を維持しておくことは、常に細
胞を培養するという時間と培養のための試薬類の無駄を
抱えることになる。
ャーレや培養用フラスコなどの培養容器上で多量に培養
した後、試験用の９６ウェルのマルチウェルプレートに
細胞数を調製して播種し直し、細胞がマルチウェルプレ
ートに接着、伸展して通常の培養形態を取ってから実際
のテストに用いられる。培養細胞を用いたテストでは、
細胞を必要量まで増殖させることに時間がかかり必要な
ときにすぐにテストが出来ない、また、いつでもテスト
を出来るようにするには常に多量の細胞を培養し維持し
てなければならない、といった問題点がある。まず第一
の問題点のすぐにテストが出来ないという点は、素早く
結果を出さなければならない臨床検査や創薬において重
要な問題である。また、第二の問題点であるすぐにテス
トするために多量の細胞を維持しておくことは、常に細
胞を培養するという時間と培養のための試薬類の無駄を
抱えることになる。
【０００４】通常、培養動物細胞は液体窒素中で凍結保
存されており、必要に応じて解凍、培養して使用される
が、凍結保存には凍結用ガラスやプラスチックチューブ
が用いられ、その中で細胞は単細胞で溶液中に分散され
た状態で凍結されている。これは、こうした球状に分散
した状態で細胞を保存することが最も安定に細胞を保存
する方法だからである。しかし、この方法では、凍結細
胞を溶解した後、細胞が必要量になるまで培養し続けな
ければいけない。
存されており、必要に応じて解凍、培養して使用される
が、凍結保存には凍結用ガラスやプラスチックチューブ
が用いられ、その中で細胞は単細胞で溶液中に分散され
た状態で凍結されている。これは、こうした球状に分散
した状態で細胞を保存することが最も安定に細胞を保存
する方法だからである。しかし、この方法では、凍結細
胞を溶解した後、細胞が必要量になるまで培養し続けな
ければいけない。
【０００５】こうした培養の手間と時間を省略すべく特
開平５−７７３８９号公報において、培養動物細胞を培
養基質に培養された状態で凍結する方法が示されてい
る。培養基質上で細胞を培養し、その形態を保ったまま
で凍結する方法である。特開平５−７７３８９号公報に
おいては実施例として３５ｍｍのプラスチック製培養皿
を用いて培養細胞の凍結を実施ており、良好な結果を得
たとしている。しかし、多くの場合、解凍後、細胞は生
きてはいるものの、シャーレやプレートから一部剥がれ
たりしており、すべての細胞が凍結前の接着した状態を
保つのは難しい状況である。特に、この技術は細胞を培
養することが目的でなく、その培養細胞を用いてアッセ
イする系で使用するため、生存している細胞はすべて同
じ状態でなければならない。従って、細胞の剥がれを防
止する方法を講じなければならない。
開平５−７７３８９号公報において、培養動物細胞を培
養基質に培養された状態で凍結する方法が示されてい
る。培養基質上で細胞を培養し、その形態を保ったまま
で凍結する方法である。特開平５−７７３８９号公報に
おいては実施例として３５ｍｍのプラスチック製培養皿
を用いて培養細胞の凍結を実施ており、良好な結果を得
たとしている。しかし、多くの場合、解凍後、細胞は生
きてはいるものの、シャーレやプレートから一部剥がれ
たりしており、すべての細胞が凍結前の接着した状態を
保つのは難しい状況である。特に、この技術は細胞を培
養することが目的でなく、その培養細胞を用いてアッセ
イする系で使用するため、生存している細胞はすべて同
じ状態でなければならない。従って、細胞の剥がれを防
止する方法を講じなければならない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、マルチウェ
ルプレート上で培養した細胞を凍結し、解凍時にマルチ
ウェルプレート内でのウェル毎の生存細胞の接着性を高
め、解凍後は細胞培養用または実験用マルチウェルプレ
ートとして活用することを目的とし、種々の検討を加え
た結果、本発明に至った。
ルプレート上で培養した細胞を凍結し、解凍時にマルチ
ウェルプレート内でのウェル毎の生存細胞の接着性を高
め、解凍後は細胞培養用または実験用マルチウェルプレ
ートとして活用することを目的とし、種々の検討を加え
た結果、本発明に至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、細胞
を培養した状態で培養器ごと凍結させ、必要時に解凍し
て培養するためのマルチウェルプレートであって、多数
の細胞を培養するための区画からなり、解凍時の解凍時
間を短縮するためにウェルの肉厚を０．５ｍｍ以下にし
たもので、解凍時に細胞を培養器表面に保持するために
その培養面に細胞接着因子を塗布することを特徴とする
培養細胞凍結用マルチウェルプレートである。
を培養した状態で培養器ごと凍結させ、必要時に解凍し
て培養するためのマルチウェルプレートであって、多数
の細胞を培養するための区画からなり、解凍時の解凍時
間を短縮するためにウェルの肉厚を０．５ｍｍ以下にし
たもので、解凍時に細胞を培養器表面に保持するために
その培養面に細胞接着因子を塗布することを特徴とする
培養細胞凍結用マルチウェルプレートである。
【０００８】
【発明の実施の形態】凍結させた培養細胞の解凍後の生
存率を高めるためには解凍に要する時間を短縮すること
が重要であることが必要である。その場合、多量の熱量
を加えれば解凍時間が短縮されることは明らかである。
しかし、本来の目的である解凍後の細胞を培養して使用
するためには、細胞が正常な状態で生存していることが
重要なポイントとなり、細胞の正常性を保つためには、
細胞の由来動物の体温（ヒトの場合３７℃）を越えて加
熱することが出来ない。これを越えて加熱すると蛋白質
の変成や、ストレス蛋白質の発現が生じ細胞が正常な状
態でなくなり、時には細胞死が生じるといった事態にな
る。従って、加温する環境温度は３７℃前後でなくては
ならない。
存率を高めるためには解凍に要する時間を短縮すること
が重要であることが必要である。その場合、多量の熱量
を加えれば解凍時間が短縮されることは明らかである。
しかし、本来の目的である解凍後の細胞を培養して使用
するためには、細胞が正常な状態で生存していることが
重要なポイントとなり、細胞の正常性を保つためには、
細胞の由来動物の体温（ヒトの場合３７℃）を越えて加
熱することが出来ない。これを越えて加熱すると蛋白質
の変成や、ストレス蛋白質の発現が生じ細胞が正常な状
態でなくなり、時には細胞死が生じるといった事態にな
る。従って、加温する環境温度は３７℃前後でなくては
ならない。
【０００９】通常、細胞培養用マルチウェルプレート
は、顕微鏡下での観察が可能なようにポリスチレン等の
透明樹脂で成形され、通常、１．５〜２．５ｍｍの厚み
を有している。この培養容器を用いた凍結培養容器を３
７℃インキュベーターに入れただけでは、肉厚があるた
め、解凍に時間がかかり、そのため、解凍後の細胞の生
存率が低くなり、細胞が使用に耐えない状態となる。特
にこの傾向はマルチウェルプレートの中央部でウェルが
多数集まっている部分で顕著に現れる。
は、顕微鏡下での観察が可能なようにポリスチレン等の
透明樹脂で成形され、通常、１．５〜２．５ｍｍの厚み
を有している。この培養容器を用いた凍結培養容器を３
７℃インキュベーターに入れただけでは、肉厚があるた
め、解凍に時間がかかり、そのため、解凍後の細胞の生
存率が低くなり、細胞が使用に耐えない状態となる。特
にこの傾向はマルチウェルプレートの中央部でウェルが
多数集まっている部分で顕著に現れる。
【００１０】上記の問題を解決する一つの方法として、
マルチウェルプレートを形成する樹脂を一般的に使用さ
れるポリスチレンから熱伝導率の良いプラスチック樹脂
に変えることと、マルチウェルプレートの肉厚を薄くす
ることが考えられる。熱伝導率の良い樹脂では、マルチ
ウェルプレート内部への熱伝導が可能となり少しでも早
く内部の凍結部位に熱が伝わることとなる。さらに肉厚
を薄くする事によってマルチウェルプレート自体を暖め
るために使われる熱量を少なくし、少しでも早く多く、
マルチウェルプレート内部の凍結物に熱を伝えようとす
るものである。
マルチウェルプレートを形成する樹脂を一般的に使用さ
れるポリスチレンから熱伝導率の良いプラスチック樹脂
に変えることと、マルチウェルプレートの肉厚を薄くす
ることが考えられる。熱伝導率の良い樹脂では、マルチ
ウェルプレート内部への熱伝導が可能となり少しでも早
く内部の凍結部位に熱が伝わることとなる。さらに肉厚
を薄くする事によってマルチウェルプレート自体を暖め
るために使われる熱量を少なくし、少しでも早く多く、
マルチウェルプレート内部の凍結物に熱を伝えようとす
るものである。
【００１１】こうして熱伝導を高め、素早い解凍を行っ
ても、先述したように、解凍後、細胞は生きてはいるも
のの、シャーレやプレートから剥がれて培養液中に浮い
たり、接着細胞がシート上になりそのシートの一部が剥
がれて丸まったりしており、こうした細胞の剥がれを防
止するためには細胞の基材への接着性を高めることであ
る。培養において細胞の接着を高める方法は種々ある
が、最も確実で簡便なのは、培養器の細胞接着領域（図
２）、具体的にはウェルの底面部に細胞接着因子を塗布
または固定化する方法である。細胞接着因子は、生体内
で実際に細胞が存在しているときに、その足場として存
在する蛋白質、ペプチドのことで、細胞との親和性、接
着性の高さは生体内での細胞の安定性で証明されてい
る。
ても、先述したように、解凍後、細胞は生きてはいるも
のの、シャーレやプレートから剥がれて培養液中に浮い
たり、接着細胞がシート上になりそのシートの一部が剥
がれて丸まったりしており、こうした細胞の剥がれを防
止するためには細胞の基材への接着性を高めることであ
る。培養において細胞の接着を高める方法は種々ある
が、最も確実で簡便なのは、培養器の細胞接着領域（図
２）、具体的にはウェルの底面部に細胞接着因子を塗布
または固定化する方法である。細胞接着因子は、生体内
で実際に細胞が存在しているときに、その足場として存
在する蛋白質、ペプチドのことで、細胞との親和性、接
着性の高さは生体内での細胞の安定性で証明されてい
る。
【００１２】細胞接着因子をプラスチック製品の表面に
塗布または固定化する方法は、単純に容器に目的とする
細胞接着因子溶液を入れ物理的な吸着により容器表面に
細胞接着因子を吸着させる方法、容器表面にプラズマ放
電や化学薬品の処理により水酸基やアミノ基、カルボキ
シル基等の官能基を導入し細胞接着因子の持つ反応性の
官能基群と化学的に結合させ表面に細胞接着因子を固定
化する方法などがある。
塗布または固定化する方法は、単純に容器に目的とする
細胞接着因子溶液を入れ物理的な吸着により容器表面に
細胞接着因子を吸着させる方法、容器表面にプラズマ放
電や化学薬品の処理により水酸基やアミノ基、カルボキ
シル基等の官能基を導入し細胞接着因子の持つ反応性の
官能基群と化学的に結合させ表面に細胞接着因子を固定
化する方法などがある。
【００１３】細胞接着因子を培養器に塗布するには、単
純に成形した成型物に細胞接着因子を含む溶液を分注し
て１時間から１晩放置して物理吸着させることも可能で
あるが、より吸着量を高めるには、プレートの培養表面
を、コロナ放電処理、プラズマ処理、又は酸化処理等を
施すことで細胞接着因子の吸着量や吸着の強度を変える
ことができる。
純に成形した成型物に細胞接着因子を含む溶液を分注し
て１時間から１晩放置して物理吸着させることも可能で
あるが、より吸着量を高めるには、プレートの培養表面
を、コロナ放電処理、プラズマ処理、又は酸化処理等を
施すことで細胞接着因子の吸着量や吸着の強度を変える
ことができる。
【００１４】化学結合で樹脂表面に細胞接着因子を固定
化するためには、培養器の培養領域に反応性の官能基を
導入する必要がある。こうした官能基を導入する方法と
しては、酸素、一酸化炭素、窒素、アンモニアを用いた
プラズマ放電処理が簡単で汎用性、生産性の点で優れて
いる。また、表面プラズマ重合等で官能基を多数持つポ
リマー（アクリル酸等）を重合させ、それを利用するこ
とも可能である。培養器側の官能基と細胞接着因子を化
学結合させるための方法としては、グルタルアルデヒド
等の化学架橋剤を用いる方法と、一方の官能基を活性化
させてもう一方の官能基と反応させる方法がある。一例
を挙げると、プレート表面に一酸化炭素プラズマ処理に
よりカルボキシル基を導入し、水溶性カルボジイミド
（ＷＳＣ）で活性化させたのち、直ちに細胞接着因子を
含む水溶液を入れ、細胞接着因子のアミノ基とのあいだ
でアミド結合を起こさせる。
化するためには、培養器の培養領域に反応性の官能基を
導入する必要がある。こうした官能基を導入する方法と
しては、酸素、一酸化炭素、窒素、アンモニアを用いた
プラズマ放電処理が簡単で汎用性、生産性の点で優れて
いる。また、表面プラズマ重合等で官能基を多数持つポ
リマー（アクリル酸等）を重合させ、それを利用するこ
とも可能である。培養器側の官能基と細胞接着因子を化
学結合させるための方法としては、グルタルアルデヒド
等の化学架橋剤を用いる方法と、一方の官能基を活性化
させてもう一方の官能基と反応させる方法がある。一例
を挙げると、プレート表面に一酸化炭素プラズマ処理に
よりカルボキシル基を導入し、水溶性カルボジイミド
（ＷＳＣ）で活性化させたのち、直ちに細胞接着因子を
含む水溶液を入れ、細胞接着因子のアミノ基とのあいだ
でアミド結合を起こさせる。
【００１５】簡便さでは物理吸着法であるが、細胞接着
因子の確実な保持や、分子量の小さな細胞接着因子には
化学結合法が適している。本発明においてはどちらをの
方法も使用することができる。細胞接着因子には、コラ
ーゲンI型やコラーゲンIV型に代表されるコラーゲン
類、細胞接着因子として広く認められているファイブロ
ネクチン、入手しやすく取り扱いも簡単なゼラチン、神
経細胞の培養に適しているポリ−Ｌ−リジン、生体内で
コラーゲンIV型と一緒に基底膜を形成しているラミニン
等、多種存在し、必要に応じてどれを用いても良い。ま
た、１種類だけでなく、２種類、３種類と細胞接着因子
を混合して使用することもできる。これらの細胞接着因
子は細胞により接着挙動が異なるため、本来ならば、培
養するそれぞれの細胞に適した細胞接着因子を探して用
いることが最も良い方法である。しかし現実問題として
個々の細胞に適した細胞接着因子を検索することは、そ
れだけでかなりの労力を割くこととなる。従って、既に
公知となっている細胞と細胞接着因子の組み合わせ（例
えばポリ−Ｌ−リジンと神経細胞）以外では、コラーゲ
ンI型コートが好適に用いられている。
因子の確実な保持や、分子量の小さな細胞接着因子には
化学結合法が適している。本発明においてはどちらをの
方法も使用することができる。細胞接着因子には、コラ
ーゲンI型やコラーゲンIV型に代表されるコラーゲン
類、細胞接着因子として広く認められているファイブロ
ネクチン、入手しやすく取り扱いも簡単なゼラチン、神
経細胞の培養に適しているポリ−Ｌ−リジン、生体内で
コラーゲンIV型と一緒に基底膜を形成しているラミニン
等、多種存在し、必要に応じてどれを用いても良い。ま
た、１種類だけでなく、２種類、３種類と細胞接着因子
を混合して使用することもできる。これらの細胞接着因
子は細胞により接着挙動が異なるため、本来ならば、培
養するそれぞれの細胞に適した細胞接着因子を探して用
いることが最も良い方法である。しかし現実問題として
個々の細胞に適した細胞接着因子を検索することは、そ
れだけでかなりの労力を割くこととなる。従って、既に
公知となっている細胞と細胞接着因子の組み合わせ（例
えばポリ−Ｌ−リジンと神経細胞）以外では、コラーゲ
ンI型コートが好適に用いられている。
【００１６】
【実施例】（実施例）透明塩ビシートをマルチウェルプ
レート状に加工したものを、紫外線滅菌し、ウェル底面
に０．２μｍの孔径のメンブレンフィルターで濾過滅菌
した塩酸酸性コラーゲンI型溶液０．０３％溶液を１時
間入れ、コラーゲンを塗布した。ヒト肝細胞癌由来株細
胞のＨｅｐＧ２細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地
（ＤＭＥＭ）に１０％のウシ胎児血清を加えた培養液で
１Ｘ１０5細胞／ｍＬに懸濁し、プレートの各ウェルの
１００μＬづつ分注した。（最終細胞濃度１Ｘ１０4細
胞／ウェル）細胞播種後プレートは、３７℃、炭酸ガス
濃度５％の炭酸ガス培養器中で一晩培養した。
レート状に加工したものを、紫外線滅菌し、ウェル底面
に０．２μｍの孔径のメンブレンフィルターで濾過滅菌
した塩酸酸性コラーゲンI型溶液０．０３％溶液を１時
間入れ、コラーゲンを塗布した。ヒト肝細胞癌由来株細
胞のＨｅｐＧ２細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地
（ＤＭＥＭ）に１０％のウシ胎児血清を加えた培養液で
１Ｘ１０5細胞／ｍＬに懸濁し、プレートの各ウェルの
１００μＬづつ分注した。（最終細胞濃度１Ｘ１０4細
胞／ウェル）細胞播種後プレートは、３７℃、炭酸ガス
濃度５％の炭酸ガス培養器中で一晩培養した。
【００１７】光学顕微鏡による形態観察で、細胞がプレ
ートに接着しているのを確認した後、培養液を、細胞凍
結保存用培地に交換し、−２０℃の冷凍庫で培養細胞ご
と凍結させた。凍結後は−８０℃の冷凍庫中で保存。−
８０℃の冷凍庫保存３日目に、凍結したプレートを冷凍
庫より取り出し、３７℃のインキュベーター中で、既に
３７℃に加温してあるプレート加温用のアルミブロック
の上で加温処理し、凍結を解凍した。解凍後そのままま
状態でプレート内に存在する細胞数を計測した。さら
に、プレート内をＰＢＳ２００μＬで３回洗浄し、生き
ている細胞でも剥がれた細胞や、剥がれ掛けている細胞
を除去した後、プレートの培養面に接着して残っている
細胞数を求めた。
ートに接着しているのを確認した後、培養液を、細胞凍
結保存用培地に交換し、−２０℃の冷凍庫で培養細胞ご
と凍結させた。凍結後は−８０℃の冷凍庫中で保存。−
８０℃の冷凍庫保存３日目に、凍結したプレートを冷凍
庫より取り出し、３７℃のインキュベーター中で、既に
３７℃に加温してあるプレート加温用のアルミブロック
の上で加温処理し、凍結を解凍した。解凍後そのままま
状態でプレート内に存在する細胞数を計測した。さら
に、プレート内をＰＢＳ２００μＬで３回洗浄し、生き
ている細胞でも剥がれた細胞や、剥がれ掛けている細胞
を除去した後、プレートの培養面に接着して残っている
細胞数を求めた。
【００１８】（比較例）透明塩ビシートをマルチウェル
プレート状に加工したものを、紫外線滅菌した。ヒト肝
細胞癌由来株細胞のＨｅｐＧ２細胞を、ダルベッコ改変
イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％のウシ胎児血清を加
えた培養液で１Ｘ１０5細胞／ｍＬに懸濁し、プレート
の各ウェルの１００μＬづつ分注した。（最終細胞濃度
１Ｘ１０4細胞／ウェル）細胞播種後プレートは、３７
℃、炭酸ガス濃度５％の炭酸ガス培養器中で一晩培養し
た。
プレート状に加工したものを、紫外線滅菌した。ヒト肝
細胞癌由来株細胞のＨｅｐＧ２細胞を、ダルベッコ改変
イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％のウシ胎児血清を加
えた培養液で１Ｘ１０5細胞／ｍＬに懸濁し、プレート
の各ウェルの１００μＬづつ分注した。（最終細胞濃度
１Ｘ１０4細胞／ウェル）細胞播種後プレートは、３７
℃、炭酸ガス濃度５％の炭酸ガス培養器中で一晩培養し
た。
【００１９】光学顕微鏡による形態観察で、細胞がプレ
ートに接着しているのを確認した後、培養液を、細胞凍
結保存用培地に交換し、−２０℃の冷凍庫で培養細胞ご
と凍結させた。凍結後は−８０℃の冷凍庫中で保存。−
８０℃の冷凍庫保存３日目に、凍結したプレートを冷凍
庫より取り出し、３７℃のインキュベーター中で加温処
理し、凍結を解凍した。解凍後そのままま状態でプレー
ト内に存在する細胞数を計測した。さらに、プレート内
をＰＢＳ２００μＬで３回洗浄し、生きている細胞でも
剥がれた細胞や、剥がれ掛けている細胞を除去した後、
プレートの培養面に接着して残っている細胞数を求め
た。
ートに接着しているのを確認した後、培養液を、細胞凍
結保存用培地に交換し、−２０℃の冷凍庫で培養細胞ご
と凍結させた。凍結後は−８０℃の冷凍庫中で保存。−
８０℃の冷凍庫保存３日目に、凍結したプレートを冷凍
庫より取り出し、３７℃のインキュベーター中で加温処
理し、凍結を解凍した。解凍後そのままま状態でプレー
ト内に存在する細胞数を計測した。さらに、プレート内
をＰＢＳ２００μＬで３回洗浄し、生きている細胞でも
剥がれた細胞や、剥がれ掛けている細胞を除去した後、
プレートの培養面に接着して残っている細胞数を求め
た。
【００２０】 解凍時間 細胞生存率 接着細胞生存率 実施例 ３分 ８２％ ７４％ 比較例 ３分 ７６％ ５８％
【００２１】上記のように、実施例１、２において凍結
状態の解凍時間には影響がないが、細胞生存率で数％で
あるが、表面にコラーゲンを塗布したほうが、細胞生存
率が高くり、それ以上に、剥がれた細胞、剥がれ掛けて
いる細胞を除いて接着細胞だけで生存率を計算するとコ
ラーゲン塗布の方が細胞生存率の落ち込みが８％、コラ
ーゲン塗布のない方が、１８％と大きな差がみられた。
状態の解凍時間には影響がないが、細胞生存率で数％で
あるが、表面にコラーゲンを塗布したほうが、細胞生存
率が高くり、それ以上に、剥がれた細胞、剥がれ掛けて
いる細胞を除いて接着細胞だけで生存率を計算するとコ
ラーゲン塗布の方が細胞生存率の落ち込みが８％、コラ
ーゲン塗布のない方が、１８％と大きな差がみられた。
【００２２】
【発明の効果】本発明の培養面に細胞接着因子を塗布し
た培養細胞凍結用マルチウェルプレートで細胞を培養す
ることにより、細胞を培養状態で凍結させられ、細胞が
必要な時に凍結融解させた際に剥がれる細胞が少なく、
細胞を用いた実験が安定に行えるので、細胞が増えるの
を待ったり、細胞を常に培養しておく必要が無く、時間
的、経済的な無駄を減らすことが出来る。
た培養細胞凍結用マルチウェルプレートで細胞を培養す
ることにより、細胞を培養状態で凍結させられ、細胞が
必要な時に凍結融解させた際に剥がれる細胞が少なく、
細胞を用いた実験が安定に行えるので、細胞が増えるの
を待ったり、細胞を常に培養しておく必要が無く、時間
的、経済的な無駄を減らすことが出来る。
【図１】細胞培養用のマルチウェルプレートの１例の斜
視図
視図
【図２】細胞培養用マルチウェルプレートのウェル断面
図
図
１１ 細胞培養用マルチウェルプレート １２ ウェル １３ マルチウェルプレート用プレート蓋 １４ ウェル内細胞培養領域
Claims (2)
- 【請求項１】 細胞を培養した状態で培養器ごと凍結さ
せ、必要時に解凍して培養するためのマルチウェルプレ
ートであって、多数の細胞を培養するための区画からな
り、解凍時の解凍時間を短縮するためにウェルの肉厚を
０．５ｍｍ以下にしたもので、解凍時に細胞を培養器表
面に保持するためにその培養面に細胞接着因子を塗布、
または化学結合により保持することを特徴とする培養細
胞凍結用マルチウェルプレート。 - 【請求項２】 マルチウェルプレートが、プラスチック
樹脂からなり、細胞接着因子がコラーゲン、ラミニン、
フィブロネクチンなどからなる細胞外マトリックス、ポ
リ−Ｌ−リジン等のポリペプチドである請求項１記載の
培養細胞凍結用マルチウェルプレート。
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