JPH06277037A - 動物組織細胞培養用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明は、動物の組織または細胞の各種薬剤に
対する感受性試験、薬効試験、または、医薬品、化粧
品、医療材料等の細胞毒性試験のために三次元的に成育
させることを目的とする組織細胞培養用キットを提供す
る。 【構成】コラ−ゲン等の細胞外マトリックスを、内部底
面に接着させ、側壁面には密着させないように配置した
培養容器からなる動物組織細胞培養用キット。 【効果】従来法では正確に判定できなかった動物の組織
や細胞でも薬剤感受性試験や細胞毒性試験を容易に実施
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、動物の組織または細胞
の各種薬剤に対する感受性試験、薬効試験、または、医
薬品、医療材料、化粧品等の細胞毒性試験のために三次
元的に成育させることを目的とする組織細胞培養用キッ
トに関する。さらに詳しく述べると、生体内の器官、組
織、あるいはそれらから得られた細胞を三次元的に増殖
させ、組織構築を維持した生体内に近い環境を提供でき
る培養用容器を用いた薬剤感受性試験、薬効試験、また
は細胞毒性試験を行なうことのできるキットに関する。

【０００２】

【従来技術および発明が解決しようとする課題】動物の
組織の一部または組織を構成する細胞を動物の体外に取
り出してガラスやプラスチック等の容器内で成長ないし
増殖させることが可能となったが、一般に組織から取り
出し培養した細胞は長期にわたって本来の状態を保って
培養を続けることができるわけではない。近年、手術や
生検によって得られたヒト腫瘍を培養することによって
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける腫瘍細胞の抗腫瘍剤感受性の
研究が可能となったが、単離した腫瘍細胞の培養に際し
ては、一般的に知られている単層培養法や浮遊培養法で
は、生体内における細胞特徴である三次元的な増殖、す
なわち組織構築が維持できないことや、蛋白質分解酵素
等で処理して単離された細胞は当該細胞のもつ本来の性
質を保持しているとはいえない。

【０００３】例えば、抗腫瘍剤の感受性試験においては
生体内での当該抗腫瘍剤の効果を適切に反映しない場合
が少なくなく、また、最近積極的に行なわれるようにな
ってきた動物実験の代替法としての各種細胞を用いた細
胞毒性試験においても同様な問題点が指摘されており、
これらの試験を適切に行なえる細胞培養法の確立が望ま
れていた。

【０００４】これらの問題点を解決するため、各種の試
験に適する細胞培養法に関する試みがなされてきた。そ
の中で、コラ−ゲンゲル上に単層培養し該ゲルを培養液
中に浮遊させて培養する浮遊コラ−ゲンゲル培養法を用
いる試験法が考案されたが、乳腺上皮細胞等の培養には
有用ではあるが、細胞の長期間の維持が困難である等の
理由から、一般的な感受性試験や毒性試験用には不適当
な方法とされていた。近年、コラ−ゲンゲル包埋培養法
を用いることにより細胞の三次元的な増殖が可能とな
り、ｉｎ ｖｉｖｏでの効果を忠実に再現する方法とし
て利用されつつある。しかしながら、この方法でも固形
腫瘍等の臨床材料を用いて感受性試験に供する際、酵素
溶液を用いた細胞分画が必要となるため、腫瘍細胞のも
つ本来の性質を正しく保持していないのではないかと疑
問視されている。また、毒性試験においても、同様な観
点から、培養細胞系や臓器モデル系での結果がｉｎ ｖ
ｉｖｏの毒性を正しく予知しているかについても議論の
わかれるところにある。

【０００５】これらの問題点を克服できる培養法とし
て、ホフマンらは手術または生検で得られた腫瘍組織切
片を細胞分画処理せずにそのままスポンジ状のコラ−ゲ
ンゲルマトリックス上に静置培養させることを特徴とす
る三次元培養法を報告した［プロシ−デイングス ナシ
ョナル アカデミイ サイエンス ユウエスエイ（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８３
巻，２６９４頁（１９８６年）］。その手法に従って培
養した腫瘍細胞を組織学的に検討した結果、三次元的増
殖と組織構築が保持されていることが判明したことか
ら、各種抗腫瘍剤の感受性試験に臨床応用されるに至っ
ている。しかし、薬剤の感受性試験や毒性試験に際し、
用いるスポンジ状のコラ−ゲン等のゲルマトリックスを
無菌的にプレ−ト内に組み込む操作は面倒で、一度に多
数の検体を扱うためには多くの問題が残っている。

【０００６】本発明は、細胞の薬剤感受性試験や毒性試
験に適する動物組織細胞培養用キットを提供することを
目的とする。すなわち、患者から手術または生検で得ら
れた腫瘍組織等を三次元的に増殖させる組織細胞培養用
容器を用い、当該患者に投与すべき有効に作用する抗腫
瘍剤の選択を行なわしめる薬剤感受性試験用の組織細胞
培養キットの提供、動物実験の代替として臓器モデル系
または培養細胞系を三次元的に増殖させる組織細胞培養
用容器を用いた細胞毒性試験用の組織細胞培養用キット
を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため、細胞の三次元的増殖と組織内構築が保持
されるようなコラ−ゲン等の細胞外マトリックスを配置
した培養用容器と、これに培地や試験に必要な試薬類や
器具類をセットした次の１）〜７）の如く、細胞の成育
および試験の遂行と判定を容易に行なうことができる動
物組織細胞用キットを完成するに至ったものである。

【０００８】１）細胞外マトリックスを、培養容器の内
部側壁面に密着しないように配置した動物組織細胞培養
用キット。 ２）細胞外マトリックスを、培養容器内部底面に接着し
た１）に記載の動物組織細胞培養用キット。 ３）細胞外マトリックスが、スポンジ状である１）ない
し２）に記載の動物組織細胞培養用キット。 ４）キットが、トレイ、シャ−レ、または、多穴プレ−
トのいずれかの培養容器を含む１）ないし３）に記載の
動物組織細胞培養用キット。 ５）キットが、培地用、細胞外マトリックス分解用、生
細胞判定用の試薬類を含む１）ないし４）に記載の動物
組織細胞培養用キット。 ６）キットが、生検用の器具類を含む１）ないし５）に
記載の動物組織細胞培養用キット。 ７）スポンジ状の細胞外マトリックスの一つの面に極く
少量の薄い酸性水溶液を加え、当該スポンジ面と培養容
器内底面とを接着固定させた１）ないし６）に記載の動
物組織細胞培養用キットに使用される細胞外マトリック
ス入り培養容器の製造方法。

【０００９】以下に本発明を詳細に説明する。本発明に
おける培養容器の内部に配置する細胞外マトリックスと
しては、例えば、ヘルスデザインインダストリ−ズ（Ｈ
Ｄｉ）社から発売されているブタ皮膚起源のコラ−ゲン
スポンジであるスポンゴスタン（登録商標）やアップジ
ョン社から発売されているゼラチンスポンジであるゼル
フォ−ム（登録商標）等を無菌的に切断して用いること
ができる。また、各種動物組織から抽出、精製したコラ
−ゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞外マトリ
ックスより再構成させた滅菌ゲルマトリックスやこれら
の細胞外マトリックスを組み合わせたバイオマトリック
スを用いることも可能である。

【００１０】代表的な細胞外マトリックスであるコラ−
ゲンの起源としては、ラットの尾腱、ウシの皮膚や腱、
ブタの皮膚や腱等々があげられる。コラ−ゲンゲルマト
リックスの調製にはペプシン等の酵素処理したアテロコ
ラ−ゲンを用いるのが好ましい。コラ−ゲンゲルマトリ
ックスの調製は常法に従って行なえばよいが、細胞の増
殖に悪影響を及ぼす因子を含まない精製度の高いアテロ
コラ−ゲンを用いることが望ましい。

【００１１】培養容器の内部に配置する細胞外マトリッ
クスは、その内側の形状に合致するサイズのものではな
く、培養液等の交換を行ない易くするためのピペット等
の先端が容器の底面まで入りこめるようなスペ−スを有
する、容器の内部側壁と完全に密着しないように成形し
たものがよい。

【００１２】容器内に配置する細胞外マトリックスは、
細胞増殖がしやすいこと、室温で保存可能となること、
輸送時に形状が乱れないこと、培養液の交換の操作が容
易となること等の理由から、スポンジ状のものが好まし
い。

【００１３】また、培養容器の内部に配置するスポンジ
状の細胞外マトリックスを、細胞の増殖や当該容器に悪
影響を及ぼさない成分からなる接着剤等、例えば、医療
用の合成樹脂等を用いて容器内底面と無菌的に固定させ
ておけば、本発明のキットの製作中や輸送中に生ずる静
電気によるスポンジの培養容器蓋へのランダムな付着か
ら回避できるし、当該細胞外マトリックスの洗浄や培養
液交換等も容易に行なうことができる。また、培養容器
の種類によっては、当該培養容器内で細胞外マトリック
スを部分的に溶解させることによっても当該細胞外マト
リックスと容器内底面とを接着固定させることも可能で
ある。

【００１４】本発明において、スポンゴスタンを配置し
た多穴プレ−トを製造する場合には、スポンゴスタンを
無菌的に均等な形に切断し、プレ−トの各穴に無菌的に
配置し、接着固定、蓋をかぶせたのち包装し、試験に供
するまで室温に保存しておけばよい。この場合、細断し
たスポンゴスタンの一つの面に極く少量の薄い酸性水溶
液を加えることによって、コラ−ゲンを部分的に溶解さ
せることができ、即座にその面をプレ−トの底面に配置
すれば、スポンゴスタンを容器底面と接着固定すること
が可能となる。この接着に用いる酸の種類は、スポンゴ
スタンを部分的に溶解させることのできるものであれば
特に限定されない。また、ゼルフォ−ム等、他の細胞外
マトリックスを配置した多穴プレ−トも、スポンゴスタ
ンを配置した多穴プレ−トの場合と同様な手法で製造す
ることができる。

【００１５】本発明において用いる培養容器は、一般的
な動物細胞の培養に利用されている滅菌済のトレイ、シ
ャ−レ、多穴プレ−ト等であれば、材質、サイズ、穴の
数等は特に限定されるものではない。

【００１６】本発明による薬剤感受性試験用キットにお
ける効果判定法としては、一般的に知られている生細胞
判定試験法を用いればよく、特に限定されないが、操作
が比較的簡便でＤＮＡ合成期以外の細胞の生存数も計測
可能であるＭＴＴ［３−（４，５−ジメチル−２−チア
ゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ テトラゾリウム
ブロミド］試験法が好ましい。それ故、本キットに
は、該試験に必要な分量のＭＴＴ試薬を同一包装にセッ
トしておくと好都合である。

【００１７】薬剤感受性試験に際しては、例えば、腫瘍
組織または腫瘍細胞に対する抗腫瘍剤の感受性試験を行
なう場合には、公知の方法に準拠して行なえばよい［癌
と化学療法、１８巻、２３９頁、１９９１年］。すなわ
ち、培養容器内に配置した細胞外マトリックスに検体の
生育に適する培養液を十分浸透させ、その上に細切した
腫瘍組織を重量測定後に静置し、炭酸ガス培養器内で３
〜４日間培養を行なった後、各種濃度の抗腫瘍剤を加
え、引き続き３日間培養を継続させるとよい。薬剤の効
果は、培養終了液にＭＴＴ溶液を加え、同時に当該細胞
外マトリックス内に浸潤、増殖した細胞の生存率も評価
するためのコラゲナ−ゼ等の酵素処理により当該細胞外
マトリックスを完全に溶解させ、生細胞との反応により
生成したＭＴＴ−ホルマザン量を５４０ｎｍにおける吸
光度で測定、腫瘍阻止率を算出することにより判定すれ
ばよい。すなわち、抗腫瘍効果は、当該細胞外マトリッ
クス上に移植した腫瘍１０ｍｇに対する対照群の吸光度
（Ｃ）と薬剤処置群の吸光度（Ｔ）を求め、腫瘍阻止率
（％）＝（１−Ｔ／Ｃ）×１００ なる計算式で算出
し、判定すればよい。

【００１８】細胞毒性試験に際しては、培養容器内に配
置した細胞外マトリックスに検体細胞の生育に適する培
養液を十分浸透させ、その上に適宜選択した細胞を接種
し、３〜４日間培養を行なった後、評価すべき化学物質
を添加し、引き続き２〜３日間培養を継続させるとよ
い。効果判定は、当該細胞外マトリックス内に増殖した
細胞に対する評価もするためのコラゲナ−ゼ等の酵素に
よる細胞外マトリックス分解処理の操作を加える以外
は、一般的に実施されている方法に従って行なえばよ
い。次に、本発明の培養用キットを用いた実施例につい
て具体的に説明する。

【００１９】

【実施例１】スポンゴスタンを無菌条件下、１ｃｍ角に
切断し、それぞれのサイコロ状の細断スポンゴスタン
を、予め１０μｌの０．１ｍＭ塩酸（滅菌済）を無菌的
に滴下しておいた２４穴プラスチックプレ−トの各穴の
底面に配置することにより、スポンゴスタンを容器穴の
底面に接着固定させた。プレ−トの各穴へのスポンゴス
タンの配置終了後、プレ−トに蓋をし、試験に供するま
で冷暗所に保管した。

【００２０】

【実施例２】本発明のキットを用い、ヌ−ドマウス可移
植性ヒト胃癌細胞ＭＫ−Ｋ株に対する抗腫瘍剤シスプラ
チンの感受性試験を以下の如く行なった。プレ−トの各
穴に配置した細断スポンゴスタンを、１０％ウシ胎児血
清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を十分に浸透させた。次
に、スポンゴスタン上に１〜２ｍｍ角に細切したヒト胃
癌細胞ＭＫ−Ｋ株５〜１０ｍｇをそれぞれの重量を測定
したのち静置し、炭酸ガス培養器内で４日間培養を行な
った。さらに、２５μｇ／ｍｌのシスプラチンを含む同
一培地に交換し、引き続き３日間培養を継続させた。本
薬剤の効果は、培養終了液に２ｍｇ／ｍｌとなるよう調
製したＭＴＴ試薬のりん酸緩衝液溶液を０．２ｍｌ加
え、同時にスポンゴスタン内に浸潤、増殖した細胞の生
存率も評価するために、１％コラゲナ−ゼ水溶液を０．
１ｍｌを加えてスポンゴスタンを完全に溶解させ、３７
℃で４時間反応後、プレ−トを遠心し、生細胞において
生成したＭＴＴ−ホルマザンを１ｍｌのジメチルスルホ
キシドに溶解、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
シスプラチンを加えて培養した場合の腫瘍１０ｍｇに対
する吸光度は０．０４２±０．０２３、加えなかった場
合の値は０．５０２±０．０１８であり、抗腫瘍阻止率
は９２％と計算できた。

【００２１】

【実施例３】ヌ−ドマウス可移植性ヒト胃癌細胞株を用
い、臨床で頻用されている抗腫瘍剤に対する感受性試験
を、実施例２に準拠して実施した。この場合の各抗腫瘍
剤の添加濃度は臨床投与時の最大血濃度の１０倍量とし
た。検討した抗腫瘍剤とその濃度（μｇ／ｍｌ）は、ア
ドリアマイシン（６）、エトポシド（３４０）、シスプ
ラチン（２５）、マイトマイシンＣ（１５）であった。
比較対照として、最大耐量を用いたヌ−ドマウス法での
感受性試験も実施した。後者の試験における各抗腫瘍剤
の投与量（ｍｇ／ｋｇ）は、アドリアマイシン（８）、
エトポシド（１５）、シスプラチン（８）、マイトマイ
シンＣ（６）、アドリアマイシン（８）であった。その
結果、臨床投与時の最大血中濃度の１０倍量での本キッ
トを用いた感受性試験の結果と、最大耐量でのヌ−ドマ
ウス法を用いた感受性試験結果とは高い相関係数を示
し、その相関係数は、アドリアマイシンが０．９２、エ
トポシドが０．９１、シスプラチンが０．８６、マイト
マイシンＣが０．８７であった。

【００２２】

【実施例４】手術または生検によって得られた臨床検体
をスポンゴスタンを組み込んだ本発明のキットを用い
て、実施例３と同様にして、感受性試験を行った結果、
胃癌や肺癌に対してはマイトマイシンＣ、シスプラチン
が、脳腫瘍に対してはニトロソウレア系化合物が、膀胱
腫瘍に対してはシスプラチンが高い感受性を示した。

【００２３】

【発明の作用効果】本発明における細胞外マトリックス
を配置した培養容器は、細胞間相互作用がある場合の薬
剤感受性試験や細胞毒性試験の細胞培養用に適し、さら
に、新規な薬剤等を開発する際のスクリ−ニング等にも
有用である。また、本発明の培養用キットは生体内の状
態に近い条件での細胞培養が可能であることから、臨床
効果を正確に予言することができる抗腫瘍剤の選択に利
用されるばかりでなく、癌の転移・浸潤等の研究や有効
な抗腫瘍剤等の薬剤の開発等にも大きな貢献をもたらす
ものである。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】細胞外マトリックスを、培養容器の内部側
   壁面に密着しないように配置したことを特徴とする動物
   組織細胞培養用キット。
2. 【請求項２】細胞外マトリックスを、培養容器内部底面
   に接着したことを特徴とする請求項１に記載の動物組織
   細胞培養用キット。
3. 【請求項３】細胞外マトリックスが、スポンジ状である
   ことを特徴とする請求項１ないし請求項２に記載の動物
   組織細胞培養用キット。
4. 【請求項４】キットが、トレイ、シャ−レ、または、多
   穴プレ−トのいずれかの培養容器を含む請求項１ないし
   請求項３に記載の動物組織細胞培養用キット。
5. 【請求項５】キットが、培地用、細胞外マトリックス分
   解用、生細胞判定用の試薬類を含むことを特徴とする請
   求項１ないし請求項４に記載の動物組織細胞培養用キッ
   ト。
6. 【請求項６】キットが、生検用の器具類を含むことを特
   徴とする請求項１ないし請求項５に記載の動物組織細胞
   培養用キット。
7. 【請求項７】スポンジ状の細胞外マトリックスの一つの
   面に極く少量の薄い酸性水溶液を加え、当該スポンジ面
   と培養容器内底面とを接着固定させることを特徴とする
   請求項１ないし請求項６に記載の動物組織細胞培養用キ
   ットに使用される細胞外マトリックス入り培養容器の製
   造方法。