WO2006109367A1 - 細胞遊離法、細胞遊離液、細胞培養法、細胞培養液、細胞液、細胞液製剤、細胞定着法及び細胞定着液 - Google Patents

細胞遊離法、細胞遊離液、細胞培養法、細胞培養液、細胞液、細胞液製剤、細胞定着法及び細胞定着液 Download PDF

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ratatopherin
culture
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Toshiaki Ishii
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Obihiro University Of Agriculture And Veterinary Medicine
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin

Definitions

  • Cell release method cell release solution, cell culture method, cell culture solution, cell solution, cell solution preparation, cell fixing method and cell fixing solution
  • the present invention relates to a cell release method, a cell release solution, a cell culture method, a cell culture solution, a cell solution, a cell solution preparation, a cell fixing method and a cell fixing solution using ratatopherin.
  • trypsin is generally contained in the culture medium.
  • a method is used in which cells are detached by adding a proteolytic enzyme such as the above, and dissolving the joint of the cultured cells with the culture dish.
  • a method of peeling cells by spraying a flow of a culture solution on the cells to be peeled and flushing the cells is sometimes used.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-75547
  • Patent Document 2 JP-A-8-66184
  • a problem to be solved is that a method for culturing and growing adherent animal cells normally in a floating state and re-establishing the cultured and grown adherent animal cells in a desired place has not been established. .
  • the cell release method according to the present invention comprises culturing in a cell culture solution in a state where the adherent animal cells are adhered to the surface of the carrier, and then the cell release solution containing ratatopherin and the cell culture.
  • the serum concentration is 5 to 20% because the serum concentration is less than 5% or 20%. This is because if it exceeds, there is a disadvantage that the proliferation rate of the cells decreases.
  • the concentration of ratatopherin was set to 10 to 500 M because the cell release effect was small when the concentration of ratatopherin was less than 10 M, and the cell release effect was saturated when the concentration exceeded 500 M.
  • the components obtained by removing lactofrin from the cell free solution may be substantially the same as the components of the cell culture solution in that the released cells can be cultured as they are. I like it.
  • the cell release solution according to the present invention is characterized in that it comprises a cell culture solution containing at least 1 to ratatopherin: LOmM.
  • the concentration of ratatopherin in the culture solution was set to 1 to LOmM because it is easy to use if the ratatopherin concentration is within this range.
  • the cell culture method according to the present invention is characterized in that adherent animal cells are cultured in a suspended state in a cell culture solution containing 5 to 20% serum and 10 to 500 M ratatopherin. is there.
  • the concentration of ratatopherin in the culture medium is preferably 10 to 500 M.
  • the ratatopherin concentration of 10-500 ⁇ was established when the concentration of ratatopherin was less than 10 ⁇ , and the effect of floating cells was reduced, and when it exceeded 500 ⁇ 500, the effect of floating cells was established. Is saturated.
  • the cell culture medium according to the present invention is characterized by containing 5 to 20% of serum and 10 to 500 liters of ratatopherin.
  • the reason that the serum concentration is 5 to 20% is also the force that causes the disadvantage that the cell growth rate decreases when the serum concentration is less than 5% or more than 20%.
  • the concentration of ratatopherin in the culture medium was 10 to 500 ⁇ . If the concentration of lactoferrin was less than 10 ⁇ , the effect of suspension culture of cells was reduced, and if the concentration exceeded 500 ⁇ This is because the effect of floating culture is saturated.
  • the cell fluid according to the present invention is characterized in that it comprises a cell culture fluid containing 5 to 20% serum, 10 to 500 ratatopherin, and adhering animal cells in a suspended state. is there.
  • the reason that the serum concentration is 5 to 20% is that when the serum concentration is less than 5% or exceeds 20%, there is a disadvantage that the cell viability decreases.
  • the concentration of ratatopherin in the culture broth was 10 to 500 ⁇ . If the concentration of ratatopherin was less than 10 ⁇ , the effect of floating the cells was reduced, and if it exceeded 500 ⁇ 500, This is because the effect of floating is saturated.
  • the cell fluid preparation according to the present invention comprises a syringe barrel and a cell fluid filled in the syringe barrel, and the cell fluid comprises 5 to 20% serum and 10 to 500 / ratatopherin. It contains ⁇ M and further contains adherent animal cells in a suspended state.
  • the reason why the serum concentration is 5 to 20% is that if the serum concentration is less than 5% or more than 20%, the cell viability decreases.
  • the concentration of ratatopherin in the culture medium was set to 10 to 500 M. If the concentration of ratatopherin was less than 10 M, the effect of floating the cells was reduced, and the cells floated when the concentration exceeded 500 M. This is because the effect is saturated.
  • the cell solution containing the adhering animal cells in the floating state and ratatopherin is placed in the planned fixing portion, and then the culture solution not containing ratatophorin is added to the fixed fixing portion.
  • the concentration of ratatophosphorin in the cell solution reduced in concentration by a culture solution not containing ratatopherin is preferably less than 10 ⁇ . Below 10 cm, suspension cell colonization is a significant force.
  • a cell solution containing adhering animal cells in a floating state is placed in a part to be fixed, and then the cell of the adhesive animal cell is put into the cell liquid in the part to be fixed.
  • a cell colonization method in which a deadline substance that abolishes stray effects is added to fix the adherent animal cells to the area to be fixed, wherein the cell fluid is 5 to 20% serum and 10 to 500 ⁇ ⁇ ratatopherin. It is characterized by including.
  • the cell fixing solution a culture solution containing glycosaminodarlican can be used.
  • the concentration of glycosaminodarlican in the cell solution when the adherent animal cells in a floating state are fixed is preferably 10 to 500 gZml. This is because if the concentration of glycosaminoglycan is less than 10 ⁇ gZml, the effect of fixing floating cells is insufficient, and if it exceeds 500 gZml, the effect of fixing floating cells is saturated.
  • the cell fixing solution according to the present invention contains glycosaminodarlican in the culture solution! It is characterized by this.
  • a fixing material for fixing an adherent animal cell is coated on a portion to be fixed, and then a cell solution containing the adhering animal cell in a floating state is fixed.
  • an extracellular matrix protein can be used as the inactivating agent.
  • laminin can be used when the floating cell is a nerve cell, and fibronectin or collagen is used when the floating cell is an epithelial cell or fibroblast. can do.
  • the culture vessel refers to all vessels that can hold and culture cells, such as culture dishes and culture flasks.
  • the adherent animal cells refer to, for example, nerve cells, glial cells, epithelial cells, various undifferentiated cells (mesenchymal cells, stem cells, etc.), cancer cells and the like.
  • the culture solution includes not only a nutrient containing cells to grow but also a simple one that retains cells such as physiological saline.
  • cells that float and adhere to cells have a higher cell proliferation ability than cells that can be cultured normally in a suspended state. There is an effect that normal cells having no cell can be obtained rapidly and in large quantities.
  • the cells can be cultured in a suspended state, there is an effect that the cultured cells can be easily transported and transported.
  • the floating state can be obtained by a simple method of diluting ratatopherin, transferring a culture solution to a laminin-coated incubator, or adding glycosaminodarlican. There is an effect that a fixed cell can be easily obtained from the cell.
  • ratatoferrin is a milky protein! It is a protein with a molecular weight of about 80 kD, has various sugar chain structures and affinity, and proteins on the cell surface are glycosaminoglycans. It has been attracting attention for its various properties such as its ability to bind to bacteria, suppression of microbial infections such as bacteria, viruses and protozoa, and anti-inflammatory action.
  • the present inventor is widely used in the study of nerve cells for the purpose of investigating the effects of ratatopherin on nerve cells, and is used in the medium of PC 12 cells derived from rat adrenal medullary pheochromocytoma. (bLl) was added and the effect was investigated.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • 5% (v / v) unheated horse serum, 5% (v / v) burned fetal bovine serum ⁇ 1 X 10 5 units / l penicillin G Sodium, 1 X 10 mg / 1 streptomycin sulfate, 0.044M NaHCO ⁇ , and PC 12 cells were
  • usilatatofurin (bLl) was added to the culture solution in the culture dish so that the concentration in the culture solution was 0 to 500 / ⁇ M.
  • Ushiratatoferrin (bLl) added to the culture solution was diluted in advance with the culture solution.
  • the concentration of usilatatoferin (bLl) in the diluent is 1 ⁇ : LOmM is easy to use.
  • Ratatopherin is not diluted with a culture solution, but may be diluted with a solution containing no nutrients such as physiological saline.
  • ushiratatoferin (bLl) is positively charged with a molecular weight of about 80 kD, so it is possible that these physical properties may have the above-mentioned effects. Therefore, in order to confirm that the above action is specific to usilatatopherin (bLl), instead of usilatatoferin (bL1), the molecular weight is increased in the same way as usilatatoferrin (bLl).
  • PC12 cells were cultured for 72 hours in the same manner as in Example 1, and then ushirataferin (bLl) was added to the culture medium in the culture dish so that the concentration in the culture medium was 100 M, and further 12 hours.
  • the absorbance (OD) of this culture solution at a wavelength of 570 nm was measured over time by MTT assay as 0.5 h, lh, 3 h, 6 h, 12 h, and the number of cells released in the culture solution ⁇ The number of cells is proportional to absorbance (OD) ⁇ was examined over time. The results are shown in Fig. 2.
  • PC12 cells were cultured for 72 hours in the same manner as in Example 1, and then ushiratatopherin (bLl) was added to the culture medium of the culture dish so that the concentration in the culture medium was 100 M, and 24 hours passed. I let you go. Through this process, the cells proliferated in an established state on the inner surface of the culture dish. The inner surface force of the body is released and floats in the culture medium.
  • ushiratatopherin bLl
  • the culture dish that is, usiratatoferrin (bLl) is 100 M in the culture medium. Transfer the collected cells to a culture dish ⁇ bL +) ⁇ that exists at a concentration and a culture dish ⁇ bL-) ⁇ that does not contain usilatatoferrin (bLl) in the culture and further culture for up to 144 hours.
  • the absorbance (OD) of this culture solution at a wavelength of 570 nm was measured over time by MTT assay, and the number of cells released in the culture solution (the number of cells is proportional to the absorbance (OD)) was determined. Examined. The result was as shown in FIG.
  • the absorbance (OD) of the culture solution ⁇ bL-) ⁇ not containing Compared to the absorbance (OD) of the culture solution ⁇ bL-) ⁇ not containing, the absorbance (OD) of the culture solution ⁇ bL +) ⁇ containing usilatatofurin (bLl) is high, that is, usilatatoferin (bLl). It can be seen that the cells in the culture solution ⁇ bL +) ⁇ containing) have higher cell proliferation ability than the cells in the culture solution ⁇ bL- » which does not contain usilatapherin (bLl).
  • cell solution a culture solution in which suspended cells are cultured
  • cell solution a culture solution in which suspended cells are cultured
  • a culture solution is filled into a syringe, and this is maintained at 37 ° C for 12 hours, and then this culture solution at a wavelength of 570 nm.
  • the number of cells released in the cell fluid was determined by measuring the absorbance (OD) of the cells by MTT assay, the cells survived. The number increased by 1.1 times due to proliferation compared to before the retention.
  • PC12 cells were cultured for 72 hours in the same manner as in Example 1, and then ushiratatopherin (bLl) was added to the culture medium of the culture dish so that the concentration in the culture medium was 100 M, and 24 hours passed. I let you go.
  • the cells floating in the culture medium are collected, and the culture medium in which usilatatopherin (bLl) concentration is 0 M, 100 ⁇ , 300 ⁇ , 500 ⁇ , 600 ⁇ It was transferred to each culture dish containing, and cultured for 24 hours. Then, the absorbance (OD) of the culture medium in each culture dish at a wavelength of 570 nm was measured by MTT assay, and the number of cells suspended in the culture liquid of each culture dish ⁇ cell The number of is proportional to absorbance (OD). The result was as shown in FIG.
  • the culture solution containing suspended cells by the addition of Ushiratatoferrin (bLl) was transferred to another culture dish, and Usiratatoferrin (bLl) was placed there.
  • the sputum culture medium without containing was added, and the concentration of usilatapherin (bLl) was reduced to 10 to: L00 M, respectively, and further allowed to pass at 37 ° C for 24 hours. During this process, it was visually observed that cells had settled on the bottom of the culture dish.
  • the culture medium in the culture dish is discarded, and the inner surface of the culture dish is washed with a washing solution.
  • the absorbance (OD) of this washing solution at a wavelength of 570 nm is measured for each culture dish by MTT assay.
  • the number of cells released inside was examined, it was as shown in FIG.
  • PC12 cells were cultured for 72 hours in the same manner as in Example 1, and then ushiratatopherin (bLl) was added to the culture medium of the culture dish so that the concentration in the culture medium was 100 M, and 24 hours passed. I let you go.
  • the culture solution containing suspended cells by the addition of usillatatopherin (bLl) is transferred to another culture dish, where heparin, chondroitin sulfate A, C, etc.
  • a culture solution (cell fixing solution) containing 1 of glycosaminoglycan was added in the range of 1 to 500 gZml, and further allowed to pass for 24 hours. During this process, it was visually observed that PC 12 cells had settled on the bottom of the culture dish.
  • the absorbance (OD) of the culture medium in this culture dish at a wavelength of 570 nm was measured by MTT assay for each culture dish, and the number of cells released in the culture medium (the number of cells was It was as shown in FIG.
  • PC12 cells were cultured for 72 hours in the same manner as in Example 1, and then ushiratatopherin (bLl) was added to the culture medium of the culture dish so that the concentration in the culture medium was 100 M, and 24 hours had passed. I let you go.
  • a culture solution containing suspended cells by the addition of Ushiratatoferrin (bLl) is added to a culture dish (Lam +) coated with laminin on the inside and laminin.
  • bLl Ushiratatoferrin
  • the absorbance (OD) of the culture medium in this culture dish at a wavelength of 570 nm was measured over time by MTT assay, and the number of cells released in the culture medium (the number of cells is the absorbance ( 0 ⁇ in proportion to 0. D.). The result was as shown in FIG.
  • PC12 cells were cultured for 72 hours in the same manner as in Example 1, and then ushiratatoferrin (bLl) was added to the culture medium in the culture dish so that the concentration in the culture medium was 100 M, and 24 hours had passed. I let you go.
  • a culture solution containing suspended cells by the addition of usillatatoferrin (bLl) was added to a culture dish (Lam +) whose inner surface was coated with laminin prepared in advance, using fibronectin. Transfer to an inner-coated culture dish (Lam-) or an uncoated culture dish (non-coat)
  • the absorbance (OD) of the culture medium in this culture dish at a wavelength of 570 nm was measured by MTT assay for each culture dish, and the number of cells released in the culture medium (the number of cells is the absorbance. Is proportional to (OD).
  • Suspension cells transferred to a laminin-coated culture dish are cells that have settled and grown on the bottom of the culture dish, despite the presence of 100 ⁇ of usilatatoferrin (bLl). The number increased (bLf +, Lam +). However, the floating cells transferred to the fibronectin-coated culture dish maintained the floating state and developed (bLf +, FN +). Therefore, it can be seen that the inhibitory effect of usilatatophorin (bLl) on neuronal cells is ineffective for integrin-dependent cell adhesion formed between integrins expressed in neurons and laminin.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between the concentration M) of usylatatofurin (bLl) in the culture solution and the absorbance (OD) of the culture solution.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between the elapsed time and the absorbance (O.D.) of the culture solution when usilatapherin (bLl) is added to the culture solution.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the time after the start of culturing the collected cells in another culture dish medium and the absorbance (OD).
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the concentration ( ⁇ L) of usillatatofurin (bLl) in the culture solution and the absorbance (O.D.) of the culture solution.
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between the concentration ( ⁇ ) of usylatatofurin (bLl) in the culture solution and the absorbance (O.D.) of the culture solution.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the amount of glycosaminodarican added (g / ml) and the absorbance (O.D.) of the culture solution.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between the presence or absence of laminin and the absorbance (O.D.) of the culture solution.
  • FIG. 8 is a graph showing the relationship between the presence or absence of laminin and the presence or absence of fibronectin and the absorbance (O.D.) of the culture solution.
  • FIG. 9 is a diagram showing a migration pattern of b + bLf when PC12 cells cultured in the presence of b-bLf and each concentration of bLf or BSA are solubilized and electrophoresed.

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Abstract

【課題】接着性動物細胞を浮遊状態で正常に培養増殖させ、この培養増殖させた接着性動物細胞を所望の場所に再び定着させる方法を提供する。 【解決手段】本発明に係る細胞遊離法は、細胞を培養している培養器の培養液中にラクトフェリン(Lactoferrin)を加えることを特徴とするものである。また、本発明に係る細胞培養法は、ラクトフェリンを含む培養液中で細胞を浮遊培養することを特徴とするものである。また、本発明に係る細胞定着法は、ラクトフェリンを希釈するか、ラミニンを被覆した培養器に浮遊細胞を含む培養液を移すか、グリコサミノグリカンを添加することを特徴とするものである。これらにおいて、前記細胞は接着性動物細胞であり、前記培養液中には血清が含まれている。

Description

細胞遊離法、細胞遊離液、細胞培養法、細胞培養液、細胞液、細胞液製 剤、細胞定着法及び細胞定着液
技術分野
[0001] 本発明は、ラタトフエリンを用いた細胞遊離法、細胞遊離液、細胞培養法、細胞培 養液、細胞液、細胞液製剤、細胞定着法及び細胞定着液に関するものである。 背景技術
[0002] 最近の医療技術や検査技術の進歩は著しぐ新たな医療技術や新たな検査技術 が次々と開発されてきている。新たな医療技術や新たな検査技術の開発では、細胞 を用いた種々の実験'研究が行われている。
[0003] 細胞を用いた種々の実験'研究では、その目的に応じて必要な細胞数や培養皿枚 数を用意する必要があるので、無処置の細胞 (マスター細胞）を絶えず継代的に培 養し続けなければならな ヽ。
[0004] 継代的に培養し続けたマスター細胞は、必要に応じて、培養皿から剥離後懸濁さ せ、一部は継代培養のために再度マスター細胞用の培養皿へ、また細胞懸濁液の 残りは、実験'研究用に必要な細胞数を実験施行時までに満たすベぐ増殖速度を 計算しながら、それに適した大きさの、必要な枚数だけ、培養皿上に撒き、増殖させ ている。
[0005] マスター細胞を継代的に培養せず、毎回、液体窒素内で冷凍保存して!/、る細胞を 起こして使用することも不可能ではないが、細胞を起こして実験に使えるように準備 するのには時間がかかり過ぎるので、通常は上述したような継代的な培養方法が採ら れる。
[0006] 目的の細胞数にまで増殖させた細胞は、その実験'研究の内容に合わせて利用す る。ここで、増殖させた細胞は、培養皿上に接着させたまま利用する場合と、培養皿 から剥離させて利用する場合がある。
[0007] 培養皿から剥離させて利用する場合は、培養皿力 細胞を剥離させなければなら ないが、培養皿力も細胞を剥離させる方法としては、一般に、培養液中にトリプシン などのタンパク質分解酵素を添加し、培養細胞の培養皿との結合部を溶かすことによ り細胞を剥離させる方法が使用されている。そして、この方法において、剥離させる 細胞に培養液の液流を吹き付けてフラッシングすることにより細胞を剥離させる方法 ち併せて採られることち有る。
[0008] しかし、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を使用したり、培養液の液流を吹き付 けてフラッシングをすると、培養細胞が損傷を受け、その機能回復に時間を要すると いう問題が有る。
[0009] また、種々の事情から、培養細胞を別の場所に輸送しなければならな 、場合が有 る。培養細胞は培養器の内面力 剥離すると死んでしまうので、輸送中に、細胞を培 養したフラスコ内の培養液が揺れて培養細胞が剥離しな 、ように、このフラスコに更 に培養液を満たして培養液が揺れな ヽようにして 、る。
[0010] しかし、このような対策を採っても、迅速に、し力も振動などの衝撃をカ卩えないように 注意して運搬しなければならな 、ので、培養細胞の輸送は非常に面倒である。
特許文献 1：特開 2004— 75547号公報
特許文献 2：特開平 8— 66184号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] 解決しょうとする課題は、接着性動物細胞を浮遊状態で正常に培養増殖させ、この 培養増殖させた接着性動物細胞を所望の場所に再び定着させる方法が確立されて いない点である。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明に係る細胞遊離法は、細胞培養液中にお!ヽて接着性動物細胞を担体の表 面に接着させた状態で培養し、その後ラタトフエリンを含む細胞遊離液と該細胞培養 液とを混合して該担体から該接着性動物細胞を遊離させる細胞遊離法であって、該 細胞培養液は血清を 5〜20%の濃度範囲で含み、該細胞遊離液は該細胞培養液と 混合した時のラタトフエリンの濃度が 10〜500 Mとなる濃度でラタトフエリンを含ん で ヽることを特徴とするものである。
[0013] ここで、血清の濃度を 5〜20%としたのは、血清の濃度が 5%未満あるいは 20%を 超えると細胞の増殖率が減少する不都合が生じるからである。また、ラタトフエリンの 濃度を 10〜500 Mとしたのは、ラタトフエリンの濃度が 10 M未満では細胞の遊 離効果が少なぐ 500 Mを超えると細胞の遊離効果が飽和してしまうからである。
[0014] また、前記細胞遊離液のラクトフ リンを除!、た成分は、遊離させた細胞をそのまま 培養させることができると 、う点で、前記細胞培養液の成分と略同一であることが好ま しい。
[0015] また、本発明に係る細胞遊離液は少なくともラタトフエリンを 1〜： LOmM含む細胞培 養液からなることを特徴とするものである。ここで、前記培養液中のラタトフエリンの濃 度を 1〜： LOmMとしたのは、ラタトフエリンの濃度をこの範囲にすれば、使い易いから である。
[0016] また、本発明に係る細胞培養法は、血清を 5〜20%、ラタトフエリンを 10〜500 M含む細胞培養液中で接着性動物細胞を浮遊状態で培養することを特徴とするも のである。ここで、前記培養液中のラタトフエリンの濃度は 10〜500 Mが好ましい。 ラタトフエリンの濃度を 10〜500 μ Μとしたのは、ラタトフエリンの濃度が 10 μ Μ未満 では細胞を浮遊培養する効果が少なくなつて定着してしまい、 500 Μを超えると細 胞を浮遊培養する効果が飽和してしまうからである。
[0017] また、本発明に係る細胞培養液は、血清を 5〜20%、ラタトフエリンを 10〜500 Μ含むことを特徴とするものである。ここで、血清の濃度を 5〜20%としたのは、血清 の濃度が 5%未満あるいは 20%を超えると細胞の増殖率が減少する不都合が生じる 力もである。また、培養液中のラタトフエリンの濃度を 10〜500 Μとしたのは、ラクト フェリンの濃度が 10 μ Μ未満では細胞を浮遊培養する効果が少なくなつて定着して しまい、 500 Μを超えると細胞を浮遊培養する効果が飽和してしまうからである。
[0018] また、本発明に係る細胞液は、血清を 5〜20%、ラタトフエリンを 10〜500 Μ含 み、接着性動物細胞を浮遊状態で含む細胞培養液からなることを特徴とするもので ある。ここで、血清の濃度を 5〜20%としたのは、血清の濃度が 5%未満あるいは 20 %を超えると細胞の生存率が減少する不都合が生じるからである。また、培養液中の ラタトフエリンの濃度を 10〜500 μ Μとしたのは、ラタトフエリンの濃度が 10 μ Μ未満 では細胞を浮遊させる効果が少なくなつて定着してしまい、 500 Μを超えると細胞 を浮遊させる効果が飽和してしまうからである。
[0019] また、本発明に係る細胞液製剤は、注射筒と、該注射筒内に充填された細胞液と からなり、該細胞液は、血清を 5〜20%、ラタトフエリンを 10〜500 /ζ M含み、更に接 着性動物細胞を浮遊状態で含むことを特徴とするものである。ここで、血清の濃度を 5〜20%としたのは、血清の濃度が 5%未満あるいは 20%を超えると細胞の生存率 が減少する不都合が生じるからである。また、培養液中のラタトフエリンの濃度を 10〜 500 Mとしたのは、ラタトフエリンの濃度が 10 M未満では細胞を浮遊させる効果 が少なくなつて定着してしまい、 500 Mを超えると細胞を浮遊させる効果が飽和し てしまうからである。
[0020] また、本発明に係る細胞定着法は、浮遊状態の接着性動物細胞及びラタトフエリン を含む細胞液を定着予定部に入れ、その後該定着予定部にラタトフヱリンを含まない 培養液を加えて該細胞液中のラタトフ リンの濃度を減じ、該定着予定部に該接着 性動物細胞を定着させる細胞定着法であって、該細胞液が血清を 5〜20%、ラタトフ エリンを 10〜500 μ Μ含むことを特徴とするものである。
[0021] ここで、ラタトフエリンを含まない培養液で濃度を減じられた前記細胞液中のラタトフ ヱリンの濃度は 10 Μ未満が好ましい。 10 Μ未満では浮遊細胞の定着が顕著だ 力 である。
[0022] また、本発明に係る別の細胞定着法は、定着予定部に浮遊状態の接着性動物細 胞を含む細胞液を入れ、その後該定着予定部の細胞液に該接着性動物細胞の浮 遊効果を失効させる失効物質を加えて、該定着予定部に該接着性動物細胞を定着 させる細胞定着法であって、該細胞液が血清を 5〜20%、ラタトフエリンを 10〜500 μ Μ含むことを特徴とするものである。
[0023] ここで、前記細胞定着液としては培養液中にグリコサミノダリカンを含んで 、るものを 使用することができる。また、浮遊状態の前記接着性動物細胞を定着させる際の前 記細胞液中のグリコサミノダリカンの濃度は 10〜500 gZmlが好ましい。グリコサミ ノグリカンの濃度が 10 μ gZml未満では浮遊細胞を定着させる効果が不充分であり 、 500 gZmlを超えると浮遊細胞を定着させる効果が飽和してしまうからである。
[0024] また、本発明に係る細胞定着液は、培養液中にグリコサミノダリカンを含有して!/、る ことを特徴とするものである。
[0025] また、本発明に係る更に別の細胞定着法は、定着予定部に接着性動物細胞を定 着させる定着物質を被覆し、その後浮遊状態の接着性動物細胞を含む細胞液を該 定着予定部に入れ、該定着予定部に該接着性動物細胞を定着させる細胞定着法で あって、該定着物質が細胞外マトリックスタンパク質であり、該細胞液が少なくとも血 清を 5〜20%、ラタトフエリンを 10〜500 M含むことを特徴とするものである。
[0026] ここで、前記失効剤としては細胞外マトリックスタンパク質を使用することができる。
細胞外マトリックスタンパク質としては、例えば、浮遊細胞が神経細胞の場合、ラミニ ンを使用することができ、浮遊細胞が上皮系細胞や線維芽細胞と 、つた他の細胞の 場合、フイブロネクチンやコラーゲンを使用することができる。
[0027] なお、上記各発明にお ヽて、培養器とは、培養皿、培養フラスコ等、細胞を保持し て培養することができる全ての器をいう。また、上記各発明において、接着性動物細 胞とは、例えば神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、各種の未分化細胞（間葉系細胞、 幹細胞等）、ガン細胞等をいう。また、上記各発明において、培養液には、細胞を増 殖させる養分を含んだもののみならず、生理食塩水のような細胞を単に保持させるだ けのものも含まれる。
発明の効果
[0028] 本発明によれば、培養させた接着性動物細胞を担体から損傷無く剥離させることが できるという効果がある。また、遊離させた培養細胞に時間をかけて機能回復をさせ る必要が無 、ので、損傷の無 、培養細胞を迅速に得ることができると 、う効果がある
[0029] また、本発明によれば、浮遊して 、る細胞が接着して 、る細胞と比べて細胞増殖能 力が高ぐし力も細胞を浮遊状態で正常に培養することができるので、損傷の無い正 常な細胞を迅速且つ大量に得ることができるという効果がある。
[0030] また、本発明によれば、細胞を浮遊状態で培養することができるので、培養細胞を 容易に輸送運搬することができると 、う効果がある。
[0031] また、本発明によれば、ラタトフエリンを希釈したり、ラミニンを被覆した培養器に培 養液を移したり、グリコサミノダリカンを添加するだけという簡単な方法で、浮遊状態の 細胞から定着状態の細胞を容易に得ることができるという効果がある。
発明を実施するための最良の形態
[0032] 接着性動物細胞を浮遊状態で培養増殖させ、これを再び所望の場所に定着させる という目的をラタトフエリンとグリコサミノダリカンを利用することにより実現した。
[0033] ここで、ラタトフエリン (Lactoferrin)は乳中力 見!、だされた分子量約 80kDのタンパ ク質で、種々の糖鎖構造と親和性を有し、細胞表層のタンパク質ゃグリコサミノグリカ ンと結合する性質をもち、細菌、ウィルス、原虫などの微生物感染の抑制ゃ抗炎症作 用などの様々な効果を有することで注目されて 、る。
[0034] 本件発明者は、ラタトフエリンの神経細胞に対する影響を調べる目的で、神経細胞 の研究に広く用 、られて 、るラット副腎髄質褐色細胞種腫由来の PC 12細胞の培地 にゥシラタトフエリン (bLl)を添加しその影響について調べた。
実施例 1
[0035] 培養液を入れた複数の培養皿を準備し、培養皿一皿当たり 7 X 104の PC12細胞を 撒き、この PC 12細胞を、 5%CO雰囲気下、 37°Cで 72時間培養した。ここで、培養
2
液は DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培地 {5%(v/v)非加熱 horse serum, 5%(v/v) カ卩熱 fetal bovine serum ^ 1 X 105units/l penicillin G Sodium、 1 X 10 mg/ 1 streptomycin sulfate, 0.044M NaHCO }を使用し、 PC 12細胞は理化学研究所細
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胞開発銀行カゝら分譲を受けたものを使用した。
[0036] 72時間培養後、培養皿の培養液にゥシラタトフヱリン (bLl)を培養液中の濃度が 0 Μ〜500 /ζ Mとなるように添カロした。ここで、培養液に添カロしたゥシラタトフエリン (bLl) は培養液で予め希釈したものを使用した。希釈液中のゥシラタトフエリン (bLl)の濃度 は 1〜： LOmMのものが使い易い。なお、ラタトフエリンは培養液で希釈したものでなく 、生理食塩水等、栄養分を含まない液で希釈したものを用いても良い。
[0037] ゥシラタトフヱリン (bLl)を添加して 24時間経過後、培養器内の培養液を顕微鏡で観 察したところ、浮遊している PC12細胞が観察された。そして、波長 570nmにおける この培養液の吸光度 (O.D.)を細胞賦活評価試験 (MTT assay)により測定して、培養 液中に遊離している細胞の数 {細胞の数は吸光度 (O.D.)に比例している }を調べたと ころ、図 1のグラフに示す通りであった。 [0038] 図 1に示す結果から、ゥシラタトフエリン (bLl)は濃度が Mを超えると PC12細胞 の培養皿上への接着を阻害し、細胞を遊離'浮遊させる作用を有することがわかる。 また、培養液中に浮遊している細胞数はゥシラタトフ リン (bLl)の濃度の増加に従つ て増加する力 濃度が 500 Mを超えるとその作用は飽和することがわかる。
[0039] なお、ゥシラタトフエリン (bLl)は分子量約 80kDで陽電荷に帯電することから、これら の物理的性質が上記の作用を及ぼしている可能性も考えられる。そこで、上記の作 用がゥシラタトフエリン (bLl)に特異的であることを確認するために、ゥシラタトフエリン (b L1)の代わりにゥシラタトフエリン (bLl)と同様に分子量の大き 、タンパク質であるゥシ血 清アルブミン (67kD)および陽電荷をもつタンパク質であるリゾチーム（14kD)に対 する影響についてもゥシラタトフエリン (bLl)と同様に調べた。
[0040] し力し、ゥシ血清アルブミン（67kD)、リゾチーム（14kD)にゥシラタトフエリン (bLl)で 認められたような細胞を培養皿力も遊離させる作用は認められな力つた。従って、 PC 12細胞を培養皿から遊離させる作用はゥシラタトフエリン (bLl)に特異的なもので、高 分子量や電荷力 Sもたらすものではないことがわかる。
実施例 2
[0041] 実施例 1と同様にして PC12細胞を 72時間培養し、その後培養皿の培養液にゥシ ラタトフエリン (bLl)を培養液中の濃度が 100 Mとなるように添加し、更に 12時間培 養し、波長 570nmにおけるこの培養液の吸光度 (O.D.)を MTT assayにより 0. 5h、 lh、 3h、 6h、 12hと経時的に測定して、培養液中に遊離している細胞の数 {細胞の 数は吸光度 (O.D.)に比例している }を時間毎に調べた。結果は図 2に示す通りであつ た。
[0042] この図 2に示された結果から、ゥシラタトフヱリン (bLl)の濃度 100 Mの条件下では 、培養皿の底面に定着していた細胞はゥシラタトフエリン (bLl)の働きにより 0. 5h当た りから少し遊離し、 3hでかなり遊離し、 6hで殆どが遊離することがわかる。
実施例 3
[0043] 実施例 1と同様にして PC12細胞を 72時間培養し、その後培養皿の培養液にゥシ ラタトフエリン (bLl)を培養液中の濃度が 100 Mとなるように添加し、 24時間経過さ せた。この経過によって培養皿の内面に定着した状態で増殖して 、た細胞は培養皿 の内面力 遊離し、培養液中に浮遊することになる。
[0044] 次に、培養液中に浮遊して!/ヽる細胞を回収し、予め用意してお!ヽた培養皿、すなわ ち培養液中にゥシラタトフエリン (bLl)が 100 M濃度で存在する培養皿 {bL +)}と、 培養液中にゥシラタトフエリン (bLl)が存在しな 、培養皿 {bL -)}に、回収したこの細胞 を移し、 144時間まで更に培養し、波長 570nmにおけるこの培養液の吸光度 (O.D.) を MTT assayにより経時的に測定し、培養液中に遊離している細胞の数 {細胞の 数は吸光度 (O.D.)に比例している }を調べた。結果は図 3に示す通りであった。
[0045] 図 3の bLf ( + )に示す結果から、浮遊細胞はゥシラタトフ リン (bLl)の濃度が 100 Mの環境下において、浮遊状態で時間と共に増殖することがわかる。
[0046] また、図 3の bLf ( + )、 bLf (—）に示す結果から、ゥシラタトフエリン (bLl)を含む培養 液 {bL +)}の吸光度 (O.D.)とゥシラタトフ リン (bLl)を含まない培養液 {bL -)}の吸光 度 (O.D.)とを比較すると、ゥシラタトフ リン (bLl)を含む培養液 {bL +)}の吸光度 (O.D. )が高いこと、すなわちゥシラタトフエリン (bLl)を含む培養液 {bL +)}中における細胞の 方がゥシラタトフエリン (bLl)を含まな 、培養液 {bL -»中における細胞より細胞増殖能 力が高いことがわかる。
[0047] また、浮遊細胞を培養した培養液 (以下、「細胞液」 、う。 )を注射筒に充填し、こ れを 37°Cで 12時間保持し、その後、波長 570nmにおけるこの培養液の吸光度 (O.D .)を MTT assayにより測定して、細胞液中に遊離している細胞の数 {細胞の数は吸 光度 (O.D.)に比例している }を調べたところ、細胞は生存しており、その数は増殖によ り保持前と比べて 1. 1倍に増加していた。
実施例 4
[0048] 実施例 1と同様にして PC12細胞を 72時間培養し、その後培養皿の培養液にゥシ ラタトフエリン (bLl)を培養液中の濃度が 100 Mとなるように添加し、 24時間経過さ せた。
[0049] 次に、培養液中に浮遊している細胞を回収し、ゥシラタトフエリン (bLl)の濃度が 0 M、 100 μ Μ、 300 μ Μ、 500 μ Μ、 600 μ Μの培養液を入れた各培養皿に移し、 2 4時間培養した。そして、波長 570nmにおけるこの各培養皿の培養液の吸光度 (O.D .)を MTT assayにより測定し、各培養皿の培養液中に浮遊している細胞の数 {細胞 の数は吸光度 (O.D.)に比例している }を調べた。結果は図 4に示す通りであった。
[0050] 図 4に示す結果から、培養液中のゥシラタトフ リン (bLl)の濃度を高くすると細胞の 増殖能力が高くなることがわかる。
実施例 5
[0051] 実施例 1と同様にして PC12細胞を 72時間培養し、その後培養皿の培養液にゥシ ラタトフエリン (bLl)を培養液中の濃度が 100 Mとなるように添加し、 24時間経過さ せた。
[0052] 次に、ゥシラタトフエリン (bLl)の添カ卩によって浮遊状態の細胞を含むようになった培 養液を別の各培養皿に移し、そこにゥシラタトフエリン (bLl)を含まな ヽ培養液を加え、 ゥシラタトフエリン (bLl)の濃度を 10〜： L00 Mまで各々低減させ、更に 37°Cで 24時 間経過させた。この経過により培養皿の底面に細胞が定着しているのが目視で観察 された。
[0053] 次に、培養皿の培養液を捨て、培養皿の内面を洗浄液で洗!ヽ、波長 570nmにお けるこの洗浄液の吸光度 (O.D.)を各培養皿毎に MTT assayにより測定し、洗浄液 中に遊離している細胞の数 {細胞の数は吸光度 (O.D.)に比例している }を調べたとこ ろ、図 5に示す通りであった。
[0054] 図 5に示す結果から、ゥシラタトフエリン (bLl)を含まない希釈液で希釈して培養液中 のゥシラタトフヱリン (bLl)の濃度を減ずると、培養液中に浮遊して!/、た細胞が培養皿 の内面に再び定着することがわかる。
実施例 6
[0055] 実施例 1と同様にして PC12細胞を 72時間培養し、その後培養皿の培養液にゥシ ラタトフエリン (bLl)を培養液中の濃度が 100 Mとなるように添加し、 24時間経過さ せた。
[0056] 次に、ゥシラタトフエリン (bLl)の添カ卩によって浮遊状態の細胞を含むようになった培 養液を別の培養皿に移し、そこにへパリンやコンドロイチン硫酸 A, Cなどのグリコサミ ノグリカンを含む培養液 (細胞定着液)を 1〜500 gZmlの範囲で添加し、更に 24 時間経過させた。この経過により培養皿の底面に PC 12細胞が定着しているのが目 視で観察された。 [0057] 次に、波長 570nmにおけるこの培養皿中の培養液の吸光度 (O.D.)を各培養皿毎 に MTT assayにより測定し、培養液中に遊離している細胞の数 {細胞の数は吸光 度 (O.D.)に比例している }を調べたところ、図 6に示す通りであった。
[0058] 図 6に示す結果から、へパリンやコンドロイチン硫酸などのグリコサミノダリカンを含 む培養液 (細胞定着液)を添加すると、培養液中に浮遊して ヽた細胞数が減少する こと、すなわち、培養液中に浮遊していた細胞が培養皿の内面に再び定着すること がわかった。
実施例 7
[0059] 実施例 1と同様にして PC12細胞を 72時間培養し、その後培養皿の培養液にゥシ ラタトフエリン (bLl)を培養液中の濃度が 100 Mとなるように添加し、 24時間経過さ せた。
[0060] 次に、ゥシラタトフエリン (bLl)の添カ卩によって浮遊状態の細胞を含むようになった培 養液を、予め用意したラミニンで内面を被覆した培養皿 (Lam + )とラミニンで内面を 被覆してない培養皿 (Lam—）に移し、更に 24時間経過させた。
[0061] 次に、波長 570nmにおけるこの培養皿中の培養液の吸光度 (O.D.)を MTT assa yにより経時的に測定し、培養液中に遊離している細胞の数 {細胞の数は吸光度 (0. D .)に比例して 、る }を調べた。結果は図 7に示す通りであった。
[0062] また、培養皿の内面を観察したところ、培養皿の内面には PC12細胞が定着し、増 殖しているのが確認された。以上のことから、培養液中に浮遊していた細胞はゥシラ タトフェリン (bLl)の存在下でラミニンの働きにより培養皿の底面に定着することがわか る。
実施例 8
[0063] 実施例 1と同様にして PC12細胞を 72時間培養し、その後培養皿の培養液にゥシ ラタトフエリン (bLl)を培養液中の濃度が 100 Mとなるように添加し、 24時間経過さ せた。
[0064] 次に、ゥシラタトフエリン (bLl)の添カ卩によって浮遊状態の細胞を含むようになった培 養液を、予め用意したラミニンで内面を被覆した培養皿 (Lam+)、フイブロネクチン で内面を被覆した培養皿 (Lam—)、何も被覆してない培養皿 (non-coat)に移し、更 に 24時間培養し、波長 570nmにおけるこの培養皿中の培養液の吸光度 (O.D.)を各 培養皿毎に MTT assayにより測定し、培養液中に遊離している細胞の数 {細胞の 数は吸光度 (O.D.)に比例している }を調べた。
[0065] 結果は図 8に示す通りであり、ラミニンを被覆した方の培養皿中の培養液中の浮遊 細胞は大幅に減少しており、ラミニンを被覆してな 、方の培養液中の浮遊細胞は減 少しなかった。また、培養皿の内面を観察したところ、培養皿の内面には PC12細胞 が定着し、増殖しているのが確認された。
[0066] ラミニンを被覆した培養皿に移した浮遊細胞は 100 μ Μのゥシラタトフエリン (bLl)存 在下にもかかわらず、浮遊細胞数が減少し、培養皿底面に定着して発育する細胞数 が増加した (bLf+,Lam+)。ところが、フイブロネクチンを被覆した培養皿に移した浮遊 細胞は、浮遊状態を維持し発育した (bLf+,FN+)。従って、ゥシラタトフヱリン (bLl)の神 経細胞に対する接着抑制効果は、神経細胞に発現するインテグリンとラミニン間で形 成されるインテグリン依存性の細胞接着には無効であることがわかる。
実施例 9
[0067] ゥシラタトフエリン (bLl)が PC 12細胞に直接結合して作用していることを確認するた めに、？じ！^細胞にビォチン化^^^—^^を添カ卩し、 24時間後に全細胞を回収' 洗浄し、細胞を可溶ィ匕後、 SDSポリアクリルアミド電気泳導に供し、さらにナイトロセ ルロース膜にプロットした後に b—bLfの結合を解析した。泳動パターンは図 9に示す 通りとなった。
[0068] 図 9において、（a)は b— bLf単独処置、（b)は b— bLf + bLf 100 M、（c)は b— b Lf+bLf 500 M、 (d)は b— bLf+BSAlOO M、 (e)は b— bLf +BSA500 μ Μ である。
[0069] 解析の結果、 b— bLfが検出され、 b— bLfが PC 12細胞に直接結合して作用してい ることがわかった。
産業上の利用可能性
[0070] 細胞の浮遊と定着の機構を制御する手段の研究を解明することにより、ヒトゃ動物 の生体組織を再生させる用途にも適用できる可能性がある。
図面の簡単な説明 [図 1]培養液中のゥシラタトフ リン (bLl)の濃度 M)と培養液の吸光度 (O.D.)との関 係を示すグラフである。
[図 2]培養液中にゥシラタトフエリン (bLl)を添加して力もの経過時間と培養液の吸光度 (O.D.)との関係を示すグラフである。
[図 3]回収した細胞を別の培養皿培養液中にて培養を開始してからの時間と吸光度（ O.D.)との関係を示すグラフである。
[図 4]培養液中のゥシラタトフ リン (bLl)の濃度（ μ Μ)と培養液の吸光度 (O.D.)との関 係を示すグラフである。
[図 5]培養液中のゥシラタトフ リン (bLl)の濃度（ μ Μ)と培養液の吸光度 (O.D.)との関 係を示すグラフである。
[図 6]グリコサミノダリカンの添加量 g/ml)と培養液の吸光度 (O.D.)との関係を示 すグラフである。
[図 7]ラミニンの有無と培養液の吸光度 (O.D.)との関係を示すグラフである。
[図 8]ラミニンの有無及びフイブロネクチンの有無と培養液の吸光度 (O.D.)との関係を 示すグラフである。
[図 9]b— bLfと各濃度の bLfあるいは BSA存在下で培養した PC12細胞を洗浄後可 溶化し、電気泳動したときの b+ bLfの泳動パターンを示す図である。

Claims

請求の範囲
[1] 細胞培養液中にぉ ヽて接着性動物細胞を担体の表面に接着させた状態で培養し
、その後ラタトフエリンを含む細胞遊離液と該細胞培養液とを混合して該担体から該 接着性動物細胞を遊離させる細胞遊離法であって、該細胞培養液は血清を 5〜20 %の濃度範囲で含み、該細胞遊離液は該細胞培養液と混合した時のラタトフエリン の濃度が 10〜500 Mとなる濃度でラタトフエリンを含んでいることを特徴とする細胞 遊離法。
[2] 前記細胞遊離液のラクトフ リンを除 、た成分が前記細胞培養液の成分と略同一 であることを特徴とする請求項 1に記載の細胞遊離法。
[3] 血清を 5〜20%、ラタトフエリンを 1〜： LOmM含む細胞培養液力もなることを特徴と する細胞遊離液。
[4] 血清を 5〜20%、ラタトフエリンを 10〜500 μ Μ含む細胞培養液中で接着性動物 細胞を浮遊状態で培養することを特徴とする細胞培養法。
[5] 血清を 5〜20%、ラタトフエリンを 10〜500 μ Μ含むことを特徴とする細胞培養液。
[6] 血清を 5〜20%、ラタトフエリンを 10〜500 μ Μ含み、接着性動物細胞を浮遊状態 で含む細胞培養液力 なることを特徴とする細胞液。
[7] 注射筒と、該注射筒内に充填された細胞液とからなり、該細胞液は、血清を 5〜20
%、ラタトフエリンを 10〜500 /ζ Μ含み、更に接着性動物細胞を浮遊状態で含むこと を特徴とする細胞液製剤。
[8] 浮遊状態の接着性動物細胞及びラタトフエリンを含む細胞液を定着予定部に入れ
、その後該定着予定部にラタトフヱリンを含まな 、細胞培養液を加えて該細胞液中の ラクトフ リンの濃度を減じ、該定着予定部に該接着性動物細胞を定着させる細胞定 着法であって、該細胞液が血清を 5〜20%、ラタトフエリンを 10〜500 μ Μ含むこと を特徴とする細胞定着法。
[9] ラタトフエリンを含まな 、培養液で濃度を減じられた前記細胞液中のラタトフエリンの 濃度が 10 μ Μ未満であることを特徴とする請求項 8に記載の細胞定着法。
[10] 定着予定部に浮遊状態の接着性動物細胞を含む細胞液を入れ、その後該定着予 定部の細胞液に該接着性動物細胞の浮遊効果を失効させる失効物質を加えて、該 定着予定部に該接着性動物細胞を定着させる細胞定着法であって、該細胞液が血 清を 5〜20%、ラタトフエリンを 10〜500 M含むことを特徴とする細胞定着法。
[11] 前記失効物質がグリコサミノダリカンであることを特徴とする請求項 10に記載の細胞 定着法。
[12] 浮遊状態の前記接着性動物細胞を定着させる際の前記細胞液中のグリコサミノダリ カンの濃度が 10〜500 gZmlであることを特徴とする請求項 11に記載の細胞定 着法。
[13] グリコサミノダリカンを含む細胞培養液力もなることを特徴とする細胞定着液。
[14] 定着予定部に接着性動物細胞を定着させる定着物質を被覆し、その後浮遊状態 の接着性動物細胞を含む細胞液を該定着予定部に入れ、該定着予定部に該接着 性動物細胞を定着させる細胞定着法であって、該定着物質が細胞外マトリックスタン パク質であり、該細胞液が少なくとも血清を 5〜20%、ラタトフエリンを 10〜500 M 含むことを特徴とする細胞定着法。
[15] 前記細胞外マトリックスタンパク質カ^ミニンであることを特徴とする請求項 14に記 載の細胞定着法。
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