JP2947488B2 - 接着性動物細胞の浮遊培養のための無血清培地及びこれを用いた浮遊培養方法 - Google Patents
接着性動物細胞の浮遊培養のための無血清培地及びこれを用いた浮遊培養方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、接着性動物細胞を浮遊
化させて培養するに適した新規な無血清培地及び、この
培地を用いて、接着性動物細胞を接着担体を用いずに浮
遊培養する方法に関する。
化させて培養するに適した新規な無血清培地及び、この
培地を用いて、接着性動物細胞を接着担体を用いずに浮
遊培養する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】培養動物細胞は（１）培養器表面に接着
して増殖する接着性細胞と、（２）培養器表面にはほと
んどあるいはまったく接着しないで増殖する浮遊性細胞
の２タイプに分類できる。前者の代表的なものに上皮性
細胞、線維芽細胞、後者の代表的なものにリンパ系細胞
などがある。
して増殖する接着性細胞と、（２）培養器表面にはほと
んどあるいはまったく接着しないで増殖する浮遊性細胞
の２タイプに分類できる。前者の代表的なものに上皮性
細胞、線維芽細胞、後者の代表的なものにリンパ系細胞
などがある。
【０００３】一般的には、接着性動物細胞を浮遊化して
培養することは困難であるとされている。このため接着
性動物細胞を高密度に培養する方法として、培養担体表
面積をホロファイバーなどを利用して大きくする方法
や、マイクキャリアーなどの接着担体を使用して細胞と
接着させ、浮遊させる方法が一般には行なわれている。
しかし、これらの方法では細胞のサンプリングや生育の
モニタリングは非常に困難であり、細胞の回収あるいは
継代の際にはトリプシンによる細胞のはく離等煩雑な操
作が必要であった。
培養することは困難であるとされている。このため接着
性動物細胞を高密度に培養する方法として、培養担体表
面積をホロファイバーなどを利用して大きくする方法
や、マイクキャリアーなどの接着担体を使用して細胞と
接着させ、浮遊させる方法が一般には行なわれている。
しかし、これらの方法では細胞のサンプリングや生育の
モニタリングは非常に困難であり、細胞の回収あるいは
継代の際にはトリプシンによる細胞のはく離等煩雑な操
作が必要であった。
【０００４】接着性動物細胞を接着させずに浮遊化して
培養する試みはいくつかなされている。例えば朝倉書店
刊 中井準之助編「組織培養」６８〜７８ｐには接着性
細胞を浮遊化し、培養する方法が開示されている。しか
しこの方法は、物理的な攪拌と、浮遊化に適した細胞の
選択例が示されてはいるが、接着性細胞を浮遊培養する
ことは困難が多いとものべられている。この中で浮遊培
養した細胞の例としては、ＨｅｌａＳ−３，Ｌ ｃｅｌ
ｌ，Ｈ．Ｅｐ．−２，ＢＨＫ，ＣＨＯ，ＣＨＬ，Ｌ−５
１７８ Ｙ，ＭＬ−２，ＭＬ−３などの細胞が浮遊培養
できることが述べられている。しかし、これらに用いて
いる培養液は血清添加培地が使用されている。この場
合、多くの細胞は血清添加によって増殖の促進と安定化
が得られるので血清の除外はあまり好ましくなく、培養
液を構成する基本塩類から Ｃａ2+あるいは同時にＭｇ
2+を除去したり、ＮａＨＳＯ4 、グリシン、セリンある
いは界面活性剤を添加した血清添加培地が用いられてい
る。
培養する試みはいくつかなされている。例えば朝倉書店
刊 中井準之助編「組織培養」６８〜７８ｐには接着性
細胞を浮遊化し、培養する方法が開示されている。しか
しこの方法は、物理的な攪拌と、浮遊化に適した細胞の
選択例が示されてはいるが、接着性細胞を浮遊培養する
ことは困難が多いとものべられている。この中で浮遊培
養した細胞の例としては、ＨｅｌａＳ−３，Ｌ ｃｅｌ
ｌ，Ｈ．Ｅｐ．−２，ＢＨＫ，ＣＨＯ，ＣＨＬ，Ｌ−５
１７８ Ｙ，ＭＬ−２，ＭＬ−３などの細胞が浮遊培養
できることが述べられている。しかし、これらに用いて
いる培養液は血清添加培地が使用されている。この場
合、多くの細胞は血清添加によって増殖の促進と安定化
が得られるので血清の除外はあまり好ましくなく、培養
液を構成する基本塩類から Ｃａ2+あるいは同時にＭｇ
2+を除去したり、ＮａＨＳＯ4 、グリシン、セリンある
いは界面活性剤を添加した血清添加培地が用いられてい
る。
【０００５】
【発明が解決しようとしている課題】接着性動物細胞を
担体を使用しないで浮遊化させて培養する方法は、上に
述べたように血清添加培地を使用しいくつかの細胞では
すでに実現している。しかし、上記のような血清添加培
地を使用するには培地の調製に手間を要し、また夾雑成
分が多いので細胞生産物の精製が困難となったりする欠
点があった。しかし、培地として安価であり、細胞生産
物の精製の容易な無血清培地ではこのような方法はまだ
実現していない。
担体を使用しないで浮遊化させて培養する方法は、上に
述べたように血清添加培地を使用しいくつかの細胞では
すでに実現している。しかし、上記のような血清添加培
地を使用するには培地の調製に手間を要し、また夾雑成
分が多いので細胞生産物の精製が困難となったりする欠
点があった。しかし、培地として安価であり、細胞生産
物の精製の容易な無血清培地ではこのような方法はまだ
実現していない。
【０００６】本発明においては、本来接着性動物細胞
を、浮遊性細胞の如く特別の手段を用いなくとも浮遊さ
せて培養するに適した無血清培地及びこの培地を使用し
た接着性動物細胞を浮遊培養する方法を提供することを
課題とする。本発明では、さらに接着性動物細胞を浮遊
性動物細胞と同様に浮遊培養可能とすることにより、浮
遊性細胞の培養を目的に開発された培養システムを接着
性動物細胞に適用することもできるようにする。またこ
のシステムにより工業規模での大量培養も可能となる。
を、浮遊性細胞の如く特別の手段を用いなくとも浮遊さ
せて培養するに適した無血清培地及びこの培地を使用し
た接着性動物細胞を浮遊培養する方法を提供することを
課題とする。本発明では、さらに接着性動物細胞を浮遊
性動物細胞と同様に浮遊培養可能とすることにより、浮
遊性細胞の培養を目的に開発された培養システムを接着
性動物細胞に適用することもできるようにする。またこ
のシステムにより工業規模での大量培養も可能となる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために、無血清培地に種々の物質を添加して、
接着性動物細胞を培養してその接着性を抑制し、浮遊性
を高めることを検討した。その結果、ラクトフェリンを
無血清培地に添加して培養した場合、細胞の増殖には何
ら悪影響をおよぼさずに、接着性動物細胞の培養器への
接着を抑制し、浮遊化することができることを見出して
本発明をなすに到った。
解決するために、無血清培地に種々の物質を添加して、
接着性動物細胞を培養してその接着性を抑制し、浮遊性
を高めることを検討した。その結果、ラクトフェリンを
無血清培地に添加して培養した場合、細胞の増殖には何
ら悪影響をおよぼさずに、接着性動物細胞の培養器への
接着を抑制し、浮遊化することができることを見出して
本発明をなすに到った。
【０００８】すなわち、本発明は、ラクトフェリンを接
着抑止因子として無血清培地に含有せしめて接着性動物
細胞を接着担体に接着させずに浮遊化させて培養するこ
とのできる無血清培地及びこの無血清培地を用いて接着
性動物細胞を接着担体に接着させずに浮遊化させて培養
する方法に関する。
着抑止因子として無血清培地に含有せしめて接着性動物
細胞を接着担体に接着させずに浮遊化させて培養するこ
とのできる無血清培地及びこの無血清培地を用いて接着
性動物細胞を接着担体に接着させずに浮遊化させて培養
する方法に関する。
【０００９】ラクトフェリン（別称: ラクトトランスフ
ェリン) は、乳や関節液などの分泌液中に含まれる鉄結
合性の分子量約８０，０００の糖蛋白質である。牛ラク
トフェリンは、牛乳中から精製され高純度品が市販され
ている。一部の細胞においては、ラクトフェリンは、無
血清培地に添加される増殖因子トランスフェリンの代替
となることが報告されている。しかし、ラクトフェリン
は、トランスフェリンほど多様な細胞への増殖効果は確
認されずトランスフェリン代替物質とはならなかった。
又特開昭５９−１６６０７９号公報にはＤＭＥＭ培地に
ヒトラクトフェリンを添加し、増殖効果を示す例が開示
されている。これは培地当り０．５〜５０μｇ／ｍｌ、
実施例では１０μｇ／ｍｌと微量の添加である。しか
も、本発明で開示されるような接着性動物細胞の浮遊化
にラクトフェリンを用いることができることは何も記載
されておらず、このことは本発明者が初めて見出したも
のである。
ェリン) は、乳や関節液などの分泌液中に含まれる鉄結
合性の分子量約８０，０００の糖蛋白質である。牛ラク
トフェリンは、牛乳中から精製され高純度品が市販され
ている。一部の細胞においては、ラクトフェリンは、無
血清培地に添加される増殖因子トランスフェリンの代替
となることが報告されている。しかし、ラクトフェリン
は、トランスフェリンほど多様な細胞への増殖効果は確
認されずトランスフェリン代替物質とはならなかった。
又特開昭５９−１６６０７９号公報にはＤＭＥＭ培地に
ヒトラクトフェリンを添加し、増殖効果を示す例が開示
されている。これは培地当り０．５〜５０μｇ／ｍｌ、
実施例では１０μｇ／ｍｌと微量の添加である。しか
も、本発明で開示されるような接着性動物細胞の浮遊化
にラクトフェリンを用いることができることは何も記載
されておらず、このことは本発明者が初めて見出したも
のである。
【００１０】又、血清添加培地にラクトフェリンを添加
しても接着性動物細胞の接着抑止現象は認められず、培
養容器に接着して増殖をする。従って本発明の培地とし
ては、血清を含まない無血清培地を使用し、好ましくは
無血清培地当りラクトフェリンが１００〜５００μｇ／
ｍｌ、好適には１００〜３００μｇ／ｍｌになるように
添加された培地を調製しなければならない。無血清培地
には、目的とする細胞にあわせた無血清基礎培地と、細
胞の要求性により添加されるインシュリン、トランスフ
ェリン、エタノールアミン、亜セレン酸、プロスタグラ
ンジン、リポタンパク質、牛血清アルブミン、上皮細胞
増殖因子などの各種増殖因子を基礎培地に添加した無血
清培地とが挙げられる。これらの無血清培地に無菌的に
ラクトフェリンを最終濃度として１００〜５００μｇ／
ｍｌとなるよう添加し溶解する。ラクトフェリンの濃度
がこの範囲以下の場合は、細胞接着抑止効果を示さず、
又この範囲以上の場合は、細胞増殖の抑制があらわれる
ために好ましくない。
しても接着性動物細胞の接着抑止現象は認められず、培
養容器に接着して増殖をする。従って本発明の培地とし
ては、血清を含まない無血清培地を使用し、好ましくは
無血清培地当りラクトフェリンが１００〜５００μｇ／
ｍｌ、好適には１００〜３００μｇ／ｍｌになるように
添加された培地を調製しなければならない。無血清培地
には、目的とする細胞にあわせた無血清基礎培地と、細
胞の要求性により添加されるインシュリン、トランスフ
ェリン、エタノールアミン、亜セレン酸、プロスタグラ
ンジン、リポタンパク質、牛血清アルブミン、上皮細胞
増殖因子などの各種増殖因子を基礎培地に添加した無血
清培地とが挙げられる。これらの無血清培地に無菌的に
ラクトフェリンを最終濃度として１００〜５００μｇ／
ｍｌとなるよう添加し溶解する。ラクトフェリンの濃度
がこの範囲以下の場合は、細胞接着抑止効果を示さず、
又この範囲以上の場合は、細胞増殖の抑制があらわれる
ために好ましくない。
【００１１】細胞培養用基礎培地としては、無血清培養
に使用するものであればどのようなものでも使用できる
が、ＲＰＭＩ １６４０，ＤＭＥＭ，ｃＲＤＦ，ＥＲＤ
Ｆなどを例示できる。また増殖因子を含む無血清培地と
しては、ＨＬ−１，ＨＢ−１０１，ＫＣ−２０００，Ｕ
ｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ，ＣＥＭ；ＮＵＴＲＩＣＬＯＮＥ，
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉａ，
Ｎｕ−ＳＥＲＵＭ，Ｈｙｂｒｉｔｙ−１，ＧＩＴ，ＡＳ
Ｆ，ＩＴＥＳ−ＥＲＤＦなどが例示できる。基礎培地の
場合は目的とする細胞の要求にあわせ、増殖因子を添加
し、さらにラクトフェリンを最終１００〜５００μｇ／
ｍｌ、好適には１００〜３００μｇ／ｍｌになるように
添加し、また無血清培地の場合は、同じくラクトフェリ
ンを１００〜５００μｇ／ｍｌ、好適には１００〜３０
０μｇ／ｍｌになるように添加し、いずれの場合も必要
に応じて濾過滅菌することで目的とする培地を調製でき
る。
に使用するものであればどのようなものでも使用できる
が、ＲＰＭＩ １６４０，ＤＭＥＭ，ｃＲＤＦ，ＥＲＤ
Ｆなどを例示できる。また増殖因子を含む無血清培地と
しては、ＨＬ−１，ＨＢ−１０１，ＫＣ−２０００，Ｕ
ｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ，ＣＥＭ；ＮＵＴＲＩＣＬＯＮＥ，
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉａ，
Ｎｕ−ＳＥＲＵＭ，Ｈｙｂｒｉｔｙ−１，ＧＩＴ，ＡＳ
Ｆ，ＩＴＥＳ−ＥＲＤＦなどが例示できる。基礎培地の
場合は目的とする細胞の要求にあわせ、増殖因子を添加
し、さらにラクトフェリンを最終１００〜５００μｇ／
ｍｌ、好適には１００〜３００μｇ／ｍｌになるように
添加し、また無血清培地の場合は、同じくラクトフェリ
ンを１００〜５００μｇ／ｍｌ、好適には１００〜３０
０μｇ／ｍｌになるように添加し、いずれの場合も必要
に応じて濾過滅菌することで目的とする培地を調製でき
る。
【００１２】使用するラクトフェリンは、どのような種
由来のものでも使用できるが、牛、羊などの乳由来のラ
クトフェリンが比較的入手しやすい。又遺伝子組換によ
り調製したラクトフェリンも使用できる。 接着性動物
細胞の培養は、マイクロキャリアーや、培養器中で増殖
させた動物細胞をトリプシン処理により常法通りハーベ
ストし、次いで本発明による無血清培地に動物細胞を約
１〜５×１０5 ／ｍｌ程度の密度に懸濁する。この細胞
懸濁培地を、通常の細胞培養器具、例えば、フラスコ、
スピナーフラスコ、ジャーファーメンターなどを用いて
培養することにより、ホロファイバーやマイクロキャリ
アーなどの接着性担体を使用せずに接着性細胞を浮遊状
態で培養することができる。培養温度その他の培養条件
は、それぞれの動物細胞に従来知られている条件がその
まま適用される。
由来のものでも使用できるが、牛、羊などの乳由来のラ
クトフェリンが比較的入手しやすい。又遺伝子組換によ
り調製したラクトフェリンも使用できる。 接着性動物
細胞の培養は、マイクロキャリアーや、培養器中で増殖
させた動物細胞をトリプシン処理により常法通りハーベ
ストし、次いで本発明による無血清培地に動物細胞を約
１〜５×１０5 ／ｍｌ程度の密度に懸濁する。この細胞
懸濁培地を、通常の細胞培養器具、例えば、フラスコ、
スピナーフラスコ、ジャーファーメンターなどを用いて
培養することにより、ホロファイバーやマイクロキャリ
アーなどの接着性担体を使用せずに接着性細胞を浮遊状
態で培養することができる。培養温度その他の培養条件
は、それぞれの動物細胞に従来知られている条件がその
まま適用される。
【００１３】以下に実施例を示し本発明をさらに詳細に
説明する。
説明する。
【実施例１】 ラクトフェリン添加無血清培地の調製 (1) ラクトフェリン−ＩＴＥＳ−Ｓ−ＥＲＤＦ培地の調
製 市販の無血清培地であるＩＴＥＳ−ＥＲＤＦ培地（極東
製薬製）に牛ラクトフェリン（アラファーム社製) を１
００μｇ／ｍｌ濃度になるように添加溶解し、次いで
０．２２μのミリポアフィルターにより濾過滅菌した。 (2) ラクトフェリン添加ＧＩＴ培地の調製 市販の無血清培地ＧＩＴ（ギット）培地（和光純薬製）
に１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの
濃度になるように牛ラクトフェリンを添加溶解し、次い
で0.22μのミリポアフィルターにより濾過滅菌した。
製 市販の無血清培地であるＩＴＥＳ−ＥＲＤＦ培地（極東
製薬製）に牛ラクトフェリン（アラファーム社製) を１
００μｇ／ｍｌ濃度になるように添加溶解し、次いで
０．２２μのミリポアフィルターにより濾過滅菌した。 (2) ラクトフェリン添加ＧＩＴ培地の調製 市販の無血清培地ＧＩＴ（ギット）培地（和光純薬製）
に１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの
濃度になるように牛ラクトフェリンを添加溶解し、次い
で0.22μのミリポアフィルターにより濾過滅菌した。
【００１４】
【実施例２】 付着性動物細胞の浮遊化培養 接着性動物細胞として、Ｌ−９２９，Ｖｅｒｏ，Ｈｅｌ
ａＳ−３を用いて培養を行った。 (1) すなわち、ＧＩＴ培地で２週間継代培養した上記細
胞を、ラクトフェリンを培地当り１〜１００μｇ／ｍｌ
添加し溶解したＧＩＴ培地（和光純薬製) 、ＩＴＥＳ−
ＥＲＤＩ培地あるいは１０％ＦＣＳを含むＥＲＤＦ培地
中に１〜５×１０5 ／ｍｌの密度で懸濁し、この２ｍｌ
を３５ｍｍシャーレ (ファルコン３００１) にまき込
み、３７℃で培養した。培養３日後に顕微鏡下で細胞の
形態を観察して細胞の接着性を検定した。
ａＳ−３を用いて培養を行った。 (1) すなわち、ＧＩＴ培地で２週間継代培養した上記細
胞を、ラクトフェリンを培地当り１〜１００μｇ／ｍｌ
添加し溶解したＧＩＴ培地（和光純薬製) 、ＩＴＥＳ−
ＥＲＤＩ培地あるいは１０％ＦＣＳを含むＥＲＤＦ培地
中に１〜５×１０5 ／ｍｌの密度で懸濁し、この２ｍｌ
を３５ｍｍシャーレ (ファルコン３００１) にまき込
み、３７℃で培養した。培養３日後に顕微鏡下で細胞の
形態を観察して細胞の接着性を検定した。
【００１５】このようにしてラクトフェリン添加培地中
での細胞の接着性を検討した結果を表１に示す。
での細胞の接着性を検討した結果を表１に示す。
【００１６】
【表１】 ラクトフェリン（ＬＦ）添加培地中での細胞の接着性 ─────────────────────────────────── 接 着 性 培 地 ────────────────────── Ｌ ９２９ Ｖｅｒｏ Ｈｅｌａ Ｓ−３ ─────────────────────────────────── ＧＩＴ ＋ ＋ ＋ ＋ＬＦ １μｇ／ｍｌ ＋ ＮＤ ＮＤ ＋ＬＦ １０μｇ／ｍｌ ± ＮＤ ＮＤ ＋ＬＦ １００μｇ／ｍｌ − − − ＩＴＥＳ−ＥＲＤＦ ＋ ＮＤ ＮＤ ＋ＬＦ １００μｇ／ｍｌ − ＮＤ ＮＤ ＦＣＳ−ＥＲＤＦ ＋ ＋ ＋ ＋ＬＦ １００μｇ／ｍｌ ＋ ＋ ＋ ─────────────────────────────────── ＋ 接着、 ± 弱く接着、 − 浮遊、 ＮＤ； 実施していない
【００１７】ラクトフェリンの細胞接着抑止効果は無血
清培地中でのみ発揮され、ＦＣＳ添加培地中では全く効
果がなかった。また、ラクトフェリンの添加量は１００
μｇで最良の結果が得られた。
清培地中でのみ発揮され、ＦＣＳ添加培地中では全く効
果がなかった。また、ラクトフェリンの添加量は１００
μｇで最良の結果が得られた。
【００１８】(2) 次に、ＧＩＴ培地で継代した動物細
胞、Ｌ−９２９を２×１０4 ／ｍｌの密度でＧＩＴ培
地、あるいは牛ラクトフェリンを添加溶解したＧＩＴ培
地に懸濁し、この１０ｍｌを１００ｍｍシャーレ (ファ
ルコン３００３) にまき込んで、３７℃で培養した。培
養３日後、６日後の細胞数を測定した。
胞、Ｌ−９２９を２×１０4 ／ｍｌの密度でＧＩＴ培
地、あるいは牛ラクトフェリンを添加溶解したＧＩＴ培
地に懸濁し、この１０ｍｌを１００ｍｍシャーレ (ファ
ルコン３００３) にまき込んで、３７℃で培養した。培
養３日後、６日後の細胞数を測定した。
【００１９】このさいの増殖曲線を図１に示す。図中─
●─は（ＧＩＴ培地）での培養を、─〇─は〔ＧＩＴ＋
牛ラクトフェリン（ｂＬｆ）培地〕での培養をそれぞれ
示し、両者は培養当初細胞数が２×１０4 ／ｍｌであっ
たが、培養３日目に前者は７．７５×１０4 ／ｍｌ、後
者は１３．７５×１０4 ／ｍｌ、６日目にそれぞれ６
１．０×１０4 ／ｍｌ、７６．２５×１０4 ／ｍｌとな
った。このことから、ラクトフェリン添加培地中で浮遊
培養させても、Ｌ−９２９細胞は良好に増殖することが
わかる。なお（ＧＩＴ培地）で培養したときは、細胞は
容器に付着して増殖した。しかし、５００μｇ／ｍｌあ
るいは１ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンを添加すると細胞
増殖は著しく抑制された。したがってラクトフェリンの
添加濃度は５００μｇ／ｍｌ以下、特に１００μ〜３０
０μｇ／ｍｌが好ましい。
●─は（ＧＩＴ培地）での培養を、─〇─は〔ＧＩＴ＋
牛ラクトフェリン（ｂＬｆ）培地〕での培養をそれぞれ
示し、両者は培養当初細胞数が２×１０4 ／ｍｌであっ
たが、培養３日目に前者は７．７５×１０4 ／ｍｌ、後
者は１３．７５×１０4 ／ｍｌ、６日目にそれぞれ６
１．０×１０4 ／ｍｌ、７６．２５×１０4 ／ｍｌとな
った。このことから、ラクトフェリン添加培地中で浮遊
培養させても、Ｌ−９２９細胞は良好に増殖することが
わかる。なお（ＧＩＴ培地）で培養したときは、細胞は
容器に付着して増殖した。しかし、５００μｇ／ｍｌあ
るいは１ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンを添加すると細胞
増殖は著しく抑制された。したがってラクトフェリンの
添加濃度は５００μｇ／ｍｌ以下、特に１００μ〜３０
０μｇ／ｍｌが好ましい。
【００２０】(3) さらにスピナーフラスコを用いた撹拌
培養におけるラクトフェリンの効果について検討した。
培養には１００ｍｌ容のスピナーフラスコ（柴田）を用
い、１００ｍｌのＧＩＴ培地、あるいは１００μｇ／ｍ
ｌの牛ラクトフェリンを添加した１００ｍｌのＧＩＴ培
地にＬ−９２９細胞を細胞密度５×１０4 ／ｍｌとなる
ように浮遊させ、培養を開始した。撹拌子は６０−１０
０回転／分で回転させた。培養４日目および７日目に、
細胞密度を測定した。この際ＧＩＴ培地では細胞塊（ｃ
ｌｕｍｐ）を形成し細胞の分散性が低かったので、コマ
ゴメピペットでよく細胞を分散させた後、細胞密度を測
定した。しかし、ラクトフェリン添加培地では、このよ
うな現象を示さず、細胞の分散性は良好であった。
培養におけるラクトフェリンの効果について検討した。
培養には１００ｍｌ容のスピナーフラスコ（柴田）を用
い、１００ｍｌのＧＩＴ培地、あるいは１００μｇ／ｍ
ｌの牛ラクトフェリンを添加した１００ｍｌのＧＩＴ培
地にＬ−９２９細胞を細胞密度５×１０4 ／ｍｌとなる
ように浮遊させ、培養を開始した。撹拌子は６０−１０
０回転／分で回転させた。培養４日目および７日目に、
細胞密度を測定した。この際ＧＩＴ培地では細胞塊（ｃ
ｌｕｍｐ）を形成し細胞の分散性が低かったので、コマ
ゴメピペットでよく細胞を分散させた後、細胞密度を測
定した。しかし、ラクトフェリン添加培地では、このよ
うな現象を示さず、細胞の分散性は良好であった。
【００２１】図２に示すように、牛ラクトフェリンを添
加した培地（−〇−）中では良好な細胞増殖が見られ、
培養７日目には、１．１４×１０6 ／ｍｌの密度に到達
した。細胞の分散性も良好であった。ＧＩＴ培地（−●
−）のみでは増殖が遅かったが、浮遊撹拌培養に適応し
た細胞増殖も見られた。しかし、培養７日目の到達密度
は４．２×１０5 ／ｍｌであり、牛ラクトフェリン添加
培養の半分以下の密度であった。
加した培地（−〇−）中では良好な細胞増殖が見られ、
培養７日目には、１．１４×１０6 ／ｍｌの密度に到達
した。細胞の分散性も良好であった。ＧＩＴ培地（−●
−）のみでは増殖が遅かったが、浮遊撹拌培養に適応し
た細胞増殖も見られた。しかし、培養７日目の到達密度
は４．２×１０5 ／ｍｌであり、牛ラクトフェリン添加
培養の半分以下の密度であった。
【００２２】
【発明の効果】本発明の実施により、接着性動物細胞の
接着抑止効果を有する動物細胞用培地が提供される。ま
たこの細胞用培地を使用することにより、接着性動物細
胞を接着性担体を用いる等特別の手段を用いなくとも浮
遊培養することが可能となる。
接着抑止効果を有する動物細胞用培地が提供される。ま
たこの細胞用培地を使用することにより、接着性動物細
胞を接着性担体を用いる等特別の手段を用いなくとも浮
遊培養することが可能となる。
【図１】Ｌ−９２９細胞をＧＩＴ培地及びこれに牛ラク
トフェリンを１００μｇ／ｍｌ濃度になるように添加し
た培地での増殖曲線を示す。
トフェリンを１００μｇ／ｍｌ濃度になるように添加し
た培地での増殖曲線を示す。
【図２】Ｌ−９２９細胞をスピナーフラスコで培養した
際の増殖曲線を示す。
際の増殖曲線を示す。
Claims (4)
- 【請求項１】 ラクトフェリンを接着抑止因子として無
血清培地に含有せしめて接着性動物細胞を接着担体に接
着させずに浮遊化させて培養することのできる接着性動
物細胞浮遊培養のための無血清培地 - 【請求項２】 接着性動物細胞培養時におけるラクトフ
ェリン濃度が無血清培地当り１００〜５００μｇ／ｍｌ
である請求項１記載の接着性動物細胞浮遊培養のための
無血清培地 - 【請求項３】 請求項１または請求項２記載の無血清培
地を用いて接着性動物細胞を接着担体に接着させずに浮
遊化させて培養することを特徴とする接着性動物細胞の
浮遊培養法 - 【請求項４】 接着性動物細胞がＬ−９２９、Ｖｅｒｏ
またはＨｅｌａＳ−３である請求項３記載の接着性動物
細胞の浮遊培養法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2417091A JP2947488B2 (ja) | 1990-12-29 | 1990-12-29 | 接着性動物細胞の浮遊培養のための無血清培地及びこれを用いた浮遊培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2417091A JP2947488B2 (ja) | 1990-12-29 | 1990-12-29 | 接着性動物細胞の浮遊培養のための無血清培地及びこれを用いた浮遊培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0866184A JPH0866184A (ja) | 1996-03-12 |
| JP2947488B2 true JP2947488B2 (ja) | 1999-09-13 |
Family
ID=18525229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2417091A Expired - Lifetime JP2947488B2 (ja) | 1990-12-29 | 1990-12-29 | 接着性動物細胞の浮遊培養のための無血清培地及びこれを用いた浮遊培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2947488B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006109367A1 (ja) * | 2005-04-05 | 2006-10-19 | Obihiro University Of Agriculture And Veterinary Medicine | 細胞遊離法、細胞遊離液、細胞培養法、細胞培養液、細胞液、細胞液製剤、細胞定着法及び細胞定着液 |
| US7214260B2 (en) | 2003-06-05 | 2007-05-08 | Fuji Xerox Co., Ltd. | Ink set for ink jet recording, ink jet recording method and ink jet recording apparatus |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20210062139A1 (en) * | 2017-12-28 | 2021-03-04 | Kaneka Corporation | Cell aggregation suppressor |
| CN110904025A (zh) * | 2019-10-08 | 2020-03-24 | 上海源培生物科技股份有限公司 | Vero细胞的无血清悬浮驯化方法 |
-
1990
- 1990-12-29 JP JP2417091A patent/JP2947488B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7214260B2 (en) | 2003-06-05 | 2007-05-08 | Fuji Xerox Co., Ltd. | Ink set for ink jet recording, ink jet recording method and ink jet recording apparatus |
| WO2006109367A1 (ja) * | 2005-04-05 | 2006-10-19 | Obihiro University Of Agriculture And Veterinary Medicine | 細胞遊離法、細胞遊離液、細胞培養法、細胞培養液、細胞液、細胞液製剤、細胞定着法及び細胞定着液 |
| JPWO2006109367A1 (ja) * | 2005-04-05 | 2008-10-02 | 国立大学法人帯広畜産大学 | 細胞遊離法、細胞遊離液、細胞培養法、細胞培養液、細胞液、細胞液製剤、細胞定着法及び細胞定着液 |
| JP4724836B2 (ja) * | 2005-04-05 | 2011-07-13 | 国立大学法人帯広畜産大学 | 細胞遊離法、細胞遊離液、細胞培養法、細胞培養液、細胞液、細胞液製剤、細胞定着法及び細胞定着液 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0866184A (ja) | 1996-03-12 |
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