JP2001174461A - 免疫学的測定方法及び当該方法に使用する測定試薬 - Google Patents

免疫学的測定方法及び当該方法に使用する測定試薬

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JP2001174461A
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Kazuhiko Imoto
和彦 井本
Koji Ushizawa
幸司 牛澤
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 免疫比濁法又は免疫比ろう法において、血漿
を被検試料とする場合に特有の非特異反応の影響を抑
制、回避し、測定対象成分を正確に測定する免疫学的測
定方法の提供。 【解決手段】 血漿と測定試薬との抗原抗体反応によっ
て生じる濁度変化又は散乱強度変化に基づいて対象成分
を測定する方法において、反応液中にカルシウムイオ
ン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン及びマグネ
シウムイオンから選ばれる2価金属イオンを添加して反
応を行う免疫学的測定方法、並びにこれに用いられる測
定試薬。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、血漿を被検試料と
する免疫比濁法又は免疫比ろう法における非特異的な濁
りによる測定値への影響を抑制、回避し、測定対象成分
を正確に測定する免疫学的測定方法に関する。
【0002】
【従来の技術】近年、免疫血清分野、脂質領域分野等の
領域において、抗原抗体反応を利用して生体中の成分を
測定する方法、特に抗原抗体反応によって生じる濁度変
化又は散乱強度変化を利用した測定方法である免疫比濁
法や免疫比ろう法によるCRP、IgG、IgA、IgM、C3、C4、
ASO、Rf、アポリポ蛋白等を対象とする測定の自動分析
機器への適用が増大する傾向にある。
【0003】これらの測定方法においては、測定試料中
に含まれる対象成分以外の成分に起因して、非特異反応
による濁りが生ずることにより、対象成分の正確な測定
が妨げられることが知られている。そのため、ポリオキ
シエチレンアルキルエーテル等の界面活性剤を添加する
ことにより、非特異反応による濁り(乳ビ等)を抑制し
ている。また、特開平8-211057号公報には、マグネシウ
ムイオンの存在下で対象物を測定することにより、補
体、リウマチ因子、熱変性蛋白質等に起因する濁りによ
る測定値への影響を回避する方法が開示されている。
【0004】ところで、上記免疫比濁法や免疫比ろう法
を実施するに際し用いる血液試料は、採血形態により血
清と血漿に大別できる。これら血清又は血漿を測定試料
とする場合、一般生化学検査においては、一部の項目を
除き両試料間で大差ない測定値が得られる。しかし、免
疫比濁法や免疫比ろう法による血漿を測定試料とする測
定では、血漿に特有の非特異反応による影響、例えばフ
ィブリノーゲン等の凝固物質、それらに由来する各種因
子、関連する蛋白等による影響が生じ、そのため血清を
用いた場合の測定との間に誤差が生じるという問題があ
った。
【0005】このような血漿を被検試料とする場合に特
有の濁りは、界面活性剤の添加により乳ビの影響を回避
し、かつ特開平8-211057号公報記載の技術を用いて補
体、リウマチ因子、熱変性蛋白質等に起因する濁りの影
響を回避したとしてもなお、解消は不可能であった。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、血
漿を被検試料とする免疫比濁法又は免疫比ろう法におけ
る、血漿特有の非特異反応による影響を抑制又は回避可
能な測定方法を提供することを目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】かかる実情において本発
明者らは鋭意研究を重ねた結果、まったく意外にも、前
記特開平8-211057号公報においては補体、リウマチ因
子、熱変性蛋白質等に起因する非特異的濁りの抑制効果
がないとされているカルシウムイオン若しくはストロン
チウムイオン、又は同公報に記載のないバリウムイオン
を反応液中に添加することにより、更には同公報におい
ては効果の得られないとされている低濃度のマグネシウ
ムイオンを反応液中に添加することにより、血漿試料に
特有の濁りの発生を回避できることを見出し、本発明を
完成するに至った。
【0008】すなわち本発明は、血漿と測定試薬との抗
原抗体反応によって生じる濁度変化又は散乱強度変化に
基づいて対象成分を測定する方法において、反応液中に
カルシウムイオン、ストロンチウムイオン及びバリウム
イオンから選ばれる2価金属イオンを添加して反応を行
うことを特徴とする免疫学的測定方法、並びにこれに用
いられる測定試薬を提供するものである。
【0009】また本発明は、血漿と測定試薬との抗原抗
体反応によって生じる濁度変化又は散乱強度変化に基づ
いて対象成分を測定する方法において、反応液中に1mM
以上5mM未満のマグネシウムイオンを添加して反応を行
うことを特徴とする免疫学的測定方法、並びにこれに用
いられる測定試薬を提供するものである。
【0010】
【発明の実施の形態】本発明方法が適用される、抗原抗
体反応によって生じる濁度変化又は散乱強度変化に基づ
く測定方式としては、免疫比濁法及び免疫比ろう法が挙
げられ、そのいずれにおいても、カルシウムイオン、ス
トロンチウムイオン、バリウムイオン又はマグネシウム
イオン(以下、「2価金属イオン」という)の存在下で
反応を行うことにより、血漿を測定試料とする場合に問
題となる非特異反応による影響を回避でき、血清を試料
とする場合との一致性の高い、精度の高い測定が可能と
なる。本発明方法においては、反応液中にこれら2価金
属イオンを添加することのほかは、通常の免疫比濁法又
は免疫比ろう法の操作に従えばよく、またその測定装置
についても、自動分析装置、分光光度計等、いずれの装
置を用いることもできる。
【0011】本発明において反応液中に添加される2価
金属イオンの濃度は、カルシウムイオン、ストロンチウ
ムイオン又はバリウムイオンにあっては、抗原抗体反応
を行う溶液中の最終濃度として、1〜25mMの範囲が好ま
しく、更には2.5〜10mM、特に3.5〜7.0mMの範囲が好ま
しい。またマグネシウムイオンにあっては、抗原抗体反
応を行う溶液中の最終濃度として、1mM以上5mM未満の
範囲であり、好ましくは2.5mM以上5mM未満、特に3.5〜
4.5mMの範囲である。なお、ここで2価金属イオンの濃
度は、あくまでも「添加される」量のみに関するもので
あり、被検試料である血漿中に最初から含まれる量を考
慮したものではない。
【0012】2価金属イオンの添加手段は特に限定され
るものではないが、例えば塩化合物の形で添加する方法
が挙げられる。かかる塩化合物としては、水に溶解し、
抗原抗体反応を阻害しないものであれば特に限定される
ものではなく、例えば塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン
原子との塩;酢酸、グルコン酸、プロピオン酸、パント
テン酸等の有機酸との塩などが挙げられ、なかでも塩化
物が好ましい。
【0013】これら2価金属イオンの反応液への添加時
期は特に限定されず、緩衝液中に2価金属イオンを添加
しておき、これを測定対象成分を含む血漿試料に加えた
後、測定対象成分に対する抗体又は抗原を含む溶液を加
えて混合してもよく、また血漿試料に2価金属イオンを
あらかじめ添加しておき、測定対象成分に対する抗体又
は抗原を含む溶液を加えて混合してもよく、更には測定
対象成分に対する抗体又は抗原を含む溶液にあらかじめ
2価金属イオンを添加しておき、血漿試料を混合しても
よい。
【0014】すなわち、免疫比濁法又は免疫比ろう法を
行うための測定用試薬を、測定対象成分に対する抗原又
は抗体と共に2価金属イオンを含むものとすれば、この
測定用試薬を用いて測定を行うことにより、血漿に特有
の非特異反応の影響を抑制又は回避でき正確な測定を行
うことができる。この場合に試薬中に添加する2価金属
イオンの量は、当該測定用試薬を用いて抗原抗体反応を
行わせる反応液中の最終濃度(添加分)として前記範囲
になるような量とすればよい。
【0015】本発明の測定方法で用いられる緩衝液とし
ては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、グ
ッド緩衝液等が挙げられ、反応時のpHは6〜10程度が好
ましい。また、反応凝集剤として、ポリエチレングリコ
ール、デキストラン等の高分子化合物を測定対象物に応
じて適宜選択して用いることができる。更に、反応系の
安定化剤として、糖、蛋白、界面活性剤等を添加するこ
ともできる。
【0016】本発明の測定方法による測定対象成分とし
ては、免疫比濁法又は免疫比ろう法により測定できるも
のであれば何れでもよく、例えばCRP、IgG、IgA、IgM、
C3、C4、ASO、RF、アポリポ蛋白、プレアルブミン等が
挙げられる。
【0017】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0018】実施例1 (1) 測定用試料の調製 EDTA-2Naを含む採血管にて健常人より採血し、遠心分離
を行った上清の血漿を測定用試料とした。
【0019】(2) 反応用試液 i)第一試液 6.0w/v%のポリエチレングリコール6000、0.1w/v%のナ
トリウムアジド、1.5w/v%のポリオキシエチレン(7)ア
ルキル(C9)エーテル、及び5mMの2価金属塩(塩化カル
シウム、塩化マグネシウム、塩化バリウム又は塩化スト
ロンチウム)を含む100mM 2-アミノ-2-ヒドロキシメチ
ル-1,3-プロパンジオール(Tris)-塩酸緩衝液(pH8.
5)を第一試液とした。
【0020】ii)第二試液 10単位/mlの抗ヒトCRP抗血清、200mMの塩化ナトリウム
及び0.1w/v%のナトリウムアジドを含むTris-塩酸緩衝
液(pH7.5)を第二試液とした。
【0021】(3) 免疫比濁法によるCRPの測定 日立自動分析装置7170型を用いて、測定用試料12μlに
第一試液240μlを混合し、37℃に加温した。測定波長80
0nm/340nmにおける吸光度を約20秒間隔で16点測定し、
この16点目の吸光度を「吸光度1」とする。続いて第二
試液80μlを混合後、37℃に加温し、測定波長800nm/340
nmにおける吸光度を約20秒間隔で18点測定し(計34
点)、この34点目の吸光度を「吸光度2」とする。得ら
れた吸光度1及び2から、以下の式に従って吸光度変化
量を計算した。
【0022】吸光度変化量=(吸光度2)−(252/33
2)×(吸光度1)
【0023】(4) 結果 上記34点の吸光度のプロットを図1に、吸光度変化量を
表1に示す。
【0024】
【表1】
【0025】図1から明らかなように、2価金属イオン
を添加しない第一試液と試料との反応は徐々に増大して
いるのに対し、5mM(反応液中の最終濃度として3.6m
M)の2価金属イオンを添加した第一試液と血漿との反
応は安定している。また表1より、2価金属イオンを含
まない第一試液を用いた場合、その測定値は不正確にな
ることが確認された。
【0026】実施例2 第一試液として、塩化カルシウムを0〜25.0mMの濃度範
囲で添加して調製したものを使用して、実施例1と同様
の測定方法により吸光度を測定し、その変化量を算出し
た。吸光度のプロットを図2に、吸光度変化量を表2に
示す。なお対照として、血清を測定用試料とした場合に
ついて同様に吸光度の測定及びその変化量の算出を行っ
た結果を併せて示す。
【0027】
【表2】
【0028】表2から明らかなように、塩化カルシウム
無添加ではマイナスの変化量をとるのに対し、第一試液
中に2.5〜25mM(反応液中の最終濃度として1.8〜18.0m
M)の塩化カルシウムを添加することにより、血清を用
いて測定した場合と同程度の安定な測定値が得られた。
【0029】実施例3 第一試液として、塩化マグネシウムを0〜5mMの濃度範
囲で添加して調製したものを使用して、実施例1と同様
の測定方法により吸光度を測定し、その変化量を算出し
た結果を表3に示す。なお対照として、血清を測定用試
料とした場合について同様に吸光度の測定及びその変化
量の算出を行った結果を併せて示す。
【0030】
【表3】
【0031】表3から明らかなように、塩化マグネシウ
ム無添加ではマイナスの変化量をとるのに対し、第一試
液中に2.5mM(反応液中の最終濃度として1.8mM)又は5
mM(反応液中の最終濃度として3.6mM)の塩化マグネシ
ウムを添加することにより、血清を用いて測定した場合
と同程度の安定な測定値が得られた。
【0032】実施例4 実施例1における第二試液として抗ヒトCRP抗血清の代
わりに、抗ヒトアポE抗血清、抗ヒトIgM抗血清又は抗R
F抗血清を同単位濃度で添加したものを調製し、第一試
液に塩化カルシウムを添加しない場合と5mMの塩化カル
シウムを添加した場合について、実施例1と同様の測定
方法により、吸光度変化量を算出した。また対照とし
て、測定試料を血清とした場合についても同様に吸光度
変化量を求め、その結果を表4に示す。
【0033】
【表4】
【0034】表4から明らかなように、塩化カルシウム
無添加では全く異常な測定値を示すのに対し、第一試液
中に5mM(反応液中の最終濃度として3.6mM)の塩化カ
ルシウムを添加することにより、血清を用いて測定した
場合と同程度の安定な測定値が得られた。
【0035】
【発明の効果】本発明によれば、血漿を被検試料とする
免疫比濁法又は免疫比ろう法における、血漿特有の非特
異反応による影響を抑制又は回避し、測定対象成分の正
確な測定が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図1】血漿を測定試料として免疫比濁法によりCRPを
測定した場合における各種2価金属イオンの添加による
効果を示す図である。
【図2】血漿を測定試料として免疫比濁法によりCRPを
測定した場合における各種濃度のカルシウムイオンの添
加による効果を示す図である。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 血漿と測定試薬との抗原抗体反応によっ
    て生じる濁度変化又は散乱強度変化に基づいて対象成分
    を測定する方法において、反応液中にカルシウムイオ
    ン、ストロンチウムイオン及びバリウムイオンから選ば
    れる2価金属イオンを添加して反応を行うことを特徴と
    する免疫学的測定方法。
  2. 【請求項2】 血漿と測定試薬との抗原抗体反応によっ
    て生じる濁度変化又は散乱強度変化に基づいて対象成分
    を測定する方法において、反応液中に1mM以上5mM未満
    のマグネシウムイオンを添加して反応を行うことを特徴
    とする免疫学的測定方法。
  3. 【請求項3】 血漿中の測定対象成分に対する抗原又は
    抗体と、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン及び
    バリウムイオンから選ばれる2価金属イオンとを含む免
    疫学的測定用試薬。
  4. 【請求項4】 血漿中の測定対象成分に対する抗原又は
    抗体と、反応液中で1mM以上5mM未満となる量のマグネ
    シウムイオンとを含む免疫学的測定用試薬。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105572384A (zh) * 2016-01-12 2016-05-11 柏荣诊断产品(上海)有限公司 一种高性价比的人血液免疫球蛋白g检测试剂盒
WO2017090103A1 (ja) * 2015-11-25 2017-06-01 デンカ生研株式会社 免疫分析方法及び試薬キット
CN111024963A (zh) * 2019-12-27 2020-04-17 桂林英美特生物技术研究所 一种液体稳定、抗冰冻的免疫比浊法载脂蛋白b单试剂

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