JP2001091839A

JP2001091839A - 共焦点顕微鏡

Info

Publication number: JP2001091839A
Application number: JP26532899A
Authority: JP
Inventors: Tomio Endo; 富男遠藤
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1999-09-20
Filing date: 1999-09-20
Publication date: 2001-04-06

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、簡単な構成で、最適な明るさの共
焦点画像を得ることができる共焦点顕微鏡を提供する。【解決手段】光源２１からの光をランダムピンホールパ
ターン部２５ａと開口部２５ｂを有する回転ディスク２
５を一定速度で回転させた状態で、回転ディスク２５の
ランダムピンホールパターン部２５ａを通過した像か開
口部２５ｂを通過した像かを判断するマーカ２５ｅを検
出するフォトインタラプタ３５の検出出力に同期してシ
ャッタ３１を開閉動作させランダムピンホールパターン
部２５ａを通過した複合画像または開口部２５ｂを通過
した明視野画像をＣＣＤカメラ３２で所定時間に亘って
撮像し、この撮像により得られた複合画像と明視野画像
の蓄積画像データの差分演算から共焦点画像を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、光を利用して試料
の微小構造や３次元の形状を高速に観察・測定する共焦
点顕微鏡に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、共焦点顕微鏡として、多数のピン
ホールをそのピンホール径の１０倍程度の間隔で螺旋状
に配置したＮｉｐｋｏｗディスクと呼ばれるディスクを
用いたものが知られている。

【０００３】ところが、Ｎｉｐｋｏｗディスクを用いた
共焦点顕微鏡は、隣接するピンホールからのクロストー
クを除く必要があるため、隣接するピンホールの間隔を
大きくせざるを得ないことから、光源からの光の利用率
が１％程度低く、暗い画像しか得られないという問題が
あった。

【０００４】そこで、このようなＮｉｐｋｏｗディスク
を用いた共焦点顕微鏡の改良を図ったものとして、Ｒ．
Ｊｕｓｋａｉｔｉｓ，Ｔ．Ｗｉｌｓｏｎらの”Ｅｆｆｉ
ｃｉｅｎｔｒｅａｌ−ｔｉｍｅｃｏｎｆｏｃａｌ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｗｉｔｈｗｈｉｔｅｌｉｇ
ｈｔｓｏｕｒｃｅｒ”，Ｎａｔｕｒｅ誌Ｖｏｌ．３８
３Ｏｃｔ．１９９６ｐ８０４−８０６およびＷＯ９７
／３１２８２に開示されたものがある。

【０００５】図７は、Ｔ．Ｗｉｌｓｏｎらによる共焦点
顕微鏡の概略構成を示すもので、ハロゲン光源または水
銀光源などの光源１からの光の光路上に光学レンズ２お
よびビームスプリッタ３を配置し、試料６まで光源１か
らの光を導くためのビームスプリッタ３の反射光路上に
回転ディスク４、対物レンズ５を配置し、また、ビーム
スプリッタ３の透過光路上に結像レンズ８を介してＣＣ
Ｄカメラ９を配置し、このＣＣＤカメラ９にモニタ１１
を有するコンピュータ１０を接続している。

【０００６】ここで、回転ディスク４は、回転軸７を介
して図示しないモータの軸に連結され一定の回転速度で
回転するもので、図８に示すように、多数のピンホール
の配置がランダムで、ピンホール総面積が２５〜５０％
になるようなランダムピンホールパターン部４ａと光が
自由に透過できる開口部４ｂと、これらランダムピンホ
ールパターン部４ａと開口部４ｂとの間にあって光を遮
断する遮光部４ｃ、４ｄを有している。

【０００７】このような構成において、光源１から出射
された光が光学レンズ２を介してビームスプリッタ３に
入射され、ビームスプリッタ３で反射された光は、一定
の回転速度で回転する回転ディスク４に入射され、この
回転ディスク４のランダムピンホールパターン部４ａと
開口部４ｂを交互に通過し、対物レンズ５を介して試料
６に照射される。また、試料６からの反射光は、対物レ
ンズ５を介し、再度回転ディスク４のランダムピンホー
ルパターン部４ａと開口部４ｂを通過し、さらにビーム
スプリッタ３を透過し、結像レンズ８を介してＣＣＤカ
メラ９で撮像される。この場合、ＣＣＤカメラ９は、回
転ディスク４の回転速度に同期して撮像タイミングが制
御されていて、ランダムピンホールパターン部４ａと開
口部４ｂを通過した２つの画像を別々に撮像する。

【０００８】そして、ＣＣＤカメラ９の出力画像データ
は、コンピュータ１０に送られ、蓄積されるとともに、
画像処理される。この場合、ランダムピンホールパター
ン部４ａを介して得られる画像データは、ピンホールの
密度が通常のＮｉｐｋｏｗディスクの数十倍であるた
め、共焦点画像に非共焦点画像が加わった複合画像デー
タとして得られ、また、開口部４ｂを介して得られる画
像データは、非共焦点画像である明視野画像データとし
て得られるので、これら画像データを差分演算すること
によって共焦点画像データを求め、この共焦点画像をモ
ニタ１１に表示するようにしている。

【０００９】なお、試料６表面近傍の立体画像を得る場
合は、試料６を垂直移動ステージやピエゾ素子によって
図示上下方向（イ）に移動させ、高さ方向で撮像位置を
変えた共焦点画像を取得し、撮像位置を変えた複数の共
焦点画像をコンピュータ１０により合成することにより
立体画像をモニタ１１に表示する。

【００１０】従って、このようなＴ．Ｗｉｌｓｏｎらの
共焦点顕微鏡によれば、Ｎｉｐｋｏｗディスクを用いた
ものでは、光源からの入射光に対して利用できる試料か
らの光が０．５〜１％程度しかなかったものが、２５〜
５０％も利用できるようになり、数十倍明るい画像を得
ることができるので、従来、応用できないとされていた
生物観察への適用の可能性がある。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、生物の
蛍光観察を行なうような場合、試料から発せられる蛍光
は非常に微弱な光であるため、一般には、撮像部分に冷
却したＣＣＤなどを用い、通常のＴＶレートより露出時
間を長くして撮像を行なうようにしている。

【００１２】しかし、このようにＣＣＤの露出時間を長
くして撮像を行なうとなると、上述したＴ．Ｗｉｌｓｏ
ｎらの共焦点顕微鏡では、モータの回転に同期して回転
ディスク４を１回転させる間にランダムピンホールパタ
ーン部４ａを介して得られる複合画像データと開口部４
ｂを介して得られる明視野画像データを１枚ずつ取得で
きる構成になっているので、ＣＣＤの露出時間を長くす
るだけでは、これら２つの画像データが混合されてしま
い共焦点画像データのみを取り出すことが難しくなる。

【００１３】そこで、ＣＣＤの露出時間が長くなる分だ
けモータの回転速度を遅くすればよいが、ＣＣＤの露出
時間は、観察する試料の蛍光の明るさによって変化され
るため、モータの回転速度を任意に可変できるようにす
ることが必要である。しかし、通常使用されるＤＣモー
タやＡＣモータの回転数を広い範囲で安定に可変させる
には、複雑な制御回路が必要になったり、精度の高い減
速ギアが必要になるなど、装置が大掛かりとなり価格的
に高価になるという問題点がある。また、モータとして
パルスモータを使用することも考えられるが、パルスモ
ータの場合振動や発熱が生じ、これらが観察系に悪影響
を及ぼすなどの問題点があった。

【００１４】本発明は上記事情に鑑みてなされたもの
で、簡単な構成で、最適な明るさの共焦点画像を得るこ
とができる共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。

【００１５】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明は、
光源からの光を試料に導く光学系と、光の通過部分と光
の遮蔽部分が混在した半通過領域と光が通過する開口部
を有し、その回転により前記光路上に前記半通過領域ま
たは開口部を位置させる回転部材と、この回転部材の前
記光路上に位置される前記回転部材の半通過領域または
開口部を判別する判別手段と、この判別手段での判別結
果に従って前記半通過領域を通過された複合画像または
前記開口部を通過された明視野画像のそれぞれの積分画
像データを取得する積分画像取得手段と、この積分画像
取得手段で取得した積分画像データから前記試料の共焦
点画像を生成する共焦点画像生成手段とを具備したこと
を特徴としている。

【００１６】請求項２記載の発明は、積分画像取得手段
が、前記判別手段による前記回転部材の半通過領域また
は開口部の判別結果に同期させて開閉されるシャッタを
有することを特徴としている。

【００１７】この結果、請求項１記載の発明によれば、
回転部材が複数回転される間、半通過領域を通過された
複合画像または開口部を通過された明視野画像を積分す
るようにしたので、蛍光観察のように撮像時間が長く設
定されたような場合も、回転部材の回転速度を変化する
ことなく、最適な明るさになるまで複合画像または明視
野画像を蓄積することで、これら積分画像から最適な明
るさの共焦点画像を得ることができる。

【００１８】また、請求項２記載の発明によれば、複合
画像または明視野画像の蓄積画像は、シャッタの開閉動
作により得られるので、装置としても簡単で、価格的に
も安価にできる。

【００１９】

【発明の実施の形態】以下、本発明の一実施の形態を図
面に従い説明する。

【００２０】図１は、本発明が適用される共焦点顕微鏡
の概略構成を示している。図において、２１は光源で、
この光源２１は、ハロゲン光源または水銀光源からなっ
ている。そして、光源２１からの光の光路上に光学レン
ズ２２、励起フィルタ２３およびビームスプリッタ２４
を配置している。

【００２１】この場合、励起フィルタ２３は、後述する
試料２８での蛍光を励起する波長を選択するためのもの
である。

【００２２】ビームスプリッタ２４から試料２８までの
反射光路上には回転ディスク２５、第１の結像レンズ２
６、対物レンズ２７が配置され、また、ビームスプリッ
タ２４の透過光路上に蛍光フィルタ２９、第２の結像レ
ンズ３０、シャッタ３１を介してＣＣＤカメラ３２が配
置される。そして、このＣＣＤカメラ３２にモニタ３４
を有するコンピュータ３３を接続している。

【００２３】この場合、回転ディスク２５は、回転軸２
５１を介して図示しないモータの軸に連結され一定の回
転速度で回転するものであり、図２に示すように、多数
のピンホールの配置がランダムで、ピンホール総面積が
２５〜５０％になるような半通過領域からなるランダム
ピンホールパターン部２５ａと光が自由に通過できる開
口部２５ｂと、これらランダムピンホールパターン部２
５ａと開口部２５ｂとの間にあって光を遮断する遮光部
２５ｃ、２５ｄを有し、さらに回転ディスク２５周縁に
沿って、ランダムピンホールパターン部２５ａを通過し
た複合画像か、開口部２５ｂを通過した明視野画像かを
判断するためのマーカ２５ｅを有している。また、この
ような回転ディスク２５周縁に対応させてフォトインタ
ラプタ３５を配置している。フォトインタラプタ３５
は、マーカ２５ｅの状態から、ＣＣＤカメラ３２に投影
されている像がランダムピンホールパターン部２５ａを
通過した複合画像か、開口部２５ｂを通過した明視野画
像かを判別できるようにしている。

【００２４】蛍光フィルタ２９は、試料２８からの蛍光
の波長のみを通し、光源２１からの光を遮断するもので
ある。

【００２５】シャッタ３１は、シャッタ制御部３６の指
示により開閉制御されるもので、シャッタ制御部３６
は、フォトインタラプタ３５の検出出力に同期してラン
ダムピンホールパターン部２５ａを通過した複合画像ま
たは開口部２５ｂを通過した明視野画像のみを通過させ
るようにシャッタ３１の開閉を制御するようになってい
る。

【００２６】ＣＣＤカメラ３２は、コンピュータ３３か
らの指示により撮像の開始、終了、撮像画像の転送など
が制御され、ここでの撮像時間は、試料２８の蛍光の明
るさによって異なるが、数秒程度に設定されている。

【００２７】コンピュータ３３は、シャッタ制御部３６
によるシャッタ３１の開閉制御に対応させてＣＣＤカメ
ラ３２で撮像された画像データを取込み演算処理してモ
ニタ３４に表示させるようにしている。

【００２８】次に、このように構成した実施の形態の動
作を説明する。

【００２９】いま、光源２１から出射された光が光学レ
ンズ２２、励起フィルタ２３を介してビームスプリッタ
２４に入射されると、ビームスプリッタ２４で反射され
た光は、一定の回転速度で回転する回転ディスク２５の
ランダムピンホールパターン部２５ａと開口部２５ｂと
に交互に照射される。この照射された光は、第１の結像
レンズ２６、対物レンズ２７を介して試料２８に照射さ
れる。

【００３０】次いで、試料２８からの蛍光は、対物レン
ズ２７、第１の結像レンズ２６を介し、回転ディスク２
５のランダムピンホールパターン部２５ａと開口部２５
ｂを通過し、さらにビームスプリッタ２４を透過し、蛍
光フィルタ２９により試料２８からの蛍光成分のみを通
過し、第２の結像レンズ３０を介してＣＣＤカメラ３２
に結像する。

【００３１】この状態から、まず、図３に示すタイミン
グチャートにしたがって、ＣＣＤカメラ３２により複合
画像を撮像する。

【００３２】この場合、コンピュータ３３の指示によ
り、同図（ａ）に示す「Ｈ」レベル信号をＣＣＤカメラ
３２に与え、所定の期間、撮像状態を維持させる。この
撮像時間は、試料２８の蛍光の明るさによって異なるが
数秒程度に設定される。

【００３３】この状態で、回転ディスク２５の回転に応
じて、回転ディスク２５のマーカ２５ｅの状態を検出す
るフォトインタラプタ３５により、同図（ｂ）に示すよ
うにランダムピンホールパターン部２５ａに対応する
「Ｈ」レベル信号と、開口部２５ｂに対応する「Ｌ」レ
ベル信号が交互に発生する。

【００３４】このフォトインタラプタ３５の検出出力
は、シャッタ制御部３６に入力される。シャッタ制御部
３６は、同図（ｃ）に示すように、フォトインタラプタ
３５により入力されるランダムピンホールパターン部２
５ａに対応する「Ｈ」レベル信号に同期して、シャッタ
３１に対し「Ｈ」レベル信号を開放指示信号として出力
し、この間だけシャッタ３１を開状態に移行させる。こ
れにより、シャッタ３１は、ランダムピンホールパター
ン部２５ａが光路上に位置した時にのみ開放するように
制御されることとなり、試料２８からの蛍光は、ランダ
ムピンホールパターン部２５ａを通過し、共焦点画像に
非共焦点画像が加わった複合画像としてＣＣＤカメラ３
２に撮像される。このＣＣＤカメラ３２により撮像され
る複合画像データは、所定時間が経過して、コンピュー
タ３３からの指示が同図（ａ）に示す「Ｌ」レベル信号
に移行するまで積分され、その後、この積分画像データ
は、コンピュータ３３に送られる。

【００３５】次に、図４に示すタイミングチャートにし
たがって、ＣＣＤカメラ３２により明視野画像を撮像す
る。

【００３６】この場合、コンピュータ３３の指示によ
り、同図（ａ）に示す「Ｈ」レベル信号をＣＣＤカメラ
３２に与え、所定の期間、撮像状態を維持させる。この
撮像時間も、試料２８の蛍光の明るさによって異なるが
数秒程度に設定される。

【００３７】この状態で、回転ディスク２５の回転に応
じて、回転ディスク２５のマーカ２５ｅの状態を検出す
るフォトインタラプタ３５より、同図（ｂ）に示すよう
にランダムピンホールパターン部２５ａに対応する
「Ｈ」レベル信号と、開口部２５ｂに対応する「Ｌ」レ
ベル信号が交互に発生する。

【００３８】このフォトインタラプタ３５の検出出力
は、シャッタ制御部３６に入力される。シャッタ制御部
３６は、同図（ｃ）に示すように、フォトインタラプタ
３５より入力される開口部２５ｂに対応する「Ｌ」レベ
ル信号に同期して、シャッタ３１に対し「Ｈ」レベル信
号を開放指示信号として出力し、この間だけシャッタ３
１を開状態に移行させる。これにより、シャッタ３１
は、開口部２５ｂが光路上に位置した時にのみ開放する
ように制御されることとなり、試料２８からの蛍光は、
開口部２５ｂを通過し、非共焦点画像である明視野画像
としてＣＣＤカメラ３２に撮像される。このＣＣＤカメ
ラ３２により撮像される明視野画像データは、所定時間
が経過して、コンピュータ３３からの指示が同図（ａ）
に示す「Ｌ」レベル信号に移行するまで積分され、その
後、この積分画像データは、コンピュータ３３に送られ
る。

【００３９】その後、コンピュータ３３により、複合画
像データと明視野画像データの差分演算が実行されて共
焦点画像データが生成され、この生成された共焦点画像
データがモニタ３４に表示される。

【００４０】なお、この実施の形態では、蛍光観察の場
合を述べたが、励起フィルタ２３と蛍光フィルタ２９を
取り除けば、通常の反射型顕微鏡による試料観察に適用
できる。また、試料２８から得られる光量が十分ある場
合は、回転ディスク２５の回転数を、例えば１８００ｒ
ｐｍにしておけば、ＣＣＤカメラ３２に代えて通常のＮ
ＴＳＣ仕様のカメラを用いることができる。

【００４１】したがって、このような構成とすれば、回
転ディスク２５を一定速度で回転させた状態で、シャッ
タ３１の開閉動作に同期させてランダムピンホールパタ
ーン部２５ａを通過した複合画像または開口部２５ｂを
通過した明視野画像をＣＣＤカメラ３２で所定時間に亘
って撮像し、この撮像により得られた複合画像と明視野
画像の蓄積画像データの差分演算から共焦点画像データ
を得るようにしたので、非常に暗い試料２８である蛍光
観察のようにＣＣＤカメラ３２での撮像時間が長く設定
されたような場合も、従来のように回転ディスク２５の
回転速度を変化することなく、最適な明るさになるまで
複合画像データまたは明視野画像データを蓄積すること
で、これら積分画像データから最適な明るさの共焦点画
像を得ることができる。

【００４２】また、複合画像または明視野画像の蓄積画
像データは、シャッタ３１の開閉動作により得られるの
で、従来の回転ディスク２５の回転速度を変化させるた
め複雑な制御回路や精度の高い減速ギアを用いたものと
比べて、装置として簡単にでき、価格的にも安価にでき
る。

【００４３】なお、上述した実施の形態では、シャッタ
３１をＣＣＤカメラ３２の直前に配置しているが、光源
２１と光学レンズ２２との間または励起フィルタ２３と
ビームスプリッタ２４との間に配置するようにしてもよ
い。このようにすると、ランダムピンホールパターン部
２５ａを介して複合画像を、開口部２５ｂを介して明視
野画像を取込んでいる以外は、光源２１からの光が試料
２８側に照射しないようにできるので、試料２８の蛍光
の褪色を極力防止できる。

【００４４】また、上述した実施の形態では、回転ディ
スク２５として、多数のピンホールを有するランダムピ
ンホールパターン部２５ａを有するものを述べたが、図
５に述べたように、ランダムピンホールパターン部２５
ａに代えて、多数のラインを形成したラインパターン部
２５ｆを有するものを用いることができる。この場合、
図５は、図２と同一部分には、同符号を付している。

【００４５】さらに、回転ディスク２５に代えて、図６
に示すように円筒状をなす回転体を用いることもでき
る。この場合、円筒状の回転体４１の周面に沿って多数
のピンホールをランダムに形成したランダムピンホール
パターン部４１ａと光が自由に通過できる開口部４１ｂ
と、これらランダムピンホールパターン部４１ａと開口
部４１ｂとの間にあって光を遮断する遮光部４１ｃ、４
１ｄを有し、さらに回転体４１の一方開口端の周縁に沿
って、ランダムピンホールパターン部４１ａを通過した
像か、開口部４１ｂを通過した像かを判断するためのマ
ーカ４１ｅを有するようにしている。このような回転体
４１を用いても上述したと同様な効果を期待できる。

【００４６】

【発明の効果】以上述べたように本発明によれば、簡単
な構成で、しかも最適な明るさの共焦点画像を得ること
ができる共焦点顕微鏡を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施の形態の概略構成を示す図。

【図２】一実施の形態に用いられる回転ディスクの概略
構成を示す図。

【図３】一実施の形態の動作を説明するためのフローチ
ャート。

【図４】一実施の形態の動作を説明するためのフローチ
ャート。

【図５】本発明に用いられる他の回転ディスクの概略構
成を示す図。

【図６】本発明に用いられる他の回転ディスクの概略構
成を示す図。

【図７】従来の共焦点顕微鏡の概略構成を示す図。

【図８】従来の共焦点顕微鏡に用いられる回転ディスク
の概略構成を示す図。

【符号の説明】

２１…光源２２…光学レンズ２３…励起フィルタ２４…ビームスプリッタ２５…回転ディスク２５１…回転軸２５ａ…ランダムピンホールパターン部２５ｂ…開口部２５ｃ．２５ｄ…遮光部２５ｅ…マーカ２５ｆ…ラインパターン部２６…第１の結像レンズ２７…対物レンズ２８…試料２９…蛍光フィルタ３０…第２の結像レンズ３１…シャッタ３２…ＣＣＤカメラ３３…コンピュータ３４…モニタ３５…フォトインタラプタ３６…シャッタ制御部４１…回転体４１ａ…ランダムピンホールパターン部４１ｂ…開口部４１ｃ．４１ｄ…遮光部４１ｅ…マーカ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 2F065 AA51 AA53 DD00 DD06 DD09 FF42 GG02 GG03 GG12 HH13 JJ03 JJ09 JJ26 LL04 LL22 LL26 LL30 LL46 NN11 NN17 PP24 QQ14 QQ25 SS02 SS13 2H052 AA08 AA09 AC04 AC07 AC08 AF21 AF25

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】光源からの光を試料に導く光学系と、光の通過部分と光の遮蔽部分が混在した半通過領域と光
が通過する開口部を有し、その回転により前記光路上に
前記半通過領域または開口部を位置させる回転部材と、この回転部材の前記光路上に位置される前記回転部材の
半通過領域または開口部を判別する判別手段と、この判別手段での判別結果に従って前記半通過領域を通
過された複合画像または前記開口部を通過された明視野
画像のそれぞれの積分画像データを取得する積分画像取
得手段と、この積分画像取得手段で取得した各画像データから前記
試料の共焦点画像を生成する共焦点画像生成手段とを具
備したことを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】前記積分画像取得手段は、前記判別手段
による前記回転部材の半通過領域または開口部の判別結
果に同期させて開閉されるシャッタを有することを特徴
とする請求項１記載の共焦点顕微鏡。