JP2000517162A - 樹木の遺伝的形質転換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は樹木の形質転換における改良であり、形質転換されている樹木にとってストレスが少ない方法を提供する。ユーカリプツス・グロブルス(Eucalyptusglobulus)のような困難なことで悪名高い樹木をうまく形質転換することができる。発芽の開始が可能な部位に切り込みを入れ、１種以上の外来ＤＮＡ配列を坦持する無害にしたアグロバクテリウム細胞をこの切り込みに導入し、この部位を形質転換された苗条が生じるのに十分な期間選択工程に処する。

Description

【発明の詳細な説明】 樹木の遺伝的形質転換 本発明は、外来遺伝子、すなわち、特定の樹木それ自体以外の源に由来する遺 伝子の導入による樹木の種の形質転換に関する。 植物種への新規遺伝子の導入は文献で十分に考察されており、トマト、ジャガ イモ、アブラナ及びコメを含む多くの１年生及び多年生作物にとって日常的なも のとなっている。導入された遺伝子は、例えば、植物全体と特定の植物部位との 両方に表れるタンパク質及び炭水化物の質、収穫後の生理機能、光合成能力及び 害虫耐性を含む、様々な固有の、及び一般的な特徴を変更するために用いられて いる。植物種の性質に応じて、直接ＤＮＡ転移（微量注入、バイオリスティック (biolistics)、ミクロフィブリル、化学穿孔、電気穿孔）並びに微生物アグロバ クテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）及びアグロバク テリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）による準自然(quasi-natur al)感染の両者を含む様々な新規遺伝子の導入方法が開発されている。 今日まで、森林種の遺伝的形質転換は、幾つかの例で昆虫耐性、除草剤耐容能 、創傷応答及び木質化に影響を及ぼす遺伝子を含むより商業的に関連する形質が 導入されているものの、ほとんどマーカー遺伝子の使用に制限されている。 樹木種の遺伝的形質転換では特別な問題が提示されており(Jouaninら 1993） 、その１つは、形質転換に対する感受性を制限する樹木それ自体の扱いにくい性 質である。多くの樹木はin vitroでの成長に劣り、これには、in vitro発芽系の 増殖速度の遅さ、並びに苗条及び根の再生能(regenerability)の低さが含まれる 。加えて、樹木は、通常、栽培１年生畑作物よりも広範囲の、個々の遺伝型によ るin vitro挙動を示す。さらに、遺伝的形質転換に対する感受性には大きな種間 及び種内の変動が存在し、樹木の中には生理学的年齢に伴って感受性が著しく低 下するものもある。植物細胞に新規ＤＮＡを一時的に導入することは可能である が、植物ゲノムへのＤＮＡの安定な組み込みなしでは導入した遺伝子の発現は短 命のものである。さらなる問題は、形質転換の前、形質転換細胞の選別の間、 の間、及び形質転換した植物全体の再生の間に、培養において組織を維持し、か つ増殖させることが困難であることである。組織の健康及び生存も上述の形質転 換及び組み込み現象にとって意味のあるものであり、本発明の目的に関連する。 安定な形質転換を得る最も一般的に用いられる方法は、アグロバクテリウムの 改変株（modified strain）によるものである。多くの樹木種は野生型アグロバ クテリウム・ツメファシエンスによる感染に対して感受性ではあるが、追加遺伝 子での安定な形質転換は僅か数種において達成されているだけである（例えば、 Brackpoolら 1990；DeBlock、1990及びMcGranahanら、1990）。成功は、これら の種の特定の遺伝型、主として容易に形質転換され、かつ増殖するものに限られ ている。 用いられる方法は、一般に、 i）標的外植片、例えば、葉ディスク、根の断片、幹の切片、胚軸、子葉、胚 芽もしくは細胞懸濁液を植物組織から切り出し、 ii）この外植片を適切な培地で数時間もしくは数日間前培養(pre-culture)し 、 iii）この外植片をＤＮＡベクターを有する細菌細胞と共存培養(co-cultivati on)して創傷植物細胞を介して感染させ、 iv）選択培地に移して、（a）残留細菌細胞の増殖を停止させ、かつ（b）形質 転換されている植物細胞を選択し、及び v）１つ以上を培地に移して外植片派生カルスからの完全な植物体の再生を開 始させること、 のような一連の工程を必要とする。 この基本的な方法論は、切り出しによって組織外植片に生じる生理学的損傷、 細菌との共存インキュベーション(co-incubation)、及び化学的選択剤を施すこ とを包含し、これらの工程の各々は、通常は組織が有する苗条再生能力に悪影響 を及ぼす激しいストレスを形質転換細胞及び組織片に与える。これらの処理の影 響は、単離された組織外植片を用いる必要性がなくなり、したがって、健康状態 、生存能(survivability)、及び再生能の点で妥協がなされた場合に減少する。 特に樹木作物においては、改善された生殖質のその後の有性生殖的又は無性生 殖的増殖は確立された実務であり、この増殖能力はクローン林学（clonal fores t ry）のための改善された材料に維持されるべき重要な特徴である。形質転換植物 を生成する方法は、その後その形質転換された種が正常に増殖するあらゆる他の 方法によって増殖するのを妨げるべきではない。 本発明の目的は、植物の組織及び形質転換細胞に対する圧迫の水準が最小限に 留められた、樹木の形質転換方法を提供することにある。 また、本発明の目的は、樹木の形質転換方法であって、非常に高い生存可能性 及び良好な再生能を有する植物組織に対して実施され、ここで、この特性は形質 転換され、もしくは改善された生殖質の増殖能の維持を確実なものとするのを助 ける方法を誘導することにもある。 さらに、本発明の目的は、形質転換細胞を含む苗条の再生の可能性を最大にす る、予め決められた発芽開始能力の帯域(zone)を標的とすることである。 本発明は、あらゆるＤＮＡ配列を樹木に導入するための手段を提供する。より 具体的には、この方法は表現型の特徴、例えば、造林上の特性、木質(timber)、 果実もしくは葉における処理の質の特性（processing quality traits）、又は 成木の生殖上の生物季節、に影響を及ぼすことが可能な遺伝子又はＤＮＡ配列を 利用することが可能である。したがって、この方法は、クローン増殖による改善 された樹木の生成及び播種果樹園（seed orchards）における有性生殖の生産量 のより良好な制御の両者を可能にする。また、所望であれば、これらの新規遺伝 子を有する形質転換された樹木の子孫にさらなる形質転換を施し、改善を高める ことも可能である。 針葉樹を形質転換するための方法がEllisら（1992）によって記述されており 、この方法は、ラリックス・デシデュア（Larix decidua）の実生の子葉節の切 り込み(cut)に野生型アグロバクテリウム・リゾゲネスを導入することを包含す る。しかしながら、この方法は苗条原基の腫瘍状塊を生じるのみであり、完全な 形質転換植物の再生は達成されなかった。 本発明は腫瘍状成長の問題を克服し、これまで形質転換することが困難であり 、そのため完全な形質転換植物の報告が公表されていない少なくとも１種の他の 樹木種からの形質転換植物の再生に適する方法を提供する。 本発明は、根付いているか、もしくはそれ以外の樹木の形質転換方法を提供し 、 この方法は、発芽の開始が可能な部位に切り込みを入れる工程、この切り込みに １以上の外来ＤＮＡ配列を坦持する無害にしたアグロバクテリウム細胞を導入す る工程、並びにこの部位を栄養素、成長調節剤及び形質転換された細胞が耐性を 有する選択作用物質を含む培地に外来ＤＮＡ配列を有する形質転換された苗条を 生成させるのに十分な期間接触させる選択工程を包含する。 この切り込みが発芽の開始部位に裂け目を形成することが好ましい。この切り 込みは、処理している樹木の大きさにより約１mm以上の深さであり得る。ここで 用いられる場合、「樹木」という用語には実生、（切断物(cuttings)、その他か ら誘導される）苗条及び切断物、又はそれらがより成長した植物が含まれる。 発芽開始部位は、子葉節、葉腋分裂組織又は頂端分裂組織が適切であり得る。 形質転換しようとする樹木が実生である場合、好ましくは、発芽開始部位は子 葉節である。好ましくは、樹木の実生を形質転換するための方法は、アグロバク テリウム細胞を導入する前、その最中又はその後に予め存在する発芽開始物を全 て除去する工程をさらに含む。この導入は接種工程として知られ得る。 形質転換しようとする樹木が樹木の苗条である場合、好ましくは、発芽開始部 位は葉腋分裂組織又は頂端分裂組織である。接種工程の前、その最中又はその後 の予め存在する分裂組織細胞の除去はこの特定の方法においては必要ない。 好ましくは、選択工程の前に、発芽開始部位を栄養素及び成長調節剤を含む培 地と特定の期間接触させる。これは、共存インキュベーション工程として知られ る。発芽開始部位が実生に見出される場合には、好ましくは、この共存インキュ ベーション工程は直立した(upright)実生と共に行う。この共存インキュベーシ ョン工程は試験管内で行うことが適切である。 好ましくは、選択工程の培地にはアグロバクテリウム株を殺す抗生物質も含ま れる。 好ましくは、樹木は地表での植物発芽を示すものである。より好ましくは、こ の方法は、例えばユーカリ属、ポプラ属、マルス属（Malus）及びプルヌス属（P runus）、並びにアグロバクテリウム・ツメファシエンス又はアグロバクテリウ ム・リゾゲネスによる感染に感受性である樹木種のいずれか１種に適用可能なも のである。この方法は、ユーカリ属の特定の種、例えば、形質転換に成功した後 にそこから形質転換植物を生成することが困難であることでこれまで悪名高かっ たユーカリプツス・グロブルス（Eucalyptus globulus）、の形質転換に特に有 用である。 好ましくは、これらの樹木は、それらが感染及び／又は共存インキュベートさ れるときに無傷の根系を有する。 好ましくは、樹木種はユーカリプツス・グロブルス又はユーカリプツス・グラ ンジス（Eucalyptus grandis）である。 本発明は、さらに、上述の方法に従って形質転換された樹木を提供する。 本発明は、さらにまた、上述の方法に従って形質転換された遺伝子を有する細 胞を提供する。また、本発明は、この方法に従って形質転換された樹木の珠芽、 この方法に従って形質転換された樹木の実生、この方法に従って形質転換された 樹木の種子、及びこの方法に従って形質転換された樹木の生殖質を提供する。 本発明が容易に理解され、かつ容易に実施されるように、例として、以下の実 施例を参照する。 ユーカリプツス・グロブルスの実生の形質転換を以下の手順で行った。実施例１．形質転換用のユーカリプツス・グロブルスの実生の調製 Ｅ．グロブルスの種子の表面を、次亜塩素酸ナトリウム及び洗浄剤を含む家庭 用漂白剤の溶液を用いて殺菌した。殺菌の濃度及び時間の長さは重要ではなかっ た。通常は、種子を、無菌の逆浸透水中の家庭用漂白剤の10％v／v希釈液中で、 回転式振とう機で連続的に撹拌しながらインキュベートした。30分後に殺菌溶液 を新しくし、第２のインキュベーションを60分間行った。第１のインキュベーシ ョン期間中に、漂白溶液の色がしばしば非常に濃くなった。最後に、塩素臭及び 残留洗浄剤の泡を取り除くのに必要なだけの回数繰り返して洗浄しながら、種子 を清浄無菌水中で浸透した。 殺菌した種子を、マジェンタ（Magenta）培養容器中の5g／lショ糖を含む無菌 0.4％水寒天培地の表面上に種子を載置することにより播種した。種子は、培地 の表面上に十分な間隔をおいて、培養容器当たり種子25個の密度で播種した。こ れらの培養容器を、20℃、16時間の日長の低光強度の下の成長棚に置き、種子 を発芽させて10日間成長させた。この段階で、大部分の実生が、子葉が十分に開 き、その間に幼芽をようやく見ることができる段階に到達するはずである。 これらの実生は、形質転換細胞が生存し、かつ増殖する頑強な環境をもたらす ことができるような時期のものである。また、これらの実生は、比較的容易な操 作しうるに十分な大きさのものである。実施例２．共存インキュベーションのためのアグロバクテリウム・ツメファシエ ンス細胞の調製 アグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA105株を用いて共存培養を行った。 この株は、β−グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子をコードし、かつ抗生物質カナ マイシンに対する耐性を付与するNPTII遺伝子をもコードするプラスミドp35S−G USintを有する。Ｅ．グロブルスの組織をこのプラスミドベクターで形質転換す ることによりこれらの２種類のマーカー遺伝子がその植物細胞中に発現し、それ により、カナマイシンの存在下での健全な成長によって示される、形質転換細胞 のみを含み、又はそれらを優勢に含む組織の選択、及びその後の色素生成基質ｘ −gluc（５−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−Ｄ−グルクロナイド）の 添加時にβ−グルクロニダーゼによって触媒される反応によるそれらの特定の形 質転換細胞の同定が可能となる。50mg／lカナマイシンを含むＬ−ブロス培地５0 mlに細菌の貯蔵培養物を接種することにより細胞を調製した。28℃で一晩成長さ せた後、遠心によって細胞を集め、使用前に10mlの１％グルコースに再懸濁した 。 Ｌ−ブロス 10g／lバクトトリプトン 5g／l酵母抽出物 5g／l塩化ナトリウム実施例３．Ｅ．グロブルス及びアグロバクテリウム・ツメファシエンスの共存培 養 実施例１の方法によって調製した発芽実生を、形質転換ベクターを坦持する細 菌との共存培養のために無菌条件下で試料採取した。Ｅ．グロブルスの形質転換 に最適の共存培養法を決定するため、実施例２の方法によって調製したアグロバ クテリウム・ツメファシエンス細胞を用いる３種類の異なる感染方法を評価した 。 方法１．実生を胚軸に沿ってほぼ半分に切断し、下半分と根を廃棄した。メス の先端を用いて幼芽を切り取り、葉柄の葉身を取り除いた。その後、切り取った 胚軸をペトリ皿中の固形培地１上に水平に横たえた。使い捨てピペットから水平 の胚軸に細菌懸濁液を滴下することにより、この組織にＡ．ツメファシエンスを 接種した。 方法２．実生を胚軸に沿ってほぼ半分に切断し、下半分と根を廃棄した。メス の先端を用いて幼芽を切り取った。次に、メスを用いて、子葉節を通して長軸方 向に各胚軸の頂部に深さ１mmの裂け目を切り込んだ。各々の切開を行う直前にメ スの刃を細菌の懸濁液に浸漬することにより、Ａ．ツメファシエンス細胞の接種 を同時に行った。その後、接種した胚軸を、各々の基部をペトリ皿中の固形培地 １に挿入することにより直立させた。ペトリ皿当たり20個の胚軸をそのように配 置した。 方法３．実生を、メスの先端を用いて幼芽を切り取った他は、完全な根系を付 けて無傷のままにした。メスを用いて、子葉節を通して長軸方向に各胚軸の頂部 に深さ１mmの裂け目を切り込んだ。各々の切開を行う直前にメスの刃を細菌の懸 濁液に浸漬することにより、Ａ．ツメファシエンス細胞の接種を同時に行った。 接種した、幼芽を取り除いた実生を個別の25mm径の試験管に移し、それらの根系 を20mlの培地２に挿入して直立させた。 100本の実生を方法１及び３で調製し、200本の実生を方法２で調製した。 共存培養を、10日間、24℃、16時間の日長の低光強度の下で継続した。この期 間の後、方法２及び３で調製した外植片をそれらそれぞれの培養容器又は試験管 から取り除き、さらに操作を加えた。 子葉のラミナを方法２で調製した胚軸から切り取った。子葉、根及び胚軸の下 半分のラミナを方法３で調製した実生から取り除いた。 ３種類の処理のいずれかで調製したあらゆる外植片に表れた腋生の苗条も取り 除いた。次に、３種類の方法の全てに由来するこれらの切り詰められた(truncat ed)胚軸を、抗生物質クラホラン（セホタキシム）を含む選択培地１上に水平に 置 いて残留A.ツメファシエンス細胞及びカナマイシンを取り除き、NPTII遺伝子を 発現する形質転換植物細胞を選択した。切り取った胚軸をペトリ皿当たり20個配 置した。次いで、これらを、10日後に選択培地２に、さらに４週間後に同じ培地 の新鮮なプレート上に移した。24℃、16時間の日長の低光強度でインキュベーシ ョンを行った。 さらに４週間後、緑色（非漂白）組織領域を示す外植片を同じ培地の新たなプ レートに移した。さらに一定の間隔で新鮮なプレートに移すことにより、選択し た組織を維持した。結果 ユーカリプツス・グロブルスの形質転換から期待される再生体の数は少なかっ た。培養培地（方法1）と接触させて水平に共存培養した切除胚軸からは再生体 は得られず、組織の健康状態は急激に低下した。方法２及び３の両者では再生体 が得られた。時間の経過に伴う生存の減少は、おそらく、多くの再生遺伝子座が 非形質転換細胞によって形成され、引き続くカナマイシン選択に屈服したことを 示す。方法２を用いて調製し、かつ共存培養した組織に由来する再生の効率は、 方法３で調製した組織のものよりも僅かに低かった。 方法３を、最小ではあるが正確な組織の創傷、根と胚軸との間の維管束系の維 持、胚軸と外来性成長物質を含む培養培地との最小限の直接接触、及び細菌の過 剰成長を最小限に留める細菌細胞の正確な接種により特徴付けた。方法３をＥ． グロブルス組織の形質転換を選択する方法として採用した。実施例４．形質転換方法の改変及び導入遺伝子の発現 Ｅ．グロブルスの苗条及びＡ．ツメファシエンスの懸濁液を実施例１及び２と 同様に調製した。実施例３の最適接種方法の３種類の改変を以下の通りに評価し た。 １．頭部切除及び裂け目の作製（すなわち、子葉節全体及び子葉を取り除いた） 。 ２．幼芽除去及び裂け目の作製（実施例３、方法３と同様）。 ３．幼芽除去及び切り込みの作製（胚軸の表面にその長さ方向に沿ってメスの刃 で切り込みを入れた）。 加えて、３種類のさらなる改変も調べた。 ４．幼芽切除及び皮下注射針での穿刺。 ５．幼芽切除、切り込みの作製及びピンセットを用いる頂端の押し潰し。 ６．幼芽切除及び押し潰し。 接種に続いて、全ての苗条を培地３を収容する個別の管に移植し、成長室内の 無灯棚に置いて共存培養した。 ３週間後、３種類の主な処理からの苗条を、以下のようなx−gluc検定による β−グルクロニダーゼ活性（GUS＋）のために試料採取した。100μｌのジメチル ホルムアミドに溶解した3mgのx−glucを0.5％トリトンX100及び1mM EDTAを含む 50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）で10mlにした。試料組織を、小容量 のこの試薬中において、37℃で16時間、暗中でインキュベートした。続いて、こ の組織を、イソプロパノール中において室温で４時間ないし数日間インキュベー トすることにより脱色した。β−グルクロニダーゼ活性を組織中の青色に染色さ れた領域の存在により検出した。 僅か１週間後に試料採取した苗条に対してもx−gluc検定を行った。これは、 ６種類の方法の全てから選択された大部分の試料においてGUS活性を示した。 実施例３において確立された選択方法、この場合の処理２は、最も高い生存率 及び最高の、すなわち最も持続する形質転換応答の両者をもたらす。これは、導 入遺伝子の一時的というよりむしろ安定な発現を表すものである。 全ての場合において、青く染まる、おそらくは特徴のない(demarking)形質転 換細胞の主要領域は裂け目の周囲に位置していた。処理１ではこれは孤立した細 胞の分散した「小班点(speckles)」の形態をとり、これに対して、処理２ではよ り大きな濃く染まった青色の領域が非常に優勢であった。これは、これらの領域 から苗条が再生した結果、形質転換植物が生じていることを示唆する。切り込み を入れた胚軸の形質転換は、一般に、頂端に裂け目を形成したものよりも劣って いた。 さらなる比較として、切除胚軸形質転換法（実施例３、方法1）に対して幾つ かの改良も加えた。これらには、メスで胚軸に切り込みを入れて様々な長さの傷 を様々な数入れること、及び胚軸組織を無菌のワイヤブラシで穿刺することが含 まれていた。これらの処理のうち、形質転換体の再生に成功したものはなかった 。実施例５．導入遺伝子を発現する苗条の再生 120本の実生を実施例３に記述される通りに調製し、共存培養した。共存培養 期間の最後に、16個の胚軸をx−gluc検定のために無作為に選択した。残りの胚 軸は選択及び再生のために調製した。胚軸の下半分に加えて根及び子葉のラミナ を、発芽しているあらゆる子葉腋と共に除去した。次に、残りの胚軸切片を、選 択培地１のプレート上にプレート当たり10個の密度で水平に置いた。プレートを ラップで密封し、成長室の無灯棚に置いた。４週間後、胚軸を同じ培地の新鮮な プレートに移し、緑色カルスの成長について検査した。次いで、あらゆる緑色カ ルスを選択培地３に移し、分化している苗条に近いと思われるものを選択培地４ 上に置いた。 x−gluc検定のために試料採取した16個の胚軸のうち、１個を除いた全てが青 く染色した領域を示した。 １週間後、全ての胚軸外植片が全体的に脱色された外見を示し、子葉腋は観察 されなかった。選択培地上で４週間後、100個の胚軸のうちの８個が非常に濃い 緑色で健常な外見のカルスを示し、さらに10個が中程度に緑色のカルスを有して いた。13個のカルスを選択培地３に移し、５個を選択培地４に移した。 選択培地４に移した後、４個のカルスが苗条を再生した。さらに６週間後、こ れらはx−gluc検定によりGUS＋であることが示された。 本発明は用いられるＤＮＡ配列及び配列の組み合わせに限定を加えるものでは なく、したがって、既述のようにいかなる範囲の特徴の導入に対しても適用する ことができる。また、本発明は、同じかもしくはより早い世代で既に形質転換さ れている材料に対しても適用することができる。 上記実生法の別の代替法において、in vitro培養における樹木苗条の発芽開始 部位、例えば、腋生分裂組織又は頂端分裂組織を、分裂組織領域を同じ方法で切 開し、遺伝的に改変されたアグロバクテリウム株に感染させることにより処理す ることができる。所定期間の後、形質転換細胞を外植片として取り出して培養し 、形質転換された植物を生成させることが可能である。 付録 用いられた培養培地−半強度(half-strength)の培地を用いる培地２及び1／4 強度の培地を用いる培地３を除いては、全て完全強度のLinsmaier及びSkoogの培 地（1965）に基づくものであった。培地は以下の添加物を含んでいた。 培地１ 15g／l グルコース 10μＭ ゼアチン 5μＭ インドリル−３−酢酸 0.01％ プルロニック(pluronic)Ｆ−68 4g／l 寒天 培地２ 10g／l ショ糖 4g／l 寒天 培地３ 10g／l ショ糖 4g／l 寒天 1g／l 活性炭 選択培地１ 15g／l グルコース 10μＭ ゼアチン 5μＭ インドリル−３−酢酸 250mg／l クラホラン 30mg／l カナマイシン 7g／l 寒天 選択培地２ 15g／l グルコース 4μＭ ゼアチン 1μＭ インドリル−３−酢酸 250mg／l クラホラン 35mg／l カナマイシン 7g／l 寒天 選択培地３ 5μＭ ゼアチン 2μＭ インドリル−３−酢酸 250mg／l クラホラン 30mg／l カナマイシン 7g／l 寒天 選択培地４ 2μＭ ６−ベンジルアミノプリン 1μＭ インドリル−３−酢酸 250mg／l クラホラン 30mg／l カナマイシン 7g／l 寒天

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年２月１６日（１９９８．２．１６） 【補正内容】 請求の範囲（補正） １． 植物組織を傷つける工程、この傷つけた組織を外来ＤＮＡ配列を坦持する ＤＮＡベクターを有する細菌細胞に導入する工程、及び形質転換細胞を選択する 工程を包含するユーカリ属、ポプラ属、マルス属及びプルヌス属の樹木の形質転 換方法であって、子葉節、腋生分裂組織又は頂端分裂組織である根付いた樹木の 発芽の開始が可能な部位に切り込みを入れること、該切り込みに１以上の外来Ｄ ＮＡ配列を坦持する無害にしたアグロバクテリウム細胞を導入すること、及び該 部位を栄養素、成長調節剤及び該形質転換細胞が耐性を有する選択作用物質を含 む培地に外来ＤＮＡ配列を有する形質転換された苗条を生成させるのに十分な期 間接触させる選択工程を包含することを特徴とする方法。 ２． 前記切り込みが発芽開始部位に裂け目を形成する、請求の範囲第１項に記 載の方法。 ３． 前記切り込みが約１mm以上の深さである、請求の範囲第１項又は第２項に 記載の方法。 ４． 形質転換しようとする樹木が実生である場合、発芽開始部位が子葉節であ る、請求の範囲第１項に記載の方法。 ５． アグロバクテリウム細胞の導入前、その最中又はその後に予め存在する全 ての苗条初期体を除去する、請求の範囲第４項に記載の方法。 ６． 形質転換しようとする樹木が樹木の苗条である場合、発芽開始部位が腋生 分裂組織又は頂端分裂組織である、請求の範囲第１項に記載の方法。 ７． 前記発芽開始部位が腋生分裂組織又は頂端分裂組織であり、該腋生分裂組 織又は頂端分裂組織からは予め存在する全ての苗条初期体が除去されている、請 求の範囲第６項に記載の方法。 ８． 共培養工程で直立した実生を用いる、請求の範囲第４項に記載の方法。 ９． 選択工程の培地がアグロバクテリウム株を殺すための抗生物質をも含む、 請求の範囲第１項ないし第８項のいずれか１項に記載の方法。 10． 前記樹木がユーカリプツス・グロブルス又はユーカリプツス・グランジス である、請求の範囲第１項ないし第９項のいずれか１項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 ピーター、リチャードソン イギリス、ケンブリッジシェア、シービー ４ ６ゼット キュー、ケンブリッジ、ミ ルトン、ジ エルム 16

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 根付いているか、もしくはそれ以外の樹木の形質転換方法であって、発芽 の開始が可能な部位に切り込みを入れる工程、該切り込みに１以上の外来ＤＮＡ 配列を坦持する無害にしたアグロバクテリウム細胞を導入する工程、並びにこの 部位を栄養素、成長調節剤及び該形質転換細胞が耐性を有する選択作用物質を含 む培地に外来ＤＮＡ配列を有する形質転換された苗条を生成させるのに十分な期 間接触させる選択工程を包含する方法。 ２． 前記切り込みが発芽開始部位に裂け目を形成する、請求の範囲第１項に記 載の方法。 ３． 前記切り込みが約１mm以上の深さである、請求の範囲第１項又は第２項に 記載の方法。 ４． 前記発芽の開始が可能な部位が子葉節、腋生分裂組織又は頂端分裂組織で ある、請求の範囲第１項、第２項又は第３項に記載の方法。 ５． 形質転換しようとする樹木が実生である場合、発芽開始部位が子葉節であ る、請求の範囲第４項に記載の方法。 ６． アグロバクテリウム細胞の導入前、その最中又はその後に予め存在する全 ての苗条初期体を除去する、請求の範囲第５項に記載の方法。 ７． 形質転換しようとする樹木が樹木の苗条である場合、発芽開始部位が腋生 分裂組織又は頂端分裂組織である、請求の範囲第４項に記載の方法。 ８． 共存培養工程で直立した実生を用いる、請求の範囲第５項に記載の方法。 ９． 樹木が注入される場合及び／又は共存培養されるときにそれらが無傷の根 系を有する、請求の範囲第１項ないし第８項のいずれか１項に記載の方法。 10． 選択工程の培地がアグロバクテリウム株を殺すための抗生物質をも含む、 請求の範囲第１項ないし第９項のいずれか１項に記載の方法。 11． 請求の範囲第１項ないし第10項のいずれか１項に記載の方法であって、か つユーカリ属、ポプラ属、マルス属及びプルヌス属、並びにアグロバクテリウム ・ツメファシエンス又はアグロバクテリウム・リゾゲネスによる感染に感受性で ある樹木種のいずれか１種又は１種以上に適用される方法。 12． 前記樹木がユーカリプツス・グロブルス又はユーカリプツス・グランジス である、請求の範囲第１項ないし第11項のいずれか１項に記載の方法。 13． 請求の範囲第１項ないし第12項のいずれか１項に記述される方法に従って 形質転換された樹木。 14． 請求の範囲第１項ないし第12項のいずれか１項に記述される方法に従って 形質転換された遺伝子を有する細胞。 15． 請求の範囲第１項ないし第12項のいずれか１項に記述される方法に従って 形質転換された樹木の珠芽。 16． 請求の範囲第１項ないし第12項のいずれか１項に記述される方法に従って 形質転換された樹木の実生。 17． 請求の範囲第１項ないし第12項のいずれか１項に記述される方法に従って 形質転換された樹木の種子。 18． 請求の範囲第１項ないし第12項のいずれか１項に記述される方法に従って 形質転換された樹木の生殖質。 19． 本明細書の実施例に関して本明細書に実質的に既述される樹木の形質転換 方法。