JP2000516618A - がん性表現型を反転させるための、メラノーマ分化関連遺伝子（ｍｄａ ７）の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸を、前記遺伝子の発現が可能な条件下で前記がん細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させる方法を提供する。本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、上記遺伝子の遺伝子産物を前記がん性細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させる方法を提供する。本発明は、さらに、がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効なメラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む一定量の核酸またはメラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 がん性表現型を反転させるための、メラノーマ分化関連遺伝子（mda７）の使用 本願は、1996年６月16日に出願されたＵ.Ｓ.シリアルＮｏ.０８/６９６，５７ ３の一部継続出願であり、原出願の内容は、参照により本願の開示内容の一部と する。 ここに開示された本発明は、保健社会福祉省（the Department Health and Hu man Services）からのＮＣＩ/ＮＩＨ助成金Ｎｏ.ＣＡ３５６７５の下、政府援助 によりなされた。それ故、米国政府が本発明の一部権利をもっている。 本願を通して、種々の参照文献がかっこ内に引用されている。これら出版物の 全開示は、本発明の属する技術分野の状況をより完全に記載するため、参照によ り本願の開示内容の一部とする。これら参照文献の完全な書誌的引用は、一連の 実験の最後に見ることができる。発明の背景 がんは、腫瘍形成の正の制御因子および負の制御因子として機能する複数の遺 伝子の相互に関連した発現および抑制が関与する、複雑な多因子および多段階の プロセスである（１−５）。形質転換または腫瘍形成の優性表現型の導入に基づ く直接的クローニングストラテジーにより、正に作用するがん遺伝子が同定され た（６−９）。対照的に、がんの表現型を抑制する遺伝子の検出およびクローニ ングは、より困難で捕らえにくいことが分かった（10−15）。増殖および分化の 制御に直接的に関与する遺伝子を単離するための直接的アプローチには、活発に 増殖するがん細胞から構築されたｃＤＮＡライブラリーと不可逆的に増殖能を失 い且つ最終分化するように誘導されたがん細胞から構築されたｃＤＮＡライブラ リーとの差引き（subtraction）ハイブリダイゼーションが必要である（13、14 ）。この実験ストラテジーは、ヒトのメラノーマ細胞に適用されており、組換え ヒトインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）およびメゼライン（mezerein）（ＭＥＺ ）を用いた処理により最終分化を誘導して、ＤＮＡデータベースに以前に記載の ない新規メラノーマ分化関連（mda）遺伝子のクローニングに至った（13、14） 。増 殖および細胞周期の制御を仲介する際の特定のmda遺伝子の直接的な役割は、mda -６の同定およびクローニングにより明らかであり（13−16）、これはサイクリ ン依存性キナーゼｐ２１の普遍的な阻害剤と同一である（17）。増殖制御におけ るｐ２１の重要性は充分記載され、この遺伝子は、種々のアプローチを用いて幾 つかの研究室により、ＷＡＦ−１、ＣＩＰ−１、およびＳＤＩ−１として、個々 に単離された（18−20）。これらの研究により、増殖制御に関与する特定遺伝子 が誘導され、ヒトのがん細胞における増殖停止および最終分化のプロセスに関与 し得ることが示唆される。 mda-７遺伝子が、分化誘導剤（ＩＦＮ−βプラスＭＥＺ）で処理されたヒト・ メラノーマ（Ｈ０−１）の差引きライブラリーからクローニングされた（13、14 ）。完全長のmda-７のｃＤＮＡは、1718ヌクレオチドであり、その主要なオープ ンリーディングフレームは、Ｍｒが23.8ｋＤａである206アミノ酸の新規タンパ ク質をコードしている（21）。以前の研究により、mda-７はヒト・メラノーマ細 胞において増殖停止および最終分化誘導の役割として誘導されることが示唆され る（14、21）。また、mda-７の発現はメラノーマの進行とは逆の関連性がある。 即ち、活発に増殖する正常なヒトのメラニン細胞は、転移性ヒト・メラノーマ細 胞よりもmda-７をより多く発現する（21）。その上、mda-７は、一過性のトラン スフゥクションアッセイにおいて、およびデキサメタゾン（ＤＥＸ）誘導性mda- ７遺伝子を含む安定な形質転換細胞において、ヒト・メラノーマ細胞の増殖を抑 制する（21）。これらの研究は、mda-７がヒトのメラニン細胞およびメラノーマ の生理学に貢献し得ることを示しており、また、この遺伝子はヒト・メラノーマ 細胞で過剰発現したときに増殖抑制特性を有することを示している。 mda-７遺伝子は、また、国際特許協力条約出願Ｎｏ．ＰＣＴ/ＵＳ９４/１２１ ６０（国際出願日1994年10月24日、国際公開Ｎｏ．ＷＯ９５/１１９８６）に記 載されており、この内容は、参照により本願の開示内容の一部とする。 本発明は、mda-７が種々の起源（胸部、中枢神経系、子宮頸部、結腸、前立腺 および結合組織など）のがん細胞において有効な増殖抑制遺伝子であることを報 告する。コロニー形成の抑制は、ｐ５３および／または網膜芽細胞腫（ＲＢ）遺 伝子に欠陥を有するがん細胞、またはｐ５３およびＲＢの発現を欠損しているが ん細胞で起こる。対照的に、正常なヒト乳房の上皮細胞、ヒト皮膚の繊維芽細胞 およびラット胚の繊維芽細胞におけるmda-７の発現は、定量的に、がん細胞ほど は増殖抑制を誘導しない。mda-７は、ヒト子宮頸部のがん腫（HeLa）および前立 腺のがん腫（ＤＵ−145）細胞で安定に発現すると、増殖およびトランスフォー メーション関連特性に対して負の効果を示す。HeLa細胞に対するmda-７の効果は 、アンチセンスmda-７遺伝子を発現する遺伝的に改変されたＡｄ５ベクターの感 染により、ＭＤＡ-７タンパク質の存在しなくなった後には反転可能である。こ れらの観察により、mda-７ば、種々の遺伝的欠陥を示すヒトのがんにおいて、広 範囲の抑制作用を有する新規増殖抑制遺伝子であることが示唆される。発明の概要 本発明は、がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノ ーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸を、前記遺伝子の発現可能な条件下で がん細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させる方法 を提供する。本発明は、また、上記核酸を被検者のがん性細胞に導入することに より、被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法を提供す る。 本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、 メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物をがん細胞に導入することに より、前記がん細胞のがん性表現型を反転させる方法を提供する。本発明は、ま た、上記遺伝子産物を被検者のがん性細胞に導入することにより、被検者におけ るがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法を提供する。 本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効なメラノー マ分化関連遺伝子（mda-７）を含む一定量の核酸と、薬学的に許容可能なキャリ アとを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、また、がん細胞のがん性表現型 を反転させるために有効な上記遺伝子の一定量の遺伝子産物と、薬学的に許容可 能なキャリアとを含む薬学的組成物を提供する。図面の簡単な説明 図１．HeLa細胞における、ハイグロマイシン耐性コロニーの形成に対するmda- ７発現の効果。 HeLa細胞に、10μｇのｐＲＥＰ４ベクター（ＲＳＶベクター）、ｐＲＥＰ４ベク ターにアンチセンス配向でクローニングされたmda-７(ＲＳＶ−ＭＤＡ−７−ア ンチセンス)、またはｐＲＥＰ４ベクターにセンス配向でクローニングされたmda -７（ＲＳＶ−ＭＤＡ−７−センス）をトランスフェクションし、100μｇのハイ グロマイシンを含有する培地で選択した。 図２．ｐＲＥＰ４ベクターHeLa cl １細胞およびmda-７（Ｓ）を発現している HeLa cl ２細胞の単層増殖に対するアンチセンスmda-７の効果。 HeLa cl １（ｐＲＥＰ４ベクターで形質転換されたHeLaクローン）細胞およびHe Lacl ２（mda-７を発現するHeLaクローン）細胞を、アンチセンスmda-７を発現 する組み換えタイプ５アデノウイルス（Ａｄ５）［Ａｄ.mda-７（ＡＳ）］の１ ０プラーク形成ユニット/細胞での感染後に、または感染させないで、増殖させ た。結果は、＜１０％の差がある３サンプルの平均細胞数である。 図３．HeLa、HeLa cl １およびHeLa cl ２細胞における、高分子量−ＭＤＡ− ７複合（ＨＭＣ）タンパク質、ＭＤＡ-７タンパク質、アクチンタンパク質に対 するアンチセンスmda-７の効果。 HeLa細胞およびHeLa cl １細胞（ｐＲＥＰ４ベクターで形質転換されたHeLaクロ ーン）を、［³⁵Ｓ］メチオニンでラベルした１０プラーク形成ユニット/細胞の Ａｄ.mda-７（ＡＳ）で９６時間感染させるか(＋)または感染させないで(−)、 ＨＭＣ、ＭＤＡ-７およびアクチンタンパク質のレベルを免疫沈降解析により測 定した。HeLa cl ２（mda-７を発現するHeLaクローン）に関しては、１０プラー ク形成ユニット/ｍＬのＡｄ.mda-７（ＡＳ）による感染のタンパク質レベルに対 する効果を、＋24、＋48、＋72および＋96時間後に［³⁵Ｓ］メチオニンラベルの 細胞溶解物を免疫沈降解析することにより、測定した。HeLa cl ２細胞のコント ロール突然変異体Ａｄ５（Ｈ５dl 434）による感染の効果を、１０プラーク形成 ユニット/細胞での感染の96時間後に、［³⁵Ｓ］メチオニンラベルの細胞溶解物 を免疫沈降解析することにより測定した。 図４Ａ＆４Ｂ．ＤＥＸ誘導性mda-７遺伝子を含むＤＵ-145クローンにおける mda-７ＲＮＡおよびタンパク質の合成。 図４Ａ．１０^-6Ｍ ＤＥＸの存在下または非存在下で、96時間細胞を増殖させ 、全ＲＮＡを単離し、ノーザンブロッティングを行い、mda-７、ネオマイシン耐 性（Neo^R）遺伝子およびＧＡＰＤＨをプローブを用いて検出した。 図４Ｂ．１０^-6Ｍ ＤＥＸの存在下または非存在下で、96時間細胞を増殖させ 、細胞性タンパク質を［³⁵Ｓ］メチオニンでラベルし、ＭＤＡ-７およびアクチ ンタンパク質を認識する抗体を用いて免疫沈降させた。 図５．無胸腺のヌードマウスにおける、株化ヒト子宮頸部がん（HeLa）異種移 植片の増殖抑制。 図６．HeLa腫瘍体積比に対するＡｄ.mda-７ Ｓの効果。 結果は、Ａｄ.mda-７ Ｓがヌードマウスにおいてin vivoで腫瘍の進行を抑制で きることを示している。発明の詳細な説明 後述する実験の詳細な説明部分を理解し易くするため、ある程度頻繁に出てく る方法および／または用語は、Sambrookら（45）に説明がある。 本発明は、がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノ ーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸を、前記遺伝子の発現可能な条件下で がん細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させること を具備した方法を提供する。 本発明は、また、被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための 方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸分子を、被検者 の細胞内で前記遺伝子の発現が可能な条件下において被検者のがん性細胞に導入 することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法 を提供する。 核酸分子を細胞に導入する方法は、当該分野で周知である。裸の（naked）核 酸分子を直接的形質転換により細胞に導入することができる。或いは、核酸分子 をリポソーム中に埋め込むことができる。それ故、本発明は、裸のＤＮＡ技術、 アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バー ルウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶベクター、レトロ ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、リポソーム、抗体で被覆した リポソーム、または機械的もしくは電気的手段により核酸分子を細胞に導入する 上記方法を提供する。上記列挙した方法は、核酸分子を細胞に導入する実行可能 な手段の例として挙げたにすぎない。公知の他の方法を、本発明で使用すること もできる。 上記方法の一態様において、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）は、その発 現が調節配列の制御下にあるように調節配列に連結されている。さらに別の態様 において、調節配列は誘導的であるか、または構成的である。誘導プロモーター のような誘導的調節配列は、当該分野で公知である。構成的発現を指示すること ができるプロモーターのような調節配列も、当該分野で公知である。 別の態様において、調節配列は、組織特異的な調節配列である。このとき、md a-７遺伝子の発現は、組織特異的になるであろう。 上記方法の別の態様において、前記がん細胞は、がん細胞内に欠陥性の腫瘍抑 制遺伝子が存在することにより特徴づけられる。欠陥性の腫瘍抑制遺伝子には、 ｐ５３、網膜芽細胞腫（ＲＢ）またはｐ１６^ink4a遺伝子が含まれるが、これに 限定されない。 上記方法の一態様において、前記がん細胞は、がん細胞内に優性作用的（domi nant acting）がん遺伝子が存在することにより特徴づけられる。特に、優性作 用的がん遺伝子は、Ha-ras、突然変異体ｐ５３またはヒトパピローマウイルス遺 伝子であり得る。Ha-rasは、Harveyウイルスのrasがん遺伝子である。 上記方法の一態様において、前記核酸はベクターを含む。該ベクターは、アデ ノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウ イルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶベクター、レトロウイ ルスベクター、ワクシニアウイルスベクターを含むが、これに限定されない。好 ましい態様において、アデノウイルスベクターは、mda-７を発現する複製欠陥性 アデノウイルスベクターであり、Ａｄ.mda-７ Ｓと称される。別の態様におい て、アデノウイルスベクターは、複製コンピテントアデノウイルスベクターであ る。 本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、 メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物をがん性細胞に導入すること により、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法を提供す る。 本発明は、さらに、被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるため の方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物を被検者の がん性細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させるこ とを具備した方法を提供する。 上記方法の一態様において、前記がん細胞は、胸部、子宮頸部、結腸、前立腺 、鼻咽頭、肺、結合組織または中枢神経系の細胞を含むが、これに限定されない 。前記がん細胞には、さらに、多形膠芽腫、リンパ腫および白血病由来の細胞が 含まれる。 本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効なメラノー マ分化関連遺伝子（mda-７）を含む一定量の核酸と、薬学的に許容可能なキャリ アとを含有する薬学的組成物を提供する。 ここで使用する「薬学的に許容可能なキャリア」という用語は、何れの標準的 な薬学的キャリアをも包含する。この薬学的組成物は、選択した投薬方法にとっ て適切な如何なる形態にも構成され得る。経口投薬に適切な組成物は、固形形態 （丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、および粉剤など）並びに液体形態（溶剤、 シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤など）を含む。非経口投薬に有効な形 態は、滅菌溶剤、乳剤、および懸濁剤などである。 ある態様において、前記核酸はベクターを含む。ベクターは、アデノウイルス ベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベク ター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶウイルス、レトロウイルスベクタ ーおよびワクシニアウイルスベクターを含むが、これに限定されない。好ましい 態様において、アデノウイルスベクターは、mda-７を発現している複製欠陥性ア デノウイルスベクターであり、Ａｄ.mda-７ Ｓ.と称される。別の態様において 、アデノウイルスは、複製コンピテントアデノウイルスベクターである。 本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効な一定量の メラノーマ分化関連子（mda-７）の遺伝子産物と、薬学的に許容可能なキャリア とを含む薬学的組成物を提供する。 上記方法の一態様において、前記がん細胞は、胸部、子宮頸部、結腸、前立腺 、鼻咽頭、肺、結合組織および中枢神経系の細胞を含むが、これに限定されない 。前記がん細胞には、さらに、多形膠芽腫、リンパ腫および白血病由来の細胞が 含まれる。 本発明は、以下の実験の詳細な説明によりさらに理解されるであろう。しかし 、当業者なら、特定の方法および議論されている結果は、後述する請求の範囲で 完全に説明された本発明の単なる例示であることを容易に認識するであろう。実験の詳細な説明 がんは、増殖制御の欠陥により特徴づけられる病気であり、腫瘍細胞は、しば しば細胞分化の異常パターンを示す。組み換えヒト繊維芽細胞インターフェロン と抗白血病薬剤メゼライン（mezerein）との組み合わせは、ヒト・メラノーマ培 養細胞のこれらの異常を直し、その結果、不可逆的な増殖停止および最終分化に 至る。差引きハイブリダイゼーションにより、増殖停止し且つ最終分化したヒト ・メラノーマ細胞において、発現が高まったメラノーマ分化関連遺伝子（mda-７ ）が同定される。mda-７が、異なる起源で複数の遺伝的欠陥を有するヒト腫瘍細 胞にトランスフェクションされると、コロニー形成は減少する。対照的に、正常 細胞（ヒト乳房上皮細胞、ヒト皮膚の繊維芽細胞およびラット胚の繊維芽細胞） を用いた一過性のトランスフェクションアッセイにおいて、増殖およびコロニー 形成に対するmda-７の効果は、がん細胞を使って見出された効果より量的に少な い。mda-７の発現が高まった腫瘍細胞は、単層増殖および足場非依存性において 抑制を示す。アンチセンスmda-７を発現している組み換えタイプ５のアデノウイ ルスを用いた感染により、インビトロにおける増殖および形質転換された表現型 のmda-７による抑制は除去される。網膜芽細胞腫（ＲＢ）およびｐ５３遺伝子の 両方を発現していないか、またはこれら両方に欠陥を有するがん細胞において増 殖を抑制するmda-７の能力は、mda-７−誘導性の増殖抑制を仲介する際に、これ ら重要な腫瘍抑制因子が関与していないことを示している。mda-７が以前に記載 された増殖抑制遺伝子とタンパク質ホモロジーがないこと、および正常細胞／が ん細胞に対するこの遺伝子の分化的効果により、mda-７は新しいクラスのがん増 殖抑制遺伝子に相当することが示唆される。 材料および方法 細胞系統および培養条件 ヒトがん腫細胞系統、例えばＭＣＦ-７およびＴ４７Ｄ（胸部）、ＬＳ１７４ ＴおよびＳＷ４８０（結腸直腸）、HeLa（子宮頸部）、ＤＵ-１４５（前立腺） 、並びにＨＯＮＥ−１（鼻咽頭）（９、22−25）を、１０％のウシ胎仔血清（Ｄ ＭＥＭ-10）を補充したダルベッコ（Dulbecco）の改良イーグル（Eagle）培地中 で、３７℃、５％ＣＯ₂／９５％空気−加湿インキュベーターで増殖させた。別 のヒト細胞タイプ、例えばＨＢＬ−１００（正常乳房上皮）、Ｈ０−１およびＣ ８１６１（メラノーマ）、ＧＢＭ−１８およびＴ９８Ｇ（多形膠芽腫）、並びに Saos-２（ヒト骨肉腫）を同様の条件下で維持した。初期継代の正常なヒト乳房 上皮細胞（ＨＭＥＣ；継代10−12）を、Clonetics Corporation（サンディエゴ 、ＣＡ）から入手した。ＨＭＥＣ細胞を、Clonetics Corporationにより説明さ れたように無血清培地中で維持した。ＣＲＥＦ−Trans ６（クローン化したフィ ッシャー（Fischer）ラット胚の繊維芽細胞）（９、26）およびＣＲＥＦ Ha-ra s（Ha-ras（Ｔ２４）がん遺伝子により形質転換されたＣＲＥＦ細胞）（27）を 、ＤＭＥＭ-５中で培養した。HeLa cl １は、ハイグロマイシン耐性（Hyg^R）の ラウス肉腫ウイルスＲＳＶベクター（ｐＲＥＰ４）(Invitrogen)により形質転換 されたHeLaクローンである。HeLa cl ２は、Hyg^Rのmda-７を発現するHeLaクロー ンである。HeLa cl １およびHeLa cl ２細胞を文献の記載どおりに構築し（12、 21）、100μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有するＤＭＥＭ−１０中で維持し た。ＤＵ-１４５ cl ６およびＤＵ-１４５ cl ７細胞は、（ｐＭＡＭneoベクタ ーにクローニングされた）ＤＥＸ-誘導性mda-７遺伝子（Clontech）を含み（21 ）、200μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ-10中で維持した。 差引きハイブリダイゼーション、プラスミド、発現ベクター構築物、およびノー ザンハイブリダイゼーション 差引きハイブリダイゼーションによるmda-７の同定およびクローニングは、文 献の記載どおりに達成された（13）。完全長のmda-７のｃＤＮＡを、組み換えＩ ＦＮ−βプラスＭＥＺで処理されたＨ０−１のｃＤＮＡライブラリーをスクリー ニングし（13）、文献の記載どおりにｃＤＮＡ末端迅速増幅法を用いることによ り（15）単離した。オープンリーディングフレームを含むmda-７のｃＤＮＡ断片 （ヌクレオチド位置176−960）をＰＣＲで増幅し、ＴＡクローニングによりｐＣ ＲII^TM（Invitrogen）にクローニングした。ベクター中の挿入物の配向を、制限 マッピングにより決定した。ヒト細胞発現の構築物は、KpnＩ−XhoＩ断片をＰＣ Ｒ^TMベクターからｐＲＥＰ４ベクター（Invitrogen）にセンス［mda-７（Ｓ）］ またはアンチセンス［mda-７（ＡＳ）］配向で、ＲＳＶプロモーターの下流にク ローニングすることにより作成された。別途、mda-７遺伝子の断片を、センスお よびアンチセンス配向でｐＭＡＭneo（Clontech）ベクターにクローニングした 。ＲＮＡの単離およびノーザンブロッティングを記載どおりに行った(９,12,13, 21)。 単層増殖、足場非依存性およびＤＮＡ−トランスフェクションアッセイ 単層増殖および足場非依存性増殖アッセイを、以前に文献に記載されたとおり に行った（８,12,26）。単層コロニー形成に対するmda-７の効果を調査するため 、挿入物のないベクター、またはmda-７（Ｓ）もしくはmda-７（ＡＳ）発現構築 物を含むベクター［ｐＲＥＰ４（ＲＳＶ）］を、リポフェクション法（ＧＩＢＣ Ｏ/ＢＲＬ）により種々の細胞タイプにトランスフェクションし、ハイグロマイ シン中でのハイグロマイシン耐性コロニー形成または細胞増殖を測定した（12,2 1）。 アンチセンス−mda-７ アデノウイルスベクターの構築 組み換え型の複製欠陥性Ａｄ.mda-７（ＡＳ）を２段階で作成した。第一に、m da-７遺伝子のコード配列を、改良型のＡｄ発現ベクターｐＡｄ.CMVにクローニ ングした（28）。これは、順に、Ａｄゲノムの左端に由来する355ｂｐ、サイト メガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、スプライス供与部位および受容 部位 をコードするＤＮＡ、所望の遺伝子（この場合mda-７）のためのクローニング部 位、βグロビン遺伝子由来のポリＡシグナル配列をコードするＤＮＡ、およびＥ ＩＢコード領域内から延びる約３kbpのアデノウイルス配列を含む。この配列は 、クローニングされた配列のＣＭＶ前初期遺伝子プロモーターによる高レベルの 発現、およびＲＮＡプロセッシングを可能にする（28）。組み換えウイルスは、 mda-７含有ベクターとプラスミドＪＭ17との間の相同的組み換えにより293細胞 内でin vivoで作成され（29）、これは、改良型ｐＢＲ322にクローニングされた Ａｄゲノム全体を含んでいる（30）。ＪＭ17は、in vivoでＡｄゲノムを生じる が、Ａｄゲノムは大きすぎて組み込むことができない。この制約からは、選択遺 伝子を含んだ組み込み可能なゲノムを作成するためのベクターとの組み換えによ り解放される（30）。組み換えウイルスは、293細胞以外のヒト細胞において複 製欠陥があり、これはアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する。二つのプ ラスミドのトランスフェクションの後、感染ウイルスを回収し、ゲノムを分析し て組み換え構造を確認し、次いでウイルスをプラーク精製した。全て標準手法に より行った（31）。 ペプチド抗体の産生および免疫沈降法解析 ペプチド抗体は、文献の記載どおりにＰＳＱＥＮＥＭＦＳＩＲＤに対して調製 した（21）。対数的に増殖するHeLa、HeLa Cl １（Hyg^RのｐＲＥＰ４ベクターコ ントロールHeLaクローン）およびHeLa cl ２［ｐＲＥＰ４-mda-７（Ｓ）により トランスフェクションされたHyg^Rのmda-７発現HeLaクローン］細胞を、未処理に するか、または１０プラーク形成ユニットのコントロールアデノウイルス（Ｈ５ d1434）(32)もしくはmda-７（ＡＳ）を発現する組み換えアデノウイルス［Ad.md a-７（ＡＳ）］で感染させた。感染後、さまざまな時間において、培養物をメチ オニンなしの培地中において３７℃で１時間、メチオニン飢餓にし、細胞を沈殿 させることにより濃縮し、100μCi（１Ci＝３７GBq）の³⁵Ｓ（NEN,Express ³⁵Ｓ ）を用いて１ｍＬの同培地中で４時間３７℃で標識した。２μｇのＭＤＡ-７ペ プチドのウサギポリクローナル抗体またはアクチンモノクローナル抗体（Oncoge ne Sciences）を用いた免疫沈降法解析は、文献の記載どおりに行った（15,21） 。 実験結果 ヒトがん細胞およびHa-ras-形質転換されたラット胚の繊維芽細胞におけるmda- ７の増殖抑制特性の増大 ＤＮＡトランスフェクションアッセイを行って、細胞増殖に対するmda-７発現 増大の効果を評価した。ヒトの子宮頸部癌腫（HeLa）細胞にmda-７（Ｓ）構築物 をトランスフェクトさせると、mda-７（Ｓ）構築物は、ｐＲＥＰ４ベクターおよ びmda-７（ＡＳ）構築物によりトランスフェクションされた培養物と比べて、Hy g^Rコロニーが１０〜１５倍減少する（図１および表１）。 表１． ヒトがん細胞、正常なラット胚の繊維芽細胞（ＣＲＥＦ）およびHa-ras 形質転換ＣＲＥＦ細胞の単層コロニー形成に対するmda-７の効果ａ 対数的に増殖する細胞を、100-mmプレートあたり１×10⁶で播き、挿入物な しのベクター、またはmda-７（Ｓ）もしくはmda-７（ＡＳ）を含む10μｇのベク ターでトランスフェクションした。24時間後、細胞を100μｇ／ｍＬのハイグロ マイシンを含有する培地に、100-mmプレートあたり約２×10⁵細胞で再度播いた 。培地を３日または４日ごとに交換し、１４日目または２１日目にプレートをホ ルムアミドで固定しギムザ染色をした。50以上の細胞を含むコロニーを数え上げ た。表示の値は、４または５プレートで形成された平均Hyg^Rコロニー±S.D.であ る。 ｂ かっこ内の値は、ＲＳＶ-mda-７（ＡＳ）によりトランスフェクションされ た細胞と比較したときのコロニー形成の低下倍数を示している。 ｃ ＭＣＦ-７、Ｔ４７Ｄ、HeLa、ＬＳ１７４Ｔ、ＤＵ-１４５およびＨＯＮＥ- １は、表示の構造部位から単離したヒトがん腫（Ｃａ）細胞系統である。Ｔ９８ Ｇは、ヒト多形膠芽腫の細胞系統である。ＣＲＥＦ-rasは、Ha-ras（Ｔ２４）が ん遺伝子により形質転換されたＣＲＥＦクローンである。 より少ないコロニー形成に加えて、mda-７（Ｓ）コロニーは、一般に、ｐＲＥ Ｐ４ベクターまたはmda-７（ＡＳ）構築物でのトランスフェクション後に得られ た対応するHyg^Rコロニーよりサイズが小さい（図１）。mda-７（Ｓ）構築物を別 のヒトがん細胞系統にトランスフェクションすると、Hyg^Rコロニー形成を３ない し１０倍低下させる（表１）。これらには、ヒト胸部がん腫（ＭＣＦ-７および Ｔ４７Ｄ）、結腸がん腫（ＬＳ１７４ＴおよびＳＷ４８０）、鼻咽頭がん腫（Ｈ ＯＮＥ-１）、前立腺がん腫（ＤＵ−１４５）、メラノーマ（Ｈ０-１およびＣ８ １６１）、多形膠芽腫（ＧＢＭ-１８およびＴ９８Ｇ）並びに骨肉腫（Saos-２） が含まれる。HeLa細胞で観察されたとおり、mda-７（Ｓ）構築物でトランスフェ クション後に形成されるHyg^Rコロニーの平均サイズは、空のｐＲＥＰ４ベクター またはmda-７（ＡＳ）構築物でのトランスフェクション後に形成されたものより 小さい。これらの結果は、mda-７が広範囲の組織学的に異なるヒトのがんにおい て過剰発現すると、効力のある増殖抑制遺伝子であることを実証している。mda- ７が正常細胞の増殖を抑制するかどうか、およびこの効果がヒトがん細胞で観察 された効果と定量的に同一であるかどうかを測定するため、一過性のＤＮＡトラ ンスフェクションアッセイを、継代10ないし12の正常なヒト乳房上皮（ＨＭＥＣ ）細胞、正常な胸部上皮細胞系統ＨＢＬ-100、正常なヒト皮膚繊維芽細胞（継代 21）およびクローニングされた正常なラット胚の繊維芽細胞系統（ＣＲＥＦ-Tra ns６）を用いて行った（７，８）。ＨＭＥＣ、ＨＢＬ-100および正常なヒト皮膚 繊維芽細胞は、フィーダー層を用いたときでさえ、高頻度に明確なコロニーを形 成しないので、異なるＲＳＶ構築物を用いてトランスフェクションし、ハイグロ マイシン中で２〜３週間増殖させた後の全細胞数に対する効果を測定した。この アプローチを用いて、mda-７（ＡＳ）またはｐＲＥＰ４ベクターでトランスフェ クトされた正常細胞に対してmda-７（Ｓ）において、ＨＭＥＣでは約1.1ないし1 .6倍の減少、ＨＢＬ-100では1.1ないし1.2倍の減少、正常なヒト皮膚繊維芽細胞 数では1.3ないし2.1倍の減少が（各細胞タイプを用いた３回の独立実験で）各々 観察された。対照的に、同様の実験プロトコールを用いたＴ４７Ｄヒト胸部がん 腫細胞に関しては、ベクターおよびアンチセンスでトランスフェクトされた細胞 と比較して、mda-７（Ｓ）構築物でのトランスフェクション後に、約3.2ないし5 .2倍増殖は抑制された。ＣＲＥＦ-Trans６細胞の場合、６回の独立トランスフェ クションアッセイに関するHyg^Rコロニー形成において、mda-７（ＡＳ）およびベ クタートランスフェクトされた細胞に対するmda-７（Ｓ）との間の違いは、0.5 から2.8倍まで及んでいる（表１）。対照的に、mda-７（Ｓ）構築物のHa-ras形 質転換ＣＲＥＦ細胞へのトランスフェクションは、コロニー形成を６〜８倍低下 させた（表１）。これらの結果は、ヒトがん細胞およびHa-ras形質転換されたラ ット胚細胞ほど、正常なヒト細胞および正常な齧歯類細胞において、mda-７が、 増殖およびコロニー形成を低下させるのに定量的に有効でないことを示している 。 安定かつ誘導的なmda-７発現の細胞増殖に対する効果、およびmda-７発現のアン チセンス阻害の細胞増殖に対する効果、並びに形質転換された表現型。 mda-７（Ｓ）遺伝子でのトランスフェクション後に低頻度にHeLa細胞が生存す る理由を決定するため、mda-７（Ｓ）構築物でのトランスフェクション後に、１ ０個の独立したHyg^Rコロニーを単離した。ノーザンブロッティングによりmda-７ 発現について解析した１０クローンのうち、７クローンは検出可能なmda-７のｍ ＲＮＡを発現しておらず、２クローンは低レベルのmda-７のｍＲＮＡを発現して おり、１クローン（名称HeLa cl ２）は、高レベルのmda-７のｍＲＮＡを発現し ていた。対照的に、このクローンの全てが、Hyg^Rおよびグリセルアルデヒド３− リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の匹敵するレベルの発現を示した 。親のHeLa細胞またはｐＲＥＰ４ベクターHeLaクローン（名称HeLa cl １）と比 較すると、HeLa cl ２（mda-７発現）細胞は低速度で増殖した（図２）。寒天で 増殖させると、クローニングされていないHeLaおよびHeLa cl １細胞は、約４２ ％の効率で増殖したが、HeLa cl ２（mda-７発現）細胞は、約２５％の効率で増 殖し、コロニーの平均サイズは、親のHeLaおよびｐＲＥＰ４ベクターHeLa cl １ 細胞について観察されたよりも小さかった。これらの結果より、mda-７でのトラ ンスフェクションした後のHeLaの生存は、主として、mda-７発現の欠損または低 レベルのmda-７発現に起因して起こることが示される。しかし、mda-７を安定に 高レベルで発現しているHeLa細胞において、単層培養および足場非依存性におけ る増殖は低下する。 HeLa cl ２（mda-７発現）において観察されたin vitroでの増殖の低下および 形質転換抑制が、mda-７発現の直接的な結果であるかどうかを決定するため、md a-７発現を直接的に抑制するためにアンチセンスストラテジーを使用した。アン チセンス配向にクローニングされたmda-７遺伝子を含む組み換えＡｄ５ベクター ［Ａｄ.mda-７（ＡＳ）］を構築した。Ａｄ.mda-７（ＡＳ）によるHeLa cl ２（ mda-７発現）の感染は、増殖速度および寒天クローニング効率を（約25％から約 44％に）増加させるが、HeLa cl １（ｐＲＥＰ４ベクター、mda-７発現せず）ま たは親のHeLaはそうではない（図２）。対照的に、mda-７遺伝子を含有しないコ ントロールの突然変異体Ａｄ５ベクター（Ｈ５dl434）は、親のHeLa、HeLa cl １またはHeLa cl ２細胞の単層増殖または寒天増殖に影響を及ぼさない（データ 示さず）。 ウサギで生産したmda-７特異的ペブチド抗体および免疫沈降法解析を使用した ところ、HeLa cl ２（mda-７発現）細胞では、約２４ｋＤａタンパク質のＭＤＡ -７および約９０ないし110ｋＤａの高分子量複合（ＨＭＣ）タンパク質のレベル が増大している（図３）。Ａｄ.mda-７（ＡＳ）での感染は、２４ｋＤａのＭＤ Ａ-７タンパク質およびＨＭＣタンパク質両方の一時的な低下を引き起こすが、 Ｈ５dl434コントロールのmda-７非発現ウイルスではそうではない(21)（図３） 。両タンパク質の低下したレベルは、Ａｄ.mda-７（ＡＳ）での感染後48時間後 に見られ、96時間にわたって抑制されたままである。対照的に、アクチンレベル は、ウイルス感染後も未変化のままである。これらの観察は、HeLa cl ２（mda- ７発現）におけるＭＤＡ-７タンパク質発現のアンチセンス阻害が、mda-７誘導 による増殖抑制および足場非依存性増殖の抑制を直接消滅させ得ることを示して いる。 mda-７の細胞増殖に対する抑制効果を確認するため、ＤＵ-145ヒト前立腺がん 細胞を、ＤＥＸ誘導性mda-７遺伝子を発現するように操作した。［ＤＥＸ誘導性 mda-７（Ｓ）遺伝子を含む］ＤＵ-145 cl ６またはcl ７細胞を、10^-6Ｍ ＤＥＸ の存在下で２４〜９６時間増殖させると、mda-７のｍＲＮＡおよび（ＨＭＣタン パク質を含む）タンパク質が誘導されるが、親のＤＵ-145細胞ではそうではない （図４）。対照的に、ＤＥＸは、ＤＵ-145 cl ６およびcl ７細胞においてネオ マイシン耐性（Neo^R）遺伝子の発現を変化させず、または試験された細胞全てに おいてＧＡＰＤＨの発現を変化させない（図４）。ＤＵ-145 cl ６およびcl ７ 細胞において、10^-6Ｍ ＤＥＸ中の増殖によるmda-７発現の誘導は、ＤＥＸの非 存在下の増殖と比べて、９６時間後の細胞数を約５０％低下させる。対照的に、 親のＤＵ-145またはｐＭＡＭneoベクター形質転換ＤＵ-145細胞を、１０^-6Ｍ Ｄ ＥＸを含む培地中で９６時間増殖させても、有意な増殖抑制は起こらない（デー タ示さず）。これらのデータは、mda-７の異所性発現が、前立腺がん細胞におい て細胞増殖を直接変化させ得ることを示している。 実験の考察 差引きハイブリダイゼーションにより、増殖停止し且つ最終分化したヒト・メ ラノーマ細胞において、発現の増大したmda遺伝子が同定された（13、14、21） 。これらmda遺伝子の機能を決定することは、ヒト・メラノーマおよび他の細胞 タイプにおける増殖制御および最終分化の分子的根拠を規定する際に重要であろ う。mda-７遺伝子（14、21）は、広範囲のヒトがん細胞系統において一過性また は安定に発現すると、普遍的な増殖抑制遺伝子であることが今日示されている。 この発見は、ヒト・メラノーマ細胞におけるＭＤＡ-７タンパク質の増殖抑制特 性を示す以前の観察を拡張するものである（21）。がん細胞に対するその効果に 対して、正営なヒト乳房上皮、正常なヒト皮膚繊維芽細胞および正常なラット胚 繊維芽細胞へのmda-７のトランスフェクションは、定量的により低い増殖抑制を 生じさせる。別のmda遺伝子であるmda-６（ｐ21）と同様に、mda-７の発現もメ ラノーマの進行と逆の関連があり、mda-６（ｐ21）およびmda-７両方のレベルの 増大は、転移性ヒト・メラノーマ細胞と比べて正常なヒトメラニン細胞に存在す る（14-16、21）。メラノーマ細胞に対して低下した速度ではあるが、正常なメ ラニン細胞はなお増殖能を保持しているため、mda-６（ｐ21）およびmda-７の両 方が、メラニン細胞／メラノーマ直系細胞においてメラノーマ進行の負のレギュ レーターとして機能することが可能である（14-16、21）。その上、最終分化を し且つ不可逆的に増殖停止したヒト・メラノーマ細胞において、mda-６（ｐ21) およびmda-７両方の発現が増大することにより、これらの遺伝子が最終分化表現 型の重要なレギュレーターであることが示唆され得る（13-16、21）。 mda-７がヒトがん細胞に対してその増殖抑制効果を引き出すメカニズムは、現 在知られていない。mda-７の構造は、潜在的な作用モードを示唆する配列モチー フが存在しないため、潜在的な機能に対する識見を提供してくれない。細胞増殖 に対するmda-７の効果は、広範囲にわたって研究された腫瘍抑制遺伝子ｐ５３と 区別することができる（33、34）。突然変異体ｐ５３を含むヒト胸部のがん腫細 胞系統Ｔ４７Ｄにおけるｐ５３の一過性発現は、増殖抑制を引き起こすが、野生 型ｐ５３を含むヒト胸部のがん腫細胞系統ＭＣＦ-７に野生型ｐ５３遺伝子をト ランスフェクションしても、増殖抑制を引き起こさない（34）。対照的に、mda- ７は、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ−７細胞の両方において同様の増殖抑制を引き起こ す（表１）。mda-７による増殖抑制は、網膜芽細胞腫遺伝子（ｐＲＢ）、ｐＲｂ 関連のｐ１０７遺伝子および推定腫瘍抑制遺伝子ｐ１６^ink4について観察された ものと切り離して考えることもできる（25、35）。ｐＲｂおよびｐ107の過剰発 現は、特定の細胞タイプにおいて細胞周期に依存した方法で細胞増殖を抑制する （35-37）。明らかに正常なＲＢ遺伝子を含むヒトグリア芽細胞腫の細胞系統Ｔ ９８Ｇに対してｐＲｂまたはｐ１０７をトランスフェクションすること（25）に よっては増殖抑制は引き起こされないが（35、37）、mda-７（Ｓ）の一過性発現 は、Ｔ９８Ｇコロニー形成を低下させる（表１）。現時点で、mda-７の増殖抑制 効果は、ＲＢファミリーメンバーｐ１３０／ｐＲｂ２（これはＴ９８Ｇ細胞にお いても増殖を抑制する）により誘導される増殖抑制と区別することができない（ 25）。ｐ１６^ink4遺伝子は、機能的なＲＢ遺伝子を含む細胞において増殖停止を 引き起こすが（35、37）、mda-７の増殖抑制は、正常、異常、または非機能的な ＲＢ遺伝子を含む細胞において起こる。突然変異したＲＢ遺伝子を含むヒト前立 腺がん腫の細胞系統ＤＵ-145（38）およびＲＢ（または野生型ｐ５３）を発現し ないヒト骨肉腫細胞Saos-２にmda-７をトランスフェクションすることによって 、コロニー形成の抑制が引き起こされる（表１）。同様に、安定なＤＥＸ-誘導 性mda-７により形質転換されたＤＵ-145クローンにおけるmda-７発現の誘導は、 増殖抑制を引き起こす。これらの発見により、mda-７による増殖抑制に関しては 、機能的ＲＢ遺伝子に対する依存性がないことが示される。これらの研究を総合 的に考えると、mda-７の抑制効果は、二つの最も広く研究された腫瘍抑制遺伝子 であるｐ53およびｐＲＢ、並びに推定腫瘍抑制遺伝子ｐ１６^ink4の作用様式とは 異なるメカニズムにより起こることが説明される。 ほ乳類細胞における増殖の停止またはＤＮＡ損傷の関数として発現の増大を示 す、幾つかの遺伝子が同定された（39,40）。増殖の停止およびＤＮＡの損傷を 誘導する３つの（gadd）遺伝子（gadd45、gadd153およびgadd34）、密接に関連 した骨髄分化初期応答（MyD118）遺伝子（41）、並びに野生型ｐ５３の抑制遺伝 子mdm-２（42）は、ＤＮＡ損傷剤メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）での処理 により細胞内でアップレギュレートされる（40）。gadd45および増殖停止特異的 遺伝子（gas１）（43,44）は、細胞を集密状態に維持することにより、血清飢餓 細胞により、または低血清で細胞を増殖させることより誘導される（40,43,44） 。対照的に、mda-７のｍＲＮＡ発現は、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）に よる処理後、または細胞を集密状態に維持した後、ヒト・メラノーマ細胞におい て誘導されない（21）。その上、９６時間の無血清培地での増殖後、ＨＯ−１ヒ ト・ メラノーマ細胞において、mda-７のｍＲＮＡ発現にはわずかな増大しか起こらな い（21）。gadd、MyD118およびgas-1遺伝子と比べたmda-７の調節における違い により、mda-７が新規クラスの増殖停止遺伝子の典型であり得ることが示される 。 要約すると、正常および突然変異のｐ５３遺伝子並びにＲＢ遺伝子の両方を含 むヒトがん細胞において増殖抑制を誘導する、負の増殖レギュレーター、即ちmd a-７が説明されている。mda-７のゲノム構造の特性決定は、この遺伝子が腫瘍抑 制遺伝子として正常に機能するかどうか、および正常細胞と腫瘍細胞との比較に おいてこの遺伝子に変異が存在するかどうかを決定する際に重要となるであろう 。mda-７のプロモーター領域の同定は、更に、この遺伝子が特定の細胞タイプに おいて特異的に発現し、且つＩＦＮ−βプラスＭＥＺにより誘導的であるメカニ ズムの解析を可能にするであろう。mda-７が正常細胞よりもがん細胞および形質 転換細胞に対して増殖抑制的であるという発見は、潜在的に重要であり且つ研究 の発展を保証するものである。この観点において、特定のヒト悪性疾患の治療に おける効能について野生型ｐ５３遺伝子が現在試験されているのと類似の方法で 、mda-７が、がん治療のための遺伝子ベースの治療ストラテジーの一部として有 効であることが証明されるであろう。 実験の第二シリーズ 組み換えアデノウイルスにおけるメラノーマ分化関連遺伝子−７（mda-７）は 、ヌードマウスの株化ヒト腫瘍の増殖を抑制する。 単層培養におけるコロニー形成の低下により示されたように、種々の起源のヒ ト腫瘍細胞におけるmda-７の異所性発現が増殖を抑制することが、以前の研究に より文書で示されている（Jiangら、ＰＮＡＳ、93：9190-9165、1996）。対照的 に、mda-７は、正常なヒト上皮細胞または繊維芽細胞の増殖を顕著には変えない 。これらの観察は、mda-７が普遍的ながん増殖抑制遺伝子であるという仮説を支 持している。 がん細胞の増殖を選択的に抑制するmda-７の能力は、この遺伝子がヒトのガン 治療において治療上の利益をもたらすことを示唆している。この可能性を詳しく 調べるため、複製欠陥性のmda-７を発現するアデノウイルスを作成した。そのプ ロトコールは、アンチセンスmda-７を発現するアデノウイルス（Ａｄ.mda-７ Ａ Ｓ）を構築するために使用したものと類似している（Jiangら、ＰＮＡＳ、93 91 60-9165、1996）。組み換え複製欠陥性Ａｄ.mda-７ Ｓは、２段階で作成した。 第一に、mda-７遺伝子を改良型Ａｄ発現ベクターｐＡｄ.ＣＭＶにセンス配向で クローニングした。このウイルスは、順に、Ａｄゲノムの左端に由来する355ｂ ｐ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、βグロビン遺伝子由 来のポリＡシグナル配列をコードするＤＮＡ、およびＥ１Ｂコード領域内から延 びる約３ｋｂｐのアデノウイルス配列を含む。この配列は、ＣＭＶ前初期遺伝子 プロモーターによりクローニング配列の高レベルの発現を、および適切なＲＮＡ プロセシングを可能にする。この組み換えウイルスは、mda-７含有ベクターとＪ Ｍ１７との間の相同的組み換えにより、293細胞内でin vivoで作成され、これは 、改良型ｐＢＲ３２２にクローニングされたＡｄゲノム全体を含んでいる。ＪＭ １７は、in vivoでＡｄゲノムを生じるが、大きすぎて詰め込むことができない 。この制約からは、選択遺伝子を含んだ組み込み可能なゲノムを作成するための ベクターとの組み換えにより解放される。組み換えウイルスは、293を除くヒト 細胞において複製欠陥であり、これはアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現 する。二つのプラスミドのトランスフェクションの後、全て標準手法により、感 染 性ウイルスを回収し、ゲノムを解析して組み換え構造を確認し、次いでウイルス をプラーク精製した。 mda-７でのトランスフェクションで観察されたように、種々のヒトがん細胞系 統のＡｄ.mda-７ Ｓでの感染は増殖を抑制するが、正常な細胞系統では抑制し ない。これらの結果は、このウイルスがmda-７プラスミド構築物で観察される特 性を保持していることを証明する。多くのがん細胞、例えば、胸部がん腫（ＭＣ Ｆ-７およびＴ４７Ｄ）、グリア芽細胞腫（ＧＢＭ−１８およびＴ９８Ｇ）並び にメラノーマ（ＨＯ-１およびＣ8161）などにおいて、Ａｄ.mda-７ Ｓでの感染 は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）の誘導を引き起こす。この効果は 、Ａｄ.mda-７ Ｓでの多数の感染（100pfu/細胞）後でさえ、正常細胞において 引き出されなかった。他のがん細胞タイプにおいて、（単層培養におけるコロニ ー形成の抑制により示されるような）増殖抑制は、核の形態的変化、ヌクレオソ ームラダー（ladder）の形成または陽性ＴＵＮＥＬ反応により示されるように、 アポトーシスの兆候がなくとも明らかである。これらの結果は、Ａｄ.mda-７ Ｓウイルスがin vitroでヒトがん細胞の増殖を選択的に抑制できることを示して いる。その上、特定のがん細胞タイプにおいて、増殖抑制は、アポトーシスの誘 導と関連している。これらの観察は、mda-７により誘導されるがん増殖の抑制が 複数の経路によって起こり得ることが示唆される。 ヌードマウスヒト腫瘍異種移植モデルを使用して、Ａｄ.mda-７ Ｓがin vivo でヒトがん細胞の増殖を抑制できるかどうかを決定した。Taconic Labsから入手 した無胸腺ヌードマウスに、マトリゲル（matrigel）と混合したＰＢＳ中の100 万個のヒト子宮頸部がん腫（HeLa）細胞を皮下注射した（最終体積0.4ｍＬ；マ トリゲル対ＰＢＳの比１：１）。腫瘍を平均体積100ないし200ｍｍ³（接種後10 ないし21日目）に達するまで増殖させた。その後、マウスを無作為に２グループ に分けた:グループ１:mda-７遺伝子を欠損している複製欠陥性Ａｄ;ヌル(null) ウイルス（ヌル）；およびグループ２：Ａｄ.mda-７ Ｓ。処理は、４週間の間 、週に３回、ヌルまたはＡｄ.mda-７ Ｓの腫瘍内注射（４箇所に100μＬ/注射 ）から成る。腫瘍を週に２ないし３回カリパスで測定した。腫瘍体積を一般式を 用いて計算した：pi/６×大きい直径×（小さい直径）²。治療の４週間後、動物 をも う１週間観察し、屠殺した。最初の腫瘍体積で割った最終腫瘍体積は、がん進行 の指標として規定された腫瘍体積比に相当する。 Ａｄ.mda-７ Ｓで処理された株化HeLa異種移植は、研究の間を通じて増殖を抑 制したが、ヌルウイルスで処理された腫瘍は、進行して増殖し続けた（図５およ び６）。mda-７の抑制効果は、ｐ値＜0.05で有意であった。本研究は反復して行 い、同じ結果が得られた。このデータから、mda-７の異所性発現がヒトのがん治 療に治療上利益をもたらし得ることが示唆される。実験は、株化ヒト胸部がん腫 瘍、ＭＣＦ-７およびＴ４７Ｄを用いてヌードマウスで今日進行中である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分 化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸を、前記遺伝子の発現可能な条件下で前記が ん細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを 具備した方法。 ２．被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって 、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸を、前記被検者の細胞内で前 記遺伝子の発現が可能な条件下において前記被検者のがん性細胞に導入すること により、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法。 ３．前記核酸がベクターを含む請求項１または２記載の方法。 ４．請求項１または２記載の方法であって、前記メラノーマ分化関連遺伝子（ mda-７）が、当該遺伝子の発現が調節配列の制御下にあるように調節配列に連結 している方法。 ５．前記調節配列が誘導的または構成的である請求項４記載の方法。 ６．前記調節配列が組織特異的調節配列である請求項４記載の方法。 ７．請求項１ないし６記載の方法であって、前記核酸が、裸のＤＮＡ技術、ア デノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バール ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶベクター、レトロウ イルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、リポソーム、抗体で被覆したリ ポソーム、または機械的もしくは電気的手段により、前記がん細胞に導入される 方法。 ８．請求項１ないし７記載の方法であって、前記がん細胞が、当該がん細胞内 に欠陥性腫瘍抑制遺伝子が存在することにより特徴付けられる方法。 ９．請求項８記載の方法であって、前記腫瘍抑制遺伝子がｐ５３、網膜芽細胞 腫（ＲＢ）またはｐ１６^ink4a遺伝子である方法。 １０．請求項１ないし７記載の方法であって、前記がん細胞が、当該がん細胞 内に優性作用的がん遺伝子が存在することにより特徴付けられる方法。 １１．請求項１０記載の方法であって、前記優性作用的がん遺伝子が、Ha-ras 、突然変異体ｐ５３またはヒトパピローマウイルス遺伝子である方法。 １２．請求項３記載の方法であって、前記ベクターが、アデノウイルスベクタ ー、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、 ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶベクター、レトロウイルスベクターまた はワクシニアウイルスベクターである方法。 １３．請求項１２記載の方法であって、前記アデノウイルスベクターが、mda- ７を発現する複製欠陥性アデノウイルスベクター（名称Ａｄ.mda-７ Ｓ）であ る方法。 １４．がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ 分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物を前記がん性細胞に導入することにより 、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法。 １５．被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であっ て、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物を前記被検者のがん性細 胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備 した方法。 １６．請求項１ないし１５記載の方法であって、前記がん細胞が、胸部、子宮 頚頸部、結腸、前立腺、鼻咽頭、肺、多形膠芽腫、リンパ腫、白血病、結合組織 または神経系の細胞である方法。 １７．がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効なメラノーマ分化関連 遺伝子（mda-７）を含む一定量の核酸と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有 する薬学的組成物。 １８．前記核酸がベクターを含む請求項１７記載の薬学的組成物。 １９．請求項１８記載の薬学的組成物であって、前記ベクターが、アデノウイ ルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルス ベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶベクター、レトロウイルスベ クターまたはワクシニアウイルスベクターである薬学的組成物。 ２０．請求項１９記載の薬学的組成物であって、前記アデノウイルスベクター が、mda-７を発現する複製欠陥性アデノウイルスベクター（名称Ａｄ.mda-７Ｓ ）である薬学的組成物。 ２１．がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効なメラノーマ分化関連 遺伝子（mda-７）の一定量の遺伝子産物と、薬学的に許容可能なキャリアとを含 有する薬学的組成物。 ２２．請求項１７ないし２１記載の薬学的組成物であって、前記がん細胞が、胸 部、子宮頸部、結腸、前立腺、鼻咽頭、肺、多形膠芽腫、リンパ腫、白血病、結 合組織または神経系の細胞である薬学的組成物。