KR100528047B1 - 멜라노마 분화 관련 유전자(ｍｄａ-7)의 용도 - Google Patents

멜라노마 분화 관련 유전자(ｍｄａ-7)의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 멜라노마 분화 관련 유전자 (mda-7)를 포함하는 핵산을 세포의 암 표현형을 전환하기위한 유전자의 발현을 허용하는 조건하에 세포로 도입하는 것으로 이루어진 암세포의 암 표현형을 전환하는 방법을 제공한다. 본 발명은 상기-설명된 핵산을 개체의 암 세포에 도입하는 것으로 개체내에 있는 암 세포의 암 표현형을 전환하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 세포의 암 표현형을 전환하기위해 멜라노마 분화 관련 유전자 (mda-7)의 유전자 산물을 암세포에 도입함으로써 암세포의 암 표현형을 전환하는 방법을 제공한다.본 발명은 또한 상기-설명된 유전자의 산물을 개체의 암세포에 도입하여 개체에 있는 암세포의 암표현형을 전환하는 방법을 제공한다.
본발명은 또한 암세포의 암 표현형을 전환하는데 효과적인 멜라노마 분화 관련 유전자 (mda-7) 를 포함하는 다량의 핵산(nucleic acid)및 약학적으로 허용가능한 담체를 가진다.본 발명은 또한 암세포의 암 표현형을 전환하는데 효과적인 상기 언급된 다량의 유전자 산물과 약학적으로 허용가능한 담체를 갖는 약학적 조성물을 제공한다.

Description

멜라노마 분화 관련 유전자(ｍｄａ-7)의 용도{USE OF A MELANOMA DIFFERENTIATION ASSOCIATED GENE(mda-7)}
본원은 1996년 6월 16일에 출원된 미국 시리얼(U.S.Serial) 번호 제08/696,573호의 연속부분출원으로 그내용은 참고로 이 본원에 삽입되어진다.
여기에 개시된 본 발명은 보건복지부로부터 NCI/NIH 등록번호 CA35675하에 정부지원으로 이루어졌다. 따라서, 미국은 본 발명에 일정 권리를 가진다.
본 출원에서 다양한 참고 문헌들이 괄호 속에 인용되었다. 여기에서 본원에 관계된 기술적인 면을 보다 충분히 설명하기 위해 뒤에 상기 문헌들의 개시가 있는 그대로 삽입되어졌으며, 이는 본 발명에 관계된 기술분야의 상태를 보다 상세히 설명하기위해서이다. 이러한 참고문헌에 대한 자세한 문헌목록의 인용은 실험의 각시리즈 끝부분에서 찾아볼 수 있다.
(발명의 배경)
암은 종양유전자의 양성과 음성조절자로 작용하는 유전자들에의해 공동 조작되는(coordinated) 발현과 억제에 대한 복합적 다인자와 다단계 작용과정이다(1-5). 주된 형질형질전환이나 종양형성을 하는 표현형의 전달에 바탕을 둔 직접적인 클로닝 방법(direct cloning strategies)은 양성으로 반응하는 종양유전인자를 동정한다(6-9). 이에 비해, 암 표현형을 억제하는 유전자의 검출과 클로닝은 더욱 어렵고 알 수 없는 것으로 판명되었다(10-15). 성장과 분화를 조절하는 데에 직접적으로 연관된 유전자를 분리하기 위한 직접적인 접근방법은 활발하게 성장하고 있는 암세포로부터 제조되는 cDNA 라이브러리들및 번식능력을 비가역적으로 잃고 마지막으로 분화되도록 유도된 암세포로부터의 cDNA라이브러리 사이에 서브트랙션(subtraction) 혼성화를 포함한다. 상기의 실험적 전략은 다음과 같이 인간의 멜라노마 세포들에 적용되어진다. 재조합 인간 인터페론 β(IFN-β)및 메제린(mezerin)(MEZ)처리에 의하여 마지막으로 분화하도록 유도되어진다. 그 결과 DNA데이타베이스에서 전에 설명되지 않은 새로운 멜라노마 분화- 관련 (mda) 유전자을 클로닝한다. 성장과 세포주기 조정을 중재하는 특정한 mda유전자들의 직접적인 역할은 mda-6 의 클로닝과 확인에 의하여 분명해진다. 상기 mda-6 는 시클린-의존성 키나아제(cyclin-dependent kinases)p21의 편재하는 억제제(inhibitor)와 동일하다(17). 성장조절(growth control)에서 p21의 중요성은 잘 증명되어졌고,상기 유전자는 WAF-1,CIP-1 및 SDI-1 으로써 많은 연구실에서 다른 접근방법에 의하여 독립적으로 분리되어져왔다. 이와 같은 연구는 번식조절을 하는 특정한 유전자들이 유도되어져, 인간 암 세포에서 성장저지(growth arrest)와 마지막 분화에 기여할 수 있다는 것을 지시한다.
mda-7 유전자는 분화 유도제(IFN-βplus MEZ)-처리된 인간 멜라노마(H0-1) 공제(subtracted) 라이브러리로부터 클로닝되었다. mda-7 cDNA 의 완전한 길이는 1718뉴클레오타이드이고, 주로 개방 해독틀은 23.8kDa의 Mr 을 가진 206 aa의 신규한 단백질을 코딩한다(21). 종래 연구는 mda-7이 인간 멜라노마 세포에서 성장 저지와 마지막 분화 유도의 기능으로써 유도된다(14,21). 또한 역으로 mda-7 발현은 멜라노마 진행과 상호 관계한다. 즉, 활발하게 성장하는 정상적인 인간 멜라닌 세포는 전이 인간 멜라노마 세포들(metastatic human melanoma cells)보다 더 많이 mda-7을 발현한다. 게다가, mda-7은 덱사메타손(dexametasone) (DEX)-유도성 mda-7 유전자를 포함하는 안정한 형질형질전환 세포들과 일시적인 형질감염 분석에서 인간 멜라노마 세포들에 대해 성장 억제제이다(21). 또한 이러한 연구는 mda-7 이 인간 멜라닌 세포와 멜라노마에서 생리기능에 기여할 수 있다는 것과 상기 유전자가 인간 멜라노마 세포들에서 과다 발현되어질때 성장 억제 성질을 가짐을 보여준다. 또한, mda-7 유전자는 국제공개번호 W095/11986, 1994년 10월 24일 국제출원된 국제특허협력조약 출원번호 PCT/US/94/12160에 기술되어 있으며 그 내용은 참고로 본 출원에 삽입되었다.
본 발명은 mda-7이 가슴, 중추 신경계, 경부, 결장, 전립선 및 결합조직을 포함하는 다양한 유래를 갖는 암세포에서 잠재적인 성장 억제 유전자라는 것을 보여준다. 콜로니 형성의 억제는 p53 및/또는 레티노블라스토마(retinoblastoma)(RB)에 결함이 있거나 p53및 RB 발현이 부족한 암세포에서 일어난다. 반대로 정상적인 인간 유선 상피세포들(human mammary epithelial cells), 인간의 피부 섬유모세포(human skin fibroblsts) 및 쥐 배아 섬유모세포(rat embryo fibroblasts)에서 mda-7의 발현은 암세포에서보다 정량적으로 더 작은 성장억제를 유도한다. 인간의 경부 암종(HeLa)과 전립선 암종(DU-145)세포들에서 안정하게 발현되어질 때 성장 및 형질형질전환-관련된 성질에서 부정적인 영향을 가진다. HeLa 세포에 대한 mda-7의 영향은 안티센스(antisense) mda-7 유전자를 발현하는 유전적으로 변형된 Ad5벡터를 감염시킴에 의하여 MDA-7단백질을 폐기함으로써 가역적이다. 이러한 관찰결과는 MDA-7이 다른 유전적인 장애를 명백히 하는 인간의 암세포에서 넓은 범위의 억제 활동을 하는 신규한 유전자라는 것을 나타낸다.
도 1. HeLa세포들에서 하이그로마이신 내성 콜로니 형성(hygromycin resistant colony formation)에 대한 mda-7 발현의 영향. HeLa세포들은 10μg의 pREP4 벡터(RSV-벡터), pREP4 벡터에서 안티센스 배향으로 클로닝된 mda-7 (RSV-MDA-7-안티센스) 또는 센스 배향으로 pREP4 벡터에서 클로닝된 mda-7 (RSV-MDA-7-안티센스)로 형질감염되었고 100μg의 하이그로마이신을 포함하는 배지에서 선택되었다.
도 2. HeLa cl 2 세포를 발현하는 pREP4 벡터 HeLa cl 1와 mda-7(S) 의 단층 성장에 대한 안티센스 mda-7 의 효과. HeLa cl 1 (HeLa 클론을 형질형질전환시키는 pREP4 벡터)및 HeLa cl 2(HeLa 클론을 발현하는 mda-7) 세포들은 안티센스 mda-7 〔Ad.mda-7 (AS)〕를 발현하는 재조합 5형 아데노바이러스 (Ad5)를 갖는 유니트/세포를 형성하는 10개 플라크를 갖는 감염이 이어지거나 감염없이 배양되었다. 결과는 ≤10%에서 변화되는 샘플 3배로부터 얻는 평균적인 세포 수이다.
도. 3 HeLa, HeLa cl 1, HeLa cl 2 세포들에서 고분자량 -MDA-7 복합(HMC) 단백질, MDA-7 단백질 및 액틴 단백질에 대한 안티센스 mda-7의 효과. HeLa와 HeLa cl 1(pREP4 벡터 형질형질전환된 HeLa 클론)은 96시간동안〔35S〕메티오닌(methionine)으로 표지된 Ad.mda-7 (AS)의 유니트/세포를 형성하는 10개 플라크로 감염되지않았거나(-) 감염되었고(+), HMC,MDA-7 및 액틴 단백질에 대한 레벨은 면역침전 분석(immunoprecipitation analysis)함으로써 결정되었다. HeLa cl 2 (HeLa 클론을 발현하는 mda-7)에서, 단백질 레벨에 대해 Ad.mda-7 (AS)의 유니트/ml를 형성하는 10개 플라크의 감염영향이 +24,+48,+72 및 +96시간후에 〔35S〕메티오닌 표지된 세포여액(cell lysates)에 대해 면역침전 분석을 하여 결정되었다. 조정(control) 돌연변이 Ad 5, H5dl 434를 갖는 HeLa cl 2 세포들의 감염 영향은 유니트/세포를 형성하는 10개 플라크에 의한 감염 96시간 후에 〔35S〕메티오닌 표지된 세포 여액들을 면역침전분석함으로써 결정되었다.
도 4A 와 4B
DEX-유도가능한 mda-7 유전자를 포함하는 DU-145 클론에서 mda-7 RNA와 단백질의 합성.
도 4A 세포들은 96시간동안 10-6M DEX가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 배양되었고 전체 RNA 는 분리되고 노던 블로팅 (Nothern blotting)법을 수행하고, mda-7, 네오마이신 내성 (NeoR)(neomycine resistant)유전자 및 GAPDH로 검사되었다.
도 4B 96시간동안 10-6M DEX가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 세포가 배양되어졌고, 세포 단백질은 [35S]메티오닌으로 표지되었고 MDA-7과 액틴 단백질을 인지하는 항체로 면역침전되었다.
도 5 무흉선 원형 쥐(athymic nude mice)에서 설립된 인간 경부 암(HeLa) 엑세노그래프트(exenografts)의 성장 억제.
도 6 HeLa 악성종양 부피비에 대한 Ad. mda-7 S의 효과. 상기 결과는 Ad. mda-7 S가 원형 쥐(nude mice)의 생체내에서 종양 진행과정을 억제할 수 있음을 보여준다.
본 발명은 멜라노마 분화 관련 유전자(mda-7)를 포함하는 핵산을 상기 유전자가 발현하여 세포의 암 표현형을 전환하도록 하는 조건하에서 세포내에 도입함을 특징으로 하는 암세포의 암 표현형을 전환하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 언급된 핵산을 개체내 암세포에 도입함에 의하여 개체내 암세포의 암 표현형을 전환하는 방법을 제공한다.
본 발명은 멜라노마 분화 관련 유전자(mda-7)의 유전자 산물을 암세포내에 도입하여 세포의 암 표현형을 전환함을 특징으로 하는 암세포의 암 표현형을 전환하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 언급된 유전자 산물을 개체내 암세포내에 도입함에 의하여 개체내 암세포의 암 표현형을 전환하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 암세포의 암 표현형을 전환하기에 유효한 멜라노마 분화 관련 유전자(mda-7)로 이루어진 핵산의 양 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 암세포의 암 표현형을 전환하는 데 유효한 상기 언급된 유전자의 유전자 산물의 양 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
후술할 실험의 상세한 부분에 대한 이해를 용이하게 하기위해 자주 나타나는 일정 방법들 및/또는 용어들이 샘부룩(Sambrook, et al)에서 설명되어진다.
본 발명은 암의 암 표현형을 전환시키는 유전자의 발현을 허용하는 조건하에 멜라노마 분화와 관련된 유전자 (mda-7)를 포함하는 핵산(nucleic acid)을 세포에 도입하는 것으로 이루어진 암 세포의 암 표현형을 전환하기 위한 방법을 제공한다.
본발명은 또한 개체의 세포들에 있는 암의 암 표현형을 전환시키는 유전자의 발현을 허용하는 조건하에 멜라노마 분화 관련된 유전자 (mda-7)를 포함하는 핵산을 세포에 도입하는 것으로 이루어진 개체의 암세포중 암 표현형을 전환하는 방법을 제공한다.
핵산분자를 세포들에 도입하는 방법은 기술적으로 잘 알려져 있다.원형 핵산 분자(Naked nucleic acid molecule)는 직접적인 형질형질전환에 의하여 세포에 도입될 수 있다. 택일적으로 핵산분자가 리포좀들(liposomes)에 끼워질 수 있다(embedded). 따라서 본 발명은 원형DNA기술, 아데노 바이러스 벡터(adenovirus vector), 아데노-관련 벡터(adeno-associated vector), 엡스테인-바(Epstein-Barr) 바이러스 벡터 ,헤르페스(Herpes) 바이러스 벡터, 약화된 HIV벡터, 레트로바이스 벡터(retroviral vector), 종두 바이러스 벡터(vaccinia virus vector), 리포좀 ,항체-코팅된 리포좀, 기계적 또는 전기적 수단들에 의해 세포에 핵산이 도입되는 상기 방법을 제공한다. 상기 인용된 방법들은 단지 세포로 핵산을 도입하는 실현가능한 수단의 예로써 제공된다. 종래 사용된 방법들이 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.
상기 방법의 실시예로써 멜라노마 분화 관련 유전자(mda-7)는 유전자의 발현이 조절인자의 통제하에 놓여지도록 조절인자와 연결되어진다. 더 나아간 실시예로, 조절인자는 유도되어질 수 있거나 구성되어진다. 유도가능한 프로모터와 같이 유도가능한 조절인자가 당업계에서 알려져있다. 구성적(constitutive) 발현을 지시할 수 있는 프로모터와 같은 조절인자는 또한 당업계에 알려져 있다.
다른 실시예로 조절인자는 조직 특이적(tissue specific) 조절인자이다, 그때 mda-7유전자의 발현은 조직-특이적이 될 것이다.
상기 설명된 방법들의 또 다른 실시예로, 암세포는 암세포내에서 장애가 있는 종양 억제 유전자에 의하여 특징지워진다. 장애있는 종양 억제 유전자는 p53, 레티노블라스토마(RB) 또는 p16ink4a유전자를 포함하나, 이것으로 제한되지는 않는다.
상기 설명된 방법들의 실시예로 암세포는 암세포내에서 지배적으로 작용하는 종양유전인자(dominant acting oncogene)의 존재로 특징지워진다. 특히 지배적으로 작용하는 종양 유전인자는 Ha-ras, 돌연변이(mutant) p53,유두종(papilloma) 바이러스 유전자가 될 수 있다. Ha-ras는 하베이 바이러스 라스 종양 유전인자(Harvey virus ras oncogene)이다.
상기 방법들의 실시예로 핵산은 벡터를 포함한다. 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련된 바이러스 벡터, 엡스테인-바 바이러스 벡터,헤르페스 바이러스 벡터,약화된 HIV벡터, 레트로바이러스벡터, 종두 바이러스 벡터등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시예로, 아데노바이러스벡터는 Ad.mda-7 S 로 명명되었으며 mda-7 을 발현하는 복제-장애가 있는 아데노바이러스벡터이다. 다른 실시예로, 아데노바이러스 벡터는 복제 능력이 있는 아데노 바이러스 벡터이다.
본 발명은 또한 암의 암 표현형을 전환하기 위해 멜라노마 분화 관련된 유전자 (mda-7)의 유전자 산물을 암세포에 도입하는 것을 포함하는 암세포의 암 표현형을 전환하는 방법을 제공한다.
본발명은 또한 개체에 있는 암세포의 암 표현형을 전환하기 위해 멜라노 분화 관련된 유전자(mda-7)의 유전자 산물을 개체의 암세포에 도입하는 것을 포함하는 개체의 암세포에 있는 암 표현형을 전환하는 방법을 제공한다.
상기 설명된 방법들중의 실시예에서 상기 암세포는 가슴, 경부, 결장, 전립선, 인두, 폐 연결 조직 또는 신경계 세포 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 암세포는 또한 교모세포종 멀티폼(glioblastoma multiforme), 림프종(lymphomas)및 백혈병(leukema)으로부터의 세포들을 포함한다.
본 명세서에 사용되어진 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 표준적인 약학적 담체의 모든 것을 포함한다. 약학적인 조성물은 선택된 투여 양식에 알맞는 형태로 구성되어질 수 있다. 구강 투여에 알맞는 조성물은 알약, 캡슐, 과립, 정제 및 가루를 포함한 고체 형태와 용액, 시럽, 엘릭시르(elixirs) 및 현탁액을 포함한 액체 형태로 이루어진다. 비경구 투여를 위한 유용한 형태는 살균용액, 에멀젼 및 현탁액을 포함한다.
실시예로 핵산은 벡터를 포함한다. 벡터는 아데노바이러스벡터, 아데노-관련된 바이러스 벡터 ,엡스테인-바 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 약화된 HIV 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 종두 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 실시예로써 아데노바이러스벡터가 Ad.mda-7 S 로 명명되며, mda-7 발현시 복제-장애가 있는 아데노바이러스 벡터이다. 다른 실시예로 아데노바이러스벡터는 복제-능력이 있는 아데노바이러스 벡터이다.
본 발명은 또한 암세포의 암 표현형을 전환하기에 유효한 멜라노 분화 관련된 유전자(mda-7)의 유전자 산물의 양과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 설명된 방법들에 대한 실시예로써, 암세포는 가슴, 경부, 결장, 전립선, 인두, 폐 연결 조직 세포, 신경계 세포들을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 암세포는 또한 교모 세포종 멀티폼, 림프종 및 백혈병으로부터의 세포들을 포함한다.
본발명은 다음의 실험 설명으로부터 더 잘 이해될 것이다. 그러나,당업자들은 토론된 특별한 방법 및 결과가 다음에 올 청구항에서 보다 충분히 설명됨으로써 본 발명을 단지 예시하고 있다는 것을 쉽게 인지할 것이다.
(실험 세부 설명)
암은 성장 조절에 있는 장애를 특징으로 하는 질병이고 종양 세포들은 종종 세포 분화의 비정상적인 형태를 나타낸다. 재조합 인간 섬유모세포 인터페론과 항백혈병 약물 메제린(antileukemic agent mezerin)의 조합은 배양된 인간 멜라노마 세포들의 상기 비정상을 수정하여 그결과 비가역적인 성장 저지 및 마지막 분화가 일어난다. 서브스트랙션 혼성화는 성장 저지된 및 마지막 분화된 인간 멜라노마 세포에서 향상된 발현을 하는 멜라노 분화 관련된 유전자(mda-7)을 동정한다. mda-7이 다양한 유전적 장애를 가지고, 다양한 유래의 인간종양 세포들로 형질감염될 때 콜로니형성은 감소한다. 반대로 인간의 유선상피세포, 인간의 피부 섬유모세포, 쥐 배아 섬유조직세포를 포함한 정상적인 세포에서의 일시적인 형질감염 분석에서 성장과 콜로니 형성에 대한 mda-7의 영향은 암 세포에서 발견된 것보다 정량적으로 적다. 향상된 mda-7을 발현하는 종양 세포들은 단층성장 및 앵커리지 독립성에서 억제를 나타낸다. 안티센스 mda-7을 발현하는 재조합 5형 아데노 바이러스 감염은 시험관내(in vitro) 성장과 형질형질전환된 표현형의 mda-7 억제를 제거한다. 레티노블라스토마(RB) 및 p53의 장애를 포함하거나 발현하지 않는 암세포들에서 성장을 억제하는 mda-7의 능력은, mda-7-유도성 성장 억제를 중재하는 데에서 상기 중요한 종양 억제자 요소의 결핍을 지적한다. 이전에 설명한 성장 억제 유전자를 가진 mda-7 의 상동 단백질의 결핍 및 암세포에 대비한 정상적인 암세포에 관한 유전자의 분화 영향은 mda-7이 항종양활성력을 갖는 암 성장 억제 유전자의 새로운 부류를 대표할 수 있다는 것을 나타낸다.
(재료 및 방법)
세포주와 배양 조건들.(cell lines and conditions)
MCF-7 및 T47D(가슴), LS174T 및S W480(콜로렉탈,colorectal), HeLa(경부), DU-145(전립선) 및 HONE-1(인두)를 포함한 인간 악성종양 세포주들은 10% 태아 소혈청(DMEM-10)이 첨가되어있는 둘베코(Dulbecco)의 조작된 이글 배지(media)에서 5% 이산화탄소/95% 수분이 있는 인큐베이터에서 배양되어졌다. HBL-100(정상적인 유선 상피세포), H0-1및 C8161(멜라노마), GBM-18 및 T98G(교모세포종 멀티폼) 및 Saos-2(인간의 골육종)을 포함한 부가적인 인간 세포형들이 비슷한 조건에서 유지되어졌다. 초기 단계의 정상적인 인간 유선 상피조직 세포들(HMEC passage 10-12)은 클로네틱스 주식회사(Clonetics corporation) (샌디에고, CA)에서 얻어졌다. HMEC 세포들은 혈청이 제거된 배지에서 클로네틱스 회사의 설명대로 배양되어졌다. CREF-트랜스(Trans) 6 (클로닝된 피셔 쥐 배아 섬유모세포 )(9,26) 및 CREF Ha-ras(Ha-ras(T24) 종양 유전자에 의해 변환되어진 CREF 세포들)(27)가 DMEM-5에서 배양되어졌다. HeLa cl 1 은 하이그로마이신 내성(HygR)로우스 사크로마 바이러스 벡터(hygromicin resistant (HyrR) Rous Sacroma)(pREP4)(인비트로겐,Invitrogen)가 형질형질전환된 HeLa 클론이다. HeLa cl 2는 HygR mda-7을 발현하는 HeLa 클론이다. HeLa cl 1 및 HeLa cl 2 세포들은 개시된 대로 제조되어지며(12,21), 하이그로마이신 100 μg/ml 를 포함하는 DMEM-10에서 배양되었다. DU-145 cl 6 및 DU-145 cl 7 세포들은 DEX-유도가능한 mda-7 유전자를 포함하고 (pMAM 네오벡터에서 클로닝되어진) (클로테크, Clotech)(21), 200μG/ml G418 을 포함하는 DMEM-10에서 유지되어진다.
서브스트랙션 혼성화, 플라즈미드(Plasmids), 발현벡터 제조 및 노던 혼성화(Northern Hybridization)
서브스트랙션 혼성화에 의한 mda-7 의 확인과 클로닝은 개시된대로(13) 얻어졌다. mda-7 cDNA의 완전한 길이는 재조합 IFN-β 플러스 MEZ - 처리된 H0-1 cDNA 라이브러리를 스크린(13)하고, 개시된대로(15) cDNA 말단의 빠른 증폭 공정을 사용하여 분리되었다. 개방된 해독 틀을 포함한 mda-7 cDNA 단편은 (뉴클레오티드 위치 176-960) PCR로 증폭되었고 TA 클로닝에 의하여 pCRIITM (인비트로겐)으로 클로닝되었다. 벡터내에서 삽입물의 배향은 제한지도 작성에 의하여 결정되었다. 인간 세포 발현 제조물은 센스 〔mda-7(S)〕나 안티센스〔mda-7(AS)〕배향(orien -tation)으로 PCRTM 벡터들에서 Kpn Ⅰ- Xho Ⅰ을 RSV 프로모터 하류 pREP4 벡터 (인비트로겐)로 클로닝함에 의하여 만들어졌다. 택일적으로 mda-7 유전자 단편은 센스와 안티센스배향에서 pMAM네오 (클론테크 Clontech) 벡터로 클로닝되어졌다. RNA 분리와 노던 블로팅 (Northern blotting)은 개시되어진대로(9,12,13,21) 수행되었다.
단층 성장, 앵커리지-독립성(anchorage-independencd)및 DNA 형질감염 분석
단층과 앵커리지-독립성 성장 분석은 개시되어진대로(8,12,26) 수행되었다. 단층 콜로니 형성에 대한 mda-7 의 영향을 연구하기위해 삽입물이 없거나 mda-7 (S) 발현 제조물 또는 mda-7 (AS)발현 제조물을 포함하는 벡터 〔pREP4(RSV)가 리포펙션 방법(lipofection method) (GIBCO/BRL)에 의해 다양한 세포형내로 형질감염되었다. 그리고 하이그로마이신에서 하이그로마이신 내성 콜로니 형성 또는 세포 성장이 (12,21) 결정되어졌다.
안티센스 mda-7 아데노바이러스 벡터의 구성
재조합 복제-장애가 있는 Ad.mda-7 (AS)는 두 단계로 생성되었다.처음에 mda-7 유전자의 코딩서열은 변형된 Ad 발현 벡터 pAd.CMV내로 클론되었다(28). 이것은 차례로 Ad게놈의 왼쪽 말단으로부터 처음 355bp ,거대세포바이러스(cytromegalo-virus)(CMV) 인접 초기 프로모터(immediate early promoter), DNA 코딩 삽입 주개와 받게 위치, 바람직한 유전자(이경우 mda-7)를 위한 클로닝 위치, 베타 글로빈 유전자로부터 polyA 시그널 서열을 코딩하는 DNA, E1B 코딩 영역내에서 확장하는 아데노바이러스 서열의 대략 3kbp를 포함한다. 이러한 배열은 CMV 인접 초기 유전자 프로모터와 클론된 서열의 높은 수준의 발현및 적당한 RNA 프로세싱(processing)을 허용한다(28). 재조합 바이러스는 mda-7-함유하는 벡터 및 플라즈미드 JM17 사이에 상동 재조합에 의하여 생체내(in vivo) 293세포들(29)에서 만들어졌고 상기 재조합 바이러스는 또 pBR322의 변형된 버전으로 클로닝된 Ad 게놈전체를 포함한다(30). JM17은 생체내에서 Ad 게놈을 야기하나 이들은 너무 커서 패키지되지 않는다. 상기 제약은 선택한 유전자를 포함하면서 패키지가능한 게놈을 생산할 수 있는 벡터와의 재조합을 통해 극복된다. 재조합 바이러스는 293세포들을 제외하고 인간 세포들내에서 복제장애가 있다. 상기 바이러스는 아데노바이러스 E1A와 E1B를 발현한다. 두개의 플라즈미드 형질감염에 이어 감염성 바이러스가 회수되었고 게놈은 재조합 구조를 확인하기 위해 분석되었으며 바이러스는 플라크로 정제되었고, 모든 과정은 기본과정을 따른다(31).
펩타이드 항체 생성(Peptide Antibody production)과 면역침전 분석(Immuoprecipitation Analyses). 펩타이드 항체들은 개시되어진대로(21) PSQENEMFSIRD에 반하여 준비되었다. 대수적으로 HeLa, HeLa cl 1(HYGR pREP4 벡터 조절HeLa 콜론) 및 HeLa cl 2〔pREP4-mda-7 (S) 형질감염된 HygR mda-7을 발현하는 HeLa 콜론〕세포들은 mda-7 (AS) 〔Ad. mda-7 (AS)〕을 발현하는 재조합 아데노바이러스 또는 조절 아데노바이러스 (H5dl434) (32) 10 플라크 형성단위들로 감염되어지거나 또는 처리되지 않았다. 감염후 다양한 시간에 배양물은 메티오닌이 없는 배지에서 37℃, 1시간동안 메티오닌을 결핍시켰다.세포들은 펠렛팅을 통해 응축되었고 35S(NEN:35S를 발현)의 100μCi (1Ci=37GBq)를 함유한 같은 배지 1ml에서 37℃로 4시간 동안 표지되었다. MDA-7 펩티드 토끼 폴리클로날(polyclonal) 항체나 액틴 모노클로날 항체(종양유전자 과학, Oncogene sciences) 2μg으로 하는 면역침전 분석은 개시된대로(15,21) 수행되었다.
실험결과
인간의 암포들과 Ha-ras-형질형질전환된 쥐 배아 섬유모세포에서 mda-7 의 증강된 성장억제 성질. DNA 형질감염 분석은 세포 성장에 대한 MDA-7의 향상된 발현 영향 측정을 위해 수행되었다. 인간의 경부 악성종양(HeLa)세포들로 mda-7 (S)가 형질감염되었을때 mda-7(S) 제조물은 pREP4벡터 및 mda-7(AS) 제조물 형질감염된 배양물과 비교하여 HygR콜로니들에서 10배 내지 15배 감소한다. (도 1, 표 1)
표 1. 인간 암세포,정상적인 쥐 배아 섬유모세포(CREF) 및 Ha-ras-형질
형질전환에 의한 CREF 세포들의 단층 콜로니 형성에 대한 mda-7의 영향
세포형 RSV-벡터a RSV mda-7(S)b RSV-mda-7(AS)
인간 암세포주c
MCF-7 (가슴-Ca) 118 ± 24 42 ± 16 (3.5) 146 ± 20
T47D (가슴-Ca) 172 ± 9 44 ± 7 (4.2) 186 ± 28
HeLa (경부-Ca) 1571 ± 446 117 ±107 (15.2) 1771 ±385
LS174T(콜로렉탈 Ca) 130 ±14 30 ± 3 (5.4) 160 ±15
HONE-1(인두-Ca) 219 ± 19 71 ± 8 (3.5) 250 ± 19
Du-145 (전립선-Ca) 174 ± 18 54 ± 8 (3.1) 166 ± 12
T98G (교모세포) 99 ± 9 32 ±4 (3.6) 115 ± 14
Saos-2(골육종) 126 ± 22 35 ± 6 (3.9) 138 ± 14
쥐 배아 섬유모세포
CREF(정상적인 배아) 60 ± 10 35 ± 5 (1.7) 66 ± 7
CREF-ras(형질형질전환된) 147 ± 16 25 ± 4 (6.0) 151 ± 16
a대수적으로 성장 세포들은 100-mm 플레이트 당 1ⅹ106가 심어졌으며 삽입물이 없거나 mda-7 (AS) 또는 mda-7(S) 를 포함하는 벡터 〔pREP4 (RSV)〕10μg으로 형질감염되었다. 24시간후에 세포들은 하이그로마이신 100μg/ml를 포함하는 배지에 100-mm 플레이트당 대략 2ⅹ105 세포로 다시 덮혀졌다.배지는 매일 3 또는 4일마다 교환되었고 플레이트들은 포름알데하이드로 고정되었으며 14 또는 21일에 지엠사(Giemsa)로 착색되었다. 50 또는 더 많은 세포를 포함하는 콜로니들이 계산되어졌다. 보여진 수치는 4 내지 5의 복제 플레이트 ± S.D.에서 형성된 평균 HygR 콜로니이다.
b괄호안의 수치는 RSV-mda-7 (AS) 형질감염된 세포에 비해 콜로니형성이 배-감소함을 나타낸다.
cMCF-7, T47D, HeLa,LS174T, DU-145 및 HONE-1은 지적된 해부학상의 위치로부터 분리된 인간의 악성종양 (Ca) 세포주이다. T98G 는 인간의 교모세포멀티폼 세포주이다. CREF-ras는 Ha-ras (T24S) 종양유전자가 형질형질전환된 CREF 클론이다.
보다 적은 콜로니 형성에 덧붙여 mda-7 (S) 콜로니들이 pREP4 또는 mda-7 (AS) 제조물들 (도 1)로 형질감염한 후 나타나는 대응하는 HygR콜로니보다 크기가 더 작다. 추가적인 인간의 암 세포주로 형질감염되어졌을때 mda-7(S) 제조물들은 3내지 10배 HygR콜로니 형성을 감소시킨다.(표 1) 이들은 인간 가슴 악성종양(human breast carcinoma)(MCF 및 T47D), 결장 악성종양(colon carcinoma)(LS174 및 SW480), 인두 악성종양(nasopharyngeal carcimona)(HONE1), 전립선 악성종양(prostate carcinoma)(DU-145), 멜라노마(H0및 C8161), 교모세포멀티폼(GBM-18및 T98G)및 골육종(osteosarcoma)(Saos-2)을 포함한다. HeLa 세포들에서 관찰된 것처럼 mda-7(S) 제조물로 형질감염한 후에 형성하는 HygR콜로니들의 평균 크기는 pREP4벡터 또는 mda-7 (AS)구조체를 가지고 형질감염에 뒤이어 형성한 것보다 더 작다. 상기 결과는 조직학적으로 구별되는 인간 암들의 범위에서 과다 발현될때 mda-7이 잠재하는 성장 억제 유전자라는 것을 증명한다.또한 mda-7이 정상세포들의 성장을 억제하는지와 이 영향이 정량적으로 인간의 암세포에서 관찰된 것과 비슷한 지를 결정하기위해 일시적인 DNA 형질감염 분석이 패시지(passage) 10내지 12 정상 인간의 유선 상피세포들(HEMC), 정상 가슴 상피세포주 HBL-100, 정상 인간 피부 섬유모세포 (패시지 21) 와 클로닝된 정상 쥐 배아 섬유모세포주(CREF-트랜스 6)를 가지고 개시된대로(7,8) 수행되었다. HMEC, HBL-100 및 정상 인간 피부섬유모세포들은 매우 자주 정의가 잘된 콜로니를 형성하지 않기 때문에 심지어 피더-래이어(feeder-layer)을 사용할 때 다른 RSV 구조물들로 형질감염한 후에 전체 세포 수 및 하이그로마이신내에서 2내지 3주동안 성장의 영향이 결정되었다. 상기 방법을 사용하여 대략 1.1 내지 1.6배의 HMEC의 감소, 대략 1.1 내지 1.2의 HBL-100의 감소 및 대략 1.3 내지 2.1배의 정상 인간 피부 섬유모세포 수의 감소가 mda-7 (S)에 비해 mda-7(AS) 또는 pREP4 벡터 형질감염된 정상 세포들에서 각각 관찰되었다(각 세포형을 가지는 3개의 독립적인 실험들). 반대로 T47D 인간 가슴 악성종양세포들을 가지고 비슷한 실험 프로토콜(protocol)을 사용해서, 벡터 및 안티센스-형질감염된 세포에 비해 mda-7 (S) 제조물 대략 3.2 내지 5.2배를 가진 형질감염에 의해 성장이 억제되어졌다. CREF-트랜스 6 세포들의 경우, mda-7 (S) 대 mda-7 (AS) 및 벡터 형질감염된 세포들사이에 6개 독립적인 형질감염 분석들에 대한 HygR콜로니형성 차이는 0.5부터 2.8배까지로 분포했다(표 1). 반대로 mda-7 (S) 제조물의 Ha-ras 형질전환된 CREF로의 형질감염은 콜로니형성을 ∼6내지 8배(표 1)까지 감소시켰다. 상기 결과들은 mda-7이 인간의 암 및 Ha-ras-형질전환된 쥐 배아 세포들에서보다 정상 인간및 정상 잠식하는 세포내에서 성장과 콜로니형성을 감소시키는데에 정량적으로 덜 효과적임을 나타낸다.
안정하고 유도가능한 mda-7 발현의 영향 및 세포성장 및 형질전환된 표현형에 대한 mda-7 발현의 안티센스 억제. mda-7(S)유전자를 가지고 형질감염한 후에 낮은 빈도로 HeLa 세포가 살아남는 이유를 설명하기 위해 10개의 독립적인 HygR콜로니들이 mda-7(S)제조물을 가지고 형질감염한 다음 분리되었다. mda-7을 발현하기위해 노던 블로팅으로 분리된 10개 클론들중에서 7개 클론들은 감지가능한 mda-7 mRNA를 발현하지 않았으며, 2개 클론들은 mda-7 mRNA을 낮은 정도로 발현했다. 또 1개의 콜론(HeLa cl 2라고 명명되는)은 높은 정도의 mda-7 mRNA를 나타냈다. 반대로 모든 클론들은 비교할 수 있을 정도의 HygR과 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로제나제(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) (GAPDH) 유전자발현을 나타냈다. 모체 HeLa 세포 또는 pREP4 벡터 HeLa 클론(HeLa cl1으로 명명되는)와 비교할 때 HeLa cl2(mda-7발현)세포는 줄어든 속도로 자라났다.(도 2) 아가(agar)에서 성장되어질때 클로닝되지 않은 HeLa 및 HeLa cl 1세포들는 42%효율로 성장하였고 반면에 HeLa cl 2(mda-7발현)세포들는 대략 25%효율로 성장했으며 콜로니의 평균크기는 모체 HeLa 및 pREP4 벡터 HeLa cl 1 세포들보다 더 작다.상기 결과는 mda-7 을 가지고 형질감염한 후에 HeLa생존이 주로 낮은 정도의 mda-7발현 또는 결여에 기인함을 보여준다. 하지만 향상된 mda-7을 안정하게 발현하는 HeLa세포들에서 단층 배양에 대한 성장 및 앵커리지-독립성은 감소되어진다.
HeLa cl 2(mda-7을 발현)에서 발견된 시험관내 성장과 형질전환 억제의 감소가 mda-7의 직접적인 발현 결과인지를 결정하기 위해 안티센스 전략이 직접적으로 mda-7의 발현을 억제하도록 사용되어졌다. 안티센스 배향〔Ad.mda-7 (AS)〕에서 클로닝된 mda-7을 포함하는 재조합 Ad5벡터가 제조되어졌다. HeLa cl 1 (pREP4 ,non-mda-7)또는 모체 HeLa가 아니라 HeLa cl 2 (mad-7 발현)를 Ad.mad-7 (AS)를 가지고 감염시키는 것은 성장 비와 아가의 클로닝 효율을 증가시킨다.(대략 25%에서 44%까지)(도 2) 반대로 mda-7유전자를 포함하지 않은 조절 돌연변이 Ad5 (H5dl434)는 단층 및 모체 HeLa, HeLa cl 1또는 HeLa cl 2 세포들의 아가 성장에 영향을 주지 않는다(데이타는 제시되지않았음).
토끼와 면역침전 촉진분석에서 생성된 mda-7-특이성 펩타이드 항체들를 사용해서 HeLa cl 2(mda-7을 발현)세포들은 대략 24kDa 단백질 MDA-7과 대략 90내지 110kDa의 고분자량 복합체(HMC)단백질의 높은 정도를 포함한다. H5dl434 조절 비(non)-mda-7 발현 바이러스가 아닌 Ad.mda-7(AS)로 감염시킨결과 ∼24 kDa MDA-7 단백질 및 HMC 단백질(21) 모두에서의 일시적 감소가 발생한다(도 3). 양쪽 단백질의 감소정도는 48시간까지 나타나고 Ad.mda-7 (AS)로 감염후에 96시간의 기간동안 억압이 유지되었다. 반대로 액틴 레벨은 바이러스성 감염에 이어 변하지않는다. 이러한 발견은 HeLa cl 2(mda-7 을 발현)에서 MDA-7 단백질 발현의 안티센스 억제로 mda-7 유도성 성장 억제 및 앵커리지-독립된 성장에서의 저해를 직접적으로 식별할 수 있음을 보여준다.
세포성장에 대한 mda-7의 억제효과를 증명하기위해 DU-145 인간 전립선 암 세포가 DEX-유도성 mda-7 유전자를 발현하도록 조작했다.모체 DU-145가 제외된 DU-145 cl 6 또는cl 7 세포들(DEX-유도성 mda-7(S)유전자를 포함하는)은 10-6M 의 존재하에서 24에서 96시간동안 성장될때, mda-7 mRNA와 단백질(HMC 단백질을 포함하는)이 유도된다.(도 4) 반대로 DEX는 DU-145 cl 6와 cl 7세포들에서 네오마이신 내성(NeoR)유전자 발현 또는 테스트된 일정 세포형에서 GAPDH 발현을 변경하지 않는다.DU-145 cl 6와 cl 7세포에서 10-6M DEX에서의 성장에 의한 mda-7 발현의 유도는 DEX가 없는 성장에 비해 96 시간 후에 세포 수의 대략 50% 감소가 일어난다. 반대로 중요한 성장억제는 모체 DU-145 또는 pMAM네오 벡터가 형질전환된 DU-145세포들이 10-6M DEX를 포함하는 배지에서 96시간 성장될때 일어나지않는다(데이타에서는 제시되지않았음).상기 데이타는 mda-7의 기외 발현이 전립선 암세포들에서 세포성장을 직접 변경할 수 있음을 나타낸다.
실험토론
서브스트렉션 혼성화는 성장억제되고 마지막 분화되는 인간 멜라노마 세포들에서 높은 발현을 하는 mda-7을 동정했다. (13,14,21) 상기 mda의 기능을 결정하는 것은 인간 멜라노마 및 다른 세포형들에서 성장조절과 마지막 분화에 대한 분자 기초를 정의 하는 데에 많은 도움을 줄 것이다. mda-7 유전자(14,21)는 여기서 인간 암 세포주의 넓은 배열(arry)에서 일시적으로 또는 안정하게 발현될 때 편재하는 성장억제 유전자임이 개시된다. 상기 발견은 인간의 멜라노마 세포들에서 MDA-7 단백질의 성장 억제 성질을 나타내는 예전의 관찰결과를 확장한다(21). 암세포들에 대한 상기 유전자 영향과는 반대로 mda-7의 정상 인간 유선 상피세포, 정상 인간 피부 섬유모세포 및 정상 쥐 배아 섬유모세포로의 형질감염은 정량적으로 작은 성장억제를 나타낸다. 다른 mda 유전자와 같이, mda-6 (p21), mda-7 발현은 또한 전이되는 인간 멜라노마세포들(metastatic human melano cells)에 관련된 정상 인간 멜라닌 세포(human melanocytes)에 존재하는 mda-6(p21) 및 mda-7 이 향상되면서 멜라노마 진행과 역으로 연관된다. 멜라노마 세포들에 비해 감소된 속도임에도 불구하고 정상 멜라닌 세포들이 여전히 번식능력을 유지하기 때문에 mda-6(p21) 및 mda-7이 멜라닌세포/멜라노마 정렬 세포(melanoma lineage cells)에서 프로세싱 표현형의 음성적인 조절인자로써 작용함이 가능하다(14-16,21). 또한 마지막 분화되고 비가역적으로 성장 억제된 인간 멜라노마 세포들에서 mda-6(p21) 및 mda-7모두의 높은 발현은 상기 유전자들이 마지막 분화 표현형의 중요한 조절인자가 될 수 있음을 제시한다(13-16, 21).
mda-7이 인간의 암세포에 대한 성장 억제 효과를 이끌어내는 작용기작이 현재 알려져있지않다. mda-7의 구조는 잠재적인 활동 양식을 제시하는 서열 동기(sequence motifs)가 없기 때문에 잠재하는 기능에 대한 예견을 제공하지 못한다. 세포성장에 대한 mda-7의 영향은 광범위하게 연구되어진 종양 억제 유전자p53과 구별될 수 있다(33,34). T47D 인간 가슴 악성종양세포주를 포함하는 돌연변이 p53에서 p53의 일시적인 발현은 성장 억제를 하고 반면에 MCF -7 인간 가슴 악성종양세포주를 포함하는 야생-유형 p53으로 야생 -유형 p53유전자의 형질감염은 성장억제를 유도하지 않는다(34). 반대로 mda-7은 T47D 및 MCF-7 세포들 모두에서 유사한 성장 억제를 유도한다(표 1). mda-7에 의한 성장 억제는 또한 레티노블라스토마 유전자(pRB), pRb-관련된 p107유전자 및 추정되는 종양억제 유전자 p16ink4로 관찰된 것과 분리될 수 있다(25,35). pRb 및 p107의 과다 발현은 특정 세포형 및 세포 주기-의존성 방법으로 세포번식을 억제한다(35,37). 명백히 인간 정상 RB유전자를 포함하는 인간 교모세포계 T98G로의 pRb 또는 p107의 형질감염(25)은 성장 억제를 유도하지 않고(35,37) 반면에 일시적인 mda-7(S)발현은 T98G 콜로니형성을 감소시킨다(표 1). 현재 mda-7의 성장 억제 영향은 RB 집합체 멤버(RB family member) p130/pRb2에 의해 유도되는 성장 억제와 구별될 수 없고 또한 T98G 세포들에서 번식을 억제한다(25). p16ink4 유전자는 기능성 RB유전자를 포함하는 세포에서 성장저지를 유도하고(35,37). 반면에 mda-7 성장억제는 정상, 비정상 또는 비기능 RB 유전자들을 포함하는 세포들내에서 일어난다. RB를 발현하지않는(또는 야생-유형 p53) 또는 돌연변이된 RB유전자(38)및 Saos-2 인간 골육종 세포들을 포함하는 DU-145 인간 전립선 악성종양 세포로의 형질감염은 콜로니 형성을 억제한다(표 1). 이와 비슷하게 안정한 DEX-가능한 mda-7 형질전환된 DU-145 클론들내에서의 mda-7 발현 유도는 성장 억제를 야기한다. 이러한 발견은 mda-7에 의한 성장 억제에서 기능하는 RB 유전자의 의존성 결여를 나타낸다. 상기 연구를 종합해보면 mda-7의 억제 영향이 2개의 가장 넓게 연구된 종양 억제 유전자들, p53 및 pRb 그리고 추정되는 종양억제 유전자 p16ink4의 활동 양식과 구별되는 작용기작에 의해 일어남을 보여준다.
포유동물 세포에서 성장 억제나 DNA 손상의 작용으로써 향상된 발현을 나타내는 여러 유전자가 확인되어왔다(39,40). gadd45, gadd153 및 gadd34의 3가지 성장 저지 및 DNA 손상 유도성 (gadd)유전자, 밀접하게 연관된 골수 분화 주된 반응 (MyD118) 유전자(41) 및 야생의 p53억제 유전자 mme-2(42)가 DNA 손상제 메틸 메탄설포네이트(methylmethane sulfonate)(MMS)(40)를 처리함으로써 세포내에서 상향 조절될 수 있다. gadd45 와 성장저지-특이성 유전자 (gas1)(43,44)는 집합으로, 혈청-차단된 세포나 낮은 혈청에서 성장하는 세포로 세포를 유지함에 의하여 유도된다(40,43,44). 반대로 mda-7 mRNA 발현이 집합으로 세포를 유지하거나 메틸 메탄 설포네이트(MMS)로 처리한 후에 인간 멜라노마 세포에서는 유도되지 않는다.더우기, 단지 mda-7 mRNA발현의 작은 증가가 H0-1 인간 멜라노마 세포에서 96시간동안 혈청-차단된 배지에서 성장한다음 일어난다(21). gadd, MyD118 및 gas-1 유전자에 비한 mda-7 조절의 차이는 mda-7이 성장 저지 유전자의 새로운 종류를 나타낼 수있음을 나타낸다.
요약해서, 음성적 조절 유전자인 mda-7은, 정상적 및 돌연변이된 p53 및 RB유전자를 모두 포함한 인간 암 세포에서 성장 억제를 유도하는 것으로 설명되어진다. mda-7 게놈 구조의 특징은 상기 유전자가 종양 억제 유전자로써 정상적으로 작용하는 지 및 종양 대 정상 세포들에 있어 상기 유전자들에 변이가 존재할지를 결정하는데에 중요할 것이다. mda-7 프로모터 영역의 동정은 또한 상기 유전자가 특정 세포형에서 IFB-β 플러스 MEZ에 의해 분화적으로 발현되고 유도되는가에 의하여 작용기작의 분석을 허용할 것이다. mda-7이 정상 세포보다 암이나 변형된 세포에 대해 더욱 성장 억제 효과가 있다는 발견은 잠재적으로 중요하고 확장된 연구를 보증하는 것이다. 이러한 배경에서 야생형의 p53 유전자가 현재 특이한 인간 악성종양의 치료법에서 유용성이 테스트되고 있는것과 같이 mda-7은 암치료에 유전자-기초하는 중재 전략의 부분으로써 유용성이 증명될 수 있다.
실험 두번째 시리즈
재조합 아데노바이러스에서 멜라노마 분화와 관련된 유전자-7 (mda-7)은 원형 쥐(nude mice)에서 설립된 인간 종양의 성장을 억제한다.
이전의 연구는 다양한 유래의 인간 종양 세포에서 mda-7의 자궁외 발현이 단층배양에서의 콜로니 형성을 감소시키는 것에 의해 증명된 것처럼 성장을 억제한다는것을 입증한다(Jiang et al., PNAS, 93: 9160-9165,1996). 반대로 mda-7은 정상 인간 상피나 섬유모세포의 성장을 심각히 변형시키지 않는다. 이러한 관찰결과는 mda-7이 편재하는 암 성장 억제 유전자라는 가설을 지지한다.
선택적으로 암세포성장을 억제하는 mda-7의 능력은 이러한 유전자가 인간의 암을 다루는 데에 치료상의 이점을 제공할 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 가능성을 조사하기 위해 복제-장애가 있는 아데노바이러스 발현 mda-7이 형성되어졌다.실험계획은 아데노바이러스 발현 안티센스 mda-7, Ad.mda-7 AS를 제조하는데 사용된 것과 비슷하다.(Jiang et al., PNAS, 93: 9160-9165, 1996). 재조합 복제-장애가 있는 Ad.mda-7 S는 두단계로 생성되었다.처음에 mda-7 유전자는 센스배향으로 변형된 Ad 발현 벡터pAd.CMV로 되었다. 상기 바이러스는 순서대로 다음을 포함한다. Ad 게놈의 왼쪽 말단으로부터 첫번째 355bp, 거대세포바이러스(CMV) 인접 초기 프로모터, 베타 글로빈 유전자로부터 poly A 시그널 서열 코딩 DNA 및 E1b 코드 범위내에서 확장된 대략 3 kbp의 아데노바이러스 서열. 이러한 배열은 CMV 인접 초기 유전자 프로모터에 의해 클로닝된 서열의 높은 발현 및 적절한 RNA 프로세싱을 허락한다. 재조합 바이러스는 벡터를 포함하는 mda-7과 JM17사이에 상동 재조합에 의해 생체내 293 세포들내에서 만들어졌다. 그리고 이것은 pBR32의 변형된 버젼내로 클로닝된 Ad 게놈전체를 포함한다. JM17은 생체내에서 Ad게놈을 야기하나 그것들은 너무 커서 패키지할 수 없다. 이러한 제약은 선택된 유전자를 포함하며 패키지 할 수 있는 게놈을 만드는 벡터와의 재조합에 의하여 극복된다. 재조합 바이러스는 293 을 제외하고 인간 세포에서 복제 장애가 있다. 또한, 이는 아데노바이러스 E1A와 E1B를 발현한다. 두 플라미드의 형질감염후에 감염 바이러스는 회수되었고, 게놈은 재조합 구조를 확인하도록 분석되었으며 바이러스는 플라크로 정제되었고 이모든 과정은 기본 과정을 따른다.
mda-7 를 가지고 형질감염에서 관찰된 것처럼, 정상세포주가 아닌 다양한 인간 암세포주가 Ad.mda-7 S으로 감염되는 것은 성장을 억제한다. 이러한 결과는 상기 바이러스가 mda-7 플라즈미드 제조물을 가지고 관찰된 성질을 유지한다는 것을 보여준다. 가슴 악성종양(MCF-7,T47D), 교모세포(GBM-18와 T98G) 및 멜라노마(H0-1및 C8161)을 포함하는 많은 암세포에서 Ad.mda-7 S로 감염한 결과 계획된 세포 사망이 유도되었다(세포자멸사). 이러한 효과는 Ad.mda-7 S를 가지고 많은 수 (100pfu/세포)에 의한 감염 후 에라도 정상세포 유형에서 나타나지 않았다. 다른 암세포 유형에서, 성장억제(단층 배양에서 콜로니형성 억제에 의해 나타나는 것처럼)는 세포자멸사의 신호없이 핵 형태변화, 뉴클레오솜 사다리의 형성 또는 양성 TUNEL 반응에 의해 지시되는대로 명확했다. 이러한 결과는 Ad.mda-7 S바이러스가 시험관내 인간 암세포의 성장을 선택적으로 억제함을 지시한다. 더우기 특이한 암 세포유형에서 성장억제는 세포 자멸사의 유도와 상호관련이 있다. 이러한 관찰결과는 mda-7에 의해 유도된 암 성장억제가 다양한 경로에 의해 일어날 수 있음을 제시한다.
원형 쥐(nude mice) 인간 종양 이종이식 모델은 Ad.mda-7 S 가 생체내 인간 암 세포의 성장을 억제할 수 있는지를 결정하는 데에 사용되어졌다. 타코닉 연구실로부터 얻어진 무흉선 원형 쥐는 마트리겔(matrigel)과 혼합된 PBS에서 백만개의 인간 경부 악성종양(HeLa) 세포와 동시에 피하 주입되었다(최종 부피 0.4ml ; 마트리겔과 PBS의 비는 1:1). 종양은 평군부피 100 내지 200mm3이 될때까지 번식되었다.(주입 후 10 내지 21일) 그때 마이스는 임의추출되어지고 두그룹으로 나뉘어졌다. 그룹 1:mda-7 유전자가 복제 -장애가 있는Ad: mda-7이 부족한 Ad: 효력없는(null) 바이러스:그리고 그룹 2:Ad.mda-7 S.처리는 바이러스나 Ad.mda-7 S(4 위치(sites)/주입 당 100μl)를 4주동안 한주에 3번 종양내주입으로 이루어진다.종양은 주당 2번내지 3번 캘리퍼스(caliper)로 측정되어졌다. 종양부피는 pi/6 ⅹ 더 큰 반경 ⅹ (더 작은 반경)2 형태를 사용해서 계산되어졌다. 치료 4주 후에 동물은 추가된 한주 동안 계속되어졌다가 희생되어졌다. 초기 종양부피로 나눈 마지막 종양 부피는 암 진행 측정으로써 정의되는 종양 부피 비와 동일하다.
Ad.mda-7 S로 처리된 잘-설립된 HeLa 이종이식은 연구과정에 걸쳐 성장이 억제되어졌다. 반면에 효력없는 바이러스로 처리된 종양은 진행하며 계속 자랐다(도 5와 6). mda-7의 억제효과는 p 값＜ 0.05를 가지는 것으로 나타났다. 한 연구는 반복되어졌고 비슷한 결과가 얻어졌다. 상기 데이타는 mda-7의 자궁발현이 인간 암 처리에서 치료상의 이점을 제공할 수 있음을 제시한다. 실험은 원형 쥐에서 설립된 인간 가슴 암종양, MCF-7 및 T47D를 사용해서 지금 진행되고있다.

Claims (64)

  1. 멜라노마 분화 관련 유전자(mda-7)를 포함하는 핵산을 상기 유전자의 발현을 허용하여 유방암세포, 자궁경부암세포, 결장암세포, 전립선암세포, 비강인두암세포 또는 결합조직암세포의 성장 또는 증식을 억제하도록 상기 암세포내로 도입하는 것을 포함하는 인간을 제외한 포유동물에서 상기 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
  2. 멜라노마 분화 관련 유전자(mda-7)를 포함하는 핵산을 인간을 제외한 포유동물 개체내의 유방암세포, 자궁경부암세포, 결장암세포, 전립선암세포, 비강인두암세포 또는 결합조직암세포에서 상기 유전자의 발현을 허용하여 상기 암세포의 성장 또는 증식을 억제하도록 상기 암세포내로 도입하는 것을 포함하는 인간을 제외한 포유동물 개체내의 상기 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 핵산이 벡터를 포함하는 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 멜라노마 분화 관련 유전자(mda-7)가 그 발현이 조절인자의 통제하에 놓여지도록 조절인자에 연결되는 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 조절인자가 유도성이거나 구성성인 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 조절인자가 조직 특이성 조절인자인 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 핵산이 원형 DNA 기술, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 에프스타인-바 바이러스 벡터, 포진 바이러스 벡터, 감쇠 HIV 벡터, 레트로바이러스 벡터들, 우두 바이러스 벡터, 리포좀, 항체-코팅된 리포좀, 기계적 또는 전기적 수단에 의하여 세포내로 도입되는 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 암세포가 그 내부에 결함있는 p53, 망막아종(RB) 또는 p16ink4a유전자인 종양 억제유전자의 존재를 특징으로 하는 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
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  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 암세포가 그 내부에 Ha-ras, 돌연변이 p53 또는 인간 유두종 바이러스 유전자인 우성 작용 암유전자의 존재를 특징으로 하는 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
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  12. 제 3 항에 있어서, 상기 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 에프스타인-바 바이러스 벡터, 포진 바이러스 벡터, 감쇠 HIV 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 우두 바이러스 벡터인 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터가 Ad.mda-7 S로 명명되고, mda-7을 발현하는 복제결함 아데노바이러스 벡터인 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
  14. 멜라노마 분화 관련 유전자(mda-7)의 유전자 생성물을 유방암세포, 자궁경부암세포, 결장암세포, 전립선암세포, 비강인두암세포 또는 결합조직암세포 내로 도입하여 이 암세포의 성장 또는 증식을 억제하는 것을 포함하는 인간을 제외한 포유동물에서 상기 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
  15. 멜라노마 분화 관련 유전자(mda-7)의 유전자 생성물을 인간을 제외한 포유동물 개체내의 유방암세포, 자궁경부암세포, 결장암세포, 전립선암세포, 비강인두암세포 또는 결합조직암세포의 암 세포내로 도입하여 이 암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 것을 포함하는 인간을 제외한 포유동물 개체내의 상기 암세포의 성장 또는 증식을 억제하는 방법.
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  19. 제 14 항에 있어서, 상기 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 에프스타인-바 바이러스 벡터, 포진 바이러스 벡터, 감쇠 HIV 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 우두 바이러스 벡터인 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터가 Ad. mda-7 S로 명명되고, mda-7을 발현하는 복제결함 아데노바이러스 벡터인 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기에 유효한 양의 멜라노마 분화 관련 유전자(mda-7)의 유전자 생성물이 상기 세포에 전달되는 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
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  23. 제 3 항에 있어서, 상기 핵산이 원형 DNA 기술, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 에프스타인-바 바이러스 벡터, 포진 바이러스 벡터, 감쇠 HIV 벡터, 레트로바이러스 벡터들, 우두 바이러스 벡터, 리포좀, 항체-코팅된 리포좀, 기계적 또는 전기적 수단에 의하여 세포내로 도입되는 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
  24. 제 4 항에 있어서, 상기 핵산이 원형 DNA 기술, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 에프스타인-바 바이러스 벡터, 포진 바이러스 벡터, 감쇠 HIV 벡터, 레트로바이러스 벡터들, 우두 바이러스 벡터, 리포좀, 항체-코팅된 리포좀, 기계적 또는 전기적 수단에 의하여 세포내로 도입되는 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
  25. 제 5 항에 있어서, 상기 핵산이 원형 DNA 기술, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 에프스타인-바 바이러스 벡터, 포진 바이러스 벡터, 감쇠 HIV 벡터, 레트로바이러스 벡터들, 우두 바이러스 벡터, 리포좀, 항체-코팅된 리포좀, 기계적 또는 전기적 수단에 의하여 세포내로 도입되는 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
  26. 제 6 항에 있어서, 상기 핵산이 원형 DNA 기술, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 에프스타인-바 바이러스 벡터, 포진 바이러스 벡터, 감쇠 HIV 벡터, 레트로바이러스 벡터들, 우두 바이러스 벡터, 리포좀, 항체-코팅된 리포좀, 기계적 또는 전기적 수단에 의하여 세포내로 도입되는 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법.
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