BRPI9711137B1 - composição farmacêutica para reversão de fenótipo canceroso de uma célula cancerosa - Google Patents

Abstract

patente de invenção: <b>"uso de um gene associado com diferenciação de melanoma (mda 7) para reversão de um fenótipo canceroso".<d>esta invenção provê um processo para reversão de fenótipo canceroso de uma célula de câncer através de introdução de um ácido nucléico tendo o gene associado com diferenciação de melanoma (mda-7) na célula sob condições que permitem a expressão do gene de modo a pelo que reverter o fenótipo canceroso da célula. esta invenção também provê um processo para reversão de fenótipo canceroso de uma célula de câncer por introdução do produto gene descrito acima na célula de câncer de modo a pelo que reverter o fenótipo canceroso da célula. esta invenção também provê uma composição farmacêutica tendo uma quantidade de um ácido nucléico tendo o gene associado com diferenciação de melanoma (mda-7) ou o produto gene de um gene associado com diferenciação de melanoma (mda-7) eficaz para reverter o fenótipo canceroso de uma célula de câncer e um carreador farmaceuticamente aceitável.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA REVERSÃO DE FENÓTIPO CANCEROSO DE UMA CÉLULA CANCEROSA".

Antecedentes da Invenção Câncer é um processo multifatores e multietapas complexo envolvendo a expressão e supressão coordenada de genes funcionando como reguladores positivos e negativos de oncogênese (1-5). Estratégias de clonagem direta, baseadas em transferência de um fenótipo tumorigênico ou transformante dominante, identificaram oncogenes de atuação positiva (6-9). Em contraste, a detecção e clonagem de genes que suprimem o fenótipo câncer provaram mais difíceis e indefiníveis (10-15). Uma direta abordagem para isolamento de genes diretamente envolvidos em regulagem de crescimento e diferenciação envolve hibridização de subtração entre bibliotecas de cADN construídas de células de câncer crescendo ativamente e bibliotecas de cADN de células de câncer induzidas para perderem capacidade prolife-rativa irreversivelmente e diferenciarem terminalmente (13,14). Esta estratégia experimental tem sido aplicada a células de melanoma humano, induzidas para diferenciarem terminalmente através de tratamento com interferon β humano recombinante (IFN-β) e mezerein (MEZ), resultando na clonagem de novos genes associados - diferenciação melanoma (mda) anteriormente não descritos em bases de dados de DNA (13,14). Um papel direto para genes mda específicos em mediação de crescimento e controle de ciclo de célula é visível através da identificação e clonagem de mda-6 (13-16), que é idêntico ao inibidor ubíquo de quinases dependentes - ciclina p21 (17). A importância de p21 em controle de crescimento é bem documentada e este gene foi isolado independentemente, como WAF-1, CIP-1, e SDI-1, por um número de laboratórios usando-se diferentes abordagens (18-20). Estes estudos indicam que genes específicos associados com controle proliferativo são induzidos e podem contribuir para os processos de impedimento de crescimento e diferenciação terminal em células de câncer humano. O gene mda-7 foi clonado de uma biblioteca subtraída de melanoma humano (H0-1) tratado - (IFN-β mais MEZ) indutor de diferenciação (13,14). O cADN de mda-7 de inteiro-comprimento são 1718 nucleotídios, e o principal quadro de leitura aberto codifica uma nova proteína de 206 aa com um Mr de 23,8 kDa (21). Estudos anteriores indicam que mda-7 é induzido como uma função de impedimento de crescimento e indução de diferenciação terminal em células de melanoma humano (14,21). Expressão de mda-7 também relaciona-se inversamente com progressão de melanoma, isto é, melanócitos humanos crescendo ativamente expressam mais mda-7 do que células de melanoma humano metastáticas (21). Além disso, mda-7 é inibidor de crescimento na direção de células de melanoma humano em ensaios de transfecção transiente e em células transformadas estáveis contendo um gene mda-7 induzível - dexametasona (DEX) (21). Estes estudos indicam que mda-7 pode contribuir para a fisiologia de melanócitos humanos e melanomas, e este gene tem propriedades supressoras quando superex-presso em células de melanoma humano. O gene mda-7 também foi descrito no Pedido de Patente Internacional sob Tratado de Cooperação em Matéria de Patente N° PCT/US94/12160, data de depósito internacional, 24 de outubro, 1994 com publicação internacional n° W095/11986, o conteúdo da qual é aqui incorporado por referência.

Esta invenção reporta que mda-7 é um potente gene supressor de crescimento em células de câncer de origem diversa, incluindo mama, sistema nervoso central, cérvix, cólon, próstata e tecido conjuntivo. Uma inibição em formação de colônia ocorre em células de câncer contendo defeitos em seus genes p53 e/ou retinoblastoma (RB) ou falta de expressão p53 e RB. Em contraste, expressão de mda-7 em células epiteliais mamíferas humanas normais, fibroblastos de pele humana e fibroblastos de embrião de rato induz quantitativamente menos supressão de crescimento que em células de câncer. Quando estavelmente expresso em células de carcinoma cervical humano (HeLa) e carcinoma de próstata (DU-145), mda-7 tem um efeito negativo sobre propriedades relacionadas a crescimento e transformação. Os efeitos de mda-7 sobre células HeLa são reversíveis seguindo anulação da proteína MDA-7 por infecção com um vetor Ad5 modificado geneticamente expressando um gene mda-7 anti - sentido. Estas observações in- dicam que mda-7 é um novo gene de supressão de crescimento com uma ampla faixa de ações inibidoras em cânceres humanos manifestando diferentes defeitos genéticos.

Sumário da Invenção Esta invenção provê um processo para reversão de fenótipo canceroso de uma célula de câncer por introdução de um ácido nucléico incluindo um gene associado com diferenciação de melanoma (mda-7) na célula sob condições permitindo a expressão do gene de modo a reverter o fenótipo canceroso da célula. Esta invenção também provê um processo para reversão de fenótipo canceroso de célula de câncer em um sujeito através de introdução do ácido nucléico descrito acima na célula cancerosa do sujeito.

Esta invenção também provê um processo para reversão do fenótipo canceroso de uma célula de câncer através da introdução do produto genético de um gene associado com diferenciação de melanoma (mda-7) na célula de câncer de modo a reverter o fenótipo canceroso da célula. Esta invenção também provê um processo para reversão do fenótipo canceroso de uma célula de câncer em um sujeito através da introdução do produto genético descrito acima na célula cancerosa do sujeito.

Esta invenção também provê uma composição farmacêutica tendo uma quantidade de um ácido nucléico incluindo um gene associado com diferenciação de melanoma (mda-7) eficaz para reverter o fenótipo canceroso de uma célula de câncer e um veículo farmaceuticamente aceitável. Esta invenção também provê uma composição farmacêutica tendo uma quantidade do produto genético do gene descrito acima eficaz para reverter o fenótipo canceroso de uma célula de câncer e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Breve Descrição das Figuras Figura 1. Efeito de expressão de mda-7 sobre formação de colônia resistente à higromicina em células HeLa. Células HeLa foram transfectadas com 10 pg de vetor de pREP4 (vetor de RSV), mda-7 clonado em uma orientação anti - sentido no vetor de pREP4 (RSV-MDA-7-anti-sentido), ou mda-7 clonado em uma orientação sentido no vetor de pREP4 (RSV-MDA-7-sentido) e selecionadas em meios contendo 100pg de higromicina.

Figura 2. Efeito de mda-7 anti - sentido sobre crescimento mono- camada de vetor de pREP4 HeLa cl 1 e mda-7 (S) expressando células HeLa cl 2 Células HeLa cl 1 (vetor de pREP4 transformado com clone HeLa) e HeLa cl 2 (mda-7 expressando clone HeLa) foram desenvolvidas na ausência ou seguindo infecção com 10 unidades formadoras de placa/célula com um adenovírus tipo 5 recombinante (Ad5) expressando mda-7 anti-sentido [Ad.mda-7 (AS)]. Resultados são número de célula médio de amostras tri-plicatas que variaram por < 10%.

Figura 3. Efeito de mda-7 anti-sentido sobre a proteína comple- xante MDA-7 (HMC) de alto peso molecular, a proteína de MDA-7 e a proteína actina em células HeLa, HeLa cM, e HeLa cl 2. HeLa e HeLa cl 1 (vetor de pREP4 transformado com clone HeLa) foram não-infectadas (-) ou infectadas (+) com 10 unidades formadoras de placa/célula de Ad. mda-7 (AS) por 96 horas rotuladas com [35S]-metionina, e os níveis das proteínas de HMC, MDA-7 e actina foram determinados por análise de imunoprecipita-ção. Para HeLa cl 2 (mda-7 expressando clone HeLa), o efeito de infecção com 10 unidades formadoras de pla-ca/ml de Ad.mda-7 (AS) sobre níveis de proteína foi determinado por análise de imunoprecipitação de lisatos de células rotuladas com [35S] metionina após +24, +48, +72 e +96 horas. O efeito de infecção de células HeLa cl 2 com o mutante controle Ad5, H5dl 434, foi determinado por análises de imunoprecipitação de lisatos de células rotuladas com [35S] metionina 96 horas após infecção com 10 unidades formadoras de placa/célula.

Figuras 4A e 4B. Síntese de RNA de mda-7 e proteína em clones DU-145 contendo um gene mda-7 induzível - DEX.

Figura 4A. Células foram desenvolvidas na ausência ou presença de DEX 10'6M por 96 horas, e RNA total foi isolado, submetido à Northern blothing e sondado com mda-7, um gene de resistência à neomicina (NeoR) e GAPDH.

Figura 4B. Células foram desenvolvidas na ausência ou presença de DEX 10'6M por 96 horas, proteínas celulares foram rotuladas com [35S] metionina e imunoprecipitadas com anticorpos reconhecendo proteínas MDA-7 e actina.

Figura 5. Inibição de crescimento de exenoenxertos de câncer cer- vical humano estabelecido (HeLa) em camundongo nu atímico.

Figura 6. Efeito de Ad.mda-7 S sobre razões de volume de tumor HeLa. O resultado indica que Ad.mda-7 S pode inibir progressão de tumor in vivo em camundongo nu.

Descrição Detalhada da Invenção De modo a facilitar um entendimento da seção de Detalhes Experimentais que se segue, certos processos e/ou termos ocorrendo fre-qüentemente são descritos em Sambrook, et al. (45).

Esta invenção provê um processo para reversão de fenótipo canceroso de uma célula de câncer que compreende introdução de um ácido nucléico compreendendo um gene associado com diferenciação de mela-noma (mda-7) na célula sob condições permitindo a expressão do gene de modo a reverter o fenótipo canceroso da célula.

Esta invenção também provê um processo para reversão do fenótipo canceroso de uma célula de câncer em um sujeito que compreende introdução de uma molécula de ácido nucléico compreendendo um gene associado com diferenciação de melanoma (mda-7) na célula cancerosa do sujeito sob condições permitindo expressão do gene na célula do sujeito de modo a pelo que reverter o fenótipo canceroso da célula.

Processos para introduzir uma molécula de ácido nucléico em células são conhecidos na técnica. Molécula de ácido nucléico nua pode ser introduzida na célula através de transformação direta. Alternativamente, a molécula de ácido nucléico pode ser embutida em lipossomas. Da mesma maneira, esta invenção provê os processos acima onde o ácido nucléico é introduzido nas células por tecnologia de DNA nu, vetor de adenovírus, vetor de vírus adeno-associado, vetor de vírus Epstein-Barr, vetor de vírus da her-pes, vetor de HIV atenuado, vetores retrovirais, vetor de vírus vacínia, lipossomas, lipossomas revestidos-anticorpos, meios mecânicos ou elétricos. Os processos citados acima são meramente usados como exemplos para meios exeqüíveis de introdução do ácido nucléico em células. Outros processos conhecidos também podem ser usados nesta invenção.

Em uma modalidade dos processos acima, o gene associado com diferenciação de melanoma (mda-7) está ligado a um elemento regulador de modo que sua expressão está sob o controle do elemento regulador. Ainda em uma modalidade, o elemento regulador é induzível ou constitutivo. Elemento regulador induzível como um promotor induzível é conhecido na técnica. Elemento regulador tal como promotor que pode direcionar expressão constitutiva é também conhecido na técnica.

Em uma modalidade separada, o elemento regulador é um elemento regulador específico de tecido. A expressão do gene mda-7 será então específica de tecido.

Em uma outra modalidade dos processos descritos acima, a célula de câncer é caracterizada pela presença dentro da célula de câncer de um gene supressor de tumor defeituoso. O gene supressor de tumor defeituoso inclui, mas não está limitado a, um gene retinoblastoma (RB) ou um p16ink4a.

Em uma modalidade dos processos descritos acima, a célula de câncer é caracterizada pela presença dentro da célula de câncer de um on-cogene atuante dominante. Especificamente, o oncogene atuante dominante pode ser um Ha-ras, mutante p53 ou genes de vírus de papíloma humano. O Ha-ras é um oncogene ras de vírus de Harvey.

Em uma modalidade dos processos acima, o ácido nucléico compreende um vetor. O vetor inclui, mas não está limitado a, um vetor de adenovírus, um vetor de vírus adeno-associado, vetor de vírus Epstein-Barr, vetor de vírus da herpes, vetor de HIV atenuado, vetor de retrovírus e vetor de vírus da vacínia. Em uma modalidade preferida, o vetor de adenovírus é um vetor de adenovírus defeituoso-replicação expressando mda-7, designado Ad.mda-7 S. Em uma outra modalidade o vetor de adenovírus é um vetor de adenovírus competente-replicação.

Esta invenção também provê um processo para reversão de fe-nótipo canceroso de uma célula de câncer que compreende introdução do produto genético de um gene associado com diferenciação de melanoma (mda-7) na célula cancerosa de modo a pelo que reverter o fenótipo canceroso da célula.

Esta invenção ainda provê um processo para reversão de fenótipo canceroso de uma célula de câncer em um sujeito que compreende introdução do produto genético de um gene associado com diferenciação de melanoma (mda-7) na célula cancerosa de sujeito de modo a pelo que reverter o fenótipo canceroso da célula.

Em uma modalidade dos processos descritos acima, a célula de câncer inclui, mas não está limita à, célula de mama, cervical, de cólon, de próstata, nasofaringeal, de pulmão, de tecido conjuntivo ou de sistema nervoso. A célula de câncer ainda inclui células de glioblastoma multiforme, lin-fomas e leucemia.

Esta invenção também provê uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade de ácido nucléico compreendendo um gene associado com diferenciação de melanoma (mda-7) eficaz para reverter o fenótipo canceroso de uma célula de câncer e um veículo farmaceutica-mente aceitável.

Como aqui usado, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" encampa quaisquer dos veículos farmacêuticos padrão. A composição farmacêutica pode ser constituída em qualquer forma apropriada para o modo de administração selecionado. Composições apropriadas para administração oral incluem formas sólidas, tais como pílulas, cápsulas, grânulos, comprimidos e pulverizados, e formas líquidas, tais como soluções, xaropes, elixires, e suspensões. Formas úteis para administração parenteral incluem soluções estéreis, emulsões e suspensões.

Em uma modalidade, o ácido nucléico compreende um vetor. O vetor inclui, mas não está limitado a, um vetor de adenovírus, vetor de vírus adeno-associado, vetor de vírus Epstein-Barr, vetor de vírus da herpes, vírus de HIV atenuado, vetor de retrovírus e vetor de vírus da vacínia. Em uma modalidade apropriada, o vetor de adenovírus é um vetor de adenovírus defeituoso-replicação expressando mda-7, designado Ad.mda-7 S. Em uma outra modalidade, o adenovírus é um vetor de adenovírus competente-replicação.

Esta invenção também provê uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade do produto genético de um gene associado com diferenciação de melanoma (mda-7) eficaz para reverter o fenótipo canceroso de uma célula de câncer e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em uma modalidade dos processos descritos acima, a célula de câncer inclui, mas não está limitada a, células de mama, cervicais, de cólon, de próstata, nasofaringeais, de pulmão, de tecido conjuntivo e de sistema nervoso. A célula de câncer ainda inclui células de glioblastoma multiforme, linfomas e leucemia.

Esta invenção será melhor entendida a partir dos Detalhes Experimentais que se seguem. Entretanto, alguém versado na técnica facilmente apreciará que os processos e resultados específicos discutidos são meramente ilustrativos da invenção como descrita mais inteiramente nas reivindicações que se seguem.

Detalhes Experimentais Câncer é uma doença caracterizada por defeitos em controle de crescimento, e células de tumor freqüentemente mostram padrões anormais de diferenciação celular. A combinação de interferon de fibroblasto humano recombinante e o agente anti-leucêmico mezerein corrige estas anormalidades em células de melanoma humano cultivadas resultando em impedimento irreversível de crescimento e diferenciação terminal. Hibridização de subtração identifica um gene associado com diferenciação de melanoma (mda-7) com elevada expressão em crescimento impedido e células de melanoma humano diferenciadas terminalmente. Formação de colônia diminui quando mda-7 é transfectado em células de tumor humano de diversas origens e com múltiplos defeitos genéticos. Em contraste, os efeitos de mda-7 sobre crescimento e formação de colônia em ensaios de transfecção transiente com células normais, incluindo epitelial mamária humana, fibroblasto de pele humana e fibroblasto de embrião de rato, é quantitativamente menos que aquele encontrado com células de câncer. Células de tumor expressando elevado mda-7 mostram supressão em crescimento de monocamada e independência de ancoragem. Infecção com um adenovírus tipo 5 recombi-nante expressando mda-7 anti-sentido elimina supressão de mda-7 do crescimento in vitro e fenótipo transformado. A habilidade de mda-7 em suprimir crescimento em células de câncer não expressando ou contendo defeitos em ambos os genes, retinoblastoma (RB) e p53 indica uma falta de envolvimento destes elementos supressores de tumores críticos em mediação de inibição de crescimento induzida por mda-7. A falta de homologia de proteína de mda-7 com genes de supressão de crescimento previamente descritos e o efeito diferencial deste gene sobre células normais versus de câncer, sugere que mda-7 pode representar uma nova classe de genes de supressão de crescimento com atividade anti-tumor.

Materiais e Processos Linhas de Células e Condições de Cultura Linhas de célula de carcinoma humano, incluindo MCF-7 e T47D (mama), LS174T e SW480 (colorretal), HeLa (cervical), DU-145 (próstata), e HONE-1 (nasofaringeal) (9,22-25), foram desenvolvidas em meio Eagle modificado Dulbecco suplementado com soro fetal de bovino 10% (DMEM-10) a 37°C em uma incubadora umidificada com ar a 95%/CC>2 a 5%. Tipos de célula humaná adicionais incluindo HBL-100 (epitelial mamária normal), H0-1 e C8161 (melanoma), GBM-18 e T98G (glioblastoma multiforme) e Saos-2 (osteosarcoma humano) foram mantidas sob condições similares. Células epiteliais mamárias humanas normais de passagem inicial (HMEC; passagens 10-12) foram obtidas de Clonetics Corporation (San Diego, CA). Células HMEC foram mantidas em um meio livre de soro como descrito por Clonetics Corporation. CREF-Trans 6 (fibroblastos de embrião de rato Fischer clonados) (9,26) e CREF Ha-ras (células CREF transformadas pelo oncoge-ne Ha-ras (T24) (27) foram cultivadas em DMEM-5. HeLa cl 1 é um vetor de RSV vírus de Sarcoma de Rous (HygR) resistente a higromicina (pREP4) (Invitrogen) transformado com clone HeLa. HeLa cl 2 é HygR mda-7 expressando clone HeLa. Células HeLa cl 1 e HeLa cl 2 foram construídas como descrito (12,21) e mantidas em DMEM-10 contendo 100pg/ml de higromici-na. Células DU-145 cl 6 e DU-145 cl 7 contêm um gene mda-7 induzível DEX (clonado em um vetor pMAMneo) (Clontech)(21) e são mantidas em DMEM-10 contendo 200pg/ml G418.

Hibridização Subtração, Plasmídios, Constructos de Vetores de Expressão, e Hibridização Northern Identificação e clonagem de mda-7 por hidridização de subtração foram obtidas como descrito (13). Um cADN de mda-7 de comprimento inteiro foi isolado por seleção de um IFN-β recombinante mais biblioteca cADN HO-1 tratado - MEZ (13) e usando o procedimento de amplificação rápida de extremidades de cDNA como descrito (15). Um fragmento de cDNA de mda-7 (posição de nucleotídeos 176-960) contendo o quadro de leitura aberto foi amplificado com PCR e clonado em pCRIl® (Invitrogen) através de clonagem TA. A orientação das inserções nos vetores foi determinada por mapeamento de restrição. Os constructos de expressão de célula humana foram produzidos por clonagem de fragmentos Kpn l-Xho I de vetores PCR® em vetor de pREP4 (Invitrogen) a jusante de um promotor RSV em uma orientação sentido [mda-7-(S)j ou anti-sentido [mda-7 (AS)]. Alternativamente, o fragmento de gene mda-7 foi clonado no vetor de pMAMneo (Clontech) em uma orientação sentido e anti-sentido. Isolamento de RNA e Northern blotting foram realizadas como descrito (9, 12, 13, 21). Ensaios de Crescimento de Monocamada, Independência de Ancoragem e Transfeccão de DNA

Ensaios de crescimento de monocamada e independência - ancoragem foram realizados como anteriormente descrito (8, 12, 26). Para estudar o efeito de mda-7 sobre formação de colônia de monocamada o vetor [pREP4 (RSV)] não contendo inserção, constructos de expressão mda-7 (S) ou mda-7 (AS) foram transfectadas nos vários tipos de células através do processo lipofectina (GIBCO/BRL) e formação de colônia resistente à higro-micina ou crescimento de célula em higromicina foi determinado (12,21). Construção de Vetor de Adenovírus mda-7 Anti-Sentido O Ad.mda-7 (AS) defeituoso-replicação recombinante foi criado em duas etapas. Primeiro, a seqüência de codificação do gene mda-7 foi clonada em um vetor de expressão Ad modificado pAd.CMV (28). Isto contém, em ordem, os primeiros 355 pb a partir da extremidade esquerda do genoma Ad, o promotor inicial imediato de citomegalovírus (CMV), DNA codificando sítios doadores e receptores de emenda, sítios de clonagem para o gene desejado (neste caso mda-7), DNA codificando uma seqüência sinal polia a partir do gene beta globina, e aproximadamente 3 kbp de seqüência de adenovírus estendendo-se de dentro da região codificante E1B. Este re-arranjo permite alto nível de expressão da seqüência clonada pelo promotor de gene inicial imediato CMV, e apropriado processamento de RNA (28). O vírus recombinante foi criado in vivo em 293 células (29) através de recom-binação homóloga entre vetor contendo mda-7 e plasmídio JM17, que contém o todo do genoma Ad clonado em uma versão modificada de pBR322 (30). JM17 dá origem a genomas Ad in vivo, mas elas são muito grandes para embalar. Esta restrição é aliviada por recombinação com o vetor para criar um genoma embalável (30), contendo o gene de escolha. O vírus recombinante é defeituoso-replicação em células humanas, exceto células 293 que expressam adenovírus E1A e E1B. Seguindo transfecção dos dois plasmídios, vírus infeccioso foi recuperado, os genomas foram analisados para confirmação de estrutura recombinante, e então o vírus foi purificado por placa, tudo através de procedimentos padrão (31).

Produção de Anticorpo Peptídeo e Análises de Imunoprecipitacão Anticorpos peptídeos foram preparados contra PSQENEMFSIRD como descrito (21). Células HeLa, HeLa cl 1 (vetor de controle HygR pREP4 clone HeLa), e HeLa cl 2 (HygR mda-7 transfectado com pREP4-mda-7 expressando clone HeLa] crescendo logaritmicamente foram tanto não-tratadas como infectadas com 10 unidades formadoras de placa de adenovírus de controle (H5dl434)(32) ou um adenovírus recombinante expressando mda-7 (AS)[Ad.mda-7 (AS)]. Em várias horas após infecção, culturas foram jejuadas de metionina por 1 hora a 37°C em meio livre de metionina, células foram concentradas por peletização e rotuladas por 4 horas a 37°C em 1 ml do mesmo meio com 100 pCi (1 Ci = 37 GBq) de 35S (NEN; Express 35S).

Análises de imunoprecipitação com 2pg de anticorpo policlonal de coelho de peptídeo MDA-7 ou anticorpo monoclonal de actina (Oncogene Sciences) foram realizadas como descrito (15,21).

Resultados Experimentais Propriedades Inibidoras de Crescimento Aperfeiçoadas de mda-7 em Células de Câncer Humano e Células Fibroblastos de Embrião de Rato Transformadas com Ha-ras Ensaios de transfecção de DNA foram realizados para avaliar o efeito de elevada expressão de mda-7 sobre crescimento de célula. Quando transfectadas em células de carcinoma cervical humano (HeLa), o constructo mda-7 (S) resulta em uma redução de 10 a 15 vezes em colônias HygR em comparação com o vetor de pREP4 e culturas transfectadas com constructo mda-7 (AS) (Fig. 1 e Tabela 1).

Tabela 1 Efeito de mda-7 sobre formação de colônia monocamada de células de câncer humano, fibroblastos de embrião de rato normais (CREF) e CREF transformadas Ha-ras.

Tipo de Célula Vetor-RSV RVS-muda-7(S)b RSV-muda-7(AS) Linhas de células de câncer humano MCF-7 (Mama - Ca) 118 ±24 42 ±16(3,5) 146 ±20 T47D (Mama - Ca) 172 ±9 44 ±7 (4,2) 186 ±28 HeLa (Cervix- Ca) 1571 ± 446 117 ± 107 (15,2 1771 ± 385 LS174T(Colorretal-Ca) 130 ±14 30 ±3 (5,4) 160 ±15 Hone-1 (Nasofaringeal-Ca) 219±19 71 ±8(3,5) 250±19 DU-145 (Próstata-Ca) 174 ±18 54 ±8 (3,1) 166 + 12 T98G (Glioblastoma) 99 ±9 32 ±4 (3,6) 115 ±14 Saos-2 (Osteossarcoma) 126 ±22 35 ±6 (3,9) 138 ±14 Fibra Blasto & Embrião de Rato CREF (Embrião de rato normal) 60 + 10 35 ±5 (1,7) 66 ±7 CREF-ras (transformada) 147 ±16 25 ±4 (6,0) 151 ±16 a Células crescendo logaritmicamente foram semeadas em 1x106 por placa de 100mm e transfectadas com 10pg de vetor [pREP4 (RSV)] não contendo inserção, mda-7 (S), ou mda-7 (AS). Após 24 horas, células foram novamente feitas placas em aproximadamente 2x105 células por placa de 100mm em meio contendo 100pg/ml de higromicina. Meio foi alterado cada 3 ou 4 dias e placas foram fixadas em formaldeído e manchadas com Giemsa no dia 14 ou 21. Colônias contendo 50 ou mais células foram enumeradas. Valores mostrados são as colônias HygR médias formadas em quatro a cinco placas réplicas +/- desvio padrão. b Valores em parênteses indicam diminuição-dobrada em formação de colônia versus células transfectadas com RSV-mda-7 (AS). c MCF-7, T47D, HeLa, LS174T, DU-145 e HONE-1 são linhas de células de carcinoma humano (Ca) isoladas do sítio anatômico indicado. T98G é uma linha de célula multiforme de glioblastoma humano. CREF-ras um clone CREF transformado com oncogene Ha-ras (T24).

Em adição a formação de menos colônias, colônias mda-7 (S) são genericamente de menor tamanho que correspondentes colônias HygR resultantes após transfecção com o vetor de pREP4 ou constructos mda-7 (AS) (Fig. 1). Quando transfectadas em linhas de célula de câncer humano adicionais constructos mda-7 (S) reduzem formação de colônia HygR por 3 a 10 vezes (Tabela 1). Estas incluem carcinoma de mama humano (MCF-7 e T47D), carcinoma de cólon (LS174T e SW480), carcinoma nasofaringeal (HONE-1), carcinoma de próstata (DU-145), melanoma (H0-1 e C8161), glioblastoma multiforme (GBM-18 e T98G) e osteossarcoma (Saos-2). Como observado com células HeLa, os tamanhos médios de colônias HygR que se formam após transfecção com constructos mda-7 (S) são menores que aquelas formadas seguindo transfecção com o vetor de pREP4 vazio ou constructos mda-7 (AS). Estes resultados demonstram que mda-7 é um potente gene supressor de crescimento quando superexpresso em um amplo espectro de cânceres humanos histologicamente distintos. Para determinar se mda-7 também inibe o crescimento de células normais e se este efeito é quantitativamente similar àquele observado com células de câncer humano, ensaios de transfecção de DNA transiente foram realizados com células epiteliais mamárias humanas normais passagens 10 a 12 (HMEC), célula epitelial de mama normal linha HBL-100, fibroblastos de pele humana normais (passagem 21) e uma linha de célula fibroblasto de embrião de rato normal clonada (CREF-Trans 6)(7,8)- Uma vez que HMEC, HBL-100 e fibroblastos de pele humana normais não formam colônias bem definidas em altas freqüências, mesmo quando usando-se uma camada - alimentadora, o efeito sobre número total de células após transfecção com as diferentes constructos RSV e crescimento para duas e três semanas em higromicina foram determinados. Usando-se esta abordagem, uma diminuição aproximada de 1,1 a 1,6 vezes em HMEC, uma diminuição aproximada de 1,1 a 1.2 vezes em HBL-100 e uma diminuição aproximada de 1,3 a 2,1 vezes em número de célula de fibroblasto de pele humana normal foram observados (três experimentos independentes com cada tipo de célula) em células normais transfectadas com mda-7 (S) versus mda-7 (AS) ou vetor de pREP4, respectivamente. Em contraste, usando-se um protocolo experimental similar com células de carcinoma de mama humano T47D, o crescimento foi inibido seguindo transfecção com o constructo mda-7 (S) aproximadamente 3,2 a 5.2 vezes em comparação com células transfectadas com vetor e anti-sentido. No caso de células CREF-Trans 6, a diferença em formação de colônia HygR para seis ensaios de transfecção independentes entre células transfectadas com mda-7 (S) versus mda-7 (AS) e vetor variaram de 0,5 a 2,8 vezes (Tabela 1). Em contraste, transfecção de constructos mda-7 (S) em células CREF transformadas com Ha-ras reduziu formação de colônia por ~6 a 8 vezes (Tabela 1). Estes resultados indicam que mda-7 é quantitativamente menos eficaz em redução de crescimento e formação de colônia em células humanas normais e de roedores normais, do que em células de câncer humano e de embrião de rato transformadas com Ha-ras.

Efeito de Expressão de mada-7 Estável e Induzível e Inibição de Expressão de mda-7 Anti-Sentido Sobre Crescimento de Célula e o Fenótipo Transformado Para determinar a razão pela baixa freqüência de sobrevivência de HeLa após transfecção com o gene mda-7 (S), dez independentes colônias HygR foram isoladas seguindo transfecção com o constructo mda-7 (S).

Dos 10 clones analisados por Northern blotting para expressão mda-7, 7 clones não expressam mRNA de mda-7 detectável, 2 clones expressaram baixos níveis de mRNA de mda-7 e 1 clone (designado HeLa cl 2) mostrou altos níveis de mRNA de mda-7. Em contraste, todos os clones mostraram níveis comparáveis de expressão de gene HygR e gliceraldeído 3-fosfatase desidrogenase (GAPDH). Quando comparadas com células HeLa de origem ou um clone HeLa vetor de pREP4 (designado HeLa cl 1), células HeLa cl 2 (expressando mda-7) cresceram em uma taxa reduzida (Fig. 2). Quando crescendo em ágar, células HeLa não-clonadas e HeLa cl 1 cresceram com aproximadamente 42% de eficiência, enquanto células HeLa cl 2 (expressando mda-7) cresceram com aproximadamente 25% de eficiência e os tamanhos médios de colônias foram menores que observados com células HeLa de origem e vetor de pREP4 HeLa cl 1. Estes resultados indicam que sobrevivência de HeLa após transfecção com mda-7 resulta primariamente da falta de, ou baixos níveis de expressão de mda-7. Entretanto, em células HeLa que expressam estavelmente mda-7 elevado, crescimento em cultura monocamada e independência-ancoragem são reduzidos.

Para determinar se a redução em crescimento in vitro e supressão de transformação verificados em HeLa cl 2 (expressando mda-7) são uma direta conseqüência de expressão de mda-7, uma estratégia anti-sentido foi usada para inibir diretamente expressão de mda-7. Um vetor de Ad5 recombinante contendo o gene de mda-7 clonado em uma orientação anti-sentido [Ad.mda-7 (AS)] foi construído. Infecção de HeLa cl 2 (expressando mda-7), mas não HeLa cl 1 (vetor de pREP4, expressando não-mda-7) ou HeLa de origem, com Ad.mda-7 (AS) aumenta a taxa de crescimento e eficiência de clonagem em ágar (de aproximadamente 25% para aproximadamente 44%)(Fig. 2). Em contraste, o vetor de Ad5 mutante controle (H5dl434), não contendo o gene de mda-7, não afeta crescimento monocamada ou ágar de células HeLa de origem, HeLa cl 1 ou HeLa cl 2 (dados não mostrados).

Usando-se anticorpos peptídeos específicos mda-7 produzidos em coelhos e análises de imunoprecipitação, as células HeLa cl 2 (expressando mda-7) contêm elevados níveis da proteína de MDA-7 de aproxima- damente 24 kDa e uma proteína complexante de alto peso molecular (HMC) de aproximadamente 90 a 110 kDa (Fig. 3). Infecção com Ad. Mda-7 (AS), mas não o vírus expressando não-mda-7 controle H5dl434, resulta em uma diminuição temporal em ambas, a proteína de MDA-7 de ~24 kDa e a proteína HMC (21)(Fig. 3). Níveis reduzidos de ambas proteínas são vistos por 48 horas e permanecem suprimidos por um período de 96 horas após infecção com Ad.mda-7 (AS). Em contraste, níveis de actina permanecem inalterados seguindo infecção viral. Estas verificações indicam que inibição anti-sentido de expressão de proteína de MDA-7 em HeLa cl 2 (expressando mda-7) pode diretamente extinguir supressão de crescimento induzida por mda-7 e inibição em crescimento independente - ancoragem.

Para confirmar o efeito supressivo de mda-7 sobre crescimento de célula, células de câncer da próstata humano DU-145 foram engenheira-das para expressarem um gene de mda-7 induzível - DEX. Quando células DU-145 cl 6 ou cl 7 [contendo um gene de mda-7 (S) induzível - DEX], mas não células DU-145 de origem, são desenvolvidas por 24 a 96 horas na presença de DEX 10'6M, mRNA de mda-7 e proteína (incluindo a proteína de HMC) são induzidas (Fig. 4). Em contraste, DEX não altera expressão de gene (NeoR) de resistência à neomicina em células DU-145 cl 6 e cl 7 ou expressão GAPDH em qualquer das células testadas (Fig. 4). Indução de expressão de mda-7 em células DU-145 cl 6 e cl 7 através de crescimento em DEX 10'6M resulta em aproximadamente 50% de redução em número de células após 96 horas versus crescimento na ausência de DEX. Em contraste, nenhuma significante inibição de crescimento ocorre quando células DU-145 de origem ou DU-145 transformadas com vetor de pMAMneo são desenvolvidas por 96 horas em meio contendo DEX 10'6 M (dados não mostrados). Estes dados indicam que expressão ectópica de mda-7 pode diretamente alterar crescimento de célula em células de câncer da próstata. Discussão Experimental Hibridização de subtração identificou genes de mda com elevada expressão em células de melanoma humano terminalmente diferenciadas e de crescimento impedido (13, 14, 21). Determinação de função destes genes de mda será predominante na definição das bases moleculares de controle de crescimento e diferenciação terminal em células de melanoma humano e outros tipos de células. O gene de mda-7 (14, 21) é agora mostrado ser um gene supressor de crescimento ubíquo quando transiente ou estavelmente expresso em um amplo arranjo de linhas de célula de câncer humano. Esta verificação estende prévias observações indicando propriedades inibidoras de crescimento da proteína de MDA-7 em células de melanoma humano (21). Em contraste a seus efeitos sobre células de câncer, transfecção de mda-7 em células epiteliais mamárias humanas normais, fibroblastos de pele humana normais e fibroblastos de embrião de rato normais resulta em quantitativamente menos supressão de crescimento. Como um outro gene de mda, mda-6 (p21), expressão de mda-7 é também inversamente correlacionada com progressão de melanoma, com níveis elevados de ambos mda-6 (p21) e mda-7 presentes em melanócitos humanos normais em relação a células de melanoma humano metastáticas (14-16, 21). Uma vez que melanócitos normais ainda retêm capacidade proliferativa, embora em uma taxa reduzida em relação a células de melanoma, é possível que ambos mda-6 (p21) e mda-7 funcionem como reguladores negativos do fenótipo de progressão em células de linhagem melanócito/melanoma (14-16, 21). Além disso, a elevada expressão de ambos, mda-6 (p21) e mda-7 em células de melanoma humano de crescimento impedido irreversível e terminalmente diferenciadas, sugere que estes genes também podem ser importantes reguladores do fenótipo de diferenciação final (13-16, 21). O mecanismo através do qual mda-7 elicita seus efeitos supressivos de crescimento sobre células de câncer humano não é presentemente conhecido. A estrutura de mda-7 não provê discernimento em função potencial, uma vez que nenhum motivo de seqüência está presente que possa sugerir um modo potencial de ação. O efeito de mda-7 sobre crescimento de célula pode ser distinguido do gene p53 supressor de tumor extensivamente estudado (33, 34). Expressão transiente de p53 na linha de célula de carci-noma de mama humano T47D contendo p53 mutante resulta em supressão de crescimento, enquanto transfecção de um gene p53 do tipo selvagem na linha de célula de carcinoma de mama humano MCF-7 contendo p53 do tipo selvagem não induz inibição de crescimento (34). Em contraste, mda-7 induz similar supressão de crescimento em ambas células T47D e MCF-7 (Tabela 1). Inibição de crescimento por mda-7 também pode ser dissociada daquela observada com o gene retinoblastoma (pRB), o gene p107 associado-pRB e o gene supressor de tumor putativo p16ink4 (25, 35). Superexpressão de pRb e p107 inibe proliferação celular em tipos específicos de células e em uma maneira dependente de ciclo de célula (35-37). Transfecção de pRb ou p107 na linha de célula de glioblastoma humano T98G que contém um gene RB aparentemente normal (25) não induz supressão de crescimento (35, 37), enquanto expressão transiente de mda-7 (S) reduz formação de colônia de T98G (Tabela 1). No presente momento, o efeito inibidor de crescimento de mda-7 não pode ser distinguido da supressão de crescimento induzida pelo membro da família RB p130/pRb2, que também inibe proliferação em células T98G (25). O gene p16'nk4 induz impedimento de crescimento em células contendo um gene RB funcional (35,37), enquanto supressão de crescimento de mda-7 ocorre em células contendo genes RB normais, anormais ou não-funcionais. A transfecção de mda-7 na linha de célula de carcinoma da próstata humano DU-145 que contém um gene RB de mutação (38) e células de osteossarcoma humano Saos-2 que não expressam RB (ou p53 tipo selvagem) resulta em uma inibição em formação de colônia (Tabela 1). Similarmente, indução de expressão de mda-7 em clones DU-145 transformados com mda-7 induzível - DEX resulta em supressão de crescimento. Estas verificações indicam uma falta de dependência sobre um gene RB funcional para inibição de crescimento por mda-7. Tomados juntos estes estudos demonstram que o efeito inibidor de mda-7 ocorre através de um mecanismo que é distinto do modo de ação dos dois genes supressores de tumor mais extensamente estudados, p53 e pRb, e o gene supressor de tumor putativo p16'nk4. Vários genes foram identificados que mostram elevada expressão como uma função de impedimento de crescimento ou dano em DNA em células de mamíferos (39, 40). Três genes induzíveis de dano de DNA e impedimento de crescimento (gadd), gadd45, gadd153 e gadd34, o gene de resposta primária de diferenciação de mielóide relacionado mais de perto (MyD118) (41) e o gene de inibição de p53 tipo selvagem mdm-2 (42) são super-regulados em células através de tratamento com o agente danificante de DNA metano sulfonato de metila (MMA)(40). O gadd45 e gene específico-impedimento de crescimento (gas1) (43, 44) são induzidos através de manutenção de células em confluência, jejuando células de soro ou desenvolvendo células em baixo teor de soro (40, 43, 44). Em contraste, expressão de mRNA de mda-7 não é induzida em células de melanoma humano seguindo tratamento com metano sulfonato de metila (MMS) ou após manutenção de células em confluência (21). Além disso, somente um pequeno aumento em expressão de mRNA de mda-7 ocorre em células de melanoma humano H0-1 seguindo crescimento em meio livre de soro por 96 horas (21). A diferença em regulação de mda-7 versus o gadd, genes MyD118 e gas-1 indica que mda-7 pode representar uma nova classe de genes impedidores de crescimento.

Em resumo, um regulador de crescimento negativo, mda-7, é descrito o qual induz supressão de crescimento em células de câncer humano contendo ambos os genes p52 e RB normais ou mutados. Caracterização da estrutura genômica de mda-7 será importante em determinação se este gene normalmente funciona como um gene supressor de tumor e se alterações estão presentes neste gene em células de tumor versus células normais. Identificação da região promotora de mda-7 também permitirá uma análise do mecanismo através do qual este gene é diferencialmente expresso e induzível por IFN-(mais MEZ em específicos tipos de células. De potencial importância e garantindo estudos expandidos, é a verificação de que mda-7 é mais inibidor de crescimento na direção de células de câncer transformadas do que células normais. Neste contexto, mda-7 pode provar utilidade como parte de uma estratégia intervencional baseada em gene para terapia de câncer, em uma maneira análoga como o gene p53 do tipo selvagem está sendo correntemente testado para eficácia na terapia de específicas malignidades humanas.

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Segunda Série de Experimentos Gene Associado Com Diferenciação de Melanoma-7 (mda-7) em um Adenovírus Recombinante Inibe o Crescimento de Tumores Humanos Estabelecidos em Camundongo Escalvados.

Estudos anteriores documentam que expressão ectópica de mda-7 em células de tumor humano de diversas origens inibe crescimento, como documentado por uma diminuição em formação de colônias em cultura em monocamada (Jiang e outros, PNAS, 93: 9160-9165, 1996). Em contraste, mda-7 não altera significantemente o crescimento de células epiteliais humanas normais ou fibroblastos. Estas observações suportam a hipótese de que mda-7 é um gene supressor de crescimento de câncer ubíquo. A habilidade de mda-7 para inibir seletivamente crescimento de célula de câncer sugere que este gene pode prover benefícios terapêuticos no tratamento de cânceres humanos. Para explorar esta possibilidade, um adenovírus defeituoso-replicação expressando mda-7 foi gerado. Os protocolos foram similares àqueles usados para construir um adenovírus expressando mda-7 anti-sentido, Ad.mda-7 AS (Jiang e outros, PNAS, 93: 9160-9165, 1996). O Ad.mda-7 S defeituoso-replicação foi produzido em duas etapas. Primeiro, o gene de mda-7 foi clonado em uma orientação sentido em um vetor de expressão Ad modificado pAd.CMV. Este vírus contém, em ordem, o primeiro 355 pb a partir da extremidade esquerda do genoma de Ad, o promotor inicial imediato de citomegalovírus (CMV), DNA codificando uma seqüência de sinal poli A a partir do gene beta globina, e aproximadamente 3 kbp de seqüência de adenovírus estendendo-se a partir de dentro da região codificando E1B. Este arranjo permite alto nível de expressão da seqüência clonada pelo promotor de gene inicial imediato CMV, e apropriado processamento de RNA. O vírus recombinante foi criado in vivo em 293 células por recombinação homóloga entre vetor contendo mda-7 e JM17, que contém o todo do genoma Ad clonado em uma versão modificada de pBR322. JM17 dá origem a genomas Ad in vivo, mas eles são muito grandes para embalar. Esta restrição é aliviada por recombinação com o vetor para criar um genoma embalável, contendo o gene de escolha. O vírus recombinante é de replicação defeituosa em células humanas exceto 293, que ex- pressa adenovírus E1A e E1B. Seguindo transfecção dos dois plasmídios, vírus infeccioso foi recuperado, os genomas foram analisados para confirmar a estrutura recombinante, e então vírus foi purificado em placa, tudo através de procedimentos padrão.

Como observado com transfecção com mda-7, infecção de diversas linhas de célula de câncer humano, mas não linhas de células normais, com Ad.mda-7 S inibiu crescimento. Estes resultados demonstraram que este vírus retém propriedades observadas com o constructo de plasmí-dio mda-7. Em muitas células de câncer, incluindo carcinoma de mama (MCF-7 e T47D), glioblastoma (GBM-18 e T98G) e melanoma (HO-1 e C8161), infecção com Ad.mda-7 S resultou na indução de programada morte de célula (apoptose). Este efeito não foi elicitado em células normais mesmo após infecção com altas multiplicidades de infecção (100 pfu/célula) com Ad.mda-7 S. Em outros tipos de célula de câncer, supressão de crescimento (como indicado por uma supressão em formação de colônia em cultura de monocamada) foi aparente sem sinais de apoptose, como indicado por mudanças de morfologia nuclear, formação de escadas nucleossomais ou uma reação TUNEL positiva. Estes resultados indicam que o vírus Ad.mda-7 S pode inibir seletivamente o crescimento de células de câncer humano in vi-tro. Além disso, em tipos específicos de célula de câncer, supressão de crescimento correlaciona-se com indução de apoptose. Estas observações sugerem que inibição em crescimento de câncer induzida por mda-7 pode ocorrer através de múltiplas vias.

Modelos de xenoenxertos de tumor humano de camundogo es-calvado foram usados para determinar se Ad.mda-7 S pode inibir o crescimento de células de câncer humano in vivo. Camundongos nus atímicos, obtidos de Taconic Laboratories, foram injetados subcutaneamente com um milhão de células de carcinoma cervical humano (HeLa) em PBS misturado com matrigel (volume final 0,4 ml; razão de matrigel para PBS 1:1). Tumores foram deixados crescer até eles atingirem um volume médio de 100 a 200 mm3 (10 a 21 dias após inoculação). Camundongos foram então rando-mizados e divididos em dois grupos: Grupo 1: Ad de replicação defeituosa faltando o gene de mda-7; vírus nulo (nulo); e Grupo 2: Ad.mda-7 S. O tra- tamento consistiu em injeções intratumorais do nulo ou Ad.mda-7 S (1 ΟΟμΙ em 4 sítios/injeção) três vezes por semana por 4 semanas. Tumores foram medidos duas a três vezes semanalmente com um calibre. Volumes de tumor foram calculados usando-se a fórmula: pi/6 x diâmetro maior x (diâmetro menor)2. Após 4 semanas de terapia, animais foram seguidos por uma semana adicional e sacrificados. Volume final de tumor dividido por volume inicial de tumor igual a razão de volume de tumor que é definida como uma medida de progressão de câncer.

Xenoenxertos HeLa bem estabelecidos, tratados com Ad.mda-7 S, foram inibidos em crescimento sobre o curso do estudo, enquanto tumores tratados com o vírus nulo continuaram a crescer progressivamente (Figuras 5 e 6). O efeito inibidor de mda-7 foi significante com um valor p < 0,05. Este estudo foi repetido e resultados similares foram obtidos. Estes dados sugerem que expressão ectópica de mda-7 pode prover benefício terapêutico para o tratamento de câncer humano. Experimentos estão agora em progresso usando-se tumores de câncer de mama humano estabelecidos, MCF-7 e T47D, em camundongo escalvado.

Claims (3)

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz para reverter o fenótipo canceroso de uma célula de câncer de um ácido nucléico compreendendo gene associado com diferenciação de melanoma (mda-7) e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o ácido nucléico compreende um vetor selecionado dentre vetor de adenovírus, vetor de vírus adeno-associado, vetor de vírus Epstein-Barr, vetor de vírus herpes, ou vetor de vírus da vacínia.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vetor de adenovírus é um vetor de adenovírus de replicação defeituosa expressando mda-7.

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a célula de câncer é uma célula de mama, cervical, de cólon, de próstata, nasofaringeal, de pulmão, de glioblastoma multiforme, de linfoma, de leucemia, de tecido conjuntivo ou do sistema nervoso.