JP2000516199A - ウマの予防用ポリヌクレオチドワクチン製剤 - Google Patents

ウマの予防用ポリヌクレオチドワクチン製剤

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Abstract

(57)【要約】 四足動物、特にウマの病理を防ぐためのワクチン製剤。宿主細胞でインビボで発現可能な形で四足動物の病原結合価の遺伝子に結合したプラスミドからなる少なくとも３つのポリヌクレオチドワクチンの結合価を含む。この結合価はウマ鼻腔肺炎ウィルスＥＨＶ、馬インフルエンザウィルスＥＩＶおよび破傷風ウィルからなる群の中から選ばれ、プラスミドは各結合価に対して、ウマ鼻腔肺炎ウィルスのgBおよびgD、馬インフルエンザウィルスのＨＡ、ＮＰおよびＮから成る群の中から選択される一つまたは複数の遺伝子および破傷風トキシンのサブユニットＣの全部または一部をコードする遺伝子からから成る。

Description

【発明の詳細な説明】 ウマの予防用ポリヌクレオチドワクチン製剤 本発明は四足動物(equides)、特にウマにワクチン接種するためのワクチン製 剤に関するものであり、また、そのワクチン接種方法に関するものである。 ウマの病理はかなり広範囲に存在している。ウマは、特にアメリカ大陸では、 よく知られた呼吸の病気、例えば鼻腔肺炎(rhinopneumonitis)およびインフルエ ンザ以外に種種の悩脊髄炎に罹る。さらに、ウマはその他のいろいろなな病理に 罹り、特に、強縮(tetanos)、ライム(Lyme)病および馬動脈炎が挙げられる。狂 犬病ウィルスに曝されていることも忘れてはならない。 かなり遠い距離を陸路や飛行機で輸送できるようになって、ウマが多様な病原 微生物に曝される状況および感染の危険度は増加する傾向にある。 動物交配業者にとっては、コストの高い動物、特に種馬や競馬馬はできるだけ 感染の危険を避け、これらの動物が利用できなくなる期間を減らすことが経済的 に重要である。ウマワクチンは既に多数存在するが、その効能は千差万別である 。 各種の馬ヘルペスウィルス(ＥＨＶ)株を用いて作った馬の鼻腔肺炎用不活化サ ブユニット・ワクチンが開発されているが、保護が不完全であり、保護期間が短 かく、使用するアジュバントに関連して安全性に問題がある。 馬のインフルエンザも重大な問題である。その予防にワクチン接種が行われて いる。これに使用されるワクチンは不活化ワクチンすなわちサブユニットワクチ ンで、一定の効果はあるが、問題もある。すなわち、保護が完全でないことが多 く、保護期間が比較的短く、その結果、鼻腔肺炎の場合には再種痘が必要になる 。また、安全性に問題がある場合もある。 抗破傷風トキソイド(anatoxine antitetanique)をベースにしたワクチンはも 開発されており、明らかに効果的である。 悩脊髄炎(encephalite)、東洋悩脊髄炎、西洋脳脊髄炎およびベネズエラ脳脊 髄炎を防ぐためのワクチンも存在する。薬効は低い。 経済的理由および合理的な馬のワクチン接種管理の観点から、これらの感染症 の複数を防ぐための多価ワクチン製剤が既に提案されている。 本出願人は、弱毒ワクチンまたは生ワクチン、必要に応じてこれらのワクチン の混合ものを用いて多価ワクチン製剤を開発してきたが、結合価(valence)の適 合性(compatibilite)および安定度に問題があった。すなわち、使用する異なる 抗原の面および製剤自身の面で、特に弱毒ワクチンと生ワクチンとを同時に組み 合わせたときには、異なる結合価間の適合性を確実にする必要がある。また、こ の種の混合ワクチンには安定性に問題があり、特に、アジュバントを含む場合に は接種法に問題がある。また、これらのワクチンは一般にかなり高価である。 さらに、これらの製剤は主要結合価、すなわち、馬インフルエンザ、鼻腔肺炎 、特にEHV-1およびEHV-4、破傷風の３つの結合価をせることができなかった。例 えば、インフルエンザ結合価と脳脊髄炎結合価との組合せまたは鼻腔肺炎結合価 と脳脊髄炎結合価との組合せが知れている。 国際特許第WO-A-90 11092、WO-A-93 19 183、WO-A-94 21 797およびWO-A-95 2 0 660には最近開発されたポリヌクレオチドワクチンの技術を使用することが提 案されている。これらのワクチンはプラスミドに挿入された抗原の宿主細胞で発 現できるプラスミドを利用している。全ての投与径路(腹膜内、静脈内、筋内、 経皮、皮内、粘膜、その他）が提案されている)。また、各種のワクチン接種法 を用いることができる。例えば、金の粒子に堆積させたＤＮＡを動物の皮ふ内に 深く入るように噴射する方法(Tang達(Nature 356，152-154，1992))、皮膚、筋 肉、脂肪質組織および乳房組織にトランスフェクション可能な液体ジェットでワ クチン接種する方法(Furth達(Analytical Biochemistry，205，365-368，1992) がある。 このポリヌクレオチド・ワクチンは裸のＤＮＡのほかリポソームまたはカチオ ン性リピドの形のＤＮＡが使用できる。 ＨＡまたはＮＴ遺伝子を統合したポリヌクレオチド・ベクターはハツカネズミ 、白イタチおよびニワト鼻腔インフルエンザウィルスで試用されたが、ウマに関 するデータはない。 破傷風に関しては、Ｃフラグメントを用いたテタヌス(tetanique)トキシンの 非毒 性Ｃ末端領域を発現するプラスミドでハツカネズミを免疫化して、ハツカネズミ の血漿保護抗体を誘発することが最近報告されている。しかし、寿命が短いこれ らの動物で得られた結果を他の哺乳類、特に大きな哺乳類に直接置き換えること はできない。 従って、四足動物、特にウマを感染性の病理から保護する方法の改善は常に必 要である。 本発明の目的は、一定数の病理作因を防ぐために四足動物、特にウマに予防注 射可能な多価ワクチン製剤を提供することにある。 本発明の別の目的は、互いに異なる結合価間の結合価の適合性と安定性に必要 な基準を満たした状態で、互いに異なる結合価を組み合せた上記ワクチン製剤を 提供することである。 本発明の別の目的は、同じ一つの賦形剤中に互いに異なる結合価を組み合せる 上記ワクチン製剤を提供することにある。 本発明の別の目的は、実行するのが簡単なおよび安いこの種のワクチン製剤を 提供することである。 本発明の別の目的は、多価保護を含む保護が得られ、安全性が高く、効果が長 時持続し、効能のレベルが高いウマの予防注射製剤および方法を提供することで ある。 本発明は、宿主細胞でインビボで発現可能な形で四足動物の病原結合価の遺伝 子に結合したプラスミドからなる少なくとも３つのポリヌクレオチドワクチンの 結合価を含む、四足動物、特にウマの病理を防ぐためのワクチン製剤であって、 結合価がウマ鼻腔肺炎ウィルスＥＨＶ、馬インフルエンザウィルスＥＩＶおよび 破傷風(Cl.tetani)ウィルからなる群の中から選ばれ、プラスミドが、各結合価 に対して、ウマ鼻腔肺炎ウィルスのgBおよびgD、馬インフルエンザウィルスのＨ Ａ、ＮＰおよびＮから成る群の中から選択される一つまたは複数の遺伝子および 破傷風トキシンのサブユニットＣの全部または一部をコードする遺伝子からから 成るワクチン製剤を提供する。 本発明で「抗原結合価(valence)」とは、問題の病原体ウイルスに対する保護を 提供する少なくとも1つの抗原を意味し、この抗原結合価は問題の病原体の1 つまたは複数の株の天然または修飾された遺伝子をサブ抗原結合価として含むこ とができる。 病原体の遺伝子とは、完全な遺伝子だけでなく、保護反応を誘発する能力を保 持する断片も含めた変化した塩基配列を意味する。遺伝子の概念には実施例に詳 細に記載したものと同じ塩基配列と均等なもの、すなわち、異なる配列で同じ蛋 白質をコードする配列が包まれる。さらに、交雑保護または株または株群に特異 的な保護を提供する問題の病原体の他の株の塩基配列も含まれる。遺伝子の概念 にはさらに、宿主動物による生体内の発現を容易にするために修飾された同じ蛋 白質をコードする塩基配列も含まれる。 特に好ましくは、本発明の馬鼻腔肺炎結合価には、EHV-1株の少なくとも一つ の抗原と、EHV-4株からの少なくとも一つの抗原と、同じ種類の抗原を含む。 上記ポリヌクレオチド結合価の治療に有効な量が、好ましくは筋内投与で動物 に投与可能な適切な賦形剤中に含まれるか、入れられる。賦形剤は油性成分を含 まない水溶賦形剤であるのが好ましい。 馬の鼻腔肺炎結合価ではＨＨＶ株、特に、株１から株４のgBおよびgD遺伝子を 組み合わせるのが好ましい。 馬インフルエンザ結合価ではヘムアグルチニンＨＡをコードする遺伝子を使用 するか、ＨＡおよびＮＰをコードする遺伝子と組み合わせるのが好ましい。好ま しくは、インフルエンザウィルスＨＡ配列、特に、特にこの分野で見られる異な る株のＨＡ配列を同じワクチン内で適当に組合せるのが好ましい。ＮＰは交差防 御するので、一つのウィルス株からの配列を入れることができる。 破傷風結合価ではＣサブユニット、必要に応じて突然変異または欠失で変性さ せたものが好ましい。 一つの同じ結合価または一つの結合価の同じ株の複数の抗原をコードする遺伝 子の組み合わせは、単一抗原を発現するプラスミドを混ぜるか、一つの同じプラ スミドにいくつかの遺伝子を入れて行うことができる。 本発明のワクチンの互いに異なる結合価を組み合わせは、各結合価の一つまた は複数の抗原を発現するポリヌクレオチドプラスミドの混合で行うことができる が、プラスミドの同じベクター型で複数の結合価の複数の抗原を発現させること もできる。 本発明の変形例では、ワクチン製剤が東洋脳脊髄炎ＥＥＶ、西洋脳脊髄炎ＷＥ Ｖ、ベネズエラ脳脊髄炎ウイルス(ＶＥＶ)を含み、好ましくはこれら全てを含む 。これらの結合価の中には、ライム病結合価、ウマ動脈炎ウィルスおよび馬狂犬 病ウィルスも挙げることができる。 悩脊髄炎の遺伝子の中では、ＣおよびE2抗原遺伝子を用い、好ましくはE2を単 独で用いるか、ＣとE2を組み合わせて用いる。 Lyme病の結合価はOspA、OspBおよびp100遺伝子の中から選択し、OspAが好まし い。 馬動脈炎ではＥ、Ｍ、Ｎ遺伝子を単独または組み合わせて用いる。 馬狂犬病ではＧ遺伝子が挙げられる。 本発明のワクチン製剤は0.1から1ml、特に1から5mlの投与量で存在することが できる。 投与量は一般にプラスミド型1個当り10ngから1mg、好ましくは100ngから500μ ｇ、さらに好ましくは0.1μｇから50μｇである。 裸のプラスミドを予防接種媒体、一般に生理食塩水(0.9% NaCl)、超高純水、 ＴＥ緩衝液、その他に単に入れたものを使用するのが好ましい。当然、従来法の 全ての型のポリヌクレオチドワクチンと同じ形で利用することができる。 各プラスミドは宿主細胞に挿入された遺伝子を確実に発現することができるプ ロモータである。これは一般に強い真核生物プロモータ、特にヒトまたはネズミ に由来のサイトメガロウイルスの初期プロモータCMV-IEあるいは由来の異なるCM V-IEプロモータ、例えばラット、ブタまたはモルモット由来のプロモータである 。 一般的には、プロモータはウイルス由来または細胞由来のプロモータにするこ とができる。CMV-IE以外のウイルスプロモータとしてはSV40ウイルスの初期また は後期プロモータまたはラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモータを挙げることがで きる。遺伝子は得られるウイルスのプロモータ、例えば遺伝子固有のプロモータ にすることもできる。 細胞プロモータとしては、細胞骨格遺伝子のプロモータ、例えばデスミンプロ モータ(Bolmont達,Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology,1990 ,22,117-122;and Zhenlin達,Gene,1989，78,243-254)またはアクチンプロモータ を挙げることができる。 複数の遺伝子が同じブラスミド内に存在する場合は、これらは同じ転写ユニッ トまたは異なる2つのユニット内に存在することができる。 本発明の他の対象は、特定の病原体、特に東洋脳脊髄炎ＥＥＶ、西洋脳脊髄炎 ＷＥＶ、ベネズエラ脳脊髄炎ウイルス、ライム病結合価、ウマ動脈炎ウィルスお よびその他の上記ウィルスの遺伝子をコードする一つまたは複数のプラスミドか ら成る単価ワクチン製剤にあり、その特徴は遺伝子の選択、組合せ、プラスミド 組成、投与量、投与回数などに関しては上記特性を有することにある。 本発明のさらに他の対象は、上記の単価、多価のワクチン製剤の有効量の投与 を含む四足動物、特に馬用の感染症の、予防接種方法にある。この予防接種方法 はワクチン製剤の1回または数回の投与を含み、ポリヌクレオチドワクチンの公 知の投与経路では投与できる。筋肉経路が好ましい。 また、液体ジェットによって皮内径路で予防注射することもできる。特に、5 から6つの穴またはノズルを有する注射器、例えばPigjet注射器(Endoscoptic，L aons、フランス)を用いて注射できる。 この注射器の投与量は0.1から0.9ml、特に0.2から0.6ml、特に0.4から0.5mlが 好ましい。これらの容積は一回以上、好ましくは２回にわけて投与することがで きる。 上記単価ワクチンは本発明の多価ワクチンを調製するのに利用できる。 単価ワクチン製剤は他の病理を防ぐための他の型(生ワクチン、不活化全ワク チン、組換え型またはサブユニット)と組み合わせるか、ワクチンの追加抗原刺 激(ブースター)として使うこともできる。 本発明のさらに他の対象は、特に全生ワクチン、弱毒化全ワクチン、サブユニ ットワクチン、組換えワクチンより成る群の中から選択された従来型の一般的な 初期ワクチン(一価または多価)であって、交雑保護を提供するプラスミドまたは 抗原によってコードされた抗原を有する(すなわち含むまたは発現可能な)初期ワ クチンを用いて最初の予防接種で動物に予防接種するためのウマ用ワクチンの製 造での本発明のプラスミドの使用にある。 このポリヌクレオチドワクチンが強力なブースター(免疫追加)効果を有し、免 疫応答を増幅させ、持続性のある免疫が得られる点は注目すべきである。 一般に、初期予防接種用ワクチンは種々の獣医学用ワクチンメーカーから入手 可能な市販のワクチンの中から選択することができる。 本発明方法の好ましい実施例では、有効量の一般的なワクチン、特に不活性化 ワクチン、生ワクチン、弱毒または組換えワクチン型またはサブユニットワクチ ンを動物に投与して第１の予防接種を提供した後、好ましくは2から6週間後に本 発明の多価または一価のワクチンを投与する。 本発明のさらに他の対象は、本発明のワクチン製剤と、上記の初期ワクチン接 種用ワクチンとを組み合せたワクチン接種キットにある。本発明はさらに、上記 の初期ワクチン接種用ワクチンの追加抗原刺激(ブスター)として使用することが 記載された指示書が添付さワクチン製剤にある。 本発明はさらに、上記ワクチン製剤の製造、その結合価の製造およびその混合 液の調製方法に関するものである。 以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施例をさらに詳細に説明する。図のリスト 図１ プスミドPVR1012 図２ プラスミドpAB042 図３ プラスミドpAB031 図４ プラスミドpABOl3 図５ プラスミドpAB032 図６ プラスミドpAB043 図７ プラスミドpAB033 図８ Fontainbleau株の馬インフルエンザHA遺伝子の配列 図９ プラスミドpAB099 図10 プラスミドpAB085 図11 プラスミドpAB084 図12 プラスミドpAB070 図13 プラスミドpAB017 図14 プラスミドpAB094 図15 プラスミドpAB093 図16 プラスミドpAB096 図17 プスミドpAB095 図18 プラスミドpAB098 図19 プラスミドpAB097 図20 プスミドpAB04l 配列番号リスト 配列番号.1:オリゴヌクレオチドABO13 配列番号.2:オリゴヌクレオチドAB014 配列番号.3:オリゴヌクレオチドAB071 配列番号.4:オリゴヌクレオチドAB074 配列番号.5:オリゴヌクレオチドAB030 配列番号.6:オリゴヌクレオチドABO31 配列番号.7:オリゴヌクレオチドAB075 配列番号.8:オリゴヌクレオチドAB076 配列番号.9:オリゴヌクレオチドAB015 配列番号.10:オリゴヌクレオチド016 配列番号.11:オリゴヌクレオチド077 配列番号.12:オリゴヌクレオチドAB078 配列番号.13:オリゴヌクレオチドAB186 配列番号.14:オリゴヌクレオチドAB187 配列番号.15:Fontainebleau馬インフルエンザ株のＨＡ遺伝子配列 配列番号.16:オリゴヌクレオチドAB156 配列番号.17:オリゴヌクレオチドAB159 配列番号.18:オリゴヌクレオチドAB157 配列番号.19:オリゴヌクレオチドAB128 配列番号.20:オリゴヌクレオチドAB129 配列番号.21:オリゴヌクレオチドAB038 配列番号.22:オリゴヌクレオチドAB039 配列番号.23:オリゴヌクレオチドAB176 配列番号.24:オリゴヌクレオチドAB177 配列番号.25:オリゴヌクレオチドAB174 配列番号.26:オリゴヌクレオチドAB175 配列番号.27:オリゴヌクレオチドAB180 配列番号.28:オリゴヌクレオチドAB181 配列番号.29:オリゴヌクレオチドAB178 配列番号.30:オリゴヌクレオチドAB179 配列番号.31:オリゴヌクレオチドAB184 配列番号.32:オリゴヌクレオチドAB185 配列番号.33:オリゴヌクレオチドAB182 配列番号.24:オリゴヌクレオチドAB183 配列番号.35:オリゴヌクレオチドABOll 配列番号.36:オリゴヌクレオチドAB012実施例１ ウィルスの培養 ウイルスは適当な細胞系で細胞変性効果が得られるまで培養する。各ウイルス に使用される細胞系は当業者に周知なものである。要約すると、用いるウイルス に対して敏感な細胞をイーグル(Eagle's)の最小必須培地(ＭＥＭ培地)または他 の適当な媒体で培養されたものに感染効率1でウイルス株を接種する。 次いで、感染した細胞を細胞変性効果が完全に現れるのに要する時間だけ37℃ でインキュベートする(平均36時間)。実施例２ バクテリアの培養 破傷風バクテリアは適当な培地で、遺伝形質物を抽出するのに充分なバクテリ アのバイオマスが得られる当業者に周知の条件で培養する。 本抽出はSambrook J.達(Molecular Cloning:A Laboratory Manual．2nd Editi on．Cold Spring Harbor Laboratory．Cold Spring Harbor．New York．1989)が 記載の慣用的な技術で実行される。 Borrelia burgdorfariの株を適当な培地で、当業者に周知の条件で培養する。 これらの条件および培地はA．Barbour(J．Biol．Med．1984．57．71-75)が記載 している。細菌ＤＮＡはW.シンプソン達(Infect．Immun．1990．58．847-853)が 記載の条件で抽出した。J．Sambrook達(Molacular Cloning：A Laboratory Manu al．2nd Edition．Cold Spring Harbor Laboratory．Cold Spring Harbor．New York．1989)が開示の慣用技術を用いることもできる。実施例３ ウィルスのゲノムＤＮＡの抽出 培養後、上澄みと溶解した細胞とを回収し、ウイルス懸濁液全体を＋４℃で10 分間、1000gで遠心分離して細胞片を除去する。次いで、ウイルス粒子を回収し 、＋４℃で1時間、400,000gで超遠心分離する。このペレットを最小量のバッフ ァー(10mM Tris、1mM EDTA）に取り、硫酸ドデシルナトリウム(ＳＤＳ)(最終濃 度0.5％)の存在下、プロテイナーゼＫ(最終濃度100μｇ/ml)で37℃で2時間処理 する。次いで、ウイルスＤＮＡをフェノール／クロロホルム混合液を用いて抽出 し、これを2容量の無水エタノールを用いて沈殿させる。・20℃で一晩放置した後 、ＤＮＡを＋４℃で15分間、10,000gで遠心分離する。ＤＮＡペレットを乾燥さ せ、次いで最小量の滅菌した超純水に取る。制限酵素で処理できる状態にある。実施例４ ウイルスゲノムＲＮＡの単離 ＲＮＡウイルスを当業者に周知な方法で精製した。次いで、各ウイルスのゲノ ムウイルスＲＮＡをP.Chromczynski and N.Sacchi(Anal.Biochem.,1987.162,156 -159)が開示の「チオシアン酸グアニジウム／フェノール・クロロホルム」抽出方 法を用いて単離した。実施例５ 分子生物学的方法 全てのプラスミドの作製はサムブルック(Sambrook)達のMolecularCloning:ALa boratoryManual.第２版、ColdSpringHarborLaboratory．ColdSpringF]arborNewY ork.1989)に記載の分子生物学の標準的手法で行った。本発明で使用した全ての 制限酵素断片はジェネクリーン(Geneclean)キット(BIO10１Inc．LaJolla，ＣＡ ）を用いて単離した。実施例６ RT-PCR 技術 特異的なオリゴヌクレオチド（増幅断片のクロ−ニングを容易にするために５ '末端に制限部位を有する）を合成し、増幅すべき遺伝子のコード領域（特定の 実施例参照)を完全にカバーした。逆転写(ＲＴ)反応およびポリメラーゼ連鎖反 応(ＰＣＲ)を標準的手法(Sambrook J達、1989)に従って行った。各ＲＴ・ＰＣＲ 反応は一対の特定の増幅器を用いて行い、鋳型として抽出したゲノムＲＮＡを用 いた。増幅した相補ＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール (25:24:1)で抽出し、次いで制限酵素で処理した。実施例７ プラスミドpVRlOl2 プラスミドpVR1012(図1)はサンディエゴ、カナダ、米国のバイカル社(Vical I nc.,)で得られた。この作製法はJ.Hartikka達.(Human Gene Therapy,1996,7,120 5−1217)が開示している。実施例８ プラスミドpAB042(EHA-1 gD 遺伝子)の作製 ＰＣＲ反応を馬ヘルペスウィルスタイプ1(EHV-1)(ケンタッキーＤ株)(P．Guo 達J．Virol、1990、64、2399-2406)のゲノムＤＮＡと、下記オリゴヌクレオチド とを用いて行い、糖蛋白gB(EHV-1 gB)をコードする遺伝子をPstI-NotI断片の形 で単離した： AB013(32mer)(配列番号.1) 5'AAAACTGCAGCCGTCATGTCCTCTGGTTGCCG 3' AB014(39mer)(配列番号.2) 5'ATAAGAAGCGGCCGCTAAACATGTTTACCATTTTTTC 3' 精製の後、2981bpのPCR生産物は、PstIおよびNotIで消化し、2959bpのPstI/No tI断片を単離させた。この断片を予めPstIとBglIIで処理したベクターpVR1012( 実施例7)に導入してプラスミドpAB042(7841bp)(図2)を得た。実施例９ プラスミドpAB031(EHA-4 gD 遺伝子)の作製 ＰＣＲ反応を馬ヘルペスウィルス タイプ4(EHV-4)(株1942)(M．Riggio達、J． Virol、1989、63、1123−1133)のゲノムＤＮＡと、下記オリゴヌクレオチドとを 用いて行い、糖蛋白gB(EHV-4gB)をコードする遺伝子をPstI-NotI断片の形で単離 した： AB071(38mer)(配列番号.3) 5'AAAACTGCAGACATGTCCACTTGTTGCCGTGCTATTTG 3' AB074(36mer)(配列番号.4) 5'CTAGTCTAGATTAAACCATTTTTTCGCTTTCCATGG 3' 精製後、ＰＣＲ生成物をPstIとXbaIで処理して2931bpのPstI/XbaI断片を単離 した。この断片を予めPstIとXbaIで処理したベクターpVR1012(実施例７)に導入 してプラスミドpAB042(7841bp)(図3)を得た。実施例10 プラスミドpAB013(EHV-1 gD 遺伝子)の作製 タイプ1の馬ヘルペスウィルス(EHV−1)(ケンタッキーＤ株)(J．C．Audonnet達 J．Gen．Virol．1990．71．2969-2978)のゲノムＤＮＡと、下記オリゴヌクレオ チドとを用いてＰＣＲ反応を行い、糖蛋白gB(EHV-1 gD)をコードする遺伝子をPs tI/BamHI断片の形で単離した： AB030(32mer)(配列番号.5) 5'AAAACTGCAGCATGTCTACCTTCAAGCTTATG 3' AB031(37mer)(配列番号.6) 5'CGCGGATCCTTACGGAAGCTGGGTATATTTAACATCC 3' 精製後、1228bpのＰＣＲ生成物をPstIとBamHIで処理して1211bpのPstI/BamHI 断片を単離した。この断片を予めPstIとBamHIで処理したベクターpVR1012(実施 例7)に導入してプラスミドpAB0l3(6070bp)(図4)を得た。実施例11 プラスミドpABO32(EHV-4 gD 遺伝子)の作製 タイプ４の馬ヘルペスウィルス(EHV-4)(A．Cullinane達J．Gen．Virol．1993 ．74．1959-1964)のゲノムＤＮＡと、下記オリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲ 反応を行って、EHV-4(EHV-4 gD)のgD糖蛋白をPstI/BamHI断片の形でコードする 遺伝子を単離した： AB075(33mer)(配列番号.7) 5'AAAACTGCAGATATGTCTACCTTCAAGCCTATG 3' AB076(33mer)(配列番号.8) 5'CGCGGATCCTTACGGAAGCTGAGTATATTTGAC 3' 精製後、1230bpのＰＣＲ生成物をPstIとBamHIで処理して1212bpのPstI/BamHI 断片を単離した。この断片を予めPstIとBamHIで処理したベクターpVR1012(実施 例7)に導入してプラスミドpAB032(6071bp)(図5)を得た。実施例12 プラスミドpAB043(プラハ株の馬インフルエンザのＨＡ遺伝子)の作成 実施例４に記載の方法で、実施例6(馬のインフルエンザウィルス(ＥＩＶ)(H7N ７プラハ株)(J.マコーリー、Genbank配列番号=X62552アクセス可能)のＤＮＡと 、下記オリゴヌクレオチドとを用いて、ＲＴ-ＰＣＲ反応を行って、馬インフル エンザウィルスのＨＡ糖蛋白をSalI/BamHI断片の形でコードする遺伝子を単離し た： AB015(36mer)(配列番号.9) 5'ACGCGTCGACATGAACACTCAAATTCTAATATTAGC 3' AB016(35mer)(配列番号.10) 5'CGCGGATCCCTTATATACAAATAGTGCACCGCATG 3' 精製後、1733bpのＰＣＲ生成物をSalIとびBamHIで処理して1720bpのSalI/BamH I断片を単離した。この断片を予めSalI/BamHIで処理したベクターpVR1012(実施 例7)に導入してプラスミドpAB043(6588bp)(図6)を得た。実施例13 プラスミドpAB033(サフォーク株の馬インフルエンザの ＨＡ遺伝子)の製作 実施例６のＲＴ・ＰＣＲ反応を、実施例４の方法に従って調製した馬のインフ ルエンザウィルス(ＥＩＶ)(サフォーク株)(M.ビンズ、Genbank配列番号=X68437 でアクセス可能)のゲノムＲＮＡと、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、 馬のインフルエンザウィルスのＨＡ糖蛋白をSalI/BamHI断片の形でコードする遺 伝子を単離した： AB077(33mer)(配列番号.11) 5'ACGCGTCGACGCATGAAGACAACCATTATTTTG 3' AB078(34mer)(配列番号.12) 5'CGCGGATCCTCAAATGCAAATGTTGCATCTGATG 3' 精製後、1729bp ＲＴ-ＰＣＲ生産物をSalIおよびBamHIで処理して1717bpのSal I/BamHI断片を単離した。この断片を予めSalIおよびBamHIで処理したベクターpV R1012(実施例7)に導入してプラスミドpAB033(6584bp)(図7)を得た。実施例14 プラスミドpAB099(Fontainebleau株の 馬インフルエンザのＨＡ遺伝子)の製作 実施例4.によって調製された馬のインフルエンザウィルス(ＥＩＶ)(Fontaineb lea u株）のＤＮＡと、下記オリゴヌクレオーチドとを使用していた実施例６の実施 例６のＲＴ・ＰＣＲ反応を実行して、馬インフルエンザウィルス(Fontainebleau 株)のＨＡ糖蛋白をコードしている遺伝子をNotI/NotI断片の形で単離した(図８ および配列番号.15): AB186(32mer)(配列番号.13) 5'TTTGCGGCCGCATGAAGACAACCATTATTTTG 3' AB187(35mer)(配列番号.14) 5'TTTGCGGCCGCTTACTCAAATGCAAATGTTGCATC 3' 精製後、1724bpのＲＴ-ＰＣＲ生産物をNotIで処理して1710bpのNotI/NotI断片 を単離した。この断片を予めNotIで処理したベクターpVR1012(実施例7)に導入し てプラスミドpAB099(6625bp)(図9)を得た。こらはプロモータに対して正しい向 きでＨＡ遺伝子を有するFontainebleau株の馬インフルエンザ株を含む。実施例15 プラスミドpAB085(プラハ株の 馬インフルエンザのＮＰ遺伝子)の製作 実施例４の技術によって調製した馬インフルエンザウィルス(ＥＩＶ)(H7N7プ ラハ株)(O.ゴーマン達、J．Virol、1991、65、3704-3714)のＤＮＡと、以下のオ リゴヌクレオチドを使用して、実施例６のＲＴ・ＰＣＲ反応を実行して、馬のイ ンフルエンザウィルスのＮＰ核蛋白質をコードする遺伝子をSalI/BamHI断片の形 で単離した： AB156(32mer)(配列番号.16) 5'CCGGTCGACATGGCGTCTCAAGGCACCAAACG 3' AB159(34mer)(配列番号.17) 5'CGCGGATCCTTAATTGTCAAACTCTTCTGCATTG 3' 精製後、1515bpのＲＴ-ＰＣＲ生産物をSalIおよびBamHIで処理して1503bpのSa lI/BamHI断片を単離した。この断片を予めSalIおよびBamHIで処理したベクターp VR1012(実施例7)に導入してプラスミドブラスミドpAB085(6371bp )(図10)を得た。実施例16 プラスミドpAB084(Jillin株の馬インフルエンザのＮＰ遺伝子)の製作 実施例４の技術によって調製した馬のインフルエンザウィルス(ＥＩＶ)(H3N8 Jillin株)(O.ゴーマン達J．Virol、1991、65、3704-3714)のＤＮＡと、、以下 のオリゴヌクレオチドを使用して、実施例６のＲＴ・ＰＣＲ反応を実行して、馬 のインフルエンザウィルスのＮＰ核蛋白質をコードする遺伝子をSalI/BamHI断片 の形で単離した： AB156(32mer)(配列番号。16) 5'CCGGTCGACATGGCGTCTCAAGGCACCAAACG 3' AB157(34mer)(配列番号.18) 5'CGCGGATCCTTAATTGTCATATTCCTCTGCATTG 3' 精製後、1515bpのＲＴ-ＰＣＲ生産物をSalIおよびBamHIで処理して1503bpのSa lI/BamHI断片を単離した。この断片を予めSalIおよびBamHIで処理したベクターp VR1012(実施例7)に導入してプラスミドプラスミドpAB084(6371bp)(図11))を得た 。実施例17 プラスミドpABO7O(テタヌストキシンＣサブユニット遺伝子)の製作 実施例２によって調製したClostridium tetani(CN3911株)(N.フェアウェザー 達J．Bact,1986,165,21−27)のゲノムと、以下のオリゴヌクレオチドtoを使用し て、実施例６のＲＴ・ＰＣＲ反応を実行して、Clostridi tetaniのトキシンのサ ブユニットＣをコードする配列をPstI/BamHI断片の形で単離した： AB128(34mer)(配列番号.19) 5'AAACTGCAGATGAAAAATCTGGATTGTTGGGTTG 3' AB129(30mer)(配列番号.20) 5'TTTGGATCCTTAATCATTTGTCCATCCTTC 3' 精製後、1377bpのＲＴ-ＰＣＲ生産物をPstIおよびBamHIで処理して1361b pのPstI／BamHI断片を単離した。この断片を予めPstIおよびBamHで処理したベク ターpVR1012(実施例7)に導入してプラスミドプラスミドpAB070(6219bp)(図12)を 得た。実施例18 プラスミドpAB017(Borrelia burgdorferiのospA 遺伝子)の製作 実施例２によって調製したBorrelia burgdorferi(B31.株)(S．Bergstrom達、M ol、Microbiol、1989、3、479−486)のゲノムＤＮＡと、以下のオリゴヌクレオ チドとを使用して、実施例６のＲＴ・ＰＣＲ反応を実行して、OspA膜蛋白質をコ ードしている遺伝子をSalI/BamHI断片の形で単離した： AB038(37mer)(配列番号.21) 5'ACGCGTCGACTATGAAAAAATATTTATTGGGAATAGG 3' AB039(34mer)(配列番号.22) 5'CGCGGATCCCTTATTTTAAAGCGTTTTTAATTTC 3' 精製後、842bpのＲＴ-ＰＣＲ生産物をSalIおよびBamHIで処理して829bpのSalI /BamHI断片を単離した。この断片を予めSalIおよびBamHIで処理したベクターpVR 1012(実施例7)に導入してプラスミドプラスミドpAB017(5698bp)(図13)を得た。実施例19 プラスミドpAB094(東洋脳脊髄炎ウイルスのE2遺伝子)の製作 実施例４によって調製した東洋脳脊髄炎ウイルス(ＥＥＶ)(北アメリカ株82V21 37)(S.Weaver達、Virology、1993、197、375-390)のゲノムＤＮＡと、以下のオ リゴヌクレオチドとを使用して、実施例６のＲＴ・ＰＣＲ反応を実行して、ＥＥ ＶのE2糖蛋白をコードする遺伝子をPstI/BamHI断片の形で単離した： AB176(34mer)(配列番号.23) 5'AAACTGCAGATGGATTTGGACACTCATTTCACCC 3' AB177(44mer)(配列番号.24) 5'CGCGGATCCTCAATAAAAATCATGCCCTCGTCGGCTTAATGCAG 3' 精製後、1294bpのＲＴ-ＰＣＲ生産物をPstIおよびBamHIで処理して1278bpのPs tI/BamHI断片を単離した。この断片を予めPstIおよびBamHIで処理したベクターp VR1012(実施例7)に導入してプラスミドプラスミドpAB094(6136bp)(図14)を得た 。 実施例20プラスミドpAB093(東洋脳脊髄炎ウイルスのＣ遺伝子)の製作 実施例４によって調製した東洋脳脊髄炎ウイルス(ＥＥＶ)(北アメリカ株82V21 37)(S.Weaver達、Virology、1993、197、375-390)のゲノムＤＮＡと、以下のオ リゴヌクレオチドとを使用して、実施例６のＲＴ・ＰＣＲ反応を実行して、カプ シドたんぱく質Ｃ(ＥＥＶ Ｃ)をコードする遺伝子をPstI/BglII断片の形で単離 した： AB174(33mer)(配列番号.25) 5'AAACTGCAGATGTTCCCATACCCTACACTTAAC 3' AB175(45mer)(配列番号.26) 5'TGAAGATCTTCAATAAAAATCACCATGGCTCTGACCCCTCTGGTG 3' 精製後、801bpのＲＴ-ＰＣＲ生産物をPstIおよびBglIIで処理して785bpのPstI /BglII断片を単離した。この断片を予めPstIおよびBglIIで処理したベクターpVR 1012(実施例7)に導入してプラスミドプラスミドpAB093(5650bp)(図15)を得た。実施例21 プラスミドpAB096(西洋脳脊髄炎ウイルスのE2遺伝子)の製作 実施例４によって調製した西洋脳脊髄炎ウイルス(ＷＥＶ)(BSF 1703株)(C.ハ ーン達、Proc．Natl．Acad．Sci．USA．1988．85．5997−6001)のゲノムＤＮＡ と、以下のオリゴヌクレオチドとを使用して、実施例６のＲＴ・ＰＣＲ反応を実 行して、ＷＥＶのE2糖蛋白をコードする遺伝子をSalI/BamHI断片の形で単離した ： AB180(35mer)(配列番号.27) 5'ACGCGTCGACATGAGCATTACCGATGACTTCACAC 3' AB181(44mer)(配列番号.28) 5'CGCGGATCCTCAATAAAAATCAAGCGTTGGTTGGCCGAATACAG 3' 精製後、1304bpのＲＴ-ＰＣＲ生産物をSalIおよびBamHIで処理して1291bpのSa lI/BamHI断片を単離した。この断片を予めSalIおよびBamHIで処理したベクターp VR1012(実施例7)に導入してプラスミドプラスミドpAB096(6159bp)(図16)を得た 。実施例22 プラスミドpAB095(西洋脳脊髄炎ウイルスのＣ遺伝子)の製作 実施例４によって調製した西洋脳脊髄炎ウイルス(ＷＥＶ)(BSF 1703株)(C.Hah n et al．Proc．Natl．Acad．Sci．USA．1988．85．5997-6001)のゲノムＤＮＡ と、以下のオリゴヌクレオチドとを使用して、実施例６のＲＴ・ＰＣＲ反応を実 行して、ＷＥＶウィルスのＣカプシドたんぱく質をコードする遺伝子をSalI/Bam HI断片の形で単離した： AB178(34mer)(配列番号.29) 5'ACGCGTCGACATGTTTCCATACCCTCAGCTGAAC 3' AB179(44mer)(配列番号.30) 5'CGCGGATCCTCAATAAAAATCACCACGGTTCAGAACCTTCGGGG 3' 精製後、809bpのＲＴ-ＰＣＲ生産物をSalIおよびBamHIで処理して796bpのSalI /BamHI断片を単離した。この断片を予めSalIおよびBamHIで処理したベクターpVR 1012(実施例7)に導入してプラスミドプラスミドpAB095(5664bp)(図17)を得た。実施例23 プラスミドpAB098(ベネズエラ脳脊髄炎ウイルスのE2遺伝子)の製作 実施例４によって調製したベネズエラ脳脊髄炎ウイルス(ＶＥＶ)(P676株(IC型 )(R．Kinney et al．Virology．1992．191．569-580)のゲノムＤＮＡと、以下の オリゴヌクレオチドとを使用して、実施例６のＲＴ・ＰＣＲ反応を実行して、Ｖ ＥＶウィルスのE2糖蛋白をコーする遺伝子をSalI/BamHI断片の形で単離した： AB184(35mer)(配列番号.31) 5'ACGCGTCGACATGTCCACCGAGGAGCTGTTTAAGG 3' AB185(44mer)(配列番号.32) 5'CGCGGATCCTCAATAAAAATCAGGCCCGGGCAGTGCGGGCGCA G 3' 精製後、1304bpのＲＴ-ＰＣＲ生産物をSalIおよびBamHIで処理して1291bpのSa lI/BamHI断片を単離した。この断片を予めSalIおよびBamHIで処理したベクターp VR1012(実施例7)に導入してプラスミドプラスミドpAB098(6159bp)(図18)を得た 。実施例24 プラスミドpAB097(ベネズエラ脳脊髄炎ウイルスのＣ遺伝子)の製作 実施例４によって調製したベネズエラ脳脊髄炎ウイルス(ＶＥＶ)(P676株(IC型 )(R．Kinney et al．Virology．1992．191．569-580)のゲノムＤＮＡと、以下の オリゴヌクレオチドとを使用して、実施例６のＲＴ・ＰＣＲ反応を実行して、Ｖ ＥＶウィルスのＣカプシドたんぱく質をコードする遺伝子をPstI/BamHI断片の形 で単離した： AB182(30mer)(配列番号。33) 5'AAACTGCAGATGTTCCCGTTCCAGCCAATG 3' AB183(45mer)(配列番号.34) 5'CGCGGATCCTCAATAAAA.ATCACCATTGCTCGCAGTTCTCCGGAG 3' 精製後、856bpのＲＴ-ＰＣＲ生産物をPstIおよびBamHIで処理して839bpのSalI /BamHI断片を単離した。この断片を予めPstIおよびBamHIで処理したベクターpVR 1012(実施例7)に導入してプラスミドプラスミドpAB097(5698bp)(図19)を得た。実施例25 プラスミドDAB04l(狂犬病ウィルスのＧ遺伝子)の製作 実施例４によって調製した狂犬病ウィルス(ERA株)(A．Anilionis et al．Natu re．1981．294．275-278)のゲノムＤＮＡと、以下のオリゴヌクレオチドとを使 用して、実施例６のＲＴ・ＰＣＲ反応を実行して、狂犬病ウィルスのＧ蛋白をコ ードする遺伝子を含む1589bpの断片を増幅した： ABO11(33mer)(配列番号.35) 5'CTGCAGAGATGGTTCCTCAGGCTCTCCTG 3' AB012(34mer)(配列番号.36) 5'CGCGGATCCTCACAGTCTGGTCTCACCCCCACTC 3' 精製後、ＲＴ-ＰＣＲ生産物をPstIおよびBamHIで処理して1578bpのSalI/BamHI 断片を単離した。この断片を予めPstIおよびBamHIで処理したベクターpVR1012( 実施例7)に導入してプラスミドプラスミドpAB04l(6437bp)(図20)を得た。実施例26 プラスミドの調製と精製 動物の予防接種用のプラスミドを調製するためにスーパーコイル状の精製した プラスミドの懸濁液が得られる任意の方法を用いることができる。これらの方法 は当業者に周知である。特に、アルカリ法の後に臭化エチジウムの存在下、塩化 セシウム勾配で連続2回の超遠心分離を行うサムブルック(Sambrook)達(Molecula r Cloning:A Laboratory Manual.第２版、Cold Spring Harbor Laboratory．Col d Spring Harbor New York.1989)が記載の方法を挙げることができる。参考文献 としては、予防接種に使用可能なプラスミドの工業規模の製造方法を記載した国 際特許出願PCT WO 95/21250号およびPCT WO 96/02658号も挙げることができる。 ワクチンを製造するためには(実施例17参照)、精製したプラスミドを再懸濁して 貯蔵可能な高濃度（＞2mg/ml)の溶液を得る。このために、プラスミドを超純水 またはTEバッファー(10mM Tris−HCl、1mM ＥＤＴＡ，pH8.0)に再懸濁する。実施例27 組み合せワクチンの製造 組み合せワクチンの製造に必要な各プラスミドをそれぞれの濃厚溶液(実施例1 6)から混合する。この混合液を各プラスミドの最終濃度が各プラスミドの有効量 に対応するように調製する。ワクチンの最終濃度を調節するのに使用できる溶液 は0.9％NaCl溶液またはPBSバッファーにすることができる。 このワクチンの製造には特殊配合物、例えばリポソーム、カチオン脂質も使用 できる。実施例28 ウマへの予防注射 プラスミド1個当り100、250または500μｇの投与量でウマに予防注射した。注 射は注射針を用いる筋肉内経路によって行うことができる。ネック筋肉に無針注 射で筋内径路で2mlの投与量を投与する。 注射は0.2mlの投与量を５つのポイント(注射点当たり0.04ml)(例えばOPIGJETO の器具)に液体ジェット注射器(可動子なし)を使用している皮内の径路を用いて 、実行されることができる。この場合、0.2または0.4mlの体積(それぞれ1回また は2回の投与に対応)を投与する。 PIGJETの注射器を使用２回連続投与する場合には、２つの注射区域が互いに約1 から２センチメートル離れるように空間をあける。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．宿主細胞でインビボで発現可能な形で四足動物の病原結合価の遺伝子に結合 したプラスミドからなる少なくとも３つのポリヌクレオチドワクチンの結合価を 含む、四足動物、特にウマの病理を防ぐためのワクチン製剤であって、結合価が ウマ鼻腔肺炎ウィルスＥＨＶ、馬インフルエンザウィルスＥＩＶおよび破傷風ウ ィルからなる群の中から選ばれ、プラスミドが、各結合価に対して、ウマ鼻腔肺 炎ウィルスのgBおよびgD、馬インフルエンザウィルスのトＨＡ、ＮＰおよびＮか ら成る群の中から選択される一つまたは複数の遺伝子および破傷風トキシンのサ ブユニットＣの全部または一部をコードする遺伝子からから成るワクチン製剤。 ２．馬の鼻腔肺炎結合価が、EHV-1株の少なくとも一つの抗原、EHV-4株の少なく とも一つの抗原、好ましくは同じ種類の抗原である請求項１に記載のワクチン製 剤。 ３．ウマ鼻腔肺炎ウィルスのgBおよびgD遺伝子を含む請求項１または２に記載の ワクチン製剤。 ４．ヘムアグルチニンＨＡをコードする遺伝子または馬インフルエンザウィルス のＨＡおよびＮＰをコードする遺伝子から成る請求項１に記載のワクチン製剤。 ５．東洋脳脊髄炎ＥＥＶ、西洋脳脊髄炎ＷＥＶ、ベネズエラ脳脊髄炎ウイルス( ＶＥＶ)(好ましくはこれら全てを含み)、ライム病結合価、ウマ動脈炎ウィルス および狂犬病ウィルスからなる群の中から選択される他の馬の病原を一つまたは 複数含み、プラスミドが、各結合価に対して、悩脊髄炎のＣおよびE2抗原遺伝子 、Lyme病のOspA、OspBおよびp100遺伝子、馬動脈炎のＥ、Ｍ、Ｎ遺伝子および狂 犬病のＧ遺伝子を有する請求項１記載のワクチン製剤。 ６．脳脊髄炎のE2遺伝子、Ｃ遺伝子またはE2遺伝予から成る請求項５に記載のワ クチン製剤。 ７．ライム病ウィルスのOspA遺伝子から成る請求項５に記載のワクチン製剤。 ８．各プラスミドを10ngから1mg、好ましくは100ngから500μｇ、さらに好まし くは1μｇから250μｇ含む請求項1から7のいずれか一項に記載のワクチン製剤。 ９．交雑保護するプラスミドまたは抗原をコードする抗原を有する全生ワクチン 、不活性化全ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチンより成る群の中 から選択された初期ワクチンを用いて最初の予防接種で四足動物に予防接種する ための四足動物用ワクチン製造での請求項1から7のいずれか一項に記載のプラス ミドの使用。 10．請求項1から8のいずれか一項に記載のワクチン製剤と、交雑保護をするポリ ヌクレオチドワクチンまたは抗原をコードした抗原を有する全生ワクチン、不活 性化全ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチンより成る群の中から選 択される四足動物用の初期ワクチンとからなり、初期ワクチンは最初の予防接種 で投与するか、ワクチン製剤とともにブースターとして投与する予防接種キット 。 11．交雑保護をするポリヌクレオチドワクチンまたは抗原をコードする抗原を有 する全生ワクチン、不活性化全ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチ ンより成る群の中から選択される四足動物用初期ワクチンのためのブースターと して使用できることを記載した指示書が添付された請求項1から8のいずれか一項 に記載のワクチン製剤。
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