JP2000509990A - ヒトＧタンパク質β３サブユニットに対する遺伝子における遺伝子変化の、疾患診断への使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトＧタンパク質β３サブユニットに対する遺伝子における遺伝子変化の、疾患診断への使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＧタンパク質β３サブユニットに対する 遺伝子における遺伝子変化の、疾患診断への使用 説明 本発明は、遺伝子分析、特にヒトグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタ ンパク質）のサブユニットに対する遺伝子の分析による、疾患診断方法に関する 。 ヘテロトリマー性グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）は、 細胞内信号伝達においてかなりの重要性を有する。それらは、ホルモンレセプタ ー及びレセプター活性化後に配座変化が発生する別のレセプターが刺激された後 で、細胞外信号の中継を媒介する。このことによりＧタンパク質の活性化が起こ り、続いて活性化Ｇタンパク質は、細胞内エフェクター（例えば、イオンチャン ネル、酵素）を活性化又は阻害することができる。ヘテロトリマー性Ｇタンパク 質は、αサブユニット、βサブユニット、及びγサブユニットの３個のサブユニ ットからなる。現在までに、異なるαサブユニット数種、βサブユニット５種、 及びγサブユニット約１２種が、生化学的方法及び分子生物学的方法によって検 出されている（Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ，Ｌ．ａｎｄ Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ，Ｍ ．Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：１ ９９４ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｒｅｓ．１５：２１３−２５２， １９９５；Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ，Ｓ．ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｇ．Ｃｏｍｐ ｌｅｘ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ ｔｒ ａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｖｏｌｖｉ ｎｇ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｕｎｙｎ Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａ ｒ ｒｇ，Ｂ．，Ｇｕｄｅｒｍａｎｎ，Ｔ．，ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｇ．Ｒｅｃ ｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｏｍ ｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎ ｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｐａｒｔ ２．Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７３：１２３−１３２，１ ９９５；Ｎｅｅｒ，Ｅ．Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ Ｇ ｐｒｏｔｅｉ ｎｓ：Ｏｒｇａｎｉｚｅｒｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｉｇｎａ ｌｓ．Ｃｅｌｌ ８０：２４９−２５７，１９９５；Ｒｅｎｓ−Ｄｏｍｉａｎｏ ，Ｓ．ａｎｄ Ｈａｍｍ，Ｈ．Ｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔ ｉｏｎａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉ ｃ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１０５９−１０６６，１９９ ５）。 レセプターが媒介する或るαサブユニットの活性化は、百日咳毒素（ＰＴＸ： ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ）での前処理によって阻害することができる。 これらには、特にα異性体（αｉ１、αｉ２、及びαｉ３）、並びに種々のｏ− サブユニットが含まれる。また、これらのタイプのＧタンパク質は、ＰＴＸ感受 性Ｇタンパク質とも称されている。 本発明者は、ヒトＧタンパク質β３サブユニットに対する遺伝子における遺伝 出した。前記遺伝子変化は、Ｇタンパク質調節異常に関連する障害発病のリスク を確定するのに特に適している。 更に、本発明は、対象者のヒトＧタンパク質β３サブユニットの遺伝子配列と 配列表のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の遺伝子配列とを比較し、そしてチミン（Ｔ） が８２５番の位置に存在する場合には、その対象者に疾患のリスクが増加してい ると判断することを含む、前記対象者におけるＧタンパク質調節異常（ジスレギ ュレーション）に関連する障害発病の相対的リスクを確定する方法に関する。 本発明者が見出した前記の遺伝子変化は、ヒトＧタンパク質β３サブユニット に対する遺伝子中に位置する。この遺伝子は、Ｌｅｖｉｎｅらによって既に記載 されている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８７，（１９９ ０）２３２９−２３３３〕。そのコード領域は、２７５番の位置にセリンコドン 「ＴＣＣ」を有する。一方、Ｇタンパク質調節異常に関連する疾患のリスクが増 加した対象者は、この位置に、コドン「ＴＣＴ」（これも同様にセリンをコード する）を有する。前記の遺伝子変化は、８２５番の位置においてシトシン（Ｃ） がチミン（Ｔ）によって置換される塩基置換である。しかしながら、塩基のこの 交換は、アミノ酸レベルでは「非顕在（ｓｔｕｍｍ）」（すなわち、この位置に おいて異なるアミノ酸の挿入をもたらさない）である。疾患のリスクが増加して いる対象者において見出された前記の配列を、配列表中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に記載する。 本発明者が見出した前記遺伝子変化は、通常、ヘテロ接合形態で発生する。 Ｇタンパク質調節異常に関連する障害は、Ｇタンパク質が信号伝達に関与して いてその機能が生理学的方法で行われない疾患と規定される。 前記障害としては、心血管疾患、代謝障害、及び免疫疾患を挙げることができ る。 心血管疾患としては：高血圧症、妊娠高血圧症（妊娠中毒、妊娠中高血圧症） 、環状心臓病（ｋｏｒｏｎａｒｅ Ｈｅｒｚｋｒａｎｋｈｅｉｔ）、局所性及び ／又は広汎性アテローム血栓症、血管の狭窄症、血管再生処置後の再狭窄（例え ば、ステント移植を伴うＰＴＣＡ及びステント移植を伴わないＰＴＣＡ）、発作 又は血栓症に対する傾向、及び血小板凝集の増加を挙げることができる。 代謝障害としては：代謝症候群、インスリン抵抗性及び高インスリン血症、二 型真性糖尿病、糖尿病合併症（例えば、腎症、神経障害、網膜症等）、脂質代謝 障害、中枢化学受容障害〔ＣＯ₂耐性、アシドーシス耐性、乳児突然死（ＳＩＤ Ｓ）〕を挙げることができる。 免疫疾患としては：体の免疫反応［イムノグロブリンの形成、Ｔ細胞及びＮＫ 能力を含む）に対する全般的低下傾向、腫瘍発生及び増殖（悪性転換細胞の転移 能力を含む）の傾向、ＨＩＶ感染後に病気が臨床的に明白となるまでの潜伏期間 の持続、カポシ肉腫、肝臓の硬変傾向、移植耐性、及び移植拒絶を挙げることが できる。 本発明による遺伝子突然変異の使用は、高血圧症発病のリスクを確定するのに 特に適している。 更に、本発明は、前記の遺伝子突然変異を有する遺伝子導入動物の産生に関す る。このタイプの遺伝子導入動物は、特に前記障害の研究及び治療用の動物モデ ルとして、非常に重要である。遺伝子導入動物の産生方法は、当業者に周知であ る。 疾患発病の相対的リスクを確定するための本発明の方法用に、対象者の遺伝情 報を含む身体材料を対象者から採取する。これは、一般的には、血液を採取し、 そこから核酸を単離することによって実施する。 Ｇタンパク質β３サブユニットに対する遺伝子の構造は、単離した対象者の核 酸から確定し、そしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列と比較する。 前記遺伝子の構造は、前記核酸のシークエンシングによって確定することがで きる。これは、ゲノムＤＮＡから直接、又は核酸の増幅（例えばＰＣＲ法による ）の後に実施することができる。 前記遺伝子の構造は、ゲノムレベル、又はｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡレベルで 実施することができる。 ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した後にシークエンシングにより確定することが好まし い。前記ＰＣＲに適したプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列か ら、当業者により容易に推察することができる。このための手順は、いずれの場 合においても、関連塩基位置である８２５位の前又は後の鎖及び相補鎖に結合す るプライマーを選択するのが有利である。 しかしながら、遺伝子の比較に、別の方法（例えば、選択的ハイブリダイゼー ション又は制限酵素を用いる適当なマッピング）も用いることができる。前記の ８２５番の位置におけるＣからＴへの塩基交換は、制限酵素ＤｓａＩ（これは、 遺伝的多型性の検出にも用いられる）の切断部位の欠損を発生させる。 或る人が８２５番の位置にチミン（Ｔ）を有するならば、その人は、その位置 にシトシン（Ｃ）を有する人よりも疾病の大きなリスクを抱えていることになる 。 以下の実施例において、本発明を更に説明する。 実施例１ シークエンシングによる、高血圧症における遺伝子変化の検出 本質的高血圧症患者に対する予備検査において、ＰＴＸ感受性Ｇタンパク質の 活性化に関する感受性の増強を検出した。この検出は、Ｎａ／Ｈ交換系の増強し た活性を表現型マーカーとして有する患者由来の不死化細胞中で実施することが できた。前記のＰＴＸ感受性Ｇタンパク質の活性化に関する感受性の増強は、細 胞の機能に関してかなりの重要性を有する。それらとしては、細胞内セカンドメ ッセンジャー分子（例えば、イノシトール１，４，５−トリスホスフェート）の 形成の増強、細胞内Ｃａ²⁺イオン放出の増強、イムノグロブリン形成の増強、及 び細胞成長速度の増強を挙げることができる。これらの変化が、不死化細胞中及 ｅｒｕｎｇ）が遺伝学的に固定されていると考えることができる（Ｒｏｓｓｋｏ ｔｅｎｓｉｖｅ ｓｏｄｉｕｍ−ｐｒｏｔｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ｐｈｅｎ ｏｔｙｐｅ ｐｅｒｓｉｓｔｓ ｉｎ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｌｙｍｐｈ ｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ−ａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｈｕ ｍａｎ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２５ ５３−２５５９，１９９３；Ｒｏｓｓｋｏｐｆ，Ｄ．，Ｈａｒｔｕｎｇ，Ｋ．， Ｈｅｎｓｅ，Ｊ．，ａｎｄ Ｓｉｆｆｅｒｔ，Ｗ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｍｍｕ ｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２６：４３２−４３５，１９９５；Ｒｏｓｓｋｏｐ ｆ， ｆ ｓｏｄｉｕｍ-ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒ ｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｓｅｄ ｌｙｍｐｈｏｂｌ ａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｈｙ ｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｒｍｏｔｅｎｓｉｖｅ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：２５４−２５９，１９９５；Ｓｉｆｆ ｅｒｔ，Ｗ．，Ｒｏｓｓｋｏｐｆ，Ｄ．，Ｍｏｒｉｔｚ，Ａ．，Ｗｉｅｌａｎｄ ，Ｔ．，Ｋａｌｄｅｎｂｅｒｇ−Ｓｔａｓｃｈ，Ｓ．，Ｋｅｔｔｌｅｒ，Ｎ．， Ｈａｒｔｕｎｇ，Ｋ．，Ｂｅｃｋｍａｎｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｊａｋｏｂｓ，Ｋ． Ｈ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｉ ｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎ ｔｓ ｗｉｔｈ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉ ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：７５９−７６６，１９９５）。 ＲＮＡを、高血圧症対象者由来の不死化細胞系から、標準的方法によって調製 し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに転写した。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を 用いてＧタンパク質Ｇ３サブユニットをコードするｃＤＮＡを増幅し、そしてシ ークエンシングを行った。以下のオリゴヌクレオチドプライマー： 5'-TGG GGG AGA TGG AGC AAC TG及び 5'-CTG CTG AGT GTG TTC ACT GCC を前記ＰＣＲに用いた。 Ｌｅｖｉｎｅらにより発行された配列（Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．Ａ．，Ｓｍａｌｌ ｗｏｏｄ，Ｐ．Ｍ．，Ｍｏｅｎ，Ｐ．Ｔ．，Ｊｒ．，Ｈｅｌｍａｎ，Ｌ．Ｊ．， ａｎｄ Ａｈｎ,Ｔ.Ｇ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ β３ ｓ ｕｂｕｎｉｔ，ａ ｔｈｉｒｄ ｆｏｒｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ β−ｓｕｂｕｎｉｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７（６）：２３２９−２３３３，１９９０）と比較し、高 血圧症対象者細胞からのｃＤＮＡ中で以下の差異を発見した：配列コード領域中 のヌクレオチド８２５シトシン（Ｃ）が、チミン（Ｔ）（ヌクレオチド１は、開 始コドン「ＡＴＧ」中の塩基Ａに相当する）により置換されている。 この塩基交換により、非顕在多型性を導く。すなわち、相当する塩基トリプレ ットによってコードされるアミノ酸（セリン）は、本来の配列と比較して変更さ れない。発見された遺伝子配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されている。 実施例２ 制限酵素分析による、高血圧症対象者における遺伝子変化の検出 図は、制限酵素分析による、正常血圧対象者由来の遺伝子と高血圧症対象者由 来の遺伝子との比較を示す。この中で、正常血圧対象者（ＮＴ）及び高血圧症対 象者（ＨＴ）からの細胞由来のＧ３をコードするｃＤＮＡ（ＰＣＲ法で予め増幅 したもの）を、酵素ＤｓａＩを用いて制限酵素分析した。その反応生成物を、ア ガロースゲル中に分画し、それを図に示す。 ＤｓａＩによる消化後の、正常血圧細胞由来のＧ３ｃＤＮＡの完全な制限が、 図によって明瞭に示されている。高血圧症対象者細胞由来のｃＤＮＡは、Ｄｓａ Ｉによって、部分的にしか切断されていない。予想される切断生成物とは別に、 切断していないＰＣＲ生成物も存在する。サイズ比較のための対照フラグメント （マーカー）が、左端及び右端に配置されている。図に記載の高血圧症対象者か らのＤＮＡ配列５個のうち４個は、前記の塩基交換を示しており、この変化に関 してヘテロ接合である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ，ＢＧ ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＪＰ， ＫＲ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトＧタンパク質β３サブユニットに対する遺伝子における遺伝子変化の、 疾患診断への使用。 ２．ヒトＧタンパク質β３サブユニットに対する遺伝子における遺伝子変化の、 Ｇタンパク質調節異常に関連する障害発病のリスク確定への使用。 ３．遺伝子変化が、配列表のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列中の２７５番 のアミノ酸に対するコドンにおける遺伝子変異である、請求項２に記載の使用。 ４．配列表のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列中の８２５番の位置において シトシンがチミンによって置換されている、請求項３に記載の使用。 ５．障害が、心血管疾患、代謝障害、又は免疫疾患である、請求項２に記載の使 用。 ６．障害が、高血圧症である、請求項２に記載の使用。 ７．対象者のヒトＧタンパク質β３サブユニットの遺伝子配列と配列表のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の遺伝子配列とを比較し、そしてチミン（Ｔ）が８２５番の位置 に存在する場合には、その対象者に疾患のリスクが増加していると判断すること を含む、前記対象者にＧタンパク質調節異常に関連する障害発病の相対的リスク を確定する方法。 ８．シークエンシングによって遺伝子の比較を行う、請求項７に記載の方法。 ９．シークエンシングの前に８２５番の位置を含む遺伝子領域を増幅する、請求 項８に記載の方法。 １０．ハイブリダイゼーションによって遺伝子の比較を行う、請求項７に記載の 方法。 １１．制限酵素を用いる切断によって遺伝子の比較を行う、請求項７に記載の方 法。 １２．制限酵素ＤｓａＩを用いる、請求項１１に記載の方法。