JP2000502054A - 治療用および診断用の組成物 - Google Patents
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-
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-
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Abstract
(57)【要約】
本発明はローソニア・イントラセルラリス(Lawsonia intracellularls)または類似のあるいは他の類縁微生物により引き起こされあるいは悪化させられる、動物や鳥の腸管疾患状態の治療および/または予防のための治療用組成物に一般的に関する。本発明はこのような腸管疾患状態の治療法および/または予防法をも提供しそしてローソニア・イントラセルラリスまたは類似のあるいは他の類縁微生物を検出するための診断薬や手順をも提供する
Description
【発明の詳細な説明】
治療用および診断用の組成物
本発明は一般にローソニア・イントラセルラリス(Lawsonia intracellularis
)または類似のあるいは他の類縁の微生物により引き起こされあるいは悪化させ
られる動物または鳥の腸管疾患状態の治療および/または予防のための治療用組
成物に関する。本発明はこのような腸管疾患状態の治療および/または予防のた
めの方法をも提供しそしてローソニア・イントラセルラリスまたは類似のあるい
は他の類縁の微生物を検出するための診断薬や手順にも関連する。
本明細書で数字で言及した出版物の文献的詳細は明細書の末尾に集めてある。
本出願書類で言及したヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に対する配列番号は
文献の後に定義する。
本出願を通じて論旨から別の意味が要求される場合を除き、「コンプライズ(
含んで成る、含む)」という用語または「コンプライジーズ」や「コンプライジ
ング」などの変形は述べられた要素または完全体(integers)あるいは要素また
は完全体の群を含むことを意味し、いかなる他の要素または完全体あるいは要素
または完全体の群を排除することを意味するものではないと解すべきである。
オーストラリアの、そして実際は世界のほとんどの国の食肉産業は全畜産業の
重要な側面である。しかしながら、食肉産業は、動物
により運ばれると推定されている動物並びにヒトの疾患に影響を与える疾患状態
に反応して急速な経済的下降を経験している。従って、動物やヒトにおける感染
または潜在的感染を処理するため十分に確立された利用可能な治療手順、予防手
順および診断手順を持つことが重要である。
ブタは食肉産業の主要な一部を占めている。しかしながら、ブタはブタ増殖性
腸症(porcine proliferative enteropathy)(PPE)と集合的に呼ばれる広
いスペクトルの腸管疾患に感受性である。この疾患はこれまで腸管腺腫症複合体
(1)、ブタ腸管腺腫症(PIA)、壊疽性腸炎(2)、増殖性出血性腸症(3
)、限局性腸炎(4)、出血性腸症候群(5)、ブタ増殖性腸炎およびカンピロ
バクター・スピーシーズにより誘発される腸炎(6)として知られていた。
PPEには二つの主要な形態がある。すなわち、成長の遅れおよび軽度の下痢
をしばしば惹き起こす腸管腺腫症に代表される非−出血型、と遠位の小腸管腔が
血液で充満する増殖性出血性腸症(PHE)により代表される、しばしば致死的
な出血型である。PPEはブタ(14)、ハムスター(7)、白イタチ(15)
、モルモット(16)、ウサギ(17)並びに鳥類の種(18)などの多数の動
物種で報告されてきた。
PPEの原因生物は本明細書で「ローソニア・イントラセルラリス」と呼ぶカ
ンピロバクター−様微生物である(26)。この微生物は先にイレアルシンビオ
ント イントラセルラリスとも呼ばれた
(7)。ブタのPPE−様疾患はカンピロバクターの種々の種などの他の病原体
によっても引き起こされることがある(8)。
ローソニア・イントラセルラリスは細胞内細菌、おそらくは絶対的細胞内細菌
である。それはイン・ビトロでは組織培養細胞と一緒の場合だけ培養することが
できる(9、26)。PPEに罹患したブタは多重に異常な未成熟の陰窩(crypt
)により特徴付けられそしてエル.イントラセルラリスがこれらの陰窩細胞の細
胞質の中に局在している。
PPEはブタ産業に関連する一つの重要な費用成分である、特に貯蔵損失、医
療費、ブタの成長速度の減少および食餌費用の増加の点でそうである。PPEは
、例えば、残留抗生物質汚染を処理する際の付加的な労働費用および環境費用や
、この微生物が他の動物またはヒトを通過したりそこに運ばれたりするのを防止
するための管理費用の形で下流の間接費用にも寄与する。
PPEに対する現在の管理戦略は抗生物質の使用に頼っている。
しかしながら、このような戦略は短期から中期的なものであると思われる。特に
、政府の規制による圧力が予防的な抗生物質によってのみ支持される畜産業を標
的とする傾向にあることからそうである。従って、抗生物質の使用に代わる有効
で、安全で、かつ低コストの代替物を開発する必要がある。この抗生物質の代替
物をヒトなどの他の動物に感染する類似の生物に拡張することも必要である。
本発明までに至る研究で、本発明者らは動物および鳥類のPPE
を予防および治療するためのワクチンを開発しようと努力した。本発明のワクチ
ンは抗生物質の使用に対する有効な代替物を提供し、ある範囲の畜産上および医
療上の利益をもたらす。
従って、本発明の一つの側面では、エル.イントラセルラリスまたは類似の微
生物または他の類縁微生物による動物または鳥類の感染の予防または治療のため
のワクチン組成物が提供される。該ワクチン組成物はエル.イントラセルラリス
または類縁の微生物の免疫原性・非病原性型またはその免疫原成分および獣医的
または薬学的用途に適する一つ以上の担体、希釈剤および/またはアジュバント
を含んで成るものである。
本発明は特に有用である、そしてエル.イントラセルラリス感染からのブタの
予防および/または治療との関連において以下にこれを例示する。しかしながら
、この例示は本発明がヒトおよび鳥類を含むすべての動物についてのエル.イン
トラセルラリスおよび/または類縁微生物による感染からの予防および治療にま
で拡張されるという理解の下になされる。本発明が想定する動物はヒト、霊長類
、愛玩動物(例えば、猫、犬)、家畜(例えば、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロ
バ、ヤギ)、実験室テスト動物(例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ
)、および捕獲野生動物(例えば、カンガルー、狐、鹿)などを含むが、これら
に限定されるものではない。本発明は家禽、猟鳥および籠の中の鳥などの鳥にも
拡張される。
さらに、本発明はエル.イントラセルラリスのすべての単離株お
よびサブタイプ並びにローソニア属の他の種、またはヌクレオチドレベル、生化
学的レベル、構造的レベル、生理学的レベルおよび/または免疫相互作用的レベ
ルでそれに関連する他の微生物にまで拡張される。以下、「ローソニア・イント
ラセルラリス」またはその略称「エル.イントラセルラリス」に言及するときは
、この微生物に類似の微生物または他の類縁する微生物のすべてが含まれる。例
えば、類縁の微生物はエル.イントラセルラリスの染色体または染色体外要素内
のヌクレオチド配列の全部または一部に関して少なくとも約60%、より好まし
くは少なくとも70%そしてさらに一層好ましくは少なくとも約80%よりも高
い、染色体レベルまたは染色体外レベルにおけるヌクレオチド配列の類似性を有
することができる。 例えば、これらの類似性パーセンテージは配列番号:5に
記載された配列に関連させることができる。この配列はエル.イントラセルラリ
スの染色体の一部である。
従って、本発明のこの側面はエル.イントラセルラリスによるブタ感染の予防
および/または治療のためのワクチン組成物に向けられる。該ワクチン組成物は
エル.イントラセルラリスまたは類縁の微生物の免疫原性・非病原性型またはそ
れらの免疫原成分および獣医学的または薬学的用途に適する一つ以上の担体、希
釈剤および/またはアジュバントを含んで成るものである。
「免疫原成分」という用語はエル.イントラセルラリス(弱毒化された非−病
原性型または死滅型)またはブタに防御的免疫反応を誘導することができる、エ
ル.イントラセルラリスから取得したまたは由来したDNAがコードする、ペプ
チド、ポリペプチドまたは
タンパクを含むエル.イントラセルラリスの成分を意味する。防御的免疫反応は
体液性およびまたは細胞性のレベルであってもよく、そして一般にブタのPPE
の症状の実質的減少を生ずる。ワクチン組成物は防御的免疫反応の誘導を許すよ
うな免疫原成分の有効量を含む。
本発明のこの側面によれば、エル.イントラセルラリスによるブタの予防およ
び治療のためのワクチン組成物であって、該ブタ中でエル.イントラセルラリス
または類縁の微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに有効な量のエル.イ
ントラセルラリスまたは類縁微生物由来の少なくとも一つの免疫原成分を含んで
おり、さらに獣医学的または薬学的用途に適する一つ以上の担体、アジュバント
および/または希釈剤を含んでいるものであるワクチン組成物が提供される。
この免疫原成分はエル.イントラセルラリスまたはその細胞培養から単離され
た天然に生ずるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、炭水化物、脂質または
核酸(例えば、DNA)またはそれらの組み合わせ、またはエル.イントラセル
ラリスからのまたは由来したDNAによりコードされるペプチド、ポリペプチド
またはタンパクの組換え型、または該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの
誘導体であってもよい。
エル.イントラセルラリスの単離された成分は、エル.イントラセルラリスを
含む細胞培養からまたはエル.イントラセルラリス細胞の溶菌調製物から少なく
とも1回の精製工程を受けまたは少なく
とも部分濃縮を受けた成分である。必要な免疫原性を有するエル.イントラセル
ラリスからのこのような成分の純度は、分子量、免疫原活性または他の適当な手
段で測定されたとき、調製物中の他の成分と比較して、好ましくは少なくとも約
40%、より好ましくは少なくとも約50%、さらにより好ましくは少なくとも
約60%、なお一層好ましくは少なくとも約70%そしてさらに一層好ましくは
少なくとも約80%〜90%またはそれ以上である。
このワクチンの特に有用な形態はエル.イントラセルラリスの弱毒化された形
またはその他の非−病原形または死滅細胞またはその様々な画分を含む全細胞ワ
クチンである。
弱毒化された細胞または非−病原性細胞には、例えば、熱、ホルマリンまたは
他の化学的処理、電気ショックまたは圧力により調製される死滅したエル.イン
トラセルラリス細胞が含まれ、そしてこのような細胞は特に本発明の実施に有用
である。
本発明のこの側面によれば、エル.イントラセルラリスまたは類縁微生物によ
るブタ感染の予防および/または治療のためのワクチン組成物であって、エル.
イントラセルラリスまたは類縁微生物の死滅調製物またはそれらの免疫原画分お
よび獣医学的または薬学的用途に適する一つ以上の担体、希釈剤および/または
アジュバントを含んで成るワクチン組成物が提供される。。
別の態様では、組換えワクチンを使用することができる。この組換えワクチン
はエル.イントラセルラリスから由来した一つ以上の
組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを含むことができ、あるいはエル
.イントラセルラリス由来のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクに免疫学的
に関連のある組換え分子であり、またはエル.イントラセルラリス由来のペプチ
ド、ポリペプチドまたはタンパクを含む第1部分と、例えば、担体分子またはア
ジュバントまたはサイトカインなどの免疫剌激分子として有用な第2の異種のペ
プチド、ポリペプチドまたはタンパクとを含む融合分子であることができる。エ
ル.イントラセルラリス由来の特に有用な組換えタンパクには、エル.イントラ
セルラリスの細胞表層または膜由来のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクが
含まれ、これはエル.イントラセルラリス内の代謝経路内の酵素であり、あるい
はリフォールディングおよび/またはヒートショックタンパクである。好ましい
態様では、タンパクはGroELおよびGroESなどのリフォールディング/
ヒートショックタンパクであるが、これに限定されるものではない。他の推定的
ワクチン候補には鞭毛基条タンパク(flagellar basal body rod protein)、S
−アデノシルメチオニン:tRNAリボシルトランスフェラーゼ−イソメラーゼ
、エノイル−(アシル−キャリア−タンパク)レダクターゼ、N−アセチルムラ
モイル−L−アラニンアミダーゼ(オートリシン)、UOP−3−0−〔3−ヒ
ドロキシミリストイル〕グルコースアミンN−アセチルトランスフェラーゼおよ
びグルカレート・トランスポーターが含まれる。
好ましい態様によれば、本発明はエル.イントラセルラリスまたは類縁微生物
によるブタ感染の予防および/または治療のためのワクチン組成物であって、該
ワクチン組成物がエル.イントラセルラ
リス由来の組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの少なくとも一つを含
むものであり、そしてエル.イントラセルラリス由来の該組換えペプチド、ポリ
ペプチドまたはタンパクがブタ内でエル.イントラセルラリスに対し防御的免疫
反応を誘導することができるものであり、該ワクチン組成物が獣医学的または薬
学的用途に適する一つ以上の担体、希釈剤および/またはアジュバントをさらに
含むものであるワクチン組成物に関する。
特に好ましい態様では、組換えタンパクは配列番号:2に記載されたアミノ酸
配列を有するGroELであり、あるいは配列番号:2に記載のアミノ酸配列の
全部または一部に少なくとも約40%、少なくとも約60%、またはより好まし
くは少なくとも約70%そしてさらにより好ましくは少なくとも約80〜90%
またはそれ以上の類似性を持つ予言されたアミノ酸配列を有するタンパクである
゜
別の態様では、組換え分子は配列番号:4に記載されたアミノ酸配列を有する
GroESであり、あるいは配列番号:4に記載のアミノ酸配列の全部または一
部に少なくとも約40%、少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも約7
0%そしてさらにより好ましくは少なくとも約80〜90%またはそれ以上の類
似性を持つアミノ酸配列を有する分子である。
本発明の別の態様は、配列番号:1に記載されたヌクレオチド配列によりコー
ドされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、またはこれらのヌクレオチド
配列と少なくとも40%の類似性を有し
、または低厳格条件下でこれらとハイブリッドを形成することができそしてエル
.イントラセルラリスまたは類縁微生物の免疫原成分をコードするヌクレオチド
配列によりコードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを含む。
関連する一つの態様では、本発明は配列番号:3に記載されたヌクレオチド配
列によりコードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、またはこれらの
ヌクレオチド配列と少なくとも40%の類似性を有し、または低厳格条件下でこ
れらとハイブリッドを形成することができそしてエル.イントラセルラリスまた
は類縁微生物の免疫原成分をコードするヌクレオチド配列によりコードされたペ
プチド、ポリペプチドまたはタンパクを含む。
関連する一つの態様では、本発明は配列番号:5に記載されたヌクレオチド配
列によりコードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、またはこれらの
ヌクレオチド配列と少なくとも40%の類似性を有し、または低厳格条件下でこ
れらとハイブリッドを形成することができそしてエル.イントラセルラリスまた
は類縁微生物の免疫原成分をコードするヌクレオチド配列によりコードされたペ
プチド、ポリペプチドまたはタンパクを含む。
関連する一つの態様では、本発明は配列番号:6に記載されたヌクレオチド配
列によりコードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、またはこれらの
ヌクレオチド配列と少なくとも40%の類似性を有し、または低厳格条件下でこ
れらとハイブリッドを形成することができそしてエル.イントラセルラリスまた
は類縁微生物
の免疫原成分をコードするヌクレオチド配列によりコードされたペプチド、ポリ
ペプチドまたはタンパクを含む。
関連する一つの態様では、本発明は配列番号:8に記載されたヌクレオチド配
列によりコードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、またはこれらの
ヌクレオチド配列と少なくとも40%の類似性を有し、または低厳格条件下でこ
れらとハイブリッドを形成することができそしてエル.イントラセルラリスまた
は類縁微生物の免疫原成分をコードするヌクレオチド配列によりコードされたペ
プチド、ポリペプチドまたはタンパクを含む。
関連する一つの態様では、本発明は配列番号:11に記載されたヌクレオチド
配列によりコードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、またはこれら
のヌクレオチド配列と少なくとも40%の類似性を有し、または低厳格条件下で
これらとハイブリッドを形成することができそしてエル.イントラセルラリスま
たは類縁微生物の免疫原成分をコードするヌクレオチド配列によりコードされた
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを含む。
関連する一つの態様では、本発明は配列番号:13に記載されたヌクレオチド
配列によりコードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、またはこれら
のヌクレオチド配列と少なくとも40%の類似性を有し、または低厳格条件下で
これらとハイブリッドを形成することができそしてエル.イントラセルラリスま
たは類縁微生物の免疫原成分をコードするヌクレオチド配列によりコードされた
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを含む。
関連する一つの態様では、本発明は配列番号:15に記載されたヌクレオチド
配列によりコードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、またはこれら
のヌクレオチド配列と少なくとも40%の類似性を有し、または低厳格条件下で
これらとハイブリッドを形成することができそしてエル.イントラセルラリスま
たは類縁微生物の免疫原成分をコードするヌクレオチド配列によりコードされた
ペプチド、ポリペブチドまたはタンパクを含む。
関連する一つの態様では、本発明は配列番号:17に記載されたヌクレオチド
配列によりコードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、またはこれら
のヌクレオチド配列と少なくとも40%の類似性を有し、または低厳格条件下で
これらとハイブリッドを形成することができそしてエル.イントラセルラリスま
たは類縁微生物の免疫原成分をコードするヌクレオチド配列によりコードされた
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを含む。
関連する一つの態様では、本発明は配列番号:18に記載されたヌクレオチド
配列によりコードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、またはこれら
のヌクレオチド配列と少なくとも40%の類似性を有し、または低厳格条件下で
これらとハイブリッドを形成することができそしてエル.イントラセルラリスま
たは類縁微生物の免疫原成分をコードするヌクレオチド配列によりコードされた
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを含む。
関連する一つの態様では、本発明は配列番号:19に記載された
ヌクレオチド配列によりコードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、
またはこれらのヌクレオチド配列と少なくとも40%の類似性を有し、または低
厳格条件下でこれらとハイブリッドを形成することができそしてエル.イントラ
セルラリスまたは類縁微生物の免疫原成分をコードするヌクレオチド配列により
コードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを含む。
関連する一つの態様では、本発明は配列番号:20に記載されたヌクレオチド
配列によりコードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、またはこれら
のヌクレオチド配列と少なくとも40%の類似性を有し、または低厳格条件下で
これらとハイブリッドを形成することができそしてエル.イントラセルラリスま
たは類縁微生物の免疫原成分をコードするヌクレオチド配列によりコードされた
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを含む。
関連する一つの態様では、本発明は配列番号:21に記載されたヌクレオチド
配列によりコードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、またはこれら
のヌクレオチド配列と少なくとも40%の類似性を有し、または低厳格条件下で
これらとハイブリッドを形成することができそしてエル.イントラセルラリスま
たは類縁微生物の免疫原成分をコードするヌクレオチド配列によりコードされた
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを含む。
関連する一つの態様では、本発明は配列番号:22に記載されたヌクレオチド
配列によりコードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、またはこれら
のヌクレオチド配列と少なくとも40%
の類似性を有し、または低厳格条件下でこれらとハイブリッドを形成することが
できそしてエル.イントラセルラリスまたは類縁微生物の免疫原成分をコードす
るヌクレオチド配列によりコードされたペブチド、ポリペプチドまたはタンパク
を含む。
関連する一つの態様では、本発明は配列番号:23に記載されたヌクレオチド
配列によりコードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク、またはこれら
のヌクレオチド配列と少なくとも40%の類似性を有し、または低厳格条件下で
これらとハイブリッドを形成することができそしてエル.イントラセルラリスま
たは類縁微生物の免疫原成分をコードするヌクレオチド配列によりコードされた
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを含む。
好ましい類似性パーセンテージは少なくとも約50%または少なくとも約60
%または少なくとも約70〜90%である。
本明細書で42℃で低厳格とは、ハイブリッド形成条件として少なくとも約1
%v/vから少なくとも約15%v/vのホルムアミドおよび少なくとも約1M
から少なくとも約2Mの塩を含み、そして洗浄条件として少なくとも約1Mから
少なくとも約2Mの塩を含むことを意味する。必要な場合は、別の厳格条件を適
用することもできる。例えば、中厳格は、ハイブリッド形成条件として少なくと
も約16%v/vから少なくとも約30%v/vのホルムアミドおよび少なくと
も約0.5Mから少なくとも約0.9Mの塩を含み、そして洗浄条件として少な
くとも約0.5Mから少なくとも約0.9Mの塩を含み、あるいは高厳格はハイ
ブリッド形成条件として少
なくとも約31%v/vから少なくとも約50%v/vのホルムアミドおよび少
なくとも約0.01Mから少なくとも約0.15Mの塩を含み、そして洗浄条件
として少なくとも約0.01Mから少なくとも約0.15Mの塩を含む。
本発明は配列番号:7または配列番号:9または配列番号:10または配列番
号:12または配列番号:14または配列番号:16のいずれかに実質的に記載
されたようなアミノ酸配列あるいはそれとまたはその全部または一部と少なくと
も40%の類似性を有するアミノ酸配列を有するペプチド、ポリペプチドまたは
タンパクをも提供する。類似性の好ましいパーセンテージは少なくとも約50%
、または少なくとも約60%または少なくとも約70〜90%を含む。
本発明はさらに上述のエル.イントラセルラリスまたは類縁微生物から由来し
たペプチド、ポリペプチドまたはタンパクをコードする組換えワクチンベクター
を含むワクチンにまで及ぶ。このワクチンベクターはウイルス起源でも、酵母起
源でもあるいは細菌起源でもよく、そして防御的免疫反応の誘導に有効なように
、エル.イントラセルラリスからのペプチド、ポリペプチドまたはタンパクをコ
ードする遺伝子配列を発現することができるものとなろう。例えば、エル.イン
トラセルラリス由来のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクをコードすること
ができる組換え配列を含む非−病原性細菌を調製することができるであろう。こ
の組換え配列は構成的または誘導可能なプロモーターの制御の下にある発現ベク
ターの形となるであろう。次いで、この細菌のコロニーををブタの腸内の適当な
場所に作らせ、そして成長させ、そしてエル.イントラセルラリスに対し防御的
免疫反応を誘導するのに十分な量の組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパ
クを生産するであろう。
さらに別の態様では、このワクチンはエル.イントラセルラリス由来のペプチ
ド、ポリペプチドまたはタンパクをコードするDNA分子を含んで成るDNAワ
クチンであって、防御的免疫反応を誘導するために有効な量のペプチド、ポリペ
プチドまたはタンパクを生産させるため、該DNAの一過性発現をさせるのに十
分な条件の下で、ブタの筋肉組織または他の適当な組織中に注射されるDNAワ
クチンであってもよい。
本発明のワクチンは異なるエピトープまたは類似のエピトープを含む1本鎖の
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパクであっても、あるいはペプチド、ポリペ
プチドまたはタンパクの集まりであってもよい。さらに、あるいはまた、1本鎖
ポリペプチドは多種のエピトープを含んでいてもよい。後者のタイプのワクチン
は多価ワクチンと呼ばれる。多種のエピトープは二つ以上の反復するエピトープ
を含む。
ワクチンの製造は当分野で一般に知られておりそしてレミントンズ・ファーマシ
ューティカル・サイエンシーズ、17版、マック・パブリッシング・コウ、イー
ストン、ペンシルバニア、USAを参照するのが便利である。
本発明は、従って、下記の一つ以上の有効量を生ずる免疫性を含
んで成る薬学的組成物、すなわち、ワクチン組成物を提供する。
(i)エル.イントラセルラリス由来の免疫原成分、
(ii)エル.イントラセルラリス由来の免疫原性を有する組換えペプチド、ポリ
ペプチドまたはタンパク、および/または
(iii)エル.イントラセルラリスの全細胞またはその成分またはその画分。
上記の成分は以後「活性成分」と呼ぶ。本発明で提供されるワクチン組成物の
活性成分は、例えば、具体的事例に応じた量で投与するときPPEの治療および
/または予防に素晴らしい治療活性を示す。例えば、組換え分子の場合は、約0
.5μgから約20mgまで投与することができる。他の有用な有効量は1μg
から約10mgまで、10μgから約5mgまで、そして50μgから約1mg
までを含む。重要な特徴は有効な防御的免疫反応を誘導するのに十分な量を投与
することである。上記の量は記載されたように投与してもよく、または体重kg
当たりに計算してもよい。投与計画は治療上の最適反応を生ずるように調節する
ことができる。例えば、幾つかに分割して毎日投与することができあるいは治療
状況の緊急に応じて投与を比例して減らすこともできる。増強投与も必要になる
ことがある。
活性成分は経口、静脈内(水溶性の場合)、筋肉内、皮下、鼻孔内、皮内また
は坐剤経路または移植(例えば、徐放技術を用いる)などの便利な方法で投与す
ることができる。投与経路に応じて、例えば、ペプチド、ポリペプチドまたはタ
ンパクを含む活性成分は該
活性成分をそれを不活性化する酵素、酸および他の自然条件から保護するためあ
る物質で被覆することが必要となる。
「アジュバント」という用語は最も広い意味で使用され、そしインターフェロ
ンなどの何らかの免疫剌激化合物を含む。本明細書で想定されるアジュバントに
は、レゾルシノール類、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびn−ヘキサ
デシルポリエチレンエーテルなどの非イオン活性剤およびフロイントの完全およ
び不完全アジュバントが含まれる。
この活性化合物は非経口的にすなわち腹膜腔内に投与することもできる。分散
剤はグリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中でお
よび油中で調製することもできる。通常の貯蔵および使用条件下では、これらの
調製物には微生物の成長を防止するため保存剤を含める。
注射用に適する薬学的剤形には、滅菌水性溶液(水可溶性の場合)または滅菌
分散剤および滅菌注射可能溶液または分散剤の即座調製のための滅菌粉末が含ま
れる。その薬学的剤形が徐放技術が使用されたときなどのように固体または半固
体である場合を除き、この剤形はすべてのケースで容易に注射器にはいるような
程度まで流体でなければならない。いずれにしても、それは製造および貯蔵の条
件下で安定でなければならず、微生物の汚染作用に対して保護されなければなら
ない。
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセ
ロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコール、および同種
のもの)、それらの適当な混合物および植物性油を含む溶媒または分散用媒体で
あることができる。適当な流動性は、例えば、リシチン(licithin)などの被覆
の使用により、分散剤の場合は必要な粒子サイズの維持によりそして界面活性剤
の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン
、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールおよび同種のもの
などの様々な抗細菌剤および抗カビ剤により達成することができる。多くの場合
、それには、例えば、糖または塩化ナトリウムなどの等張性物質を含めることが
好ましい。注射可能組成物の長期間吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニ
ウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物の中に使用することにより達成す
ることができる。
滅菌注射可能溶液は必要な量の活性化合物を上に列挙した種々の他の成分と共
に適当な溶媒の中に混合し、必要があれば、その後にろ過滅菌をすることにより
、調製される。一般に、分散剤は種々の滅菌活性成分を基本的分散用媒体と上に
列挙したものの中の必要な他の成分を含む滅菌ビークル中に混合することにより
調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、好ましい調
製法は予め滅菌ろ過されたその溶液から活性成分プラス付加的必要成分の粉末を
生ずる真空乾燥および凍結乾燥法である。
担体および希釈剤には溶媒、分散用媒体、被覆剤、抗細菌剤および抗カビ剤、
等張剤および吸収遅延剤および同種のもののどれでもすべて含まれる。このよう
な媒体および物質をワクチンに使用する
ことは当分野でよく知られている。通常の媒体または物質が活性成分と不和合で
ある場合を除き、治療用組成物にそれを使用することが予定される。補助的な活
性成分もこの組成物の中に混合することができる。
本発明のさらに別の側面は、エル.イントラセルラリス由来のペプチド、ポリ
ペプチドまたはタンパクあるいはそれらの組換え型あるいは炭水化物などの非タ
ンパク性分子に対する抗体に関する。このような抗体はモノクローンでもポリク
ローンでもよく、エル.イントラセルラリスに対する天然に生ずる抗体から選択
することができ、あるいは特定分子または全細胞またはその成分または画分に対
し特異的に抗体を作らせることができる。本発明の抗体は免疫治療やワクチン注
射にとりわけ有用であり、そして感染のためあるいはワクチン注射計画または治
療計画の進展の監視のための診断手段としても使用することができる。
例えば、エル.イントラセルラリスの組換えペプチド、ポリペプチドまたはタ
ンパクは天然に生ずるエル.イントラセルラリスに対する抗体をスクリーニング
するために使用することができる。また、特異的抗体をエル.イントラセルラリ
スのスクリーニングに使用することができる。このような検定のための技法は当
分野でよく知られており、例えば、サンドイッチ検定およびELISAが挙げら
れる。今後、免疫原成分はエル.イントラセルラリスの免疫原成分を含みそして
組換え分子、全細胞および細胞抽出物を含むものと考える。
本発明のこの側面と一致して、免疫原成分はエル.イントラセルラリスに対す
る抗体をスクリーニングするのに特に有用である。従って、エル.イントラセル
ラリス感染を検出するための診断プロトコールを提供する。また、免疫原成分に
対して作成された抗体を用いて、生物試料を直接エル.イントラセルラリスのス
クリーニングに使用することができる。
従って、該ブタ由来の生物試料を免疫原成分−抗体複合体が形成するのに十分
な時間および条件の下で免疫原成分と結合する有効量の抗体と接触させる工程、
および該複合体を検出する工程を含んで成る、ブタのエル.イントラセルラリス
感染を診断する方法が提供される。
ブタの血液、血清、または他の体液中に免疫原成分(またはそれに対する抗体
)が存在することは、米国特許第4,016, 043号、第4,424,27
9号および第4,018,653号に記載されている方法などの広範囲の免疫検
定法を使用して検出することができる。これには、非−競争型の1−部位検定お
よび2−部位検定、すなわち「サンドイッチ」検定の両方、並びに従来の競争的
結合試験が含まれる。サンドイッチ検定は最も有用な検定の一つでありそして普
通に使用されている検定でありそして本発明でも使用するのが好ましい。サンド
イッチ検定法の変法が幾つもあるが、すべて本発明に含まれることになる。
簡単に述べれば、典型的なホワード検定では、免疫原成分に特異的な抗体を固
体基質上に固定化して第1の複合体を形成させ、そし
て免疫原成分についてテストされるべき試料をこの結合分子と接触させる。適当
なインキュベーション期間、すなわち、抗体−免疫原成分の第2の複合体を形成
させるのに十分な時間の後、検出可能なシグナルを生産することができるレポー
ター分子で標識化した第2の免疫原成分抗体を次に添加しそして三次複合体を形
成させるのに十分な時間インキュベートする。未反応物質はすべて洗い流し、結
合した標識化抗体の存在をレポーター分子が生産するシグナルの観察により測定
する。この結果は肉眼で見えるシグナルの単純な観察による定性的なものとも、
対照試料と比較することによる定量的なものともすることができる。本発明は、
例えば、エル.イントラセルラリス由来の組換えペプチド、ポリペプチドまたは
タンパクを用いるこの微生物の抗体の検定を含む主体検定に対する一連の変法を
提供する。
固体基質は典型的にはガラスまたはポリマーであり、最も普通に使用されるポ
リマーはセルローズ、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化
ビニル、またはポリプロピレンである。固体支持体は管状、ビーズ状、ディスク
状または微小板状、または免疫検定を行うのに適する他の表面であってもよい。
結合プロセスは当分野でよく知られており、一般には不溶性の担体にこの分子を
架橋的に共有結合させること、または物理的に吸着させることからなる。
本出願において使用するとき、「レポーター分子」とは、その化学的性質によ
り、抗原−結合抗体を検出させる分析的に同定可能なシグナルを生産する分子を
意味する。検出は定性的でも定量的でも
よい。この種の検定で最も普通に用いられるレポーター分子は酵素、発蛍光団ま
たは分子を含む放射性核種(すなわち、放射性同位元素)のいずれかである。酵
素免疫検定の場合には、酵素を第2の抗体に、一般にはグルタルアルデヒドまた
は過ヨウ素酸塩を用いて結合させる。しかしながら、容易に認められるように、
当分野の熟練した者に容易に利用可能な極めて多様な異種の結合技術が存在する
。普通に使用される酵素には、中でもホースラディッシュペルオキシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが
含まれる。これらの特定の酵素と共に使用される基質は、一般に、対応する酵素
による加水分解の際の検出可能な色調変化の形成により選択される。蛍光性生産
物を生ずる蛍光原基質を使用することも可能である。
また、フルオレセインやローダミンなどの蛍光性化合物を抗体の結合能力を変
えることなく抗体に化学的に結合させることができる。特定波長の光で照射する
ことにより活性化すると、蛍光色素−標識化抗体は光エネルギーを吸収し、分子
の励起状態を誘発し、次いで光学顕微鏡で肉眼で検出可能な特徴的な色の光を放
出する。EIAにおけると同様に、蛍光標識抗体を第1の抗体−ハプテン複合体
に結合させる。未結合の試薬を洗い流した後、次に残っている3重複合体を適当
な波長の光に曝すと、観察される蛍光は目的のハプテンの存在の証拠となる。免
疫蛍光技法とEIA技法は共に当分野で極めてよく確立されており、本発明には
特に好ましい。しかながら、放射性同位元素などの他のレポーター分子、化学発
光性分子または生物発光性分子も使用することができる。必要な目的に適合させ
るためこれらの手順を如何に変えるべきかは熟練した技術者には容
易に明らかとなる。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)検定、ハイブリッド形成検定またはタンパク
切断検定(protein truncation)などの一連の遺伝子診断検定を使用することが
できる。このような検定はすべて本発明で予定される。
本発明はさらに下記の非限定的図面および/または実施例により説明する。図面
図1はワクチン注射されたブタにより認識されるエル.イントラセルラリス抗
原のウエスタン分析を示す写真である。トラック1(395)は、エル.イント
ラセルラリス全細胞のホルマリン死菌ワクチンで3回免疫されたブタ(395)
からのブタ血清でプローブしたものである。トラック2からトラック5まで(Y
10、Y12、Y14、Y16)はそれぞれ0日目にブタY10、Y12、Y1
4およびY16から得た血清でプローブしたものである。
図2はブタY1から20日目に得た小腸の写真である。
図3はブタY2から20日目に得た小腸の写真である。
図4はブタY4から20日目に得た小腸の写真である。
アミノ酸残基に対しては下記の1文字および3文字略号を使用する 実施例1
ブタ組織の起源感染したブタ小腸
肉眼で厚くなっている回腸の切片を自然のブタまたはPPEを実験的に感染さ
せたブタから採取した。回腸中にエル.イントラセルラリス細菌が存在すること
は特異的モノクローン抗体を用いる免疫蛍光染色で確認した(10)。適当な抗
体の一例は、英国エジンバラ大学から入手可能なモノクローン抗体IG4である
。
実施例2
感染したブタ回腸から細菌ローソニア・イントラセルラリスの単離
細菌ローソニア・イントラセルラリスはろ過によりブタのPPE病巣から直接
抽出し、パーコル(ファルマシア、ウプサラ、スエーデン)勾配上でさらに精製
した。感染した回腸をブタから集め、エル.イントラセルラリスの存在を組織学
的に確認した後−80℃に貯蔵した。回腸の切片を融解し、約8gの感染した粘
膜を腸壁から剥離した。この粘膜をサーバルオムニミキサーを用いて40ml滅
菌リン酸緩衝化食塩水(PBS)と共に半速度で10秒間ホモジナイズした。こ
の懸濁液を2000×gで4分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを4
0mlPBSに再懸濁し、再遠心分離した。この洗浄工程を2回繰り返した。細
胞ペレットを、次いで、20mlPBSに再懸濁し、エル.イントラセルラリス
細菌を放出させるため全速で1分間ホモジナイズした。
このホモジネートを1000×gで4分間遠心分離するとホモジナイズされた
上皮細胞と腸内細菌の粗混合物を含むペレットが得られた。ポアサイズ3μm、
1.2μmおよび0.8μm(ミリポアコーポレーション、MA、USA)のフ
ィルターを用いてこの上清をろ過した。ろ液を8000×gで30分間遠心分離
すると、エル.イントラセルラリス細菌の小さなペレットが得られた。以下に述
べるように、45%自己形成パーコル勾配を用いて、このエル.イントラセルラ
リス細菌をさらに精製した。すなわち、2mlの細菌調製物を30mlの45%
自己形成パーコル(ファルマシアLKB、ウプサラ、スエーデン)勾配(45%
v/vパーコル、150mMのNaCl)中に逆さにして混合した。この勾配を
SS34ローター、サーバル遠心分離機を用い、4℃、30分間20,000r
pmで遠心分離した。通常、何本かのバンドが勾配内に生ずる。エル.イントラ
セルラリス細菌を含むバンド(通常管の底から約10〜20mmに位置する)を
集め、PBSで16mlの容積にした。次いで、この溶液を8000rpmで1
5分間遠心分離した。その結果得られるペレットをPBSで洗浄し、約1mlの
最終容積になるように再懸濁した。
実施例3
ローソニア・イントラセルラリスのゲノムDNAの精製
アンダーソンら(11)およびサムブルックら(12)により記述された方法
で、感染ブタ回腸剥離物(実施例2)から回収され、パーコル−勾配で精製され
たローソニア・イントラセルラリス細菌からゲノムDNAを抽出した。実施例4
ゲノムライブラリーの免疫スクリーニング
ラムダZAPIIエル.イントラセルラリスゲノムライブラリーを大腸菌XLI
−ブルー(23)細胞の菌叢の上に2,000プラーク形成ユニット(pfu)
/150mmL−ブロス寒天プレートの密度で接種した。このライブラリーをプ
ロトブロット・テクニカル・マニュアル(プロメガ、WI、USA)に記載され
ている方法を用いてウサギ抗−エル.イントラセルラリス血清でスクリーニング
した。フィルターを10mMトリス−塩酸、pH8.0、150mM塩化ナトリ
ウム、0.05%トゥイーン20、1%w/wゼラチンを含む緩衝液中でブロッ
クした。一次スクリーニングで同定された陽性プラークを釣り上げ、低密度で再
接種し、個々の陽性プラークが同定されるまで再スクリーニングした。
実施例5
cDNA挿入物の単離と配列決定
λZAPIIファージクローンからファージ中央のDNAをストラタジーン(C
A、USA)により推奨された条件の下でpブルースクリプトファージミドのイ
ン・ビボ切断により単離した。プラスミドDNAをバーンボイムおよびドーりの
方法により抽出し、cDNA挿入物を鎖終結法(21)により配列決定するか、
またはPEG−沈澱法により抽出し、製造業者(アプライド・バイオシステムズ
)により推奨されたように色素−終結法によりサイクル−配列決定
を行った。
実施例6
抗血清
エル.イントラセルラリス細菌に対する抗血清をウサギおよびブタで形成させ
た。ウサギにはパーコル勾配で精製したエル.イントラセルラリス細菌調製物を
油アジュバント(フロイントの不完全アジュバント、CSLリミティッド、メル
ボルン、オーストラリア)で処理することにより作成された二重−エマルション
と混合して筋肉内に注射し、次いでトゥイーン80増強剤を注射した。9mgタ
ンパクを含む、3ml注射2回を4週間離して投与した。免疫化の前および第2
回目の注射の後2週間目に耳の縁の血管から血液試料を採取した。
ウサギの場合と同様にフロイントの不完全アジュバントで調製されたパーコル
勾配精製エル.イントラセルラリス細菌を筋肉内注射することにより、6週令の
ブタ(395)を高免疫化した。調製された抗原の注射3回を4週間の間隔で投
与し、そして最終注射の2週間後に血液を頸静脈から採集した。希釈されたブタ
血清(1ml、1/200)は100μlの大腸菌DH5α(24)溶菌液を穏
和にかき混ぜながら室温で1時間予め吸収させた。この溶菌液は大腸菌のPBS
懸濁液を凍結融解させることにより調製された。
実施例7
硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(SDS−PAGE)
タンパク試料を50μlの試料緩衝液(62.4mMHC1、2%w/vSD
S、10%v/vグリセロール、5%v/v20メルカプトエタノール、0.0
02%ブロモフェノールブルー、pH6.8)に再懸濁し、95℃まで5分間加
熱した後、0.1%w/vSDS−12%w/vPAGE垂直スラブゲル(13
)上で電気泳動的に可溶化タンパクを分離した。
実施例8
ウエスタン ブロット
CAPS(3−〔シクロヘキシルアミノ〕−1−プロパンスルホン酸、pH1
1、シグマ、MI、USA)および10%v/vメタノールをふくむ緩衝液中、
100Vで1時間電気泳動的することにより、タンパクをトランス−ブロット・
セル(バイオラド、CA、USA)中のイムモビロン−P(ミリポア・コーポレ
ーション、MA、USA)膜に移動させた。次いで、この膜を室温で30分間軽
くゆすりながらブロット(ディプロマ・スキムミルク粉末、メルボルン、オース
トラリア)の5%w/vPBS溶液でブロックした。次いで、このフィルターを
ブロットの5%w/vPBS溶液で希釈した抗血清に移した。予め吸収されたブ
タ血清は1/200に希釈された。このフィルターをブタ血清中で1時間インキ
ュベートした後PBSTで3回洗浄した。
HRP結合抗−ブタ免疫グロブリン(ダコ、CA、USA)は1/2000の
希釈で使用した。化学発光の増強(ECL、アマシャム、IL、USA)をエル
.イントラセルラリスタンパクの識別に使用した。ECL検出に先立って、ブロ
ットを3回それぞれ7分間洗浄した。このフィルターを1分間未満オートラジオ
グラフィー用フィルム(アグファ、NJ、USA)に曝した後、現像した。
実施例9
GroELおよびGroESの同定
実施例4に記述された免疫スクリーニング法により陽性であることが見出され
たクローンを、実施例5で詳細に述べたプロトコールを用いて配列決定を行った
。単離された一つのクローンはGroELタンパクを表していた。GroELの
ヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は配列番号:1および配列番号:
2に示す。単離された別のクローンはGroESタンパクを表していた。Gro
ESのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は配列番号:3および配列
番号:4に示す。
実施例10
ローソニア・イントラセルラリスの免疫蛍光検出
ブタ糞中の細菌
綿棒の消毒綿を用いてブタの糞を拭き取り、次いでこの試料をスライドグラス
上に塗った。10分間風乾させた後、60℃まで約10秒間加熱して塗布部を熱
固定した。次いで、このスライドをPB
Sでリンスした。IG−4モノクローン抗体(実施例1参照)を含むマウスの腹
水の1/200希釈液30μlを添加し、ガラスカバーを乗せ、スライドを室温
で40分間インキュベートした。ガラスカバーを除き、スライドを洗浄した(P
BSTで7分間、3回)。FITC結合抗−マウス抗血清(シレヌス、メルボル
ン、オーストラリア)の1/40希釈液30μlを添加し、ガラスカバーを乗せ
、スライドを室温で40分間インキュベートした。ガラスカバーを除き、スライ
ドを洗浄した(PBSTで7分間、3回)。このスライドはPBSで最後のリン
スを行った。グリセロールの10%v/vPBS溶液1滴を添加し、ガラスカバ
ーを乗せた。蛍光性細菌はライツ・ラポラックスS顕微鏡を用い340nmで高
倍率(×1200)の下で可視化された。20の視野を数え、結果(表1参照)
を高倍率視野当たりのエル.イントラセルラリス細菌の平均数として表した。
実施例11
エル.イントラセルラリスのホルマリン死滅ワクチン
パーコル勾配で精製したエル.イントラセルラリス細菌ペレットをホルマリン
の1%食塩水溶液1ml中に再懸濁し、4℃で一晩インキュベートした。次いで
、このパーコル勾配で精製したエル.イントラセルラリス細菌を油アジュバント
(フロイントの不完全アジュバント、コモンウエルス・シーラム・ラボラトリー
ズ、メルボルン、オーストラリア)で処理して作成された二重−エマルション中
に混合し、ついでトゥイーン80増強剤と混合した。実施例12
ワクチン注射のプロトコール
12頭の離乳したブタ(ラージホワイトと交配したランドレース)をピッグ・
インプルーブメント・カンパニーのブタ飼育所から入手し、5日間ネオーテラマ
イシン(0.25g/キロ)で処理した。7日後に(−40日)、ブタY10、
Y12、Y14およびY16を記述したようにワクチン注射した。ブタY3、Y
11およびY13は−34日に長期間作用するテラマイシンで膿瘍を治療した。
12頭のブタを3グループに分け、次のように処置した。
グループ1 感染した対照
4頭のブタ(耳札番号Y1〜Y4)はワクチン注射したブタと一緒に飼育した
。
グループ2 全細菌ワクチン
4頭のブタ(耳札番号Y10、Y12、Y14およびY16)を−33日およ
び−12日に0.5m1のPBS/フロイント不完全アジュバント中でエマルシ
ョンとしたホルマリン死滅エル.イントラセルラリス細菌の0.5mlで免疫化
した。
グループ3 未感染対照
4頭のブタ(耳札番号Y9、Y11、Y13およびY15)は処置を受けなか
った。そしてワクチン注射したブタおよび感染した対照ブタとは別の領域で飼育
した。実施例13
感染ブタへの経ロチャレンジ
実施例1に記述したようにブタから感染した回腸を採取し、そしてエル.イント
ラセルラリスの存在を組織学的に確認した後−80℃に貯蔵した。回腸の切片を
融解し、約150gの感染した粘膜を腸壁から剥離した。粘膜を等容量の滅菌P
BSと共にサーバルオムニミキサーを用い半速度で20秒間ホモジナイズした。
この懸濁液を滅菌PBSで2倍希釈してチャレンジ用懸濁液を作成した。
0日にグループ1および2からの各ブタに5%w/v重炭酸ナトリウム水(1
0ml/kg)を投与した後、チャレンジ懸濁液30mlを投与した。これを1
日と2日に繰り返した。
11日から後、各ブタの糞中のエル.イントラセルラリス細菌の数を免疫蛍光
により監視した。病気の徴候およびエル.イントラセルラリス細菌の排出につい
てブタを監視した。高倍率視野当たり100細菌より多く排出するブタおよび下
痢をしている(scouring)ブタは倫理的な理由で屠殺した。
22日に、生存しているブタを人力で殺し、小腸を回収した。小腸の回盲接合
部から約5cmおよび17cmの場所の二つの切片を切除した。これらの切片を
10%v/vホルマリンで固定し、ワックス中に埋め込み、そして切片を分析の
ため独立の家畜病理学者に送った。実施例14
ワクチン注射したブタにより認識される
ローソニア・イントラセルラリスのタンパク
ワクチン注射後のブタにより形成されるエル.イントラセルラリスタンパクに
対する抗体は、実施例8で記述したようにウエスタン・ブロットの後のECL(
アマシャム、IL、USA)検出により分析した。その結果を図1に示す。ワク
チン注射したブタは一連のエル.イントラセルラリスタンパクに対する抗体を生
産する。認識された最も免疫優性のタンパクは約62.7KDa、58.7KD
a、57.2KDa、44KDa、36.7KDaであり、そして24〜26K
Daおよび22〜23.5KDaの二つのしみである。マイナーな免疫反応性の
バンドは次の分子量に近い値を有していた、すなわち、67KDa、52.5K
Da、50.5KDa、50KDa、48.2KDa、47.9KDa、44.
7KDa、43.5KDa、42.5KDa、41.5KDa、40.5KDa
、39KDa、35.3KDa、17KDa、15.5KDa、12KDaおよ
び7KDaである。認識されたタンパクの分子量は評価方法により5%まで変動
するであろう。
実施例15
試験の間にブタによるエル.イントラセルラリス細菌の排出
実施例番号12のグループ1(感染させた対照)の3頭のブタ(Y1、Y2お
よびY4)は、経ロチャレンジの19日後までにその糞に高倍率視野当たりエル
.イントラセルラリス細菌を100個よ
り多く排出した(表1)。これらのブタのうちの2頭(Y2およびY4)は血便
をした。3頭のブタはすべて20日に人力で殺した。
Y3は感染実験の過程の間エル.イントラセルラリス細菌を低レベルで排出した
。Y3の最大細菌排出は高倍率視野当たり16細菌であった。
実施例12に記述したように全細菌でワクチン注射したグループ3のブタはす
べて、高倍率視野当たりエル.イントラセルラリス細菌を3個より多く排出する
ことはなかった。エル.イントラセルラリスのホルマリン死滅菌ワクチンをワク
チン注射すると、ワクチン注射されたブタによるエル.イントラセルラリス細菌
の総細菌排出数をグループ1のブタに比べると98.5%も減少した。
グループ3のブタ(非感染対照)はいずれも実験の過程でエル.イントラセル
ラリス細菌を全く排出しなかった。
ブタ当たりのエル.イントラセルラリス細菌の排出の結果は表1に示す。
実施例16
実験Aに対する肉眼的病理学
グループ1 感染した対照群
Y1 末端の回腸のほぼ5cmを肉眼で厚くなっていた。PPEの徴候は巨視的
には全く明らかでなかった。所見は腸の腺腫症と一致している(図2参照)。
Y2 腸は肉眼で厚くなっていることが分かった。そして漿膜は特徴的なセレブ
リフォーム型(cerebriform form)(図3)を有していた。腸の2.5mを越え
る部分が関与していた。腸の管腔は新鮮な血液を含むことが見出された。そして
線維素性の円柱が明らかであった。
増殖性出血性腸症。
Y3 PPEの肉眼的徴候は明らかでなかった。
Y4 腸は壊死性腸炎を有することが見出された(図4)。その粘膜表面は線維
状の偽膜で置き代わっていた。腸間膜の浮腫は明瞭に認められた。腸の2.0m
を越える部分が関与していた。
グループ2 エル.イントラセルラリスの全細胞ワクチン
Y10 PPEの肉眼的徴候はなかった。
Y12 PPEの肉眼的徴候はなかった。
Y14 PPEの肉眼的徴候はなかった。
Y16 PPEの肉眼的徴候はなかった。
グループ3 非感染対照
Y9 PPEの肉眼的徴候はなかった。
Y11 PPEの肉眼的徴候はなかった。
Y13 PPEの肉眼的徴候はなかった。
Y15 PPEの肉眼的徴候はなかった。
実施例17
実験に対する組織病理学報告
報告はジャブら(20)による確立された組織病理学的記載に基づいている。
グループ1 感染した対照群
Y1 ブタ腸腺腫症(PIA)の無数の微小点状/全面を覆った病巣がパイヤー
ス・パッチーズ(Peyers Patches)と関連している。
Y2 ブタ腸腺腫症の重い一般化した(環状の)病巣。
Y3 PIAの決定的な証拠はない。非特異的な軽度の反応性(修復用の)増殖
(腺腫症ではなく)を示唆するまばらな微小点状病巣。
Y4 PIAの重い一般化した(環状の)病巣。
グループ2 エル.イントラセルラリス全細胞ワクチン
Y10 PIAの決定的な証拠はない。
Y12 PIAの決定的な証拠はない。
Y14 PIAの決定的な証拠はない。
Y16 PIAの決定的な証拠はない。PIAの可能性のある1個の微小点がパ
イヤース・パッチーズと関連している。
グループ3 非感染対照群
Y11 PIAの決定的証拠はない。
Y9 PIAの決定的証拠はない。
Y13 このブタは15日目に跛行のため殺したので腸は回収されなかった。
Y15 切片の状態が不良のため診断できなかった。
実施例18
ワクチン注射したブタから得た実験的血清を用いる
エル.イントラセルラリスライブラリーの免疫スクリーニング
エル.イントラセルラリスのゲノムDNAは実施例3に記述したように精製した
。このDNAを制限酵素Sau3A(プロメガ)で部分的に消化し、ラムダZA
PII発現(ストラタジーン)中に連結した。このラムダ・ライブラリーを大腸菌
XLI−ブルー細胞の菌叢上に150mmのL−ブロス寒天プレート当たり10
,000pfuの密度で接種した。実施例4に記述したように、Y12からの血
清を用いてこのライブラリーをスクリーニングした。ブタY12は実施例11お
よび実施例12に記述したように、エル.イントラセルラリスのホルマリン死滅
細胞で免疫化された。ワクチン注射されたブタは、実施例14に記述したように
、一連のエル.イントラセルラリス・タンパクに対する抗体を生産した。エル.
イントラセルラリス・タンパクを発現する多数のファージクローンを同定した。
実施例19
エル.イントラセルラリスを発現するファージクローンの解析
陽性のラムダZAPII発現ファージクローンからのファージ中のDNAを、製
造業者(ストラタジーン)が推奨する条件でイン・ビボ切断により単離した。制
限分析のため、そしてハイ・ピュア・プ
ラスミド・キットを用いて製造業者(ベーリンガー・マンハイム)が推奨するよ
うに自動配列決定を行うため、プラスミドDNAを、サムブルックら(12)が
記述したように、アルカリ−溶解により抽出した。挿入物のDNA配列決定は自
動配列決定の色素−終結法(ABIバイオシステムズ)により行った。同定され
た配列は配列番号:5〜配列番号:23に記載されている(実施例20参照)。
実施例20
エル.イントラセルラリス成分の同定
推定的なワクチン候補をコードするDNA分子の配列類似性が実施例18およ
び実施例19から同定され、そしてBLAST(27)を用いて同定された。配
列番号:6のヌクレオチド配列および配列番号:7の対応するアミノ酸配列は鞭
毛基条タンパクと配列類似性を有する。配列番号:8(ヌクレオチド)と配列番
号:9および10(アミノ酸)はオートリシン(自己消化酵素)と配列類似性を
有する。配列番号:11(ヌクレオチド)と配列番号:12(アミノ酸)はS−
アデノシルメチオニン:tRNAリボシルトランスフェラーゼ−イソメラーゼ(
キューオシン生合成タンパク queA)と配列類似性を示す。
配列番号:13(ヌクレオチド)と配列番号:14(アミノ酸)はエノイル−
(アシル−キャリア−タンパク)レダクターゼと配列類似性を示す。配列番号:
15(ヌクレオチド)と配列番号:16(アミノ酸)はグルカレート・トランス
ポーターと配列類似性を示
す。推定的ワクチン候補をコードする他のヌクレオチド配列は配列番号:5、配
列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:
21、配列番号:22および配列番号:23である。
当分野で熟練した者は本明細書に記載された発明が具体的に記述されたもの以
外の変更や修飾が可能であることを認めるであろう。本発明はこのような変更お
よび修飾をすべて包含するものと理解されるべきである。本発明は本明細書で個
々にまたは集合的に言及しあるいは指摘した工程、特徴、組成物および化合物の
すべて、そして該工程または特徴の二つ以上の如何なる組み合わせをも包含する
° 文献
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家畜の病理学」、第3版、第2巻、1-237 頁、ケイ.ブイ.エフ.ジャブ、ピー
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C12N 1/20 C12N 1/20 A
15/09 ZNA 15/00 ZNAA
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ
,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,
CU,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,G
E,HU,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR
,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,
MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,P
L,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK
,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,
VN
(72)発明者 マイケル パナッキオ
オーストラリア国、ビクトリア 3104、ノ
ースボールウイン、ヒル ロード 122番
地
(72)発明者 ディートレフ ハッセ
オーストラリア国、ビクトリア 3429、サ
ンベリ、スカリン コート 4番地
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 動物または鳥類のローソニア・イントラセルラリス(Lawsonia intracellu laris)または類縁微生物による感染を予防または治療するワクチン組成物であっ て、エル.イントラセルラリスまたは類縁微生物の免疫原性を持つ非病原型ある いはそれらの免疫原性成分および獣医学的または薬学的用途に適する一つ以上の 担体、希釈剤および/またはアジュバントを含んで成るワクチン組成物。 2. この組成物がエル.イントラセルラリスまたは類縁微生物によるブタ感染 の予防または治療用である、請求項1記載のワクチン組成物。 3. エル.イントラセルラリスまたは類縁微生物の非病原型がこの微生物の弱 毒化された株である、請求項2記載のワクチン組成物。 4. エル.イントラセルラリスまたは類縁微生物の非病原型がこの微生物の死 菌調製物である、請求項2記載のワクチン組成物。 5. エル.イントラセルラリスの非病原型がこの微生物のホルマリンによる死 菌調製物である、請求項4記載のワクチン組成物。 6. 該組成物がエル.イントラセルラリスまたは類縁微生物由来のペプチド、 ポリペプチド、タンパク、炭水化物、脂質または核酸の分子またはそれらの組み 合わせをエル.イントラセルラリスまた は類縁微生物に対し防御的免疫反応を誘発するのに有効な量で含んでいるもので ある、請求項1または請求項2記載のワクチン組成物。 7. この組成物がエル.イントラセルラリスまたは類縁微生物由来のペプチド 、ポリペプチド、タンパクまたはそれらの誘導体を含むものである、請求項6記 載のワクチン組成物。 8. ペプチド、ポリペプチドまたはタンパクが組換え型である、請求項7記載 のワクチン組成物。 9. この組成物がリホールディング/ヒートショックタンパク、鞭毛基条タン パク、S−アデノシルメチオニン:tRNAリボシルトランスフェラーゼ−イソ メラーゼ、オートリシン、エノイル−(アシル−キャリア−タンパク)レダクタ ーゼまたはグルカレート・トランスポーターまたはそれらの誘導体を含むもので ある、請求項7または請求項8記載のワクチン組成物。 10. そのタンパクが配列番号:2に記載されたアミノ酸配列を有するGro ELである、またはそれに少なくとも約40%の類似性を有するタンパクである 、請求項9記載のワクチン組成物。 11. そのタンパクが配列番号:4に記載されたアミノ酸配列を有するGro ESである、またはそれに少なくとも約40%の類似性を有するタンパクである 、請求項9記載のワクチン組成物。 12. その組成物が配列番号:1を含むヌクレオチド配列またはそれに少なく とも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペブチド またはタンパクを含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 13. その組成物が配列番号:3を含むヌクレオチド配列またはそれに少なく とも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチド またはタンパクを含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 14. その組成物が配列番号:5を含むヌクレオチド配列またはそれに少なく とも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチド またはタンパクを含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 15. その組成物が配列番号:6を含むヌクレオチド配列またはそれに少なく とも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチド またはタンパクを含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 16. その組成物が配列番号:8を含むヌクレオチド配列またはそれに少なく とも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチド またはタンパクを含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 17. その組成物が配列番号:11を含むヌクレオチド配列また はそれに少なくとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるぺプチド 、ポリペプチドまたはタンパクを含んで成るものである、請求項8記載のワクチ ン組成物。 18. その組成物が配列番号:13を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 19. その組成物が配列番号:15を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 20. その組成物が配列番号:17を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 21. その組成物が配列番号:18を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 22. その組成物が配列番号:19を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードさ れるペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを含んで成るものである、請求項8 記載のワクチン組成物。 23. その組成物が配列番号:20を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 24. その組成物が配列番号:21を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 25. その組成物が配列番号:22を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 26. その組成物が配列番号:7のアミノ酸配列またはそれに少なくとも約4 0%の類似性を有する配列を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを含 んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 27. その組成物が配列番号:9のアミノ酸配列またはそれに少なくとも約4 0%の類似性を有する配列を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを含 んで成るものである、請求項8記載のワ クチン組成物。 28. その組成物が配列番号:10のアミノ酸配列またはそれに少なくとも約 40%の類似性を有する配列を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを 含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 29. その組成物が配列番号:12のアミノ酸配列またはそれに少なくとも約 40%の類似性を有する配列を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを 含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 30. その組成物が配列番号:14のアミノ酸配列またはそれに少なくとも約 40%の類似性を有する配列を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを 含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 31. その組成物が配列番号:16のアミノ酸配列またはそれに少なくとも約 40%の類似性を有する配列を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを 含んで成るものである、請求項8記載のワクチン組成物。 32. エル.イントラセルラリスまたは類縁微生物による感染を防御するため 動物または鳥にワクチン注射をする方法またはエル.イントラセルラリスに感染 した動物または鳥を治療する方法であって、該動物または鳥にエル.イントラセ ルラリスまたは類縁微生物 の非病原型またはその免疫原成分の有効量をエル.イントラセルラリスまたは類 縁微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに十分な時間および条件の下で投 与することを含んで成る方法。 33. その動物がブタである、請求項32記載の方法。 34. エル.イントラセルラリスまたは類縁微生物の非病原型がこの微生物の 弱毒化株である、請求項33記載の方法。 35. エル.イントラセルラリスまたは類縁微生物の非病原型がこの微生物の 死菌調製物である、請求項33記載の方法。 36. エル.イントラセルラリスの非病原型がこの微生物のホルマリンによる 死菌調製物である、請求項35記載の方法。 37. 該免疫原成分がエル.イントラセルラリスまたは類縁微生物由来のペプ チド、ポリペプチド、タンパク、炭水化物、脂質または核酸の分子またはそれら の組み合わせを、エル.イントラセルラリスまたは類縁微生物に対する防御的免 疫反応を誘導するのに有効な量で含むものである、請求項32または請求項33 記載の方法。 38. 該免疫原成分がエル.イントラセルラリスまたは類縁微生物由来のペプ チド、ポリペプチド、タンパクまたはそれらの誘導体を含むものである、請求項 37記載の方法。 39. このペプチド、ポリペプチドまたはタンパクが組換え型である、請求項 38記載の方法。 40. この免疫原成分がリホールディング/ヒートショックタンパク、鞭毛基 条タンパク、S−アデノシルメチオニン:tRNAリボシルトランスフェラーゼ −イソメラーゼ、オートリシン、エノイル−(アシル−キャリア−タンパク)レ ダクターゼまたはグルカレート・トランスポーターまたはそれらの誘導体である 、請求項29または請求項30記載の方法。 41. このタンパクが配列番号:2に記載されたアミノ酸配列を有するGro ELである、あるいはそれに少なくとも約40%の類似性を有するタンパクであ る、請求項40記載の方法。 42. このタンパクが配列番号:4に記載されたアミノ酸配列を有するGro ESである、あるいはそれに少なくとも約40%の類似性を有するタンパクであ る、請求項40記載の方法。 43. 免疫原成分が配列番号:1を含むヌクレオチド配列またはそれに少なく とも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチド またはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 44. 免疫原成分が配列番号:3を含むヌクレオチド配列またはそれに少なく とも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチド またはタンパクを含むものである、請求 項38記載の方法。 45. 免疫原成分が配列番号:5を含むヌクレオチド配列またはそれに少なく とも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチド またはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 46. 免疫原成分が配列番号:6を含むヌクレオチド配列またはそれに少なく とも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチド またはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 47. 免疫原成分が配列番号:8を含むヌクレオチド配列またはそれに少なく とも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチド またはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 48. 免疫原成分が配列番号:11を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 49. 免疫原成分が配列番号:13を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 50. 免疫原成分が配列番号:15を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 51. 免疫原成分が配列番号:17を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 52. 免疫原成分が配列番号:18を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 53. 免疫原成分が配列番号:19を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 54. 免疫原成分が配列番号:20を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 55. 免疫原成分が配列番号:21を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 56. 免疫原成分が配列番号:22を含むヌクレオチド配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有する配列によりコードされるペプチド、ポリペプチ ドまたはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 57. 免疫原成分が配列番号:7に記載されたアミノ酸配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、ポリペプチドま たはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 58. 免疫原成分が配列番号:9に記載されたアミノ酸配列またはそれに少な くとも約40%の類似性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、ポリペプチドま たはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 59. 免疫原成分が配列番号:10に記載されたアミノ酸配列またはそれに少 なくとも約40%の類似性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、ポリペプチド またはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 60. 免疫原成分が配列番号:12に記載されたアミノ酸配列ま たはそれに少なくとも約40%の類似性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、 ポリペプチドまたはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 61. 免疫原成分が配列番号:14に記載されたアミノ酸配列またはそれに少 なくとも約40%の類似性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、ポリペプチド またはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 62. 免疫原成分が配列番号:16に記載されたアミノ酸配列またはそれに少 なくとも約40%の類似性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、ポリペプチド またはタンパクを含むものである、請求項38記載の方法。 63. 配列番号:1に記載されたヌクレオチド配列または配列番号:1に記載 されたヌクレオチド配列に少なくとも40%の類似性を有し、そして低厳格条件 下でそれとハイブリッドを形成することができ、そしてエル.イントラセルラリ スまたは類縁微生物由来の免疫原性のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを コードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。 64. 配列番号:3に記載されたヌクレオチド配列または配列番号:3に記載 されたヌクレオチド配列に少なくとも40%の類似性を有し、そして低厳格条件 下でそれとハイブリッドを形成することができ、そしてエル.イントラセルラリ スまたは類縁微生物由来の免疫原性のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを コードするヌ クレオチド配列を含む単離された核酸分子。 65. 配列番号:5に記載されたヌクレオチド配列または配列番号:5に記載 されたヌクレオチド配列に少なくとも40%の類似性を有し、そして低厳格条件 下でそれとハイブリッドを形成することができ、そしてエル.イントラセルラリ スまたは類縁微生物由来の免疫原性のペブチド、ポリペプチドまたはタンパクを コードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。 66. 配列番号:6に記載されたヌクレオチド配列または配列番号:6に記載 されたヌクレオチド配列に少なくとも40%の類似性を有し、そして低厳格条件 下でそれとハイブリッドを形成することができ、そしてエル.イントラセルラリ スまたは類縁微生物由来の免疫原性のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを コードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。 67. 配列番号:8に記載されたヌクレオチド配列または配列番号:8に記載 されたヌクレオチド配列に少なくとも40%の類似性を有し、そして低厳格条件 下でそれとハイブリッドを形成することができ、そしてエル.イントラセルラリ スまたは類縁微生物由来の免疫原性のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを コードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。 68. 配列番号:11に記載されたヌクレオチド配列または配列番号:11に 記載されたヌクレオチド配列に少なくとも40%の類似性を有し、そして低厳格 条件下でそれとハイブリッドを形成する ことができ、そしてエル.イントラセルラリスまたは類縁微生物由来の免疫原性 のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクをコードするヌクレオチド配列を含む 単離された核酸分子。 69. 配列番号:13に記載されたヌクレオチド配列または配列番号:13に 記載されたヌクレオチド配列に少なくとも40%の類似性を有し、そして低厳格 条件下でそれとハイブリッドを形成することができ、そしてエル.イントラセル ラリスまたは類縁微生物由来の免疫原性のペプチド、ポリペプチドまたはタンパ クをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。 70. 配列番号:15に記載されたヌクレオチド配列または配列番号:15に 記載されたヌクレオチド配列に少なくとも40%の類似性を有し、そして低厳格 条件下でそれとハイブリッドを形成することができ、そしてエル.イントラセル ラリスまたは類縁微生物由来の免疫原性のペプチド、ポリペプチドまたはタンパ クをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。 71. 配列番号:17に記載されたヌクレオチド配列または配列番号:17に 記載されたヌクレオチド配列に少なくとも40%の類似性を有し、そして低厳格 条件下でそれとハイブリッドを形成することができ、そしてエル.イントラセル ラリスまたは類縁微生物由来の免疫原性のペブチド、ポリペプチドまたはタンパ クをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。 72. 配列番号:18に記載されたヌクレオチド配列または配列 番号:18に記載されたヌクレオチド配列に少なくとも40%の類似性を有し、 そして低厳格条件下でそれとハイブリッドを形成することができ、そしてエル. イントラセルラリスまたは類縁微生物由来の免疫原性のペプチド、ポリペプチド またはタンパクをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。 73. 配列番号:19に記載されたヌクレオチド配列または配列番号:19に 記載されたヌクレオチド配列に少なくとも40%の類似性を有し、そして低厳格 条件下でそれとハイブリッドを形成することができ、そしてエル.イントラセル ラリスまたは類縁微生物由来の免疫原性のペプチド、ポリペプチドまたはタンパ クをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。 74. 配列番号:20に記載されたヌクレオチド配列または配列番号:20に 記載されたヌクレオチド配列に少なくとも40%の類似性を有し、そして低厳格 条件下でそれとハイブリッドを形成することができ、そしてエル.イントラセル ラリスまたは類縁微生物由来の免疫原性のペプチド、ポリペプチドまたはタンパ クをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。 75. 配列番号:21に記載されたヌクレオチド配列または配列番号:21に 記載されたヌクレオチド配列に少なくとも40%の類似性を有し、そして低厳格 条件下でそれとハイブリッドを形成することができ、そしてエル.イントラセル ラリスまたは類縁微生物由来の免疫原性のペプチド、ポリペプチドまたはタンパ クをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。 76. 配列番号:22に記載されたヌクレオチド配列または配列番号:22に 記載されたヌクレオチド配列に少なくとも40%の類似性を有し、そして低厳格 条件下でそれとハイブリッドを形成することができ、そしてエル.イントラセル ラリスまたは類縁微生物由来の免疫原性のペプチド、ポリペプチドまたはタンパ クをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。 77. 配列番号:1に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも約 40%の類似性を有するヌクレオチド配列または配列番号:1と低厳格条件下で ハイブリッドを形成することができるヌクレオチド配列を有するDNA配列を含 んで成る遺伝子ワクチンであって、該DNA配列がブタ中で発現してエル.イン トラセルラリスまたは類縁微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに有効な 量のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを生産することができるものである 遺伝子ワクチン。 78. 配列番号:3に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも約 40%の類似性を有するヌクレオチド配列または配列番号:3と低厳格条件下で ハイブリッドを形成することができるヌクレオチド配列を有するDNA配列を含 んで成る遺伝子ワクチンであって、該DNA配列がブタ中で発現してエル.イン トラセルラリスまたは類縁微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに有効な 量のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを生産することができるものである 遺伝子ワクチン。 79. 配列番号:5に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも約 40%の類似性を有するヌクレオチド配列または配列番号:5と低厳格条件下で ハイブリッドを形成することができるヌクレオチド配列を有するDNA配列を含 んで成る遺伝子ワクチンであって、該DNA配列がブタ中で発現してエル.イン トラセルラリスまたは類縁微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに有効な 量のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを生産することができるものである 遺伝子ワクチン。 80. 配列番号:6に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも約 40%の類似性を有するヌクレオチド配列または配列番号:6と低厳格条件下で ハイブリッドを形成することができるヌクレオチド配列を有するDNA配列を含 んで成る遺伝子ワクチンであって、該DNA配列がブタ中で発現してエル.イン トラセルラリスまたは類縁微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに有効な 量のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを生産することができるものである 遺伝子ワクチン。 81. 配列番号:8に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも約 40%の類似性を有するヌクレオチド配列または配列番号:8と低厳格条件下で ハイブリッドを形成することができるヌクレオチド配列を有するDNA配列を含 んで成る遺伝子ワクチンであって、該DNA配列がブタ中で発現してエル.イン トラセルラリスまたは類縁微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに有効な 量のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを生産することができるものである 遺伝子ワクチン。 82. 配列番号:11に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも 約40%の類似性を有するヌクレオチド配列または配列番号:11と低厳格条件 下でハイブリッドを形成することができるヌクレオチド配列を有するDNA配列 を含んで成る遺伝子ワクチンであって、該DNA配列がブタ中で発現してエル. イントラセルラリスまたは類縁微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに有 効な量のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを生産することができるもので ある遺伝子ワクチン。 83. 配列番号:13に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも 約40%の類似性を有するヌクレオチド配列または配列番号:13と低厳格条件 下でハイブリッドを形成することができるヌクレオチド配列を有するDNA配列 を含んで成る遺伝子ワクチンであって、該DNA配列がブタ中で発現してエル. イントラセルラリスまたは類縁微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに有 効な量のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを生産することができるもので ある遺伝子ワクチン。 84. 配列番号:15に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも 約40%の類似性を有するヌクレオチド配列または配列番号:15と低厳格条件 下でハイブリッドを形成することができるヌクレオチド配列を有するDNA配列 を含んで成る遺伝子ワクチンであって、該DNA配列がブタ中で発現してエル. イントラセルラリスまたは類縁微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに有 効な量のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを生産することが できるものである遺伝子ワクチン。 85. 配列番号:17に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも 約40%の類似性を有するヌクレオチド配列または配列番号:17と低厳格条件 下でハイブリッドを形成することができるヌクレオチド配列を有するDNA配列 を含んで成る遺伝子ワクチンであって、該DNA配列がブタ中で発現してエル. イントラセルラリスまたは類縁微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに有 効な量のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを生産することができるもので ある遺伝子ワクチン。 86. 配列番号:18に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも 約40%の類似性を有するヌクレオチド配列または配列番号:18と低厳格条件 下でハイブリッドを形成することができるヌクレオチド配列を有するDNA配列 を含んで成る遺伝子ワクチンであって、該DNA配列がブタ中で発現してエル. イントラセルラリスまたは類縁微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに有 効な量のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを生産することができるもので ある遺伝子ワクチン。 87. 配列番号:19に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも 約40%の類似性を有するヌクレオチド配列または配列番号:19と低厳格条件 下でハイブリッドを形成することができるヌクレオチド配列を有するDNA配列 を含んで成る遺伝子ワクチンであって、該DNA配列がブタ中で発現してエル. イントラセルラリスまたは類縁微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに有 効な量のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを生産することができるもので ある遺伝子ワクチン。 88. 配列番号:20に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも 約40%の類似性を有するヌクレオチド配列または配列番号:20と低厳格条件 下でハイブリッドを形成することができるヌクレオチド配列を有するDNA配列 を含んで成る遺伝子ワクチンであって、該DNA配列がブタ中で発現してエル. イントラセルラリスまたは類縁微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに有 効な量のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを生産することができるもので ある遺伝子ワクチン。 89. 配列番号:21に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも 約40%の類似性を有するヌクレオチド配列または配列番号:21と低厳格条件 下でハイブリッドを形成することができるヌクレオチド配列を有するDNA配列 を含んで成る遺伝子ワクチンであって、該DNA配列がブタ中で発現してエル. イントラセルラリスまたは類縁微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに有 効な量のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを生産することができるもので ある遺伝子ワクチン。 90. 配列番号:22に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも 約40%の類似性を有するヌクレオチド配列または配列番号:22と低厳格条件 下でハイブリッドを形成することができるヌクレオチド配列を有するDNA配列 を含んで成る遺伝子ワクチンであって、該DNA配列がブタ中で発現してエル. イントラセル ラリスまたは類縁微生物に対する防御的免疫反応を誘導するのに有効な量のペプ チド、ポリペプチドまたはタンパクを生産することができるものである遺伝子ワ クチン。
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