BG98989A

BG98989A - Защитни антигени срещу инфекции от еснinососсus grаnulоsus и ваксини,съдържащи такива антигени

Info

Publication number: BG98989A
Application number: BG98989A
Authority: BG
Inventors: David Heath; Stephen Lawrence; Mark Ralston; David Maass; Marshal Lightowlers
Original assignee: New Zealand Pastoral Agriculture Researchinstitute Limited; University Of Melbourne
Priority date: 1992-02-21
Filing date: 1994-08-19
Publication date: 1995-07-28
Also published as: AU676828B2; BG61754B1; PT629131E; ES2160594T3; HU9402404D0; DE69330385D1; UA45946C2; BR9305933A; WO1993016722A1; EP0629131A4; EP0629131A1; DE69330385T2; HU220575B1; HUT69925A; RU94045154A; EP0629131B1; JPH07504088A; RU2205875C2; AU3650093A

Abstract

Изобретението се отнася до антигенни полипептиди или пептидни фрагменти и техни варианти, които могат да се използват като ваксина за защита от инфекции, причинени от паразити от рода еснinососсus или таеniа, по-специално инфекции с е.grаnulоsus. Антигените се получават чрез експресия на кодиращатаги днк в рекомбинантна клетка гостоприемник.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Този патент се отнася до защитни антигени срещу инфекции причинени от Echinococcus granulosus, до ваксини съдържащи такива антигени, както и до методи, предпазващи гостоприемници податливи на паразитни инфекции причинявани от Echinococcus и Taenii.

ПРЕДШЕСТВУВАНИ) СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Ехинококовите болести се причиняват от заразяване с ларви /метацестоден стадий/ на тении принадлежащи към род Echinococcus. Предаването става в циклите хищник - жертва при бозайници, като това се осъществява между месоядни гостоприемници и тревопасни или всеядни междинни гостоприемници.

От тениите Echinococcus, най-значими са Echinococcus granulosus. Те са причината за цестозната болест /ЦБ/ и се предават между домашни кучета и домашни тревопасни, като овце и крави, като хората също могат да бъдат междинни гостоприемници, но обикновено не допринасят за жизнения им цикъл. В резултат на това, Е. granulosus е много широко разпространен в географски смисъл и неговото разпределение е в тясна връзка с тези области в света, където отглеждането на селскостопански животни е главната стопанска дейност.

Следователно може да се каже, че ЦБ е важна ендемична болест в широки региони на Южна

Америка,

Африка, Австралия,

Централна

Европа,

Централна Азия,

Средиземноморието, включително и Северна Африка

Някои страни сега се опитват да контролират ЦБ чрез обучаване собствениците на кучета и редовно анти хелминтологично третиране на кучетата, като най-значими гостоприемници. Обаче, въпреки че подобни програми са били частично успешни, окончателното решаване на проблема се оказа трудно за постигане.

Един по-добър подход за контрол над ЦБ включва използуването на ваксина, която въздействува върху цистния стадий от жизнения цикъл на

Е.

granulosus в междинния гостоприемник. Този подход има това предимство, че предаването на инфекцията на кучетата чрез консумиране на храна, заразена с цисти, се предотвратява. В резултат на това окончателното премахване на болестта изглежда една реална възможност.

Настоящето изобретение е насочено предимно към подхода, включващ използуване на ваксина.

Обаче, за да се получи комерсионално-достъпна ваксина, е необходимо да се идентифицират специфични защитни антигени срещу Е. granulosus. Въпреки, че досегашните изследвания (Gemmell М A, Immunology Ц 325-335 (1966); Heath et al., J. Parasitol ξ£_ (6) 797-799 (1981)) ясно показаха, че онкосферата на Е. granulosus е потентен източник на такива антигени, не бяха идентифицирани такива, които да имат защитни функции.

Международен патент No. PCT/FR91/00563 /публикуван като W092/01051/ се отнася до имуногенен пептид от Е. granulosus, заедно с ДНК секвенция, кодираща този пептид и методите за диагностициране и лечение на ехинококова инфекция с помощта на този пептид. Обаче, описания антиген от Е. granulosus /известен като антиген 5/ няма отношение към онкосферните антигени изследвани от авторите. Освен това авторите са показали, че присъствието на антитела срещу антиген 5 не предпазва агнета срещу инфекция с яйца от Е. granulosus (Heath et al., Int__Journal of__Parasitology 22. 1017-1021 (1992)).

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Целта на настоящето изобретение е да се получи специфичен антиген, който да се използува за ваксина срещу инфекции с Е. granulosus или поне обществото да има един полезен избор.

От една страна настоящето изобретение предлага един антигенен полипептид с молекулно тегло 23-25 кД, изчислено чрез SDS-PAGE, включващ от четвъртата до седемдесет и седмата аминокиселини, съгласно секвенцията от Фиг. 4 и можещ да предизвика защитна имунологична реакция срещу инфекция от Е.

granulosus в даден податлив гостоприемник, или от друга един пептиден фрагмент или негов вариант, който има еквивалентна защитна имунологична активност.

В един по-добър вариант, полипептида включва аминокиселини от 1 до 154 от секвенцията на Фиг. 4.

В един още по-добър вариант, изобретението се състои от пептиден фрагмент имащ част или цялата аминокиселинна секвенция от Фиг. 4.

Полипептида или пептидния фрагмент е продукт на кодираща нуклеотидна секвенция в клетката гостоприемник.

В по-нататъшен аспект изобретението се състои от смес от вещества, способни да предизвикат защитна имунологична реакция срещу инфекция от Е. granulosus в чувствителни гостоприемници и която основно съдържа компонент, подбран от група състояща се от:

/а/ полипептида, описан по-горе /б/ пептиден фрагмент от /а/, който има еквивалентна защитна имунологична активност; и /в/ вариант на /а/ или /б/, който е бил модифициран чрез включване, заместване или премахване на една или повече аминокиселини и който има еквивалентна имунологична активност.

В един допълнителен аспект, изобретението предлага молекула ДНК, която е подбрана от групата ДНК състояща се от:

/а/ нуклеотидна секвенция, кодираща антигенния полипептид, дефиниран по-горе /б/ нуклеотидна секвенция, кодираща пептиден фрагмент от антигенния полипептид от /а/, който фрагмент има еквивалентна защитна имунологична активност с полипептида от /а/; и /в/ нуклеотидна секвенция, кодираща вариант на полипептида от /а/ или пептида от /б/ в която аминокиселинните секвенции са били модифицирани чрез включване, заместване или премахване на една или повече аминокиселини, като варианта има еквивалентна защитна имунологична активност на полипептида от /а/ или на пептидния фрагмент /б/.

В един предпочитан вариант, молекулата ДНК включва поне нуклеотиди 10 до 233 от секвенцията на Фиг. 4, за предпочитане нуклеотиди 3 до 461 от секвенцията на Фиг. 4 и най-добре нуклеотиди от 1 до 461 от секвенцията на Фиг. 4.

В по-нататъшни аспекти, изобретението предлага рекомбинантни експресионни вектори, които съдържат молекула ДНК, както е описано по-горе, клетки гостоприемници, които са трансформирани с тези вектори и са способни да експресират полипептида, пептидния фрагмент или техни варианти, методи за култивиране на клетките гостоприемници, продуциращи антигенните полипептиди, пептидните фрагменти или техните варианти и получаването на експресираните продукти.

В един друг аспект настоящето изобретение предлага ваксина срещу инфекции с Е. granulosus, състояща се от полипептид, пептиден фрагмент или негов вариант, съгласно описанието по-горе, заедно с имунологично подходящ адювант или носител.

В един допълнителен аспект, настоящето изобретение предлага метод за защита на гостоприемника срещу паразити от рода на Echinococcus или Taeniid, включващ въвеждането в гостоприемника на известно количество полипептид, пептиден фрагмент или негов вариант, който е дефиниран по-горе и който има защитна функция срещу тази инфекция.

Полипептида, пептидния фрагмент или неговия вариант се въвежда в гостоприемника под формата на ваксина, както е описано по-горе.

В допълнителен аспект, изобретението предлага антитяло, специфично за антигенния полипептид, пептидния фрагмент или негов вариант, както е дефинирано по-горе.

Други аспекти на изобретението ще станат очевидни от описанието което следва.

ОПИСАНИЕ НА ПРИЛОЖЕНИТЕ ФИГУРИ

Въпреки, че изобретението обширно е описано по-горе, хората които са добре запознати с тази материя ще преценят, че това изобретение не е ограничено в описаните рамки, но включва и редица варианти за които описваме няколко примера по-долу. Особено добро разбиране на това изобретение може да се постигне ако се разгледат следните илюстрации:

Фигура 1 показва IgG^ и IgG2 овчи антитела, получени в отговор на ваксинация с SDS-PAGE фракции от онкосфери. Групи овце бяха ваксинирани с фракции от онкосфери представляващи SDS-PAGE фракции включващи антигени с определени молекулни тегла: Група 1: Всички молекули под 21кД; Група 2: 23 + 25кД ; Група 3: ЗОкД; Група 4: 34кД; Група 5: 40кД двойка; Група 6: 43кД; Група 7: Всички молекули над 43кД; Група 8: Смес от всички молекули; Група 9: Само адювант; Група 10 овце бяха ваксинирани с нетретирани онкосфери или третирани по начин подобен на групи 1 до 9, и Група 21 бяха ваксинирани със замразен и размразен соникат от активирани онкосфери на Е. granulosus. Фигура 1 показва анализа на имунния отговор на овце от всяка от тези групи, в реакция срещу SDS-PAGE фракции получени при разделяне на екстракти от цели онкосфери.

Фигура 2 показва получените антитела IgG^ и IgG2 в резултат на ваксинация с клонирани антигени. Групи: 11. Клон S2; 12. Клон S3; 13. Клон 48; 14. Клон 95; 15. Клон 101; 15. Клон 119; 17. Клон 123; 18. Смес от всички клонове; 19.Клонове 33, 42 и 85; 20. GST-контрола; 21. Смесен серум от

5 овце имунизирани със	замразен и размразен соникат	от
активирани	онкосфери от	Е. gtanulosus.	Процедурата	на
имунизация	е идентична с	тази проведена	за антигените	от
групи 11 до	20.
Фигура	3 показва	имунния отговор	IgG£ при овце

ваксинирани с препаративни SDS-PAGE фракции от онкосферни антигени или с клонирани антигени. Групите са същите както описаните по-горе.

Фигура 4 показва нуклеотидните секвенции и аминокиселинните секвенции на пептиден фрагмент от защитния антиген описан в изобретението. Цифрите от ляво показват нуклеотидния номер в посока 5' към 3' . Цифрите от дясно показват броя на аминокиселините. Транслационния стоп кодон е подчертан.

Ш#’·'

ПОДРОБНА ТЕХНИЧЕСКА CWQCI_.HA ИЗОБЕЕТЕНИЕЩ

Както е описано по-горе, в своя първоначален аспект, това изобретение е насочено към получаване на антиген който защитава даден гостоприемник срещу Е. granulosus, без значение дали се касае за самата тения или нейния цистен стадий. Гостоприемниците които са податливи на инфекции с Е. granulosus са предимно бозайниците, включително и човека. Съответно, примери за гостоприемници, върху които може да се приложи това изобретение са овце, говеда, свине, коне, хора и ДР8

В резултат на изследванията авторите са идентифицирали полипептид от Е. granulosus, който може да участвува в защитата на даден гостоприемник срещу Е. granulosus. Този полипептид от Е. granulosus има молекулно тегло 23-25кД.

Настоящето изобретение също включва антигени, получени от нативния полипептид от Е. granulosus за който стана дума, като тези деривати също имат защитна активност. Тези деривати обикновено са пептидни фрагменти от нативния полипептид които включват протективния епитоп, но могат също така да бъдат функционално еквивалентни варианти на нативния полипептид, модифицирани чрез известни техники, като специфична по място мутагенеза (виж Adelman et al., DNA 2 183 (1983)). Например, възможно е чрез такива методи да се заменят аминокиселини в дадена секвенция с еквивалентни аминокиселини. Такива групи аминокиселини за които че са еквивалентни са:

се знае,

(а)	Ala	Ser	Thr	Pro	Gly;
(Ь)		Asn		Asp		Glu	Gin	/
(в)		His		Arg		Lys
(г)		Met		Leu		He	Vai	; и
(д)		Phe		Tyr		Trp	•
В	един	предпаочитан	вариант,	антигена	е пептиден
фрагмент	имащ	част	или	цялата	аминокиселинна	секвенция от
Фиг. 4	По-	-добре	е	пептидния	фрагмент	да съдържа
аминокиселини	4-77	от	Фиг.	4.	Още	по-добре	е пептидния
фрагмент	да съдържа	аминокиселини	: 1-77	от Фиг. 4	. Най добре е

1-153 пептидния фрагмент да от Фиг.4.

съдържа аминокиселини

Защитния антиген от изобретението може да се получи чрез изолиране от нативния онкосферен комплемент на Е.

granulosus, като се използуват известните техники на очистване. Обаче, ясно е че за получаване на антиген за комерсионални нужди, е необходимо получаването му да стане по синтетичен начин. Този начин включва подхода описан от Merryfield ( J Amer Chem Soc Si 2149-2156 (1963)) c използуването на рекомбинантни ДНК технологии. Посоченият начин беше използуван предимно от авторите на изобретението.

В един по-нататъшен аспект, изобретението се отнася към рекомбинантното получаване на антигенния полипептид или пептид описан по-горе.

Най-общо казано, получаването на защитния антиген предложен в изобретението чрез рекомбинантни ДНК технологии, включва трансформирането на един подходящ гостоприемников организъм или клетка чрез експресионен вектор, който съдържа ДНК секвенция кодираща антигена, последвано от култивиране на трансформирания гостоприемник и последващо очистване на експресирания антиген. Такива техники са описани в Sambrook et al., Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Press (1987).

Първоначалната стъпка в метода за рекомбинантно получаване на антигена се състои във включването на ДНК секвенцията, кодираща антигена в експресионен вектор, съдържащ промотор, място за свързване с рибозомите в гостоприемниковата клетка, в която трансформиращата секвенция ще бъде трансформирана. Най-често срещаните примери за такива експресионни вектори са плазмидите, които представляват двойноспирални, кръгови молекули ДНК, които се реплицират автономно в клетката гостоприемник. Ще стане ясно по-нататък обаче, че подходящи вектори, които не са плазмиди, могат да се използуват в това изобретение.

За предпочитане е, клетката гостоприемник, в която ДНК секвенцията кодираща полипептида ще се клонира и експресира, да бъде прокариотна, като например Е. coli. Например Е. coli DH5 (Raleigh Е A et al., Nucleic Acid Research Ifj. (4) 15631575 (1988)), E. coli K12 клон 294 (ATCC 31446), E. coli B,E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli клон ST9 или E. coli JM101 могат да бъдат използувани. Други прокариоти също могат да бъдат използувани, като например бацили от типа на Bacillus subtilis и ентеробактерии като например Salmonella tuphimurium, Serrati a marсеsans или модифицирания щам на Bacille Callmete-Guerin (BCG) от Mucobacterium bovis.

Общо взето, когато клетката е прокариот се използуват ......„ експресионни или клониращи вектори, съдържащи контролни секвенции и секвенции отговорни за репликацията, които са получени от видове, сравними с клетката гостоприемник. Векторът също така може да носи маркерни секвенции, които осигуряват фенотипна селекция на трансформираните клетки. Например Е. coli обикновено се трансформира чрез pBR322, плазмид получен от щам на Е. coli (Bolivar et al., Gene 2 95 (1977)). pBR322 съдържа гени за ампицилинова и тетрациклинова резистентност и така осигурява лесен начин за идетифициране на трансформираните клетки.

При използуване за експресиране, плазмида който ще се експресира, съдържа промотор. Промоторите, които се използуват най-често при конструиране на рекомбинантна ДНК за използуване в прокариотни гостоприемници включват беталактамаза /пеницилаза/ и лактозна промоторна система (Chang et al., Nature 275 615 (1978); Itakura et al., Science 198 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281 544(1979) и триптофанова (trp) промоторна система (Goeddel et al., Nucleic Acid Research S 4057 (1980); EPO Publ No. 0036776). Докато тези са най-често използуваните, други микробиални промотори, като например tac-промотора (Amann et al., Gene 25 167-178 (1983) са били конструирани и използувани, като детайлите около тяхното конструиране и използуване са публикувани и всеки квалифициран експериментатор може да ги използува (Siebenlist et al., Cell 20 269 (1980)).

Освен прокариотите, еукариотните микроби могат също да бъдат използувани. Saccharomyces cerevisiae е най-често използувания еукариотен микроорганизъм, но се използуват също така и други щамове. За експресиране в Saccharomyces найчесто се използува плазмида YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282 39 (1979); Kingsman et al., Gene Z 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10 157 (1980). Този плазмид вече съдържа trpl гена, който се използува за селекциониране на мутантния щам дрожди, тъй като той не е в състояние да расте в триптофан, например АТСС No 44076 или РЕР4-1 (Jones, Genetics 85 12 (1977)). Наличието на trpl дефект, което е характерно за генома на дрождите гостоприемник, осигурява по-късно ефективна възможност за установяване на трансформацията чрез растеж при липса на триптофан.

Подходящи промоторни секвенции във векторите при дрождите, включват промоторите за 3-фосфоглицерат киназа (Hitzeman et al., J Biol Chem 255 2073 (1980) или други гликолитични ензими (Hess et al., J Adv Enzvme Rea Z 149 (1968); Holland et al., Biochemistry LZ 4900 (1978). Други промотори, които имат допълнително преимущество да контролират транскрипцията чрез условията на растеж са промоторните области на алкохол дехидрогеназа 2, изоцитохром С, кисела фосфатаза, разграждащи ензими свързани с азотния метаболизъм и вече споменатата глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа, както и ензимите отговорни за използуването на малтоза и глюкоза. Подходящ е всеки един плазмиден вектор, който съдържа промотор, съвместим с този на дрождите, начало на репликация и терминиращи секвенции.

Освен микроорганизмите, клетъчни култури, получени от многоклетъчни организми като например бозайници и насекоми, също могат да се използуват като гостоприемници. По принцип, може да се използува всяка една клетъчна култура, без значение дали произхожда от гръбначни или безгръбначни животни.

Все пак по-голям е интереса към клетките на гръбначните животни, като напоследък те се използуват по

масово в експерименталната практика (Tissue Culture. Academic

Press, Kruse and Patterson, editors (1973)). Примери за такива полезни и удобни клетъчни линии са VERO, HeLa и клетки от овариум на китайски хамстер (СНО). Експресионните вектори за подобни клетки обикновено включват /ако е необходимо/ начало на репликация, промотор, локализиран преди гена който ще се експресира, необходимите места за свързване на рибозомите, места за сплайсинг на РНК, места отговорни за полиаденилиране и секвенции отговорни за терминацията на транскрипцията.

При клетките от бозайниците, контролните функции върху експресионния вектор често се поемат от вирусен материал. Например, често използуваните промотори се получават от полиома, Аденовирус 2 и особено често от Simian Virus 40 (SV40). Ранните и късните промотори на SV40 са особено полезни защото и двата се получават лесно от вируса като фрагмент който съдържа и вирусното начало на репликация (Piers et al., Nature 273 113 (1978). По-малки или по-големи фрагменти от SV40 също могат да бъдат използувани, при условие че в тях е включена приблизително 250 н.дв. секвенция разположена от мястото за Hind III до мястото за Bgl I, локализирани във вирусното начало на репликация. Освен това е възможно, а често пъти е и желателно да се използува промотора или контролните секвенции, които нормално са свързани с желаната генна секвенция, при положение че тези нормални генни секвенции са съвместими с клетъчните системи на гостоприемника.

Източник на репликация (ori) може да се получи или чрез конструиране на вектор, включващ екзогенен ori, като например произхождащ от SV40 или друг вирус (напр. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) или може да се осигури от хромозомния репликационен механизъм на клетката гостоприемник. Ако векторът се интегрира в хромозомата на клетката гостоприемник, това обикновено е достатъчно.

При трансформиране на клетката гостоприемник с подходящ вектор, антигенния полипептид или пептид може да се продуцира чрез култивиране на клетките гостоприемници.

След получаване на антигенния полипептид или пептид, като хибриден белтък, той се подлага на очистване до необходимата степен. Процедурата на очистване, която ще се приложи зависи от степента на очистване което е необходимо да се достигне. За нуждите на ваксиниране е достатъчно грубо отделяне на хибридния белтък от остатъчните компоненти на клетъчната култура и антигена може да бъде включен във ваксина в сравнително по-груб вид. Обаче, в случаи когато е необходима по-висока степен на чистота, компонента-носител на хибридния белтък, трябва да бъде отделен от антигенния компонент.Както ще се види от специфичните примери и илюстрации, това може лесно да се направи чрез предварително включване на подходящо за ензимно разграждане място между компонента-носител и антигена.

При положение, че се използуват рекомбинантни техники за получаване на антигенния пептид, първата стъпка е да се получи ДНК кодираща желания продукт. Такива ДНК молекули представляват един по-нататъшен аспект на това изобретение.

За предпочитане е ДНК молекулата от настоящето изобретение да включва поне част или цялата нуклеотидна секвенция от Фиг. 4. В един от вариантите, ДНК молекулата включва поне нуклеотиди 3-233 от секвенцията на Фиг.4. Наидобре е молекулата да съдържа поне нуклеотиди 3-461 от секвенцията на Фиг. 4 ако не цялата нуклеотидна секвенция от Фиг. 4.

Молекулата ДНК от изобретението може да бъде получена или като съдържаща се в една ДНК молекула изолирана от подходящ естествен източник или може да бъде продуцирана като свободна от интрони кДНК с конвенционални техники, като тези използувани в специфичното описание на изобретението. Предпочита се кДНК.

Обаче, както вече беше отбелязано, изобретението също така обхваща и варианти на полипептида които се различават от нативните аминокиселинни секвенции чрез добавяне, заместване или премахване на една или повече аминокиселини. Там където такъв вариант е желетелен, се променя съответно и нуклеотидната секвенция на нативната молекула ДНК. Тази промяна може да бъде направена чрез избирателна синтеза на ДНК, като се използува подходящ синтезатор като например Applied Biosystems DNA Synthesizer или чрез модификация на нативната ДНК , например чрез специфична по място или касетна мутагенеза.

След получаването и, ДНК молекулата се обработва така, че да бъде подходяща за включване заедно с избраните регулаторни секвенции в подходящ вектор за клониране или експресиране. Това включва разрязване на молекулата, обработване на получените краища и повторно зашиване в зависимост от необходимостта.

Разрязването се прави чрез третиране с рестриктази в подходящ буфер. Всеки от големия брой от комерсионално достъпни рестрикционни ензими може да бъде използуван при спазване указанията на производителя. След разрязването, нуклеиновата киселина се получава например чрез утаяване с етанол.

Обработването на краищата на молекулата ДНК се извършва чрез използуването на конвенционални техники. Например ако е необходимо получаването на гладки краища, ДНК може да бъде третирана с ДНК полимераза I (Klenow), екстрахирана с фенол и хлороформ и утаена с алкохол.

Повторното зашиване може да бъде извършено чрез смесване на еквимоларни количества от желаните компоненти, чиито краища са предварително така обработени че да осигуряват точно сдвояване и третиране с подходяща лигаза (напр. Т4

ДНК

Освен защитните антигени и метод за получаването им изобретението предлага и ваксина срещу инфекции с

Е.

granulosus. Такава ваксина включва като основен компонент известно количество от полипептида, пептидния фрагмент или негов вариант от Е.

granulosus, който играе роля за защита на гостоприемника, заедно с подходящ адювант или носител.

Пример за подходящи адюванти са сапонините /или техни производни или техни сходни материали/, мурамилдипептид, трехалозо димиколат, пълен адювант на Freund, непълен адювант

на Freund, някои емулсии, декстран, детлиаминоетил-декстран, алуминиев фосфат, алуминиев хидроксид, бентонит, зимозан, полиелектролити, ретинол, калциев фосфат, протамин, саркозин, глицерол, сорбитол, пропилен гликол, фиксирани мазнини и синтетични естери на висшите мастни киселини.За сапонините е установено, че са много ефективни адюванти.

Ведни допълнителни варианти ваксината може да съдържа и някои терапевтични агенти по отношение на гостоприемника. Такива терапевтични агенти могат да бъдат антихелминти или други ваксини, а също така и имуностимуланти като интерферони или интерлевкини.

Такава ваксина може да бъде въвеждана в гостоприемника по всеки един от широко приетите методи. Все пак найпредпочитания начин за въвеждане на тази ваксина е парентералния. Термина парентерален се използува тук в смисъл на: интравенозно, интрамускулно, интрадермално и подкожно инжектиране. Най-удобно е въвеждането в организма да стане с подкожна инжекция.

Количеството ваксина въвеждана в гостоприемника ще зависи от типа, размера и теглото на тялото на гостоприемника, както и от имуногенността на ваксината. Ваксината е приготвена така, че относително малки дози от нея /1-5мл/ да бъдат ефективни за получаване на защитна реакция.

Ваксината може също така да бъде и под формата на жива рекомбинантна вирусна ваксина, включваща нуклеинова киселина кодираща полипептида, пептидния фрагмент или негов вариант. Ваксината се въвежда в гостоприемника под тази форма и след като вече се намира в гостоприемника, експресира кодирания полипептид, пептиден фрагмент или вариант за да индуцира защитна имунна реакция в гостоприемника.

Известни са няколко такива системи от рекомбинантни живи ваксини. Пример за такава система е вирусната система Vaccinia (US Patent 4603112; Brochier et al. , Nature 354 520 (1991)).

В един по-нататъшен аспект, изобретението предлага метод за защита на гостоприемник податлив на инфекция с Е. granulosus и Taeniid. Този метод включва като първоначална стъпка въвеждането в гостоприемника или на антигенния полипептид, пептиден фрагмент или негов вариант per se, или на ваксина както беше описано по-горе.

Докато специфичните примери представени в изобретението описват само използуването на антигените за защите срещу инфектиране с Е. granulosus, опитните експериментатори биха преценили, че може да се получи и кръстосана видова защита, при използуване на антигени от един паразитен вид ( виж например Lighttowlers, Acta_Leidensia__ΪΖ 135-142 (1989)). Следователно ще стане ясно, че антигените от изобретението са кандидат защитни антигени Echinococcus: Е. granulosus, Е. multilocularis, Е. vogelii, Т. ovis, Т. saginata, Т. solium, Т. multiceps и Т. hudatigena.

В един по-нататъшен аспект на изобретението се разглежда използуването на ДНК молекулата, описана по-горе, като сонда. В този смисъл, ДНК молекулата се използува за идентификация чрез хибридизация на ДНК от Echinococcus или Taenid, като например Т. saginata, Т. hudatigena или Е. multilocularis, която кодира един имуногенен антиген от този паразит. По този начин могат да бъдат идентифицирани и други паразитни антигени, които могат да бъдат използувани за ваксина. Метода за използуване на ДНК молекулата, като сонда, в това изобретение ще бъде разбран добре от хората, квалифицирани в тази област. Например техниките, описани в Maniatis et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1982), могат да бъдат използувани.

Алтернативно, техниките за амплификация на ДНК, като например полимеразна верижна реакция (PCR)(Saki et al., Science 239 487 (1988), могат да се използуват за установяване на хомоложна ДНК от други паразити, като праймерите за PCR могат да се разположат върху нуклеотидната секвенция от Фигура 4.

Подобно на използуването на ДНК молекулата от изобретението, за идентификация на ДНК кодираща съответния протективен антиген от други паразити, могат да се използуват антитела специфични за защитните антигени от изобретението, за да скринират антигените, които са експресирани от организмите трансформирани с въпросната ДНК. Локализирането на един положителен клон /такъв, който експресира антиген, разпознат от антитялото/ ще позволи да се идентифицират и защитния антиген и ДНК която го кодира. Такива антитела, които се използуват като сонди могат да бъдат или поликлонални или моноклонални и могат да бъдат получени чрез всяка една от широкоизползуваните техники. Най-вече моноклонални антитела могат да се получат според метода на Kohler и Milstein (Kohler G & Milstein C, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predifined specificity Nature (London) 256 459-497 (1975)).

Имуногенността на антигенния полипептид от изобретението, както и на пептидни фрагменти от този полипептид ще бъде оценена от следните примери.

ПРИМЕР 1; ТЕСТИРАНЕ НА АНТИГЕНИ ИЗОЛИРАНИ ОТ ОНКОСФЕРИ

НА ECHINOCOCCUS GRANULOSUS ЧРЕЗ ПРЕПАРАТИВНА ПОЛИАКРИЛАМИЛНА ГЕЛ ЕЛЕКТРОФОРЕЗА (SDS/PAGE)

Предишни непубликувани изследвания на авторите доведоха до идентифициране на няколко потенциални защитни антигени от Е. granulosus. Тези потенциални антигени имаха следните молекулни тегла, определени чрез SDS/PAGE:

- 23-25кД

- ЗОкД

- 34кД

- 40кД

Този експеримент беше проведен от авторите за да се идентифицират защитния/те/ антиген/и/ сред посочените по-горе кандидати.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ПРОЦЕДУРИ

Препаративен гел: При използуването на Biorad SDS Preparative Cell, бяха изляти 50мл от 15% полиакриламиден разтвор в 32мм държател, до височина 5,5см. След полимеризацията на повърхността бяха изляти 8мл концентриращ гел, който беше оставен също да полимеризира.

Антиген: Девет милиона излюпен онкосфери бяха приготвени по следния начин: Яйца на Е. granulosus с напълно развити ембриофори бяха преброени и необходимия брой яйца, при очакван добив от 20% от активирани онкосфери, бяха поставени в 15мл пластмасови центрофужни епруветки (Falcon Plastics). Не повече от 500 000 бяха използувани за всяка епруветка. Яйцата бяха центрофугирани на 200д за 2 мин, супернатантата изхвърлена и беше добавена Юмл от изкуствена стомашна течност (AIF), затоплена до 37°С (Heat D D and Smith J D, In vitro cultivation of Echinococcus granulosus, Taenia hydatigena, T. ovis, T. pisiformis and T. serialis from oncosphere to cystic larva, Parasitology 61 329-344 (1970)) предварително филтрувани през 0,2 микронова мембрана. Епруветките бяха рязбърквяни на 37°С за един час.

Яйцата бяха центрофугирани на 200д за 2 мин, супернатантата изтеглена и подменена с Юмл изкуствена стомашна течност (AIF) затоплена до 37°С и филтрирана през 0,2 микронова мембрана. Яйцата бяха разбърквани на 37°С за 30 мин и след това центрофугирани на 1 000д за 2 мин. Супернатантата беше изхвърлена и подменена с 15мл Percoll (Pharmacia, Sweden), разредени стерилно 9:1 (v/v) с 10 път w·· концентриран NCTC135 (GIBCO, NY). Ембриофорните агрегати, активираните и неактивираните онкосфери, от които се състоеше утайката, бяха смесени с Percoll чрез обръщане на епруветките. След това епруветките бяха центрофугирани на 1 000д за 10 мин и всяка супернатанта, съдържаща онкосферите беше прехвърлена в нова стерилна 15мл центрофужна епруветка. След това, половината от супернатантата (7,5мл) беше прехвърлена в друга стерилна центрофужна епруветка и към всяка от двете епруветки бяха добавени по 7,5мл от NCTC135.

«**’ Епруветките бяха разбъркани чрез обръщане и центрофугирани на w

000д за 5 мин. Супернатантите бяха премахнати и утайките съдържащи онкосферите бяха промити два пъти с Юмл NCTC135 и центрофугирани за 2 мин на 1 000д всеки път. Накрая утайките бяха ресуспендирани в NTCT135 до краен обем 10 микролитра в който всъщност се съдържаха между 40 и 200 онкосфери. След това броят на активираните и неактивираните онкосфери беше оценен чрез преброяване на целия обем от 4x10 микролитрови препарати чрез нанасяне от двете страни на две хематоцитометрични камери (Improved Neubauer) при увеличение #*·

200х, позволяващо различаването на неактивираните онкосфери от тези, които нямаха онкосферни мембрани /активирани онкосфери/.

Разделяне на_онкосферни_белтъци; Онкосферите /приблизително 50% неактивирани и 50% активирани/ бяха сварени в SDS препаратен буфер (Laemmli U К, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, fiatlAEfi__(London)__211 680-685 (1970))(съдържащ дитиотреитол (DTT), Sigma [10мгр/мл] вместо меркаптоетанол) и нанесени върху колона на Biorad SDS Preparative Cell. Когато фронтът на бромфенолово синьото багрило почти достигна края на колоната, бяха събирано последователни фракции от по 2,5мл в продължение на 24 часа.

Ензимни инхибитори: Всички бяха получени от Sigma. Те бяха разтворени в 20мл Шрис/HCl, рН 8,0 така, че при разрежданията (ν/ν), крайната им концентрация беше:

йодоацетамид - 20мМ, Апротинин - 10мкл/мл, Пепстатин 2мг/мл, N-тозил-Ь-фенилаланин хлор метил кетон /ТРСК/ 50мкг/мл, Ка-р-тозил-Ь-лизин- хлоро метил кетон /TLCK/ 50мкг/мл, Етилен диамин тетра оцетна киселина /EDTA/ - 2мМ, Фенил метил сулфонил флуорид /PMSF/ - 1мМ. Те бяха добавяни към всички фракции. Препарати от всяка фракция бяха разделяни на 5-25% гел при използуване на SDS/PAGE и теловете бяха оцветявани със сребро за идентифициране на молекулните тегла. Избраните фракции бяха концентрирани чрез Amicn UM3 мембрани до Юмл. След това те бяха центрофугирани на 2 200 об/мин за 30 мин на 1°С. Супернатантата беше отделена от наслагванията от SDS и след това всяка беше диализирана срещу 20мМ физиологичен раствор забуфериран с Трис/HCl, рН 7,5, съдържащ ензимни инхибитори в продължение на три дни и четири смени на буфера.

Молекулните тегла, които трябваше да бъдат тестирани бяха избрани според молекулните тегла на фракциите както следва: 1./всички молекули под 21кД/, 2. /23 + 25кД/, 3. /ЗОкД/, 4. /34кД/, 5. /40кД двойка/, 6. /43кД/, 7. /всички молекули над 43кД/, 8. /смес от всички молекули/, 9. /само адювант/, 10. /Препарат от антигена преди нанасянето му на гела. Този препарат също беше обработен чрез студено центрофугиране и интензивна диализа/.

Имунизаиионна процедура: Всеки антиген представляваше Юмл супернатанта. Фсяка фракция представляваше опеделен/и_ вид/ове/ молекула/и/ получени от пет милиона онкосфери, докато сместта от всички молекули беше получена от два милиона онкосфери, както и антигена п<еди нанасянето /група 10/. За първото инжектиране 1мл от антигена беше хомогенизиран с 1мл от STM адювант (Bokhout et al., Veterinary Immunology and Immunopatholoav 2 491-500 (1980)) и половината от този разтвор беше инжектиран подкожно, над левите ребра, докато другата половина беше инжектирана мускулно в задния ляв крак. За второто инжектиране, което беше направено един месец по-късно, беше използуван същият разтвор и същата схема на имунизация с изключение на това, че 2мг от лиофилизирани Micobacterium phlei бяха добавени към всяка инжекция. Инжекциите бяха направени от дясната страна.

Индукция. С Яйца: Един месец след втората инжекция, на всички агнета бяха дадени 1 000 яйца от Е. granulosus орално. Яйцата бяхя съхранявани на 4°С за 6 седмици. Те бяха събрани от тении от експериментално инфектирани кучета по метода на Heath D D and Lawrence S B, Dayly egg production of dogs infected with Echinococcus granulosus, AtchiZAS__de la

Hidatidosis 30 321-328 (1991).

Експериментални животни: Агнетата бяха от Romney и Dorset линии, разпределени равномерно във всички групи. Те бяха отглеждани без инфекции от Е. granulosus и първата имунизация им беше направена на 8 месечна възраст. За получаване на серум, от всяко животно бяха събрани по Юмл кръв по време на първата и втората имунизация и още веднъж, когато беше проведена индукцията. Серумът беше отделен стерилно и пазен на -20°С до тестирането му от in vitro култивирани онкосфери или имуноблотинг.

Некроскопия: Шест месеца след индуциращата инжекция беше взет още един препарат от кръв след което агнетата бяха обезкървени след умъртвяване. Черният дроб и белият дроб на всяко животно бяха нарязани на 2-Змм дебелина и всеки и всеки срез беше внимателно огледан с невъоръжено око. Белите дробове бяха нарязани на дебелина 4мм и срезите бяха внимателно проверени чрез палпиране и оглеждане.

Имуноблотинг: Антигените от онкосфери на Е. granulosus бяха разделени чрез SDS/PAGE според публикуваните методи (Laemmli (1979); Hames В D and Rickwood D, Gel electrophoresis of proteins: a practical approach, IRE. Press, Oxford (1981). Препаратите бяха разтворени чрез сваряване за 3 мин в бОмМ Трис/HCl pH 6,8, 10% глицерол, 2% SDS, 1% DTT и 0,05% бромфенолово синьо. Разделянето беше извършено на градиентен гел (Т=5-25%) при използуване на вертикална система за електрофореза (BioRad Protean 11) според инструкциите на производителя. Разделените антигени бяха прехвърлени електрофоретично (Towbin Н, Staehelin Т and

Gordon J, Electrophoretic transfer of proteins, Proceedings of the National.Academy of Sciences USA,. 76 4350-4354 (1979)) върху нитроцелулозни мембрани (0,45мкм Schleicher & Schull, Dassel Germany) в изстудена камера Transblot с плоски електроди (BioRad, Richmond, USA) при използуване на 50V напрежение за 2 часа в ЮмМ карбонатен буфер pH 9,0, съдържащ 20% метанол (Dunn S D, Effects of modification of transfer buffer composition and the renaturation of proteins in gels on the recognition of proteins on Western blots by monoclonal antibodies, Analytical Biochemistry 157 144-153 (1986)). След прехвърлянето, нитроцелулозните мембрани бяха оцветявани в 0,5% Ponceau S (BDH) в 1% оцетна киселина за 5 мин и след това бяха промивани в дестилирана вода докато белтъчните ивици започнат да се виждат ясно. Маркерите за молекулните (Pharmacia) тегла бяха отбелязвани с молив. Отделни ивици от нитроцелулозните мембрани бяха отрязани и поставени в инкубационни съдове (Schleicher & Schull, Germany). Ивиците бяха блокирани с 5% обезмаслено мляко на прах в 0,1% Tween 20 (BDH), 20мМ Трис/HCL pH 7,5, 0,5% NaCl за 1 час на 37°С. Тестуваните серуми бяха разредени 1:100 с блокиращия буфер. Ивиците бяха инкубирани в разредените серуми за едно денонощие при стайна температура на клатачка. След това ивиците бяха промити четири пъти по 10 мин с 20мМ Трис/HCl pH 7,5 съдържащ 0,5М NaCl и 0,1% Tween 20. Една допълнителна стъпка беше включена в имунологичния тест за установяване на имуноглобулиновите класове IgG^ или IgG₂. След първото антитяло, ивиците бяха тестувани с миши моноклонални антитела за овчи IgG-]_ или IgG₂, получени от Dr. Ken Beh, CSIRO McMaster Laboratory, Sidney. След това ивиците бяха тестувани с кози анти миши IgG /цяла молекула/ белязани с пероксидаза (Cappel) и разредени 1:1 000 с блокиращия буфер. След това ивиците бяха промити три пъти с блокиращия буфер без мляко или Teen 20. Пероксидазната активност беше визуализирана с 3амино-9 етилкарбазол (Sigma). Развитието на оцветяването при всички ивици беше спряно по едно и също време, така че да могат да се правят сравнения в интензитета на оцветяването, което отразява количеството на специфичния имуноглобулин във всички серуми.

Убиване на онкосферите_in vitro: Сборният серум преди индукцията, получен от десетте групи от овце беше тестуван за способността му да убива онкосферите. За фетален агнешки серумен комплемент, беше взимана кръв със стерилна спринцовка Г от агнешки фетуси близо до термина, като кръвта беше

Ч»' поставяна веднага в 50мл стерилни полипропиленови епруветки (Falcon plastics). След съсирване за два часа при стайна температура, съсиреците бяха отделени от стените на епруветките със стерилни пръчици в стерилен бокс. След това епруветките бяха центрофугирани в охладена центрофуга Beckman при 4°С за 30 мин. Епруветките бяха държани на лед до премахването на серума. Феталният агнешки серум беше съхраняван на порции от по 2мл на -70°С до използуването му за култивиране.

* Културите бяха поставени в 96-кладенчови плоскодънни панички за култивиране (Falcon Microtest III). Към всяко кладенче бяха добавени по 150мкл от тест-серума /инактивиран при 56°С за 30 мин/ и150мкл от NTCT135, съдържащи 50 активирани онкосфери плюс 20мкл фетален агнешки серумен комплемент. Всички култури бяха изследвани в дубликати или в трипликати. Паничките бяха съхранявани във влажен СС>2 инкубатор при 37°С, а резултатите бяха отчитани на 24тия час и на 7мия ден използувайки Leitz Labovert, инвертен микроскоп. Там където NCTC135 беше използуван, той беше допълнен с ЗООмг/л цистеин хидрохлорид (Sigma) и 50 мкг/мл гентамицин сулфат (Schering).

РЕЗУЛТАТИ

Профилите на антитела срещу онкосферния антиген, които бяха получени от всяка група са показани на Фиг. 1. Ясно е, че различните групи продуцираха антитела, които разпознаваха тази област от молекулни тегла с които те са били имунизирани. В някои групи, като например 1 и 5 имаше епитопи от молекулите използувани за имунизация, които бяха същите като при молекули с други молекулни тегла.

Резултатите от некроскопията са показани на Таблица 1, групи 1-10 и те показват, че докато другите кандидат-антигени намаляват броя на цистите в сравнение с контролите, то само молекули с тегла около 23-25кД предизвикват значителна степен на защита (Р = 0,012, F = 10,62, 8DF).

Резултатите от убиването in vitro на онкосфери чрез серумите от групите овце, имунизирани с фракции с различни молекулни тегла, са показани на Таблица 2. Вижда се ясно, че тези резултати подкрепят заключението, че само антигенни молекули с тегла 23-25кД от Е. granulosus, действуват защитно върху гостоприемника.

Таблица 1: Резултати от некроскопия на овце третирани с 1 000 яйца от Е. granulosus след имунизация с нативни антигени, елуирани от полиакриламидни телове /групи 1-8/, контроли с

адювант /група 9/, и третирани с SDS онкосфери /група 10/
Група	Имунизационен антиген	Номера на групите овпе	Брой на цистите	Средно
1	< 20	62,47,12,50,65	75,39,19,101,47	56,2
2	23 + 25	05,24,67,45,95	0,39,10,2,4,	11
3	30	17,19,13,57,03	0,42,17,148,197	80,8
4	34	11,37,14,77,43	167,9,48,85,126	87
5	40	51,39,06,41,82	109,86,156,276,97	144,8
6	43	08,64,04,88,68	57,67,165,3,52	68,8
7	> 43	86,45,40,72,01	84,75,2,17,78	51,2
8	Смес	15,23,92,48,27	0,0,104,133,79	63,2
9	Контрола	96,09,38,90,33	27,137,170,242,86	132,4
10	SDS онк.	60,30,44,20,18	247,49,175,25,54	110

Таблица 2: Убиване in vitro на онкосфери от Е. granulosus чрез сборни серуми, събрани в деня на индукция с яйца на Е.

granulosus

	Номер на групата	Третиране	% Убити
it. w	1	< 20кД	0%
	2	23 - 25кД	91%
	3	ЗОкД	0%
	4	34кД	0%
	5	40кД	0%
	6	43кД	0%
	7	> 43кД	0%
	8	Смес от вс. мол.	0%
	9	Само адювант	0%
	10	SDS-онкосфери	0%

ч»

ПРИМЕР 2; АФИНИТЕТНО ПРЕЧИСТВАНЕ НА ПРОБИ СЬЛЪРЖАШИ АНТИТЕЛА

Афинитетно пречистени антитела от имобилизирани молекули с молекулни тегла 23-25кД бяха получени по следния начин: Агнета 1488 и 1489 бяха имунизирани подкожно и интрамускулно с 100 000 активирани онкосфери от Е. granulosus на четири пъти. Първите две инжекции бяха през 2 седмици, следващата след 1 месец и последната - след 3 месеца. Една седмица след последната инжекция беше взета кръв от агнетата, като от ЗООмл кръв бяхя получени по 150мл стерилен хиперимунен серум. Агнетата бяха третирани с 3 000 прясно събрани яйца от Е. granulosus в деня когато беше взет и серума, като по същият начин бяха третирани и две контролни агнета. При некроскопия, б месеца по-късно, имунизираните агнета имаха нарастващи цисти само на мястото на първото инжектиране, докато контролните - имаха голям брой цисти в белите дробове и черния дроб.

Серумът от агне 1488 беше използуван за афинитетно очистване на антитела, защото имаше по-висок титър на способността да убива онкосферите в сравнение с 1489. Антитела специфични към замразен-размразен и озвучен антиген от Е. granulosus, цял старт от SDS/PAGE от онкосфери или към антигени с относителна подвижност 0-20, 20-25, 25-30, 30-36, 36-67, или към антигени с относителна подвижност от 0-20, 2030, 30-43, 43-67, 67-90, 90-180, и >180кД, бяха афинитетно очистени от нитроцелулозните ивици, съдържащи горните антигени, чрез метода на Beaii J A and Mitchell G F, Identification of a particular antigen from a parasite cDNA library using antibodies affinity purified from selected portions of Western blot, Journal of Immunological Methods £6

217-223 (1986). Белтъка-носител беше 1% фетален агнешси серум. Афинитетно очистените антитела бяха промити и след това концентрирани 10 пъти използувайки Amicon stirred cell и РМ10 мембрана.

ПРИМЕР 3:

КЛОНИРАНЕ НА РЕКОМБИНАНТНА ДНК И ЕКСПРЕСИЯ

НА АНТИГЕНИ ОТ ОНКОСФЕРИ НА ECHINOCOCCUS

GRANULOSUS

1. Изолиране м...идентифициране на иРНК /а/ Приготвяне на реагенти

Всички разтвори използувани при изолиране на иРНК, освен разтворите съдържащи Трие [Трие(хидроксиметил) аминоетан Sigma, St Louis, МО USA],бяха третирани с 0,1% диетилпирокарбонат (DEPC, Sigma) за едно денонощие, след което бяха автоклавирани преди употреба. Цялята стъклария беше изпечена на 200°С или по-висока температура. Концентрираните разтвори на Трие бяха приготвяни с DEPC третирана вода и автоклавирани.

/б/ ОнкосФеюа

Зрели яйца от Е. granulosus бяха получени и активирани

И*' както е описано в пример 1.

£

Приблизително 4x10° онкосфери бяха разтворени в лед в 6М свободен от нуклеази гуанидин хидрохлорид (BRL Ultrapurе,

Bethesda Research

Laboratories,

USA),

0,1М натриев ацетат, pH 5,2, използувайки стъклен/тефлонов тъканен хомогенизатор. Разтворените онкосфери бяха съхранявани на -70°С преди изолирането на РНК.

/в/ Изолиране на РНК

Разтворените онкосфери бяха размразени в лед и неразтворимия материал беше утаен чрез центрофугиране при 10 ОООоб/мин за 30 мин на 4°С в тип 50 Ti ротор и ултрацентрофуга Beckman L8 (Beckman, Palo Alto, CA USA). Супернатантата беше надслоена върху разтвор съдържащ 4,8М цезиев хлорид (CsCl - BRL, Ultrapure, Betesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD USA), IOmM EDTA /етилен диамин тетра оцетна киселина, двунатриева сол/, б,5мл гуанидин/ 5,5мл CsCl в полиаломерна епруветка от Beckman SW40. Епруветките бяха центрофугирани на 35 ОООоб/мин за 18 часа на 15°С на ротор SW40, ултрацентрофуга Beckman L8. Супернатантата беше премахната и дъното на епруветките беше промито бързо и внимателно с 200мкл от Τ^θΕ^ (ЮмМ Трие, 1мМ EDTA, pH 8,0). Утаената РНК беше разтворена в 200мкл Τ-^θΕ^ и беше преципитирана чрез добавяне на 1:10 обема ЗМ натриев ацетат и 2,5 обема 100% леден етанол, като беше инкубирана на -20°С за една нощ. Преципитираната РНК беше утаена чрез центрофугиране в микроцентрофуга за 15 мин при 4°С, утайката беше промита със 70% етанол, повторно центрофугирана и изсушена на въздух. Изолираната РНК беше ресуспендирана в 50мкл ТудЕу, като количеството и, измерено по абсорбция при дължина на вълната 2б0нм беше 23мкг тотална РНК. Един микрограм беше изследван в 1,2% формалдехид-агарозен гел (Sambrook J Fritsch Е Maniatis Т, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) и се оказа, че препарата съдържа интактна рибозомална РНК.

/г/ Очистване на поли А* РНК

Поли А⁺ информационна РНК беше очистена чрез олиго (dT) целулоза Тип 7 (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden) съгласно инструкциите на производителя и описанието на Aviv Н & Leder Р, Purification of biologically active globin messenger RNA was by chromatography on oligothymidilic acidcellulose, Proc Nat Acad Sci 69 1408-1412 (1972). Елюираната β#**»

поли Α⁺ иРНК беше преципитирана както вече беше описано и утайката отново беше разтворена в Т^дЕ^.

/Д/ Транслация in vitro

Пет микролитра от иРНК бяха транслирани in vitro използувайки Rabbit Reticulocyte Lysate (Amersham, UK) в тотален обем от 25мкл, съгласно инструкциите на производителя. Продуктите бяха белязани радиоактивно с 37,5 микрокюри ³⁵δ-ΜβτποΗΗΗ (Amersham International, Amersham UK) и бяха изследвани с полиакриламидна гел електрофореза в 10% полиакриламиден гел при редуциращи условия.(laemmli U К, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriofage T4, Nature (London) 227 680-685 (1970)) и установени c флуорография след импрегниране на гела с Amplify (Amersham, UK). Продуктите от транслацията бяха с хетерогенна големина, включвайки и продукти с молекулна маса повече от 94кД.

2. Синтез и клониране на кДНК /а/ синтез на кДНК

Тридесет и пет микролитра от разтвора на иРНК в Т^дЕ^ беше обратно транскрибирана в присъствие на алфа ³²P-dATP (Amersham) използувайки Moloney-Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase, както и реагентите и протокола, съдържащи се в ZAP-cDNA Synthesis Kit (Lot# UC106, Catalog # 200400, Stratagene, La Jolla, USA). След синтеза на втората верига, една проба беше изследвана с гел електрофореза 1% алкална агароза, съгласно инструкциите в ZAP-cDNA Synthesis Kit. Размера на кДНК беше хетерогенен и в сравнение с Lambda Hind

III маркерите (Promega Corporation, Madison, WI, USA), включваше установими транскрипти, по-големи от 2 000 н. дв.

/б/ Клониране на кДНК кДНК беше клонирана в бактериофагния вектор Uni-ZAP XR (ламбда ZAP)(Stratagene) съгласно условията детайлизирани в инструкциите на UNI-ZAP XR Cloning Kit, (Lot #18D, Catalog #237211, Stratagene). кДНК беше лигирана c вектора без някакъв специален подбор на размера на кДНК. Цялото количество кДНК беше свързана с 1мкг векторна ДНК.

/в/ In vitro опаковане на бактеоиоФага

Два	микролитра от кДНК, лигирани	с вектора, бяха
опаковани	в неефективен	фаг, използувайки	единична	реакция на
опаковане	Gigapack II	Gold (Lot #1535,	Catalog	# 200216,

Stratagene) съгласно инструкциите на производителя. Получения фаг беше титруван върху Е. coli PLK-F'. Останалата лигирана кДНК беше опакована след това в две еднакви реакции, като продуктите от трите реакции бяха събрани заедно и титрувани. Получената библиотека от кДНК клонове /кДНК библиотека/ в ламбда ZAP беше титрувана в Е. coli PLK-F' и се оказа, че съдържа приблизително 100 000 първични клона (според методите описани в UNI-ZAP XR Cloning Kit, Stratagene).

3. АмплиФикапия на кДНК библиотеката

Цялата кДНК библиотека беше амплифицирана в клетки на Е. coli PLK-F' при плътност от 5 000 плакови единици (pfu) на агарови панички с диаметър 150мм. Амплифицираните фаги бяха събрани след една нощ в Юмл SM (ЮОмМ NaCl, 8мМ MgSO4, 50мМ Трие pH 7,5, 0,01% w/v желатин). Амплифицираната библиотека беше обединена и титрувана върху Е. coli XLl-Blue cells (Stratagene) в присъствие на изопропилтиогалактозид (IPTG) и 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-бета-П-галактозид (Xgal), според инструкциите на UNI-ZAP XR Cloning Kit (Stratagene). Титърът

Q на амплифицираната библиотека беше оценен на 1,7x10’ pfu на милилитър.

4. ИМУНОСКРИНИРАНЕ НА БИБЛИОТЕКАТА ОТ кДНК /а/ Подготовка.на. антит.ела-сонди

Два типа антитела-сонди бяха използувани в имунологичния тест на плаките: серумни и афинитетно пречистени антитела приготвени съгласно пример 2. Серумните проби бяха освободени от фонова реактивност спрямо Е. coli и или бета-галактозидаза по следния начин. Чувствителен гостоприемник Е. coli (обикновено XL-1 Blue, Stratagene) бяха заразени с почти конфлуентни, не-рекомбинантни ламбда gtll или ламбда ZAP. Нитроцелулозни филтри (Schleicher & Schule, Dassel, Germany) бяха импрегнирани с ЮмМ IPTG, изсушени и след инкубация на паничките при 42°С за 4 часа, на повърхността на всяка паничка беше поставен по един филтър. Паничките бяха инкубирани при 37°С за една нощ, след което бяха инкубирани на 4°С за ЗОмин. Филтрите бяха извадени и промити с TNT (150мМ NaCl, 0,05% Tween 20, 20мМ Трие pH 8,0) и инкубирани в 5% обезмаслено мляко на прах/TNT (BLOTTO) за един час. Всички имунологични инкубации бяха проведени при стайна температура на клатачка. Всяка една серумна проба, предназначена за имунологично изследване беше разредена в TNT съдържащ 20% фетален телешки серум (FTNT) и беше инкубирана в петриева паничка, съдържаща 20мл разреден серум плюс два нитроцелулозни филтъра, приготвени както вече беше описано. След инкубация от 2 часа, нитроцелулозните филтри бяха извадени и освободените от фонова реактивност серуми бяха готови за използуване.

Антителата, които бяха получени получени от серум чрез афинитетно очистване /детайлизирано в Пример 2/ не бяха афинитетно пречиствани с не-рекомбинантни ламбда gtll или (supra); накратко: сдвоените олигонуклеотиди бяха третирани с

Т4 полинуклеотид киназа (New England Biolabs, Beyer1у СА,

USA); pGEX ЗХ ДНК беше смляна c EcoR I (New England Biolabs), обработена c фосфатаза и лигирана за киназираните сдвоени олигонуклеотиди. Е.coli JM101 бяха трансформирани с лигирания плазмид използувайки калциев хлорид. Трансформираните с плазмида бактериални клонове бяха селекционирани, плазмидната ДНК беше изолирана и модификацията беше потвърдена чрез секвениране на съответните части от ДНК чрез dideoxy chain%₽* termination метода след субклониране на BamH I/позиция

914/Pst I/позиция 1885/ в М13 бактериофаги. Вектора pGEX ЗЕХ има следната ДНК секвенция и предсказана аминокиселинна секвенция в полилинкерната област:

BamH I pGEX-ЗЕХ CCA AAA TCG GAT CTG ATC GAA GGT CGT GGG АТС

Pro Lys Ser Asp Leu He Glu Glv Ara Gly lie Factor X

Sma.....X.

EcoR......1

CCC GGG AAT TCA TAC TCG AGT /КАТ TCA TCG TGA

Pro Gly Asn Ser Tyr Ser Ser Asn Ser Ser ***

Плазмидна ДНК от pBluescript беше очистена чрез центрофугиране в CsCI (Sambrook et al., supra) и включеното парче кДНК беше изрязано по следния начин. Около 2мкг от pBluescript ДНК от всеки клон беше смляна с по 10 единици EcoR I и Xho I (Amersham, UK) в 20 мкл високо солев буфер. Включената ДНК беше разделена на 1% агароза, ДНК ивиците бяха изрязани и пречистени чрез използуване на Geneclean (ВЮ101 Inc., La Jolla, USA). След околичествяване при абсорбция при 260нм, около ЮОнг от включеното парче ДНК беше лигирано /2 единици Т4 ДНК лигаза Boehringer, Mannheim) към около 50нг цезиево хлоридно пречистена и обработена с фосфатаза pGEX-3EX ДНК, предварително смляна с EcoR I и Xho I.

Лигираната кДНК в pGEX-ЗЕХ /виж по-долу/ беше трансформирана в Е. coli щам ВВ4 (Stratagene Cloning System, La Jolla, California, USA, cat. # 200269) чрез електропориране при използуване на BioRad Gene Pulser, съгласно инструкциите на производителя (BioRad, Richmond, USA).

ПРИМЕР 4: ПРОДУКЦИЯ НА Е. GRANULOSUS ХИБРИДЕН БЕЛТЪК

Селекционираните Е. granulosus онкосферни кДНК клонове бяха субклонирани в експресионния плазмид pGEX-ЗЕХ и трансформирани в Е. coli щам ВВ4, както е описано по-горе.

Експресията доведе до получаване на паразитния белтък, свързан с глутатион S-трансфераза (GST). Такива хибридни белтъци са много често разтворими и могат да бъдат пречистени от лизирани клетки при неденатуриращи условия чрез абсорбция с агарозни зърна, свързани с глутатион.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

GST-хибридните белтъци бяха индуцирани и пречистени както е описано от Smith & Johnson, Gene б7 31-40 (1988) при използуване на специфични стъпки детайлизирани по-долу:

1. Колонии от pGEX трансформирани клетки бяха посяти в 4Х100мл LB/ампицилинова среда и инкубирани за една нощ на 37°С с разклащане.

2. Културите бяха разредени 1:10 със свежа LB/ампицилинова среда и инкубирани за 90мин на 37°С.

3. Експресията беше индуцирана чрез добавяне на ЮОмл IPTG до 0,1мМ.

4. Инкубацията беше продължена за 4,5 часа допълнително.

5. Клетките бяха утаени чрез центрофугиране на 5 000д на 4°С за 10 мин.

6. Утайката от клетки, получена от всеки литър беше ресуспендирана в 15мл изстуден PBS pH 7,2 и пазена на -20°С/70°С до последващо обработване.

7. Утайките бяха размразени и инкубирани за 10 мин на стайна температура с лизозим /0,25мг/мл/.

8. Беше добавен 0,5% Тритон Х-100.

9. Клетъчната суспенсия беше озвучена на лед 3 пъти по 12 сек с 15 секундни интервали.

10. Неразтворимият материал беше премахнат чрез центрофугиране на 10 000д на 4°С за 15 мин.

11. Супернатантата от един литър първоначална култура беше добавен към 15мл 50% глутатионови агарозни зърна и беше размесвана внимателно на стайна температура за 3 часа.

12. Агарозните зърна бяха утаени чрез центрофугиране на 2 000д за 5 мин на стайна температура.

13. Агарозните зърна бяха измити 5 пъти със студен PBS чрез центрофугиране на 2 000д за 5 мин на стайна температура.

14. GST хибридният белтък, закачен за агарозата беше получен.

15. Концентрацията на хибридния белтък върху агарозните зърна беше определена чрез метода на Брадфорд (BioRad).

ПРИМЕР 5:

ДЕМОНСТРАЦИЯ НА ИМУНОГЕННОСТТА НА ХИБРИДЕН

БЕЛТЪК ОТ Е. GRANULOSUS

ИМУНИЗАЦИЯ НА ОВПЕ

Овцете бяха осем месечни по времето на първоначалната ваксинация.Те бяха смес от породи Rommey и Dorset и бяха разделени на 9 групи от по пет третирани овце и една група с осем контроли. Всяко животно получаваше по 50мкг хибриден белтък, свързан с агароза /Приготвен съгласно Примар 4/, в С-’ 1мл физиологичен разтвор смесен с 1мл STM адювант (Bokhout В A, van Gaalen С and Van der Heijen Ph J, A selected water-inoil emulsion: Composition and usefulness as an immunological adjvant, Veterinary Immunology and Immunopatholoav 2 491-500 (1981)). Тоталният обем за инжектиране от 2мл/овца, беше въвеждан наполовина подкожно и наполовина - интрамускулно в лявата страна и беше повторен след 1 месец от дясната страна. Контролите получиха експресираната глутатион S-трансфераза от не-рекомбинантни pGEX. Две седмици след втората инжекция беше взета кръв от овцете и беше приготвен серум за култивиране in vitro и за имуноблотинг срещу онкосферен антиген, както е описано в Пример 1. Същият ден, овцете бяха третирани орално с 1 000 яйца от Е. granulosus, както е описано в Пример 1.

НЕКРОСКОПИЯ

Шест месеца след заразяването, овцете бяха обезкървени и техните бели и черни дробове бяха взети за изследване. Черните дробове бяха нарязани на парчета дебели 2мм и бяха изследвани на око за наличието на цисти. Белите дробове бяха нарязани на парчета дебели по 4мм и бяха внимателно палпирани за установяване наличието на цисти. Всички неясни лезии бяха срязани и отворени за да се установи дали са цисти на Е. granulosus.

Резултатите от некроскопията са показани в Таблица 3, а убиването на онкосферите - на Таблица 4, Една значителна имунна реакция беше стимулирана от клон S2 (97%. Р<0,001. F=24,04, 11DF); клон 48 (83%. Р=0,002. F=16,51, 11DF); клон 95 (96%. Р<0,001. F=23,41, 11DF); клон 119 (83%. Р=0,002. 11DF).

Умъртвяване in vitro беше наблюдавано при серуми, събрани от тези четири клона, както и от смес от всички клонове.

Всички тези клонове продуцираха антитела, които реагираха с нативния 23-25кД белтък, докато два клона /101 и 123/, които не индуцираха статистически значима защитна реакция, реагираха с нативния 34кД белтък. Друг клон, който не индуцира статистически значима защита (S3), реагира с ЗОкД белтък /Фигура 2/.

Клонове S2 и 95 индуцираха силен IgG₂ отговор на 23-25кД молекулата в сравнение с по-малко ефективните клонове 48 и 119. Отделни овце в тези групи също потвърдиха хипотезата, че един силен IgG₂ отговор е много полезен при индуцирането на защитен имунитет /Фигура 3/. Ниската вариабилност на резултатите от Юте овце, имунизирани с клон S2 или 95, показа че тази секвенция може да бъде разпозната от широк диапазон от генотипове.

Таблица 3 Резултати от некроскопията на овце заразени с яйца от Е. granulosus след имунизация с рекомбинантни антигени.

Група Имунизационен Номера на овцете Брой цисти Средно .антиген

11	Клон S2	28,53,46,29,16	2,3,0,16,3	4,8
12	Клон S3	56,54,36,26,71	0,68,72,53,99	58,4
13	Клон 48	31,49,25,22,66	17,58,12,0,46	26,6
14	Клон 95	76,80,10,42,52	13,14,5,0,2	6,8
15	Клон 101	58,02,93,79,83	64,79,30,108,100	76,2
16	Клон 119	84,73,91,85,55	53,29,0,13,40	27
17	Клон 123	21,07,34,81,63	305,8,100,20,40	94,6
18	Смес от вс.	89,61,75,74,70	8,74,27,0,105	42,8
19	Клон 33,42,86	32,87,69,78,59	6,130,136,5,200	95,4
20	GST-	94,97,99,00,01	70,105,270,180	156,6
	контрола	02,04,05	122,227,108,171

Таблица 4. Групов номер	Убиване in от събрани индукциа с	vitro на онкосфери от Е. granulosus групови серуми получени в дена на яйца на Е. granulosus
Третиране	% Убити
11		Клон S2	94%
12		Клон S3	0%
13		Клон 48	97%
14		Клон 95	100%
15		Клон 101	0%
16		Клон 119	89%
17		Клон 123	0%
18		Смес от всички	89%
19		Смес от 33,42,86	0%
20		Адювантна контрола	0%
21		Онкосферна контрола	0%

ПРИМЕР 6: ЧАСТИЧНО-СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК ОТ КЛОНОВЕ S2,

48, 95 И 119

Получаване на PBluescript

Phagemid pBluescript беше генериран чрез phagemid rescue от ламбда-ZAP за всяка кДНК, както е описано в инструкциите на производителя към UNI-ZAP XR Cloning Kit (Stratagene). Получаване на едноверижна ДНК

Едноверижна ДНК беше получена от плазмида pBluescript (Stratagene), използувайки техниките описани от Ausubel et ( al., Current Protocols in Molecular Biology, Green

Publishing	Associates	and Wiley	Interscience,	New York
(1987).
Секвениоане	на кДНК
кДНК беше секвенирана частично	чрез	верижно	терминиращи
инхибитори	(Sanger F,	Nicklen S	and	Coulson	A R, DNA

sequencing with chain-terminating inhibitors, Proc Natl Acad Sci USA 14 5463 (1977)) използувайки Sequenase, Version 2.0 (Unated States Biochemical). Праймера беше ТЗ (Albert Einstein College of Medicine, Oligonucleotide Synthesis Unit). Продуктите на терминиращите реакции бяха разделени на 6% полиакриламиден гел и визуализирани чрез авторадиография (X-Omat, Kodak).

Резултати

Резултатите са показани на Таблица 5.

Таблица 5:

Име:	95	Дължина:	224	Проверка:	708	Тегло:	1,00
Име:	S2	Дължина:	224	Проверка:	708	Тегло:	1,00
Име:	48	Дължина:	224	Проверка:	708	Тегло:	1,00
Име:	119	Дължина:	224	Проверка:	708	Тегло:	1,00

59

	95 TCCAGTTAT 82..TCCAGTTAT 48 119 ...	GTCTCATTTT GTTTGCGACT TCAGTTTTGG CTCAGGAATA CAAAGGAATG
GTCTCATTTT GTCTCATTTT GTCTCATTTT	GTTTGCGACT TCAGTTTTGG CTCAGGAATA CAAAGGAATG GTTTGCGACT TCAGTTTTGG CTCAGGAATA CAAAGGAATG
GTTTGCGACT TCAGTTTTGG	CTCAGGAATA CAAAGGAATG
		60				109
	95	GGCGTAGAGA	CAAGGACAAC	AGAGACTCCG	CTCCGTAAAC	ACTTCAATTT
	S2	GGCGTAGAGA	CAAGGACAAC	AGAGACTCCG	CTCCGTAAAC	ACTTCAATTT
	48	GGCGTAGAGA	CAAGGACAAC	AGAGACTCCG	CTCCGTAAAC	ACTTCAATTT
	119	GGCGTAGAGA	CAAGGACAAC	AGAGACTCCG	CTCCGTAAAC	ACTTCAATTT
		110				159
	95	GACTCCTGTG	GGTTCTCAGG	GCATTCGCTT	AAGTTGGGAA	GTCCAACACT
	S2	GACTCCTGTG	GGTTCTCAGG	GCATTCGCTT	AAGTTGGGAA	GTCCAACACT
	48	GACTCCTGTG	GGTTCTCAGG	GCATTCGCTT	AAGTTGGGAA	GTCCAACACT
	119	GACTCCTGTG	GGTTCTCAGG	GCATTCGCTT	AAGTTGGGAA	GTCCAACACT
		160				209
Уви»	95	TGTCTGACCT	CAAAGGAACA	GATATTTCTC	TAAAAGCGGT	GAATCCTTCT
	S2	TGTCTGACCT	CAAAGGAACA	GATATTTCTC	TAAAAGCGGT	GAATCCTTCT
	48	TGTCTGACCT	CAAAGGAACA	GATATTTCTC	TAAAAGCGGT	GAATCCTTCT
	119	TGTCTGACCT	CAAAGGAACA	GATATTTCTC	TAAAAGCGGT	GAATCCTTCT
		210		233
	95	GACCCGTTAG	TCTACAAAAG	ACAA
	S2	GACCCGTTAG	TCTACAAAAG	ACAA
	48	GACCCGTTAG	TCTACAAAAG	ACAA
	119	GACCCGTTAG	TCTACAAAAG	ACAA

Както се вижда от Таблица 5, всеки от клоновете експресиращи защитни антигени срещу Е. granulosus включва една идентична 224 н. дв. ДНК молекула /нуклеотиди от 10 до 233/.

ПРИМЕР -2...;	СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК ОТ КЛОН 95
кДНК	беше секвенирана използувайки ^T7Sequencing Kit

(Pharmacia) със CsCl пречистена плазмидна ДНК и олигонуклеотидни праймери, получени от pGEX секвенцията, приблизително 30

н.дв.

на ляво и на дясно от EcoR I клониращото място. Олигонуклеотидите бяха синтезирани чрез използуването на PCR - MATE 391 DNA Synthesiser (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA) и химикали от Applied Biosystems. Вътрешната секвенция беше получена при използването на прави и обратни олигонуклеотидни праймери съответни на вътрешната кДНК секвенция.

Пълната секвенция на клон 95 и предсказаната аминокиселинна секвенция на транслирания белтък е показана на

Фигура 4. Клон 95 на кДНК съдържа парче от 715 н.дв. / с изключение на нуклеотидите получени като част от клониращата стратегия в ламбда ZAP/. Тази кДНК съдържа отворена рамка за четене от 461 н.дв., кодираща един предсказан белтък с молекулно тегло 16 592 Да.

Следната ДНК секвенция е включена в пълната секвенция на клон 95, като тя произхожда от стратегията , използувана за получаване на кДНК и беше клонирана във вектора ламбда ZAP XR.

На 5' края на кДНК:

⁵'GAATTCGGCACGAG³' нА 3' края на кДНК:

⁵'AAAAAAAAAAAAAAAAAACTCGAG³’

Секвенцията от Фигура 4 беше потвърдена независимо използувайки процедурата от Пример 6.

ПРОМИШЛЕНО ПРИЛОЖЕНИЕ

Настоящото изобретение предлага един антигенен полипептид заедно с активни пептидни фрагменти и техни варианти, коитно са ефективни за предизвикване на защитен имунологичен отговор срещу инфекция с Е. granulosus на даден гостоприемник, податлив на такава инфекция. Беше установено, че ваксинирането с този полипептид и/или неговите пептидни фрагменти стимулира почти напълно имунитета срещу заразяване с яйца от Е. granulosus. Изобретението също така предлага рекомбинантен метод за експресия на антигена, чрез който могат да бъдат получени комерсиални количества.

Ясно е, че горното описание се предлага като пример и че опитните експериментатори могат да използуват редица вариации както на материалите, така и на използуваните техники.

ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИИТЕ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ:

/1/ ЗЯВИТЕЛ: NEW ZEALAND PASTORAL AGRICULTURAL INSTITUTE LIMITED, компания включена към Companies Act 1955, съответствуващ на Crwn Research Institutes Act 1992 и имаща регистрирана кантора на Peat Marwick Tower, 85 Alexandra Street, Hamilton New Zealand, THE UNIVERSITY OF MELBOURNE, организация, съобразена със законите на Щата Виктория, Grattan Street, Prkville, Victoria 3052, Australia.

/2/ НАЗВАНИЕ HA ПАТЕНТА: Защитни антигени срещу инфекция среппцу Echinococcus granulosus и ваксини съдържащи такива антигени.

/3/ БРОЙ НА СЕКВЕНЦИИТЕ: 4 /4/ АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ:

/А/ Адресант: A J PARK & SON /Б/ Улица: HUDDART PARKER BUILDING, POST OFFICE SQUARE /В/ Град: Ρ Ο BOX 949, WELLINGTON /Г/ Страна:NEW ZEALAND /5/ КОМПЮТЪРНА ФОРМА:

/А/ Вид: 3.5, DS, HD FLOPPY DISK /Б/ Компютър: IBM PC COMPATIBLE /В/ Операционна система: MS-DOS /Г/ Софтуер: WORP PERFECT 5.1 FOR WINDOWS /б/ ТЕКУЩИ ДАННИ:

/А/ Номер на заявката:

/Б/ Дата на попълване: 22. февруари 1993 /В/ Класификация:

/7/ АДВОКАТ/АГЕНТ:

/А/ Име: BENNETT, MICHAEL R.

/8/ТЕЛЕКОМУНИКАЦИОННА ИНФОРМАЦИЯ:

/А/ Телефон: (64 4) 473 8278 /Б/ Телефакс: (64 4) 472 3358

472 3351 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА СЕКВЕНЦИЯ ID No 1 /1/ СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

/А/ Дължина: 224 НУКЛЕОТИДНИ ДВОЙКИ /Б/ Вид: НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА /В/ Верижност: ЕДНОВЕРИЖНА /Г/ Топология: ЛИНЕЙНА /2/ МОЛЕКУЛЕН ВИД: кДНК /3/ ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: SEQ ID NO 1

1

GT СТС Leu

ATT lie

TTG Leu

TTT Phe

GCG Ala

ACT Thr

TCA Ser

GTT Vai

TTG GCT

CAG Gin

GAA Glu

TAC Tyr

AAA Lys

GGA Gly

47

Leu

Ala

48

ATG

GGC

GTA

GAG

ACA

AGG

ACA

GAG

ACT

CCG

CTC

COT

AAA

CAC

92

Met

Gly

Vai

Glu

Thr

Arg

Thr

Glu

Thr

Pro

Leu

Arg

Lys

His

93

ТТС

AAT

TTG

ACT

CCT

GTG

GGT

TCT

CAG

GGC

ATT

CGC

TTA

ACT

TGG

137

Phe

Asn

Leu

Thr

Pro

Vai

Gly

Ser

Sin

Gly

lie

Arg

Leu

Ser

Trp

13

GAA

GTC

CAA

CAC

TTG

TCT

GAC

CTC

AAA

GGA

ACA

GAT

ATT

TCT

CTA

182

G1U

Vai

Gin

His

Leu

Ser

Asp

Leu

Lys

Gly

Thr

Asp

lie

Ser

Leu

18

AAA

GCG

GTG

AAT

CCT

TCT

GAC

CCG

TTA

GTC

TAC

AAA

AGA

CAA

224

Lys

Ala

Vai

Asn

Pro

Ser

Asp

Pro

Leu

Vai

Tyr

Lys

Arg

Gin

(3) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID No 2:

/1/ СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ /А/ Дължина: 74 АМИНО КИСЕЛИНИ /Б/ Вид: АМИНО КИСЕЛИНИ /В/ Топология: ЛИНЕЙНА /2/ МОЛЕКУЛЕН ВИД: БЕЛТЪК /3/ ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИИТЕ: SEQ ID No 2.:

1

Leu

lie

Leu

Phe

Ala

Thr

Ser

Vai

Leu

Ala

Gin

Glu

Tyr

Lys

Gly

15

16

Het

Gly

Vai

Glu

Thr

Arg

Thr

Glu

Thr

Pro

Leu

Arg

Lys

His

30

31

Pile

Asn

Leu

Thr

Pro

Vai

Gly

Ser

Gin

Gly

Ila

Arg

Leu

Ser

Trp

45

46

Glu

Vai

Gin

His

Leu

Ser

Asp

Leu

Lys

Gly

Thr

Asp

lie

Ser

Leu

60

61

Lys

Ala

Vai

Asn

Pro

Ser

Asp

Pro

Leu

Vai

Tyr

Lys

Arg

Gin

74

(4) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID No 3:

/1/ СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

/А/ Дължина: 715 НУКЛЕОТИДНИ ДВОЙКИ /В/ Вид: НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА /В/ Верижност: ЕДНОВЕРИЖНА /Г/ Топология: ЛИНЕЙНА /2/ МОЛЕКУЛЕН ВИД: кДНК /3/ ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: SEQ ID No. 3:

	1 TC	CAG Gin	TTA Leu	TGT Cye	CTC Leu	ATT lie	TTG Leu
	4	TAC	AAA	GGA	ATG	GGC	GTA
		Tyr	Lys	Gly	Het	Gly	Vai
	9	CGT	AAA	CAC	TTC	AAT	TTG
		Arg	Lye	His	Phe	Aen	Leu
	138	TTA	AGT	TGG	GAA	GTC	CAA
		Leu	Ser	Trp	Glu	Vai	Gin
	183	ATT	TCT	CTA	AAA	GCG	GTG
(		lie	Ser	Leu	Lys	Ala	Vai
	228	AGA	CAA	ACT	GCA	AAA	TTC
		Arg	Gin	Thr	Ala	Lys	Phe
	273	CTG	AAG	CCC	TCC	ACA	TTA
		Leu	Lye	Pro	Ser	Thr	Leu
	318	GCG	AAA	AAG	ACC	ATT	TTG
		Ala	Lys	Lys	Thr	lie	Leu
	363	CGC	GCT	GGC	AAG	AAG	GAA
		Arg	Ala	Gly	Lys	Lys	Glu
	408	TTA	ACA	TCC	GCA	ATC	GCT
		Leu	Thr	Ser	Ala	lie	Ala
	453	GTC	CTT	ACT	TGA	ACT	CTC
		Vai	Leu	Thr

	498	CTT	CTA	TAC	TGA	GTA	GCA
	543	ACT	CTT	CTT	CCA	CAT	CAG
	588	TCA	CCA	TTT	ATT	TTC	GCT
	633	GTG	GAT	TAC	TCC	CGA	ATG

TTT	GCG	ACT	TCA	GTT	TTG	GCT	CAG	GAA	47
Phi	Ala	Thr	Ser	Vai	Leu	Ala	Gin	Glu
GAG	ACA	AGG	ACA	ACA	GAG	ACT	CCG	CTC	92
Glu	Thr	Arg	Thr	Thr	Glu	Thr	Pro	Leu
ACT	CCT	GTG	GGT	TCT	CAG	GGC	ATT	CGC	137
Thr	Pro	Vai	Gly	Ser	Gin	Gly	He	Arg
CAC	TTG	TCT	GAC	CTC	AAA	GGA	ACA	GAT	182
His	Leu	Ser	Asp	Leu	Lys	Gly	Thr	Asp
AAT	CCT	TCT	GAC	CCG	TTA	GTC	TAC	AAA	227
Asn	Pro	Ser	Asp	Pro	Leu	Vai	Tyr	Lys
CCA	GAT	GGA	CAA	CTC	ACT	ATC	GGC	GAA	272
Ser	Asp	Gly	Gin	Leu	Thr	lie	Gly	Glu
TAC	AAA	ATG	ACT	GTG	GAA	GCA	GTG	AAA	317
Tyr	Lys	Het	Thr	Vai	Glu	Ala	Vai	Lys
GGA	TTC	ACC	GTA	GAC	ATT	GAG	ACA	CCG	362
Gly	Phe	Thr	Vai	Asp	ILe	Glu	Thr	Pro
AGC	ACT	GTA	ATG	ACT	AGT	GGA	TCC	GCC	407
Ser	Thr	Vai	Het	Thr	Ser	Gly	Ser	Ala
GGT	TTT	GTA	TTC	AGC	TGC	ATA	GTG	GTT	452
Gly	Phe	Vai	Phe	Ser	Cye	lie	Vai	Vai
ATG	TAA	GTC	AAT	GCA	AAT	TAT	CCA	CTG	497
CGA	CCC	ATA	ACT	TGC	ATT	TTT	CAA	ATA	542
GCT	TCC	TTG	GTG	CCG	AAG	ATG	CAC	AAA	587
TTA	TTA	ACA	TTT	GTA	TGA	CCT	CTC	ATT	632
ACA	AAT	ACG	GGA	CTT	TGT	CAT	ATT	TGC	677

678

TTC ATT GTT ATC ACC CTT AAT TCC AAT TCA CTG ACT CG

715 (5) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID No. 4:

/1/ СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

/А/ Дължина: 153 АМИНО КИСЕЛИНИ /Б/ Вид: АМИНО КИСЕЛИНИ /В/ Топология: ЛИНЕЙНА /2/ МОЛЕКУЛЕН ВИД: БЕЛТЪК /3/ ОПИСАНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА: SEQ ID No. 4:

1

Gin

Leu

Cys

Leu

lie

Leu

Phe

Ala

Thr

Ser

Vai

Leu

Ala

Gin

Glu

15

16

Tyr

Lys

Gly

Met

Gly

Vai

Glu

Thr

Arg

Thr

Glu

Thr

Pro

Leu

30

31

Arg

Lye

His

Phe

Asn

Leu

Thr

Pro

Vai

Gly

Ser

Gin

Gly

He

Arg

45

46

Leu

Ser

Trp

Glu

Vai

Gin

His

Leu

Ser

Asp

Leu

Lys

Gly

Thr

Asp

60

61

He

Ser

Leu

Lye

Ala

Vai

Asn

Pro

Ser

Asp

Pro

Leu

Vai

Tyr

Lys

75

76

Arg

Gin

Thr

Ala

Lys

Phe

Ser

Asp

Gly

Gin

Leu

Thr

He

Gly

Glu

90

91

Leu

Lys

Pro

Ser

Thr

Leu

Tyr

Lys

Met

Thr

Vai

Glu

Ala

Vai

Lys

105

106

Ala

Lys

Thr

lie

Leu

Gly

Phe

Thr

Vai

Asp

ILe

Glu

Thr

Pro

120

121

Arg

Ala

Gly

Lye

Lys

Glu

Ser

Thr

Vai

Met

Thr

Ser

Gly

Ser

Ala

135

136

leu

Thr

Ser

Ala

He

Ala

Gly

Phe

Vai

Phe

Ser

Cys

lie

Vai

150

151 Vai Leu Thr 153

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Пречистен антигенен полипептид, който има молекулно тегло в диапазона 23 до 25кД, изчислено чрез SDS-PAGE и който включва аминокиселинната секвенция:

Leu He Leu Phe Ala Thr Ser Vai Leu Ala Gin Glu Tyr Lys Glu Met Glu Vai Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Vai Glu Ser Gin Glu lie Arg Leu Ser Trp Glu Vai Gin His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp He Ser Leu Lys Ala Vai Asn Pro Ser Asp Pro Leu Vai Tyr Lys Arg Gin

и който е в състояние да генерира защитен имунологичен отговор при податлив на инфекция с Е. granulosus гостоприемник; или пептиден фрагмент или негов вариант, които имат

еквивалентна защитна имунологична активност.
2. Пептиден фрагмент, съгласно претенция 1, включващ аминокиселинната секвенция:

Leu He Leu Phe Ala Thr Ser Vai Leu Ala Gin Glu Tyr Lys Glu Met Glu Vai Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Vai Glu Ser Gin Glu He Arg Leu Ser Trp Glu Vai Gin His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp He Ser Leu Lys Ala Vai Asn Pro Ser Asp Pro Leu Vai Tyr Lys Arg Gin
3. Пептиден фрагмент съгласно претенция 1, състоящ се от аминокиселинната секвенция:

Leu He Leu Phe Ala Thr Ser Vai Leu Ala Gin Glu Tyr Lys Glu Met Glu Vai Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Vai Glu Ser Gin Glu lie Arg Leu Ser Trp Glu Vai Gin His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp He Ser Leu Lys Ala Vai Asn Pro Ser Asp Pro Leu Vai Tyr Lys Arg Gin
4.

Пептиден фрагмент, съгласно претенция 1, състоящ се от аминокиселинната секвенция:

Gin Leu Cys Leu He Leu Phe Ala Thr Ser Vai Leu Ala Gin Glu Tyr Lys Glu Met Glu Vai Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Vai Glu Ser Gin Glu He Arg Leu Ser Trp Glu Vai Gin His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp He Ser Leu Lys Ala Vai Asn Pro Ser Asp Pro Leu Vai Tyr Lys

Arg Gin

5.

Полипептид или пептиден фрагмент, съгласно претенция 1, включващ аминокиселинната секвенция:

Gin Leu Cys Leu He Leu Phe Ala Thr Ser Vai Leu Ala Gin Glu Tyr Lys Glu Met Glu Vai Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Vai Glu Ser Gin Glu He Arg Leu Ser Trp Glu Vai Gin His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp He Ser Leu Lys Ala Vai Asn Pro Ser Asp Pro Leu Vai Tyr Lys Arg Gin Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gin Leu Thr He Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Vai Glu Ala Vai Lys Ala Lys Lys Thr He Leu Gly Phe Thr Vai Asp He Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr Vai Met Thr Ser Gly Ser Ala Leu Thr Ser Ala He Ala Glu Phe Vai Phe Ser Cys He Vai Vai

Vai Leu Thr

6. Пептиден фрагмент, съгласно претенция 1, състоящ се от аминокиселинна секвенция:

Gin Leu Cys Leu lie Leu Phe Ala Thr Ser Vai Leu Ala Gin Glu Туг Lys Glu Met Glu Vai Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Vai Glu Ser Gin Glu He Arg Leu Ser Trp Glu Vai Gin His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp He Ser Leu Lys Ala Vai Asn Pro Ser Asp Pro Leu Vai Tyr Lys Arg Gin Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gin Leu Thr He Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Vai Glu Ala Vai Lys Ala Lys Lys Thr He Leu Gly Phe Thr Vai Asp He Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr Vai Met Thr Ser Gly Ser Ala Leu Thr Ser Ala He Ala Glu Phe Vai Phe Ser Cys He Vai Vai

Vai Leu Thr

7. Полипептид или пептиден фрагмент или негов вариант, съгласно претенции 1 до 6, който е продукт от експресирането на нуклеотидна секвенция в клетката гостоприемник.
8. Полипептид или пептиден фрагмент или негов вариант, съгласно претенция 7, който се експресира в клетката гостоприемник като хибриден белтък.
9. Полипептид или пептид, който съгласно претенция 8 се експресира като хибриден белтък с ензима глутатион sтрансфераза (Е.С 2.5.18).
10. Състав, характеризиращ се с това, че е способен да генерира защитна имунологична реакция срещу инфекция с Е. granulosus в даден податлив гостоприемник и основно се състои от компонент подбран от група състояща се от:

/а/ полипептидът от претенция 1;

/б/ пептиден фрагмент от /а/, които има еквивалентна имунологична активност; и /в/ вариант на /а/ или /б/, който е бил модифициран чрез вмъкване, заместване или премахване на една или повече аминокиселини и който има еквивалентна защитна имунологична активност.
11. ДНК молекула, която е подбрана от групата състояща се от:

/а/ нуклеотидна секвенция, кодираща антигенния полипептид от претенция 1;

/б/ нуклеотидна секвенция, кодираща пептиден фрагмент от антигенния пептид от /а/, който фрагмент има еквивалентна защитна имунологична активност, като полипептида от /а/; и /в/ нуклеотидна секвенция, кодираща вариант на полипептида от /а/ или пептида от /б/ в който аминокиселинната секвенция е била модифицирана чрез вмъкване, заместване или премахване на една или повече аминокиселини, като този вариант има еквивалентна защитна имунологична активност на полипептида от /а/ или пептидния фрагмент от /б/.
12. ДНК молекула, която има следната секвенция:

Λ ч»»

GT СТС АТТ TTG ТТТ GCG ACT TCA GTT TTG GCT CAG GAA ТАС ААА GGA ATG GGC GTA GAG АСА AGG АСА АСА GAG ACT CCG СТС CGT AAA САС ТТС ААТ TTG ACT ССТ GTG GGT TCT CAG GGC АТТ CGC ТТА AGT TGG GAA GTC CAA CAC TTG ТСТ GAC СТС ААА GGA АСА GAT ATT TCT СТА ААА GCG GTG ААТ ССТ ТСТ GAC CCG TTA GTC ТАС ААА AGA САА

13. ДНК молекула, която има следната секвенция:

CAG TTA TGT CTC ATT TTG TTT GCG ACT TCA GTT TTG GCT CAG GAA TAC AAA Gin Leu Cys Ley He Leu Phe Ala Thr Ser Vai Leu Ala Gin Glu Tyr Lys GGA ATG GGC GTA GAG ACA AGG ACA ACA GAG ACT CCG CTC CGT AAA CAC TTC Gly Met Gly Vai Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe ААТ TTG ACT CCT GTG GOT TCT CAG GGC ATT CGC TTA AGT TGG GAA GTC CAA Αβη Leu Thr Pro Vai Gly Ser Gin Gly He Arg Leu Ser Trp Glu Vai Gin CAC TTG TCT GAC CTC AAA GGA ACA GAT ATT TCT CTA AAA GCG GTG AAT CCT His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp He Ser Leu Lys Ala Vai Asn Pro TCT GAC CCG TTA GTC TAC AAA AGA CAA ACT GCA AAA TTC TCA GAT GGA CAA Ser Asp Pro Leu Vai Tyr Lys Arg Gin Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gin СТС ACT ATC GGC GAA CTG AAG CCC TCC ACA TTA TAC AAA ATG ACT GTG GAA Leu Thr He Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Vai Glu GCA GTG AAA GCG AAA AAG ACC ATT TTG GGA TTC ACC OTA GAC ATT GAG ACA Ala Vai Lys Ala Lys Lys Thr He Leu Gly Phe Thr Vai Asp He Glu Thr CCG CGC GCT GGC AAG AAG GAA AGC ACT OTA ATG ACT AGT GGA TCC GCC TTA Pro Arg Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr Vai Met Thr Ser Gly Ser Ala Leu ACA TCC GCA ATC GCT GOT TTT GTA TTC AGC TGC ATA GTG GTT GTC CTT ACT Thr Ser Ala lie Ala Gly Pho Vai Phe Ser Cys He Vai Vai Vai Leu Thr

14. ДНК молекула която има следната секвенция:

CAG TTA TGT CTC ATT TTG TTT GCG ACT TCA GTT TTG GCT CAG GAA TAC AAA Gin Leu Cys Ley Ila Leu Phe Ala Thr Ser Vai Leu Ala Gin Glu Tyr Lys GGA ATG GGC GTA GAG ACA AGG ACA ACA GAG ACT CCG CTC CGT AAA CAC TTC Gly Met Gly Vai Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe AAT TTG ACT CCT GTG GGT TCT CAG GGC ATT CGC TTA AGT TGG GAA GTC CAA Asn Leu Thr Pro Vai Gly Ser Gin Gly lie Arg Leu Ser Trp Glu Vai Gin CAC TTG TCT GAC CTC AAA GGA ACA GAT ATT TCT CTA AAA GCG GTG AAT CCT His Lau Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp lie Ser Leu Lys Ala Vai Asn Pro TCI GAC CCG TTA GTC TAC AAA AGA CAA ACT GCA AAA TTC TCA GAT GGA CAA Sar Asp Pro Leu Vai Tyr Lys Arg Gin Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gin CTC ACT ATC GGC GAA CTG AAG CCC TCC ACA TTA TAC AAA ATG ACT GTG GAA Leu Thr He Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Vai Glu GCA GTG AAA GCG AAA AAG ACC ATT TTG GGA TTC ACC GTA GAC ATT GAG ACA Ala Vai Lys Ala Lys Lys Thr Ila Leu Gly Phe Thr Vai Asp He Glu Thr CCG CGC GCT GGC AAG AAG GAA AGC ACT GTA ATG ACT AGT GGA TCC GCC TTA Pro Arg Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr Vai Met Thr Ser Gly Ser Ala Leu ACA TCC GCA ATC GCT GGT TTT GTA TTC AGC TGC ATA GTG GTT GTC CTT ACT Thr Sar Ala Ila Ala Gly Phe Vai Phi Ser Cys He Vai Vai Vai Leu Thr

TGAACTCTCATGTAAGTCAATGCAAATTATCCACTGCTTCTATACTGAGTAGCACGACCCATAACTTGCATTTTTCAAATAAC

TCTTCTTCCACATCAGGCTTCCTTGGTGCCGAAGATGCACAAATCACCATTTATTTTCGCTTTATTAACATTTGTATGACCTC TCATTGTGGATTACTCCCGAATGACAAATACGGGACTTTGTCATATTTGCTTCATTGTTATCACCCTTAATTCCAATTCACTG ^*·

ACTCG

15. ДНК молекула, съгласно всяка една от претенции 11 до 14, която е била изолирана от естествен източник.
16. ДНК молекула, съгласно всяка една от претенции 11 до 14, коята е кДНК.
17. Рекомбинантен експресионен вектор, който съдържа ДНК молекула, съгласно всяка една от претенции 11 до 16.
18. Клетка гостоприемник, трансформирана с вектор, съгласно претенция 17 и способна да експресира полипептида, пептидния фрагмент или негов вариант, който е кодиран.
19. Клетка гостоприемник, съгласно претенция 18, която е прокариот.
20. Клетка гостоприемник, съгласно претенция 19, като прокариотния гостоприемник е Е. coli.
21. Клетка гостоприемник, съгласно претенция 18, която е еукариот.
22. Метод за получаване на антигенен полипептид, пептиден фрагмент или негов вариант, който се състои в култивиране на клетки, съгласно всяка една от претенции 18 до 21 и получаване на експресирания продукт.
23. Антигенен полипептид, пептиден фрагмент или негов вариант, получен по метода от претенция 22.
24. Ваксина, характеризираща се с това, че съдържаща имунологично-ефективно количество от полипептида, пептидния фрагмент или негов вариант, съгласно всяка една от претенции 1 до 9 и 23 в комбинация с фармацевтично приемлив адювант, носител или разтворител.
25. Ваксина съгласно претенция 24, която по-нататък включва едно ефективно количество от един или повече полипептид/и/ от Е. granulosus имащи молекулно тегло, определено 4pe3SDS-PAGE подбрано от ЗОкД, 34кД и 40кД или от един или повече фрагменти или варианти от споменатите полипептиди, имащи еквивалентна имунологична активност.
26. Рекомбинантна вирусна ваксина, характеризираща се с това, че включва нуклеинова киселина кодираща антигенен полипептид, пептиден фрагмент или негов вариант, съгласно претенция 1 и която е способна да експресира споменатия кодиран полипептид, пептиден фрагмент или негов вариант.
27. Метод за защита на гостоприемник, податлив на инфектиране с паразити от Echinococcus или Taeniid, срещу такава инфекция състоящ се във въвеждане в гостоприемника на имунологично активен полипептид, пептиден фрагмент или вариант, съгласно всяка една от претенции 1 до 8 и 22.
28. Метод за защита на гостоприемник, податлив на инфектиране с паразити от Echinococcus или Taeniid, срещу такава инфекция.
29. Метод за защита на гостоприемник, податлив на инфектиране с паразити от Echinococcus или Taeniid, срещу такава инфекция, състоящ се от въвеждане в гостоприемника на имунологично ефективно количество ваксина, съгласно всяка една от претенции 24 до 26.
30. Метод, съгласно всяка една от претенции 27 до 29, при който споменатия паразит е Е. granulosus.
31. Метод, съгласно всяка една от претенции 27 до 29, когато споменатия паразит е Е. multilocularis, Е. vogelii, Т. ovis, Т. saginata, Т. solium, Т. multiceps или Т. hudatigena.
32. Очистено антитяло или свързващ -| агмент, специфичен за антигенния полипептид, пептиден фрагмент или вариант, съгласно претенция!.
33. Белязана ДНК молекула, съдържаща част или цялата нуклеотидна секвенция от Фигура 4, удобна за използуване като сонда за идентифициране на нуклеиновата киселина, кодираща защитния антиген от Echinococcus или Taeniid, различни от Е. granulosus.
34. Използуването на антитяло или свързващ фрагмент, съгласно претенция 32, за идентифициране на защитен антиген от Echinococcus или Taeniid, но не Е. granulosus.
35. Използуване на ДНК молекула, съгласно претенция 33, за идентифициране на ДНК кодираща защитен антиген от Echinococcus или Taeniid, но не Е. granulosus.
36. Използуване на претенции 34 или 35, когато паразита, който не е Е. granulosus, е Е. multilocularis, Е. vogelii, Т. ovis, Т. saginata, Т. solium, Т. multiceps или Т. hudatigena.
37. Метод за идентифициране на защитен антиген от паразитите Echinococcus или Taeniid, но не Е. granulosus, който съдържа и стъпката на идентифициране на ген от споменатия паразит, който има нуклеотидна секвенция, хомоложна на част или на цялата нуклеотидна секвенция от Фигура 4.
38. Антигенен полипептид, пептиден фрагмент или вариант, съгласно претенция 1, който е описан подробно тук и има отношение към придружаващите примери и илюстрации.
39. ДНК молекула, съгласно претенция 11, която подробно е описана тук и има част или цялата секвенция от Фигура 4.
40. Рекомбинантен експресионен вектор, както е дефинирано в претенция 17 и подробно е описан тук.
41. Клетка гостоприемник, както е дефинирано в претенция 18 и подробно описано тук.
42. Метод за получаване на антигенен полипептид, пептиден фрагмент или вариант, съгласно претенция 22 и подробно описан тук.
43. Ваксина, както е дефинирано в претенция 24 и както е описана подробно тук.
44. Метод за предпазване на гостоприемник, податлив на заразяване с Echinococcus или Taeniid, срещу такава инфекция съгласно всяка една от претенции 27 до 29 икойто подробно е описан тук с оглед на приложените примери и илюстрации.