HU220575B1 - Echinococcus granulosus fertőzés elleni védettség létrehozására képes antigének és ilyen antigént tartalmazó vakcinák - Google Patents

Echinococcus granulosus fertőzés elleni védettség létrehozására képes antigének és ilyen antigént tartalmazó vakcinák Download PDF

Info

Publication number
HU220575B1
HU220575B1 HU9402404A HU9402404A HU220575B1 HU 220575 B1 HU220575 B1 HU 220575B1 HU 9402404 A HU9402404 A HU 9402404A HU 9402404 A HU9402404 A HU 9402404A HU 220575 B1 HU220575 B1 HU 220575B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
leu
thr
ser
gly
lys
Prior art date
Application number
HU9402404A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9402404D0 (en
HUT69925A (en
Inventor
David Duncan Heath
Stephen Bruce Lawrence
Marshall William Lightowlers
David Richard Maass
Mark John Ralston
Original Assignee
New Zealand Pastoral Agriculture Research Institute Ltd.
University Of Melbourne
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by New Zealand Pastoral Agriculture Research Institute Ltd., University Of Melbourne filed Critical New Zealand Pastoral Agriculture Research Institute Ltd.
Publication of HU9402404D0 publication Critical patent/HU9402404D0/hu
Publication of HUT69925A publication Critical patent/HUT69925A/hu
Publication of HU220575B1 publication Critical patent/HU220575B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43536—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms
    • C07K14/4355—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms from cestodes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány Echinococcus vagy Taeniid parazita fertőzésre fogékonygazdaszervezetben, ilyen fertőzés elleni védettség, különöstekintettel E. granulosus-fertőzés elleni védettség létrehozásáravakcinában alkalmazható antigén hatású polipeptidekkel,peptidfragmensekkel, vagy azok variánsaival foglalkozik. Azantigéneket előnyösen az azt kódoló DNS expresszálásával állítják előegy rekombináns gazdasejtben. A találmány szerinti antigén hatásúpolipeptid tartalmazza a 4. ábrán bemutatott aminosavszekvenciát. ŕ

Description

A leírás terjedelme 24 oldal (ezen belül 4 lap ábra)
HU 220 575 Bl
A találmány Echinococcus granulosus-fertőzés ellen védettség létrehozására képes antigénekkel, ilyen antigéneket tartalmazó vakcinákkal, valamint Echinococcus, illetve Taenia parazitákkal szemben fogékony gazdaszervezetekben védettség létrehozására szolgáló eljárásokkal foglalkozik.
A hidatid betegséget az Echinococcus rendbe tartozó szalagféreg lárvájával (metacestode állapottal) történő fertőzés okozza. Az átvitel ragadozó-zsákmány emlőscikluson keresztül történik a ragadozó végső gazdaszervezetek, illetve a növényevő és mindenevő közti-gazdaszervezetek között. Az Echinococcus szalagférgek közül az Echinococcus granulosus a legjelentősebb. Az E. granulosus a cisztikus hidatid betegség (CHD) okozója, amelyet a házikutyák és házi növényevők, például birkák és szarvasmarhák közti átvitel jellemez, és az ember csupán közti-gazdaszervezetként szerepel, azonban a parazita életciklusában rendesen nem vesz részt. Következésképp, az E. granulosus világszerte elterjedt, és előfordulása szoros párhuzamot mutat a világ azon területeivel, ahol a pásztorkodás a fő foglalkozás. Elfogadott tehát, hogy a CHD jelentős endémiás megbetegedés DélAmerika, Afrika, Ausztrália, Közép-Európa, KözépÁzsia kiterjedt részein és a mediterrán partok mentén, beleértve Észak-Afrikát.
Néhány országban napjainkban kísérletet tesznek a CHD visszaszorítására a kutyák gazdáinak kioktatásával és a kutyák mint végső gazdaszervezetek rendszeres féreghajtó kezelésével. Ezek a programok általában részben sikeresek voltak, azonban a betegség felszámolása sokkal nehezebbnek bizonyult.
A CHD visszaszorítására tett további előnyös próbálkozás, hogy vakcinázással megakadályozzuk a közti-gazdaszervezetnek az E. granulosus életciklusának cisztikus formájával való fertőződését.
Ez a megközelítés azzal a figyelemre méltó előnnyel jár, hogy meggátolja a fertőzésnek a közti-gazdaszervezetből származó cisztákat tartalmazó hulladékok elfogyasztásával történő átvitelét kutyákban. így a betegség felszámolása reális lehetőséggé válik.
A találmány elsősorban a vakcinázás lehetőségével foglalkozik.
Egy kereskedelemben forgalmazható vakcina kifejlesztésénél alapvető fontosságú az E. granulosus ellen védettséget kiváltó fajlagos antigének azonosítása. Napjainkig folytatott vizsgálatok [Gemmel M A., Immunology, 11, 325-335, (1966)]; Heath és munkatársai [J. Parasitol., 67, 797-799, (1981)] világosan kimutatták, hogy az E. granulosus onkoszférája ilyen antigének valószínű forrása, azonban védettséget kiváltó fajlagos E. granulosus-onkoszféraantigént nem sikerült azonosítani.
A WO 92/01051 számú nemzetközi közrebocsátási irat egy immunogén E. granulosus-peptidet, a peptidet kódoló DNS-szekvenciát és ennek a peptidnek a felhasználásával az E. granulosus-fertőzés kimutatására, valamint kezelésére szolgáló eljárásokat ismertet. A találmányban ismertetett („5-ös antigén”-ként leírt) E. granulosus-antigén azonban nincs kapcsolatban a bejelentő által vizsgált onkoszféraantigénekkel. Ezenkívül, a bejelentők kutatásairól megjelent közleményeikben kimutatták, hogy az 5-ös antigén ellen jelen levő ellenanyagok bárányokban nem hoznak létre védettséget E. granulosus-petékkel történt fertőzéssel szemben [Heath és munkatársai, Int. Journal of Parasitology, 22, 1017-1021,(1992)].
A találmány szerinti megoldás rövid összefoglalása
A találmány tárgyát tehát vakcinában alkalmazható, E. granulosus-fertőzéssel szemben védettség kiváltására alkalmazható fajlagos antigén, vagy annak legalább lehetőségét nyújtó antigén képezi.
A találmány tárgya egy olyan alapvetően tisztított antigén hatású polipeptid, amelynek molekulatömege SDS-PAGE vizsgálat alapján a 23-25 kilodalton tartományba esik, a 4. ábrán bemutatott szekvencia szerinti 4-77. aminosavakat tartalmazza és fogékony gazdaszervezetben E. granulosus-fertőzéssel szemben védettséget létrehozó immunválasz kiváltására képes; vagy annak lényegében azonos immunológiai aktivitással rendelkező peptidfragmense vagy variánsa.
A találmány előnyös megvalósításában a polipeptid a 4. ábra szerinti 1-154. aminosavakat tartalmazza.
A találmány még előnyösebb megvalósításában a találmány tárgyát egy a 4. ábrán bemutatott szekvencia szerinti aminosavak összességét vagy egy részét tartalmazó peptidfragmens képezi.
Előnyös esetben a polipeptidet vagy peptidfragmenst egy gazdasejtben az azt kódoló nukleotidszekvencia expresszálásával állítjuk elő.
A találmány tárgyát másrészt egy fogékony gazdaszervezetben E. granulosus-fertőzéssel szemben védettséget létrehozó immunválasz kiváltására képes készítmény képezi, amely összetevőként lényegében az alábbiak valamelyikét tartalmazza:
a) a fent ismertetett polipeptid;
b) az a) pontban ismertetett polipeptiddel egyenértékű védettséget létrehozó immunválaszt kiváltó peptidfragmens;, illetve
c) az a), illetve b) pontok szerinti peptidek variánsa, amelyet egy vagy több aminosav inszertálásával, helyettesítésével vagy deletálásával módosítottunk, és amely azokkal legalább egyenértékű immunológiai aktivitással rendelkezik.
A találmány kiteljed továbbá olyan DNS-molekulára, amely a következők közül valamelyiket tartalmazza:
a) a fenti antigén hatású polipeptidet kódoló nukleinsavszekvenciát;
b) az a) pont szerinti antigén hatású polipeptid egy peptidffagmensét kódoló olyan nukleinsavszekvenciát, mely fragmens az a) pont szerinti polipeptiddel egyenértékű védettséget létrehozó immunaktivitással rendelkezik; valamint (c) az a) pont szerinti polipeptid, illetve b) pont szerinti peptid variánsát kódoló olyan nukleinsavszekvencia, amelyben az aminosavszekvenciát egy vagy több aminosav inszertálásával, helyettesítésével vagy deletálásával módosítottuk, és amely variáns az a) pont szerinti polipeptiddel, illetve b) pont szerinti peptidfragmenssel egyenértékű immunológiai aktivitással rendelkezik.
HU 220 575 Bl
A találmány előnyös megvalósításában a DNSmolekula tartalmazza a 4. ábra szerinti legalább a 10-233. nukleotidokat, előnyösebben a 4. ábra szerinti 3-461. nukleotidokat, és még előnyösebben a 4. ábra szerinti 1-461. nukleotidokat.
A találmány kiterjed továbbá a fenti DNS-molekulát tartalmazó expressziós vektorokra, ilyen vektorokkal transzformált és a kódolt polipeptid, annak peptidfragmense vagy variánsa expresszálására képes gazdasejtekre, valamint egy antigén hatású polipeptid, annak ffagmense vagy variánsa előállítására szolgáló eljárásokra, mely eljárás tartalmazza a fenti gazdasejtek tenyésztését és az expresszált termék visszanyerését.
A találmány tárgyát képezi továbbá az E. granulosus-polipeptidet, -peptidfragmenst vagy a fenti polipeptid variánsát, valamint egy immunológiailag megfelelő adjuvánst vagy hordozóanyagot tartalmazó E. granulosus-fertőzés elleni vakcina.
A találmány kiteljed továbbá fogékony gazdaszervezetben E. granulosus vagy Taeniid parazitákkal történt fertőzés ellen védettség létrehozására szolgáló eljárásra, mely eljárás tartalmazza az említett gazdaszervezetnek a találmány szerinti polipeptid, peptidfragmens vagy a fenti polipeptid variánsa az említett fertőzés ellen védettség kiváltására képes mennyiségének adagolását.
Előnyösen a polipeptidet, peptidfragmenst vagy variánst a fentiek szerint az említett gazdaszervezetnek vakcina formájában adagoljuk.
A találmány kiteljed továbbá a fenti antigén hatású polipeptidre, peptidfragmensre vagy variánsra fajlagos ellenanyagra.
Az ábrák rövid leírása
A találmány tárgyát ugyan a fentiekben ismertetettek képezik, a gyakorlatban járatos személy számára azonban világos, hogy a találmány a fentiekre nem korlátozódik, hanem kiteljed az alábbi leírás szerinti példák nyújtotta lehetőségekre. Pontosabban, a találmány jobb megértését szolgálják az alábbi ábrák:
Az 1. ábra onkoszférák preparatív SDS-PAGE frakcióival végzett vakcinázással nyert IgG] és IgG2 ellenanyagokat mutat. Birkákból álló csoportokat onkoszférákból nyert olyan SDS-PAGE frakciókkal vakcináztunk, amelyek az alábbi becsült molekulatömegű antigéneket tartalmazták: 1. csoport: a 21 kilodalton alatti összes molekula; 2. csoport: 23 és 25 kilodalton; 3. csoport: 30 kilodalton; 4. csoport: 34 kilodalton; 5. csoport: két 40 kilodalton molekulatömegű; 6. csoport: 43 kilodalton; 7. csoport: a 43 kilodalton feletti összes molekula; 8. csoport: az eddigi összes molekula elegye; 9. csoport: csak adjuváns; 10. csoport: az ebbe a csoportba tartozó birkákat nem frakcionált, egyébként az 1-9. csoportokhoz hasonló módon kezelt onkoszférákkal vakcináztuk; a 21. csoportot fagyasztott-olvasztott, ultrahanggal kezelt aktivált E. granulosus-onkoszférákkal vakcináztuk. Az 1. ábra a fenti birkacsoportokban kiváltott ellenanyagválasz vizsgálatát mutatja SDS-PAGE-n futtatott teljes onkoszférakivonattal reagáltatva.
A 2. ábra klónozott antigénekkel történő vakcinázással birkákban nyert IGj és IgG2 ellenanyagválaszt mutatja. 11. csoport: S2 klón; 12: S3 klón; 13: 48. klón; 14: 95. klón; 15: 101. klón; 16: 119. klón; 17: 123. klón; 18: az összes klón elegye; 19: 33., 42., és 85. kiónok: 20: GST-kontroll; 21: fagyasztott-felolvasztott, ultrahanggal kezelt aktivált E. granulosus-onkoszférákkal immunizált öt birkától vett kevert szérum. Az immunizálás menete megegyezett a 11-20. csoportok antigénjei esetében alkalmazottal.
A 3. ábra onkoszféraantigének preparatív SDS-PAGE frakcióival vagy klónozott antigénekkel birkákban végzett vakcinázással nyert IgG2-választ mutat. A csoportok jelölése megegyezik a fentiekben ismertetettel.
A 4. ábra a találmány szerinti védettséget létrehozó antigén peptidffagmensének nukleotidszekvenciáját és következtetett aminosavszekvenciáját mutatja. A bal oldali számozás a nukleotidok számát jelöli 5’-3’ irányban, a jobb oldali számozás aminosavszámozást jelöl. A transzláció végét jelző kodont aláhúzással jelöltük.
A találmány szerinti megoldás részletes ismertetése
A fentiek szerint a találmány tárgyát elsősorban E. granulosus-fertőzés ellen gazdaszervezetben védettséget létrehozó antigén képezi, tekintet nélkül arra, hogy a fertőzést féreg vagy ciszta okozta. Az E. granulosusfertőzésre fogékony gazdaszervezetek az emlősök, beleértve az embert is. A találmány szerinti megoldás tehát alkalmazható lehet szárnyas, szarvasmarha, sertés, húsevő, ló és emberi gazdaszervezetekben.
Vizsgálataink során azonosítottunk egy olyan E. granulosus-polipeptidet, amely fogékony gazdaszervezetekben szerepet játszik az E. granulosus-fertőzés elleni védettség létrehozásában. Ez az E. granulosus-polipeptid körülbelül 23-25 kilodalton molekulatömeggel rendelkezik.
A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti natív E. granulosus-polipeptidből származó antigének, amennyiben azok gazdaszervezetben védettséget hoznak létre. Ezek a származékok általában a natív polipeptidvédettséget létrehozó epitópját tartalmazó peptid fragmensei, de lehetnek a natív polipeptidnek a gyakorlatban ismert eljárásokkal, például irányított mutagenezissel módosított fúnkcionálisan megfelelő variánsai [Adelman és munkatársai, DNA, 2, 183, (1983)]. Az említett eljárásokkal helyettesíthetünk például a szekvenciában aminosavakat fúnkcionálisan megfelelő aminosavakkal. Ismereteink szerint fúnkcionálisan megfelelő aminosavakat tartalmazó csoportok az alábbiak:
a) Al a Ser Thr Pro Gly;
b) Asn Asp Glu Gin;
c) Hi s Arg Lys ;
d) Me t Leu I le Val; és
e) Phe Tyr Trp.
Előnyös esetben az antigén a 4. ábra szerinti aminosavszekvencia egy részét vagy egészét tartalmazó peptidfragmens. Előnyösebben a peptidfragmens a 4. ábra szerinti 4-77. aminosavakat tartalmazza. Még előnyösebben a peptidfragmens a 4. ábra szerinti 1-77. aminosavakat tartalmazza. Legelőnyösebben azonban a peptidfragmens a 4. ábra szerinti 1-153. aminosavakat tartalmazza.
HU 220 575 Bl
A találmány szerinti, védettséget létrehozó antigén szokásos tisztítási eljárásokkal izolálható a natív E. granulosus-onkoszférájából. Az antigén kereskedelmi célú felhasználásra alkalmas mennyiségének előállítására azonban érthetően a szintetikus úton történő előállítási mód előnyös. Ilyen eljárások lehetnek a Merryfield szerinti lépésenkénti szilárd fázisú eljárással történő előállítás [J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149-2156, (1963)] és rekombináns DNS-technikák alkalmazásával való előállítási mód. A találmány megvalósítási módjában az utóbbi eljárást alkalmaztuk.
A találmány kiterjed továbbá a találmány szerinti antigén hatású polipeptid vagy peptid rekombináns úton történő előállítására.
Általában, a találmány szerinti, védettséget létrehozó antigén rekombináns DNS-technikákkal történő előállítása magában foglalja egy megfelelő gazdaszervezet vagy gazdasejt transzformálását az antigént kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós vektorral, ezt követően a trasznformált gazdasejtek tenyésztését, majd az expresszált antigén visszanyerését. Ilyen technikák leírását megtaláljuk általában Sambrook és munkatársai kézikönyvében [Molecular Cloning, második kiadás, Cold Spring Harbour Press, (1987)].
Az antigén rekombináns úton való előállításának egy kezdeti lépése az antigént kódoló DNS-szekvencia ligálása egy olyan megfelelő expressziós vektorba, amely a kódolószekvencia transzformálására használt gazdasejtben működőképes promotert és riboszóma kötőhelyet tartalmaz. Ilyen expressziós vektorok leggyakrabban alkalmazott példái a gazdasejtben önállóan replikálódó dupla szálú DNS-hurok alkotta plazmidok. Érthető azonban, hogy plazmidokon kívül egyéb megfelelő vektorok is felhasználhatók a találmány megvalósításában.
Előnyösen a gazdasejt, amelyben a polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát klónozzuk és expresszáljuk egy prokarióta, például E. coli. Alkalmazható például E. coli DH5 [Raleigh E. A. és munkatársai, Nucl. Acid Research, 76(4), 1563-1575, (1988)], E. coli K12 294es törzs [ATCC 31446 nyilvántartási szám], E. coli B, E. coli X1776 [ATCC 31537 nyilvántartási szám], E. coli ST9 törzs vagy E. coli JM 101. Alkalmazhatók egyéb prokarióták, például bacillusok, mint például Bacillus subtilis és Enterobakteriaceae, például Salmonella typhimurium, Serratia marcesans vagy gyengített Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin törzs (BCG).
Általában, ha a gazdasejt prokarióta, az alkalmazott gazdasejttel kompatibilis fajból származó replikációs és szabályozószekvenciákat tartalmazó expressziós és klónozási vektorokat alkalmazhatunk. A vektor tartalmazhat olyan jelzőszekvenciákat is, amelyek lehetővé teszik fenotípus alapján a transzformált sejtek kiválogatását. Az E. colit például gyakran transzformálják pBR322 plazmiddal, amely egy E. coli fajból származó plazmid [Bolivár és munkatársai, Gene, 2, 95, (1977)]. A pBR322 ampicillin- és tetraciklinrezisztenciáért felelős géneket tartalmaz, így tehát megkönnyíti a transzformáit sejtek azonosítását. Az expresszálandó DNS-t tartalmazó plazmidnak az expresszió céljából tartalmaznia kell egy promotert. Prokarióta gazdasejtek esetében rekombináns DNS-konstrukciók előállításánál leggyakrabban használt promoterek a béta-laktamáz (penicillináz) és laktóz promoter rendszerek [Chang és munkatársai, Natúré, 275, 615, (1978)]; Itakura és munkatársai, Science, ul98, 1056, (1977); Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544, (1979)] és egy triptofán (trp) promoter rendszer [Goeddel és munkatársai, Nucleic Acid Rés., 8, 4057, (1980); 0036776 számú európai szabadalmi leírás]. Ezek a leggyakrabban alkalmazott promoterek, de előállítottak és alkalmaztak egyéb mikrobiális eredetű promotereket is, például a tac promotert [Amann és munkatársai, Gene, 25, 167-178, (1980)], ezek nukleinsavszekvenciáját közölték, lehetővé téve a gyakorlatban járatos személynek azok működőképes formában való ligálását vektorokba épített génekbe [Siebenlist és munkatársai, Cell, 20, 269, (1980)].
Prokariótákon kívül alkalmazhatók eukarióta mikroorganizmusok is, például élesztők. Az eukarióta mikroorganizmusok közül leggyakrabban a Saccharomyces cerevisiae-t, más néven közönséges kenyérélesztőt alkalmazzák, bár számos egyéb törzs is rendelkezésre áll. Saccharomycesben expressziós célra gyakran használják például az YRp7 plazmidot [Stinchcomb és munkatársai, Natúré, 282, 39, (1979); Kingsman és munkatársai, Gene, 7, 141, (1979); Tschemper és munkatársai, Gene, 10, (1980)]. Ez a plazmid már tartalmazza a trpl gént, amely triptofán tartalmú táptalajon szaporodási képességét elvesztett mutáns élesztőtörzsekben, mint például az ATCC 44076 nyilvántartási számon szereplő törzsben vagy a PEP4-1 törzsben [Jones, Genetics, 85, 12, (1977)] alkalmazható jelzőszekvenciát tartalmaz. Az élesztőgazdasejt genomját jellemző trpl lézió lehetővé teszi triptofánmentes táptalajon való tenyésztéskor a transzformánsok felismerését.
Élesztővektorokban alkalmazható promoterszekvenciák lehetnek a 3-foszfoglicerát-kináz promotere [Hitzeman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, 2073, (1980)] vagy egyéb glikolitikus enzimek promoterei [Hess és munkatársai, J. Adv. Enzyme Reg., 7, 149, (1968); Holland és munkatársai, Biochemistry, 17, 4900, (1978)]. Egyéb, azzal a további előnnyel rendelkező promoterek, hogy transzkripciójukat szaporodási feltételek szabályozzák, az alkohol-dehidrogenáz 2, izocitokróm C, savas foszfatáz, a nitrogén-anyagcserével kapcsolatos lebontóenzimek, az előbb említett glicerinaldehid-3foszfát-dehidrogenáz, valamint a maltóz és galaktóz felhasználásért felelős enzimek promoter régiói. Alkalmazható bármely élesztővel kompatibilis promotert, replikációs origót és terminációs szekvenciát tartalmazó plazmidvektor.
Mikroorganizmusokon kívül többsejtű szervezetekből, például emlősökből és rovarokból származó sejtek tenyészetei is alkalmazhatók. Elvileg bármely gerincesekből vagy gerinctelenekből származó ilyen sejttenyészet alkalmazható. Az érdeklődés megnőtt azonban a gerincesekből származó sejtek iránt, és gerinces eredetű sejtek tenyészetben (szövettenyészetben) való szaporítása napjainkban szokásos eljárássá vált [Tissue Culture, Academic Press, Kruse és Patterson szerkesztő,
HU 220 575 Bl (1973)]. Ilyen alkalmazható gazdasejtvonalak például a VERŐ- és HeLa-sejtek, és a kínaihörcsögpetefészek (CHO)-sejtek. Az említett sejtekben alkalmazható expressziós vektorok (szükség szerint) rendszerint tartalmaznak egy replikációs origót és egy, az expresszálandó géntől 5’ irányban található promotert a szükséges riboszóma kötőhellyel, RNS-hasítási helyekkel, poliadenilációs hellyel és a transzkripció befejezését jelző szekvenciákkal együtt.
Emlőssejtekben való felhasználásra az expressziós vektorok szabályozóműködéseit gyakran vírus eredetű szekvenciák töltik be. Szokásosan használt promoterek például a polyoma, adenovírus 2, és leggyakrabban a simian vírus 40-ből (SV40) származnak. Különösen előnyös az SV40 vírus korai és késői promoterének alkalmazása, mivel mindkettő könnyen előállítható a vírusból egy olyan ffagmensen, amely tartalmazza az SV40 vírus replikációs origóját is [Fiers és munkatársai, Natúré, 273, 113, (1978)]. Használhatók kisebb vagy nagyobb SV40 vírusfragmensek is, feltéve, hogy azok tartalmazzák a vírus replikációs origójában található, a HindlII helytől a BglI hasítási helyig terjedő körülbelül 250 bázispár hosszúságú szekvenciát. Ezenkívül lehetséges és gyakran előnyös a kívánság szerinti génszakasszal eredetileg kapcsolt promoter- vagy szabályozószekvenciák alkalmazása, feltéve, hogy ezen szabályozószekvenciák kompatibilisek a gazdasejt rendszereivel.
A replikációs origót szolgáltathatja egy exogén origót, például az SV40 vírusból vagy egyéb vírusból (például polyoma, adeno, VSV, BPV) származó origót tartalmazó vektor vagy szolgáltathatja a gazdasejt-kromoszóma replikációs mechanizmusa. Abban az esetben, ha a vektor beépült a gazdasejt kromoszómájába, az utóbbi gyakran elegendő.
A kiválasztott gazdasejtnek a megfelelő vektorral való transzformálását követően a kódolt antigén hatású polipeptid, illetve peptid előállítható a gazdasejtek tenyésztésével. Ezt követően a fúziós peptid visszanyerhető.
Az antigén hatású polipeptid, illetve peptid kinyerését követően, az kívánt esetben tisztítható. Az alkalmazott tisztítási eljárás természetesen függ a polipeptid, illetve peptid felhasználási célja által megszabott tisztasági foktól. Vakcinázási célra legtöbbször elegendő a fúziós protein megtisztítása a sejttenyészet maradék összetevőinek többségétől, mivel az antigén viszonylag durva formában vakcinába építhető. Abban az esetben azonban, ha nagyobb tisztasági fokra van szükség, a fúziós protein hordozó-összetevője az antigén hatású összetevőről lehasítható. Amint ez az alábbi példákból nyilvánvaló, az utóbbi könnyen megvalósítható egy megfelelő enzimhasítási hely közbeiktatásával a hordozó-összetevő és az antigén közé.
Előnyös esetben, az antigén hatású polipeptid előállítására rekombináns eljárások alkalmazhatók, ilyenkor az első lépés a kívánt terméket kódoló DNS előállítása. A találmány kiterjed továbbá ilyen DNS-molekulákra is. A találmány szerinti DNS-molekula előnyösen tartalmazza a 4. ábra szerinti nukleotidszekvencia legalább egy részét vagy egészét. A találmány egy megvalósítási módjában a DNS-molekula tartalmazza a 4. ábra szerinti szekvencia 10-233. nukleotidjait. A találmány egy előnyösebb megvalósítási módjában a DNS-molekula tartalmazza a 4. ábra szerinti szekvencia 3-233. nukleotidjait. Legelőnyösebb azonban, ha a DNS-molekula tartalmazza a 4. ábra szerinti szekvencia legalább 3-461. nukleotidjait vagy a 4. ábra szerinti szekvencia összes nukleotidjait.
A találmány szerinti DNS-molekula előállítható egy megfelelő természetes forrásból izolált DNS-molekula részeként vagy szokásos eljárásokkal, mint például a találmány leírásában alább ismertetett eljárásokkal előállítható intronmentes cDNS-molekulaként. A cDNS előállítása előnyösebb megoldás.
Amint azt említettük, a találmány kiterjed a polipeptid olyan variánsaira is, amelyek a natív aminosavszekvenciától egy vagy több aminosav közbeiktatásában, helyettesítésében vagy kiiktatásában különböznek. Abban az esetben, ha ilyen variáns előállítása kívánt, a natív DNS-molekula nukleotidszekvenciáját megfelelően módosítani kell. Ez a módosítás végezhető a DNS-nek egy megfelelő szintetizálókészülékkel, például az „Applied Biosystems DNA Synthesizer” készülékkel való elektív szintézisével vagy a natív DNS módosításával, például hely- vagy kazettairányított mutagenezissel.
A DNS kinyerését követően azt úgy kezeljük, hogy alkalmas legyen a választott szabályozószekvenciával együtt egy megfelelő klónozási és/vagy expressziós vektorba való inszertálásra. Végül a DNS-t kívánság szerint hasítjuk, a végeit módosítjuk és újból ligáljuk.
A hasítást megfelelő pufferben, restrikciós enzimmel (enzimekkel) való kezeléssel végezzük. Bármely, a kereskedelemben hozzáférhető restrikciós enzim használható, a gyártó utasításai szerint. A hasítást követően a nukleinsavat például etanollal való kicsapással kinyeqük.
A hasított DNS végeinek módosítását szokásos eljárásokkal végezhetjük. Ha például tompa végeket kívánunk előállítani, a DNS-t DNS polimeráz I-gyel (Klenow) kezeljük, fenollal és kloroformmal extraháljuk és etanollal kicsapjuk.
A ligálást a helyes összeilleszkedés céljából megfelelően módosított kívánt komponensek körülbelül azonos mólnyi mennyiségének hozzáadásával és egy megfelelő ligázzal (például T4 DNS-ligázzal) való kezeléssel végezhetjük.
A találmány szerinti, védettséget létrehozó antigéneken és ezek előállítására szolgáló eljárásokon kívül a találmány kiterjed egy E. granulosus-fertőzés elleni vakcinára. Ilyen vakcina lényeges összetevőként tartalmazza az E. granulosus-polipeptidjének, peptidfragmensének vagy fent említett variánsának gazdaszervezetben védettség létrehozására alkalmas mennyiségét egy megfelelő adjuvánssal vagy hordozóanyaggal együtt.
A gyakorlatban járatos személy számára ismert megfelelő adjuvánsok például a szaponinok (vagy annak származékai vagy rokon vegyületei), muramidilpeptid, trehalóz, dimikolát, Freund-féle inkomplett adjuváns, egyéb „víz az olajban” típusú emulziók, dupla
HU 220 575 BI emulziók, dextrán, dietil-amino-etil-dextrán, káliumalum, alumínium-foszfát, alumínium-hidroxid, bentonit, zimozán, polielektrolitok, retinol, kalcium-foszfát, protamin, szarkozin, glicerol, szorbitol, propilénglikol, fixált olajok és hosszú szénláncú zsírsavak szintetikus észterei. Különösen hatékony adjuvánsoknak bizonyultak a szaponinok. Ezenkívül, a találmány szerinti megoldásban a vakcinát formulázhatjuk oly módon, hogy egyéb, a gazdaszervezetben hatásos gyógyászati készítményt is tartalmazzon. Ilyen gyógyászati készítmények lehetnek féregellenes vagy egyéb vakcinák vagy immunstimulánsok, például interferonok vagy interleukinek.
A vakcina bármely, a gyakorlatban ismert módszerrel adagolható a gazdaszervezetnek. A vakcina előnyös adagolási módja azonban a parenterális adagolási mód. A „parenterális” adagolás a találmány szerint történhet vénába, izomba, bőrbe és bőr alá adott injekcióval. Az adagolás legelőnyösebben bőr alá adott injekcióval történhet.
A kezelendő gazdaszervezetnek adagolt vakcina mennyisége függ a gazdaszervezet fajától, méretétől, testtömegétől, valamint a vakcina immunogén sajátságaitól. A vakcina előnyösen úgy készíthető, hogy a vakcina viszonylag kis dózisai (1-5 ml) elegendőek legyenek a védettség létrehozásához.
A vakcina lehet olyan élő rekombinánsvírus-vakcina is, amely a polipeptidet, peptidfragmenst vagy variánst kódoló nukleinsavat tartalmaz. A vakcina ebben a formában adagolható, és az a gazdaszervezetbe kerülve expresszálja a védettséget létrehozó kódolt polipeptidet, peptidfragmenst vagy variánst.
Számos ilyen élő rekombinánsvírus-vakcinarendszer ismert. Ilyen rendszer például a Vaccinia vírusrendszer [4603112 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Brochier és munkatársai, Natúré, 354, 520, (1991)]. A találmány kiteljed továbbá fogékony gazdaszervezetben Echinococcus vagy Taeniid paraziták által okozott fertőzés elleni védettség létrehozására alkalmas eljárásra. A találmány szerinti eljárás lényeges lépése a gazdaszervezetnek az antigén hatású polipeptid, peptidfragmens vagy variáns önmagában való adagolása vagy a fent leírt vakcina adagolása.
Az alábbi példák ugyan csak a találmány szerinti antigéneknek az E. granulosus-fertőzés elleni védettség létrehozására szolgáló alkalmazását ismertetik, a gyakorlatban járatos személy számára érthető, hogy egy parazitafajból származó antigének alkalmazásával különböző fajok elleni keresztvédettség hozható létre [lásd, például Lightowlers, Acta Leidensia, 57, 135-142, (1989)]. Érthető tehát, hogy a találmány szerinti antigének védettséget hozhatnak létre az E. granulosus-on kívül legalább a következő Echinococcus vagy Taeniid parazitákkal szemben: E. multilocularis, E. vogelii, T. ovis, T. saginata, T. solium, T. multiceps, és T. hydatigena.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fent leírt DNS-molekulának vagy egy részének próbaként való alkalmazása. Ebben a vonatkozásban a DNS-molekulát hibridizációs eljárással Echinococcus vagy Taeniid parazita, például T. saginata, T. hydatigena vagy E. multilocularis immunogén hatású antigénjét kódoló DNS azonosítására használhatjuk. Ily módon további, vakcinában alkalmazható parazitaantigének azonosíthatók.
A találmány szerinti DNS-molekulának próbaként való alkalmazására szolgáló eljárások a gyakorlatban járatos személy számára jól ismertek. Alkalmazhatók például Maniatis és munkatársai által ismertetett eljárások [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, (1982)].
Más eljárás szerint, DNS amplifikációs technikák, például a polimeráz láncreakció [Saiki és munkatársai, Science, 239, 487, (1988)] alkalmazható egyéb paraziták homológ DNS-szakaszainak kimutatására a 4. ábra szerinti szekvencián alapuló PCR-primerek felhasználásával.
Hasonlóképpen ahhoz, ahogy a találmány szerinti DNS-molekulák alkalmazhatók egyéb paraziták megfelelő, védettség létrehozására alkalmas antigénjeit kódoló DNS-einek azonosítására, a találmány szerinti, védettség létrehozására képes antigénekre fajlagos ellenanyagpróbák alkalmazhatók a kérdéses parazitából származó DNS-sel transzformált organizmusok által expresszált antigének válogatására. Egy pozitív reakciót adó klón (az ellenanyag által felismert antigént expresszáló klón) meghatározása lehetővé teszi mind a védettséget létrehozó antigén, mind az azt kódoló DNS azonosítását. Ilyen ellenanyagpróbák lehetnek poliklonálisak vagy monoklonálisak, és bármely a gyakorlatban ismert eljárással előállíthatok. Pontosabban, monoklonális ellenanyagok előállíthatok Köhler és Milstein szerint [Köhler G. és Milstein C., Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predifmed specificity, Natúré, 256, 495-497, (1975)].
A találmány szerinti antigén hatású polipeptidnek, illetve ezen polipeptid peptidfragmenseinek immunogén hatását az alábbi nem kizárólagos példák szemléltetik.
7. példa
Echinococcus granulosus-onkoszférából preparatív
SDS-PAGE eljárással előállított antigének vizsgálata
Korábbi, közleményben meg nem jelentetett vizsgálatainkban számos E. granulosusból származó lehetséges, védettséget létrehozó antigént azonosítottunk. Ezen antigén jelöltek SDS-PAGE vizsgálat alapján a következő molekulatömeggel rendelkeztek:
- 23-25 kilodalton
- 30 kilodalton
- 34 kilodalton
- 40 kilodalton.
Az alábbi kísérletet a fenti jelöltek közül a gazdaszervezetben védettséget létrehozó antigén azonosítása céljából végeztük.
Anyagok és módszerek
Preparatív gél: Egy „Biorad SDS Preparative Cell” alkalmazásával 50 ml 15%-os poliakrilamid oldatot töltöttünk egy 32 mm-es tartályba 5,5 cm magasságig. A megkötődést követően ennek tetejére 8 ml felső gélt öntöttünk, és hagytuk megkötni.
HU 220 575 Bl
Antigén: Kilencmillió kikelt onkoszférát készítettünk elő az alábbiak szerint; teljesen kifejlődött embriószférával rendelkező E. granulosus-petéket leszámoltunk, és a kívánt mennyiségű petét, 20% aktivált onkoszférát feltételezve, egy 15 ml térfogatú eldobható műanyag centrifugacsőbe (Falcon Plastics) tettük. Mindegyik csőbe legfeljebb 500 000 petét raktunk. A petéket 200 g-n 2 percig centrifugáltuk, a felülúszót kidobtuk, és a csövekhez 37 °C-on 10 ml térfogatú 0,2 mikrométer pórusnagyságú membránon átszűrt mesterséges gyomomedvet (AIF) adtunk [Heath D. D. és Smyth J. D., In vitro cultivation of Echinococcus granulosus, Taenia hydatigena, T. ovis, T. pisiformis, and T. serialis írom oncosphere to cystic larva, Parasitology, 61, 329-343, (1970)]. A csöveket 37 °C-on 1 órán át rotációs keverővei kevertük.
A petéket 200 g-n 2 percig centrifugáltuk, a felülúszót leszívtuk, és a csövekhez 37 °C-on 10 ml térfogatú, 0,2 mikrométer pórusnagyságú membránon átszűrt mesterséges bélnedvet (AIF) adtunk [Heath és Smyth, (1970), lásd fent] adtunk. A petéket 37 °C-on 30 percen át rotációs keverővei kevertük, majd 2 percig 1000 g-n centrifugáltuk. A felülúszót leöntöttük és 10-szer koncentrált NCTC135-tel (GIBCO, NY) aszeptikus feltételek mellett 9:1 (térfogat/térfogat) arányban hígított 15 ml térfogatú Percollal (Pharmacia, Svédország) helyettesítettük. Az üledéket, amelyet az embrioforikus blokkok, valamint aktivált és aktiválatlan onkoszférák összessége alkot, a cső megfordításával összekevertük a Percollal. A csöveket ezután 1000 g-n 10 percig centrifugáltuk, és az onkoszférákat tartalmazó minden egyes felülúszót egy új steril 15 ml térfogatú centrifugacsőbe pipettáztunk. A felülúszó felét (7,5 ml) ezután egy másik steril centrifúgacsőbe pipettáztuk, és mindkét csőhöz 7,5 ml NCTC 135-öt adtunk. A csövek megfordításával az elegyet összekevertük és 1000 g-n 5 percig centrifugáltuk. A felülúszót eltávolítottuk, és az onkoszférákat tartalmazó üledéket kétszer 10 ml NCTC 135-tel mostuk, a csöveket mindkét alkalommal 2 percig, 1000 g-n centrifugáltuk. Az üledéket végül ahhoz megfelelő térfogatú NCTC 135-ben vettük fel, hogy 10 mikroliter minta 40-200 onkoszférát tartalmazzon. Az aktivált és aktiválatlan onkoszférák számát ezután két hemocitométer lemez (Improved Neubauer) mindkét oldalára cseppentett 4x10 mikroliter minta teljes térfogatában, az onkoszféramembrántól mentes onkoszféráknak (aktivált onkoszféráknak) az aktiválatlan onkoszféráktól való megkülönböztetésére 200-szoros nagyítás alkalmazásával megszámoltuk.
Onkoszféraproteinek szétválasztása: Az onkoszférákat (körülbelül 50% aktiválatlan, és 50% aktivált onkoszférát) merkaptoetanol helyett 10 mg/ml ditiotreitolt (DTT) (Sigma) tartalmazó SDS mintapufferben [Laemmli U. K., Clevage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T4, Natúré, London, 277, 680-685, (1970)] forraltuk, és a Biorad SDS Preparative Cell oszlopra töltöttük. Attól kezdve, hogy a brómfenilkék festék majdnem elérte az oszlop alját, 24 órán át egymást követően 2,5 ml-es frakciókat gyűjtöttünk.
Enzimgátlók: Mindegyik enzimgátlót a Sigmától szereztük be. Ezeket oly módon vettük fel 20 mmol/1 Tris/HCl pufferben (pH 8,0), hogy térfogat/térfogat arányban hígítva azok végkoncentrációja az alábbi legyen: jód-acetamid, 20 mmol/1; Aprotinin, 10 mikrogramm/ml, Pepstatin, 2 mikrogramm/ml; N-tozil-l-fenil-alanin-klór-metil-keton (TPCK), 50 mikrogramm/ml; Na-p-tozil-l-lizin-klór-metil-keton (TLCK), 50 mikrogramm/ml; Etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA), 2 mmol/1; fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF), 1 mmol/1. Ezeket hozzáadtuk mindegyik frakcióhoz. Mindegyik frakcióból mintát vettünk és egy 5-25%-os SDS/PAGE gélen futtattunk, a gélt a megfelelő molekulatömegű molekulák azonosítására ezüsttel festettük. A kiválasztott frakciókat keverővei ellátott készülékben egy Amicon UM3 szűrővel 10 ml-re koncentráltuk. Ezután azokat 2200 rpm-en, 30 percig 1 °C-on centrifugáltuk. A felülúszót eltávolítottuk a leülepedett SDS-ről, és mindegyiket 4-szer cserélt, enzimgátlókat tartalmazó 20 mmol/1 koncentrációjú Tris-pufferes fiziológiás sóoldattal szemben dializáltuk 3 napon át (pH 7,5).
A vizsgálandó molekulatömegeket a következő molekulatömeggel rendelkező frakcióknak megfelelően választottuk: 1. csoport: a 21 kilodalton alatti összes molekula; 2. csoport: 23 és 25 kilodalton; 3. csoport: 30kilodalton; 4. csoport: 34 kilodalton; 5. csoport: két40 kilodalton molekulatömegű; 6. csoport: 43 kilodalton; 7. csoport: a 43 kilodalton feletti összes molekula; 8. csoport: az eddigi összes molekula elegye; 9. csoport: csak adjuváns; 10. csoport: antigénminta a gélen való futtatást megelőzően. Ezt a mintát szintén hidegen centrifugáltuk és kimerítően dializáltuk.
Immunizálás menete: Mindegyik antigén 10 ml felülúszóban volt jelen. Mindegyik frakció 5 millió onkoszférából nyert meghatározott méretű molekulát (molekulákat) tartalmazott, az összes molekula elegye a 2 millió onkoszférából nyert összes molekulát tartalmazta, ugyanúgy a gélen való futtatást megelőzően kapott antigén (10. csoport) is. Az első injektálásra 1 ml antigént homogenizáltunk 1 ml STM adjuvánssal [Bokhut és munkatársai, Veterinary Immunology and Immunpathology, 2, 491-500, (1981)], felét a bal oldali bordák felett injektáltuk a bőr alá, a másik felét bal hátsó lábba injektáltuk izomba. A második injektálásra, amelyre 1 hónappal később került sor, az injekció formulázása és az injektálás menete ugyanaz volt, azzal az eltéréssel, hogy mindegyik injekcióhoz 2 mg fagyasztva szárított Mycobacterium phlei-t adtunk. Az injektálást ezúttal a jobb oldalon végeztük.
Fertőzés petékkel: A második injektálást követően egy hónappal mindegyik báránynak 1000 E. granulosus-petét adtunk szájon át. A petéket 6 héten át 4 °C-on tároltuk. Ezeket kísérletes úton fertőzött kutyákból izolált férgekből extraháltuk Heath D. D. és Lawrence S. B. eljárása szerint [Daily egg-production of dogs infected with Echinococcus granulosus, Arhivos de la Hidatidosis, 30, 321-328, (1991)].
Kísérleti állatok: A bárányok Romney és Dorset tenyésztési vonalakból származtak, és azokat az egyes csoportokba random osztottuk el. Ezeket E. granulo7
HU 220 575 Bl sus-fertőzéstől mentes feltételek mellett tenyésztettük, és az első injekciót 8 hónapos korban kapták. Az első és második injektálás alkalmával, valamint a fertőzéskor, mindegyik állattól vacutainerrel 10 ml vért vettünk szérum előállítására. A szérumot aszeptikus feltételek mellett eltávolítottuk, és az onkoszférák in vitro tenyésztéssel való vizsgálatáig vagy immunlenyomatvizsgálat végzéséig -20 °C-on tároltuk.
Boncolás: A ráfertőzést követően hat hónappal további vérmintát vettünk, és a bárányokat, miután azokat ütőszeges pisztollyal elkábítottuk, elvéreztettük. Mindegyik állat máját és tüdejét eltávolítottuk és felszeleteltük, hogy a jelen levő ciszták számát és állapotát meg tudjuk becsülni. A májat 2-3 mm vastag szeletekre vágtuk, és mindegyik szeletet szemmel gondosan megvizsgáltunk. A tüdőket 4 mm vastag szeletekre vágtuk és a cisztákat megtapintottuk és megtekintettük.
Immunlenyomat-vizsgálat: E. granulosus-onkoszféraantigéneket SDS-PAGE eljárással ismert módszer szerint [Laemmli, (1970), lásd fent; Hames B. D. és Rickwood D., Gél electroforesis of Proteins; a practical approach, IRL Press, Oxford, (1981)] szétválasztottunk. A mintákat 3 percig, 60 mmol/1 Tris/HCl (pH 6,8), 10% glicerol, 2% SDS, 1% DTT és 0,05% brómfenolkék tartalmú pufferben forraltuk. A szétválasztást gradiens gélen végeztük (T=5-25%) egy függőleges rendszerű elektroforéziskészülék alkalmazásával (Bio Rád Protean 11) a gyártó utasításai szerint. A szétválasztott antigéneket elektroforetikus úton [Towbin H., Staehelin T. és Gordon J., Electroforetic transfer of proteins írom polyacryalmid gels to nitrocellulose sheets: Procedure and somé applications, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 76, 4350-4354, (1979)] nitrocellulózszűrőre (0,45 mikrométer pórusnagyságú, Schleicher és Schull, Dassel, Németország) vittük át egy hűtött Transblot kamrában lapelektródákkal (BioRad, Richmond, USA) 50 Volt feszültség mellett, 2 óra alatt, 20% metanolt tartalmazó 10 mmol/1 koncentrációjú karbonátpufferben (pH 9,0) [Dunn S. D., Effects of the modification of the transfer buffer composition and the renaturation of proteins in gels on the recognition of proteins on Westem-blots by monoclonal antibodies, Analytical Biochemistry, 157, 144-153, (1986)]. Az átvitelt követően a nitrocellulózszűrőket 5 percre, 0,5% Ponceau S-t (BDH) tartalmazó 1%-os ecetsavba helyeztük, majd desztillált vízzel mostuk, míg a proteincsíkok világosan láthatóvá váltak. A molekulatömeg-jelzőket (Pharmacia) ceruzával megjelöltük. Antigént tartalmazó nitrocellulózcsíkokat vágtunk ki és azokat inkubációs tálcákba (Schleicher és Schull, Németország) helyeztük. A csíkokat 0,5% NaCl-t tartalmazó 20 mmol/1 Tris/HCl pufferben (pH 7,5) oldott 5% zsírmentes tejporral és 0,1% Tween 20szal (BDH) 1 órán át, 37 °C-on blokkoltuk. A vizsgálandó szérumokat a blokkolópufferben 1:100 arányban hígítottuk. A csíkokat éjszakán át a hígított szérumban szobahőmérsékleten, keverőlapon inkubáltuk. Ezután a csíkokat 4-szer cserélt, 0,5 mol/1 NaCl-t és 0,1% Tween 20-at tartalmazó 20 mmol/1 Tris/HCl pufferrel (pH 7,5), 10-10 percig mostuk.
Az immunvizsgálatba egy külön lépést iktattunk az IgG! és IgG2 immunglobulinosztályok kimutatására. Az első ellenanyagot követően a csíkokat birka-IgGp illetve birka-IgG2 ellen egérben termelt monoklonális ellenanyagokkal (Dr Ken Beh, CSIRO McMaster Laboratory, Sydney) kezeltük. A csíkokat ezután blokkolópufferben 1:1000 arányban hígított, kecskében termelt, peroxidázzal (Cappel) jelölt, egér elleni IgG-vel (teljes molekula) kezeltük. Ezt követően a csíkokat tejport és Tween 20-at nem tartalmazó blokkolópufferrel háromszor mostuk. A peroxidázaktivitást 3-amino-9-etil-karbazollal (Sigma) láthatóvá tettük. Az előhívást mindegyik csíkon azonos időben állítottuk le, hogy összehasonlíthassuk a festék intenzitását, és így utalást kapjunk az egyes szérumokban található fajlagos immunglobulinok mennyiségére.
Onkoszférák in vitro jelölése: Vizsgáltuk mind a tíz birkákból álló csoporttól a fertőzés előtt nyert összegyűjtött szérumok onkoszféraölő képességét.
Fötális bárányszérum-komplement előállításához a terminushoz közel álló bárányoktól steril injekciós fecskendővel vért vettünk, és a vért azonnal 50 ml-es steril polipropiléncsövekbe (Falcon Plastics) tettük. Kétórás szobahőmérsékleten való alvadást követően az alvadékot steril pálcákkal lamináris áramlású steril fülkében leválasztottuk a cső faláról. A csöveket ezután egy Beckman hűtőcentrifugában 30 percig, 4 °C-on centrifugáltuk. A csöveket jégre állítottuk és a szérumot eltávolítottuk. A fötális bárányszérumot a tenyészetben való felhasználásig 2 ml-es adagokban -70 °C-on tároltuk.
A tenyésztést 96 rekeszű lapos fenekű tenyésztőlemezeken (Falcon Microtest III) végeztük. Mindegyik rekeszhez 150 mikroliter (30 percig, 56 °C-on inaktivált) vizsgálandó szérumot és 150 mikroliter 50 aktivált onkoszférát, valamint 20 mikroliter fötális bárányszérumkomplementet tartalmazó NCTC 135-öt adtunk. Mindegyik tenyészetet duplikátumban vagy triplikátumban készítettünk. A lemezeket 37 °C-on, párásított CO2inkubátorban tároltuk, és az eredményeket 24 óra, valamint 7 nap elteltével egy Leitz Labovert-féle mvert mikroszkóp segítségével értékeltük. Az NCTC 135-öt külön említés nélkül 300 mg/ml cisztein-hidrokloriddal (Sigma) és 50 mikrogramm/ml gentamicin-szulfáttal (Schering) egészítettük ki.
Eredmények
Az egyes csoportok onkoszféraantigének ellen adott ellenanyagprofilját az 1. ábra mutatja. Érthető, hogy a különböző csoportok elsősorban azokat az adott molekulatömeg-tartományba eső antigéneket felismerő ellenanyagokat termeltek, amelyekkel immunizálva lettek. Néhány csoport esetében, például az 1. és 5. csoportokban, az immunizálásra használt molekulákon olyan epitópok is jelen voltak, amelyek más molekulatömegtartományba eső molekulákon is előfordultak.
Az 1-10. csoportokban a boncolás eredményét az
1. táblázat mutatja, amelyből látható, hogy míg az egyéb antigénjelöltek a kontrollcsoporthoz képest csökkentették a ciszták számát, jelentős fokú védettséget csupán a 23-25 kilodalton molekulatömeg-tartományba eső antigének váltottak ki (p=0,012, F=10,62, 8DF).
HU 220 575 Β1
A különböző molekulatömeg-tartományokba eső antigénekkel immunizált birkák szérumainak in vitro onkoszféraölő képességét a 2. táblázat mutatja. Látható, hogy ezek az eredmények megerősítik, hogy csak a
23-25 kilodalton molekulatömeg-tartományba eső E. granulosus-antigének váltottak ki védettséget a gazdaszervezetben.
1. táblázat
Poliakrilamid gélből eluált natív antigénekkel (1-8. csoportok), adjuváns kontrollal (9. csoport), illetve SDS-sel kezelt onkoszférákkal (10. csoport) való immunizálást követően 1000 E. granulosus-petével fertőzött birkák boncolásának eredményei
Csoport Immunizáló antigén Birkák száma Ciszták száma Átlag
1. <20 62,47,12, 50, 65 75, 39,19,101, 47 56,2
2. 23+25 05,24, 67,45, 95 0, 39,10, 2,4 11
3. 30 17,19,13, 57, 03 0,42,17,148,197 80,8
4. 34 11,37,14, 77,43 167,9,48, 85,126 87
5. 40 51,39,06,41,82 109, 86,156, 276, 97 144,8
6. 43 08, 64, 04, 88, 68 57, 67,165,3, 52 68,8
7. >43 86,45, 40, 72, 01 84, 75, 2,17, 78 51,2
8. MIX 15,23, 92,48,27 0, 0,104,133,79 63,2
9. KONTROLL 96,09, 38,90, 33 27,137,170,242, 86 132,4
10. SDS ONCS 60, 30,44,20,18 247,49,175,25, 54 110
2. táblázat
E. granulosus-onkoszférák in vitro jelölése az E. granulosus-petékkel való fertőzés napján a csoportokból összegyűjtött szérumokkal
Csoportszám Kezelés Leölt (%)
1. <20 kD 0
2. 23-25 kD 91
3. 30 kD 0
4. 34 kD 0
5. 40 kD 0
6. 43 kD 0
7. >43 kD 0
8. összes molekula keveréke 0
9. csak adjuváns 0
10. SDS-onkoszféra 0
2. példa
Ellenanyagpróbák tisztítása affinitásos eljárással Az immobilizált 23-25 kilodalton molekulatömegű molekulákból affinitásos eljárással tisztított ellenanyagokat az alábbiak szerint állítottuk elő. Az 1488 és 1489 számú bárányokat négy alkalommal, bőr alá és izomba adva 100 000 aktivált E. granulosus-onkoszférával oltottuk. Az első két injektálás között két hét telt el, majd a következő injektálás egy hónappal később, és a negyedik három hónap elteltével következett. Egy héttel az utolsó injektálást követően a bárányok mindegyikétől 300 ml vért vettünk, és abból 150 ml steril „hiperimmun” antiszérumot nyertünk. A szérum levételének napján az előbbi bárányokat, valamint két kontrollbárányt 3000 frissen gyűjtött E. granulosus-petével fertőztünk. Hat hónappal később a boncolás alkalmával az immunizált bárányoknál csak az első injektálás helyén növő cisztákat találtunk, míg a kontrollok eseté30 ben nagy számú cisztát találtunk a májban és tüdőkben. Az 1488 számú báránytól nyert szérumot használtuk fel ellenanyagok affinitásos eljárással való tisztítására, mivel ez magasabb onkoszféraölő titerrel rendelkezett, mint az 1489 számú. Fagyasztva szárított, ultra35 hanggal kezelt E. granulosus-onkoszféraantigénekre, SDS/PAGE-n futtatott onkoszféra teljes csíkjában található antigénekre, 0-20, 20-25, 25-30, 30-36, 36-67 kilodalton relatív molekulatömeggel rendelkező antigénekre, illetve 0-20, 20-30, 30-43, 43-67,
67-90, 90-180 kilodalton és 180 kilodaltonnál nagyobb relatív molekulatömeggel rendelkező antigénekre fajlagos ellenanyagokat állítottunk elő a fenti antigéneket tartalmazó nitrocellulózcsíkokból affinitásos tisztítási eljárással Beáll J. A. és Mitchell G. F. eljárása sze45 rint [Identification of a particular antigén from a parasite cDNA library usig antibodies affinity purified from selected portions of Westem-blots, Journal of Immunological Methods, 86, 217-223, (1986)]. A hordozó protein 1% fötális bárányszérum volt. Az affinitásos el50 járással tisztított ellenanyagokat mostuk, majd Amicon keverőkészülékkel és PM10 szűrővel 10-szer koncentráltuk.
3. példa
E. granulosus-onkoszféraantigén DNS-ek rekombináns úton való klónozása és expresszálása
1. mRNS izolálása és azonosítása
a) Reagensek előállítása
A Tris-t [trisz(hidroxi-metil)-amino-metán, Sigma,
St. Louis, MO, USA] tartalmazó oldatok kivételével az
HU 220 575 Β1 mRNS izolálásánál és kezelésénél felhasznált mindegyik oldatot 0,1%-os dietil-pirokarbonáttal (DEPC, Sigma) kezeltünk. Minden üvegedényt 200 °C-on vagy magasabb hőmérsékleten kezeltünk egy éjszakán át. Ezeket a törzsoldatokat DEPC-vei kezelt vízzel készítettük és autoklávoztuk.
b) Onkoszférák
Érett E. granulosus-petéket az 1. példában ismertetett módon nyertünk és keltettünk/aktiváltunk. Körülbelül 4χ 106 onkoszférát szolubilizáltunk jégen, nukleázmentes 6 mol/1 koncentrációjú guanidin-hidrokloridot (BRL Ultrapure, Bethesda Research Laboratories, USA) és 0,1 mol/1 nátrium-acetátot (pH 5,2) tartalmazó elegyben üveg/teflon szövethomogenizátor segítségével. A szolubilizált onkoszférákat az mRNS izolálásáig -70 °C-on tároltuk.
c) RNS izolálása
A szolubilizált onkoszférákat jégen felolvasztottuk, és az oldhatatlan részt centrifugálással ülepítettük (10 000 rpm, 30 perc, 4 °C) egy Type 50 Ti-rotor és Beckman L8 ultracentrifuga (Beckman, Palo, Alto CA USA) segítségével. A felülúszót 4,8 mol/1 koncentrációjú cézium-kloridot (CsCl-BRL Ultrapure, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD USA), 10 mmol/l EDTA-t (Etilén-diamin-tetraecetsav, dinátriumsó), valamint 5,5 ml CsCl-oldatra számítva 6,5 ml guanidint tartalmazó oldatra rétegeztük Beckman SW40 poliallomér csövekbe. A csöveket Beckman L8 ultracentrifugában egy SW40 rotorban centrifugáltuk (35 000 rpm, 18 óra, 15 °C). A felülúszót kidobtuk, és a cső alját rövid ideig óvatosan 200 mikroliter T10E, (10 mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA, pH 8,0) pufferrel mostuk. A leülepedett RNS-t 200 mikroliter Τ10Ε! pufferben feloldottuk, további 1:10 térfogat 3 mol/1 koncentrációjú nátrium-acetát és 2,5 térfogat 100%-os jéghideg etanol hozzáadásával kicsaptuk, és éjszakán át -20 °C-on inkubáltuk. A kicsapódott RNS-t mikrocentrifügában centrifugálással (15 perc, 4 °C) ülepítettük, az üledéket 70%-os etanollal mostuk, a centrifügálást megismételtük, és az így kapott üledéket levegőn szárítottuk. Az RNS-t 50 mikroliter T10Erpufferben szuszpendáltuk, annak mennyisége a 260 nanométeres hullámhosszon mért abszorpció alapján 23 mikrogramm teljes RNS volt. Egy mikrogramm RNS-t 1,2%-os formaldehid-agarózgélen futtattunk [Sambrook J., Fritsch E. F., és Maniatis T., Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, (1989)], és megállapítottuk, hogy az RNS intakt riboszómális RNS-t tartalmaz.
d) Poliadenilált RNS tisztítása
Poliadenilált mRNS-t 7-es típusú oligo(dT) cellulózon (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Svédország) tisztítottunk a gyártó utasításai szerint, és amint azt Aviv H. és Leder P. ismerteti [Purification of biologically active globin messenger RNA was by chromatography on oligothymidylic acid-cellulose, Proc. Nat. Acad. Sci, 69, 1408-1412, (1972)]. Az eluált poliadenilált mRNS-t a fentiek szerint kicsaptuk, és az üledéket 50 mikroliter T10E,-pufferben szuszpendáltuk.
e) In vitro transzláció
Az mRNS-t 5 mikroliter térfogatban „Rabbit Reticulocyte Lysate” (Amersham, UK) felhasználásával 25 mikroliter teljes reakció-térfogatban in vitro transzláltuk a gyártó utasításai szerint. Az így kapott terméket radioaktívan megjelöltük 37,5 mikroCi 35S-metionin (Amersham International, Amersham UK) felhasználásával, majd 10%-os akrilamid gélen redukáló feltételek mellett poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgáltuk [Laemmli U. K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Natúré, 227, 680-685, (1970)], és a gél Amplifyvel (Amersham, UK) való impregnálását követően fluorográfiás eljárással kimutattuk. Nagy mennyiségű és heterogén méretű transzlációs termékeket, köztük 94 kilodaltonnál nagyobb méretű termékeket nyertünk.
2. cDNS előállítása és klónozása
a) cDNS előállítása mikroliter T10Erpufferben szuszpendált mRNS felhasználásával reverz transzkripciós reakciót végeztünk alfa-32P-dATP (Amersham) jelenlétében, „Moloney-Murine Leukémia Vírus Reverse Transcriptase”, valamint a „ZAP-cDNA Synthesis Kit” (gyártási szám: # UC106; katalógusszám: 200400, Stratagene, La Jolla, USA) készletben található reagensek és leírás felhasználásával a gyártó utasításai szerint. A második szál szintézisét követően a ZAP-cDNA Synthesis Kit utasításai szerint egy mintát 1%-os alkalikus agarózgélen elektroforetizáltunk. A kapott cDNS heterogén méretű volt, és Lambda HindlII DNS markerekkel összehasonlítva kimutatható mennyiségű 2000 bázispámál nagyobb méretű átírt cDNS-t is tartalmazott.
b) cDNS-klónozása
A cDNS-t Uni-ZAP XR (lambda-ZAP) (Stratagene) bakteriofág vektorba klónoztuk a gyártónak az „Uni-ZAP XR Cloning Kit” készlethez (gyártási szám: #18; katalógusszám: 237211, Stratagene) mellékelt utasításai szerint. A cDNS-t anélkül ligáltuk a vektorhoz, hogy a cDNS méretét bármilyen módon kiválogattuk volna. A teljes cDNS-mintát 1 mikrogramm vektorDNS-hez ligáltuk.
c) In vitro becsomagolás bakteriofágba
Két mikroliter vektorhoz ligáit cDNS-t fertőzőképes fágba csomagoltunk egyetlen Gigapack II Gold becsomagolókészlet (gyártási szám: #1535; katalógusszám: 200216, Stratagene) felhasználásával a gyártó utasításai szerint. Az így kapott fágot PLK-F’ E. coli törzsben titráltuk. A megmaradt ligáit cDNS-t ezután két egyforma reakcióban becsomagoltuk, a három reakció termékét összekevertük és megtitráltuk. A lambdaZAP-ban így előállított cDNS-klónokból álló génkönyvtárat (cDNS-génkönyvtár) PLK-F’ E. coliban megtitráltuk, és ennek alapján megállapítottuk, hogy az körülbelül 100 000 elsődleges kiónt tartalmaz (az UNIZAP XR Cloning Kit eljárása szerint, Stratagene).
3. A cDNS-génkönyvtár amplifikálása
A teljes cDNS-génkönyvtárat PLK-F’ E. coli-sejtekben amplifikáltuk oly módon, hogy egy-egy 150 mm átmérőjű agarlemezen 5000 plakképző egységet (pfú) számoltunk. Az amplifikált fágokat egy éjszakán át 10 ml
HU 220 575 Bl
SM pufferbe (100 mmol/1 NaCl, 8 mmol/1 MgSO4, 50 mmol/1 Tris pH:7,5, 0,01% súly/térfogat zselatin) gyűjtöttük. Az amplifikált génkönyvtárat alkotó plakkokat összegyűjtöttük, és E. coli XLl-Blue sejteken (Stratagene) izopropil-tiogalaktozid (IPTG) és 5bróm-4-klór-3-indolil-béta-D-galaktozid (Xgal) jelenlétében az „UNI-ZAP XR Cloning Kit” (Stratagene) készlet utasításai szerint titráltuk. Ennek alapján az amplifikált génkönyvtár titere 1,7 xlO9 plakképző egység/ml volt.
4. A cDNS-génkönyvtár vizsgálata immunvizsgáló eljárással
a) Ellenanyagpróbák előállítása
Két típusú ellenanyagpróbát használtunk a plakk immunvizsgáló eljárásnál; szérumokat, és a 3. példában leírtak szerint affinitásos eljárással tisztított ellenanyagokat. A szérummintákban jelen levő E. coli, és/vagy béta-galaktozidáz elleni „háttér” reaktivitást az alábbiak szerint csökkentettük. Nem rekombináns lamdagtll, illetve lambda-ZAP fágokkal alkalmas E. coli gazdasejtet (általában XL-1 Blue, Stratagene) fertőzünk úgy, hogy csaknem összefolyó sűrűségű tenyészetet kapjunk. Nitrocellulózszűrőket (Schleicher és Schuell, Dassel, Németország) 10 mmol/1 koncentrációjú IPTGvel itattunk át, szárítottunk, majd miután a lemezeket 4 órán át 42 °C-on inkubáltuk, mindegyik lemez felszínére egy-egy szűrőt helyeztünk. Ezt követően a lemezeket egy éjszakán át 37 °C-on, majd 30 percig 4 °C-on inkubáltuk. A szűrőket eltávolítottuk, és TNT-vel (150 mmol/1 NaCl, 0,05 5 Tween 20, 10 mmol/1 Tris, pH 8,0) mostuk, majd 5%-os fölözött tejport tartalmazó TNT-ben (BLOTTO) inkubáltuk 1 órán át. Az immunvizsgáló eljárás mindegyik lépését szobahőmérsékleten (RT°) végeztük, keverőlapon. Az immunvizsgálatban használandó mindegyik szérummintát 20% borjúszérumot (FTNT) tartalmazó TNT-ben hígítottuk, és 20 ml hígított szérumot, valamint két a fentiek szerint előkészített nitrocellulózszűrőt tartalmazó Petri-csészében inkubáltunk. Kétórás inkubálást követően a nitrocellulózszűrőket eltávolítottuk, és az affinitásos eljárással depletált szérumok készen voltak a plakk immunvizsgálatban való felhasználásra.
A szérumokból affinitásos tisztítási eljárással (lásd
2. példa) nyert ellenanyagpróbák esetében a szérumokat nem depletáltuk affinitásos módszerrel a nem rekombináns lambda-gtll, illetve lambda-ZAP fágokkal, és azokat az immunvizsgálatban hígítás nélkül használtuk.
b) cDNS-génkönyvtár-klónok immuneljáráson alapuló vizsgálata
Két különböző fonásból származó ellenanyagot használtunk az amplifikált génkönyvtár kiónjainak elsődleges vizsgálatára. Az 1488 jelzésű birkától a 2. példában leírtak szerint nyert szérumot a fent ismertetettek szerint előkészítettük, és E. granulosus-onkoszféraantigéneket expresszáló cDNS-klónok azonosítására használtuk. A cDNS-génkönyvtárat lemezekre oltottuk, és Sambrook és munkatársai által leírt (lásd fent) szokásos immuneljárás szerint vizsgáltuk. Röviden, a plakkokat 150 mm átmérőjű Petri-csészékbe, LG agarózt és NZY fedóagart (0,9%) tartalmazó lemezekre oltottuk 5000 plakképző egység sűrűségben. A BB4, illetve az XL1 Blue (Stratagene) E. coli törzseket használtuk. A vizsgált birkaszérumból ellenanyagokat kötő kiónokat alkalikus foszfatázzal konjugált (katalógusszám: 313 055 003, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, USA), nyúlban termelt birkaellenes IgG (nehéz és könnyű lánc) ellenanyagokkal mutattuk ki. Az ellenanyag-konjugátumot 1:2000 arányban BLOTTO-ban hígítottuk, és a szűrőket elkülönítve, 5 ml térfogatban, 2 órán át inkubáltuk. A szűrőket ezután egy órán át, hatszor cserélt TNT-vel, a cserék közt rázatva egyenként mostuk. A pozitív plakkokat brómklór-indolil-foszfát/nitro-blue-tetrazolium (BCIP/NBT) kromogénszubsztráttal mutattuk ki Harlow E. és Lane D. módszerével [Antibodies, A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, (1988)]. Összesen 129 plakk klón adott a szérummal pozitívnak látszó jelet. Mindegyik pozitív jelet adó plakkot steril Pasteur-pipettával felszedtünk az agárról, és 0,5 ml SM pufferbe tettünk. Mindegyik kiónból származó passzívan eluálódott bakteriofág kiónokat tartalmazó SM felülúszót szokásos módszerrel titráltuk (Sambrook és munkatársai, lásd fent) és 75 mm átmérőjű lemezeken és szűrőkön, alacsony sűrűségben kioltva (lemezenként körülbelül 50 plakk) újra vizsgáltunk. A 129 eredeti klón közül az 1488 jelzésű birkaszérummal 80 bizonyult pozitívnak a fentiek szerint vizsgálva.
A génkönyvtárat hasonló módon vizsgáltuk az 1488 jelzésű birkából a 2. példában leírtak szerint affinitásos eljárással tisztított ellenanyagokkal. Egy pozitív kiónt mutattunk ki a 2. szérumfrakcióval (megfelel a 20-25 kilodalton molekulatömegű onkoszféraantigéneknek), amelyet S2 kiónnak neveztünk, és egy klón reagált a 3. szérumfrakcióval (25-30. kilodalton molekulatömegű antigének), amelyet S3 kiónnak neveztünk. Mindkét klón pozitívnak bizonyult a fentiek szerint végzett ismételt plakk immunvizsgálatban.
Mindkét fág kiónt egy 150 mm átmérőjű lemezre oltottuk 20000 plakképző egység/lemez sűrűségben, és a fág törzstenyészeteket a génkönyvtár-amplifikálásnál fent ismertetett módon összegyűjtöttük.
c) Klánok kiválasztása
A kiónokat tartalmazó génkönyvtárból az immunvizsgálat alapján az s2, s3, 48, 95, 101, 119, valamint a 123 jelzésű kiónokat választottuk további vizsgálatra, annak megállapítása céljából, hogy az általuk expresszált antigének a gazdaszervezetben védettséget váltanak-e ki. A 33,42, valamint 86 jelzésű kiónokat (amelyek a korábbi, nem közölt vizsgálataink szerint nem voltak képesek jelentős mértékű védettség kiváltására) kontrollként való alkalmazás céljából választottuk.
5. cDNS szubklónozása és expresszálása
a) pBluescript előállítása
A pBluescript plazmidot az egyes cDNS-klónok lambda-ZAP törzstenyészeteiből fagemidmentéssel állítottuk elő a „UNI-ZAP XR Clonig Kit” (Stratagene) gyártó cég utasításai szerint.
b) Szubklónozás pGEX-3EXplazmidba
Az E. granulosus-antigének vakcinában való alkalmazás céljára történő expresszálására a pGEX plazmid
HU 220 575 Bl sorozatot (AMRAD Corporation, Melbume, Ausztrália) választottuk vektorrendszerként, amely a molekula parazita által kódolt részét a Schistosoma japonicum glutation-S-transzferáz [Smith D. B., és Johnson K. S., Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusion proteins with glutation Stransferase, Gene, 67, 31-40, (1988)] karboxivégéhez kapcsolva fúziós proteinként expresszálja. Hogy a lambda-ZAP XR vektorból a megfelelő irányban klónozott cDNS-eket szubklónozhassuk, a pGEX 3X vek- 10 tort úgy kellett módosítanunk, hogy a pGEX polilinkerében található EcoRI restrikciós helytől 3’ irányban egy Xhol restrikciós hasítási helyet iktattunk be. Ezt az alábbi szekvenciával rendelkező, a bázispárokon keresztül összekapcsolódó oligonukleotidok inszertálásá- 15 val értük el:
5 AAT TCA TAC TCG AGT3’ 3’ GT ATG AGC TCA TTA A4 5’
Az Xhol hasítási hely közbeiktatását kivéve ez a konstrukció megőrizte a lambda-ZAP XR vektorba kló- 20 nozott cDNS-ek megegyező irányultságát. A módosított vektort pGEX 3EX-nek neveztük. A pGEX vektor módosítására szokásos módszereket alkalmaztunk (Sambrook és munkatársai, lásd fent), röviden, a bázispárokat képző összekapcsolódott oligonukleotidokat T4 Polinukleotid kinázzal (New England Biolabs, Beverly, CA, USA) kezeltük, a pGEX 3X DNS-t EcoRI enzimmel (New England Biolabs) emésztettük, foszfatázzal kezeltük, és ligáltuk a kinázzal kezelt összekapcsolt oligonukleotidokkal. A ligáit plazmiddal JM101 jelzésű E. coli törzset transzformáltunk kalcium-kloridos eljárással. Plazmiddal transzformált baktériumklónokat válogattunk, azokból plazmid-DNS-t izoláltunk, és a módosítás megtörténtét a DNS adott szakaszának M13 bakteriofág BamHI (914. pozíció)/PstI (1885. pozíció) helyére való szubklónozását követően didezoxi láncterminációs eljárással végzett szekvenálással igazoltuk. A pGEX vektor polilinker szakasza az alábbi DNS-szekvenciával és következtetett transziáit aminosavszekvenciával rendelkezik:
BamHI pGEX-3EX: CCA AAA TCG GAT CTG ATC GAA GGT DGT GGG ATC Pro Lys Ser Asp Leu I 1 e Glu Gly ArgGly Ile
X-f ak t o r
Smal
EcoRI
CCC GGG AAT TCA TAC TCG AGT AAT TCA TCG TGA
Pro Gly Asn Ser Tyr Ser Ser Asn Ser Ser ***
A pBluescript plazmid-DNS-t CsCl-ban végzett centrifügálással tisztítottuk (Sambrook és munkatársai, lásd fent) és az inszertált cDNS-t az alábbiak szerint kivágtuk. Mindegyik pBluescript DNS-klónból körülbelül 2 mikrogramm mennyiséget 10 egység EcoRI és Xhol 35 (Amersham, UK) enzimmel emésztettünk 20 mikroliter magas sókoncentrációjú pufferben. Az inszertált DNS-t 1%-os agarózon tisztítottuk, a DNS-csíkokat kivágtuk, és Geneclean (BIO101 Inc., La Jolla, USA) felhasználásával tisztítottuk. Miután a 260 nanométeren mért ab- 40 szorpció alapján a DNS mennyiségét meghatároztuk, körülbelül 100 nanogramm inszert-DNS-t körülbelül 50 nanogramm EcoRI és Xhol enzimekkel emésztett, CsClban tisztított, foszfatázzal kezelt pGEX-3EX DNS-sel ligáltunk (2 egység T4 DNS ligázzal, Boehringer 45 Mannheim). A pGEX-3EX plazmidba ligáit cDNS-t (lásd lent) E. coli BB4 törzsbe (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Kalifornia, USA, katalógusszám: 200269) transzformáltuk elektoporációs eljárással ,$ioRad Gene Pulser” alkalmazásával (BioRad, Rich- 50 mond, USA) a gyártó utasításai szerint.
4. példa
E. granulosus fúziós protein előállítása
A kiválasztott E. granulosus-onkoszféra cDNS-kló- 55 nokat a pGEX-3EX expressziós plazmidba szubklónoztuk és a fent ismertetettek szerint E. coli BB4 törzsbe transzformáltuk.
A DNS expresszálása glutation S-transzferázzal fuzionált (GST) parazitaproteint eredményezett. Az ilyen 60 fúziós proteinek általában oldhatóak, és lizált sejtekből nem denaturáló feltételek mellett glutation agarózszemcsékhez való abszorpcióval tisztíthatok.
Módszerek és anyagok
A GST fúziós proteineket lényegében Smith és Johnson eljárásával indukáltuk és tisztítottuk [Gene, 67, 31-40, (1988)] az alább részletezett lépések szerint:
1. Egy-egy pGEX transzformáns telepet 4 χ 100 ml LB/ampicillin tápfolyadékba oltottunk és éjszakán át rázóinkubátorban 37 °C-on inkubáltunk.
2. A tenyészeteket 1:10 arányban friss LB/ampicillin tápfolyadékban hígítottuk és 90 percen át 30 °Con inkubáltuk.
3. Az expresszálást 100 mmol/1 IPTG-nek 0,1 mmol/1 végkoncentrációban való hozzáadásával indukáltuk.
4. Az inkubálást további 4 1/2 órán át folytattuk.
5. A sejteket centrifügálással ülepítettük, (5000 xg, 4 °C, 10 perc).
6. Minden egyes literből nyert sejtüledéket 15 ml hideg PBS-ben szuszpendáltunk (pH 7,2) és felhasználásig -20/-70 °C-on tároltunk.
7. Az üledéket felolvasztottuk, 0,25 mg/ml koncentrációban lizozimet adtunk hozzá, és szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk.
8. Az elegyhez Triton Χ-100-at adtunk 0,5% koncentrációig.
9. A sejtszuszpenziót jégen, 15 másodperces szünetek közbeiktatásával 3x12 másodpercig ultrahanggal kezeltük.
HU 220 575 Bl
10. Az oldhatatlan részt centrifugálással (10 000 xg, 4 °C, 15 perc) eltávolítottuk.
11. 1 liter kiinduló tenyészetből nyert felülúszót 15 ml 50%-os glutation agarózszemcsékhez adtuk és szobahőmérsékleten, három órán keresztül óvatosan ke- 5 vertünk.
12. Az agarózszemcséket centrifugálással (2000 g, perc, szobahőmérséklet) ülepítettük.
13. Az agarózszemcséket az eredeti térfogatú hideg PBS-sel, centrifugálással (2000 g, 5 perc, szobahőmérséklet) ötször mostuk.
14. Az agarózhoz kötődött GST fúziós proteint visszanyertük.
15. Az agarózszemcsékhez kötődött fúziós protein koncentrációját Bradford-féle proteinvizsgálattal 15 (BioRad) határoztuk meg.
5. példa
Az E. granulosus fúziós protein immunogén sajátságának kimutatása Birkák immunizálása
Az első vakcinázáskor a birkák 8 hónapos korúak voltak és E. granulosus-petéktől mentes legelőn nőttek fel. Az állatok Romney és Dorset fajta keverékek voltak és azokat random elosztással 9, egyenként 5-5 ke- 25 zelt, valamint egy nyolc kontrollállatot tartalmazó csoportba osztottuk. Mindegyik állat 50 mikrogramm agarózhoz kötődött (a 4. példa szerint előállított) fúziós proteint kapott 1 rész fiziológiás sóoldat és 1 rész STM adjuváns [Bokhut B. A., van Gaalen C., és Van dér 30 Heijden Ph J., A selected water-in-oil emulsion: Composition and usefulness as an immunological adjuvant, Veterinary Immunology and Immunpathology, 2, 491-500, (1981)] elegyében felvéve. A teljes injektálandó térfogat (2 ml/birka) felét bőr alá, felét izomba ad- 35 tűk a bal oldalon, és egy hónappal később megismételtük a jobb oldalon. A kontrollok a nem rekombináns pGEX-ből származó expresszált glutation S-transzferázt kaptak.
Két héttel a második injektálást követően a birkáktól 40 vért vettünk és szérumot készítettünk in vitro tenyésztés és onkoszféraantigének elleni immunlenyomat-vizsgálat céljára az 1. példában leírtak szerint. Ugyanazon a napon a birkákat 1000 E. granulosus-petével fertőztük szájon át az 1. példában ismertetettek szerint.
Boncolás
A fertőzés után hat hónappal a birkákat ütőszeges pisztollyal elkábítottuk, elvéreztettük, az állatok máját és tüdejét a vizsgálat céljára kivettük. A májat 2 mm vastag szeletekre vágtuk és mindegyik szeletet szemmel gondosan megvizsgáltuk, hogy tartalmaznak-e cisz10 tákat. A tüdőket 4 mm vastag szeletekre vágtuk és azokat megtapintottuk, hogy tartalmaznak-e cisztákat. Minden gyanús léziót felvágtunk, annak magállapítása céljából, hogy azok E. granulosus ciszták-e.
Eredmények
A boncolás eredményét a 3. táblázat mutatja, az in vitro onkoszféraölő hatást a 4. táblázat mutatja. Jelentős mértékű immunitást váltott ki a fertőzéssel szemben az S2 klón (97%, P<0,001, F=24,04, 11DF); a 48. klón (83%, P=0,002, F=16,51, 11DF); a 95. klón 20 (96%, P<0,001, F=23,41,11DF); valamint a 119. klón (83%, P=0,002, 11DF). In vitro onkoszféraölő hatást csak a fenti négy klón ellen termelt összegyűjtött szérumokkal, illetve az összes összekevert kiónnal tudtunk kimutatni.
Mindegyik fenti klón ellen a 23-25. kilodalton molekulatömegű natív proteinekkel reagáló ellenanyag termelődött, míg két klón (101. és 123. klón), amelyek nem váltottak ki statisztikailag jelentős védettséget a natív 34 kilodalton molekulatömegű molekulával reagált. Egy másik klón, amelyik nem váltott ki statisztikailag jelentős védettséget (S3) a 30 kilodalton molekulatömegű proteinnel reagált (lásd a 2. ábrát).
Mind az S2, mind a 95. klón erős IgG2-választ váltott ki a 23-25. kilodalton molekulatömegű molekulák ellen, összehasonlítva a kevésbé hatásos 48. és 119. klónnal. Az öt-öt birkából álló csoportokba tartozó egyes birkáknál tapasztaltak szintén megerősítették azt a feltevést, hogy az erős IgG2-válasz elősegíti az imunvédettség létrehozását (lásd 3. ábra). Az S2, illetve a 95. kiónokkal immunizált tíz birkánál tapasztalt eredmények kismértékű variabilitása arra utal, hogy ezt a szekvenciát sokféle genotípus is felismeri.
3. táblázat
Rekombináns antigénekkel való immunizálást követően E. granulosus-petékkel fertőzött birkák boncolási eredménye
Csoport Immunizáló antigén Birkák száma Ciszták száma Átlag
11. S2 klón 28, 53,46,29,16 2, 3,0,16,3 4,8
12. S3 klón 56, 54, 36,26, 71 0,68, 72, 53, 99 58,4
13. 48 klón 31,49,25,22, 66 17, 58,12,0,46 26,6
14. 95 klón 76, 80,10,42, 52 13,14, 5,0,2 6,8
15. 101 klón 58, 02,93, 79, 83 64, 79, 30,108,100 76,2
16. 119 klón 84, 73,91,85, 55 53,29,0,13,40 27
17. 123 klón 21,07, 34,81,63 305, 8,100, 20,40 94,6
18. 7 klón elegye 89,61, 75,74, 70 8, 74,27,0,105 42,8
19. 33., 42. és 86. kiónok 32,87,69,78,59 6,130,136, 5,200 95,4
20. GST-kontroll 94, 97,99,00, 01, 02,04,05 70,105, 270,180, 122,227,108,171 156,6
HU 220 575 Bl
4. táblázat
E. granulosus-onkoszférák in vitro jelölése az E. granulosus-petékkel való fertőzés napján a csoportokból összegyűjtött szérumokkal
Csoportszám Kezelés Leölt (%)
11. S2 klón 94
12. S3 klón 0
13. 48. klón 97
14. 95. klón 100
15. 101. klón 0
16. 119. klón 89
17. 123. klón 0
18. az összes klón elegye 89
19. 33., 42., 86. kiónok elegye 0
20. adjuváns kontrollok 0
21. onkoszféra kontrollok 0
6. példa
Az S2. 48., 95., és 119. klánok részleges DNS-szekvenálása pBluescript előállítása
A pBluescript fagemidet az egyes cDNS-klónok lambda-ZAP törzstenyészeteiből fagemid mentéssel állítottuk elő a „UNI-ZAP XR Clonig Kit”-tel (Strata5 gene) a gyártó cég utasításai szerint.
Egyszálú DNS előállítása
A pBluescript plazmidból (Stratagene) egyszálú DNS-t állítottunk elő Ausubel és munkatársai (szerkesztő) eljárása szerint [Current Protocols in Molecular Bio10 logy, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New York, (1987)].
cDNS szekvenálása
A cDNS-t láncterminációs eljárással [Sanger F., Nicklen S. és Coulson A. R., DNA sequencing with chain15 terminating inhibitors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 14, 5463, (1977)] részlegesen szekvenáltuk „Sequenase, Version 2,0” felhasználásával (United States Biochemical). T3 prímért alkalmaztunk (Albert Enstein College of Medicine, Oligonucleotide Synthesis Unit). A terminációs reakciót 6%-os poliakrilamid gélen futtattuk és autoradiográfiával (X-Omat, Kodak) tettük láthatóvá.
Eredmények
Az eredményeket az 5. táblázat mutatja.
5. táblázat
Jel: 95 Tömeg: 1,00
Jel: S2 Tömeg: 1,00
Jel: 48 Tömeg: 1,00
Jel: 119 Tömeg: 1,00
95 S2 48 119 1 TCCAGTTAT GTCTCATTTT GTTTGCGACT 59 TCAGTTTTGG CTCAGGAATA CAAAGGAATG TCAGTTTTGG CTCAGGAATA CAAAGGAATG TCAGTTTTGG CTCAGGAATA CAAAGGAATG TCAGTTTTGG CTCAGGAATA CAAAGGAATG
TCCAGTTAT GTCTCATTTT GTTTGCGACT GTCTCATTTT GTTTGCGACT GTCTCATTTT GTTTGCGACT
60 109
95 GGCGTAGAGA CAAGGACAAC AGAGACTCCG CTCCGTAAAC ACTTCAATTT
S2 GGCGTAGAGA CAAGGACAAC AGAGACTCCG CTCCGTAAAC ACTTCAATTT
48 GGCGTAGAGA CAAGGACAAC AGAGACTCCG CTCCGTAAAC ACTTCAATTT
119 GGCGTAGAGA CAAGGACAAC AGAGACTCCG CTCCGTAAAC ACTTCAATTT
110 159
95 GACTCCTGTG GGTTCTCAGG GCATTCGCTT AAGTTGGGAA GTCCAACACT
S2 GACTCCTGTG GGTTCTCAGG GCATTCGCTT AAGTTGGGAA GTCCAACACT
48 GACTCCTGTG GGTTCTCAGG GCATTCGCTT AAGTTGGGAA GTCCAACACT
119 GACTCCTGTG GGTTCTCAGG GCATTCGCTT AAGTTGGGAA GTCCAACACT
160 209
95 TGTCTGACCT CAAAGGAACA GATATTTCTC TAAAAGCGGT GAATCCTTCT
S2 TGTCTGACCT CAAAGGAACA GATATTTCTC TAAAAGCGGT GAATCCTTCT
48 TGTCTGACCT CAAAGGAACA GATATTTCTC TAAAAGCGGT GAATCCTTCT
119 TGTCTGACCT CAAAGGAACA GATATTTCTC TAAAAGCGGT GAATCCTTCT
210 233
95 GACCCGTTAG TCTACAAAAG ACAA
S2 GACCCGTTAG TCTACAAAAG ACAA
48 GACCCGTTAG TCTACAAAAG ACAA
119 GACCCGTTAG TCTACAAAAG ACAA
HU 220 575 Bl
Amint az az 5. táblázatból látható, mindegyik E. granulosus ellen védettséget kiváltó antigént expresszáló klón tartalmaz egy azonos 224 bázispárból álló DNSmolekula részletet (a fenti 10-233. nukleotidokat).
7. példa
A 95. klón DNS-szekvenálása
A cDNS-eket a T7Sequencing Kit (Pharmacia) készlettel szekvenáltuk CsCl-dal tisztított plazmid-DNS és a pGEX szekvenciából származó, az EcoRI klónozási 10 helytől 5’ és 3’ irányban körülbelül 30 bázispár távolságra található szekvenciáknak megfelelő oligonukleotid primerek felhasználásával. Az oligonukleotidokat „PCR-Mate 391 DNA Synthesizer” (Applied Biosystems, Foster City, Ca USA) készülékkel és az Applied 15 Biosystems által szállított vegyszerekkel állítottuk elő.
A közbülső szekvenciát a belső cDNS-szekvencia alapján tervezett előre és visszafelé irányuló oligonukleotid primerek segítségével határoztuk meg.
A 95. klón teljes szekvenciáját és a transziáit pro- 20 tein következtetett aminosavszekvenciáját a 4. ábra mutatja. A 95. klón cDNS-e egy 715 bázispárból álló inszertet tartalmaz (a lambda-ZAP vektorba való klónozási stratégiából származó nukleotidokon felül). Ez a cDNS egy 461 bázispárból álló, 16592 dalton követkéz- 25 tetett molekulatömeggel rendelkező proteint kódoló nyitott olvasási keretet tartalmaz.
A 95. klón teljes szekvenciája az alábbi DNS-szekvenciát tartalmazta, amely a cDNS előállításának menetéből származott, és amelyet a lambda-ZAP XR vektorba klónoztunk.
A cDNS 5’végén:
5 ’ GAATTCGGCACGAG2 3’
A cDNS 3’ végén:
5 ’AAAAAAAAAAAAAAAAAACTCGAG3’
A 4. ábrán bemutatott szekvencia helyességét az előbbiektől függetlenül a 6. példa szerinti eljárással igazoltuk.
Ipari alkalmazás
A találmány tárgyát fogékony gazdaszervezetben E. granulosus-fertőzés ellen immunológiai védettség kialakítására alkalmas antigén hatású polipeptid, valamint az említett polipeptid aktív peptidfragmensei és variánsai képezik. Megállapítottuk, hogy az említett polipeptiddel, illetve annak peptidfragmenseivel végzett vakcinázás csaknem teljes immunvédettséget hoz létre E. granulosus-petékkel való fertőzés ellen. A találmány kiterjed az antigén expresszálására szolgáló olyan rekombináns eljárásra, amellyel kereskedelemben forgalmazható mennyiségű antigén állítható elő. Nyilvánvaló, hogy a fenti példák csak a találmány szerinti megoldás szemléltetésére szolgálnak, és a találmány kiterjed az alkalmazott anyagoknak és technikáknak a gyakorlatban járatos személy számára ismert variációira.
SZEKVENCIALISTA (2) Információk az 1. szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 224 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: egyszeres (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: cDNS (xi) Szekvencia leírása: 1. szekvencia:
1 GT CTC ATT TTG TTT GCG ACT TCA GTT TTG GCT CAG GAA TAC AAA GGA 47
Leu Ile Leu Phe Alá Thr Ser Val Leu Alá Gin Glu Tyr Ly s Gly
48 ATG GGC GTA GAG ACA AGG ACA ACA GAG ACT CCG CTC CGT AAA CAC 92
Me t Gly Va 1 Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Ly s Hi s
93 TTC AAT TTG ACT CCT GTG GGT TCT CAG GGC ATT CGC TTA AGT TGG 137
Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gin Gly Ile Arg Leu Ser Trp
138 GAA GTC CAA CAC TTG TCT GAC CTC AAA GGA ACA GAT ATT TCT CTA 182
Glu Val Gin His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile Ser Leu
183 AAA GCG GTG AAT CCT TCT GAC CCG TTA GTC TAC AAA AGA CAA 224
Ly s Alá Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gin
(2) Információk a 2. szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 74 aminosavak (B) Típus: aminosav (C) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa : fehérje (xi) Szekvencia leírása: 2. szekvencia:
HU 220 575 Bl
1 Leu Ile Leu Phe Al a Thr Ser Val Leu Al a Gin Glu Tyr Lys Gly 15
16 Me t Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys Hi s 30
31 Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gin G1 y Ile Arg Leu Ser Trp 45
46 Glu Val Gin Hi s Leu Ser As p Leu Lys Gly Thr As p Ile Ser Leu 60
Lys Alá Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gin 74 (2) Információk a 3. szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 715 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: egyszeres (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: cDNS (xi) Szekvencia leírása: 3. szekvencia:
1 TC CAG Gin TTA TGT CTC ATT TTG TTT GCG ACT TCA GTT TTG GCT CAG GAA 47
Leu Cys Leu Ile Leu Phe Al a Thr Ser Val Leu Al a Gin Glu
48 TAC AAA GGA ATG GGC GTA GAG ACA AGG ACA ACA GAG ACT CCG CTC 92
Tyr Lys Gly Me t Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pr o Leu
93 CGT AAA CAC TTC AAT TTG ACT CCT GTG GGT TCT CAG GGC ATT CGC 137
Arg Lys Hi s Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gin Gly Ile Arg
138 TTA AGT TGG GAA GTC CAA CAC TTG TCT GAC CTC AAA GGA ACA GAT 182
Leu Ser Trp Glu Val Gin Hi s Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp
183 ATT TCT CTA AAA GCG GTG AAT CCT TCT GAC CCG TTA GTC TAC AAA 227
Ile Ser Leu Ly s Al a Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys
228 AGA CAA ACT GCA AAA TTC TCA GAT GGA CAA CTC ACT ATC GGC GAA 272
Arg Gin Thr Al a Lys Phe Ser Asp Gly Gin Leu Thr Ile Gly Glu
273 CTG AAG CCC TCC ACA TTA TAC AAA ATG ACT GTG GAA GCA GTG AAA 317
Leu Ly s Pro Ser Thr Leu Tyr Ly s Me t Thr Va 1 Glu Al a Val Lys
318 GCG AAA AAG ACC ATT TTG GGA TTC ACC GTA GAC ATT GAG ACA CCG 362
Al a Ly s Ly s Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro
363 CGC GCT GGC AAG AAG GAA AGC ACT GTA ATG ACT AGT GGA TCC GCC 407
Arg Al a Gly Lys Ly s Glu Ser Thr Val Me t Thr Ser Gly Ser Al a
408 TTA ACA TCC GCA ATC GCT GGT TTT GTA TTC AGC TGC ATA GTG GTT 452
Leu Thr Ser Al a Ile Al a Gly Phe Val Phe Ser Cy s Ile Val Val
453 GTC CTT ACT TGA ACT CTC ATG TAA GTC AAT GCA AAT TAT CCA CTG 497
Val Leu Thr
498 CTT CTA TAC TGA GTA GCA CGA CCC ATA ACT TGC ATT TTT CAA ATA 542
543 ACT CTT CTT CCA CAT CAG GCT TCC TTG GTG CCG AAG ATG CAC AAA 587
588 TCA CCA TTT ATT TTC GCT TTA TTA ACA TTT GTA TGA CCT CTC ATT 632
HU 220 575 Bl
633 GTG GAT TAC TCC CGA ATG ACA AAT ACG GGA CTT TGT CAT ATT TGC 677
678 TTC ATT GTT ATC ACC CTT AAT TCC AAT TCA CTG ACT CG 715 (2) Információk a 4. szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 153 bázispár (B) Típus: aminosav (C) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: fehéqe 10 (xi) Szekvencia leírása: 4. szekvencia:
1 Gin Leu Cys Leu I le Leu Phe Al a Thr Ser Va 1 Leu Al a Gin Glu 15
16 Tyr Lys Gly Me t Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu 30
31 Arg Lys Hi s Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gin Gly Ile Arg 45
46 Leu Ser Trp Glu Val Gin Hi s Leu Ser As p Leu Lys Gly Thr Asp 60
61 I le Ser Leu Lys Al a Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Va 1 Tyr Lys 75
76 Arg Gin Thr Al a Lys Phe Ser Asp Gly Gin Leu Thr I le Gly Glu 90
91 Leu Ly s Pro Ser Thr Leu Tyr Ly s Me t Thr Val Glu Al a Val Lys 105
106 Al a Lys Lys Thr I le Leu Gly Phe Thr Va 1 Asp I le Glu Thr Pro 120
121 Arg Alá Gly Lys Lys Glu Ser Thr Val Me t Thr Ser Gl y Ser Al a 135
136 Leu Thr Ser Al a I le Al a Gly Phe Val Phe Ser Cys I le Val Val 150
151 Val Leu Thr 153

Claims (23)

1. Tisztított antigén hatású polipeptid, azzal jellemezve, hogy SDS-PAGE vizsgálat alapján 23-25 ki-
Le u Ile Leu Phe Al a Thr Ser Val Leu Al a Gin Glu Tyr Lys Gly Me t Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Ly s Hi s Phe Asn Leu Thr Pro Val Gl y Ser Gin Gly Ile Arg Leu Ser Trp Glu Va 1 Gin Hi s Leu Ser As p Leu Lys Gly Thr Asp Ile Ser Leu Ly s Al a Val Asn Pro Ser As p Pro Leu Va 1 Tyr Lys Arg Gin
valamint fogékony gazdaszervezetben E. granulosus- 2. Az 1. igénypont szerinti peptidfragmens, azzal fertőzés ellen immunológiai védettség kialakítására al- jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciát tartal-
kalmas, vagy az említett polipeptidnek azzal lényegé- 40 mázzá: ben azonos mértékű védettséget létrehozó immunoló- giai aktivitással bíró peptidffagmense vagy variánsa. Leu Ile Leu Phe Alá Thr Ser Val Leu Al a Gin Glu Tyr Ly s Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gin Gly Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gin His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile Ser Leu Lys Al a Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gin 3.Azl. igénypont szerinti peptidfragmens, azzal jel- lemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciából áll: Leu Ile Leu Phe Alá Thr Ser Val Leu Al a Gin Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gin Gly Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gin His Leu Ser Asp Leu Lys Gl y Thr Asp Ile Ser Leu Lys Al a Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Va 1 Tyr Lys Arg Gin 4. Az 1. igénypont szerinti peptidfragmens, azzal
jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciát tartalmazza :
HU 220 575 Bl
Gin Leu Cy s Leu Ile Leu Phe Al a Thr Ser Val Leu Ala Gin Glu Tyr Lys Gly Me t Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys Hi s Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gin Gly Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gin Hi s Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile Ser Leu Ly s Al a Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Ly s Arg Gin
5. Az 1. igénypont szerinti polipeptid vagy peptidfragmens, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciát tartalmazza: 10
Gin Leu Cy s Leu Ile Leu Phe Al a Thr Ser Val Leu Al a Gin Glu Tyr Lys Gly Me t Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys Hi s Phe Asn Leu Thr Pro Va 1 Gly Ser Gin Gly Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gin Hi s Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile Ser Leu Lys Al a Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gin Thr Al a Lys Phe Ser Asp Gly Gin Leu Thr Ile Gly Gl u Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Ly s Me t Thr Val Glu Al a Val Ly s Al a Lys Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Al a Gly Lys Ly s Glu Ser Thr Va 1 Me t Thr Ser Gly Ser Al a Leu Thr Ser Al a Ile Ala Gly Phe Val Phe Ser Cy s Ile Val Val Val Leu Thr
6. Az 1. igénypont szerinti peptidfragmens, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciából áll: 25
Gin Leu Cy s Leu Ile Leu Phe Al a Thr Ser Val Leu Al a Gin Glu Tyr Lys Gly Me t Gly Va 1 Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys Hi s Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gin Gly Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gin Hi s Leu Ser Asp Leu Ly s Gly Thr Asp Ile Ser Leu Lys Al a Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Ly s Arg Gin Thr Al a Lys Phe Ser Asp Gly Gin Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Me t Thr Val Glu Al a Val Lys Al a Lys Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Al a Gly Lys Lys Glu Ser Thr Va 1 Me t Thr Ser Gly Ser Al a Leu Thr Ser Al a Ile Ala Gly Phe Val Phe Ser Cy s Ile Val Val Val Leu Thr
gében azonos mértékű védettséget létrehozó immunológiai aktivitással rendelkezik.
11. DNS-molekula, amely az alábbiak közül valamelyiket tartalmazza:
a) az 1. igénypont szerinti antigén hatású polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia;
b) az a) pont szerinti antigén hatású peptid olyan peptidfragmensét kódoló nukleotidszekvencia, amely fragmens az a) pont szerinti polipeptiddel azonos mértékű védettséget létrehozó immunológiai aktivitással rendelkezik; valamint
c) az a) pont szerinti polipeptid vagy a b) pont szerinti peptid variánsát kódoló nukleotidszekvencia, amelyben az aminosavszekvenciát egy vagy több aminosav inszertálásával, szubsztituálásával, illetve deletálásával módosítottuk, és amely variáns az a) pont szerint poli55 peptiddel vagy a b) pont szerinti peptidfragmenssel azonos mértékű védettséget létrehozó immunológiai aktivitással rendelkezik.
12. DNS-molekula, azzaljellemezve, hogy az alábbi DNS-szekvenciát tartalmazza:
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, peptidfragmens vagy azok variánsa, azzal jelle- 40 mezve, hogy egy gazdasejtben az azt kódoló nukleotidszekvencia expresszálásának a termékei.
8. A 7. igénypont szerinti polipeptid, peptidfragmens vagy azok variánsa, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtben fúziós proteinként expresszálódik. 45
9. A 8. igénypont szerinti polipeptid, vagy peptid, azzal jellemezve, hogy glutation s-transzferáz enzimmel (E. C. 2.5.18) kapcsolt fúziós proteinként expresszálódik.
10. Fogékony gazdaszervezetben E. granulosus-fer- 50 tőzés ellen védettség kialakítására alkalmas készítmény, azzal jellemezve, hogy az alábbi összetevők közül valamelyiket tartalmazza:
a) az 1. igénypont szerinti polipeptid;
b) Az a) pont szerinti polipeptid olyan peptidfragmense, amely azzal lényegében azonos mértékű védettséget létrehozó immunológiai aktivitással rendelkezik;
c) a) vagy b) olyan variánsa, amelyben egy vagy több aminosavat inszertálással, szubsztituálással, illetve deletálással módosítottunk, és amely azokkal lénye- 60
HU 220 575 Bl
GT CTC ATT TTG TTT GCG ACT TCA GTT TTG GCT CAG GAA TAC AAA GGA ATG GGC GTA GAG ACA AGG ACA ACA GAG ACT CCG CTC CGT AAA CAC TTC AAT TTG ACT CCT GTG GGT TCT CAG GGC ATT CGC TTA AGT TGG GAA GTC CAA CAC TTG TCT GAC CTC AAA GGA ACA GAT ATT TCT CTA AAA GCG GTG AAT CCT TCT GAC CCG TTA GTC TAC AAA AGA CAA
13. A 12. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal 10 jellemezve, hogy az alábbi DNS-szekvenciával rendelkezik:
CAG TTA TGT CTC ATT TTG TTT GCG ACT TCA GTT TTG GCT CAG GAA TAC AAA Gin Leu Cys Leu Ile Leu Phe Alá Thr Ser Val Leu Al a Gin Glu Tyr Ly s GGA ATG GGC GTA GAG ACA AGG ACA ACA GAG ACT CCG CTC CGT AAA CAC TTC Gly Me t Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Ly s Hi s Phe AAT TTG ACT CCT GTG GGT TCT CAG GGC ATT CGC TTA AGT TGG GAA GTC CAA Asn Leu Thr Pro Va 1 Gly Ser Gin Gly Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gin CAC TTG TCT GAC CTC AAA GGA ACA GAT ATT TCT CTA AAA GCG GTG AAT CCT Hi s Leu Ser As p Leu Ly s Gly Thr As p Ile Ser Leu Ly s Al a Val Asn Pro TCT GAC CCG TTA GTC TAC AAA AGA CAA ACT GCA AAA TTC TCA GAT GGA CAA Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gin Thr Al a Lys Phe Ser Asp Gly Gin CTC ACT ATC GGC GAA CTG AAG CCC TCC ACA TTA TAC AAA ATG ACT GTG GAA Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Me t Thr Val Glu GCA GTG AAA GCG AAA AAG ACC ATT TTG GGA TTC ACC GTA GAC ATT GAG ACA Al a Val Lys Al a Ly s Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr CCG CGC GCT GGC AAG AAG GAA AGC ACT GTA ATG ACT AGT GGA TCC GCC TTA Pro Arg Al a Gl y Lys Lys Glu Ser Thr Val Me t Thr Ser Gly Ser Al a Leu ACA TCC GCA ATC GCT GGT TTT GTA TTC AGC TGC ATA GTG GTT GTC CTT ACT Thr Ser Al a Ile Al a Gly Phe Val Phe Ser Cy s Ile Val Val Val Leu Thr
14. A 12. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az alábbi DNS-szekvenciával rendelkezik:
CAG TTA TGT CTC ATT TTG TTT GCG ACT TCA GTT TTG GCT CAG GAA TAC AAA Gin Leu Cys Leu Ile Leu Phe Al a Thr Ser Val Leu Al a Gin Glu Tyr Lys GGA ATG GGC GTA GAG ACA AGG ACA ACA GAG ACT CCG CTC CGT AAA CAC TTC Gly Me t Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys Hi s Phe AAT TTG ACT CCT GTG GGT TCT CAG GGC ATT CGC TTA AGT TGG GAA GTC CAA Asn Leu Thr Pro Va 1 Gl y Ser Gin Gly Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gin CAC TTG TCT GAC CTC AAA GGA ACA GAT ATT TCT CTA AAA GCG GTG AAT CCT Hi s Le u Ser Asp Leu Lys Gl y Thr Asp Ile Ser Leu Lys Alá Val Asn Pr o TCT GAC CCG TTA GTC TAC AAA AGA CAA ACT GCA AAA TTC TCA GAT GGA CAA Ser As p Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gin Thr Al a Ly s Phe Ser Asp Gly Gin
HU 220 575 BI
CTC ACT ATC GGC GAA CTG AAG CCC TCC ACA TTA TAC AAA ATG ACT GTG GAA Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Me t Thr Val Glu GCA GTG AAA GCG AAA AAG ACC ATT TTG GGA TTC ACC GTA GAC ATT GAG ACA Al a Val Lys Al a Ly s Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val As p Ile Glu Thr CCG CGC GCT GGC AAG AAG GAA AGC ACT GTA ATG ACT AGT GGA TCC GCC TTA Pro Arg Al a Gly Lys Lys Glu Ser Thr Val Me t Thr Ser Gly Ser Al a Leu ACA TCC GCA ATC GCT GGT TTT GTA TTC AGC TGC ATA GTG GTT GTC CTT ACT Thr Ser Al a Ile Al a Gly Phe Val Phe Ser Cys Ile Va 1 Val Val Leu Thr
TG4ACTCTCATGTAAGTCAATGCAAATTATCCACTGCTTCTATACTGAGTAGCACGACCCATAACTT
GCATTTTTCAAATAACTCTTCTTCCACATCAGGCTTCCTTGGTGCCGAAGATGCACAAATCACCATT
TATTTTCGCTTTATTAACATTTGTATGACCTCTCATTGTGGATTACTCCCGAATGACAAATACGGGA
CTTTGTCATATTTGCTTCATTGTTATCACCCTTAATTCCAATTCACTGACTCG
15. A 11-14. igénypontok bármelyike szerinti DNSmolekula, azzal jellemezve, hogy természetes forrásból van izolálva.
16. A 11-14. igénypontok bármelyike szerinti DNSmolekula, azzal jellemezve, hogy cDNS.
17. Rekombináns expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy a 11-16. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekulát tartalmaz.
18. Gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a 17. igénypont szerinti vektorral transzformált, és képes a kódolt polipeptid, peptidfragmens vagy azok variánsa expresszálására.
19. A 18. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy prokarióta.
20. A 19. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a prokarióta gazdasejt E. coli.
21. A 18. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy eukarióta.
22. Eljárás egy antigén hatású polipeptid, peptidfragmens vagy azok variánsa előállítására, azzal jellemezve, hogy a 18-21. igénypontok bármelyike szerinti sejteket tenyésztjük, és az expresszált terméket kinyerjük.
23. A 22. igénypont szerinti eljárással előállított antigén hatású polipeptid, peptidfragmens vagy azok variánsa.
24. Vakcina, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az 1-9. és 23. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, peptidfragmens, vagy azok variánsa immunológiailag hatásos mennyiségét egy gyógyszergyártásban szokásos adjuvánssal, hordozóanyaggal vagy hígítószerrel együtt.
25. A 24. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy tartalmazza továbbá egy vagy több, SDS-PAGE alapján 30, 34, illetve 40 kilodalton molekulatömegű E. granulosus-polipeptid (polipeptidek) hatásos mennyiségét vagy az említett polipeptideknek azokkal azonos immunológiai aktivitással rendelkező egy vagy több fragmensét, vagy variánsát.
26. Rekombinánsvírus-vakcina, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti antigén hatású polipeptidet, peptidfragmenst, vagy azok variánsát kódoló nukleinsavat tartalmaz, és képes az említett polipeptid, peptidfragmens vagy azok variánsa expresszálására.
27. Tisztított ellenanyag vagy annak egy kötőfragmense, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti antigén hatású polipeptidre, peptidre vagy variánsra fajlagos.
28. Eljárás Echinococcus vagy E. granulosus parazitán kívüli egyéb Taeniid paraziták ellen védettséget létrehozó antigének azonosítására, azzal jellemezve, hogy az említett parazitában hibridizációs eljárással a 4. ábra szerinti nukleotidszekvencia részével vagy egészével legalább lényegében megegyező nukleotidszekvenciával rendelkező gént azonosítunk.
HU9402404A 1992-02-21 1993-02-22 Echinococcus granulosus fertőzés elleni védettség létrehozására képes antigének és ilyen antigént tartalmazó vakcinák HU220575B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NZ24168892 1992-02-21
PCT/NZ1993/000007 WO1993016722A1 (en) 1992-02-21 1993-02-22 Antigens protective against echinococcus granulosus infection and vaccines containing such antigens

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9402404D0 HU9402404D0 (en) 1994-10-28
HUT69925A HUT69925A (en) 1995-09-28
HU220575B1 true HU220575B1 (hu) 2002-03-28

Family

ID=19923888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9402404A HU220575B1 (hu) 1992-02-21 1993-02-22 Echinococcus granulosus fertőzés elleni védettség létrehozására képes antigének és ilyen antigént tartalmazó vakcinák

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0629131B1 (hu)
JP (1) JPH07504088A (hu)
AU (1) AU676828B2 (hu)
BG (1) BG61754B1 (hu)
BR (1) BR9305933A (hu)
DE (1) DE69330385T2 (hu)
ES (1) ES2160594T3 (hu)
HU (1) HU220575B1 (hu)
PT (1) PT629131E (hu)
RU (1) RU2205875C2 (hu)
UA (1) UA45946C2 (hu)
WO (1) WO1993016722A1 (hu)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1886936A1 (en) 2006-08-11 2008-02-13 Graphic Packaging International, Inc. Construct for heating a rounded food item in a microwave oven and blank therefore
CN109234410A (zh) * 2018-11-15 2019-01-18 海南国际旅行卫生保健中心（海南出入境检验检疫局口岸门诊部） 一种基于环介导等温扩增技术的检测包虫病的方法
CN113214374B (zh) * 2020-02-06 2022-08-26 深圳华大基因股份有限公司 一种包虫病新抗原Cystatin蛋白
CN113214373B (zh) * 2020-02-06 2022-08-30 深圳华大基因股份有限公司 新包虫病抗原Murinoglobulin-2蛋白
CN111796090B (zh) * 2020-04-21 2023-02-07 沈阳农业大学 牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法
CN112014556A (zh) * 2020-08-04 2020-12-01 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种牛棘球蚴eg95蛋白抗体间接elisa检测试剂盒

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU642874B2 (en) * 1989-05-09 1993-11-04 Her Majesty The Queen In Right Of New Zealand Through The Ministry Of Agriculture And Fisheries Stable forms of antigenic taenia ovis polypeptides
FR2664613B1 (fr) * 1990-07-12 1994-08-26 Pasteur Institut Sequence peptidique immunogene d'echinococcus granulosus, sequence d'adn codant pour cette sequence peptidique et applications diagnostiques et therapeutiques.

Also Published As

Publication number Publication date
AU676828B2 (en) 1997-03-27
BG61754B1 (bg) 1998-05-29
PT629131E (pt) 2001-12-28
ES2160594T3 (es) 2001-11-16
HU9402404D0 (en) 1994-10-28
DE69330385D1 (de) 2001-08-02
UA45946C2 (uk) 2002-05-15
BR9305933A (pt) 1997-08-26
BG98989A (bg) 1995-07-28
WO1993016722A1 (en) 1993-09-02
EP0629131A4 (en) 1995-11-29
EP0629131A1 (en) 1994-12-21
DE69330385T2 (de) 2002-06-06
HUT69925A (en) 1995-09-28
RU94045154A (ru) 1996-11-10
EP0629131B1 (en) 2001-06-27
JPH07504088A (ja) 1995-05-11
RU2205875C2 (ru) 2003-06-10
AU3650093A (en) 1993-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Harrison et al. Identification and cDNA cloning of two novel low molecular weight host-protective antigens from Taenia ovis oncospheres
EP0871735A1 (en) Therapeutic and diagnostic compositions
DE69432137T2 (de) Impfstoff gegen Geflügelkokzidose
HU220575B1 (hu) Echinococcus granulosus fertőzés elleni védettség létrehozására képes antigének és ilyen antigént tartalmazó vakcinák
DE69521007T2 (de) Impfstoff gegen Geflügelkokzidose
US5952194A (en) Flea nucleic acid sequences and uses thereof
US7351693B2 (en) Peptides and nucleic acids of the cathelicidin family, derived from fish, and uses thereof
US5525508A (en) Haemonchus contortus vaccine
Saint et al. Expression of Schistosoma japonicum antigens in Escherichia coli
HUT56852A (en) Process for producing anticoagulant and vermicidal proteins
EP0540128B1 (en) Nematode vaccine
US5618542A (en) Vaccines comprising antigenic polypeptides of Taenia ovis
NZ249600A (en) Antigenic polypeptides, their production and vaccines containing them, useful against echinococcus (tapeworm) and taenii parasite infections
US7090849B2 (en) Babesia canis vaccine
AU693788B2 (en) Antigenic polypeptides of (T. ovis) and vaccines containing such polypeptides
US7264812B2 (en) Ostertagia vaccine
AU693440B2 (en) Antigenic polypeptides of (T. ovis) and vaccines containing such polypeptides
US5948644A (en) Polynucleotides encoding excretory/secretory proteins of parasitic nematodes, host cells transformed therewith
NZ265398A (en) Antigenic peptides of cestode parasites such as taenia ovis, coding sequences, production methods, vaccines and uses
Garcia-Almazan et al. c12) United States Patent

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee