JP2000501935A - 新しいキシラナーゼ組成物およびその産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 約3.6から4.2までのｐＨ最適条件およびゲル濾過により測定した約50-55ｋＤの分子量を有する、アシドサームスエスピーにより産生される新しい精製キシラナーゼが開示されている。開示されたキシラナーゼは、紙を製造するためのパルプの漂白および飼料組成物の処理に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 新しいキシラナーゼ組成物およびその産生方法 発明の背景 １． 発明の分野 本発明は、新しいキシラナーゼ組成物およびその産生方法に関するものである 。すなわち、本発明は、アシドサームスエスピー(Acidothermus sp.)、特にアシ ドサームスセルロリティクス(cellulolyticus)由来の精製キシラナーゼ組成物、 並びにパルプと紙の漂白および飼料組成物の処理へのこの酵素の使用に関するも のである。 ２． 従来の技術 キシラナーゼは、多くの異なる微生物により産生されることが知られている。 いくつかの異なるキシラン分解酵素が、一般的に微生物により産生され、キシラ ナーゼの各々が、木材複合体の異なる結合を攻撃するように作用する。菌類源お よび細菌類源の両方の由来の酵素を工業工程、例えば、製紙工業でのリグノセル ロースパルプの漂白において塩素の使用を減少または除去する一方で、脱リグニ ンおよび明度の向上、あるいは家畜飼料の価値の改良に使用する試みが文献に記 載されている。 キシランのバックボーン鎖を加水分解するキシラナーゼ、例えば、エンド−β −キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）が、リグノセルロース物質の漂白への使 用に関して研究されている。例えば、米国特許第5,179,021号において、パルプ の漂白におけるキシラナーゼ処理と酸素処理との組合せが特に有用であると開示 されている。ＰＣＴ出願公開番号WO92/03541において、菌類トリコデルマリーセ イ(Trichoderma reesei)由来のヘミセルラーゼによりヘミセルロースを溶解させ る方法が開示されている。しかしながら、キシラナーゼに関する研究では、高温 およびアルカリを用いたパルプ漂白条件下で有用な好熱性および好アルカリ性キ シラナーゼに焦点が当てられている。しかしながら、より低いｐＨでは、一般的 に酸素漂白またはオゾン漂白が行われている。したがって、高温で著しい活性を 有 する低ｐＨキシラナーゼを発見することが有利である。 最近、菌類および細菌類の微生物から、いくつかの好熱性キシラナーゼが確認 された。例えば、好熱性キシラナーゼが、6.0-7.0の最適ｐＨおよび70-80℃の温 度範囲を有するミクロテトラスポラ(Microtetraspora)として再分類されたアク チノマジュラ(Actinomadura)から単離された（Holtz,C.等 Antonie van Leewenh oek 59:1-7，1991）。欧州特許出願第EP473545号には、細菌菌株サーモモノスポ ラフスカ(Thermomonosposra fusca)が、広いｐＨ範囲に亘り、すなわち、約5-10 、より好ましくは6.6-9.5の範囲に亘り、10-90℃、好ましくは50-80℃の温度で 活性を有する熱安定性キシラナーゼを産生することが開示されている。さらに、 ＰＣＴ出願公開番号WO92/18612には、広いｐＨ範囲に亘る(5.0-8.0)活性および6 0-90℃の温度範囲での熱安定性を有する、ジクチオグロムス(Dictyoglomus)属由 来のキシラナーゼ酵素が開示されている。好熱性セルロース分解細菌アシドサー ムスセルロリティクスが、Mohagheghi等のInt.J.Systematic Bact.，vol.36，no .3，435-443頁(1986)に記載されており、セルラーゼの産生がShiang等のAppl.Mi crob.Biotech.，vol.34，591-597(1991)に記載されている。しかしながら、いず れの文献にも、低ｐＨおよび高温で有用かもしれない精製キシラナーゼは記載さ れていない。 家畜に効率的に飼料を消化させる家畜飼料においても、キシラナーゼは有用で ある。キシラナーゼを飼料に加えた結果の一つとして、単位重量当たりの費用を 増加させずに、飼料の飼料要求率（ＦＣＲ）が改良される。飼料のＦＣＲは、家 畜の体重増加に対して消費された飼料の量の比率である。低いＦＣＲは、所定の 量の飼料によって、比例してより多くの体重が増加して、家畜が成長することを 示す。このことは、家畜がより効率的に飼料を利用できることを意味する。ＦＣ Ｒを減少できる方法の一つに、家畜による消化率を改善し、それによって、家畜 が飼料から引き出せる栄養利得を増大させることがある。 しかしながら、それには、デンプン、脂肪、タンパク質およびアミノ酸内容物 のような飼料の栄養成分の消化率について、様々な制限がある。これらの制限と しては以下の項目が挙げられる： (i) 家畜の消化器官内に存在する物質の粘度。このような粘度は、少なく と も一部は、混合され連結されたβグルカンおよびアラビノキシランのような可溶 性非デンプン多糖類によるものである； (ii) 飼料の細胞壁内、特に穀物におけるアリューロン層の細胞壁内の栄養 の包括。このような包括は、家畜の消化系による分解に対して比較的抵抗性を有 する穀物の細胞壁内にある高レベルの非デンプン多糖類により生じる。このこと により、細胞内に包括された栄養を、家畜が栄養として利用できなくなる；およ び (iii) 家畜と、特に若い家畜内における消化器官の微生物個体群との両方の 内因性酵素活性における欠損。 消化率を妨げる上述した問題は、小麦の含有量が多いもののような、穀物ベース の食餌の場合に特に著しい。 飼料からの栄養の消化率が悪いという問題のために、家畜の栄養要求を満たす ためには、通常、高レベルのエネルギーおよびタンパク質供給物質を含有するよ うに飼料を配合する必要がある。 現在、ある（補給）酵素を穀物ベースの家畜飼料中に含めることが、家畜の消 化器官内に存在する物質の粘度を減少させるのに有利な場合があることを示す一 連の証拠がある。このような減少は、可溶性キシランを加水分解して、それによ って、消化工程についての重要な制限である消化物の粘度を減少させるキシラナ ーゼのような酵素により達成することができる。 補給物質として加えられるキシラナーゼは、対象とする家畜の胃腸（ＧＩ）管 内に見られるｐＨおよび温度の条件で安定で活性でなければならない。このキシ ラナーゼがそのような生体内条件に曝されたときに安定で活性でない場合には、 消化物の粘度を著しくは減少させることができない。現在、トリコデルマロンギ ブラチアツム(longibrachiatum)、黒色アスペルギルスおよびフミコラインソレ ンス(insolens)のような菌類由来のキシラナーゼを、家畜飼料中に補給物質とし て含ませることが知られている。BedfordおよびClassen（The Journal of Nutri tion，vol.122，560-569頁）は、ブロイラーの場合に生体内で測定された消化物 の粘度と、体重の増加と、ＦＣＲ値との間に、顕著な相関関係があることを開示 している。家禽に与えられる小麦およびライ麦ベースの食餌の場合、重量増加お よびＦＣＲにおける変動の70-80％が、腸粘度のみの差に基づくことが示された 。こ のことは、高レベルの可溶性アラビノキシランを含有する穀物ベースの飼料中の 消化物の粘度が重要であることを強調している。消化物の粘度が増加するにつれ 、膵臓酵素、基質および消化工程の最終生成物の拡散を妨害することにより、全 ての栄養の消化率が減少する。 しかしながら、家畜飼料中にキシラナーゼのような酵素補給物質を使用するこ とは、穀物補給物質に関する加工必要条件のために困難である。多くの場合、そ のような酵素補給物質は、酵素を、穀物のような生理的許容担体に含浸させるこ とにより得られる。含浸させられた担体を、飼料の他の成分と混合し、家畜に直 接与えるために立方体またはペレットに圧縮する。実施されている工程では、比 較的高温を用いている。このことは、第一に、製造工程の効率を改良し、第二に 、有害な細菌類、特にサルモネラ属を含まない飼料を製造するためである。さら に、高温を使用することにより、得られる立方体およびペレットの品質および耐 久性が改良され、効率的に取り扱える成分の範囲が広がり、また、脂肪および糖 蜜のような、飼料中に含ませることのできる液体成分のレベルが増える。 飼料成分の加工技術では現在、比較的長時間に亘り比較的高温を用いている。 さらに、混合物を、ペレット形成の最中に比較的高圧に曝し、形成された立方体 またはペレットの耐久性を増加させている。飼料の栄養特性を改良するために開 発された加工方法のうち一つに、蒸気ペレット形成がある。この方法は、配合し た飼料を蒸気で処理して、その温度と水分の含有量を増加させる工程を含んでい る。この工程は、調質と呼ばれている。調質は、飼料の種類および配合により、 数秒から数分まで継続する。調質器内の温度は、100℃まで上昇してもよい。そ の後、飼料を、摩擦により温度を急速に上昇させるペレット形成ダイに通過させ る。 最近、エキスパンダと呼ばれる、飼料の前処理または調質を行う新しい装置が 導入された。この装置により、維持された調質を圧力下におき、その後ペレット 形成を行うことができる。この技術によれば、以前に蒸気調質に曝されていた様 々な飼料成分を、より多くの流れが注入される圧縮スクリュー中に供給し、次い で、その塊を、増大する圧力および剪断作用に曝し、次いで、可変の出口間隙に 押し込む。圧縮した生成物を、粒子サイズで減少させた後、標準的なペレット成 形機中に供給する。エキスパンダ内の飼料成分の滞留時間は約5-20秒であり、到 達する温度は145℃ほどであってもよい。約3.5ＭＰａの圧縮圧に到達するが、温 度および圧力の両方の増加は非常に速く、両方とも、生成物が出口間隙を通って 吐出されるときに急速に落下する。エキスパンダを使用することにより、有害な 細菌類、特にサルモネラ属が効果的に除去されるので、このことは有利である。 さらに、比較的高レベルの脂肪および他の液体成分をペレット形成の前に混合物 中に含ませることができる。さらに、調理および圧力／剪断作用により、デンプ ンのゲル化が促進される。 残念ながら、エキスパンダおよびペレット形成技術に特徴的な高温および高圧 の加工条件は、特に、ペレット形成中に通常出くわす湿潤条件で適用される場合 、ある飼料成分に有害な可能性がある。このことは特に、キシラナーゼを含む、 存在するいかなる酵素にも当てはまる。したがって、従来技術の酵素には、一般 的に、このようなペレット形成技術を経済的に使用できるようにする商業的なペ レット形成操作の加工条件下で十分には安定でないという問題がある。 したがって、飼料の加工中における酵素の安定性問題の一部を解決する方法が あるけれども、それらのうちのどれも、この問題を全体的に効果的に解決してい ない。発明の概要 本発明の目的は、低ｐＨおよび高温で著しい活性を有する新しいキシラナーゼ を提供することにある。 本発明のさらなる目的は、リグノセルロースパルプを漂白する新しい方法を提 供することにある。 本発明のさらなる目的は、飼料の穀物を処理して、それらの消化率を改良する 手段を提供することにある。 本発明によれば、以下の物理的特性により特徴付けられる精製キシラナーゼを 提供する：約3.6から4.2までのｐＨ最適条件およびゲル濾過により測定した約50 -55ｋＤの分子量。好ましくは、キシラナーゼは、アシドサームスエスピー、よ り好ましくはアシドサームスセルロリティクス、そして最も好ましくはアシドサ ームスセルロリティクスＡＴＣＣ４３０６８由来である。 本発明の組成物の実施の形態において、そのキシラナーゼがアシドサームスエ スピー由来であり、約3.6から4.2までのｐＨ最適条件およびゲル濾過により測定 した約50-55ｋＤの分子量を有する精製キシラナーゼ組成物を提供する。 本発明の組成物の別の実施の形態において、アシドサームスエスピー由来のキ シラナーゼを含み、約3.6から4.2までのｐＨ最適条件およびゲル濾過により測定 した約50-55ｋＤの分子量を有する飼料添加物を提供する。 本発明の方法の実施の形態において、アシドサームスエスピーの発酵培養物か ら単離したキシラナーゼをリグノセルロースパルプの漂白に使用する。 本発明の別の方法の別の実施の形態において、アシドサームスエスピー由来の キシラナーゼを含み、約3.6から4.2までのｐＨ最適条件およびゲル濾過により測 定した約50-55ｋＤの分子量を有する飼料添加物を用いて、穀物ベースの家畜飼 料の品質を改良する。図面の簡単な説明 図１は、10分間に亘る4.5のｐＨでのＲＢＢ−キシランへの、本発明によるキ シラナーゼの活性の温度依存性を示している。 図２は、ある温度範囲で処理されたキシラナーゼの半減期を示している。 図３は、あるｐＨ範囲でのｐＨ最適条件を示す本発明のキシラナーゼの相対的 活性を示している。 図４は、3.3のｐＨでの処理後のある時間に亘る本発明のキシラナーゼの安定 性を示している。発明の詳細な説明 本発明によれば、以下の物理的特性により特徴付けられる精製キシラナーゼを 提供する：約3.6から4.2までのｐＨ最適条件、ゲル濾過により測定した約50-55 ｋＤの分子量、約6.0-6.5のｐＩ、および約70-80℃の温度最適条件。好ましくは 、そのキシラナーゼは、アシドサームスエスピー、より好ましくはアシドサーム スセルロリティクス、そして最も好ましくはアシドサームスセルロリティクスＡ ＴＣＣ４３０６８（American Type Culture Collectionに寄託された，12301 Pa rklawn Drive，Rockville，Maryland，USA 20852）由来である。アシドサームス セルロリティクスは、Int.J.Systematic Bact.，vol.36，435-443頁(1986)およ び米国特許第5,366,884号に分類学的に記載されている。これらの文献をここに 引用す る。 本発明の別の形態において、アシドサームスエスピー由来の、より好ましくは アシドサームスセルロリティクス由来のキシラナーゼを、穀物ベースの家畜飼料 の調製に使用する。そのような穀物ベースの飼料において、穀物は好ましくは、 小麦、大麦、トウモロコシ、モロコシ、ライ麦、オート麦、ライ小麦および米の うちの少なくとも一つである。穀物が小麦であることが特に好ましい。 本発明による穀物ベースの飼料は、シチメンチョウ、ガチョウ、カモ、ヒツジ およびウシのような家畜に与えてもよい。しかしながら、その飼料を、ブタまた は家禽、特にブロイラーに与えることが特に好ましい。穀物ベースの飼料は、好 ましくは、飼料１キロ当たり0.00001-10ｇのキシラナーゼタンパク質を含み；よ り好ましくは、飼料１キロ当たり0.0001-1ｇのキシラナーゼタンパク質を含み； そして最も好ましくは、飼料１キロ当たり0.001-0.1ｇのキシラナーゼタンパク 質を含む。穀物ベースの飼料は、少なくとも20重量％の穀物を含む。その飼料は 、より好ましくは、少なくとも30重量％の穀物、そして最も好ましくは、少なく とも50重量％の穀物を含むべきである。その穀物は、上述したいずれのものであ っても差し支えないが、小麦が特に好ましい。 穀物ベースの飼料の穀物成分はタンパク質の供給源を構成するが、魚粉、肉粉 または野菜由来のもののような補助タンパク質の供給源を飼料に含むことが通常 必要である。植物性タンパク質の供給源としては、全脂肪ダイズ、アブラナ、菜 種、ダイズ粉、アブラナ粉および菜種粉のうちの少なくとも一つを含む。従来の 飼料と比較すると、魚粉、肉粉または植物性タンパク質のような追加のタンパク 質供給源の相対的な量を、本発明の教示を採用することにより減少させ、費用を 著しく削減することができる。これは、穀物の相対的な費用が、従来のタンパク 質補給物質のものよりも著しく少ないからである。この点を考慮して、本発明の 教示にしたがって、利用できるエネルギー、アミノ酸およびタンパク質に関して 、従来の飼料と同等の栄養価を有するが、穀物の相対比率が高く、タンパク質補 給物質の相対比率が低い穀物を調製することができる。家畜飼料中に熱安定性キ シラナーゼを含めることには、あるレベルの性能を有する飼料を達成するために 含む必要のある脂肪および油のようなエネルギー補給物質のレベルを減少させる と いう効果がある。 本発明により家畜飼料中に熱安定性キシラナーゼを含ませることにより、飼料 中の粗タンパク質値および／または消化率および／またはアミノ酸含有量および ／または消化率係数を増加させることができ、これにより、以前には家畜飼料の 必要成分であった代わりのタンパク質供給源および／またはアミノ酸補給物質の 量を減少させられる。熱安定性キシラナーゼを加えることにより、小麦の、利用 できる粗タンパク質の含有量および／またはタンパク質の消化率係数を増加させ る場合、従来は加える必要のあったタンパク質および／またはエネルギー補給物 質のレベルを減少させることが、主な節約となることが分かった。あるいは、熱 安定性キシラナーゼを加えることによってアミノ酸含有量または消化率係数値の みを増加させる場合、従来は飼料に加える必要のあったアミノ酸補給物質のレベ ルを減少させることが、主な節約となることが分かった。 本発明により提供される飼料には、β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、マ ンナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ、リパーゼ、α−アラビノフラノ シダーゼ、プロテアーゼ、α−アミラーゼ、エステラーゼ、オキシダーゼ、オキ シド−レダクターゼおよびペクチナーゼのうちの一つ以上のような他の酵素補給 物質を含めてもよい。さらなる酵素補給物質として、バチルス属由来のサブチリ シンのようなプロテアーゼを含めることが特に好ましい。そのようなサブチリシ ンは、例えば、米国特許第4,760,025号に詳細に記載されている。 本発明による適切な飼料は、生理学的に許容される担体および熱安定性キシラ ナーゼを含む飼料添加物を調製し、次いで、この添加物を、家畜飼料を構成する 他の成分（穀物およびタンパク質補給物質の他の供給源を含む）と0.01-50ｇ／ ｋｇ、より好ましくは0.1-10ｇ／ｋｇ、そして最も好ましくは約１ｇ／ｋｇの量 で混合することにより得られる。 本発明のこの形態における生理学的に許容される担体は、好ましくは穀物であ るかまたは穀物由来である。そのような穀物としては、精製された小麦、トウモ ロコシ、ダイズ、砂糖、デンプンまたはこれらのいずれかの副生成物が挙げられ る。このような担体はこの従来技術において慣習的なものであり、しだかって、 さらに詳細には記載しない。 本発明のこの形態による飼料添加物を他の飼料成分と組み合わせて、穀物ベー スの飼料を製造する。そのような他の飼料成分としては、一つ以上の他の（好ま しくは熱安定性の）酵素補給物質、ビタミン飼料添加物、ミネラル飼料添加物お よびアミノ酸飼料添加物が挙げられる。次いで、可能性のあるいくつかの異なる 種類の成分を含む得られた（組み合わされた）飼料添加物を、穀物およびタンパ ク質補給物質のような他の飼料成分と適切な量で混合して、家畜飼料を形成する ことができる。二軸ペレット形成機、蒸気ペレット形成機、エキスパンダまたは 押出機のような現在用いられている加工装置のいずれを用いて、これらの成分を 家畜飼料中に含ませるように加工しても差し支えない。 得られた穀物ベースの飼料中に熱安定性キシラナーゼが存在することには、そ のＦＣＲを減少させる効果がある。その代わりに、または追加して、キシラナー ゼにより、穀物ベースの飼料の消化率を増加させてもよい。さらに、追加して、 またはその代わりに、家畜が消費する飼料の単位量当たりの家畜の体重増加の比 率を増加させてもよい。 別の形態において、本発明のキシラナーゼには、従来技術によるパルプの漂白 および／または脱リグニンを向上させる用途がある。この工程は、パルプを、全 上澄みキシラナーゼ、または上述した一つ以上の精製キシラナーゼと接触させる 工程を含み、ｐＨ、温度、処理時間、酵素の使用量およびパルプの品質と種類の ような要因に依存する。 上述した工程を、酵素活性を向上させる温度およびｐＨで行うことが好ましい 。温度は約50-90℃の範囲に及んでもよく、70-85℃が好ましい。この工程の好ま しいｐＨは、約5-11好ましくは、最も好ましくは約７から約９までの範囲に及ぶ 。広いアルカリ性ｐＨ範囲に亘り活性であり、約７から約９までの好ましいｐＨ 範囲で高い活性を有することが、本発明の精製キシラナーゼの特徴である。 本発明の精製キシラナーゼを適用する好ましい処理時間は、例えば、所望の結 果、処理したパルプの品質および量、並びに酵素の濃度のような要因に依存して 、約30分間から約４時間までである。 適切な酵素の使用量は、約0.10から200ユニット／乾燥パルプのｇ、より好ま しくは0.50から50ユニット／ｇである。酵素標品のキシラナーゼ活性は以下のよ う に決定される：1.8ｍｌのキシラン溶液（0.05Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液中で調 製し、酢酸によりｐＨ5.3に調節した0.6％のシグマNO.X-0627）に、同一の緩衝 液中の適切に希釈した0.200ｍｌの酵素を加える。次いで、３ｍ１のＤＮＳ試薬 （３，５−ジニトロサリチレート 10ｇ／ｌ；Ｎａ、Ｋ酒石酸塩 300ｇ／ｌ） を加えることにより反応を停止させ、５分間に亘り試料を沸騰させることにより 色を展開させる。次いで、540ｎｍの波長で吸光度を測定する。１酵素ユニット が、アッセイ条件下で、１分当たりに、キシロースとして計算される還元糖の１ マイクロモルを遊離させる。活性は、アッセイ条件下で４マイクロモルの還元糖 を遊離させる酵素希釈物から計算する。 本発明を適用して、様々な加工パルプ、すなわち、リグニンの含有量を減少さ せる様々な方法のいずれかで既に以前に処理されており、本発明の方法において 処理されて、化学的方法によりリグニン除去がさらに向上するパルプの品質を高 めるまたは品質を高める補助をしてもよい。本発明を適用して硬材および軟材の クラフトパルプを処理し、リグニンの除去およびパルプの明度を向上させてもよ い。本発明は特に、化学パルプ、すなわち、硫酸鉛（クラフト）工程および酸素 脱リグニンにおけるような様々な化学処理によりリグニン成分が化学的に変性さ れたパルブに適用でき、好ましくはクラフトパルプに適用される。好ましい方法 において、本発明の酵素を、クラフト消化または酸素脱リグニンの後であるが、 漂白の前にパルプに適用する。同一のパルプにクラフト消化および酸素脱リグニ ンの両方を行う場合、酵素は、クラフト消化の後で、酸素脱リグニンの前または 酸素脱リグニンの後に適用する。本発明はまた、オゾン漂白したパルプにも適用 できる。 得られたパルプを、適切な抽出剤を用いて処理して、放出可能なリグニン成分 を除去する。別の実施の形態において、本発明の酵素により処理したパルプを、 塩素、二酸化塩素および過酸化物のようなリグニン分解化学物質により続いて処 理して、適切な抽出剤によりさらに抽出してもよい。さらに別の実施の形態にお いて、酵素処理したパルプを適切な抽出剤で処理し、続いて、リグニン分解およ び適切な抽出剤により最終処理を行ってもよい。そのような抽出剤は、影響を受 けたリグニン成分を実質的に可溶化させる。適切な抽出剤としては、限定するも のではないが、アルカリ金属水酸化物（Ｅ）、ＤＭＦ、ジオキサン、アセトン、 およびアルコールのような塩基が挙げられる。水酸化物抽出剤を過酸化水素（Ｅ_p ）または酸素（Ｅ_o）と組み合わせてもよい。次いで、得られたパルプを、二酸 化塩素（ＤＥＤ）または過酸化物（Ｐ−Ｐ）のような化学漂白剤により所望の明 度まで漂白し、それによって、同一の漂白剤によるが、酵素処理を用いていない 方法により同一の明度まで漂白したパルプと比較したときに、化学物質の実質的 な節約を観察してもよい。塩素含有化学物質または過酸化物の還元をそのような 方法により行う。さらに、上述した酵素について本発明を実施することにより、 同量の漂白化学物質をパルプに適用して、処理したパルプにおける明度をより大 きくしてもよい。 別の実施の形態において、本発明は、本発明によるキシラナーゼを含有する全 キシラナーゼ上澄みまたは上述した精製酵素の、様々な工業的設定における用途 を提供する。例えば、精製キシラナーゼまたは全キシラナーゼ上澄みを用いて、 アルコール燃料および他の重要な工業化学物質の製造のため、または洗浄剤組成 物中の成分として、農業廃棄物を酵素的に分解してもよい。 実施例 実施例１ アシドサームスキシラナーゼの精製 アシドサームスセルロリティクスＡＴＣＣ４６０６８をメリーランド州ロック ビルのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得た。オート 麦スペルトキシラン(oat spelt xylan)を加えた、ヘンセン(Henssen)培地（ｇ／ Ｌ） Ｋ２ＨＰＯ４ 0.2ｇ ＭｇＳｏ４．７Ｈ２Ｏ 0.3ｇ ＣａＣＯ３ 0.2ｇ ＦｅＳｏ４．７Ｈ２Ｏ 0.005ｇ 酵母抽出物 0.1ｇ カザミノ酸 0.1ｇ ＮＨ４ＨＯ３ 0.2ｇ 尿素 0.1ｇ アスパラギン 0.25ｇ カゼイン 0.2ｇ ｐＨ 5.5 を含有する培地中の菌株を、100ｒｐｍでの250ｍｌのエルレンマイアーフラスコ 内において5.5のｐＨおよび55-60℃の温度で６−８日間に亘り培養することによ り、培養濾液を得た。培養上澄みに限外濾過を施して、余分な細胞キシラナーゼ 酵素を含有する濾液を濃縮し、ペレットを捨てた。以下に記載するように、上澄 みは、相当なキシラナーゼ活性を含んでいた。 実施例２ アシドサームスキシラナーゼの特性の測定 実施例２において、上述したように得た精製キシラナーゼを用いて、キシラナ ーゼの特性を測定した。分子量 キシラナーゼ活性を含有する培養上澄みを、セントリプレップ３（Centriprep 3）限外濾過容器（アミコン、製造業者の指示による）を用いて４倍に濃縮した 。フアーマシアＦＰＬＣ装置を用いて、100ｍＭのＮａＣｌ−50ｍＭのクエン酸 塩／リン酸塩緩衝液、ｐＨ6.0により平衡にされている、縦に連結された二つの ゲル濾過カラム（ファーマシアスーパーデクスG-200 10/30の後にファーマシア スーパーデクスG-75 10/30）に１ｍｌの濃縮材料を適用した。流量は0.5ｍｌ／ 分であり、280ｎｍで紫外線吸収をモニタし、１ｍｌの分画を採集した。 以下のように、分画をキシラナーゼ活性についてアッセイした：レマゾルブリ リアントブルーで染色したカバノキキシラン（ＲＢＢ−キシラン、メガザイム、 オーストラリア）基体を用いて、キシラナーゼの存在を測定した。50ｕｌの試料 を400ｕｌの基体溶液（50ｍＭの酢酸ナトリウム中の1.25％［ｗ／ｖ］のＲＢＢ ーキシラン、ｐＨ4.5）と混合し、10分間に亘り40℃で定温培養する。消化され ていないキシランを、１ｍｌの95％エタノールを加えることにより沈殿させ、遠 心分離により除去する。溶液中に残留している放出された染料を分光測光（ＯＤ₅₉₀ ）により定量する。この染料は、キシラナーゼ活性に比例している。活性は 、標準 曲線を用いて定量してもよく、ＸＡＵ／ｍｌ（１ミリリットル当たりのキシラナ ーゼ活性ユニット）として報告される。キシラナーゼ活性は、この装置を用いて 、42分後に溶出することが分かった。上述した条件を用いて、この層にファーマ シア低分子量ゲル濾過基準（1.25ｍｇ／ｍｌ）を適用し、溶出結果を用いて分子 量標準曲線を作成した。アシドサームスキシラナーゼの溶出は、この標準曲線と 比較した場合、50-55キロダルトン（約52.9キロダルトン）の分子量に対応した 。等電点 ゲルオーバーレイ法を用いて、アシドサームスキシラナーゼの等電点（ｐＩ） を測定した。キシラナーゼ活性を含有する培養上澄みの電気泳動（ＩＥＦ）をフ ァスト装置（ファーマシア）を用いて行った。ＩＥＦゲル、ｐＨ3.9に溶融アガ ロース−基質懸濁液（50ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ4.5内の0.4％（ｗ／ｖ）ア ガロース、７ｍｇ／ｍｌのＲＢＢ−キシラン、0.5％（ｖ／ｖ）グリセロール） を重ねて、37℃で培養した。１時間後に、キシラナーゼ活性は、透明区域として 明らかであった。ゲルを完全に乾燥させ、貯蔵した。キシラナーゼｐＩを、同時 に実行した、銀染色ｐＩマーカー（ブロードｐＩキットｐＨ5.3-9.3、ファーマ シアバイオテック）を含有するＩＥＦゲルと比較することにより測定した。指示 にしたがって、ファストシステム展開銀染色を用いてタンパク質を視覚化した。ｐＨおよび温度分布 この実施例において、上述したＲＢＢ−キシランアッセイを用いて、酵素試料 をアッセイした。精製キシラナーゼのｐＨ分布を、3.0、4.0、5.0、6.0、6.0お よび7.0のｐＨでＲＢＢアッセイを実施することにより測定した。図２に示した ように、精製キシラナーゼは、約3.6-4.2のアッセイ条件下でｐＨ最適条件を有 する。 キシラナーゼの温度分布を、ｐＨ4.5および37℃、55℃、65℃、70℃および80 ℃の温度で、10分間に亘りＲＢＢ−キシランアッセイを実施することにより測定 した。図１に示したように、精製キシラナーゼは、70-80℃のアッセイ条件下で 最適温度を有する。熱安定性 精製キシラナーゼの個々の試料を70℃、75℃、80℃、85℃または90℃の温度で 定温培養した。ある時間間隔でアリコートを採取して、所定の温度での所定の定 温培養後のキシラナーゼの活性を測定した。60℃、ｐＨ4.5および10分の時問で ＲＢＢ−キシランアッセイにしたがって、アリコートを活性についてアッセイし 、定温培養温度でのキシラナーゼの半減期を計算した。その結果が図２に示され ている。実験条件下における70℃および75℃でのキシラナーゼの半減期は24時間 より長かった。低ｐＨの安定性 実施例２において記載したキシラナーゼの精製試料を、水酸化ナトリウムで3. 3のｐＨに調節し、室温で定温培養した。65℃、4.5のｐＨで10分間に亘り上述し たＲＢＢアッセイを用いて、試料の活性を30分後、60分後、90分後および120分 後に測定した。図４に示したように、キシラナーゼの活性の大部分は、低ｐＨで ２時間後にも残っていた。 実施例３ アシドサームスキシラナーゼによる家畜飼料の処理 キシラナーゼ活性に用いたアッセイは、家畜の胃腸管に見られる条件を模倣し た条件下で粘性基体として小麦アラビノキシランを用いた生体外粘度降下アッセ イであった。このような生体外アッセイは、キシラナーゼ（またはキシラナーゼ の混合物）が、家畜飼料中の補助物質として使用される場合に、消化物粘度を減 少させる所望の効果を有するか否かに関する規準として機能する。活性を以下の ように測定した： キシラナーゼ活性の１ユニットは、上述した条件下で１分間で基質からの還元 糖（キシロース等価物として表される）の１μモルを遊離させる酵素の量である 。試薬 １． １％（ｗ／ｖ）キシラン基質 10ｍ１の0.5Ｍ水酸化ナトリウムを1.0ｇのキシラン（Fluka95590）に加える。 電磁気撹拌器により30分間に亘り混合する。約40ｍｌの0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩 衝液、ｐＨ6.5を加える。１Ｍ酢酸によりｐＨを6.5に調節する。0.05Ｍ酢酸ナト リウム緩衝液、ｐＨ6.5で100ｍｌまで満たす。基質は、使用する場合、ずっと混 合しているべきである。 ２． １Ｍ酢酸 5.7ｍｌの氷酢酸を容量フラスコ中にピペットで移し、蒸留水で100ｍｌまで満 たす。 ３． 0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ6.5 Ａ． 蒸留水中に4.1ｇの酢酸ナトリウムを溶解させ、蒸留水で1000ｍｌ まで満たす。 Ｂ． 蒸留水中に3.0ｇの氷酢酸を溶解させ、蒸留水で1000ｍｌまで満た す。 溶液ＡのｐＨを溶液ＢによりｐＨ6.5に調節する。 ４． ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）試薬 20.0ｇの３，５−ジニトロサリチル酸を約800ｍｌの蒸留水中に懸濁させる。 連続して撹拌しながら、300ｍｌの水酸化ナトリウム溶液（300ｍｌの蒸留水中の 32.0ｇのＮａＯＨ）を徐々に加える。この懸濁液を、溶液が透明になるまで、撹 拌しながら水浴中（温度が＋４８℃を越えない）で暖める。600ｇの酒石酸カリ ウムナトリウムを徐々に加える。溶液が透明になるまで、必要であれば溶液を暖 める（温度は＋48℃を越えない）。 蒸留水を2000ｍｌまで満たし、粗粒焼結ガラスフィルタに通して濾過する。濃 い色のボトル内に室温で貯蔵する。この試薬は、最大６ケ月に亘り安定である。方法 １． 酵素試料 １ｍｌの酵素希釈物（0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ6.5中）を＋50℃で 平衡にする。１ｍｌのキシラン基質を加え、撹拌し、正確に30分間に亘り＋50℃ で定温培養する。３ｍｌのＤＮＳ−試薬を加え、撹拌し、正確に５分間に亘り反 応混合物を沸騰させる。反応混合物を冷たい水浴中で室温まで冷却し、蒸留水に 対する540ｎｍでの吸光度を測定する。 ２． 酵素ブランク １ｍｌのキシラン基質を30分間に亘り＋50℃で定温培養する。３ｍｌのＤＮＳ −溶液を加え、撹拌する。１ｍｌの酵素希釈物（0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、 ｐＨ6.5中）を加え、撹拌する。正確に５分間に亘り混合物を沸騰させる。反応 混合物を冷たい水浴中で室温まで冷却し、蒸留水に対する540ｎｍでの吸光度を 測定する。 酵素試料と酵素ブランクとの間の吸光度の差は、0.3-0.5であるべきである。 ３． 標準曲線 0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ6.5中において無水キシロースから標準溶 液を調製する。標準溶液中のキシロース濃度は、0.05-0.5ｍｇ／ｍｌであるべき である。１ｍｌの標準溶液、１ｍｌのキシラン基体および３ｍｌのＤＮＳ−試薬 をピペットで試験管中に移す。撹拌し、正確に５分間に亘り沸騰させる。冷たい 水浴中で室温まで冷却し、標準ブランクに対する540ｎｍでの吸光度を測定する 。標準ブランクにおいて、キシロース溶液を、１ｍｌの0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩 衝液、ｐＨ6.5と置き換える。それ以外は、標準ブランクをキシロース標準溶液 と同様に取り扱う。 キシロース濃度を吸光度の関数としてプロットする。新しい標準曲線を、新し いＤＮＳ−試薬ごとに作成する。計算 試料のキシラナーゼ活性を以下の等式にしたがって計算する： ここで： A(X) ＝酵素試料の吸光度 A(O) ＝酵素ブランクの吸光度 k ＝標準曲線の傾斜 C₀ ＝キシロースの標準曲線の切片 1000 ＝因子、mモル−＞μモル Df ＝希釈因子 MW_xyl ＝キシロースの分子量(150.13mg／mモル) t ＝反応時間(30分) キシラナーゼの粘度を減少させる能力を測定するために用いた粘度降下アッセ イを以下のように実施した。このアッセイは、全ての場合において二重に行う。 得られた溶液が１ｍｌ当たり1.0ユニットのキシラナーゼ活性を有するような キシラナーゼ濃度を調節するために、アッセイすべきキシラナーゼ酵素を、6.5 のｐ Ｈを有する0.1Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で希釈する。このようなキシラナーゼ 活性を、詳細に上述したキシラナーゼ活性のアッセイ方法にしたがって測定する 。 得られた溶液中の酵素の最終濃度が0.2Ｕ／ｍｌであり、小麦アラビノキシラ ンの最終濃度が1.0％ｗ／ｗとなるように、100μｌの酵素溶液を、ガラス試験管 内の0.1Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ6.5中の400μｌの小麦アラビノキシラ ン（メガザイムｐｔｙから得た）溶液に加えた。 次いで、溶液を含有する試験管を密封し、ある期間に亘り、典型的に１分間ま たは５分間に亘り、95℃に設定された水浴内に配置した。この熱処理後、試験管 を氷浴内で冷却した。得られた溶液の粘度を、１秒に１回粘度を測定するように プログラムされたブルックフィールドＤＶ−II、ＣＰ４０粘度計を用いて40℃の 温度で測定した。表１に示した数値は、20分間の定温培養後の粘度測定値である 。アシドサームスセルロリティクスからのキシラナーゼを、両者とも飼料の添加 物としてよく知られている、黒色アスペルギルスおよびトリコデルマビリデから のキシラナーゼと比較した。結果を以下に示した： 表１に示したように、１分間に亘り95℃の温度に曝しても、アシドサームスセル ロリティクス由来のキシラナーゼにより粘度レベルは実質的に増加しなかったが 、黒色アスペルギルスおよびトリコデルマビリデからのキシラナーゼに関しては 、粘度が著しく増加したことが示された。同様に、アシドサームスセルロリティ クスからのキシラナーゼに関して、５分間に亘り95℃の温度に曝した後の粘度の 増加は、黒色アスペルギルスおよびトリコデルマビリデ由来のキシラナーゼのも のの半分未満であった。 もちろん、上述した好ましい実施の形態について、幅広い変更および改良を行 うことができる。したがって、本発明の範囲を定義するのは、全ての同等物を含 む、以下の請求の範囲である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 クラークソン，キャスリーン エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94304―1013 パロアルト ペイジ ミル ロード 925 ジェネンコア インター ナショナル インコーポレーテッド (72)発明者 ワン，ザイ シー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94304―1013 パロアルト ペイジ ミル ロード 925 ジェネンコア インター ナショナル インコーポレーテッド (72)発明者 モーガン，アンドリュー ジェイ イギリス国 エスエヌ８ １エイエイ ウ ィルトシャー マルボロー ハイ ストリ ート エイルズバリー コート マーケッ ト ハウス フィンフィーズ インターナ ショナル リミテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．約3.6から4.2までのｐＨ最適条件およびゲル濾過により測定した約50-55ｋ Ｄの分子量を有する精製キシラナーゼ。 ２．前記キシラナーゼが約70-80℃の温度最適条件を有することを特徴とする請 求の範囲１記載の精製キシラナーゼ。 ３．前記キシラナーゼがアシドサームスセルロリティクス由来であることを特徴 とする請求の範囲１記載の精製キシラナーゼ。 ４．前記キシラナーゼがアシドサームスセルロリティクスＡＴＣＣ４３０６８由 来であることを特徴とする請求の範囲３記載の精製キシラナーゼ。 ５．アシドサームスエスピー由来のキシラナーゼにより、亜硫酸パルプまたはク ラフトパルプを処理する工程からなるパルプの漂白方法。 ６．少なくとも20重量％の穀物、および飼料１ｋｇ当たり約0.00001ｇから約10 ｇまでのキシラナーゼタンパク質を含む穀物ベースの飼料であって、該キシラナ ーゼタンパク質が、約3.6から4.2までのｐＨ最適条件およびゲル濾過により測定 した約50-55ｋＤの分子量を有することを特徴とする穀物ベースの飼料。 ７．前記キシラナーゼがアシドサームスエスピーから得られることを特徴とする 請求の範囲６記載の穀物ベースの飼料。 ８．前記キシラナーゼがアシドサームスセルロリティクスから得られることを特 徴とする請求の範囲７記載の穀物ベースの飼料。 ９．前記穀物が、小麦、大麦、トウモロコシ、モロコシ、ライ麦、オート麦、ラ イ小麦および米のうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求の範囲６記 載の穀物ベースの飼料。 10．生理学的に許容される担体および精製されたときに約3.6から4.2までのｐＨ 最適条件およびゲル濾過により測定した約50-55ｋＤの分子量を有するキシラナ ーゼを含む飼料添加物。 11．前記キシラナーゼがアシドサームスエスピーから得られることを特徴とする 請求の範囲10記載の飼料添加物。 12．前記キシラナーゼがアシドサームスセルロリティクスから得られることを特 徴とする請求の範囲11記載の飼料添加物。 13．前記担体が、穀物である、または穀物由来であることを特徴とする請求の範 囲10記載の飼料添加物。 14．前記担体が、精製された小麦、トウモロコシ、ダイズまたはこれらのいずれ かの副生成物であることを特徴とする請求の範囲13記載の飼料添加物。 15．穀物ベースの家畜飼料の消化率を増大させる、またはそのＦＣＲを低下させ る方法であって、精製されたときに、約3.6から4.2までのｐＨ最適条件およびゲ ル濾過により測定した約50-55ｋＤの分子量を有するキシラナーゼを前記飼料に 加える工程からなることを特徴とする方法。