ES2242970T3 - Nueva composicion de xilanasa y metodo para su produccion. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UNA NUEVA XILANASA PURIFICADA PRODUCIDA POR ACIDOTERMUS SP. QUE POSEE UN PH OPTIMO DE ENTRE ALREDEDOR DE 3,6 - 4,2 Y UN PESO MOLECULAR DE ENTRE ALREDEDOR DE 50 - 55 KD DETERMINADO POR FILTRACION EN GEL. LA XILANASAS QUE SE DESCRIBE ES UTIL EN EL BLANQUEADO DE PULPA PARA LA PRODUCCION DE PAPEL Y EN EL TRATAMIENTO DE COMPOSICIONES PARA ALIMENTACION.

Description

Nueva composición de xilanasa y método para su producción.

Antecedentes del invento Campo del invento

El presente invento se refiere a una nueva composición de xilanasa y a un método para su producción. Específicamente, el invento se refiere a una composición de xilanasa purificada derivada de Acidothermus sp., y particularmente Acidothermus cellulolyticus, y al uso de esa enzima en el blanqueo de pasta papelera y papel y en el tratamiento de composiciones de pienso.

Estado de la técnica

Se sabe que las xilanasas se producen por varios diferentes microorganismos. Generalmente, un microorganismo produce varias enzimas xilanolíticas diferentes, cada xilanasa actuando para atacar diferentes enlaces en el complejo de madera. Se han descrito en la bibliografía intentos de emplear enzimas derivadas tanto de fuentes fúngicas como bacterianas en procedimientos industriales, p. ej., para incrementar la deslignificación y el abrillantamiento en tanto que disminuye o se elimina el uso de cloro en el blanqueo de la pasta lignocelulósica en la industria papelera o para mejorar el valor del pienso animal.

Las xilanasas, p. ej., las endo-\beta-xilanasas (EC 3.2.1.8), que hidrolizan la cadena estructural de xilano, se han estudiado para su uso en el blanqueo de material lignocelulósico. Por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.179.021, la combinación de xilanasa y tratamiento con oxígeno en el blanqueo de pasta papelera se describe como particularmente útil. En la solicitud PCT de la publicación nº WO 92/03541, se describe un método para disolver la hemicelulosa con hemicelulasas derivadas del hongo Trichoderma reesei. La búsqueda de xilanasas, sin embargo, se ha centrado en las xilanasas termófilas y alcalófilas, que son útiles en las condiciones de blanqueo de la pasta papelera que emplean altas temperaturas y álcalis. Sin embargo, el empleo de oxígeno u ozono para blanqueo tiene lugar generalmente a un pH más bajo. En consecuencia, sería ventajoso descubrir una xilanasa de pH bajo que tenga actividad significativa a temperaturas elevadas.

Recientemente, se han identificado varias xilanasas termófilas de hongos y microorganismos bacterianos. Por ejemplo, se ha aislado una xilanasa termófila de Actinomadura, reclasificada como Microtetraspora, que tiene un pH óptimo de 6,0-7,0 y un intervalo óptimo de temperatura de 70-80ºC (Holtz, C., et al. Antonie van Leewenhoek 59:1-7, 1991). El documento EP 473 545 describe que la cepa bacteriana Thermomonospora fusca produce xilanasas termoestables activas a temperaturas de 10-90ºC, preferiblemente 50-80ºC, en un amplio intervalo de pH, es decir, desde aproximadamente 5-10, con el intervalo más preferido entre 6,6-9,5. Además, el documento WO92/18612 describe una enzima xilanasa derivada del género Dictyoglomus, que tiene actividad sobre un amplio intervalo de pH (5,0-9,0) y termoestabilidad a temperaturas que varían desde 60-90ºC. La bacteria celulolítica termófila Acidothermus cellulolyticus se describe en Mohagheghi et al., Int. J. Systematic Bact., vol. 36, nº 3, pág. 435-443 (1986) y la producción de celulasa se describe en Shiang et al., Appl. Microb. Biotech., vol. 34, págs. 591-597 (1991). Sin embargo, ninguna de las referencias describe una xilanasa purificada que pueda ser útil a pH bajo y temperatura alta.

Las xilanasas también han sido útiles en los piensos de animales para permitir a los animales digerir los piensos más eficazmente. Un resultado de añadir xilanasa al pienso es una mejora del índice de conversión del pienso (Feed Conversion Ratio, FCR) de un pienso sin incrementar su coste por unidad de peso. El FCR de un pienso es la proporción de la cantidad de pienso consumido en relación al aumento de peso del animal. Un bajo FCR indica que una cantidad dada de pienso da como resultado un animal en crecimiento que proporcionalmente aumenta más de peso. Esto significa que el animal es capaz de utilizar el pienso más eficazmente. Un modo en el que el FCR puede reducirse es mejorando su digestibilidad por un animal, de tal modo que se incrementa el beneficio nutricional que el animal puede obtener de él.

Sin embargo, hay varias restricciones en la digestibilidad de los componentes nutricionales de un pienso tales como su contenido de almidón, grasa, proteína y aminoácidos. Estas restricciones incluyen:

(i)

la viscosidad de los materiales presentes en los intestinos del animal. Tal viscosidad se debe, al menos en parte, a polisacáridos no amiláceos solubles tales como mezclas de \beta-glucanos ligados y arabinoxilanos;

(ii)

el atrapamiento de nutrientes dentro de las paredes celulares del pienso, particularmente los de la capa aleurona en los cereales. Tal atrapamiento está causado por los altos niveles de polisacáridos no amiláceos en las paredes celulares de los cereales que son relativamente resistentes a la descomposición por el sistema digestivo del animal. Esto impide que los nutrientes atrapados dentro de las células estén disponibles nutricionalmente para el animal; y

(iii)

una deficiencia en actividad enzimática endógena, tanto del animal como de la población microbiana intestinal, particularmente en un animal joven.

Los problemas anteriores, que interfieren con la digestibilidad, son particularmente notables en el caso de las dietas basadas en cereales, tales como las que tienen un alto contenido en trigo.

Debido al problema de la pobre digestibilidad de los nutrientes del pienso, es normalmente necesario formular piensos que contengan materiales que proporcionen niveles más altos de energía y proteína a fin de satisfacer las demandas nutricionales de los animales.

Hay ahora una cantidad importante de evidencias que muestran que el incorporar ciertas enzimas (suplementarias) en los piensos animales basados en cereales puede ser ventajoso para reducir la viscosidad del material presente en los intestinos del animal. Esta reducción puede llevarse a cabo mediante enzimas tales como las xilanasas que hidrolizan los xilanos solubles, de tal modo que reducen la viscosidad de la digesta, que es una importante restricción en el proceso digestivo.

Las xilanasas que se añaden como suplementos deben ser estables y activas a las condiciones de pH y temperatura encontradas dentro del tracto gastrointestinal (GI) del animal diana. Si no son estables y activas cuando se exponen a tales condiciones in vivo, entonces no serán capaces de reducir la viscosidad de la digesta de forma significativa. Es conocida en la actualidad la inclusión de xilanasas, como un suplemento en un pienso animal, derivadas de hongos como Trichoderma longibrachiatum, Aspergillus niger y Humicola insolens. Bedford y Classen (The Journal of Nutrition, vol. 122, pág. 560-569) describen que hay una correlación significativa entre la viscosidad de la digesta medida in vivo en el caso de los pollos de cebo y la ganancia de peso corporal y los valores FCR. En el caso de aves de corral alimentadas con dietas basadas en trigo y centeno, se ha mostrado que hasta un 70-80% de las variaciones en el aumento de peso y FCR se basan únicamente en diferencias de viscosidad intestinal. Esto destaca la importancia de la viscosidad de la digesta en piensos basados en cereales que contienen altos niveles de arabinoxilanos solubles. A medida que aumenta la viscosidad de la digesta, se reduce la digestibilidad de todos los nutrientes al interferir con la difusión de las enzimas pancreáticas, sustratos y productos finales del proceso digestivo.

Sin embargo, el empleo de suplementos enzimáticos como la xilanasa en el pienso animal se complica por los requerimientos de elaboración de los suplementos del grano. A menudo, tales suplementos enzimáticos se obtienen impregnando la enzima sobre un vehículo aceptable fisiológicamente, tal como un cereal. El vehículo impregnado se mezcla con los otros componentes del pienso y se prensa en cubos o bolas para alimentar directamente a los animales. Los procedimientos que se han desarrollado emplean temperaturas relativamente elevadas. Esto es primeramente para mejorar la eficacia del procedimiento de fabricación y en segundo lugar para producir piensos que estén exentos de bacterias perjudiciales, particularmente Salmonella. Además, el empleo de temperaturas elevadas mejora la calidad y durabilidad de los cubos y bolas resultantes, aumenta la serie de ingredientes que pueden ser eficazmente manipulados y también aumenta el nivel de ingredientes líquidos, tales como grasas y molasas, que pueden incorporarse dentro del pienso.

En la actualidad las técnicas de elaboración de los componentes alimentarios emplean temperaturas relativamente elevadas durante un periodo de tiempo relativamente largo. Además, la mezcla se somete a presiones relativamente altas durante la granulación para aumentar la durabilidad de los cubos o bolas formados. Uno de los métodos de elaboración que se ha desarrollado para mejorar las propiedades nutricionales del pienso es la granulación al vapor. Este método incluye la etapa de tratar el pienso compuesto con vapor para aumentar su temperatura y su contenido de humedad. Esta etapa se denomina acondicionamiento. El acondicionamiento dura desde unos pocos segundos hasta varios minutos dependiendo del tipo y formulación del pienso. La temperatura en el acondicionador puede elevarse hasta 100ºC. Después el pienso se pasa a través de una matriz de granulación que provoca un rápido aumento en su temperatura por fricción.

Recientemente, se ha introducido un nuevo dispositivo para el tratamiento previo o acondicionamiento de piensos denominado expansor. Este dispositivo permite acondicionamiento mantenido bajo presión seguido de granulación. Conforme a esta técnica, varios componentes del pienso que se han visto previamente sometidos al acondicionamiento por vapor alimentan un tornillo de compresión dentro del que se inyecta más vapor y la masa se somete entonces a aumento de presión y a cizalla y luego se hace pasar a través de una salida de abertura variable. El producto comprimido, después de reducir su tamaño de partículas, alimenta una prensa convencional de granulación. El tiempo de permanencia de los componentes del pienso en el expansor es de aproximadamente 5-20 segundos, y la temperatura alcanzada puede ser de hasta 145ºC. Se alcanza una presión de compresión de alrededor de 3,5 MPa, pero la producción de ambas, temperatura y presión, es muy rápida y ambas caen rápidamente a medida que el producto se expulsa a través de la abertura de salida. El empleo de expansores es ventajoso porque eliminan de forma eficaz bacterias perjudiciales, particularmente Salmonella. Además, es posible incluir niveles relativamente elevados de grasa y otros ingredientes líquidos en la mezcla antes de la granulación. Por añadidura, la cocción y la presión/cizalla tienen como resultado una mayor gelatinización del almidón.

Desafortunadamente, las condiciones de elaboración de elevadas temperaturas y altas presiones características del expansor y de la tecnología de granulación, particularmente cuando se aplican en las condiciones de humedad encontradas normalmente durante la granulación, son potencialmente destructivas para ciertos componentes del pienso. Esto es particularmente cierto para cualquier enzima, incluidas las xilanasas, que están presentes. De este modo, las enzimas de la técnica anterior han tenido generalmente el problema de que no eran lo suficientemente estables en las condiciones de elaboración de las operaciones de granulación comercial como para permitir el empleo económico de tales técnicas de granulación.

Por consiguiente, aunque están disponibles soluciones parciales al problema de la estabilidad enzimática durante el procesamiento del pienso, ninguna de ellas resuelve el problema de una manera completamente eficaz.

Compendio del invento

Es un objetivo del invento proporcionar una nueva xilanasa que tiene una actividad significativa a pH bajo y temperatura elevada.

Es un objetivo adicional del invento proporcionar medios para tratar los granos de pienso para mejorar su digestibilidad.

Conforme al presente invento, se proporciona una xilanasa purificada que se caracteriza por las siguientes propiedades físicas: un pH óptimo de aproximadamente 3,6 a 4,2, un peso molecular de aproximadamente 50-55 kD según se determina por filtración en gel, una temperatura óptima de aproximadamente 70-80ºC y un pI de aproximadamente 6,0-6,5. Preferiblemente, la xilanasa se deriva de Acidothermus sp., más preferiblemente de Acidothermus cellulolyticus y lo más preferiblemente de Acidothermus cellulolyticus ATCC 43068.

En una realización de la composición del invento, se proporciona una composición de xilanasa purificada, tal xilanasa se deriva de Acidothermus sp. y tiene un pH óptimo de aproximadamente 3,6 a 4,2, un peso molecular de aproximadamente 50-55 kD, según se determina por filtración en gel, una temperatura óptima de aproximadamente 70-80ºC y un pI de aproximadamente 6,0-6,5.

En otra realización de la composición del invento, se proporciona un aditivo para pienso en el que dicho aditivo para pienso comprende una xilanasa derivada de Acidothermus sp. y tiene un pH óptimo de aproximadamente 3,6 a 4,2, un peso molecular de aproximadamente 50-55 kD, según se determina por filtración en gel, una temperatura óptima de aproximadamente 70-80ºC y un pI de aproximadamente 6,0-6,5.

En otra realización del método del presente invento, un aditivo para pienso que comprende una xilanasa derivada de Acidothermus sp., según se declama en la reivindicación 1 se emplea para mejorar la calidad del pienso animal basado en grano.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 ilustra la dependencia de la temperatura de la actividad de la xilanasa, de acuerdo con el invento, en RBB-xylano a un pH de 4,5 durante 10 minutos.

La Fig. 2 ilustra la semivida de la xilanasa tratada en un intervalo de temperatura.

La Fig. 3 ilustra la actividad relativa de la xilanasa del invento en un intervalo de pH y representando el pH óptimo.

La Fig. 4 ilustra la estabilidad de la xilanasa del invento a través del tiempo tras tratamiento a un pH de 3,3.

Descripción detallada del invento

De acuerdo con el presente invento, se proporciona una xilanasa purificada que se caracteriza por las siguientes propiedades físicas: un pH óptimo de aproximadamente 3,6 a 4,2, un peso molecular de aproximadamente 50-55 kD según se determina por filtración en gel, un pI de aproximadamente 6,0-6,5 y una temperatura óptima de aproximadamente 70-80ºC. Preferiblemente, la xilanasa se deriva de Acidothermus sp., más preferiblemente de Acidothermus cellulolyticus y lo más preferiblemente de Acidothermus cellulolyticus ATCC 43068 (depositada en American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, EE.UU. 20852). Acidothermus cellulolyticus se describe taxonómicamente en Int. J. Systematic Bact., vol. 36, págs. 435-443 (1986) y en la patente de EE.UU. nº 5.366.884, que se incorporan en esta memoria como referencia.

En otro aspecto del invento, la xilanasa derivada de Acidothermus sp., y preferiblemente de Acidothermus cellulolyticus, se emplea en la preparación de un pienso animal basado en cereal. En tal pienso basado en cereal, el cereal es preferiblemente al menos uno de entre trigo, cebada, maíz, sorgo, centeno, avena, triticale y arroz. Es particularmente preferible que el cereal sea trigo.

El pienso basado en cereal de acuerdo con el presente invento puede proporcionarse a animales como pavos, gansos, patos, ovejas y vacas. Es particularmente preferido, sin embargo, que el pienso se proporcione a cerdos o aves de corral, y en particular a pollos de cebo. El pienso basado en cereal incluye preferiblemente 0,00001-10 g de proteína xilanasa por kilo de pienso; más preferiblemente incluye entre 0,0001-1 g de proteína xilanasa por kilo de pienso; y lo más preferiblemente 0,001-0,1 g de proteína xilanasa por kilo de pienso. El pienso basado en cereal comprende al menos un 20% en peso de cereal. Más preferiblemente, debe incluir al menos un 30% en peso de cereal y, lo más preferiblemente, al menos un 50% en peso de cereal. El cereal puede ser cualquiera de los previamente mencionados, siendo el trigo particularmente preferido.

Aunque el componente cereal de un pienso basado en cereal constituye una fuente de proteína, es normalmente necesario incluir fuentes de proteínas suplementarias en el pienso tales como aquellas derivadas de harina de pescado, harina de carne o vegetales. Fuentes de proteínas vegetales incluyen al menos uno entre soja de grasa completa, semillas de colza, canola, harina de soja, harina de semillas de soja y harina de canola. Según se compara con los piensos convencionales, la cantidad relativa de las fuentes de proteínas adicionales, tales como harina de pescado, harina de carne o proteínas vegetales, pueden reducirse al adoptar las enseñanzas del presente invento, lo que da como resultado ahorros significativos de costes. Esto se debe a que el coste relativo de los cereales es significativamente menor que el de los suplementos de proteína convencionales. A la vista de esto, un pienso puede prepararse conforme a la enseñanza del presente invento teniendo el mismo valor nutricional en términos de energía disponible, aminoácidos y proteínas que un pienso convencional, pero el cual incluye una proporción relativa mayor de cereal y una proporción relativa menor de suplementos proteicos. También se ha encontrado que la inclusión de una xilanasa termoestable en un pienso animal tiene el efecto de que necesitan incluirse niveles reducidos de suplementos de energía tales como grasas y aceites para obtener un pienso que tenga un cierto nivel de rendimiento.

La inclusión de una xilanasa termoestable en un pienso animal de acuerdo con el presente invento hace posible aumentar el valor de proteína bruta y/o digestibilidad y/o contenido de aminoácido y/o coeficientes de digestibilidad del pienso, lo que permite una reducción en las cantidades de fuentes alternativas de proteína y/o de suplementos de aminoácidos que habían sido previamente ingredientes necesarios de los piensos animales. Cuando el coeficiente de digestibilidad de proteína y/o el contenido de proteína bruta disponible del trigo aumenta por la adición de la xilanasa termoestable, pueden encontrarse ahorros importantes en los niveles reducidos de proteína y/o de suplementos de energía que se han necesitado añadir convencionalmente. Alternativamente, cuando sólo el contenido de aminoácidos o los valores del coeficiente de digestibilidad se aumentan por la adición de la xilanasa termoestable, los mayores ahorros se encuentran en los niveles reducidos de suplementos de aminoácidos que se ha necesitado convencionalmente añadir a los piensos.

El pienso proporcionado por el presente invento puede incluir también otros suplementos enzimáticos tales como una o más de entre \beta-glucanasa, glucoamilasa, mananasa, \alpha-galactosidasa, fitasa, lipasa, \alpha-arabinofuranosidasa, proteasa, \alpha-amilasa, esterasa, oxidasa, óxidorreductasa y pectinasa. Es particularmente preferido incluir una proteasa como suplemento enzimático adicional, tal como una subtilisina derivada del género Bacillus. Tales subtilisinas se describen en detalle, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 4.760.025.

Un pienso adecuado de acuerdo con el presente invento puede obtenerse preparando un aditivo para pienso que comprende un vehículo aceptable fisiológicamente y la xilanasa termoestable y, después, mezclando este aditivo en cantidades de 0,01-50 g por kilo con los otros componentes que constituyen el pienso animal (incluyendo el cereal y otras fuentes de suplemento proteico), más preferiblemente 0,1-10 g/kg, y lo más preferiblemente de aproximadamente 1 g/kg.

El vehículo aceptable fisiológicamente en este aspecto del presente invento es preferiblemente un cereal o un derivado de un cereal. Tales cereales incluyen trigo, maíz, soja, azúcares, almidones o un subproducto molido de cualquiera de éstos. Tales vehículos son convencionales en esta técnica y, por tanto, no se describen en mayor detalle.

El aditivo para pienso de acuerdo con este aspecto del presente invento se combina con otros componentes del pienso para producir un pienso basado en cereal. Tales otros componentes del pienso incluyen uno o más (preferiblemente termoestables) suplementos enzimáticos, aditivos vitamínicos del pienso, aditivos minerales del pienso y aditivos aminoacídicos del pienso. Los aditivos del pienso resultantes (combinados), incluyendo posiblemente varios tipos diferentes de compuestos pueden entonces mezclarse en una cantidad apropiada con los otros componentes del pienso, tales como cereal y suplementos proteicos para formar un pienso animal. El procesamiento de estos componentes dentro de un pienso animal puede llevarse a cabo empleando cualquiera de los aparatos de procesado empleados en la actualidad, tales como una máquina de granulación doble, un granulador de vapor, un expansor o un
extrusor.

La presencia de la xilanasa termoestable en el pienso basado en cereal resultante tiene el efecto de reducir su FCR. La xilanasa puede alternativa o adicionalmente aumentar la digestibilidad del pienso basado en cereal. Además de eso, la inclusión de la xilanasa puede adicional o alternativamente aumentar la velocidad de aumento de peso corporal en un animal por unidad de cantidad de pienso que el animal consume.

Además, las xilanasas del presente invento pueden tener aplicación para incrementar la deslignificación y/o el blanqueo de la pasta papelera de acuerdo con los recursos técnicos reconocidos en el estado de la técnica. El procedimiento comprende poner en contacto la pasta papelera con el sobrenadante completo de xilanasa, o una o más de las xilanasas purificadas descritas anteriormente, y depende de factores tales como el pH, la temperatura, el tiempo de tratamiento, la dosis de enzima y la cantidad y tipo de pasta papelera.

El procedimiento anterior debe llevarse a cabo a una temperatura y pH que incrementarán la actividad enzimática. Las temperaturas están en el intervalo de aproximadamente 50-90ºC, siendo preferidas 70-85ºC. El pH preferido para el procedimiento está en el intervalo de 5-11, preferiblemente aproximadamente, y el más preferido por encima de 7 hasta aproximadamente 9. Es característico de las xilanasas purificadas del presente invento ser activas en un amplio intervalo de pH alcalino, así como el tener actividad elevada en el intervalo de pH preferido de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 9.

El periodo de tiempo de tratamiento preferido para aplicar las xilanasas purificadas del presente invento es desde aproximadamente 30 minutos hasta aproximadamente 4 horas, dependiendo de factores tales como los resultados deseados, la cantidad y calidad de pasta papelera tratada y la concentración de enzima, por ejemplo.

Una dosificación adecuada del enzima es aproximadamente 0,10 a 200 unidades/g de pasta papelera seca, más preferiblemente 0,50 a 50 unidades/g. La actividad xilanasa de las preparaciones enzimáticas se determina según sigue: a 1,8 ml de solución de xilano (0,6% de Sigma nº X-0627, preparado en tampón de acetato sódico 0,05M y ajustado a pH de 5,3 con ácido acético) se le añaden 0,200 ml de enzima diluida adecuadamente en el mismo tampón. La solución se incuba a 40ºC durante exactamente 30 minutos. La reacción se para entonces por adición de 3 ml de reactivo DNS (10 g/l de 3,5-dinitrosalicilato; 300 g/l de tartrato de Na,K), y el color se desarrolla al hervir la muestra durante 5 minutos. La absorbancia se mide entonces a una longitud de onda de 540 nm. Una unidad de enzima libera un micromol de azúcares reductores calculados como xilosa por minuto en las condiciones de ensayo. La actividad se calcula a partir de una dilución de enzima que libera 4 micromoles de azúcar reductor en las condiciones de
ensayo.

La xilanasa purificada, de acuerdo con el presente invento, puede aplicarse para mejorar o ayudar en la mejora de cualquiera de una amplia variedad de pastas papeleras procesadas, es decir, pastas papeleras que han sido ya previamente tratadas de cualquiera de la variedad de formas para reducir su contenido en lignina y que se tratan según se describe anteriormente para incrementar más la eliminación de lignina por métodos químicos. La presente xilanasa puede aplicarse para tratar pastas kraft de madera de frondosas y madera de coníferas para incrementar la eliminación de lignina y el abrillantamiento de las pastas de papel. La xilanasa, de acuerdo con el presente invento, es particularmente aplicable a las pastas químicas, es decir, a aquellas en las que el componente lignina se ha modificado químicamente por diversos tratamientos químicos tales como en los procedimientos de sulfato (kraft) y deslignificación de oxígeno, y es preferiblemente aplicada a las pastas kraft. Las enzimas del presente invento pueden aplicarse a la pasta papelera después de la digestión kraft o de la deslignificación por oxígeno, pero antes del blanqueo. En el caso donde ambos digestión kraft o deslignificación por oxígeno se llevan a cabo sobre la misma pasta papelera, la enzima puede aplicarse después de la digestión kraft, antes de la deslignificación por oxígeno o después de la deslignificación por oxígeno. La presente xilanasa también es aplicable a las pastas papeleras blanqueadas por
ozono.

La pasta de papel resultante se trata para eliminar el componente de lignina liberable empleando un extractante apropiado. Además, la pasta papelera tratada con las enzimas del presente invento puede ser tratada subsecuentemente con productos químicos que degradan la lignina, tales como cloro, dióxido de cloro y peróxido, y extraerse además con un extractante apropiado. Además, la pasta papelera tratada enzimáticamente puede tratarse con un extractante apropiado, seguido por degradación de la lignina y un tratamiento final con un extractante apropiado. Tales extractantes, esencialmente, solubilizan el componente de lignina afectado y los extractantes adecuados incluyen, pero no están limitados a, las bases como hidróxidos de metales alcalinos (E), DMF, dioxano, acetona y alcohol. Las extracciones de hidróxido pueden combinarse con peróxido de hidrógeno (E_{p}) u oxígeno (E_{o}). La pasta papelera resultante puede entonces blanquearse adicionalmente mediante una secuencia química de blanqueo, tal como dióxido de cloro (DED) o peróxido (P-P) hasta el brillo deseado por medio del cual se observan ahorros sustanciales de productos químicos cuando se compara con pasta papelera que se ha blanqueado hasta conseguir el mismo brillo mediante la misma secuencia, pero sin usar el tratamiento enzimático. La reducción de los productos químicos que contienen cloro o del peróxido se lleva a cabo de esa manera. Además, al llevar a cabo tal procedimiento con las enzimas presentadas anteriormente, se puede aplicar la misma cantidad de productos químicos de blanqueo a la pasta y conseguir un brillo aún mayor en la pasta de papel tratada.

Aplicaciones adicionales de las enzimas purificadas descritas anteriormente o de los sobrenadantes totales de la xilanasa que contienen xilanasas, de acuerdo con el presente invento, son posibles en una variedad de instalaciones industriales. Por ejemplo, las xilanasas purificadas o los sobrenadantes totales de las xilanasas pueden emplearse para degradar enzimáticamente residuos agrícolas para la producción de combustibles de alcohol y otros productos químicos industriales importantes o como componente de una composición detergente.

Ejemplos Ejemplo 1 Purificación de la xilanasa de Acidothermus

Acidothermus cellulolyticus ATCC 43068 se obtuvo de la American Type Culture Collection en Rockville Md. Se obtuvo un filtrado de cultivo mediante el cultivo de la cepa en un medio que contenía: medio de Henssen (medio de Henssen (g/l))

\newpage

	K_{2}HPO_{4}	0,2 g
	MgSO_{4}.7H_{2}O	0,3 g
	CaCO_{3}	0,2 g
	FeSO_{4}.7H_{2}O	0,005 g
	Extracto de levadura	0,1 g
	Ácido casamino	0,1 g
	NH_{4}HO_{3}	0,2 g
	Urea	0,1 g
	Asparagina	0,25 g
	Caseína	0,2 g
	pH	5,5

con la adición de xilano de glumilla de avena (1%) a un pH de 5,5 y a una temperatura de 55-60ºC en un matraz Erlenmeyer de 250 ml a 100 rpm, durante 6-8 días. El sobrenadante del cultivo se sometió a ultrafiltración para concentrar el sobrenadante que incluye la enzima xilanasa extracelular con el sedimento retirado. Según se describe a continuación, el sobrenadante incluyó actividad xilanasa significativa.

Ejemplo 2 Determinación de las características de la xilanasa de Acidothermus

La xilanasa purificada, obtenida según se describió anteriormente en el Ejemplo 2, se empleó para determinar las características de la xilanasa.

Peso molecular

El sobrenadante del cultivo, que contiene actividad xilanasa, se concentró 4x empleando células de ultrafiltración Centriprep 3 (Amicon, según las instrucciones del fabricante). Empleando un sistema FPLC de Pharmacia, se aplicó 1 ml del material concentrado en dos columnas de filtración en gel unidas en serie (Superdex G-200 10/30 de Pharmacia seguido de Superdex G-75 10/30 de Pharmacia) que se habían equilibrado con NaCl 100 mM y tampón citrato/fosfato 50 mM, pH 6,0. El caudal fue de 0,5 ml/min, la absorción UV se monitorizó a 280 nm, se recogieron fracciones de 1 ml.

Las fracciones se sometieron a ensayo en cuanto a la actividad xilanasa como sigue: la presencia de xilanasa se determinó empleando un sustrato de xilano de madera de abedul (RBB-xilano, Megazyme, Australia) teñido con azul billante remazol. 50 \mul de las muestras se mezclaron con 400 \mul de solución sustrato (1,25% [p/v] de RBB-xilano en acetato sódico 50 mM, pH 4,5) y se incubaron a 40ºC durante 10 minutos. El xilano no digerido se precipitó por adición de 1 ml de etanol al 95% y se eliminó mediante centrifugación. El colorante liberado que permanece en solución se cuantifica por espectrofotometría (OD_{590}) y es proporcional a la actividad xilanasa. La actividad puede cuantificarse empleando una curva estándar y se describe como XAU/ml (unidades de actividad xilanasa por mililitro). Se encontró que, empleando este sistema, la actividad xilanasa eluye después de 42 minutos. Los estándares de bajo peso molecular de filtración en gel de Pharmacia (1,25 mg/ml) se aplicaron al sistema empleando las condiciones anteriores y los resultados de la elución se emplearon para crear una curva estándar de peso molecular. La elución de la xilanasa de Acidothermus correspondió a un peso molecular entre 50-55 kilodaltons, (aproximadamente 52,9 kilodaltons) cuando se comparó con la curva estándar.

Punto isoeléctrico

Se empleó un método de superposición en gel para determinar el punto isoeléctrico (pI) de la xilanasa de
Acidothermus. Se llevó a cabo isoelectroenfoque (IEF) de sobrenadante de cultivo que contenía actividad xilanasa empleando un PhastSystem (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante. Los geles de IEF, pH 3-9, se superpusieron con una suspensión de sustrato de agarosa fundida (0,4% (p/v) de agarosa, 7 mg/ml de RBB-xilano, 0,5% (v/v) de glicerol en acetato sódico 50 mM, pH 4,5) y se incubó a 37ºC. Después de una hora la actividad xilanasa fue evidente como una zona de aclarado. Se permitió a los geles secarse completamente y se almacenaron. El pI de la xilanasa se determinó por comparación con geles de IEF corridos de forma idéntica que contenían marcadores de pI teñidos con plata (kit de amplio pI de pH 3,5-9,3, Pharmacia Biotech). La visualización de las proteínas se realizó mediante desarrollo de tinción de plata de PhastSystem, según instrucciones.

Perfil de pH y temperatura

Las muestras de enzima se sometieron a ensayo empleando el ensayo RBB-xilano según se describió anteriormente en este Ejemplo. El perfil de pH de la xilanasa purificada se determinó llevando a cabo el ensayo RBB a pH de 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 6,0 y 7,0. Según se muestra en la Figura 2, la xilanasa purificada tiene un pH óptimo en las condiciones del ensayo de aproximadamente 3,6-4,2.

El perfil de temperatura de la xilanasa se determinó llevando a cabo el ensayo RBB-xilano a pH 4,5 y a una temperatura de 37ºC, 55ºC, 65ºC, 70ºC y 80ºC durante un período de 10 minutos. Según se muestra en la Figura 1, la xilanasa purificada tiene una temperatura óptima en las condiciones de ensayo de aproximadamente entre 70-80ºC.

Termoestabilidad

Las muestras separadas de xilanasa purificada se incubaron a temperaturas de 70ºC, 75ºC, 80ºC, 85ºC o 90ºC. Las alícuotas se recogieron a varios intervalos de tiempo para determinar la actividad de la xilanasa después de un tiempo de incubación dado a una temperatura dada. Las alícuotas se sometieron a ensayo en relación con la actividad de acuerdo con el ensayo RBB-xilano a 60ºC, pH 4,5 y a un tiempo de 10 minutos y se calculó la semimedia de la xilanasa a las temperaturas de incubación. Los resultados se muestran en la Figura 2, las semividas a 70ºC y 75ºC en las condiciones del experimento fueron superiores a 24 horas.

Estabilidad en pH bajo

Una muestra purificada de xilanasa, según se describió en el Ejemplo 2, se ajustó a un pH de 3,3 con hidróxido sódico y se incubó a temperatura ambiente. La actividad de la muestra se midió a 30, 60, 90 y 120 minutos empleando el ensayo RBB descrito anteriormente a 65ºC, pH de 4,5, durante 10 minutos. Según se muestra en la Figura 4, una parte significativa de la actividad de la xilanasa permaneció después de 2 horas a pH bajo.

Ejemplo 3 Tratamiento de pienso animal con xilanasa de Acidothermus

El ensayo empleado para la actividad de la xilanasa fue un ensayo reductor de la viscosidad in vitro que emplea arabinoxilano de trigo como sustrato viscoso en condiciones que mimetizan las encontradas en el tracto GI de un animal. Tal ensayo in vitro actúa como guía de si una xilanasa (o mezcla de xilanasas) tendría el efecto deseado de reducir la viscosidad de la digesta cuando se emplea como un suplemento en un pienso animal. La actividad se determinó como sigue:

Una unidad de actividad xilanasa es la cantidad de enzima que libera un \mumol de azúcares reductores (expresados como equivalentes de xilosa) a partir del sustrato en un minuto, en las condiciones descritas.

Reactivos 1. 1% (p/v) de sustrato xilano

Añadir 10 ml de hidróxido sódico 0,5 M a 1,0 g de xilano (Fluka 95590). Mezclar durante 30 minutos con un agitador magnético. Añadir aproximadamente 40 ml de tampón acetato sódico 0,05 M, pH 6,5. Ajustar el pH hasta 6,5 con ácido acético 1 M. Llenar hasta 100 ml con tampón acetato sódico 0,05 M, pH 6,5. El sustrato debe mezclarse todo el tiempo mientras se emplee.

2. Ácido acético 1 M

Pipetear 5,7 ml de ácido acético glacial dentro de un matraz volumétrico y llenar hasta 100 ml con agua destilada.

3. Tampón de acetato sódico 0,05 M, pH 6,5

A.

Disolver 4,1 g de acetato sódico en agua destilada y llenar hasta 1.000 ml con agua destilada.

B.

Disolver 3,0 g de ácido acético glacial en agua destilada y llenar hasta 1.000 ml con agua destilada.

Ajustar el pH de la disolución A a pH 6,5 con disolución B.

4. Reactivo de ácido dinitrosalicílico (DNS)

Suspender 20,0 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico en aproximadamente 800 ml de agua destilada. Añadir gradualmente 300 ml de disolución de hidróxido sódico (32,0 g de NaOH en 300 ml de agua destilada) mientras se agita continuamente. Templar la suspensión en un baño de agua (la temperatura no puede exceder +48ºC) mientras se agita hasta que la disolución es transparente. Añadir gradualmente 600 g de tartrato sódico potásico. Templar la disolución (la temperatura no puede exceder +48ºC) si se necesita, hasta que la disolución sea transparente.

Llenar hasta 2.000 ml con agua destilada y filtrar a través de un filtro basto de vidrio sinterizado.

Almacenar en una botella oscura a temperatura ambiente. El Reactivo es estable durante un máximo de 6 meses.

Procedimiento 1. Muestra de enzima

1 ml de dilución enzimática (en tampón de acetato sódico 0,05M, pH 6,5) se equilibra a +50ºC. Añadir 1 ml de sustrato xilano, agitar e incubar a +50ºC durante exactamente 30 minutos. Añadir 3 ml de reactivo DNS, agitar y hervir la mezcla de reacción durante exactamente 5 minutos. Enfriar la mezcla de reacción en un baño de agua fría hasta temperatura ambiente y medir la absorbancia a 540 nm frente a agua destilada.

2. Blanco de enzima

Incubar 1 ml de sustrato xilano a +50ºC durante 30 minutos. Añadir 3 ml de disolución DNS y agitar. Añadir 1 ml de dilución de enzima (en 0,05 M de tampón de acetato sódico, pH 6,5) y agitar. Hervir la mezcla durante exactamente 5 minutos. Enfriar la mezcla de reacción en un baño de agua fría hasta temperatura ambiente y medir la absorbancia a 540 nm frente a agua destilada.

La diferencia de absorbancia entre la muestra de enzima y el blanco de enzima debería ser 0,3-0,5.

3. Curva estándar

Preparar soluciones estándar de xilosa anhidra en tampón de acetato sódico 0,05 M, pH 6,5. La concentración de xilosa en los estándares debería ser 0,05-0,5 mg/ml. Pipetear 1 ml de solución estándar, 1 ml de sustrato xilano y 3 ml de reactivo DNS dentro de un tubo de ensayo. Agitar y hervir durante exactamente 5 minutos. Enfriar en un baño de agua fría hasta temperatura ambiente y medir la absorbancia a 540 nm frente al blanco estándar. En el blanco estándar, la solución de xilosa se reemplaza por 1 ml de tampón de acetato sódico 0,05 M, pH 6,5. De lo contrario el blanco estándar se trata como estándar de xilosa.

Trazar la concentración de xilosa en función de la absorbancia. Se prepara una nueva curva estándar para cada reactivo DNS nuevo.

Cálculos

La actividad xilanasa de la muestra se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación:

Actividad \ (U/g) = \frac{([A(X) - A(O)] \ x \ k \ + \ C_{o}) \ x \ 1000 \ x \ Df}{MW_{xyl}x t}

en la que:

A(X)	=	absorbancia de la muestra de enzima
A(O)	=	absorbancia del blanco enzimático
k	=	la pendiente de la curva estándar
C_{o}	=	el corte con los ejes de la curva estándar de xilosa
1000	=	factor, mmol \rightarrow \mumol
Df	=	factor de dilución (ml/g)
MW_{xyl}	=	peso molecular de la xilosa (150,13 mg/mmol)
t	=	tiempo de reacción (30 minutos).

El ensayo reductor de la viscosidad empleado para medir la capacidad de una xilanasa para reducir la viscosidad se llevó a cabo como sigue. El ensayo se lleva a cabo en todos los casos por duplicado.

La enzima xilanasa que va a ser sometida a ensayo con 0,1 M de tampón fosfato-Na con un pH de 6,5 para ajustar la concentración de xilanasa, de manera que la solución resultante posea una actividad xilanasa de 1,0 unidad por ml. Tal actividad xilanasa se determina de acuerdo con el método de ensayo para la actividad xilanasa descrito con anterioridad en detalle.

100 \mul de la solución de enzima se añadieron a 400 \mul de una solución de arabinoxilano de trigo (obtenido de Megazyme Pty) en fostato-Na 0,1 M a pH 6,5 en un tubo de ensayo de cristal, de manera que la concentración final de enzima en la solución resultante fue de 0,2 U/ml y la del arabinoxilano de trigo fue de 1,0% p/p.

Los tubos de ensayo que contenían las disoluciones se sellaron entonces y se colocaron en un baño de agua fijo en 95ºC durante un cierto periodo de tiempo, típicamente 1 minuto o 5 minutos. Después de este tratamiento con calor, los tubos de ensayo se enfriaron en un baño de agua con hielo. La viscosidad de la solución resultante se midió a una temperatura de 40ºC empleando un viscómetro Brookfield DV-II, CP 40, programado para medir viscosidad una vez por segundo. Los datos mostrados en la Tabla 1 son mediciones de la viscosidad después de 20 minutos de incubación. La xilanasa de Acidothermus cellulolyticus se comparó con la xilanasa de Aspergillus niger y Trichoderma viride, dos aditivos para pienso bien conocidos. Los resultados fueron como sigue:

TABLA 1

Fuente de xilanasa	Viscosidad - (Pa.s)	Viscosidad - (Pa.s)	Viscosidad - (Pa.s)
	sin tratamiento de	20 minutos después	20 minutos después
	calor (Control)	de exposición a 95ºC	de exposición a 95ºC
		durante 1 minuto	durante 5 minutos
Tricoderma viride	2,0 x 10^{-3}	1,1 x 10^{-2}	1,1 x 10^{-2}
Aspergillus niger	1,4 x 10^{-3}	7,2 x 10^{-3}	7,3 x 10^{-3}
Acidothermus cellulolyticus	4,3 x 10^{-3}	4,0 x 10^{-3}	9,9 x 10^{-3}

Según se muestra en la Tabla 1, la exposición a una temperatura de 95ºC durante un minuto no dio como resultado un aumento esencial en el nivel de viscosidad con la xilanasa derivada de Acidothermus cellulolyticus, mientras que se mostraron aumentos significativos en la viscosidad con las xilanasas de Aspergillus niger y Trichoderma viride. De forma similar, el aumento en viscosidad después de la exposición a una temperatura de 95ºC durante 5 minutos de la xilanasa de Acidothermus cellulolyticus fue menos de la mitad que el de las xilanasas derivadas de Aspergillus niger y Trichoderma viride.

Por supuesto, debe entenderse que un amplio intervalo de cambios y modificaciones puede realizarse a las realizaciones preferidas descritas anteriormente. Se pretende, por tanto, hacer entender que las siguientes reivindicaciones, incluidas todas las equivalentes, son las que definen el alcance del invento.

Claims (8)

1. Una xilanasa purificada que tiene un pH óptimo de aproximadamente 3,6 a 4,2, un peso molecular de aproximadamente 50-55 kD según se determina por filtración en gel, una temperatura óptima de aproximadamente 70-80ºC y un punto isoeléctrico de aproximadamente 6,0-6,5, en la que dicha xilanasa es derivable de Acidothermus cellulolyticus.

2. La xilanasa purificada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha xilanasa es derivable de Acidothermus cellulolyticus ATCC 43068.

3. Un pienso basado en cereal que comprende al menos un 20% en peso de cereal, y desde aproximadamente 0,00001 hasta aproximadamente 10 gramos de proteína xilanasa por kg de pienso, en el que la proteína xilanasa, cuando se purifica, corresponde a la xilanasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

4. Un pienso basado en cereal de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el cereal es al menos uno de entre trigo, cebada, maíz, sorgo, centeno, avena, triticale y arroz.

5. Un aditivo para pienso que comprende un vehículo aceptable fisiológicamente y una xilanasa que, cuando se purifica, corresponde a la xilanasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

6. Un aditivo para pienso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el vehículo es un cereal o se deriva de un cereal.

7. Un aditivo para pienso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el vehículo es trigo, maíz, soja o un subproducto molido de cualquiera de ellos.

8. Un método para aumentar la digestibilidad de un pienso animal basado en cereal o para reducir su FCR que comprende la etapa de añadir al pienso una xilanasa que, cuando se purifica, corresponde a la xilanasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2.