JP2000500736A - 部分的酸素添加形態における加熱処理による薬学的グレードのヘモグロビンの調製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 薬学的グレードの架橋ヘモグロビンの精製の間に、架橋および非架橋ヘモグロビンの混合物が、非化学量論的量の酸素の存在下で加熱され、その結果、非架橋ヘモグロビンの選択的な沈澱が生じる。沈澱した非架橋四量体の分離後、上清中に残る架橋ヘモグロビンは、さらなるクロマトグラフィー精製工程が必要でないように精製される。このヘモグロビンは高度に架橋されており、絶対的にクロマトグラフィー微粒子を含まず、そして低いメトヘモグロビン含量を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 部分的酸素添加形態における加熱処理による 薬学的グレードのヘモグロビンの調製 発明の背景 遊離ヘモグロビンの、そうでなければ全血液の輸血が必要とされる広範囲に渡 る多くの臨床的症状の処置における使用は、長年に渡って提案されている。歴史 的な概説については、Winslow、「Hemoglobin-based Red Cell Substitutes」、 Johns Hopkins U．Press（1992）を参照のこと。遊離ヘモグロビンの使用に対す るいくつかの障害は、サブユニットへの解離に際しての天然ヘモグロビンの毒性 、および遊離ヘモグロビンの酸素に対するより高い結合親和性（従って、組織に おける酸素放出能力を制限する）を含んでいる。さらなる障害は、細胞ストロマ 、ウイルスおよび細菌性の病原体、およびエンドトキシンを含まないヘモグロビ ン調製物を達成することである。 好ましくない解離に関するこれらの障害の中の第一のものは、四量体ヘモグロ ビンを架橋する種々の方法を利用することにより、大部分は取り除かれている。 これは、四量体サブユニットがα-β二量体へ解離することを物理的に防止する 目的に役立つ。米国特許第4,061,736号（Bonsonら）は、架橋剤が、複素環式ト リアジンまたはハロゲン化芳香族、シクロアルカン、ジアルデヒドなどのいずれ かである分子内架橋ヘモグロビンを記載する。米国特許第4,826,811号（Sehgal ら）において、ヘモグロビンは、まずピリドキシル化され、次いでグルタルアル デヒドを用いて分子内および分子間架橋される。 他の架橋ストラテジーは、低免疫原性を有する架橋剤を利用することにより、 コンフォメーションの固定化および分子安定性の目的と、非抗原性とを組み合わ せる。例えば、米国特許第4,377,512号（Ajisakiら）は、ポリアルキレン酸化物 結合基を介する架橋を開示する。米国特許第5,234,903号は、同様に、ウレタン 結合を介するヘモグロビンのポリアルキレン酸化物への結合を開示する。最後に 、費用効果的な試薬を利用して高収率を得ることに加えて、上記目的のすべてを 達 成するストラテジーは、米国特許第4,598,064号および米国特許第4,600,531号に よるジアスピリンの架橋を含む。 治療的に受容可能なヘモグロビンを達成することに対する別の障害は、純度で ある。生成物の純度の概念は、部分的には、ヘモグロビン溶液から除去される赤 血球のストロマおよび非ヘモグロビンタンパク質のような内因性混入物の除去を いう。純度はまた、ウイルス、細菌およびエンドトキシンのような外因的に導入 される混入物が存在しないことをいう。 非常に多くの精製スキームが、ヘモグロビンを精製するために考案されている 。細胞溶解から生じる、より大きな細胞成分は、代表的には濾過により除去され る。フィルターは珪藻土（米国特許第4,001,200号、Bonsonを参照のこと）、ま たは、より代表的には、小孔径のメンブレンフィルター（例えば、米国特許第4, 001,200号、同第3,991,181号および同第4,473,494号）であり得る。一般に、粗 濾過工程の後に、限外濾過（例えば、米国特許第4,598,064号および同第4,401,6 52号中に教示される血液透析濾過カートリッジを通しての）が続き得る。あるい は、大きな破片および微粒子物質は、連続流遠心分離により除去され得る。初期 の精製は、一般に、濾過技術分野における改良に直接比例して、歴史的な困難を 改良および克服しており、その結果、現在、従来利用可能な濾過技術は、ほとん どの薬学的応用において、微粒子物質を除去するために適切である。 非ヘモグロビン可溶性タンパク質および他の物質を除くためのさらなる精製は 、代表的には、いくつかの形態のゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィー により行われる。適切なゲル排除クロマトグラフィー工程を選択することにより 、非ヘモグロビン可溶性タンパク質の除去がもたらされ得る。例えば、米国特許 第4,136,093号（Bonhard）は、濾過したヘモグロビンをG-150 Sephadexのゲル濾 過カラムに通すことにより精製する方法を開示する。ずっとより高レベルの純度 （エンドトキシンのレベルを0.5 EU/mLより低い薬学的に受容可能なレベルに減 少させることをいう）は、Sephadex G-200での二工程再クロマトグラフィー、お よび任意にそれに続くハプトグロビン親和性クロマトグラフィー工程を利用する （米国特許第5,084,558号および同第5,296,465号を参照のこと）。 別の精製へのアプローチは、複雑な混合物において、いくつかのタンパク質は ストレス条件に対して他のタンパク質より安定であるという観察を反映する、タ ンパク質の差別沈澱（differential precipitation）を含む。タンパク質混合物 の加熱において、個々のタンパク質は、特徴的な温度において変性し、そして溶 液から沈澱することが見出されている。従って、変性タンパク質を含有する得ら れた沈殿の除去は、部分精製をもたらす。米国特許第4,861,867号は、摂氏45℃ と85℃との間の温度に、デオキシヘモグロビンの形態で、ヘモグロビン溶液を加 熱することによる、ヘモグロビン溶液中のウイルスの差別的な不活化を開示する 。ウイルスは、ヘモグロビンよりかなり熱に不安定であり、そしてウイルス力価 における数桁の減少は、生物学的活性ヘモグロビンの認識可能な損失なしに、加 熱処理に際して容易に得られる。 米国特許第4,861,867号は、溶液を摂氏45℃と85℃との間の温度に、10時間ま での変動する時間加熱することにより、デオキシヘモグロビンを非ヘモグロビン タンパク質から精製する加熱処理プロセスを開示する。ヘモグロビンのメトヘモ グロビンへの変換を制限することは重要であるので、アスコルビン酸塩のような 還元剤の存在下でか、または本質的に完全な脱酸素をもたらす膜ガス交換デバイ スを利用する脱ガス手順によるかのいずれかで、脱酸素が行われる。代表的な実 施においては、５時間の60℃における加熱処理では、総ヘモグロビンの93％の回 収がもたらされた。 ヘモグロビンに基づく血液代替物の生産の別の目的は、低レベルの、このタン パク質の不活性な酸化メトヘモグロビン形態を有する材料の製造である。これは 、しばしば、製造操作を低温で行うことにより達成される。なぜなら、メトヘモ グロビン形成は温度が上昇するにつれて実質的に加速されるからである。上昇さ れた温度への曝露が必要とされる場合は（例えば、ヘモグロビンの特定の修飾剤 との反応の間またはウイルスを不活化するための加熱処理の間）、米国特許第4, 861,867号に開示されるように、メトヘモグロビン形成を阻害するために、この タンパク質の脱酸素が使用され得る。ヘモグロビンの酸化に関する文献に基づく と、避けるべき条件は、部分的酸素添加条件へのヘモグロビンの曝露である。な ぜなら、ヘモグロビンが部分的に酸素で飽和される場合に、メトヘモグロビン形 成の速度は最大になるからである。Brooks、Proc ．Roy．Soc．Lond．Ser．B.、1 18： 560-577、1935を参照のこと。これは、ヘモグロビンの酸化の速度が、20 mmHgの 酸素分圧において、最大であることを教示する。 発明の要旨 本発明の目的は、最適な酸素結合親和性を維持するために架橋され、有害な生 理学的反応を生じさせないように、0.25 EU/mL未満のエンドトキシンを含み、実 質的に非ヘモグロビンタンパク質および非架橋ヘモグロビンを含まず、絶対的に クロマトグラフィー微粒子（chromatography fines）も、その他のクロマトグラ フィーマトリックス由来の混入ポリマー種を含まず、実質的にウイルス混入を含 まず、そして流通のための製品の出荷時において、５％未満のメトヘモグロビン 含量を有する薬学的品質のヘモグロビン組成物を提供することである。 本発明のさらなる目的は、高価でありそして煩雑な固相クロマトグラフィーシ ステムを含まないバッチ手順を含む、このようなヘモグロビンの生産方法を提供 することである。 本発明において、架橋ヘモグロビンおよび非架橋ヘモグロビンの混合物を含有 する溶液は、約45℃と85℃との間で、30分間〜10時間の範囲の期間、非化学量論 的な量の酸素の存在下で、7.25〜7.55のpHで加熱される。沈澱した非ヘモグロビ ンタンパク質および大部分の非架橋ヘモグロビンの除去に際して、得られた架橋 ヘモグロビン溶液は、１％未満の非架橋物質を含有する。 本発明の組成物は、１％未満の残存非架橋ヘモグロビン、微量の残存非ヘモグ ロビンタンパク質（0.01％ w/w未満）、0.25 EU/mL未満のエンドトキシンを有し 、絶対的にクロマトグラフィー微粒子またはマトリックス含有精製システムから の持ち込み（carryover）の残余分を含まず、そして流通のための製品の出荷時 において、５％未満のメトヘモグロビン含量を有する、高度に精製された薬学的 に受容可能な架橋ヘモグロビン溶液である。 本発明の方法において、架橋および非架橋の脱酸素されたストロマ非含有ヘモ グロビンの混合物は酸素不透過性の反応器手段中に置かれ、部分的に酸素と反応 されて11〜28％のオキシヘモグロビンを得、約45℃と85℃との間の温度に加熱さ れ、差別的または優先的に非架橋ヘモグロビンを沈澱させ、そして沈澱した非架 橋ヘモグロビンを除去する。 等価に、本発明の精製の目的を達成し得る部分的酸索添加のレベルは、溶存酸 素のppmとして、便利に測定され得る。従って、薬学的グレードのヘモグロビン は、クロマトグラフィー精製工程なしに、脱酸素されたストロマ非含有架橋ヘモ グロビンおよび非架橋ヘモグロビンの混合物を酸素不透過性の反応器手段中に置 き、酸素を0.7〜1.7 ppmの溶存酸素含量まで導入し、ヘモグロビンを約45℃〜85 ℃の温度に加熱し、そして沈澱した非ヘモグロビンおよび非架橋ヘモグロビンを 除去することにより得られ得る。 図面の簡単な説明 図１は、薬学的グレードの架橋ヘモグロビンを生産するための架橋および加熱 処理工程の流れ図である。 図２は、製造プロセスの加熱処理工程の間に存在する％オキシヘモグロビンの 関数としての、架橋ヘモグロビン収率の直線的プロットである。 好ましい実施態様の詳細な説明 破砕赤血球から放出される、遊離のヒトおよびいくつかの他のヘモグロビンが 、赤血球中のその天然の相対物より有意に高い酸素に対する結合親和性を有する ことが長い間知られていた。この高い親和性結合は、組織におけるその低い放出 特性のために、酸素運搬分子として、ヘモグロビンをより有用でなくしている。 特定の薬剤を用いる架橋が、四量体ヘモグロビンを、酸素の結合親和性がインタ クトな赤血球のものと近いコンフォメーションに強制することが後に発見された 。本発明の架橋ヘモグロビンのための受容可能なP₅₀値（ヘモグロビンが半分飽 和する酸素分圧）は、20 mm Hg以上45 mm Hg以下である。架橋はまた、そうでな ければ二量体に解離する傾向がある、四量体ヘモグロビンを安定化する。分子量 が120,000〜600,000ダルトンの範囲の高分子を生じるように、さらに重合された 架橋ヘモグロビンもまた、本発明の範囲内である。 本発明で利用される無細胞ヘモグロビンは、ストロマ非含有、および、サブユ ニットの解離を防止するため、および形成された化学結合が以下に示す条件下の 加熱に対して安定である限り、酸素結合親和性を約20 mm Hgと45 mm Hgとの間の P₅₀値の範囲に増加させるために化学的に修飾された任意のタイプであり得る。 修飾ヘモグロビンは、複合ヘモグロビン、架橋ヘモグロビン、重合ヘモグロビン であり得る。 ヘモグロビンの修飾技術のいくつかの例は、本発明の実施において有利に使用 され得る科学文献に記載される。例えば、Winslow,R.M.、「Hemoglobin-based R ed Cell Substitutes」 、Johns Hopkins U．Press（1992）に含まれる概説を参 照のこと。より詳細には、化学的修飾ヘモグロビンの作製方法は以下に記載され る。 複合ヘモグロビンは、非タンパク質高分子がヘモグロビンに共有結合している ものである。１つの例は、その調製のためのプロセスと共に、国際公開第WO 910 7190号（Enzon）に記載されるポリ-アルキレングリコールにより化学的に修飾さ れたヘモグロビンである。ポリ（アルキレンオキシド）に複合化されたヘモグロ ビンおよびその調製のためのプロセスの例は、米国特許第4,301,144号、同第4,4 12,989号および同第4,670,417号、ならびに日本国特許第59-104,323号および同 第61-053,223号（Ajinomoto）において提供される。ヘモグロビンは、米国特許 第4,377,512号（Ajinomoto）において開示されるプロセスにおいて、イヌリンに 複合化され得る。特許、国際公開第WO 91/07190号、米国特許第4,301,144号、同 第4,670,412号、同第4,377,512号、ならびに日本国特許第59-104,323号および同 第61-053,223号は、本明細書中で参考として援用する。 架橋ヘモグロビンは、分子内化学結合を含有する。架橋ヘモグロビンおよびそ れらの調製のための方法の例は、米国特許第4,001,401号および同第4,053,590号 に記載され、これはハロゲン化シクロアルカン、ジエポキシドおよびジアゾベン ジジンのような化合物を利用する四量体ヘモグロビンのαサブユニットとβサブ ユニットとの間の分子間架橋を開示する。本発明の加熱処理精製方法において、 好ましい修飾ヘモグロビンは、２つのαサブユニット間でフマル酸の架橋を生じ る、ビス（3,5-ジブロモサリチル）フマレートを用いて架橋される。この架橋ヘ モグロビンは、米国特許第4,598,064号、同第4,600,531号、米国特許再発行第34 ,271号に、クロマトグラフィー工程を省略して、その調製のための方法と共によ り完全に記載されている。それは、β鎖間の架橋を防止するために、好ましくは 米国特許第5,128,452号（Hai）に開示された条件下で製造される。米国特許第4, 598,064号、同第4,600,531号、米国特許再発行第34,271号および米国特許第5,12 8,452号は、本明細書中で参考として援用する。国際公開第WO 90/13309号（Staa t Der Nederlanden De Minister Van Defeuric）は、β-β結合を介するヘモグ ロビンの架橋方法を開示する。 重合ヘモグロビンは、修飾ヘモグロビンの分子量を増加するために四量体ヘモ グロビンの分子間の架橋が使用されたものである。重合ヘモグロビンおよびその 調製のためのプロセスの例は、米国係属特許出願第08/149,679号、同第08/173,8 82号、同第08/480,593号および同第08/473,459号に記載されている。米国特許第 4,777,244号は、脂肪族ジアルデヒドを用いる、架橋および重合のための方法を 開示する。上記特許は、本明細書中で参考として援用する。 方法の組合せにより修飾されたヘモグロビンは、以下により例示される。酸素 親和性を調整するためのピリドキサール-５'-リン酸により、そしてポリエチレ ングリコールの結合により修飾されたヘモグロビンおよびその調製のためのプロ セスは、日本国特許第59-089,629号、同第59-103,322号および同第59-104,323号 （Ajinomoto）に記載されている。米国特許第5,248,766号は、120,000ダルトン を超える分子量を有するポリヘモグロビンを形成するための、オキシランを用い る、四量体単位を共有結合的に相互連結するためのプロセスおよび架橋重合方法 を開示する。重合ヘモグロビンを開示する前記の特許、米国特許第5,194,590号 、同第5,248,766号、日本国特許第59-103,322号、同第59-089,629号および同第5 9-104,323号は、本明細書中で参考として援用する。 ヘモグロビンは、部位特異的変異誘発により改変され得、そして微生物または トランスジェニック動物において発現され得る。組換え変異体および人工ヘモグ ロビンおよびその細胞培養または液体における生産は、米国特許第5,028,588号 （Somatogen）に記載されている。細菌および酵母におけるヘモグロビンの生産 のために使用されるジ-αおよびジ-βグロビン様ポリペプチド（単数または複数 ）は、国際公開第WO 90/13645号（Somatogen）に記載されている。非天然多量体 ヘモグロビン様タンパク質は、国際公開第WO 93/09143号（Somatogen）に 記載されている。一般に、20〜45 mm Hgの作動可能な範囲にP₅₀を有する遊離四 量体を生じる、架橋、重合、カプセル化または遺伝子的改変、あるいはそれらの 組合せの任意の方法は、本発明方法における有効性を有する。条件は、過度な実 験なしに、それから誘導される各々のこのような架橋四量体またはポリマーにつ いて調整され得る。 図１は、薬学的グレードのジアスピリン架橋ヘモグロビン（本明細書中以下で 「DCLHb^TM」という）の生産に含まれる製造プロセスの流れ図である。他の架橋 ヘモグロビンは同様のプロセスで精製され得るが、DCLHb^TMの製造が本明細書に おいて好ましい実施態様として詳細に記載される。その好ましい態様は、商業的 な大規模量におけるその合成および精製の容易性、ならびにいくつかの適応症に おける治療薬剤としてのその有用性を反映する。 赤血球はプールされ、血漿タンパク質の残存レベルを減少させるために、定容 ダイアフィルトレーション（constant volume diafiltration）のような方法に より洗浄され、そして濃縮される。洗浄された細胞は、３容量の低張緩衝液中で 溶解される。得られた溶血物は、500Kのポアサイズのファイバーメンブレンを用 いて濾過されて、ストロマ非含有ヘモグロビン溶液を生じる。ストロマ非含有ヘ モグロビンは、限外濾過により濃縮される。この溶液は、0.2ミクロンのポアサ イズのフィルターを通して濾過される。 次いで、ストロマ非含有ヘモグロビンは、トリポリリン酸ナトリウム（0.01 M ）の存在下で脱酸素される。溶液中のオキシヘモグロビンの含量は、３％未満に 減少される。ベースラインを確立する低いレベルまで酸素を除去することは重要 である。なぜなら、酸素の再添加（これは、本発明のプロセスにおいて重要であ る）は正確な測定を必要とするからである。脱酸素後、ヘモグロビンは、化学量 論的に過剰のビス（3,5-ジブロモサリチル）フマレート（DBBF）を用いて架橋さ れる。 この時点において、酸素は反応器に導入され、次いで約５〜６ g/dLの濃度の 溶液が代表的な実施においては約76℃に90分間pH 7.4にて加熱される。利用され 得る加熱処理の温度および期間の範囲は、それぞれ、45℃〜85℃、30分間〜10時 間である。この範囲内で、65℃〜80℃が好ましく、そして74℃〜78℃が最も好ま しい。ヘモグロビンの濃度は、３ g/dL〜20 g/dLに変動し得る。pHは、7.25〜7. 55に変動し得る。上記の範囲内で条件を選択する際に、高レベルの純度を維持し ながら、収率を最適化するために、いくらかの実験が必要とされる。例えば、よ り短い処理時間が所望される場合、加熱処理は76℃より高い温度で行われる；し かし、濃度またはpHのいくらかの調整が必要とされ得る。各々の上記の範囲内で 、最適な生産のための仕様を得ることは、少しの生産実施しか含まれ得ない。酸 素含量は、２つのパラメーターに従って測定され得る。酸素は、全オキシヘモグ ロビン含量が約11％と28％との間、好ましくは約13％〜18％の間になるまで添加 される。あるいは、ヘモグロビン溶液中の溶存酸素の％が測定され得る。溶存酸 素含量は、約0.7 ppmと1.7 ppmとの間に維持されるべきである。図１は、ヘモグ ロビンの架橋および加熱処理のための代表的な工程の順序を示す。図は好ましい 実施態様におけるパラメーターを与える。しかし、処理の時間および温度は変動 し得る。一般に、処理温度を高くすればするほど、プロセスを完了するために必 要とされる時間は短くなる。しかし、任意の特定の修飾ヘモグロビンについて、 温度は、これらの条件下において加熱処理される所望のタンパク質についての変 性温度より低く維持されなければならない。この点で、これらの条件下において 、85℃はDCLHbについては高すぎるかもしれないが、その他の誘導体については 受容可能であり得る。 加熱処理工程におけるプロセス制御は重要である。特殊な装置の構築は必要で はないが、気圧および溶存ガスの制御に関するシステムの完全性は、妥協しては ならない。反応容器がガス不透過性であり、そして漏れが起こらないように予防 策を講じることは必須である。ガスケットの漏れを防止するため、および、酸素 の正確な計測を保証するために、精密なバルブが使用されるべきである。 溶存酸素のレベルは、加熱処理工程の間、0.7〜1.7 ppmの範囲（11〜28％のオ キシヘモグロビン）に、細心の注意を払って制御されなければならない。これら の条件下において、メトヘモグロビンのレベルは、加熱処理後に１％未満であり 、そして梱包および製品の出荷に際して、低く維持される（＜５％）。製造プロ セスの間に、これらのメトヘモグロビンのレベルを低く維持することは、いかな るバッチも流通への製品の出荷のための５％の制限を超えることを、統計的にな さ そうにする。 特に部分的に酸素添加される場合に、非架橋ヘモグロビンが、優先的に沈澱す ることが経験的に定められている。非架橋ヘモグロビンは、架橋ヘモグロビン分 子より強く酸素と結合するので、非架橋物質が優先的に酸素添加されることが予 想され得る。しかし、出願人は、非架橋ヘモグロビンが、総ヘモグロビンの30％ 以上を上方に構成するが、オキシヘモグロビン含量の操作可能な範囲は11〜28％ であるという知見に対する説明を有しない。従って、酸素含量は、非化学量論的 であり、そしてより多くの酸素の添加は収率の猛烈な減少を導く。Brooks（前出 ）における教示の観点からは、より高度に精製された架橋ヘモグロビン調製物が 、高温における加熱処理の前に、反応混合物を部分的に再酸素添加することによ り得られ得ることが見出されたことは驚くべき事であった。部分的再酸素添加後 の加熱処理後に得られた溶液は、２％未満の所望されない非架橋ヘモグロビンを 含有したが、可溶性架橋タンパク質は高度には酸化されなかった。このことは、 より完全に脱酸素された反応混合物の加熱処理から得られた物質を上回る、化学 的純度の顕著な改善を表す。なぜなら、後者は数％以上の非架橋ヘモグロビンを 含有するからである。この結果は、加熱処理開始前の溶液中に存在する酸素の最 適な量が、存在する非架橋ヘモグロビンを完全に飽和するために不十分であると いう事実に照らすと、さらにより驚くべき事である。それゆえ、本発明は、最終 的な架橋産物中のメトヘモグロビンのレベルを増加することなく、実質的な量の 非架橋ヘモグロビンを含有する反応混合物からの、架橋ヘモグロビンの増強され た精製を可能とする。 図２は、変動するオキシヘモグロビン含量の、産物収率に対する影響を示す。 酸素含量が増加するにつれて、％架橋は増加するが、特定の範囲を超えた場合、 収率は下降し始める。操作可能な範囲は、約11〜約28％、好ましくは約13〜約18 ％のオキシヘモグロビン（0.7〜1.7 ppmの溶存酸素に対応する）である。 加熱処理は、45℃〜85℃の範囲の温度で行われ得、そして温度は、30分間〜10 時間までの総処理時間にわたって、この範囲内で変動され得る。一般に時間と温 度との間には相互的な関係があり、より高温での処理のためには、より短い時間 が必要とされる。90分間の約76℃における加熱は、大規模製造目的に、特に良好 に適合すると経験的に決定されている。加熱処理は、45〜85℃の範囲内で選択さ れる特定の温度について、非架橋ヘモグロビンの最適な沈澱を得るために十分な 時間継続すべきである。 加熱処理後、沈澱は一連の従来の濾過工程により、または遠心分離により除去 される。DCLHb^TMの濃縮は、ダイアフィルトレーション（例えば、Millipore 30K spiral ultrafilterに対する）により容易にされる。 本明細書中上記のプロセスにより生産される架橋ヘモグロビンは、組成的に独 特および無類である。達成される純度のレベルは、クロマトグラフィー工程を不 必要とする。製造の情況において調製用クロマトグラフィーは非常に高価であり 、そして樹脂またはゲルを浪費する（なぜなら、マトリックスベッドは容易には 再構成されないからである）ので、このことは費用に対する深刻な影響を有する 。また、クロマトグラフィー微粒子は最終産物中に出現し、実際に産物の品質を 悪化する量で存在しなくても、曖昧または偽陽性の品質保証試験（例えば、エン ドトキシンについてのLAL試験において）の原因となり得る。 非架橋ヘモグロビンおよび非ヘモグロビンタンパク質の極めて低い％、および クロマトグラフィー微粒子が完全に存在しないことに加えて、本発明の架橋ヘモ グロビンは、USPの第85章に記載される試験で測定された場合に、0.25 EU/mＬ未 満のエンドトキシンレベルを有し、そして製品出荷時に５％未満のメトヘモグロ ビン含量を有する。製造プロセスにおいて、エンドトキシンの供給源は厳密に排 除され、それで超純粋な水および試薬が使用される。設備は設計が薬学的に強固 であり、そして十分な洗浄が可能なように加工される。このような容易さのため の設計仕様は、製薬工学の分野における当業者によって公知となる。 本発明のさらなる利点は、以下の実施例から明らかとなる。 実施例 加熱処理手順を、変動する条件下で、DBBFをヒトのストロマ非含有ヘモグロビ ンを反応させることにより得られた反応混合物に対して行った。表１は、最終産 物における収率および％架橋ヘモグロビンに対する、加熱処理の間に存在する変 動する量の酸素の効果を示す。すべての状況において、ストロマ非含有ヘモグロ ビンを、架橋前に十分に脱酸素し、次いで加熱処理の前に変動する程度まで再酸 素添加した。結果は、28％より高いオキシヘモグロビンのレベルにおいて、収率 が77〜83％の範囲から59％のみにまで低下し、残存する非架橋ヘモグロビンに関 して最終産物の純度が、わずかしか増加されない（99.6％から99.9％）ことを示 す。これらのデータから、約11％と18％との間のオキシヘモグロビンを達成する 酸素の導入が、高純度を有する最大の収率を得るため、およびメトヘモグロビン のレベルを低く維持するために所望されることは明らかである。A．非加熱反応混合物中の％架橋の測定のためのプロセス中方法（in-process me thod）は、Bio-Sil^TM TSK 250カラムおよび、移動相としてのBisTris緩衝液（pH 7.2）中の1 M MgCl₂を用いて決定した。 B．％収率は、以下のように計算した： C．加熱処理溶液中の％架橋は、Superose^TM 12カラムおよび、移動相としてのBi sTris緩衝液（pH 6.5）中の0.75 M MgCl₂を用いることにより決定した。 表2Aおよび2Bは、微量酸素添加（microoxygenation）工程をプロセスにおいて 履行する前（2A）の製品の出荷時におけるメトヘモグロビン値を、微量酸素添加 の履行後（2B）の対応する値と比較する。微量酸素添加前の平均値は、微量酸素 添加の履行後のわずか1.6％と比較して、4.09％であった。 後者について、大半の無菌バッチについては１％を下回り、そしてすべての出 荷バッチについては５％未満の、値の一貫性に留意のこと。統計学的には、本発 明のプロセスに従って製造されたすべてのバッチの99％が、目標とした５％未満 のメトヘモグロビンの出荷値を有するという95％の信頼が存在する。加熱処理直 後の１％未満のメトヘモグロビンのレベルは、メトヘモグロビンのレベルが、製 品出荷において５％未満の標準に合致することの強い指標である（必ずしも原因 となるものではないが）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピッケン，ジョン イー. アメリカ合衆国 イリノイ 60014，ビレ ッジ オブ レイクウッド，スコッツ レ ーン 7204 (72)発明者 エステプ，ティモシー エヌ. アメリカ合衆国 イリノイ 60030，グレ イスレイク，ハーベイ アベニュー 530

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．薬学的グレードの架橋ヘモグロビンの調製方法であって、以下の工程： 酸素を化学的修飾ヘモグロビンおよび化学的非修飾ヘモグロビンを含むヘモグ ロビン混合物と反応させて、約11〜約28％のオキシヘモグロビンを含む反応混合 物を形成させる工程； 該反応混合物を加熱して、該化学的非修飾ヘモグロビンを沈澱させる工程；お よび 沈澱した該化学的非修飾ヘモグロビンを除去する工程、 を包含する、方法。 ２．薬学的グレードのヘモグロビンの調製方法であって、以下の工程： 酸素を化学的修飾ヘモグロビンおよび化学的非修飾ヘモグロビンを含むヘモグ ロビン混合物へ添加して、0.7〜1.7 ppmの溶存酸素量を有する反応混合物を形成 させる工程； 反応混合物を加熱して、該化学的修飾ヘモグロビンを沈澱させる工程；および 沈澱した該化学的非修飾ヘモグロビンを除去する工程、 を包含する、方法。 ３．前記化学的修飾ヘモグロビンが主にデオキシヘモグロビンである、請求項１ または２に記載の方法。 ４．前記ヘモグロビン混合物が３％未満のオキシヘモグロビンを含有する、請求 項３に記載の方法。 ５．前記化学的修飾ヘモグロビンがストロマ非含有である、請求項１、２、３ま たは４に記載の方法。 ６．前記化学的修飾、ストロマ非含有ヘモグロビンが、架橋、重合または複合ヘ モグロビンであり、そして反応混合物の加熱に際して安定である、請求項５に記 載の方法。 ７．前記化学的修飾、ストロマ非含有ヘモグロビンが、ジアスピリン架橋ヘモグ ロビンである、請求項６に記載の方法。 ８．前記化学的非修飾ヘモグロビンが差別的に沈澱される、請求項１、２、３、 ４、５、６または７に記載の方法。 ９．前記化学的非修飾ヘモグロビンが優先的に沈澱される、請求項１、２、３、 ４、５、６または７に記載の方法。 １０．前記反応混合物が約45℃と約85℃との間の温度に加熱される、請求項１、 ２、３、４、５、６、７、８または９に記載の方法。 １１．前記反応混合物が65℃と80℃との間の温度に加熱される、請求項１０に記 載の方法。 １２．前記反応混合物が74℃と78℃との間の温度に加熱される、請求項１１に記 載の方法。 １３．前記反応混合物が30分間〜10時間加熱される、請求項１、２、３、４、５ 、６、７、８、９、１０、１１または１２に記載の方法。 １４．前記反応混合物が7.25〜7.55のpH、および３〜20 g/dlのヘモグロビン濃 度を有する、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ま たは１３に記載の方法。 １５．５％未満のメトヘモグロビン、0.25エンドトキシン単位/ml未満のエンド トキシンを含有し、そしてクロマトグラフィー残余物を含まない、化学的修飾ヘ モグロビン溶液。 １６．前記化学的修飾ヘモグロビン溶液が、架橋、重合または複合ヘモグロビン を含む、請求項１５に記載のヘモグロビン溶液。 １７．前記化学的修飾ヘモグロビンが、架橋ヘモグロビンである、請求項１６に 記載のヘモグロビン溶液。 １８．前記架橋ヘモグロビンが、ジアスピリン架橋ヘモグロビンである、請求項 １７に記載のヘモグロビン溶液。 １９．２％未満の非架橋四量体含量を有する、請求項１７に記載のヘモグロビン 溶液。 ２０．ストロマ非含有であり、そして実質的に非ヘモグロビンタンパク質および ウイルス混入物を含まない、請求項１５、１６、１７、１８または１９に記載の ヘモグロビン溶液。 ２１．約20〜約45 mm HgのP₅₀を有する、請求項１５、１６、１７、１８、１９ または２０に記載のヘモグロビン溶液。