JP3331433B2 - ヘモグロビン精製法 - Google Patents
ヘモグロビン精製法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、赤血球由来のヘモグロ
ビンの精製法に関し、ヘモグロビン精製工程においてヘ
モグロビンの変性を可及的に抑制することができる新規
技術手段を提供するものであり、医用分野、製薬分野等
において利用される。
ビンの精製法に関し、ヘモグロビン精製工程においてヘ
モグロビンの変性を可及的に抑制することができる新規
技術手段を提供するものであり、医用分野、製薬分野等
において利用される。
【０００２】
【従来の技術】事故や医療手術の際には、汚染されてい
ない血液が確実に、かつ迅速に供給される必要があるた
め、代替血液の要請は非常に強いものがある。わが国で
は、日赤血液センターが献血により集め、これが輸血医
療に広く使用されているが、血液適合性に個体差が大き
いこと、ウイルス汚染が懸念されること、及び慎重に検
定されて合格した血液でも三週間期限で新鮮を失ったと
して処分されていることなどが原因で、利用効率が低
く、コスト高ともなっている。また、血しょう増量剤、
抗生物質、凝固促進剤などの開発によって血液の持って
いる機能のうち、酸素運搬能以外の機能は何らかの代替
物が実用化されているが、人工酸素運搬体はまだまだ発
展途上の段階にあり、しかも、最近の肝炎やＡＩＤＳな
どのウイルス感染症の蔓延によって、益々安全な酸素運
搬体に関する需要が高まっており、現在盛んに研究され
ている。
ない血液が確実に、かつ迅速に供給される必要があるた
め、代替血液の要請は非常に強いものがある。わが国で
は、日赤血液センターが献血により集め、これが輸血医
療に広く使用されているが、血液適合性に個体差が大き
いこと、ウイルス汚染が懸念されること、及び慎重に検
定されて合格した血液でも三週間期限で新鮮を失ったと
して処分されていることなどが原因で、利用効率が低
く、コスト高ともなっている。また、血しょう増量剤、
抗生物質、凝固促進剤などの開発によって血液の持って
いる機能のうち、酸素運搬能以外の機能は何らかの代替
物が実用化されているが、人工酸素運搬体はまだまだ発
展途上の段階にあり、しかも、最近の肝炎やＡＩＤＳな
どのウイルス感染症の蔓延によって、益々安全な酸素運
搬体に関する需要が高まっており、現在盛んに研究され
ている。
【０００３】人工酸素運搬体は大きく次の三つに分類さ
れる。第一は物理的に酸素溶解度の極めて高い人工物で
ある PFC（Perfluoro-Carbon-Emulsion)であり、認可さ
れてはいるものの、酸素運搬量が少ないことや、代謝・
免疫系への影響においていまだ満足する結果は得られて
いない。
れる。第一は物理的に酸素溶解度の極めて高い人工物で
ある PFC（Perfluoro-Carbon-Emulsion)であり、認可さ
れてはいるものの、酸素運搬量が少ないことや、代謝・
免疫系への影響においていまだ満足する結果は得られて
いない。
【０００４】第二は赤血球中にあって酸素運搬機能を有
する蛋白質ヘモグロビンを化学的に修飾、或はリン脂質
小胞体中に内包した系であり、第三はヘモグロビン中の
酸素結合部位であるポルフィリンの誘導体を合成してリ
ン脂質二分子層膜中に包埋させた系である。
する蛋白質ヘモグロビンを化学的に修飾、或はリン脂質
小胞体中に内包した系であり、第三はヘモグロビン中の
酸素結合部位であるポルフィリンの誘導体を合成してリ
ン脂質二分子層膜中に包埋させた系である。
【０００５】第二番目の人工酸素運搬体では、期限切れ
赤血球由来のヘモグロビンが原料に用いられており、献
血により集められた赤血球の有効利用につながることか
らも、大いに注目を集めている。そして、赤血球の有効
利用に当っては、ヘモグロビンを可及的に変性させずに
赤血球膜成分や共雑蛋白質が完全に除去されたウイルス
フリーのヘモグロビンを大量に得ることができる技術手
段の確立が急務とされている。
赤血球由来のヘモグロビンが原料に用いられており、献
血により集められた赤血球の有効利用につながることか
らも、大いに注目を集めている。そして、赤血球の有効
利用に当っては、ヘモグロビンを可及的に変性させずに
赤血球膜成分や共雑蛋白質が完全に除去されたウイルス
フリーのヘモグロビンを大量に得ることができる技術手
段の確立が急務とされている。
【０００６】従来、赤血球からヘモグロビンを精製する
技術手段として、次の各種技術手段が実施或いは報告さ
れている。先ず、現在最も一般的なヘモグロビン精製法
は、洗浄赤血球に脱イオン水（あるいは低張液）を添加
して溶血し、遠心分離により単離した後に濃縮する方法
（Rabiner, S.F.et al., J.Exp.Med., 126, 1127 (196
7) ）である。
技術手段として、次の各種技術手段が実施或いは報告さ
れている。先ず、現在最も一般的なヘモグロビン精製法
は、洗浄赤血球に脱イオン水（あるいは低張液）を添加
して溶血し、遠心分離により単離した後に濃縮する方法
（Rabiner, S.F.et al., J.Exp.Med., 126, 1127 (196
7) ）である。
【０００７】また、有機溶媒を用いた赤血球の溶血法と
ストローマ成分の除去法が幾つか報告されており、四塩
化炭素を用いた方法（Schroeder, W.A., et al.,“The
Chromatography of Hemoglobin. ”Dekker, New York
(1980) ）、トルエンを用いた方法（Farnell, K.J., Ar
ch, Biochem. Biophys., 158, 702, (1973)）、クロロ
ホルムを用いた方法（Pristoupil, T.I., Int.J.Artif.
Org., 13, 383 (1990)）がある。
ストローマ成分の除去法が幾つか報告されており、四塩
化炭素を用いた方法（Schroeder, W.A., et al.,“The
Chromatography of Hemoglobin. ”Dekker, New York
(1980) ）、トルエンを用いた方法（Farnell, K.J., Ar
ch, Biochem. Biophys., 158, 702, (1973)）、クロロ
ホルムを用いた方法（Pristoupil, T.I., Int.J.Artif.
Org., 13, 383 (1990)）がある。
【０００８】また、ヘモグロビン溶液の加熱処理法（60
℃，〜10hr）による共雑蛋白質の除去とウイルスの不活
性化がPristoupilらによって報告されている（Pristoup
il,T.I., Int.J.Artif.Org., 13, 383 (1990)）。
℃，〜10hr）による共雑蛋白質の除去とウイルスの不活
性化がPristoupilらによって報告されている（Pristoup
il,T.I., Int.J.Artif.Org., 13, 383 (1990)）。
【０００９】さらに、精製ヘモグロビン溶液をCO化して
メト化を防止する方法が報告されている（Antonini,
E., et al., “Methods in Enzymology vol.76, Hemogl
-obins”, p.9, Academic Press, 1981)。
メト化を防止する方法が報告されている（Antonini,
E., et al., “Methods in Enzymology vol.76, Hemogl
-obins”, p.9, Academic Press, 1981)。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】よく知られている通
り、ヘモグロビンは不安定であり、速やかに酸化してメ
ト体となるため、赤血球からヘモグロビンを精製するに
当って実用できる精製法は限られており、また、その精
製効率も十分なものとは言い難いという問題がある。
り、ヘモグロビンは不安定であり、速やかに酸化してメ
ト体となるため、赤血球からヘモグロビンを精製するに
当って実用できる精製法は限られており、また、その精
製効率も十分なものとは言い難いという問題がある。
【００１１】即ち、前記イオン水（あるいは低張液）を
用いる方法にあっては、処理中にヘモグロビンがメト
化、変性することや溶血時にHb濃度が８wt％程度にまで
希釈されるので濃縮（［Hb］：30〜40g/dl）にかなりの
時間と手間がかかることなどの問題点がある。
用いる方法にあっては、処理中にヘモグロビンがメト
化、変性することや溶血時にHb濃度が８wt％程度にまで
希釈されるので濃縮（［Hb］：30〜40g/dl）にかなりの
時間と手間がかかることなどの問題点がある。
【００１２】また、前記有機溶媒を用いる方法にあって
も、処理中のヘモグロビンの変性とそれによる収率の低
下という問題点があり、また、いずれも希薄溶液での処
理であるため精製後の濃縮が問題となる。
も、処理中のヘモグロビンの変性とそれによる収率の低
下という問題点があり、また、いずれも希薄溶液での処
理であるため精製後の濃縮が問題となる。
【００１３】また、前記加熱処理法にあっては、等電点
電気泳動法による分析及び酸素親和性測定において特に
異常は認められないものの（Estep, T.N., Biomat., Ar
t.Cells, Art.Org., 16(1-3), 129 (1988)）、ヘモグロ
ビンはデオキシ状態にして加熱処理しなければならない
ため、操作の煩雑さと条件の厳密さが要求されるという
問題点がある。
電気泳動法による分析及び酸素親和性測定において特に
異常は認められないものの（Estep, T.N., Biomat., Ar
t.Cells, Art.Org., 16(1-3), 129 (1988)）、ヘモグロ
ビンはデオキシ状態にして加熱処理しなければならない
ため、操作の煩雑さと条件の厳密さが要求されるという
問題点がある。
【００１４】もっとも、前記精製ヘモグロビン溶液をCO
化する方法を用いてヘモグロビンをCO化させてから前記
の諸方法を実施すれば、前記諸方法に内存する問題点は
かなり解決される。しかしながら、精製ヘモグロビン溶
液のCO化操作の際に必然的に生じる溶液の泡立ちがヘモ
グロビンの変性や反応効率を低下させることになり、大
きな問題点となっているのである。
化する方法を用いてヘモグロビンをCO化させてから前記
の諸方法を実施すれば、前記諸方法に内存する問題点は
かなり解決される。しかしながら、精製ヘモグロビン溶
液のCO化操作の際に必然的に生じる溶液の泡立ちがヘモ
グロビンの変性や反応効率を低下させることになり、大
きな問題点となっているのである。
【００１５】本発明者等は、人工酸素運搬体について永
年にわたり系統的な研究を重ねているものであるが、期
限切れ赤血球有効利用の観点から、赤血球からヘモグロ
ビンを可及的に変性させることなく、かつ収率よく精製
できる技術手段を確立することを技術的課題として鋭意
努力した結果、上記諸問題点を解決し、当該課題を達成
した。
年にわたり系統的な研究を重ねているものであるが、期
限切れ赤血球有効利用の観点から、赤血球からヘモグロ
ビンを可及的に変性させることなく、かつ収率よく精製
できる技術手段を確立することを技術的課題として鋭意
努力した結果、上記諸問題点を解決し、当該課題を達成
した。
【００１６】
【課題を解決するための手段】前記技術的課題は、次の
通りの本発明によって達成できる。即ち、本発明は、赤
血球からヘモグロビン（以下「Hb」とする）を精製する
に当って、赤血球中を一酸化炭素処理して該赤血球中の
HbをCO化Hbとした後に精製することを特徴とするHb精製
法である。
通りの本発明によって達成できる。即ち、本発明は、赤
血球からヘモグロビン（以下「Hb」とする）を精製する
に当って、赤血球中を一酸化炭素処理して該赤血球中の
HbをCO化Hbとした後に精製することを特徴とするHb精製
法である。
【００１７】本発明の構成を詳しく説明すれば次の通り
である。先ず、本発明におけるCO化は赤血球液に一酸化
炭素を通気することによって行える。より効率よく行う
には、ホローファイバーモジュール型人工肺の使用が好
適である。通気によってHbの95％以上がCO化されている
ことを確認した後、遠心分離（例えば、 2,000×ｇ）に
よって濃厚赤血球液を得る。
である。先ず、本発明におけるCO化は赤血球液に一酸化
炭素を通気することによって行える。より効率よく行う
には、ホローファイバーモジュール型人工肺の使用が好
適である。通気によってHbの95％以上がCO化されている
ことを確認した後、遠心分離（例えば、 2,000×ｇ）に
よって濃厚赤血球液を得る。
【００１８】本発明においては、赤血球の段階でHbをCO
錯体としており、このCO化Hbには、通常のCO化していな
いHbでは変性が起こるような操作や条件を積極的に採用
して精製が行える。精製には従来知られている各種の方
法が適用できるが、CO化Hbの特長を活かした好ましい溶
血、ストローマ除去は有機溶剤処理法の適用である。上
記濃厚赤血球液に、等容量以上のＣn Ｈ(2n+2-m)Ｘ
m （Ｘ：ハロゲン）で示されるハロゲン化炭化水素（例
えば、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラクロロメ
タン、テトラクロロエタン）や、トルエン、ベンゼンな
どの芳香族系炭化水素、ジエチルエーテルなどの有機溶
媒を添加し、激しく振盪、遠心した後、有機溶媒層と中
層の固形物の層を分離し、Hb溶液層を得る。この操作を
二回以上行い、ストローマの無いCO化Hb溶液を得る。こ
の場合、赤血球を濃厚液の状態で処理するため、溶血液
のHb濃度は24g/dl以上となり、濃縮操作が大幅に短縮さ
れる。
錯体としており、このCO化Hbには、通常のCO化していな
いHbでは変性が起こるような操作や条件を積極的に採用
して精製が行える。精製には従来知られている各種の方
法が適用できるが、CO化Hbの特長を活かした好ましい溶
血、ストローマ除去は有機溶剤処理法の適用である。上
記濃厚赤血球液に、等容量以上のＣn Ｈ(2n+2-m)Ｘ
m （Ｘ：ハロゲン）で示されるハロゲン化炭化水素（例
えば、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラクロロメ
タン、テトラクロロエタン）や、トルエン、ベンゼンな
どの芳香族系炭化水素、ジエチルエーテルなどの有機溶
媒を添加し、激しく振盪、遠心した後、有機溶媒層と中
層の固形物の層を分離し、Hb溶液層を得る。この操作を
二回以上行い、ストローマの無いCO化Hb溶液を得る。こ
の場合、赤血球を濃厚液の状態で処理するため、溶血液
のHb濃度は24g/dl以上となり、濃縮操作が大幅に短縮さ
れる。
【００１９】また、CO化Hbの特長を活かした共雑蛋白質
の除去は加熱処理法の適用である。加熱処理操作時にウ
イルスの不活性化も行うことができる。即ち、赤血球中
にはHb以外にも脱炭酸酵素等の水溶性蛋白質が数多く存
在し、これらは有機溶媒処理では除去できない。一般
に、蛋白質は熱に対して不安定であり熱変性により凝集
沈澱するから、加熱処理により熱に対して安定なCO化Hb
から共雑蛋白質を容易に分離できる。また、一般にウイ
ルス不活性化は60℃以上で10時間程度処理すると完全に
行えることから、共雑蛋白質を除去する加熱処理で同時
にウイルスの不活性化も行える。なお、CO化していない
Hbにこれらの操作を施すと、速やかにメト体、次いで変
性体へと移行してしまう。分離は、80℃以下の温度での
加熱処理後に遠心分離や濾過操作で容易に行える。凝集
体は 2,000×ｇ程度の低い回転数で十分に分離され、更
に除去を完全なものとするには、孔径 0.2μｍのフィル
ターを通過させればよい。
の除去は加熱処理法の適用である。加熱処理操作時にウ
イルスの不活性化も行うことができる。即ち、赤血球中
にはHb以外にも脱炭酸酵素等の水溶性蛋白質が数多く存
在し、これらは有機溶媒処理では除去できない。一般
に、蛋白質は熱に対して不安定であり熱変性により凝集
沈澱するから、加熱処理により熱に対して安定なCO化Hb
から共雑蛋白質を容易に分離できる。また、一般にウイ
ルス不活性化は60℃以上で10時間程度処理すると完全に
行えることから、共雑蛋白質を除去する加熱処理で同時
にウイルスの不活性化も行える。なお、CO化していない
Hbにこれらの操作を施すと、速やかにメト体、次いで変
性体へと移行してしまう。分離は、80℃以下の温度での
加熱処理後に遠心分離や濾過操作で容易に行える。凝集
体は 2,000×ｇ程度の低い回転数で十分に分離され、更
に除去を完全なものとするには、孔径 0.2μｍのフィル
ターを通過させればよい。
【００２０】
【作用】前記の通りの構成を採る本発明の作用は次の通
りである。本発明は、赤血球の段階でHbのCO化を行うこ
とを最大の特徴としており、本発明においては、Hbは赤
血球中にあるので一酸化炭素の通気によって生じる泡で
Hbが変性することは無い。そして、CO化Hbは安定である
ので、溶血、ストローマ除去、更なるHbの精製には、ど
のような従来法も適用でき、しかもメト化率の進行は殆
ど抑えられる。また、温度や雰囲気等の操作条件に注意
を払わなくてもよいので、簡略化され、大量調製が可能
となる。
りである。本発明は、赤血球の段階でHbのCO化を行うこ
とを最大の特徴としており、本発明においては、Hbは赤
血球中にあるので一酸化炭素の通気によって生じる泡で
Hbが変性することは無い。そして、CO化Hbは安定である
ので、溶血、ストローマ除去、更なるHbの精製には、ど
のような従来法も適用でき、しかもメト化率の進行は殆
ど抑えられる。また、温度や雰囲気等の操作条件に注意
を払わなくてもよいので、簡略化され、大量調製が可能
となる。
【００２１】
【実施例】次に、代表的な実施例を挙げて本発明をより
詳しく説明する。
詳しく説明する。
【００２２】実施例１ 期限切れの人血（保存血）５ｌを人工肺ＣＡＰＩＯＸ
３５０（商品名：テルモ社製）に通し、COガスを通気す
ることによってCO化赤血球とする。人血の流速を 500ml
/minとし30分間循環させることによりHbのCO化率は98.5
％に達した。次に、４℃にて遠心分離（ 2,000×ｇ）を
行い、下層の赤血球を回収し、更に等容量の生理食塩水
を添加して攪拌後、遠心分離して洗浄する。この操作を
四回繰り返して得られたCO化洗浄赤血球は 900ml、Hb濃
度は26.4g/dlであった。
３５０（商品名：テルモ社製）に通し、COガスを通気す
ることによってCO化赤血球とする。人血の流速を 500ml
/minとし30分間循環させることによりHbのCO化率は98.5
％に達した。次に、４℃にて遠心分離（ 2,000×ｇ）を
行い、下層の赤血球を回収し、更に等容量の生理食塩水
を添加して攪拌後、遠心分離して洗浄する。この操作を
四回繰り返して得られたCO化洗浄赤血球は 900ml、Hb濃
度は26.4g/dlであった。
【００２３】次に、上記CO化洗浄赤血球（ 850ml、26.3
g/dl）に等容量のクロロホルムを添加、約５分間激しく
振盪後、遠心分離（ 3,000回転、20分）にてCO化Hb溶液
(620ml、24.9g/dl）を上層に得る。最下層のクロロホル
ム層と、中層の固形物層にはストローマ成分が存在し
た。一回目の洗浄の際、桃色の固形物層が体積比で15％
得られるが、二回目では、固形物の量は２％程度に減少
する。三回まで繰り返した後、遮光減圧下で攪拌するこ
とにより残存しているクロロホルムを除去した。このと
き、シアンメト法により求めたメト化率は 0.5％であっ
た。
g/dl）に等容量のクロロホルムを添加、約５分間激しく
振盪後、遠心分離（ 3,000回転、20分）にてCO化Hb溶液
(620ml、24.9g/dl）を上層に得る。最下層のクロロホル
ム層と、中層の固形物層にはストローマ成分が存在し
た。一回目の洗浄の際、桃色の固形物層が体積比で15％
得られるが、二回目では、固形物の量は２％程度に減少
する。三回まで繰り返した後、遮光減圧下で攪拌するこ
とにより残存しているクロロホルムを除去した。このと
き、シアンメト法により求めたメト化率は 0.5％であっ
た。
【００２４】得られたCO化Hb溶液の残存リン脂質成分の
確認は、Bligh & Dier法の変法に従って抽出し、ＨＰＬ
Ｃ分析を行った。カラムはＴＳＫ gel-Silica 60、溶離
液はCH3 CN /CH3 OH/85 ％リン酸（900 / 95 / 5）、流
速 1.0ml/min、検出波長 210nmの条件で測定した。上記
CO化洗浄赤血球から抽出した脂質成分のクロマトチャー
トでは、溶出の速いものから、ホスファチジルセリン
（PS）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホス
ファチジルコリン（PC）に帰属される。このCO化洗浄赤
血球の90倍に相当する量のCO化Hb溶液をクロロホルム処
理し、同様にリン脂質成分を抽出してＨＰＬＣ測定し
た。単位Hbに対するリン脂質成分の減少率を計算し、表
１に示す。
確認は、Bligh & Dier法の変法に従って抽出し、ＨＰＬ
Ｃ分析を行った。カラムはＴＳＫ gel-Silica 60、溶離
液はCH3 CN /CH3 OH/85 ％リン酸（900 / 95 / 5）、流
速 1.0ml/min、検出波長 210nmの条件で測定した。上記
CO化洗浄赤血球から抽出した脂質成分のクロマトチャー
トでは、溶出の速いものから、ホスファチジルセリン
（PS）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホス
ファチジルコリン（PC）に帰属される。このCO化洗浄赤
血球の90倍に相当する量のCO化Hb溶液をクロロホルム処
理し、同様にリン脂質成分を抽出してＨＰＬＣ測定し
た。単位Hbに対するリン脂質成分の減少率を計算し、表
１に示す。
【００２５】
【表１】 クロロホルム処理によるリン脂質成分の除去率 ─────────────────── リン脂質 PS PE PC ─────────────────── 減少率 1/984 1/1218 1/261 ───────────────────
【００２６】次に、ＨＰＬＣにてHb変性の有無の確認を
した。カラムはＴＳＫ gel−ＳＰ−ＮＰＲ(4.6mm×3.5c
m)、溶離液はＡ：20mMビストリス-HCl緩衝液（pH 6.
0），Ｂ：Ａ＋0.2M−NaCl，Ａ／Ｂ（75／25）→Ｂ直線
グラジェント（３分）、流速 1.5ml/min．検出波長：41
9nm にて行った。常法の低張溶血法で精製したCO化Hbの
ＨＰＬＣクロマトチャートにおいて、約 0.3、 0.6、
2.0分に溶出する物質は、HbF 、HbA 1 C 、他の微量HbA
1 成分に帰属される。約 2.5分に検出される大きなピ
ークはHbA 0 である。次にクロロホルム洗浄したCO化Hb
について測定を行ったが、クロマトチャートはほぼ溶血
液と等しく、変性は認められなかった。
した。カラムはＴＳＫ gel−ＳＰ−ＮＰＲ(4.6mm×3.5c
m)、溶離液はＡ：20mMビストリス-HCl緩衝液（pH 6.
0），Ｂ：Ａ＋0.2M−NaCl，Ａ／Ｂ（75／25）→Ｂ直線
グラジェント（３分）、流速 1.5ml/min．検出波長：41
9nm にて行った。常法の低張溶血法で精製したCO化Hbの
ＨＰＬＣクロマトチャートにおいて、約 0.3、 0.6、
2.0分に溶出する物質は、HbF 、HbA 1 C 、他の微量HbA
1 成分に帰属される。約 2.5分に検出される大きなピ
ークはHbA 0 である。次にクロロホルム洗浄したCO化Hb
について測定を行ったが、クロマトチャートはほぼ溶血
液と等しく、変性は認められなかった。
【００２７】更に、得られたCO化Hb溶液の酸素親和性測
定を行った。Hbに対し、１モル当量の２，３−ジホスホ
グリセリン酸を添加し、ヘモックスアナライザー（商品
名：ＴＣＳ Medical Products 社製 (米国) ）にて測定
した（pH 7.4のヘモックス緩衝液中、37℃）。常法に従
い精製したHbはヒル係数 2.5、P 50 は24torrを示した
のに対し、クロロホルム処理後のHbはそれぞれ 2.5、26
torrであり、Hbの変性は確認されなかった。
定を行った。Hbに対し、１モル当量の２，３−ジホスホ
グリセリン酸を添加し、ヘモックスアナライザー（商品
名：ＴＣＳ Medical Products 社製 (米国) ）にて測定
した（pH 7.4のヘモックス緩衝液中、37℃）。常法に従
い精製したHbはヒル係数 2.5、P 50 は24torrを示した
のに対し、クロロホルム処理後のHbはそれぞれ 2.5、26
torrであり、Hbの変性は確認されなかった。
【００２８】次に、クロロホルム処理したCO化Hb溶液
（ 620ml、24.9g/dl、CO化率99.8％）を１リットルの三
角フラスコに封入し、遮光下加熱処理（60℃、10時間）
した。沈澱物や浮遊物を遠心分離（ 2,000×ｇ）したあ
と、ポリカーボネート製メンブレンフィルター（孔径
0.2μｍ、膜面積 3.4cm2 ：ニュクレポアー社製）を通
過させて精製Hb溶液を約 500ml（24.9g/dl）を得た。こ
の加熱処理したHbのヒル係数、P 50 はそれぞれ 2.5、
25torrであり、Hbの変性は確認されなかった。加熱処理
後のHbについてのＨＰＬＣ分析結果は、何の相違も認め
なかった。検出波長を280nm として同様に測定したとこ
ろ、溶血液ではHb以外の成分が 0.2分に認められた。こ
れはHbよりも低いpIを有する蛋白質（例：脱炭酸酵素、
pI：6.4 ）が検出されたものと思われる。加熱処理後の
系では 0.2分のピーク面積は80％以上減少し、共雑蛋白
質が除去されたことを示している。また、薄層等電点電
気泳動分析では、溶血液では認められたHb（HbAo、HbAl
c、HbF 等）以外の共雑蛋白質のバンド、例えば脱炭酸
酵素などが、加熱処理後消失しており、共雑蛋白質の除
去を確認した。得られた精製CO化Hb溶液（600ml 、24.9
g/dl、CO化率99.8% ）の濃縮は、限外濾過膜（PTTK，限
外分子量 30,000, 濾過面積 5.0 ft 2 :ミリポア社
製）を装填したペリコンカセットシステム（ミリポア社
製）を通過させて行い、Hb濃度47wt% まで濃縮すること
ができた。
（ 620ml、24.9g/dl、CO化率99.8％）を１リットルの三
角フラスコに封入し、遮光下加熱処理（60℃、10時間）
した。沈澱物や浮遊物を遠心分離（ 2,000×ｇ）したあ
と、ポリカーボネート製メンブレンフィルター（孔径
0.2μｍ、膜面積 3.4cm2 ：ニュクレポアー社製）を通
過させて精製Hb溶液を約 500ml（24.9g/dl）を得た。こ
の加熱処理したHbのヒル係数、P 50 はそれぞれ 2.5、
25torrであり、Hbの変性は確認されなかった。加熱処理
後のHbについてのＨＰＬＣ分析結果は、何の相違も認め
なかった。検出波長を280nm として同様に測定したとこ
ろ、溶血液ではHb以外の成分が 0.2分に認められた。こ
れはHbよりも低いpIを有する蛋白質（例：脱炭酸酵素、
pI：6.4 ）が検出されたものと思われる。加熱処理後の
系では 0.2分のピーク面積は80％以上減少し、共雑蛋白
質が除去されたことを示している。また、薄層等電点電
気泳動分析では、溶血液では認められたHb（HbAo、HbAl
c、HbF 等）以外の共雑蛋白質のバンド、例えば脱炭酸
酵素などが、加熱処理後消失しており、共雑蛋白質の除
去を確認した。得られた精製CO化Hb溶液（600ml 、24.9
g/dl、CO化率99.8% ）の濃縮は、限外濾過膜（PTTK，限
外分子量 30,000, 濾過面積 5.0 ft 2 :ミリポア社
製）を装填したペリコンカセットシステム（ミリポア社
製）を通過させて行い、Hb濃度47wt% まで濃縮すること
ができた。
【００２９】実施例２ 期限切れ濃厚赤血球パック（ 1.0l 、Hb濃度24.8g/dl、
メト化率0.45% ) を1.0lの生理食塩水で希釈して５リッ
トルの三角フラスコに入れた。フラスコ内の空気をCOガ
スで置換した後、10分間激しく振盪した。この操作を二
回繰り返し、CO化率98% の赤血球を得た。次に、４℃に
て遠心分離（ 2,000×ｇ）を行い、下層の赤血球を回収
し、更に等容量の生理食塩水を添加して攪拌後、遠心分
離して洗浄する操作を四回繰り返した。HbのCO化率は9
5.7％であった。得られたCO化洗浄赤血球は 410ml、Hb
濃度は25.4g/dlであった。以下の有機溶媒処理、加熱処
理は実施例１記載の方法に従って、精製Hb溶液を得た。
メト化率0.45% ) を1.0lの生理食塩水で希釈して５リッ
トルの三角フラスコに入れた。フラスコ内の空気をCOガ
スで置換した後、10分間激しく振盪した。この操作を二
回繰り返し、CO化率98% の赤血球を得た。次に、４℃に
て遠心分離（ 2,000×ｇ）を行い、下層の赤血球を回収
し、更に等容量の生理食塩水を添加して攪拌後、遠心分
離して洗浄する操作を四回繰り返した。HbのCO化率は9
5.7％であった。得られたCO化洗浄赤血球は 410ml、Hb
濃度は25.4g/dlであった。以下の有機溶媒処理、加熱処
理は実施例１記載の方法に従って、精製Hb溶液を得た。
【００３０】実施例３ 期限切れ濃厚赤血球パック（5.0l、Hb濃度24.8g/dl、メ
ト化率0.45％）を、実施例１に記載の人工肺を用いる方
法でCO化した。赤血球の流速は 500ml/minとし、COガス
を通気させ、30分間循環させることによりHbのCO化率は
99.3％に達した。次に、このCO化赤血球に等容量の生理
食塩水を添加して遠心分離する洗浄操作を二回繰り返し
た。得られた濃厚CO化洗浄赤血球溶液は4.7l、Hb濃度は
26.3g/dlであった。以下の有機溶媒処理、加熱処理は実
施例１記載の方法に従って、精製Hb溶液を得た。
ト化率0.45％）を、実施例１に記載の人工肺を用いる方
法でCO化した。赤血球の流速は 500ml/minとし、COガス
を通気させ、30分間循環させることによりHbのCO化率は
99.3％に達した。次に、このCO化赤血球に等容量の生理
食塩水を添加して遠心分離する洗浄操作を二回繰り返し
た。得られた濃厚CO化洗浄赤血球溶液は4.7l、Hb濃度は
26.3g/dlであった。以下の有機溶媒処理、加熱処理は実
施例１記載の方法に従って、精製Hb溶液を得た。
【００３１】実施例４ 期限切れ濃厚赤血球パック（1.0l、Hb濃度24.8g/dl、メ
ト化率 0.4％）を攪拌（ 500回転／分）しながら、実施
例２と同様に、COガスを50ml/minの速度で30分間バブル
した。このとき、HbのCO化率は95.3％であった。次に、
実施例３記載の洗浄操作を二回繰り返した。得られた濃
厚CO化洗浄赤血球溶液は 940ml、Hb濃度は26.3g/dlであ
った。以下の有機溶媒処理、加熱処理は実施例１記載の
方法に従って精製Hb溶液を得た。
ト化率 0.4％）を攪拌（ 500回転／分）しながら、実施
例２と同様に、COガスを50ml/minの速度で30分間バブル
した。このとき、HbのCO化率は95.3％であった。次に、
実施例３記載の洗浄操作を二回繰り返した。得られた濃
厚CO化洗浄赤血球溶液は 940ml、Hb濃度は26.3g/dlであ
った。以下の有機溶媒処理、加熱処理は実施例１記載の
方法に従って精製Hb溶液を得た。
【００３２】実施例５ 実施例４記載の方法で得た濃厚CO化洗浄赤血球溶液（2
6.3g/dl、1.0l）に等容量のジクロロメタンを添加し
た。約５分間激しく振盪後、遠心分離（ 3,000回転、20
分）にてCO化Hb溶液（ 800ml、24.3g/dl）を上層に得
る。この操作を三回繰り返した後、遮光減圧下で攪拌す
ることにより残存しているジクロロメタンを除去した。
このとき、シアンメト法により求めたメト化率は 0.5％
であった。以下の加熱処理は実施例１記載の方法に従っ
て精製Hb溶液を得た。
6.3g/dl、1.0l）に等容量のジクロロメタンを添加し
た。約５分間激しく振盪後、遠心分離（ 3,000回転、20
分）にてCO化Hb溶液（ 800ml、24.3g/dl）を上層に得
る。この操作を三回繰り返した後、遮光減圧下で攪拌す
ることにより残存しているジクロロメタンを除去した。
このとき、シアンメト法により求めたメト化率は 0.5％
であった。以下の加熱処理は実施例１記載の方法に従っ
て精製Hb溶液を得た。
【００３３】実施例６ 実施例４記載の方法で得た濃厚CO化洗浄赤血球（26.3g/
dl、 500ml）に等容量のジエチルエーテルを添加した。
約５分間激しく振盪後、遠心分離(3,000回転、20分）に
てCO化Hb溶液（ 800ml、24.3g/dl）を下層に得る。この
操作を三回繰り返した後、遮光減圧下で攪拌することに
より残存しているジエチルエーテルを除去した。このと
き、メト化率は 0.5％であった。以下の加熱処理は実施
例１記載の方法に従った。
dl、 500ml）に等容量のジエチルエーテルを添加した。
約５分間激しく振盪後、遠心分離(3,000回転、20分）に
てCO化Hb溶液（ 800ml、24.3g/dl）を下層に得る。この
操作を三回繰り返した後、遮光減圧下で攪拌することに
より残存しているジエチルエーテルを除去した。このと
き、メト化率は 0.5％であった。以下の加熱処理は実施
例１記載の方法に従った。
【００３４】実施例７ 実施例１のCO化洗浄赤血球（ 500ml、26.3g/dl）を常法
の低張溶血法で溶血後、遠心分離（20,000×ｇ）してス
トローマを除去した。更に、ポリカーボネート製メンブ
レンフィルター（孔径 0.2μｍ：ニュクレポア社製）を
通過させて残存ストローマを除去し、Hb溶液を約1500ml
得た。濃度は 7.5g/dlに希釈されていたので限外濾過膜
（限外分子量：３万）を用いて30g/dlに濃縮して精製Hb
溶液を得た。
の低張溶血法で溶血後、遠心分離（20,000×ｇ）してス
トローマを除去した。更に、ポリカーボネート製メンブ
レンフィルター（孔径 0.2μｍ：ニュクレポア社製）を
通過させて残存ストローマを除去し、Hb溶液を約1500ml
得た。濃度は 7.5g/dlに希釈されていたので限外濾過膜
（限外分子量：３万）を用いて30g/dlに濃縮して精製Hb
溶液を得た。
【００３５】実施例８ 実施例７の遠心分離してストローマを除去した段階のCO
化Hb溶液（８wt％,4.0l)を、ウイルス除去膜ＢＭＭ（商
品名：旭化成）を通過させて精製を行った。得られた精
製Hb溶液のメト化率は 0.3％程度に抑えることができ
た。残存リン脂質成分の確認を実施例１記載のＨＰＬＣ
法で行ったところ、脂質成分（PS，PE，PC）はそれぞ
れ、CO化洗浄赤血球の 1/906、1/1198、1/221 に減少し
ていた。
化Hb溶液（８wt％,4.0l)を、ウイルス除去膜ＢＭＭ（商
品名：旭化成）を通過させて精製を行った。得られた精
製Hb溶液のメト化率は 0.3％程度に抑えることができ
た。残存リン脂質成分の確認を実施例１記載のＨＰＬＣ
法で行ったところ、脂質成分（PS，PE，PC）はそれぞ
れ、CO化洗浄赤血球の 1/906、1/1198、1/221 に減少し
ていた。
【００３６】実施例９ 実施例７の遠心分離してストローマを除去した段階のCO
化Hb溶液（８wt％,3.5l)に、実施例１記載の加熱処理を
行い、Hb溶液（3.3l）を得た。濃縮は実施例７記載の方
法に従って精製Hb溶液を得た。
化Hb溶液（８wt％,3.5l)に、実施例１記載の加熱処理を
行い、Hb溶液（3.3l）を得た。濃縮は実施例７記載の方
法に従って精製Hb溶液を得た。
【００３７】実施例１０ 実施例１のクロロホルム処理して得たCO化Hb溶液（ 800
ml，24.9g/dl）を１リットルの三角フラスコに封入し、
遮光下温度を80℃にして加熱処理を５時間した。沈澱物
や浮遊物を遠心分離（ 2,000×ｇ）し、実施例１記載の
フィルター処理を行い、精製Hb溶液を約 600ml（24.5g/
dl）得た。実施例１記載のHb溶液のＨＰＬＣ分析を行っ
たが、クロマトチャートには異常は認められなかった。
ml，24.9g/dl）を１リットルの三角フラスコに封入し、
遮光下温度を80℃にして加熱処理を５時間した。沈澱物
や浮遊物を遠心分離（ 2,000×ｇ）し、実施例１記載の
フィルター処理を行い、精製Hb溶液を約 600ml（24.5g/
dl）得た。実施例１記載のHb溶液のＨＰＬＣ分析を行っ
たが、クロマトチャートには異常は認められなかった。
【００３８】
【発明の効果】本発明によれば次の効果を得ることがで
きる。即ち、本発明においては、赤血球の段階でHbをCO
錯体にするからHbは赤血球中にあるので一酸化炭素の通
気によって生じる泡でHbが変性することなく、このCO化
Hbに常法、有機溶媒処理法、加熱処理法によるHb精製を
適用しているためHbの変性を可及的に抑制することがで
きる。従って、従来の酸素錯体のまま精製する場合より
も収率、純度の向上が可能である。また、有機溶媒、加
熱処理法の適用に当っては高濃度CO化Hb溶液を処理で
き、得られるHb溶液も濃厚であり、操作も簡単であり、
しかも、加熱処理時にウイルスの不活性化が行えるの
で、精製Hb溶液の工業的量産の一法として推奨できる。
きる。即ち、本発明においては、赤血球の段階でHbをCO
錯体にするからHbは赤血球中にあるので一酸化炭素の通
気によって生じる泡でHbが変性することなく、このCO化
Hbに常法、有機溶媒処理法、加熱処理法によるHb精製を
適用しているためHbの変性を可及的に抑制することがで
きる。従って、従来の酸素錯体のまま精製する場合より
も収率、純度の向上が可能である。また、有機溶媒、加
熱処理法の適用に当っては高濃度CO化Hb溶液を処理で
き、得られるHb溶液も濃厚であり、操作も簡単であり、
しかも、加熱処理時にウイルスの不活性化が行えるの
で、精製Hb溶液の工業的量産の一法として推奨できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−154418（ＪＰ，Ａ) 国際公開91／9615（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 1/00 - 1/36 A61K 35/18 A61K 38/16 ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (5)
- 【請求項１】 赤血球からヘモグロビンを精製するに当
って、赤血球中を一酸化炭素処理して該赤血球中のヘモ
グロビンをCO化ヘモグロビンとした後に精製することを
特徴とするヘモグロビン精製法。 - 【請求項２】 赤血球からヘモグロビンを精製するに当
って、赤血球中を一酸化炭素処理して該赤血球中のヘモ
グロビンをCO化ヘモグロビンとした後、当該赤血球を有
機溶媒処理して溶血とストローマ除去とを同時に行うこ
とを特徴とするヘモグロビン精製法。 - 【請求項３】 赤血球からヘモグロビンを精製するに当
って、赤血球中を一酸化炭素処理して該赤血球中のヘモ
グロビンをCO化ヘモグロビンとした後、当該赤血球から
CO化ヘモグロビンを得、これを加熱処理して共雑蛋白質
除去を行うことを特徴とするヘモグロビン精製法。 - 【請求項４】 赤血球からヘモグロビンを精製するに当
って、赤血球中を一酸化炭素処理して該赤血球中のヘモ
グロビンをCO化ヘモグロビンとした後、当該赤血球を有
機溶媒処理して溶血とストローマ除去とを同時に行い、
次いで加熱処理して共雑蛋白質除去を行うことを特徴と
するヘモグロビン精製法。 - 【請求項５】 赤血球液に一酸化炭素を通気することに
よって赤血球中を一酸化炭素処理する請求項１乃至請求
項４のいずれかに記載のヘモグロビン精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05637292A JP3331433B2 (ja) | 1992-02-05 | 1992-02-05 | ヘモグロビン精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05637292A JP3331433B2 (ja) | 1992-02-05 | 1992-02-05 | ヘモグロビン精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0616693A JPH0616693A (ja) | 1994-01-25 |
| JP3331433B2 true JP3331433B2 (ja) | 2002-10-07 |
Family
ID=13025429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05637292A Expired - Fee Related JP3331433B2 (ja) | 1992-02-05 | 1992-02-05 | ヘモグロビン精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3331433B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007269665A (ja) * | 2006-03-30 | 2007-10-18 | Hidetoshi Tsuchida | 配位子置換型輸液製剤 |
| WO2012137834A1 (ja) | 2011-04-04 | 2012-10-11 | 学校法人早稲田大学 | 小胞体の製造方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5741894A (en) * | 1995-09-22 | 1998-04-21 | Baxter International, Inc. | Preparation of pharmaceutical grade hemoglobins by heat treatment in partially oxygenated form |
-
1992
- 1992-02-05 JP JP05637292A patent/JP3331433B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007269665A (ja) * | 2006-03-30 | 2007-10-18 | Hidetoshi Tsuchida | 配位子置換型輸液製剤 |
| WO2012137834A1 (ja) | 2011-04-04 | 2012-10-11 | 学校法人早稲田大学 | 小胞体の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0616693A (ja) | 1994-01-25 |
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