JP2000333681A - タンパク質分解酵素切断配列を含有するタンパク質分解酵素用基質及びその発現用ベクター - Google Patents
タンパク質分解酵素切断配列を含有するタンパク質分解酵素用基質及びその発現用ベクターInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 蛍光信号の微妙な変化を検出することがで
き、製造が容易で、かつ検出対象としての試料が微生物
や細胞である場合における試料内でのタンパク質分解酵
素活性の検出を可能とする構成を有するタンパク質分解
酵素用の標識化基質、該基質の発現用のベクター、該ベ
クターを用いた標識化基質の製造方法及び該標識化基質
を用いたタンパク質分解酵素活性の検出方法を提供する
こと。 【解決手段】 タンパク質分解酵素による切断部位を有
するペプチドのアミノ末端とカルボキシル末端のそれぞ
れに標識としての蛍光タンパク質を結合した構造を有す
るタンパク質分解酵素用の標識化基質をコードするＤＮ
Ａ配列を、発現用ベクターに組み込んで、微生物や培養
細胞等の宿主中で発現させることで、宿主中に標識化基
質を生産する。
き、製造が容易で、かつ検出対象としての試料が微生物
や細胞である場合における試料内でのタンパク質分解酵
素活性の検出を可能とする構成を有するタンパク質分解
酵素用の標識化基質、該基質の発現用のベクター、該ベ
クターを用いた標識化基質の製造方法及び該標識化基質
を用いたタンパク質分解酵素活性の検出方法を提供する
こと。 【解決手段】 タンパク質分解酵素による切断部位を有
するペプチドのアミノ末端とカルボキシル末端のそれぞ
れに標識としての蛍光タンパク質を結合した構造を有す
るタンパク質分解酵素用の標識化基質をコードするＤＮ
Ａ配列を、発現用ベクターに組み込んで、微生物や培養
細胞等の宿主中で発現させることで、宿主中に標識化基
質を生産する。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】タンパク質分解酵素の活性の
検出に有用な蛍光タンパク質標識を有するタンパク分解
酵素用の標識化基質、この標識化基質をコードするＤＮ
Ａ配列を有し、該標識化基質の宿主での発現を可能とす
る組換えベクター、及び該タンパク質分解酵素用標識化
基質または該組換えベクターを用いるタンパク質分解酵
素活性の検出方法、更にはタンパク質分解酵素としての
トロンビンによる切断部位として利用し得るトロンビン
切断配列ペプチドに関する。 【０００２】 【従来の技術】生体内には様々なタンパク質分解酵素が
あり恒常性の維持に関わるほか、疾病発症に重大な役割
を果たしていることが知られてきている。その一つであ
るトロンビンは血液凝固過程を制御するタンパク質分解
酵素である。トロンビンの量を容易に測定することがで
きれば、生体内でのトロンビン活性のモニタリングだけ
ではなく、トロンビンの活性を制御する薬物開発の効率
化が図れる。 【０００３】従来、タンパク質分解酵素の基質ぺプチド
内にある距離をおいて位置するアミノ酸側鎖の２箇所の
一方に発光色素団、他方に消光団を結合し、これら色素
団の間での蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）を見ること
によりタンパク質分解酵素活性を検出する手法が開発さ
れている（例えば特表平9-504778号公報）。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】従来技術では、蛍光強
度の強弱変化すなわちモノカラー信号としてタンパク質
分解酵素活性を検出しており、信号の微妙な変化を検出
することが困難であった。更に、従来の手法では基質ペ
プチドのアミノ酸側鎖に煩雑な化学的手法により蛍光色
素を共有結合させる必要があった。また、従来法では、
細胞外からタンパク質分解酵素用基質を導入して細胞内
のタンパク質分解酵素活性を直接検出するような、細胞
内の活性測定は困難であった。 【０００５】本発明はこのような従来技術における問題
に鑑みなされたものであり、蛍光信号の微妙な変化を検
出することができ、製造が容易で、かつ検出対象として
の試料が微生物や細胞である場合における試料内でのタ
ンパク質分解酵素活性の検出を可能とする構成を有する
タンパク質分解酵素用の標識化基質、該基質の発現用の
ベクター、該ベクターを用いた標識化基質の製造方法及
び該標識化基質を用いたタンパク質分解酵素活性の検出
方法を提供することにある。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明のタンパク質分解
酵素用の標識化基質は、タンパク質分解酵素により切断
し得る切断部位を有するポリペプチドのアミノ末端とカ
ルボキシ末端のそれぞれに蛍光タンパク質を結合させた
構造を有し、前記ポリペプチドが前記切断部位から切断
されることでこれらの蛍光タンパク質からの蛍光特性が
変化するものであることを特徴とする。 【０００７】また、本発明のタンパク質分解酵素用標識
化基質発現用の組換えベクターは、プロモーターと、上
記の標識化基質をコードするＤＮＡ配列と、ベクター部
分とを有し、該プロモーターに該ＤＮＡ配列が宿主での
発現可能に接続していることを特徴とする。 【０００８】また、本発明の標識化基質の生産方法は、
上記の構成の組換えベクターを宿主に導入して形質転換
し、得られた形質転換体を培養して該形質転換体に該組
換えベクター中にコードされた標識化基質を生産させる
工程を有することを特徴とする。 【０００９】更に、本発明の標識化基質のトロンビン切
断配列として有用なトロンビン切断配列ペプチドは、ト
ロンビンに切断され得るアミノ酸配列としてGly-Leu-Va
l-Pro-Arg-Gly-Ser-Ile-Ala-Thr（配列番号：１）を有
することを特徴とする。 【００１０】また、本発明の試料中のタンパク質分解酵
素活性を検出する方法であって、試料と請求項１〜６の
いずれかに記載の標識化基質とを反応させて、該標識化
基質の有するタンパク質分解酵素による切断部位からの
切断による蛍光タンパク質からの蛍光特性の変化をタン
パク質分解酵素活性として検出することを特徴とする。 【００１１】本発明のタンパク分解酵素用の標識化基質
は、標識物質としての蛍光タンパク質が、タンパク質分
解酵素による切断部位を有するポリペプチドのアミノ末
端（Ｎ−末端）とカルボシキ末端（Ｃ−末端）に結合し
た構造を有するので、例えば蛍光タンパク質が結合した
状態の基質（標識化基質）をコードするＤＮＡ配列を発
現用のベクターに組み込んで、これを宿主に発現させる
ことで、目的とする標識化基質を宿主中に産生させるこ
とができ、基質への蛍光タンパク質の結合という煩雑な
工程を省略することができる。 【００１２】更に、タンパク質分解酵素活性の有無を検
出する対象として試料自体がこの宿主としての機能を有
する場合には、試料中で標識化基質を直接産生させるこ
とができ、産生された標識化基質を用いて試料としての
宿主中でのタンパク質分解酵素活性の検出が可能とな
る。すなわち、in vivoでのタンパク質分解酵素活性の
検出が可能となる。 【００１３】 【発明の実施の形態】本発明の標識化基質は、タンパク
質分解酵素による切断部位を有するポリペプチド部分
と、このポリペプチド部分のＮ−末端に結合した蛍光タ
ンパク質と、Ｃ−末端に結合した蛍光タンパク質とを有
する。酵素用基質の両端に蛍光タンパク質を結合する方
法としては、例えば、蛍光タンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列を酵素用基質をコードするＤＮＡ配列の５’末端
と３’末端に結合したＤＮＡ配列を作成し、これを適当
な宿主中で発現させる遺伝子組換え技術を利用した方法
が好適に利用できる。この方法によれば、酵素用基質に
蛍光タンパク質を共有結合する操作が省略でき、確実か
つ効率の良い蛍光タンパク質での酵素用基質の標識化が
可能となる。 【００１４】上記のように蛍光タンパク質で標識化され
た状態の酵素用基質自体をコードするＤＮＡ配列は、タ
ンパク質分解酵素の検出対象である試料が、微生物や各
種細胞である場合に、このＤＮＡ配列を発現ベクター中
に組み込んでこれらの試料中に導入して、これを発現さ
せることで、試料中で標識化基質を産生させることがで
きる。産生された標識化基質は、試料がタンパク質分解
酵素を持っている場合は、これと反応し、その反応に基
づく蛍光特性の変化を測定することでタンパク質分解酵
素の検出が可能となる。 【００１５】標識化基質の発現用のベクターは、これを
導入する試料（宿主）の種類に応じて選択したプロモー
ターを、必要に応じて複製開始点、エンハンサー、発現
確認用のマーカー等を有するベクター中に有する構成の
ものを好適に利用することができる。試料（宿主）とし
ては、例えば細菌等の微生物、ヒトや動物由来の各種培
養細胞などを挙げることができる。なお、発現用のベク
ターと標識化酵素の生産用の宿主との組合せを適宜選択
することで、標識化基質を宿主内に生産させたり、宿主
外に分泌生産させることもできる。宿主内に生産させた
標識化酵素は、通常の各種分離、精製方法を用いて単離
することができる。 【００１６】酵素用基質としては、宿主での発現が可能
であり、タンパク質分解酵素によって特異的に切断され
る部位を有するものが利用され、タンパク質分解酵素の
種類に応じて選択あるいは設計できる。例えば、トロン
ビン用の切断部位を構成し得るものとしては、先に挙げ
た配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドを挙げ
ることができる。 【００１７】一方、酵素用基質に結合させる蛍光タンパ
ク質としては、酵素用基質の両端に結合している状態で
の蛍光特性と、酵素用基質がタンパク質分解酵素によっ
て切断された場合における蛍光特性とが異なるものが利
用される。このような切断前後での蛍光特性の変化を提
供し得る蛍光タンパク質の組合せとしては、蛍光共鳴エ
ネルギー転移(FRET)の供与体と受容体の組合せを形成し
得るものを挙げることができる。例えば、酵素用基質の
アミノ末端に結合した蛍光タンパク質とカルボキシ末端
に結合した蛍光タンパク質とで、これら蛍光タンパク質
の励起に必要な励起光の波長及び励起状態での放射光の
波長が異なる組合せを好適なものとして例示できる。こ
のような励起放射光の波長が異なる組合せの好ましい例
としては、アミノ末端に結合した蛍光タンパク質とカル
ボキシ末端に結合した蛍光タンパク質の一方が、緑色蛍
光タンパク質（GFP）であり、他方が青色蛍光タンパク
質（BFP）である組合せを挙げることができ、励起放射
光の色変化評価を用いてタンパク質分解酵素活性の検出
における高精度化を達成できる。 【００１８】FRETは蛍光分子間の距離に依存した励起状
態の相互作用であり、隣接して存在する一方の蛍光分子
の発光と他方の励起とがカップリングして起きる。例え
ば、GFPとBFPの組合せを用いた酵素用基質に380nm付近
の励起用の光を照射するとBFPから440nm付近の光が放射
されるが、BFPにGFPが充分近接して位置するため、BFP
からの光はGFPに励起光として吸収され全体として酵素
用基質からは510nm付近の放射光が観察されることにな
る。一方、酵素用基質がタンパク質分解酵素によってBF
PとGFPをつなぐポリペプチド部分で切断されると、両蛍
光タンパク質はFRETを起こすほど近接して位置しなくな
るために380nm付近の光を照射するとBFPからの440nm付
近の放射光のみが観測され、このことによって、サンプ
ル中のタンパク質分解酵素の存在を検出することが可能
になる。このように、FRETを利用する場合には、励起光
の波長が異なり、かつ一方の蛍光タンパク質からの励起
状態での放射光が他方の蛍光タンパク質の励起光となる
ような２種の蛍光タンパク質の組合せが好適に用いられ
る。 【００１９】 【実施例】以下実施例により、トロンビン活性の検出に
有用な標識化基質の生産について詳述する。 【００２０】実施例１ まず、トロンビン切断配列含有タンパク質分解酵素用基
質遺伝子配列の設計を行った。トロンビン切断配列含有
タンパク質分解酵素用基質の遺伝子配列を設計するため
にはトロンビン認識ペプチドのアミノ(N)末側、カルボ
キシ(C)末側にそれぞれにGFP、BFPが配置されるだけで
なく、フォールディングしたタンパク質上においてGF
P、BFPが正しく折りたたまれ、かつトロンビンの切断配
列を含むペプチドを、トロンビンによって認識・切断さ
れるためにタンパク質表面上に配置させる必要がある。
そこでGFPの3次構造(PDBデータバンク)とトロンビン切
断配列を元にコンピュータモデリングの手法によりBFP
のC末端、トロンビン切断配列ペプチド、GFPのN末端が
スムーズなループ構造でつがるようにトロンビン切断配
列ペプチドを設計し、以下のアミノ酸配列： GlyLeuValProArgGlySerIleAlaThr（配列番号：１） を確定した。さらに分子動力学計算によりこの融合タン
パク質の安定性を確かめた。上述の遺伝子配列設計に基
づき、トロンビン切断配列含有タンパク質分解酵素用基
質遺伝子配列の構築を、以下の方法で行った。 【００２１】まず、BFP遺伝子を含むベクター「pEBFP」
(クロンテック社製)を鋳型とし、5'センスプライマー： 5'-CTGCAGATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3'（配列番号：２） と3'アンチセンスプライマー： 5'-GGATCCACGCGGAACCAGGCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAG
TGATCCC-3'（配列番号：３） とを用いてポリメラーゼ増幅反応（PCR）を行った。具
体的には100μlの反応液中に50ngの「ｐEBFP」、0.2μM
のプライマー、0.2mMのdNTP、10mMのTris-Cl(ｐH8.3)、
50mMのKCl、1.5mMのMgCl2及び2.5Uの「Takara Taq」(宝
酒造)に対し「95℃で1分、55℃で2分、72℃で2分(最後
のサイクルでは72℃、7分)」の処理を30サイクル行っ
た。これにより得られたPCR産物を0.6%アガロースゲル
電気泳動と「Suprec01」(宝酒造)を用いて精製した。精
製したPCR産物を制限酵素「Pst I」、「Bam HI」(宝酒
造)で37℃、3時間の切断処理を行った後、フェノール・
クロロホルム抽出とエタノール沈殿[村松、ラボマニュ
アル遺伝子工学、第29-33頁、丸善(1990)]によって精製
した。得られた制限酵素切断PCR産物を、同じく制限酵
素「Pst I」、「Bam HI」(宝酒造)で37℃、3時間の切断
処理、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿
を行ったGFP遺伝子を含むベクター「pEGFP-N3」(クロン
テック社製)に「Takara Ligation kit」(宝酒造)を用い
て挿入した。得られたプラスミドを大腸菌JM109コンピ
テントセル(宝酒造)に導入し、カナマイシンを含むLB培
地(1%トリプトン、0.5%イーストエクストラクト、0.5%
塩化ナトリウム、30μg/mlカナマイシン)で37℃、20時
間培養した。得られた形質転換体の中から紫外線照射に
よって蛍光を発するコロニーを選択、培養し、プラスミ
ドを抽出した。以上の結果得られたプラスミドの制限酵
素地図と作成手順を図１に示した。 【００２２】このプラスミドを、大腸菌ＪＭ１０９コン
ピテントセル（宝酒造）に導入し、これを形質転換し
て、BFPとGFPとが末端に結合した標識化基質を大腸菌内
に生産させた。生産された標識化基質は、定法により菌
体から分離精製し、トロンビン活性の検出に好適に利用
可能であった。 【００２３】 【発明の効果】本発明ではタンパク質分解酵素用の基質
の両端に、例えば蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)の供与
体と受容体の組合せを形成し、かつ励起波長及び放射波
長の異なる２種の蛍光タンパク質を結合させた融合タン
パク質をコードする組換え遺伝子を作製し、この組換え
遺伝子を細菌等の微生物や、ヒトまたは動物由来の各種
培養細胞に導入し発現させることで、タンパク質分解酵
素用の標識化基質の作製が容易になる。 【００２４】更に、上記のような蛍光共鳴エネルギー転
移(FRET)の供与体と受容体の組合せを形成する２種の蛍
光タンパク質を用いることで、信号の微妙な変化を検出
することが可能となる。 【００２５】一方、検出対象試料が、この組換え遺伝子
を導入した細菌等の微生物や、ヒトまたは動物由来の培
養細胞を用いることにより、in vivoでの分解酵素活性
の検出において励起放射光の色変化評価を用いて高精度
化を達成できる。 【００２６】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Ile-Ala-Thr 1 5 10 配列番号：２ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：PCR用5'アンチセンスプライマー 配列 CTGCAGATGG TGAGCAAGGG CGAGG 15 配列番号：３ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：PCR用3'アンチセンスプライマー 配列 GGATCCACGC GGAACCAGGC CCTTGTACAG CTCGTCCATG 40 CCGAGAGTGA TCCC 54
検出に有用な蛍光タンパク質標識を有するタンパク分解
酵素用の標識化基質、この標識化基質をコードするＤＮ
Ａ配列を有し、該標識化基質の宿主での発現を可能とす
る組換えベクター、及び該タンパク質分解酵素用標識化
基質または該組換えベクターを用いるタンパク質分解酵
素活性の検出方法、更にはタンパク質分解酵素としての
トロンビンによる切断部位として利用し得るトロンビン
切断配列ペプチドに関する。 【０００２】 【従来の技術】生体内には様々なタンパク質分解酵素が
あり恒常性の維持に関わるほか、疾病発症に重大な役割
を果たしていることが知られてきている。その一つであ
るトロンビンは血液凝固過程を制御するタンパク質分解
酵素である。トロンビンの量を容易に測定することがで
きれば、生体内でのトロンビン活性のモニタリングだけ
ではなく、トロンビンの活性を制御する薬物開発の効率
化が図れる。 【０００３】従来、タンパク質分解酵素の基質ぺプチド
内にある距離をおいて位置するアミノ酸側鎖の２箇所の
一方に発光色素団、他方に消光団を結合し、これら色素
団の間での蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）を見ること
によりタンパク質分解酵素活性を検出する手法が開発さ
れている（例えば特表平9-504778号公報）。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】従来技術では、蛍光強
度の強弱変化すなわちモノカラー信号としてタンパク質
分解酵素活性を検出しており、信号の微妙な変化を検出
することが困難であった。更に、従来の手法では基質ペ
プチドのアミノ酸側鎖に煩雑な化学的手法により蛍光色
素を共有結合させる必要があった。また、従来法では、
細胞外からタンパク質分解酵素用基質を導入して細胞内
のタンパク質分解酵素活性を直接検出するような、細胞
内の活性測定は困難であった。 【０００５】本発明はこのような従来技術における問題
に鑑みなされたものであり、蛍光信号の微妙な変化を検
出することができ、製造が容易で、かつ検出対象として
の試料が微生物や細胞である場合における試料内でのタ
ンパク質分解酵素活性の検出を可能とする構成を有する
タンパク質分解酵素用の標識化基質、該基質の発現用の
ベクター、該ベクターを用いた標識化基質の製造方法及
び該標識化基質を用いたタンパク質分解酵素活性の検出
方法を提供することにある。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明のタンパク質分解
酵素用の標識化基質は、タンパク質分解酵素により切断
し得る切断部位を有するポリペプチドのアミノ末端とカ
ルボキシ末端のそれぞれに蛍光タンパク質を結合させた
構造を有し、前記ポリペプチドが前記切断部位から切断
されることでこれらの蛍光タンパク質からの蛍光特性が
変化するものであることを特徴とする。 【０００７】また、本発明のタンパク質分解酵素用標識
化基質発現用の組換えベクターは、プロモーターと、上
記の標識化基質をコードするＤＮＡ配列と、ベクター部
分とを有し、該プロモーターに該ＤＮＡ配列が宿主での
発現可能に接続していることを特徴とする。 【０００８】また、本発明の標識化基質の生産方法は、
上記の構成の組換えベクターを宿主に導入して形質転換
し、得られた形質転換体を培養して該形質転換体に該組
換えベクター中にコードされた標識化基質を生産させる
工程を有することを特徴とする。 【０００９】更に、本発明の標識化基質のトロンビン切
断配列として有用なトロンビン切断配列ペプチドは、ト
ロンビンに切断され得るアミノ酸配列としてGly-Leu-Va
l-Pro-Arg-Gly-Ser-Ile-Ala-Thr（配列番号：１）を有
することを特徴とする。 【００１０】また、本発明の試料中のタンパク質分解酵
素活性を検出する方法であって、試料と請求項１〜６の
いずれかに記載の標識化基質とを反応させて、該標識化
基質の有するタンパク質分解酵素による切断部位からの
切断による蛍光タンパク質からの蛍光特性の変化をタン
パク質分解酵素活性として検出することを特徴とする。 【００１１】本発明のタンパク分解酵素用の標識化基質
は、標識物質としての蛍光タンパク質が、タンパク質分
解酵素による切断部位を有するポリペプチドのアミノ末
端（Ｎ−末端）とカルボシキ末端（Ｃ−末端）に結合し
た構造を有するので、例えば蛍光タンパク質が結合した
状態の基質（標識化基質）をコードするＤＮＡ配列を発
現用のベクターに組み込んで、これを宿主に発現させる
ことで、目的とする標識化基質を宿主中に産生させるこ
とができ、基質への蛍光タンパク質の結合という煩雑な
工程を省略することができる。 【００１２】更に、タンパク質分解酵素活性の有無を検
出する対象として試料自体がこの宿主としての機能を有
する場合には、試料中で標識化基質を直接産生させるこ
とができ、産生された標識化基質を用いて試料としての
宿主中でのタンパク質分解酵素活性の検出が可能とな
る。すなわち、in vivoでのタンパク質分解酵素活性の
検出が可能となる。 【００１３】 【発明の実施の形態】本発明の標識化基質は、タンパク
質分解酵素による切断部位を有するポリペプチド部分
と、このポリペプチド部分のＮ−末端に結合した蛍光タ
ンパク質と、Ｃ−末端に結合した蛍光タンパク質とを有
する。酵素用基質の両端に蛍光タンパク質を結合する方
法としては、例えば、蛍光タンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列を酵素用基質をコードするＤＮＡ配列の５’末端
と３’末端に結合したＤＮＡ配列を作成し、これを適当
な宿主中で発現させる遺伝子組換え技術を利用した方法
が好適に利用できる。この方法によれば、酵素用基質に
蛍光タンパク質を共有結合する操作が省略でき、確実か
つ効率の良い蛍光タンパク質での酵素用基質の標識化が
可能となる。 【００１４】上記のように蛍光タンパク質で標識化され
た状態の酵素用基質自体をコードするＤＮＡ配列は、タ
ンパク質分解酵素の検出対象である試料が、微生物や各
種細胞である場合に、このＤＮＡ配列を発現ベクター中
に組み込んでこれらの試料中に導入して、これを発現さ
せることで、試料中で標識化基質を産生させることがで
きる。産生された標識化基質は、試料がタンパク質分解
酵素を持っている場合は、これと反応し、その反応に基
づく蛍光特性の変化を測定することでタンパク質分解酵
素の検出が可能となる。 【００１５】標識化基質の発現用のベクターは、これを
導入する試料（宿主）の種類に応じて選択したプロモー
ターを、必要に応じて複製開始点、エンハンサー、発現
確認用のマーカー等を有するベクター中に有する構成の
ものを好適に利用することができる。試料（宿主）とし
ては、例えば細菌等の微生物、ヒトや動物由来の各種培
養細胞などを挙げることができる。なお、発現用のベク
ターと標識化酵素の生産用の宿主との組合せを適宜選択
することで、標識化基質を宿主内に生産させたり、宿主
外に分泌生産させることもできる。宿主内に生産させた
標識化酵素は、通常の各種分離、精製方法を用いて単離
することができる。 【００１６】酵素用基質としては、宿主での発現が可能
であり、タンパク質分解酵素によって特異的に切断され
る部位を有するものが利用され、タンパク質分解酵素の
種類に応じて選択あるいは設計できる。例えば、トロン
ビン用の切断部位を構成し得るものとしては、先に挙げ
た配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドを挙げ
ることができる。 【００１７】一方、酵素用基質に結合させる蛍光タンパ
ク質としては、酵素用基質の両端に結合している状態で
の蛍光特性と、酵素用基質がタンパク質分解酵素によっ
て切断された場合における蛍光特性とが異なるものが利
用される。このような切断前後での蛍光特性の変化を提
供し得る蛍光タンパク質の組合せとしては、蛍光共鳴エ
ネルギー転移(FRET)の供与体と受容体の組合せを形成し
得るものを挙げることができる。例えば、酵素用基質の
アミノ末端に結合した蛍光タンパク質とカルボキシ末端
に結合した蛍光タンパク質とで、これら蛍光タンパク質
の励起に必要な励起光の波長及び励起状態での放射光の
波長が異なる組合せを好適なものとして例示できる。こ
のような励起放射光の波長が異なる組合せの好ましい例
としては、アミノ末端に結合した蛍光タンパク質とカル
ボキシ末端に結合した蛍光タンパク質の一方が、緑色蛍
光タンパク質（GFP）であり、他方が青色蛍光タンパク
質（BFP）である組合せを挙げることができ、励起放射
光の色変化評価を用いてタンパク質分解酵素活性の検出
における高精度化を達成できる。 【００１８】FRETは蛍光分子間の距離に依存した励起状
態の相互作用であり、隣接して存在する一方の蛍光分子
の発光と他方の励起とがカップリングして起きる。例え
ば、GFPとBFPの組合せを用いた酵素用基質に380nm付近
の励起用の光を照射するとBFPから440nm付近の光が放射
されるが、BFPにGFPが充分近接して位置するため、BFP
からの光はGFPに励起光として吸収され全体として酵素
用基質からは510nm付近の放射光が観察されることにな
る。一方、酵素用基質がタンパク質分解酵素によってBF
PとGFPをつなぐポリペプチド部分で切断されると、両蛍
光タンパク質はFRETを起こすほど近接して位置しなくな
るために380nm付近の光を照射するとBFPからの440nm付
近の放射光のみが観測され、このことによって、サンプ
ル中のタンパク質分解酵素の存在を検出することが可能
になる。このように、FRETを利用する場合には、励起光
の波長が異なり、かつ一方の蛍光タンパク質からの励起
状態での放射光が他方の蛍光タンパク質の励起光となる
ような２種の蛍光タンパク質の組合せが好適に用いられ
る。 【００１９】 【実施例】以下実施例により、トロンビン活性の検出に
有用な標識化基質の生産について詳述する。 【００２０】実施例１ まず、トロンビン切断配列含有タンパク質分解酵素用基
質遺伝子配列の設計を行った。トロンビン切断配列含有
タンパク質分解酵素用基質の遺伝子配列を設計するため
にはトロンビン認識ペプチドのアミノ(N)末側、カルボ
キシ(C)末側にそれぞれにGFP、BFPが配置されるだけで
なく、フォールディングしたタンパク質上においてGF
P、BFPが正しく折りたたまれ、かつトロンビンの切断配
列を含むペプチドを、トロンビンによって認識・切断さ
れるためにタンパク質表面上に配置させる必要がある。
そこでGFPの3次構造(PDBデータバンク)とトロンビン切
断配列を元にコンピュータモデリングの手法によりBFP
のC末端、トロンビン切断配列ペプチド、GFPのN末端が
スムーズなループ構造でつがるようにトロンビン切断配
列ペプチドを設計し、以下のアミノ酸配列： GlyLeuValProArgGlySerIleAlaThr（配列番号：１） を確定した。さらに分子動力学計算によりこの融合タン
パク質の安定性を確かめた。上述の遺伝子配列設計に基
づき、トロンビン切断配列含有タンパク質分解酵素用基
質遺伝子配列の構築を、以下の方法で行った。 【００２１】まず、BFP遺伝子を含むベクター「pEBFP」
(クロンテック社製)を鋳型とし、5'センスプライマー： 5'-CTGCAGATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3'（配列番号：２） と3'アンチセンスプライマー： 5'-GGATCCACGCGGAACCAGGCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAG
TGATCCC-3'（配列番号：３） とを用いてポリメラーゼ増幅反応（PCR）を行った。具
体的には100μlの反応液中に50ngの「ｐEBFP」、0.2μM
のプライマー、0.2mMのdNTP、10mMのTris-Cl(ｐH8.3)、
50mMのKCl、1.5mMのMgCl2及び2.5Uの「Takara Taq」(宝
酒造)に対し「95℃で1分、55℃で2分、72℃で2分(最後
のサイクルでは72℃、7分)」の処理を30サイクル行っ
た。これにより得られたPCR産物を0.6%アガロースゲル
電気泳動と「Suprec01」(宝酒造)を用いて精製した。精
製したPCR産物を制限酵素「Pst I」、「Bam HI」(宝酒
造)で37℃、3時間の切断処理を行った後、フェノール・
クロロホルム抽出とエタノール沈殿[村松、ラボマニュ
アル遺伝子工学、第29-33頁、丸善(1990)]によって精製
した。得られた制限酵素切断PCR産物を、同じく制限酵
素「Pst I」、「Bam HI」(宝酒造)で37℃、3時間の切断
処理、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿
を行ったGFP遺伝子を含むベクター「pEGFP-N3」(クロン
テック社製)に「Takara Ligation kit」(宝酒造)を用い
て挿入した。得られたプラスミドを大腸菌JM109コンピ
テントセル(宝酒造)に導入し、カナマイシンを含むLB培
地(1%トリプトン、0.5%イーストエクストラクト、0.5%
塩化ナトリウム、30μg/mlカナマイシン)で37℃、20時
間培養した。得られた形質転換体の中から紫外線照射に
よって蛍光を発するコロニーを選択、培養し、プラスミ
ドを抽出した。以上の結果得られたプラスミドの制限酵
素地図と作成手順を図１に示した。 【００２２】このプラスミドを、大腸菌ＪＭ１０９コン
ピテントセル（宝酒造）に導入し、これを形質転換し
て、BFPとGFPとが末端に結合した標識化基質を大腸菌内
に生産させた。生産された標識化基質は、定法により菌
体から分離精製し、トロンビン活性の検出に好適に利用
可能であった。 【００２３】 【発明の効果】本発明ではタンパク質分解酵素用の基質
の両端に、例えば蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)の供与
体と受容体の組合せを形成し、かつ励起波長及び放射波
長の異なる２種の蛍光タンパク質を結合させた融合タン
パク質をコードする組換え遺伝子を作製し、この組換え
遺伝子を細菌等の微生物や、ヒトまたは動物由来の各種
培養細胞に導入し発現させることで、タンパク質分解酵
素用の標識化基質の作製が容易になる。 【００２４】更に、上記のような蛍光共鳴エネルギー転
移(FRET)の供与体と受容体の組合せを形成する２種の蛍
光タンパク質を用いることで、信号の微妙な変化を検出
することが可能となる。 【００２５】一方、検出対象試料が、この組換え遺伝子
を導入した細菌等の微生物や、ヒトまたは動物由来の培
養細胞を用いることにより、in vivoでの分解酵素活性
の検出において励起放射光の色変化評価を用いて高精度
化を達成できる。 【００２６】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Ile-Ala-Thr 1 5 10 配列番号：２ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：PCR用5'アンチセンスプライマー 配列 CTGCAGATGG TGAGCAAGGG CGAGG 15 配列番号：３ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：PCR用3'アンチセンスプライマー 配列 GGATCCACGC GGAACCAGGC CCTTGTACAG CTCGTCCATG 40 CCGAGAGTGA TCCC 54
【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光タンパク質によって標識したトロンビンに
対する基質の発現用の組換えDNAの構造を示す図であ
る。 【符号の説明】 １ 青色蛍光タンパク質BFPの遺伝子をもつベクターpEB
FP(4.7ｋｂ） ２ BFP遺伝子 ３ センスプライマー ４ アンチセンスプライマー ５ トロンビン切断配列を含む基質ペプチドをコードす
るＤＮＡ配列 ６ 緑色蛍光タンパク質ＧＦＰの遺伝子をもつベクター
pEGFP（4.7ｋｂ) ７ マルチクローニング部位 ８ ＧＦＰ遺伝子 ９ トロンビンに対する基質発現用組換えベクター
対する基質の発現用の組換えDNAの構造を示す図であ
る。 【符号の説明】 １ 青色蛍光タンパク質BFPの遺伝子をもつベクターpEB
FP(4.7ｋｂ） ２ BFP遺伝子 ３ センスプライマー ４ アンチセンスプライマー ５ トロンビン切断配列を含む基質ペプチドをコードす
るＤＮＡ配列 ６ 緑色蛍光タンパク質ＧＦＰの遺伝子をもつベクター
pEGFP（4.7ｋｂ) ７ マルチクローニング部位 ８ ＧＦＰ遺伝子 ９ トロンビンに対する基質発現用組換えベクター
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 9/74 Ｃ１２Ｑ 1/37 ４Ｂ０６５
Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 21/64 33/58 Ａ
33/58 Ａ６１Ｋ 49/00 Ｚ
// Ａ６１Ｋ 49/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ
33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ
(72)発明者 金子 寛生
東京都港区芝五丁目７番１号 日本電気株
式会社内
Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA03 DA02 EA01
GA07 KA02 KA05
2G045 AA28 BB25 DA13 DA36 FA11
FA26 FB01 FB07 FB12 GC15
4B024 AA11 AA20 BA80 CA02 CA05
CA07 CA20 DA01 DA02 DA05
DA06 DA11 FA02 HA01 HA11
4B050 CC05 CC10 DD20 LL03
4B063 QA01 QQ36 QR58 QX02
4B065 AA26X AA58X AA72X AA88X
AA90X AA99Y AB01 AC14
AC16 BA02 CA24 CA46
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 タンパク質分解酵素により切断し得る切
断部位を有するポリペプチドのアミノ末端とカルボキシ
末端のそれぞれに蛍光タンパク質を結合させた構造を有
し、前記ポリペプチドが前記切断部位から切断されるこ
とでこれらの蛍光タンパク質からの蛍光特性が変化する
ものであることを特徴とするタンパク質分解酵素用の標
識化基質。 【請求項２】 前記タンパク質分解酵素がトロンビンで
ある請求項１に記載の標識化基質。 【請求項３】 前記切断部位が、Gly-Leu-Val-Pro-Arg-
Gly-Ser-Ile-Ala-Thrで示されるアミノ酸配列を有する
請求項２に記載の標識化基質。 【請求項４】 前記アミノ末端に結合した蛍光タンパク
質と前記カルボキシ末端に結合した蛍光タンパク質は、
蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)の供与体と受容体の組合
せを形成し得るものである請求項１〜３のいずれかに記
載の標識化基質。 【請求項５】 前記アミノ末端に結合した蛍光タンパク
質と前記カルボキシ末端に結合した蛍光タンパク質は、
これら蛍光タンパク質の励起に必要な励起光の波長及び
励起状態での放射光の波長が異なるものである請求項１
〜４のいずれかに記載の標識化基質。 【請求項６】 前記アミノ末端に結合した蛍光タンパク
質と前記カルボキシ末端に結合した蛍光タンパク質の一
方が、緑色蛍光タンパク質であり、他方が青色蛍光タン
パク質である請求項１〜５のいずれかに記載の標識化基
質。 【請求項７】 プロモーターと、請求項１〜６のいずれ
かに記載のタンパク質分解酵素用基質をコードするＤＮ
Ａ配列と、ベクター部分とを有し、該プロモーターに該
ＤＮＡ配列が宿主での発現可能に接続していることを特
徴とするタンパク質分解酵素用標識化基質発現用の組換
えベクター。 【請求項８】 前記宿主が微生物であり、前記プロモー
ターが微生物中で機能し得るものである請求項７に記載
の組換えベクター。 【請求項９】 前記微生物が細菌である請求項８に記載
の組換えベクター。 【請求項１０】 前記宿主が真核細胞であり、前記プロ
モーターが真核細胞中で機能し得るものである請求項７
に記載の組換えベクター。 【請求項１２】 請求項７〜１０のいずれかに記載の組
換えベクターを宿主に導入して形質転換し、得られた形
質転換体を培養して該形質転換体に該組換えベクター中
にコードされた標識化基質を生産させる工程を有するこ
とを特徴とする標識化基質の製造方法。 【請求項１３】 トロンビンに切断され得るアミノ酸配
列としてGly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Ile-Ala-Thrを
有することを特徴とするトロンビン切断配列ペプチド。 【請求項１４】 試料中のタンパク質分解酵素活性を検
出する方法であって、試料と請求項１〜６のいずれかに
記載の標識化基質とを反応させて、該標識化基質の有す
るタンパク質分解酵素による切断部位からの切断による
蛍光タンパク質からの蛍光特性の変化をタンパク質分解
酵素活性として検出することを特徴とするタンパク質分
解酵素活性の検出方法。 【請求項１５】 前記試料が微生物または真核細胞であ
り、請求項７〜１０のいずれかに記載の組換えベクター
を該試料中に導入して、該試料中で該組換えベクターの
有する標識化基質をコードするＤＮＡ配列を発現させて
産生される標識化基質を用いて試料中のタンパク質分解
酵素活性を検出する請求項１１に記載の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11148095A JP2000333681A (ja) | 1999-05-27 | 1999-05-27 | タンパク質分解酵素切断配列を含有するタンパク質分解酵素用基質及びその発現用ベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11148095A JP2000333681A (ja) | 1999-05-27 | 1999-05-27 | タンパク質分解酵素切断配列を含有するタンパク質分解酵素用基質及びその発現用ベクター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000333681A true JP2000333681A (ja) | 2000-12-05 |
Family
ID=15445141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11148095A Pending JP2000333681A (ja) | 1999-05-27 | 1999-05-27 | タンパク質分解酵素切断配列を含有するタンパク質分解酵素用基質及びその発現用ベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000333681A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006525804A (ja) * | 2003-04-25 | 2006-11-16 | メドトロニック・インコーポレーテッド | 酵素活性化に関する光学式検出器 |
| JP2009521666A (ja) * | 2005-10-12 | 2009-06-04 | アラーガン、インコーポレイテッド | 共鳴エネルギー移動後の偏光解消（ｄａｒｅｔ）を用いる分子または細胞より小さい部分の相互作用力のアッセイ |
| CN112683867A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-04-20 | 复旦大学附属中山医院 | 一种在活体细胞上实时检测消皮素d的方法及其应用 |
-
1999
- 1999-05-27 JP JP11148095A patent/JP2000333681A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006525804A (ja) * | 2003-04-25 | 2006-11-16 | メドトロニック・インコーポレーテッド | 酵素活性化に関する光学式検出器 |
| US8940522B2 (en) | 2003-04-25 | 2015-01-27 | Medtronic, Inc. | Optical detector for use in therapy |
| JP2009521666A (ja) * | 2005-10-12 | 2009-06-04 | アラーガン、インコーポレイテッド | 共鳴エネルギー移動後の偏光解消（ｄａｒｅｔ）を用いる分子または細胞より小さい部分の相互作用力のアッセイ |
| CN112683867A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-04-20 | 复旦大学附属中山医院 | 一种在活体细胞上实时检测消皮素d的方法及其应用 |
| CN112683867B (zh) * | 2020-12-21 | 2023-08-04 | 复旦大学附属中山医院 | 一种在活体细胞上实时检测消皮素d的方法及其应用 |
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