JP2021533771A - 核酸のインビトロ検出 - Google Patents

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Abstract

本明細書において、核酸のインビトロ検出のための組成物および方法が記載される。核酸センサーは、標的核酸の存在に基づく、コードされたレポータータンパク質の無細胞発現に対して活性化される。このシステムは、機器も厳密な温度制御も必要としない、低コストの細胞抽出物において機能するように設計されている。これらの特徴は、消費者の健康、ペット/動物の健康、および食品の安全性における、ならびにコストと携帯性とが重要な要素である他の分野での、ポイントオブユース分子診断用途に有利である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、2018年8月14日に出願された米国仮出願第62/718,427号の35 U.S.C.§119（e）に基づく恩典を主張する。
配列表
本出願は、EFS-Webを介してASCII形式で提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる配列表を含む。2019年7月29日に作成された該ASCIIコピーは、002806-092060WOPT_SL.txtという名称であり、サイズは15,781バイトである。
発明の分野
本明細書において、無細胞発現システムを使用して核酸を検出するためのシステムおよび方法が記載される。
背景
従来の核酸検出技術は、多大な基本的施設および運用投資を必要とする。特に、標識および増幅システムは、熱サイクルプラットフォームと、高価で場所をとる画像化技術とを必要とする。そのようなシステムは、現場で配置する機会も制限する。タンパク質発現が検出読み出しである場合、インビボ細胞発現システムは、現場で使用するための実行可能な展開を伴わず、複雑性のもう1つの層を追加する。したがって、当技術分野において、複雑さが低減しており、最小限の基本的施設によって柔軟な展開を提供するシステムおよび方法に対する大きな必要性が存在する。
概要
本明細書において、標的核酸分子の存在を検出するためのセンサーシステムに関連する方法および組成物が提供される。標的の非存在下では、これらのセンサーは非機能的部分として存在する。標的の存在下では、標的核酸結合配列を含むセンサーシステム部分は、標的に特異的に結合し、標的に結合すると、互いに近接して配置され、機能的なセンサーシステムを形成することが可能になる。機能的である場合、センサーシステムはレポータータンパク質を発現することができる。したがって、本明細書において記載されるセンサーは、非常に低いバックグラウンドシグナルを有し、かつ、タンパク質出力を測定するための既存の技術とともに使用するように容易に適合される。
本明細書において、核酸のインビトロ検出のための組成物および方法が記載される。核酸センサーは、標的核酸の存在に基づく、コードされたレポータータンパク質の無細胞発現に対して活性化される。このシステムは、機器も厳密な温度制御も必要としない、低コストの細胞抽出物において機能するように設計されている。これらの特徴は、消費者の健康、ペット/動物の健康、および食品の安全性における、ならびにコストと携帯性とが重要な要素である他の分野における、ポイントオブユース分子診断用途に有利である。
本明細書において記載される本発明の局面は、一緒にライゲーションされた場合に、i）プロモーターと、ii）リボソーム結合部位（RBS）と、iii）コード配列とを含むDNA発現カセットの一本鎖を生成する、第1および第2の一本鎖DNAセンサー部分を含む、核酸センサーシステムを提供する。いくつかの態様では、第1および第2の一本鎖DNAセンサー部分内に、標的核酸ハイブリダイゼーション配列が位置する。
本発明の局面は、一緒にライゲーションされた場合に、i）プロモーターと、ii）リボソーム結合部位（RBS）と、iii）コード配列とを含むDNA発現カセットの一本鎖を生成する、第1および第2の一本鎖DNAセンサー部分を含む、核酸センサーシステムを記載し、この一本鎖は、3’および5’ハイブリダイゼーション領域を含む標的核酸ハイブリダイゼーション配列を含み、ここで、3’ハイブリダイゼーション領域は、第1のセンサー部分に含まれており、かつ5’ハイブリダイゼーション領域は、第2のセンサー部分に含まれており、そのため、センサーシステムが、標的核酸配列とハイブリダイズする標的核酸を含む試料に接触した場合に、標的核酸とのハイブリダイゼーションによって、第1の部分と第2の部分のライゲーションが可能になる。
いくつかの態様では、DNA発現カセットは、非鋳型DNA発現カセットである。いくつかの態様では、発現カセットの第1および第2のセンサー部分は、発現カセット内の任意の所与の位置で分離されている。いくつかの態様では、分離は、標的核酸ハイブリダイゼーション配列内で生じている。いくつかの態様では、標的核酸ハイブリダイゼーション配列は、発現カセット内の任意の所与の位置に位置する。
いくつかの態様では、第1または第2のセンサー部分のいずれかがコード配列を含み、残りのセンサー部分がプロモーターを含む。いくつかの態様では、第1または第2のセンサー部分のいずれかが、プロモーターと、リボソーム結合部位とを含み、残りのセンサー部分がコード配列を含む。いくつかの態様では、第1または第2のセンサー部分のいずれかが、プロモーターと、リボソーム結合部位と、コード配列の開始コドンとを含み、残りのセンサー部分が残りのコード配列を含む。いくつかの態様では、第1のセンサー部分は、5’から3’方向に、i）プロモーターと、ii）リボソーム結合部位（RBS）と、iii）コード配列の開始コドンと、iv）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態の3’ハイブリダイゼーション領域とを含み、第2のセンサー部分は、5’から3’方向に、i）残りのコード配列とインフレームのリーディングフレームの形態の5’ハイブリダイゼーション領域と、ii）5’ハイブリダイゼーション領域の下流で、かつ5’ハイブリダイゼーション領域とインフレームで連結された、残りのコード配列とを含む。
いくつかの態様では、第1または第2のセンサー部分のいずれかがプロモーターを含み、残りのセンサー部分がリボソーム結合部位とコード配列とを含む。いくつかの態様では、第1のセンサー部分は、5’から3’方向に、i）プロモーターと、ii）3’ハイブリダイゼーション領域とを含み、第2のセンサー部分は、5’から3’方向に、i）5’ハイブリダイゼーション領域と、ii）リボソーム結合配列と、iii）コード配列とを含む。
いくつかの態様では、第1または第2のセンサー部分のいずれかが、プロモーターと、リボソーム結合部位と、コード配列の5’部分とを含み、残りのセンサー部分が残りのコード配列を含む。いくつかの態様では、第1のセンサー部分は、5’から3’方向に、i）プロモーター、ii）RBS、iii）開始コドンおよび少なくとも1つの追加のコドンを含む、コード配列の第1の部分、iv）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態の3’ハイブリダイゼーション領域を含み、第2のセンサー部分は、5’から3’方向に、i）コード配列の第1の部分とインフレームかつコード配列の第2の部分とインフレームのリーディングフレームの形態の5’ハイブリダイゼーション領域と、ii）5’ハイブリダイゼーション領域の下流で、かつ5’ハイブリダイゼーション領域とインフレームで連結された、コード配列の第2の部分とを含む。
いくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域の少なくとも一部は、プロモーター内、リボソーム結合部位内、またはコード配列内にある。いくつかの態様では、5’ハイブリダイゼーション領域の少なくとも一部は、プロモーター内、リボソーム結合部位内、またはコード配列内にある。いくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域は、プロモーター内にも、リボソーム結合部位内にも、コード配列内にもない。いくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域は、第1のセンサー部分内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の3’である。いくつかの態様では、5’ハイブリダイゼーション領域は、プロモーター内にも、リボソーム結合部位内にも、コード配列内にもない。いくつかの態様では、5’ハイブリダイゼーション領域は、第2のセンサー部分の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の5’である。
いくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域は、合計で少なくとも12ヌクレオチド長である。いくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域は、それぞれ少なくとも6ヌクレオチド長である。
いくつかの態様では、第1および第2のセンサー部分は同じ分子上にある。いくつかの態様では、第1および第2のセンサー部分が単一の分子を形成するように、第1のセンサー部分の5’末端が、介在するssDNA配列を介して第2のセンサー部分の3’末端に連結されている。いくつかの態様では、システムは、非鋳型発現カセット内の配列に相補的な、または介在するssDNA配列に相補的なプライマーをさらに含む。いくつかの態様では、第1および第2のセンサー部分は、少なくとも2つの別個の分子上にある。
いくつかの態様では、第1のセンサー部分の5’末端は、末端ヘアピンループを形成する配列をさらに含む。いくつかの態様では、システムは、第2のセンサー部分の3’領域に相補的なプライマーをさらに含む。いくつかの態様では、システムは、第2のセンサー部分内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の3’である配列に相補的なプライマーをさらに含む。いくつかの態様では、システムは、第2のセンサー部分内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の領域5’に相補的なプライマーをさらに含む。いくつかの態様では、第2のセンサー部分は、末端ヘアピンループ内にプライマーを含むその3’末端に、ヌクレオチド配列をさらに含む。
いくつかの態様では、DNA発現カセットのコード配列は、ポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、ポリペプチドは、レポータータンパク質である。いくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域は、レポータータンパク質の溶媒曝露ループをコードする領域内のコード配列に位置する。いくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域は、レポータータンパク質のコード配列に位置し、レポーター遺伝子機能に実質的に影響を及ぼさない。いくつかの態様では、レポータータンパク質は、ルシフェラーゼと、ナノルシフェラーゼと、βラクタマーゼと、βガラクトシダーゼと、ホースラディッシュペルオキシダーゼと、アルカリホスファターゼと、カタラーゼと、炭酸脱水酵素と、緑色蛍光タンパク質と、赤色蛍光タンパク質と、シアン蛍光タンパク質と、黄色蛍光タンパク質と、トリプシンと、プロテアーゼと、短縮型レポータータンパク質を補完および活性化するペプチドと、アッセイによって検出可能なポリペプチドとを含む。
いくつかの態様では、核酸センサーシステムは、無細胞発現システムをさらに含む。いくつかの態様では、核酸センサーシステムは、リガーゼをさらに含む。いくつかの態様では、核酸センサーシステムは、逆転写酵素をさらに含む。いくつかの態様では、核酸センサーシステムは、DNAにハイブリダイズしているRNAを加水分解するリボヌクレアーゼをさらに含む。いくつかの態様では、リボヌクレアーゼは、RNAse Hである。
いくつかの態様では、核酸センサーシステムは、リガーゼ、鎖置換DNAポリメラーゼ、dNTP、RNAse阻害剤、および無細胞発現システムのうちの1つまたは複数をさらに含む。いくつかの態様では、無細胞発現システムは、全細胞抽出物である。いくつかの態様では、核酸センサーシステムはDNAポリメラーゼをさらに含む。いくつかの態様では、DNAポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ部分を有するクレノウ断片、エキソヌクレアーゼ部分を有しないクレノウ断片、phi29ポリメラーゼ、改変T7 DNAポリメラーゼ、サイクロバチルス（Psychrobacillus）由来のポリメラーゼ、鎖置換が増強されたサイクロバチルス由来のポリメラーゼ、B. スブチリス（B. subtilis）由来のポリメラーゼ、シーケナーゼバージョン2.0、Bsu DNAポリメラーゼ大断片、Bst 3.0 DNAポリメラーゼ、Phusion（登録商標）高忠実性DNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ部分を有しないVent（登録商標）DNAポリメラーゼ、Vent（登録商標）DNAポリメラーゼ、Q5（登録商標）高忠実性DNAポリメラーゼ、およびDNAポリメラーゼI大（クレノウ）断片からなる群より選択される。
いくつかの態様では、標的核酸の多型が、第1のセンサー部分のハイブリダイゼーション領域の配列3’と、第2のセンサー部分のハイブリダイゼーション領域の5’とにハイブリダイズする。いくつかの態様では、第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域または第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域は、標的核酸の多型にハイブリダイズするように構成される。いくつかの態様では、第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域の遊離末端または第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域の遊離末端は、標的核酸の多型にハイブリダイズするように構成される。いくつかの態様では、多型のハイブリダイゼーション配列は、第1のセンサー部分のハイブリダイゼーション領域の最も3’側の塩基および第2のセンサー部分のハイブリダイゼーション領域の5’側の塩基のうちの一方または両方を含む。いくつかの態様では、標的核酸ハイブリダイゼーション領域は、1つまたは複数の多型を含む。
本発明の局面は、試料中の標的核酸を検出するための方法であって、a）標的核酸を含む試料を提供する工程、b）発現カセットの第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域および第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域に対する標的核酸のハイブリダイゼーションに好適な条件下、リガーゼの存在下で、標的核酸を含む試料と、本明細書において記載される核酸センサーシステムとを接触させて、それによって、互いに動作可能に連結された第1のセンサー部分および第2のセンサー部分にハイブリダイズした標的核酸を含む反応生成物を生成する工程、c）レポータータンパク質の生成に好適な条件下、鎖置換DNAポリメラーゼおよびプライマーの存在下で、工程b）で生成された反応生成物と、無細胞発現システムとを接触させる工程、d）工程c）で生成された反応生成物と、レポータータンパク質の発現の検出を可能にする試薬とを接触させる工程、e）工程d）で生成されたレポータータンパク質の発現を測定して、試料中の標的核酸の存在および/または量を決定する工程を含む方法を記載する。いくつかの態様では、リガーゼは、無細胞システムの一部として提供される。
本発明の局面は、試料中の標的核酸を検出するための方法であって、a）標的核酸を含む試料を提供する工程、b）発現カセットの第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域および第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域に対する標的核酸配列のハイブリダイゼーションに好適な条件下、リガーゼおよび任意でプライマーの存在下で、標的核酸を含む試料と、本明細書において記載される核酸センサーシステムとを接触させて、それによって、互いに動作可能に連結された第1のセンサー部分および第2のセンサー部分にハイブリダイズした標的核酸を含む反応生成物を生成する工程、c）レポータータンパク質の生成に好適な条件下、鎖置換DNAポリメラーゼの存在下で、工程b）で生成された反応生成物と、無細胞発現システムとを接触させる工程、d）工程c）で生成された反応生成物と、レポータータンパク質の発現の検出を可能にする試薬とを接触させる工程、e）工程d）で生成されたレポータータンパク質の発現を測定して、試料中の標的核酸の存在および/または量を決定する工程を含む方法を記載する。
本発明の局面は、試料中の標的核酸を検出するための方法であって、a）標的核酸を含む試料を提供する工程、b）発現カセットの第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域および第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域に対する標的核酸のハイブリダイゼーションに好適かつレポータータンパク質の生成に好適な条件下で、標的核酸を含む試料を、i）リガーゼの存在下で、本明細書において記載される核酸センサーシステムと、ならびにii）鎖置換DNAポリメラーゼおよびプライマーの存在下で、無細胞発現システムと、接触させる工程、c）工程b）で生成された反応生成物と、レポータータンパク質の発現の検出を可能にする試薬とを接触させる工程、d）工程d）で生成されたレポータータンパク質の発現を測定して、試料中の標的核酸の存在および/または量を決定する工程を含む方法を記載する。いくつかの態様では、リガーゼは、無細胞システムの一部として提供される。いくつかの態様では、リガーゼは、無細胞システムの一部として提供される。
本発明の局面は、試料中の標的核酸を検出するための方法であって、a）標的核酸配列を含む試料を提供する工程、b）発現カセットの第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域および第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域に対する標的核酸のハイブリダイゼーションに好適かつレポータータンパク質の生成に好適な条件下で、標的核酸配列を含む試料を、i）リガーゼの存在下で、本明細書において記載される核酸センサーシステムと、ii）鎖置換DNAポリメラーゼおよびプライマーの存在下で、無細胞発現システムと、ならびにiii）レポータータンパク質の発現の検出を可能にする試薬と、接触させる工程、c）工程b）で生成されたレポータータンパク質の発現を測定して、試料中の標的核酸の存在および/または量を決定する工程を含む方法を記載する。いくつかの態様では、リガーゼは、無細胞システムの一部として提供される。
本発明の局面は、包装材内に核酸センサーシステムを含む組成物と、試料採取装置と、陽性対照と、使用説明書とを含むキットを記載する。
核酸検出技術の図。無細胞発現システムでは、標的核酸を含有する試料（破線）が核酸センサー部分（A、B、p）と組み合わされる。センサー部分（i’、ii’）の接合部は、標的核酸（i、ii）にハイブリダイズし、リガーゼによってAおよびBが一本鎖にライゲーションするのを可能にするように設計される。DNAポリメラーゼは、プライマーpを伸長して、無細胞発現システムによって転写され、検出可能なレポーター（例えば、酵素、または容易に検出可能な非触媒ポリペプチド）に翻訳される機能的な二本鎖発現カセットを作成する。 センサーシステムの核酸構成要素を示す図。（図2A）非鋳型（センス）ssDNA鎖と、コード配列の開始コドンの後に分割部位とを有するセンサーシステムの一態様。ハイブリダイゼーション領域および標的RNAを網掛けで示し、Bドメイン上の5’ホスフェート（P）を示す。Aドメインは、プロモーター、リボソーム結合部位（RBS）、ATG開始コドンおよび3’ハイブリダイゼーション領域（網掛け）を含む。Bドメインは、5’ホスフェート（P）、5’ハイブリダイゼーションドメイン（網掛け）およびコード配列を含む。プライマーも示されている。（図2B）代替的なセンサー構成要素スキーム:（i）それぞれ5’末端および3’末端で連結されたAドメインおよびBドメイン、（ii）Bドメインの末端ヘアピンとしてssDNAプライマーを組み込むAドメインおよびBドメイン、または（iii）Aドメインの5’末端およびBドメインの3’末端の両方にヘアピンを含むAドメインおよびBドメイン。 センサーシステム構成要素の3つのバージョンを示す図。バージョン1では、発現カセットは、コード配列の開始コドン（ATG）の後で、A部分とB部分とに分割されている。バージョン2では、発現カセットは、プロモーター（P）とリボソーム結合部位（RBS）との間でA部分とB部分とに分割されている。バージョン3では、発現カセットは、コード配列内でA部分とB部分とに分割されている。挿入された標的ハイブリダイゼーション領域は、バージョン1および2の設計では斜線付きボックスとして示されている。バージョン3は挿入された配列は含まず、代わりに、接合部位に隣接するレポーターコード配列に一致する標的配列を有する。B部分の3’末端にハイブリダイズするプライマーが示されている。 図4A〜図4C:各設計バージョンのインタクトなdsDNA発現カセット（AB）対個々のdsDNA A部分またはB部分（B_T1、B_T2、A_T3）の測定された発光を示す棒グラフ。（図4A）バージョン1システムに関してのみ、2つの異なる挿入されたハイブリダイゼーション領域AB_T1およびAB_T2を有する発現カセットと、B部分とを比較した。（図4B）バージョン2システムに関してのみ、2つの異なる挿入されたハイブリダイゼーション領域AB_T1およびAB_T2を有する発現カセットと、B部分とを比較した。（図4C）バージョン3の発現カセットと、対応するA部分とを比較した。RLU＝相対発光単位。 図4Aの説明を参照のこと。 図4Aの説明を参照のこと。 バージョン1（v1）センサーシステムによる様々な量の標的RNA（T2）の検出を示す棒グラフ。反応には、0pM〜10.9nMの濃度の標的RNAを含めた。非相補的RNA配列（オフ標的）も10.9nMで試験した。（図5A）ライゲーションされた接合部を介したプライマー伸長のために、クレノウ断片+exo DNAポリメラーゼを使用した。（図5B）ライゲーションされた接合部を介したプライマー伸長のために、シーケナーゼDNAポリメラーゼを使用した。ブランク＝空のウェル、RLU＝相対発光単位。 v1センサーシステムによる様々な量の標的T1 RNAの検出を示す棒グラフ。反応には、0〜1.44pMの濃度の標的RNAを含めた。これらの反応ではライゲーション工程は15分であり、1時間後に発光を測定した。RLU＝相対発光単位。 いくつかのT1標的RNA濃度（0〜50pM）でのv1センサー性能と、0〜2600ngのバックグラウンド（bg）RNA量の増加との比較を示す棒グラフ。RLU＝相対発光単位 水、RNA抽出物（RNAex）および熱溶解全細胞抽出物（WCex）のバックグラウンドに添加されたT1標的のv1センサー性能の比較を示す棒グラフ。RLU＝相対発光単位。 v1センサー性能と、細胞材料の均等物に対応するRNA抽出物（RNAex）または熱溶解全細胞抽出物（WCex）から直接得られたT2検出との比較を示す棒グラフ。RLU＝相対発光単位。 プールされたヒト唾液のバックグラウンドを増加させた（0〜70.8％）T1検出によるv1センサー性能を示す棒グラフ。RLU＝相対発光単位。 図11A〜図11D:バージョン3センサーシステムのRNAを介した活性化のプロセスにおける様々なDNAポリメラーゼの性能を示す棒グラフ。リガーゼおよび標的を用いない反応（-LT）と比較して、リガーゼおよびRNA T2標的（+LT）の存在下で発現カセットを活性化するのに、（図11A）クレノウ断片+exo、（図11B）クレノウ断片-exo、（図11C）phi29ポリメラーゼおよび（図11D）シーケナーゼDNAポリメラーゼはいずれも有効であった。RLU＝相対発光単位。 図11Aの説明を参照のこと。 図11Aの説明を参照のこと。 図11Aの説明を参照のこと。 A部分およびB部分の両方が同じssDNA配列上にあり、BがAの5’になっているv1の代替的なセンサー構成要素スキームの試験を示す棒グラフ。一方はT7ターミネータードメイン（CSt）を用いてRNA転写物を終結させ、他方は3つの反復終止コドン（CSs）を含む2つの構築物を試験した。棒グラフは、性能と、様々な濃度（0〜200pM）でのT1またはT2標的RNAの検出との比較を示している。RLU＝相対発光単位。 v1の標的のハイブリダイゼーション領域内に導入された一塩基変異（SNV）または一塩基多型（SNP）の識別を示す棒グラフ。4つの異なる変異体（例えば、SNP-UG、SNP-AA、SNP-GA、SNP-GG）を試験した。RLU＝相対発光単位。 図14A〜図14C:v1を使用した複数のDNAポリメラーゼの試験を示す棒グラフ。（図14A）標的RNA配列を有しない陰性対照（-RNA）と対比した、CT標的RNA配列（+RNA）を標的とするインビトロ検出システムにおけるポリメラーゼ（特に指定のない限り、1反応当たり4単位）の性能。IsoPol（サイクロバチルス由来のポリメラーゼ）、IsoPol SD+（鎖置換が増強されたサイクロバチルス由来のポリメラーゼ）、Bsu（B. スブチリス由来のポリメラーゼ）。RLU＝相対発光単位。（図14B）これらの測定値に基づくシグナル対バックグラウンド比（S:B比）が各ポリメラーゼについて示されている。（図14C）1.7〜4Uまでの異なる量のIsoPol SD+単位を使用したS:B比。 図14Aの説明を参照のこと。 図14Aの説明を参照のこと。 ナノルシフェラーゼ酵素（NLuc）の発現カセットを分割し、溶媒曝露ループに標的ハイブリダイゼーション配列を挿入する試験を示す棒グラフ。（図15A）示された溶媒曝露ループ領域にハイブリダイゼーション配列が挿入されたNlucの活性。（図15B）記載されているように、A内の分割位置と標的CT配列とに基づいてssDNAセンサー部分を構築し、100nM標的CT RNAの検出についてこれらを試験した。RLU＝相対発光単位。 分割ルシフェラーゼ構築物の独立した転写/翻訳からのバックグラウンドを試験するために使用された構築物の概略図。各PCR産物は、T7プロモーターと、それに続くRBSおよびATG開始コドンと、ナノルシフェラーゼの断片と、終止コドンとを有する。例えば、分割部位1の場合、A部分は、配列1からのアミノ酸1〜17をコードするDNA配列であり、B部分は、アミノ酸18〜170をコードするDNA配列である。 無細胞発現システムで試験された分割ルシフェラーゼ構築物の発光シグナルを示す棒グラフ。全長構築物は、T7駆動PCR産物を含有する完全なルシフェラーゼであり、陰性構築物は、PCR産物を加えていない反応物である。
発明の詳細な説明
本明細書において、標的核酸の存在下での活性化のために設計された非機能的で不活性な発現カセットに基づく核酸センサーシステムが記載されている。活性化は、例えば、標的分子に対する複数の別個のカセット分子のハイブリダイゼーションによって起こり、それによって、カセット分子を会合させ、機能的である完全なカセットを提供することができる。活性で機能的な発現カセットは、無細胞発現システムで転写され、コードされたタンパク質またはポリペプチドに翻訳される。無細胞発現システムは、生細胞の状況の外で、細胞膜の制約を伴わず動作する細胞機構を含む。コードされたタンパク質またはポリペプチドは、直接的または間接的に検出され得る。
無細胞発現システムとは、DNAからRNAへの転写と、RNAからタンパク質への翻訳とを含む、発現カセットからのタンパク質生成に必要な分子機構、ビルディングブロック構成要素およびエネルギー分子のいずれも含むインビトロシステムである。発現カセットからのタンパク質生成に必要な分子機構には、RNAポリメラーゼ、リボソームおよびtRNAが含まれるが、それに限定されるわけではない。無細胞発現システムは、細胞全体が膜破壊によって溶解されて外部発現が可能になる細胞抽出物に基づくか、細胞から精製された転写および翻訳機構に基づき得る。いずれの場合も、これらのシステムは、ATPなどのエネルギー構成要素とともに、dNTPおよびアミノ酸などのビルディングブロック構成要素により補足され得る。
本明細書において記載されるように、発現カセットのプロモーター、リボソーム結合部位（RBS）およびタンパク質コード配列は、2つの一本鎖DNA（ssDNA）核酸またはドメインに分離される。発現カセットを2つの部分（例えば、第1の核酸またはドメイン、および第2の核酸またはドメイン）に分離し、非鋳型（センス）ssDNAを使用すると、発現カセットは、レポータータンパク質の転写および翻訳に対して非機能的になる。本明細書において使用される場合、「非鋳型」は、そこからmRNAが転写され得る鋳型鎖に相補的なDNA鎖を示す。したがって、非鋳型鎖を直接mRNAに転写することはできない。本明細書において使用される場合、「センス」は、DNA鎖が、コードされたmRNAと同じ鎖であることを示す。特定の単位または構成要素を「コードする」核酸は、その特定の単位または構成要素を転写する（および任意で翻訳する）ために必要な配列を含む核酸である。そのような転写が起こるためには鋳型鎖を合成する介在工程が必要である場合があるが、遺伝情報は核酸の配列または構造に固有であるため、核酸は依然としてその単位または構成要素をコードすると言われる。本明細書において使用される場合、「非機能的」は、プロモーター、RBSおよびコード配列がいずれも同じ鎖および/または分子上に存在するわけではないため、レポータータンパク質をコードするmRNAにDNA鎖または分子を転写することができないことを示す。
核酸センサーシステムの部分は、標的核酸（RNAまたはssDNA）が、ハイブリダイゼーション部位および/または接合部位で核酸またはドメインをハイブリダイズおよび架橋し、リガーゼが2つの核酸またはドメインを一本鎖に接続することが可能になり得るように設計される。DNAポリメラーゼによる、結合/接続/ライゲーションされた非鋳型（センス）鎖の3’領域に相補的な「プライマー」のその後の伸長は、RNAポリメラーゼによって転写され、レポータータンパク質に翻訳され得る機能的なdsDNA発現カセットの形成をもたらす（例えば、図1を参照）。
本明細書において、第1の核酸および第2の核酸を含む核酸センサーシステムが記載されている。第1および第2の核酸は、それぞれ分子または配列であり得る。第1の核酸は3’ハイブリダイゼーション領域を含む。3’ハイブリダイゼーション領域は、第1の核酸の3’末端に位置する。3’ハイブリダイゼーション領域は、標的核酸の第1の領域に相補的である。第2の核酸は5’ハイブリダイゼーション領域を含む。5’ハイブリダイゼーション領域は、第2の核酸の5’末端に位置する。5’ハイブリダイゼーション領域は、標的核酸の第2の領域に相補的である。任意の局面のいくつかの態様では、標的核酸の第1および第2の領域は、互いに隣接し、近接し、および/または連続している。
第1の核酸および第2の核酸は、標的核酸によって架橋されるか、近接させられ得る。標的核酸の第1の領域は、第1の核酸の上流のハイブリダイゼーション領域（例えば、3’ハイブリダイゼーション領域）にハイブリダイズする。標的核酸の第2の領域は、第2の核酸の下流のハイブリダイゼーション領域（例えば、5’ハイブリダイゼーション領域）にハイブリダイズする。標的核酸の第1および第2の領域は互いに隣接し、近接し、および/または連続しているため、第1の核酸の3’ハイブリダイゼーション領域は、第2の核酸の5’ハイブリダイゼーション領域に近接させられる。任意の局面のいくつかの態様では5’ホスフェートを含む3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域は、リガーゼによって結合、接続またはライゲーションされ得る。ライゲーションされた第1および第2の核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、およびレポータータンパク質のコード配列をコードする非鋳型カセットを形成する。任意の局面のいくつかの態様では、第1および第2の核酸は、リガーゼによって一緒にライゲーションされた場合、第1および第2のドメインと呼ばれる。第1および第2の核酸は、別個の分子または配列であり得るが、第1および第2のドメインは、第1および第2の核酸のハイブリダイゼーションおよびライゲーションに続いて、同じ分子または配列上に位置し得る。
任意の局面のいくつかの態様では、第1の核酸および第2の核酸は、一緒にライゲーションされた場合に、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列とを含む非鋳型カセットをコードするように構成される。任意の局面のいくつかの態様では、第1の核酸および第2の核酸は、一緒にライゲーションされ、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域にハイブリダイズする標的核酸にハイブリダイズした場合に、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列とを含む非鋳型カセットをコードするように構成される。任意の局面のいくつかの態様では、カセット内に、標的核酸ハイブリダイゼーション配列が位置しており、カセットは第1の核酸および第2の核酸に分離されており、分離はハイブリダイゼーション領域内で生じている。
任意の局面のいくつかの態様では、第1の核酸はプロモーターを含み、第2の核酸はレポータータンパク質のコード配列を含む。任意の局面のいくつかの態様では、第1の核酸は、プロモーターおよびリボソーム結合部位を含み、第2の核酸は、レポータータンパク質のコード配列を含む。
任意の局面のいくつかの態様では、システムは、第2の核酸の3’領域に相補的な、または第2の核酸もしくはドメイン内のコード配列の3’である配列に相補的なプライマーをさらに含む。任意の局面のいくつかの態様では、システムは、第2の核酸の3’領域に相補的な、または第2の核酸もしくはドメイン内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、もしくはコード配列の3’である配列に相補的なプライマーをさらに含む。任意の局面のいくつかの態様では、第1の核酸および第2の核酸はDNAである。任意の局面のいくつかの態様では、第1の核酸および第2の核酸は、ssDNAである。
本明細書において、a）i）プロモーター、ii）RBS、iii）レポータータンパク質のコード配列を含む、非機能的一本鎖非鋳型形態のDNA発現カセットであって、カセット内に標的核酸ハイブリダイゼーション配列が挿入されており、カセットが2つの核酸またはドメインに分離されており、分離がハイブリダイゼーション領域内で生じている、DNA発現カセット、b）発現カセットの3’領域に相補的な、または第2の核酸もしくはドメイン内のコード配列の3’である配列に相補的な一本鎖DNAプライマー、c）リガーゼおよび無細胞発現システムを含む核酸センサーシステムがさらに記載されている。
本明細書において、a）i）プロモーター、ii）RBS、iii）レポータータンパク質のコード配列を含む、非機能的一本鎖非鋳型形態のDNA発現カセットであって、カセット内に標的核酸ハイブリダイゼーション配列が挿入されており、カセットが2つの分子、配列、核酸またはドメインに分離されており、分離がハイブリダイゼーション領域内で生じている、DNA発現カセット、b）発現カセットの3’領域に相補的な、または第2の核酸もしくはドメイン内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、もしくはコード配列の3’である配列に相補的な一本鎖DNAプライマー、c）リガーゼおよび無細胞発現システムを含む核酸センサーシステムがさらに記載されている。
本明細書において、いくつかの局面または態様ではバージョン1（v1）核酸システムと呼ばれる核酸センサーシステムが記載されている（例えば、図3を参照）。任意の局面のいくつかの態様では、第1の核酸またはドメインは、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列の開始コドンとを含み、第2の核酸またはドメインは、レポータータンパク質の残りのコード配列を含む。任意の局面のいくつかの態様では、この核酸システムは、a）5’から3’方向に、i）プロモーター、ii）RBS、iii）開始コドン、およびiv）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態の3’ハイブリダイゼーション領域の非鋳型（センス）鎖を含む第1のssDNA核酸またはドメインと、b）5’から3’方向に、i）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態の5’ハイブリダイゼーション領域、およびii）ハイブリダイゼーション領域の下流で、かつ開始コドンとインフレームで連結された、レポータータンパク質またはポリペプチドのコード配列の非鋳型（センス）鎖を含む第2のssDNA核酸またはドメインと、c）第2の核酸またはドメインの3’領域に相補的なssDNAプライマーとを含む。
任意の局面のいくつかの態様では、第1または第2の核酸またはドメインのいずれかが、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列の開始コドンとを含み、残りの核酸またはドメインが、レポータータンパク質の残りのコード配列を含む。任意の局面のいくつかの態様では、この核酸システムは、a）5’から3’方向に、i）プロモーター、ii）RBS、iii）開始コドン、およびiv）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態のハイブリダイゼーション領域の上流部分（例えば、3’ハイブリダイゼーション領域）の非鋳型（センス）鎖を含む第1のssDNA核酸またはドメインと、b）5’から3’方向に、i）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態のハイブリダイゼーション領域の下流部分（例えば、5’ハイブリダイゼーション領域）、およびii）ハイブリダイゼーション領域の下流で、かつ開始コドンとインフレームで連結された、レポータータンパク質のコード配列の非鋳型（センス）鎖を含む第2のssDNA核酸またはドメインと、c）第2のドメインの3’領域に相補的なssDNAプライマーとを含む。
本明細書において、いくつかの局面または態様ではバージョン2（v2）核酸システムと呼ばれる核酸センサーシステムがさらに記載されている（例えば、図3を参照）。任意の局面のいくつかの態様では、第1の核酸またはドメインは、プロモーターを含み、第2の核酸またはドメインは、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列とを含む。任意の局面のいくつかの態様では、この核酸システムは、a）5’から3’方向に、i）プロモーターおよびii）3’ハイブリダイゼーション領域の非鋳型（センス）鎖を含む第1のssDNA核酸またはドメインと、b）5’から3’方向に、i）5’ハイブリダイゼーション領域、ii）RBS、およびiii）レポータータンパク質のコード配列とインフレームで連結された開始コドンの非鋳型（センス）鎖を含む第2のssDNAドメインと、c）第2の核酸もしくはドメインの3’領域に相補的な、または第2の核酸もしくはドメイン内のコード配列の3’である配列に相補的なssDNAプライマーとを含む。
任意の局面のいくつかの態様では、第1または第2の核酸またはドメインのいずれかがプロモーターを含み、残りの核酸またはドメインが、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列とを含む。任意の局面のいくつかの態様では、この核酸システムは、a）5’から3’方向に、i）プロモーター、およびii）ハイブリダイゼーション領域の上流部分（例えば、3’ハイブリダイゼーション領域）の非鋳型（センス）鎖を含む第1のssDNA核酸またはドメインと、b）5’から3’方向に、i）ハイブリダイゼーション領域の下流部分（例えば、5’ハイブリダイゼーション領域）、ii）RBS、およびiii）レポータータンパク質のコード配列とインフレームで連結された開始コドンの非鋳型（センス）鎖を含む第2のssDNAドメインと、c）第2の核酸もしくはドメインの3’領域に相補的な、または第2の核酸もしくはドメイン内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、もしくはコード配列の3’である配列に相補的なssDNAプライマーとを含む。
本明細書において、いくつかの局面または態様ではバージョン3（v3）核酸システムと呼ばれる核酸センサーシステムが記載されている（例えば、図3を参照）。任意の局面のいくつかの態様では、第1の核酸またはドメインは、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列の5’部分とを含み、第2の核酸またはドメインは、レポータータンパク質の残りのコード配列を含む。任意の局面のいくつかの態様では、この核酸システムは、a）5’から3’方向に、i）プロモーター、ii）RBS、iii）例えば、開始コドンおよび少なくとも1つの追加のコドンを含む、レポータータンパク質のコード配列の上流部分とインフレームで連結された開始コドン、ならびにiv）レポータータンパク質のコード配列の上流部分の下流で、かつレポータータンパク質のコード配列の上流部分とインフレームで連結された、リーディングフレームの形態の3’ハイブリダイゼーション領域の非鋳型（センス）鎖を含む第1のssDNA核酸またはドメインと、b）5’から3’方向に、i）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態の5’ハイブリダイゼーション領域、およびii）ハイブリダイゼーション領域の下流部分の下流で、かつハイブリダイゼーション領域の下流部分とインフレームで連結された、レポータータンパク質のコード配列の下流部分の非鋳型（センス）鎖を含む第2のssDNA核酸またはドメインと、c）その3’末端で第2の核酸ドメインに相補的な、または第2の核酸もしくはドメイン内のコード配列の3’である配列に相補的なssDNAプライマーとを含む。
任意の局面のいくつかの態様では、第1または第2の核酸またはドメインのいずれかが、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列の5’部分とを含み、残りの核酸またはドメインが、レポータータンパク質の残りのコード配列を含む。任意の局面のいくつかの態様では、この核酸システムは、a）5’から3’方向に、i）プロモーター、ii）RBS、iii）例えば、開始コドンおよび少なくとも1つの追加のコドンを含む、レポータータンパク質のコード配列の上流部分とインフレームで連結された開始コドン、ならびにiv）レポータータンパク質のコード配列の上流部分の下流で、かつレポータータンパク質のコード配列の上流部分とインフレームで連結された、リーディングフレームの形態のハイブリダイゼーション領域の上流部分（例えば、3’ハイブリダイゼーション領域）の非鋳型（センス）鎖を含む第1のssDNA核酸またはドメインと、b）5’から3’方向に、i）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態のハイブリダイゼーション領域の下流部分（例えば、5’ハイブリダイゼーション領域）、およびii）ハイブリダイゼーション領域の下流部分の下流で、かつハイブリダイゼーション領域の下流部分とインフレームで連結された、レポータータンパク質のコード配列の下流部分の非鋳型（センス）鎖を含む第2のssDNA核酸またはドメインと、c）その3’末端で第2の核酸ドメインに相補的な、または第2の核酸もしくはドメイン内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、もしくはコード配列の3’である配列に相補的なssDNAプライマーとを含む。
任意の局面のいくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域は、レポータータンパク質またはポリペプチドのコード配列に位置する（例えば、v3核酸センサーシステム）。任意の局面のいくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域は、レポータータンパク質の溶媒曝露ループをコードする領域内に位置する。本明細書において使用される場合、「溶媒曝露ループ」は、タンパク質の外部（溶媒）側にあるタンパク質の領域を指す。溶媒曝露ループは、タンパク質の他の領域よりも立体構造的に柔軟であり得る。溶媒曝露ループとは、外因性の単数または複数の核酸配列（例えば、3’および5’ハイブリダイゼーション領域）の挿入に最適な部位を表し得る。外因性の核酸配列を溶媒曝露ループに挿入すると、タンパク質の通常の構造および機能が損なわれない可能性が高くなり得る。非限定的な例として、ナノルシフェラーゼへの3’および5’ハイブリダイゼーション領域の挿入のために試験または使用される特定の溶媒曝露ループ部位には、E50-N51、L66-S67、G123-K124、G135-N136またはN145-P146が含まれる（例えば、実施例17を参照）。別の非限定的な例として、ナノルシフェラーゼへの3’および5’ハイブリダイゼーション領域の挿入のために試験または使用される特定の溶媒曝露ループ部位には、Y17-N18、G26-G27、S29-S30、G36-G37、E50-N51、L66-S67、K79-V80、D86-H87、D101-G102、R113-P114、G123-K124、G135-N136、N145-P146およびN157-G148が含まれる（例えば、実施例18を参照）。任意の局面のいくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域は、レポータータンパク質のコード配列に位置し、レポーター遺伝子機能に実質的に影響を及ぼさないか、タンパク質間相互作用またはタンパク質-小分子相互作用を介した検出を可能にする構造化領域に位置する。
任意の局面のいくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域の少なくとも一部は、プロモーター内、リボソーム結合部位内、またはコード配列内にある。任意の局面のいくつかの態様では、5’ハイブリダイゼーション領域の少なくとも一部は、プロモーター内、リボソーム結合部位内、またはコード配列内にある。任意の局面のいくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域は、プロモーター内にも、リボソーム結合部位内にも、コード配列内にもないか、それらと同一の範囲に及ばない。任意の局面のいくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域は、第1の核酸またはドメイン内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の3’である。任意の局面のいくつかの態様では、5’ハイブリダイゼーション領域は、プロモーター内にも、リボソーム結合部位内にも、コード配列内にもないか、それらと同一の範囲に及ばない。任意の局面のいくつかの態様では、5’ハイブリダイゼーション領域は、第2の核酸内の任意のプロモーター、リボソーム結合部位、またはコード配列の5’である。
前述の様々な態様では、第1および第2のssDNA核酸またはドメインは、別個のDNA断片であり、第2のssDNA核酸またはドメインは、5’ホスフェートを含む。任意の局面のいくつかの態様では、第2のssDNA核酸またはドメインは、末端ヘアピンループ内にssDNAプライマーを含むその3’末端に、ヌクレオチド配列またはリンカーをさらに含む（例えば、図2B（ii）または図2B（iii）を参照）。任意の局面のいくつかの態様では、第1の核酸またはドメインの5’末端は、末端ヘアピンループを形成する配列またはリンカーをさらに含む（例えば、図2B（iii）を参照）。任意の局面のいくつかの態様では、第1および第2のドメインが単一のssDNA配列上に存在するように、第1の核酸またはドメインの5’末端が、介在するssDNA配列を介して第2の核酸またはドメインの3’末端に連結されている（例えば、図2B（i）を参照）。
任意の局面のいくつかの態様では、完全なハイブリダイゼーション領域（例えば、3’および5’ハイブリダイゼーション領域の両方）は、少なくとも12〜60ヌクレオチドである。任意の局面のいくつかの態様では、完全なハイブリダイゼーション領域は、少なくとも12〜40ヌクレオチドである。任意の局面のいくつかの態様では、完全なハイブリダイゼーション領域は、少なくとも12〜36ヌクレオチドである。任意の局面のいくつかの態様では、完全なハイブリダイゼーション領域は少なくとも12ヌクレオチドである。任意の局面のいくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域（例えば、ハイブリダイゼーション領域の上流部分）および5’ハイブリダイゼーション領域（例えば、ハイブリダイゼーション領域の下流部分）は、それぞれ少なくとも6〜20ヌクレオチドである。任意の局面のいくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域は、それぞれ少なくとも6〜18ヌクレオチドである。任意の局面のいくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域は、それぞれ少なくとも18ヌクレオチドである。任意の局面のいくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域は、それぞれ少なくとも6ヌクレオチドである。
任意の局面のいくつかの態様では、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域は標的核酸の一部に相補的であり、その結果、3’および5’ハイブリダイゼーション領域への標的核酸のハイブリダイゼーションが、生産的なライゲーションが起こるのに十分な接合部を第1の核酸またはドメインと第2の核酸またはドメインとの間に作成する。任意の局面のいくつかの態様では、ハイブリダイゼーション領域と、標的核酸の相補的標的部分とは、80〜85％、85％〜90％、90〜95％、95〜99％もしくは99％またはさらに多くのパーセント同一性だけ相補的であり、ここで、パーセント同一性は、n個のヌクレオチドの2つの配列間の比較ウィンドウを選択することによって確立され、比較内の相補的塩基対の程度は、比較ウィンドウ内のn個のヌクレオチドによって分類されるか、当業者に容易に公知であるパーセント同一性を決定するための任意の他の技術によって分類される。核酸またはドメインの接合部とは、2つの分子もしくはドメインが物理的に接触している点、または2つの分子もしくはドメインのライゲーションがその接合部で互いにライゲーションすることができるように配置されている点を指し得る。
任意の局面のいくつかの態様では、核酸センサーシステムは、第2の核酸の3’領域に相補的なプライマーを含む。任意の局面のいくつかの態様では、プライマーは、第2の核酸またはドメイン内のコード配列の3’である配列に相補的である。任意の局面のいくつかの態様では、プライマーは、第2の核酸またはドメイン内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の3’である配列に相補的である。任意の局面のいくつかの態様では、プライマーはssDNAである。任意の局面のいくつかの態様では、プライマーは、第2の核酸またはドメインに結合し、非鋳型鎖に相補的な鋳型鎖のDNA重合を可能にする。任意の局面のいくつかの態様では、プライマーはSEQ ID NO:19である。
レポータータンパク質とは、（例えば、化合物を検出可能な生成物に転換する反応を触媒することによって、または検出を可能にする別の分子に結合することによって）検出可能なシグナルを提供する、および/または検出可能なシグナルを生成する能力を含むものである。検出可能なシグナルは、例えば、蛍光または発光を含み得る。検出可能なシグナル、それらを検出する方法、およびそれらを試薬（例えば、レポータータンパク質を含むポリペプチド）に組み込む方法は、当技術分野において周知である。任意の局面のいくつかの態様では、検出可能なシグナルは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電磁的手段、放射化学的手段または化学的手段、例えば蛍光、化学蛍光もしくは化学発光、または任意の他の適切な手段によって検出され得るシグナルを含み得る。任意の局面のいくつかの態様では、レポータータンパク質は、ルシフェラーゼ、ナノルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、βガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、カタラーゼ、炭酸脱水酵素、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、トリプシン、プロテアーゼ、短縮型レポータータンパク質を補完および活性化するペプチド、キナーゼからなる群より選択される。
任意の局面のいくつかの態様では、システムは、リガーゼ、RNAポリメラーゼ、鎖置換DNAポリメラーゼ、dNTP、RNAse阻害剤、および無細胞発現システムのうちの1つまたは複数を含む。任意の局面のいくつかの態様では、システムはまた、機能的RNaseHドメインを有する逆転写酵素を含み得る。任意の局面のいくつかの態様では、システムは、別個の逆転写酵素活性およびRNaseH活性を含み得る。任意の局面のいくつかの態様では、無細胞発現システムは全細胞抽出物である。
本明細書において記載されるように、核酸システムは、a）i）発現カセットの3’領域に相補的な、ii）第2の核酸もしくはドメインの3’領域に相補的な、iii）第2の核酸もしくはドメイン内のコード配列の3’である配列に相補的な、またはiv）発現カセット内の任意のプロモーター、リボソーム結合部位もしくはコード配列の3’である配列に相補的な、一本鎖DNA（ssDNA）プライマー、b）リガーゼおよび/またはc）無細胞発現システムを含むことができる。
本明細書において記載されるように、核酸システムは、a）i）発現カセットの3’領域に相補的な、ii）第2の核酸もしくはドメインの3’領域に相補的な、iii）第2の核酸もしくはドメイン内の任意のプロモーター、リボソーム結合部位もしくはコード配列の3’である配列に相補的な、またはiv）発現カセット内の任意のプロモーター、リボソーム結合部位もしくはコード配列の3’である配列に相補的な、一本鎖DNA（ssDNA）プライマー、b）リガーゼおよび/またはc）無細胞発現システムを含むことができる。
本明細書において使用される場合、「ポリメラーゼ」は、長い核酸の合成を触媒する酵素を指す。本明細書において使用される場合、「鎖置換ポリメラーゼ」は、合成中に遭遇する下流のDNAまたはRNA（例えば、核酸センサーシステムにハイブリダイズした標的DNAまたはRNA）を置換または除去する能力を有するポリメラーゼを指す。DNAポリメラーゼは、様々な程度の鎖置換活性を示す。鎖置換活性の低いDNAポリメラーゼは、多くの場合、下流のDNAまたはRNAを越えてDNAを合成することができず、その結果、不完全なDNA重合をもたらす可能性がある。鎖置換活性の高いDNAポリメラーゼは、多くの場合、下流のDNAまたはRNAを越えてDNAを合成することができ、その結果、完全なDNA重合をもたらす。任意の局面のいくつかの態様では、鎖置換DNAポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ部分を有するクレノウ断片、エキソヌクレアーゼ部分を有しないクレノウ断片、phi29ポリメラーゼ、改変T7 DNAポリメラーゼ、サイクロバチルス由来のポリメラーゼ、鎖置換が増強されたサイクロバチルス由来のポリメラーゼ、およびB. スブチリス由来のポリメラーゼ（例えば、実施例13、実施例16を参照）からなる群より選択される。
任意の局面のいくつかの態様では、接合部（例えば、3’または5’ハイブリダイゼーション領域）は、標的核酸の多型に対してハイブリダイズするように構成される。任意の局面のいくつかの態様では、接合部または3’もしくは5’ハイブリダイゼーション領域の遊離末端は、標的核酸の多型にハイブリダイズするように構成される。任意の局面のいくつかの態様では、多型は、上流または下流のssDNAセンサードメインのいずれかまたは両方の上の、ハイブリダイゼーション領域の接合部にある2つの塩基の一方または両方に位置する。任意の局面のいくつかの態様では、1つまたは複数の多型は、ハイブリダイゼーション領域内に任意で導入され得る。非限定的な例として、4つの異なる例示的な変異体（多型）を試験した（例えば、実施例15を参照）。
任意の局面のいくつかの態様では、第1および第2の核酸は、別個の分子または配列であり得る。任意の局面のいくつかの態様では、第1および第2の核酸は、一緒にライゲーションされた際に、一緒にライゲーションされた後、またはリガーゼによって一緒にライゲーションされた後、第1および第2のドメインと呼ばれる。第1および第2の核酸は、別個の分子または配列であり得るが、第1および第2のドメインは、第1および第2の核酸のハイブリダイゼーションおよびライゲーションに続いて、同じ分子または配列上に位置し得る。
いくつかの態様では、本明細書において記載される核酸センサーシステムの1つまたは複数の構成要素は、固体基質にコンジュゲートされ得る。固体基質は、ビーズ、磁性マイクロビーズ、常磁性マイクロビーズ、微孔性膜、中空繊維、任意の他の流体濾過膜、流動装置、マイクロタイタープレート、試験管、細胞培養プレート、マイクロアレイプレート、ガラスビーズ、ラテックスビーズ、生細胞、生体組織または器官の細胞外マトリックス、および食細胞からなる群より選択され得る。任意の局面のいくつかの態様では、固体基質は、第1の核酸、第2の核酸、第1のドメイン、第2のドメイン、プライマーおよび/または標的核酸に付着またはコンジュゲートされ得る。任意の局面のいくつかの態様では、固体基質は、第1の核酸および/または第2の核酸に付着またはコンジュゲートされる。
本明細書において使用される場合、「核酸センサーシステムの構成要素」は、第1の部分、第2の部分、または第1の核酸、第2の核酸、または第1のドメイン、第2のドメイン、またはAドメイン、Bドメイン、または第1の配列、第2の配列、および/またはプライマー、および/または標的核酸を指す。限定されることなく、使用され得る例示的なタイプの基質には、核酸足場、生体分子（例えば、生細胞）または固体表面が含まれるが、それに限定されるわけではない。任意の局面のいくつかの態様では、固体表面は、固体表面に対する核酸センサーシステムの構成要素のコンジュゲーションを容易にするために、カップリング分子、例えば、アミノ基により官能化され得る。
基質表面に対する核酸センサーシステムの構成要素の付着は、複数のアプローチによって、例えば、基質表面に核酸センサーシステムの構成要素を直接架橋することによって;核酸マトリックス（例えば、DNAマトリックスまたはDNA/オリゴヌクレオチド折り紙構造）を介して、基質表面に核酸センサーシステムの構成要素を架橋することによって;デンドリマー様構造（例えば、PEG/キチン構造）を介して、基質表面に核酸センサーシステムの構成要素を架橋することによって;基質表面に収束磁場勾配を適用しながら、核酸センサーシステムの構成要素によってコーティングされた磁性マイクロビーズを基質表面に引き付けることによって、ビオチン-アビジンもしくはビオチン-アビジン様相互作用を介して、基質に核酸センサーシステムの構成要素を付着させることによって、または当技術分野において認識されている任意の他の方法によって行われ得る。
核酸センサーシステムの構成要素は、ハイブリダイゼーション領域を基質から離れる方向に向けるために適合させることができる。核酸センサーシステムの構成要素は、固体基質上の標的配列または結合パートナーに結合する核酸配列またはポリペプチド配列を含むことができる。あるいは、またはさらに、基質の表面は、本明細書において記載されるカップリング分子を含むように機能化され得る。本明細書において使用される場合、用語「カップリング分子」は、本明細書において記載される核酸センサーシステムの構成要素と選択的に結合することができる任意の分子または任意の官能基を指す。カップリング分子の代表的な例には、抗体、抗原、レクチン、タンパク質、ペプチド、核酸（それらの混合物であるか、ヌクレオチド誘導体または類似体を含むDNA、RNA、PNAおよび核酸）;インスリン受容体などの受容体分子;受容体のリガンド（例えば、インスリン受容体のインスリン）;ならびに別の分子に対して親和性を有する生物学的分子、化学的分子または他の分子、例えば、ビオチンおよびアビジンが挙げられるが、それに限定されるわけではない。カップリング分子は、天然に存在する分子全体を含む必要はないが、例えば、抗体のFab断片のように、天然または非天然に存在する分子の一部、断片またはサブユニットのみからなり得る。カップリング分子は、検出可能な標識をさらに含むことができる。カップリング分子はまた、核酸センサーシステムの構成要素に基質を結合することができる様々な官能基を包含することができる。そのような官能基の例には、アミノ基、カルボン酸基、エポキシ基およびトシル基が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
任意の局面のいくつかの態様では、核酸センサーシステムの構成要素は、共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用を介して基質表面にコンジュゲートされ得る。核酸センサーシステムの構成要素および/またはカップリング分子は、当業者に公知の方法のいずれかを使用して、共有結合的にまたは非共有結合的に固体基質の表面にコンジュゲートさせることができる。例えば、共有結合による固定化は、例えば、シランカップリングによって達成することができる。例えば、Weetall,15 Adv.Mol.Cell Bio.161（2008）;Weetall,44 Meths.Enzymol.134（1976）を参照されたい。核酸センサーシステムの構成要素および/またはカップリング分子と表面との間の共有結合性相互作用はまた、当技術分野において認識されている他の化学反応、例えば、NHS反応またはコンジュゲーション剤によって媒介され得る。核酸センサーシステムの構成要素および/またはカップリング分子と表面との間の非共有結合性相互作用は、イオン相互作用、ファンデルワールス相互作用、双極子-双極子相互作用、水素結合、静電相互作用および/または形状認識相互作用に基づいて形成され得る。
限定されることなく、コンジュゲーションは、安定または不安定な（例えば、切断可能な）結合またはコンジュゲーション剤のいずれかを含み得る。例示的なコンジュゲーションには、共有結合、アミド結合、炭素-炭素多重結合への付加、アジド・アルキン・ヒュスゲン環化付加、ディールス・アルダー反応、ジスルフィド結合、エステル結合、マイケル付加、シラン結合、ウレタン、求核開環反応:エポキシド、非アルドールカルボニル化学、環化付加反応:1,3-双極子環化付加、温度感受性、照射（IR、近IR、UV）感受性結合またはコンジュゲーション剤、pH感受性結合またはコンジュゲーション剤、非共有結合（例えば、イオン性電荷錯体形成、水素結合、pi-pi相互作用、シクロデキストリン/アダマントリ・ホスト・ゲスト相互作用（cyclodextrin/adamantly host guest interaction））などが含まれるが、それに限定されるわけではない。
本明細書において使用される場合、用語「コンジュゲーション剤」は、化合物の2つの部分を接続する有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接結合、または原子、例えば、酸素または硫黄、単位、例えば、NR1、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH、または原子の鎖、例えば、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールを含み、ここで、1つまたは複数のメチレンは、O、S、S(O)、SO2、NH、C(O)N(R1)2、C(O)、切断可能な連結基、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロ環式によって中断または終結され得、式中、R1は、水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。
限定されることなく、2つの分子、または組成物の異なる部分を一緒にコンジュゲートするための当技術分野において公知の任意のコンジュゲーション化学を使用して、核酸センサーシステムの少なくとも1つの構成要素を基質に連結することができる。核酸センサーシステムの少なくとも1つの構成要素を基質にコンジュゲートするための例示的なカップリング分子および/または官能基には、ポリエチレングリコール（PEG、1＜X＜100の様々な長さXのPEGスペーサーアームを有し得るNH2-PEGX-COOH、例えば、PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG-40Kなど）、マレイミドコンジュゲーション剤、PAS化、HES化、スベリン酸ビス(スルホスクシンイミジル)コンジュゲーション剤、DNAコンジュゲーション剤、ペプチドコンジュゲーション剤、シランコンジュゲーション剤、多糖コンジュゲーション剤、加水分解性コンジュゲーション剤およびそれらの任意の組合せが含まれるが、それに限定されるわけではない。
代替的な態様では、核酸センサーシステムの構成要素は、カップリング分子対によって固体基質の表面にコンジュゲートされ得る。本明細書において区別なく使用される用語「カップリング分子対」および「カップリング対」は、互いに特異的に結合する第1および第2の分子を指す。結合対の一方のメンバーは固体基質とコンジュゲートされ、第2のメンバーは核酸センサーシステムの構成要素とコンジュゲートされる。本明細書において使用される場合、「互いに特異的に結合する第1および第2の分子」という句は、他の分子よりも高い親和性および特異性で、カップリング対の第1のメンバーがカップリング対の第2のメンバーに結合することを指す。
例示的なカップリング分子対には、限定されることなく、対応する抗体またはその結合部分もしくは断片と組み合わせた任意のハプテン性または抗原性化合物（例えば、ジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン;マウス免疫グロブリンおよびヤギ抗マウス免疫グロブリン）および非免疫学的結合対（例えば、ビオチン-アビジン、ビオチン-ストレプトアビジン）、ホルモン（例えば、サイロキシンおよびコルチゾール-ホルモン結合タンパク質）、受容体-受容体アゴニスト、受容体-受容体アンタゴニスト（例えば、アセチルコリン受容体-アセチルコリンまたはその類似体）、IgG-プロテインA、レクチン-炭水化物、酵素-酵素補因子、酵素-酵素阻害剤、ならびに核酸二重鎖を形成することができる相補的なオリゴヌクレオチド対）が含まれる。カップリング分子対はまた、負に荷電した第1の分子と正に荷電した第2の分子とを含み得る。
カップリング対コンジュゲーションを使用する1つの例は、ビオチン-アビジンまたはビオチン-ストレプトアビジンコンジュゲーションである。このアプローチでは、カップリング対のメンバーの一方（例えば、5’末端などの核酸センサーシステムの構成要素の一部、または基質）がビオチン化され、他方（例えば、基質、または核酸センサーシステムの構成要素）がアビジンまたはストレプトアビジンとコンジュゲートされる。核酸またはタンパク質などの分子をビオチン化するための多くの市販のキットも入手可能である。例えば、アミノオキシ-ビオチン（AOB）を使用して、アルデヒド基またはケトン基を有する分子にビオチンを共有結合的に付着させることができる。一態様では、AOBは、核酸センサーシステムの構成要素の基質結合ドメイン（例えば、AKTオリゴペプチドを含む）に付着される。
カップリング分子対とのコンジュゲーションを使用する1つの非限定的な例は、ビオチンサンドイッチ法である。例えば、Davis et al.,103 PNAS 8155（2006）を参照されたい。一緒にコンジュゲートされる2つの分子はビオチン化され、次いで、4価のストレプトアビジンを使用して一緒にコンジュゲートされる。さらに、ビオチン化のためにアクセプターペプチドの15アミノ酸配列にペプチドを結合させることができる（APと呼ばれる;Chen et al.,2 Nat.Methods 99（2005））。アクセプターペプチド配列は、大腸菌（E.coli）酵素ビオチンリガーゼ（BirA;Id）による部位特異的ビオチン化を可能にする。核酸センサーシステムの構成要素は、固体基質とのコンジュゲーションのために同様にビオチン化され得る。核酸またはタンパク質をビオチン化するための多くの市販のキットも入手可能である。固体表面に対するコンジュゲーションの別の例は、PLPを介したバイオコンジュゲーションを使用することである。例えば、Witus et al.,132 JACS 16812（2010）を参照されたい。前述のように、核酸センサーシステムの構成要素の5’末端にコンジュゲートされたAKT配列により、基質結合ドメインを単一部位でビオチン化し、さらにストレプトアビジンによりコーティングされた固体表面にコンジュゲートすることが可能になり得る。
カップリング対コンジュゲーションを使用するさらに別の例は、二本鎖核酸コンジュゲーションである。このアプローチでは、カップリング対のメンバーの一方（例えば、核酸センサーシステムの構成要素）は二本鎖核酸の第1の鎖とコンジュゲートされ得、他方（例えば、基質、または核酸センサーシステムの構成要素）は二本鎖核酸の第2の鎖とコンジュゲートされる。核酸は、限定されることなく、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、ならびに骨格修飾、分岐点および非ヌクレオチド残基、基または架橋を含むヌクレオチドを含む定義された配列セグメントおよび配列を含み得る。
任意の局面のいくつかの態様では、リンカーは、少なくとも1つの切断可能な連結基を含むことができる。切断可能な連結基とは、1つの一連の条件下では十分に安定であるが、異なる一連の条件下では切断されて、リンカーが一緒に保持している2つの部分を解放するものである。
切断可能な連結基は、切断剤、例えば、加水分解、pH、酸化還元電位、または分解性分子の存在に対して易反応性である。そのような分解剤の例には、例えば、還元により酸化還元切断可能な連結基を分解することができる、細胞内に存在する酸化もしくは還元酵素または還元剤、例えばメルカプタンを含む、特定の基質に対して選択されるか基質特異性を有しない酸化還元剤;エステラーゼ;アミダーゼ;酸性環境をもたらし得るエンドソームまたは作用物質、例えば、5以下のpHをもたらすもの;一般的な酸として機能することによって酸切断可能な連結基を加水分解または分解することができる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）およびプロテアーゼ、ならびにホスファターゼが挙げられる。リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な連結基を含むことができる。リンカーに組み込まれる切断可能な連結基のタイプは、標的とされる細胞、器官または組織に依存し得る。
例示的な切断可能な連結基には、加水分解可能なリンカー、酸化還元切断可能な連結基（例えば、-S-S-および-C(R)2-S-S-、式中、RはHまたはC1〜C6アルキルであり、少なくとも1つのRはC1〜C6アルキル、例えば、CH3またはCH2CH3である）;ホスフェートに基づく切断可能な連結基（例えば、-O-P(O)(OR)-O-、-O-P(S)(OR)-O-、-O-P(S)(SR)-O-、-S-P(O)(OR)-O-、-O-P(O)(OR)-S-、-S-P(O)(OR)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(OR)-O-、-O-P(O)(R)-O-、-O-P(S)(R)-O-、-S-P(O)(R)-O-、-S-P(S)(R)-O-、-S-P(O)(R)-S-、-O-P(S)(R)-S-、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-および-O-P(S)(H)-S-、式中、Rは、置換されてもよい直鎖または分岐C1〜C10アルキルである）;酸切断可能な連結基（例えば、ヒドラゾン、エステル、ならびにアミノ酸のエステル、-C=NN-および-OC(O)-）;エステルに基づく切断可能な連結基（例えば、-C(O)O-）;ペプチドに基づく切断可能な連結基（例えば、細胞内の酵素、例えばペプチダーゼおよびプロテアーゼによって切断される連結基、例えば、-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-、式中、RAおよびRBは、2つの隣接するアミノ酸のR基である）が含まれるが、それに限定されるわけではない。ペプチドに基づく切断可能な連結基は、2つ以上のアミノ酸を含む。任意の局面のいくつかの態様では、ペプチドに基づく切断結合は、ペプチダーゼまたはプロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。任意の局面のいくつかの態様では、酸切断可能な連結基は、約6.5以下（例えば、約6.5、約6.0、約5.5、約5.0またはそれ以下）のpHを有する酸性環境下で、または一般的な酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断可能である。
活性化剤を使用して、一緒にコンジュゲートされる構成要素（例えば、基質の表面）を活性化することができる。限定されることなく、コンジュゲーション活性化のために、当技術分野において公知の任意のプロセスおよび/または試薬を使用することができる。例示的な表面活性化方法または試薬には、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはEDAC）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、2-(1H-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートメタンアミニウム（HATU）、シラン化、プラズマ処理による表面活性化などが含まれるが、それに限定されるわけではない。
この場合も、限定されることなく、当技術分野において公知の任意の反応性基をカップリングに使用することができる。例えば、限定されることなく、ハロゲン化アルキル、アルデヒド、アミノ、ブロモまたはヨードアセチル、カルボキシル、ヒドロキシル、エポキシ、エステル、シラン、チオールなどを含む様々な表面反応性基を表面カップリングに使用することができる。
任意の局面のいくつかの態様では、本明細書において記載されるシステムおよび/または条件は、陽性対照を備え得る。本明細書において使用される場合、陽性対照とは、結果をもたらすか、反応生成物を生成することが公知である反応である。一例として、陽性対照は、標的1またはT1（SEQ ID NO:20）、およびT1にハイブリダイズすることが公知である核酸システムであり得る。T1にハイブリダイズすることが公知である核酸システムには、v1_A_T1（SEQ ID NO:1）およびv1_B_T1（SEQ ID NO:2）;v1_CSs_T1（SEQ ID NO:6）;v2_A_T1（SEQ ID NO:9）およびv2_B_T1（SEQ ID NO:10）;v3_A_T1（SEQ ID NO:13）およびv3_B_T1（SEQ ID NO:14）が含まれるが、それに限定されるわけではない。別の例として、陽性対照は、標的2またはT2（SEQ ID NO:21）、およびT2にハイブリダイズすることが公知である核酸システムであり得る。T2にハイブリダイズすることが公知である核酸システムには、v1_A_T2（SEQ ID NO:3）およびv1_B_T2（SEQ ID NO:5）;v1_A2_T2（SEQ ID NO:4）およびv1_B_T2（SEQ ID NO:5）;v1_CSt_T2（SEQ ID NO:7）;v1_CSs_T2（SEQ ID NO:8）;v2_A_T2（SEQ ID NO:11）およびv2_B_T2（SEQ ID NO:12）;v3_A_T2（SEQ ID NO:15）およびv3_B_T2（SEQ ID NO:16）が含まれるが、それに限定されるわけではない。別の例として、陽性対照は、標的3またはT3（SEQ ID NO:22）、およびT3にハイブリダイズすることが公知である核酸システムであり得る。T2にハイブリダイズすることが公知である核酸システムには、v3_A_T3（SEQ ID NO:17）およびv3_B_T3（SEQ ID NO:18）が含まれるが、それに限定されるわけではない。
任意の局面のいくつかの態様では、本明細書において記載されるシステムまたは組成物をキットで提供することができる。様々な態様では、キットは、使用説明書を含む。キットは、本明細書において記載される核酸センサーシステムのうちの少なくとも1つを含む材料または構成要素の集団である。本発明のキット内で構成される構成要素の正確な性質は、その意図された目的に依存する。一態様では、キットは、特にヒト対象のために構成される。さらなる態様では、キットは、限定されることなく、家畜、飼育動物および実験動物などの対象を治療する獣医用途のために構成される。いくつかの態様では、キットは、例えば作物病害を処置するか、形質を検出する農業用途のために構成される。いくつかの態様では、キットは、産業用途のために構成される。いくつかの態様では、キットは、消費者向け用途、例えば、家庭用試験のために構成される。
キットには使用説明書が含まれ得る。「使用説明書」は、典型的に、キットの構成要素を使用して対象に対する所望の結果に影響を与える際に使用される技術を説明する具体的な表現を含む。なお本発明によれば、「使用説明書」は、核酸センサーシステムの調製および/または少なくとも1つの方法パラメーター、例えば、典型的に、意図された目的のための核酸センサーシステムの相対量、投与量要件および投与指示などを説明する具体的な表現を含み得る。任意で、キットはまた、他の有用な構成要素、例えば、測定ツール、希釈剤、緩衝液、試料採取装置（例えば、綿棒）、使用説明書、および/または当業者によって容易に認識される他の有用な装備を含む。
操作性および実用性を維持するあらゆる便利かつ適切な方法で保管されているキットに組み立てられた材料または構成要素が開業医に提供され得る。例えば、構成要素は、溶解、脱水または凍結乾燥された形態であり得る。それらは、室温、冷蔵温度または冷凍温度で提供され得る。構成要素は、典型的には、適切な包装材内に収容される。本明細書において使用される場合、「包装材」という句は、本発明の組成物などのような、キットの内容物を収容するために使用される1つまたは複数の物理的構造を指す。包装材は、好ましくは無菌で汚染物質のない環境を提供するために、周知の方法によって構築される。包装はまた、好ましくは、光、湿度および酸素から保護する環境を提供し得る。本明細書において使用される場合、用語「包装体」は、個々のキット構成要素を使用に適した形式に保持することができる適切な固体マトリックスまたは材料、例えば、ガラス、プラスチック、紙、箔、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレートまたはマイラなど）などを指す。したがって、例えば、包装体は、本明細書において記載されるある体積の核酸センサーシステムを含む適切な量の組成物を収容するために使用されるガラスバイアル、プラスチックバイアルまたはラテラルフローストリップであり得る。包装材は、一般に、キットおよび/またはその構成要素の内容物および/または目的を示す外部ラベルを有する。
本明細書において、試料中の標的核酸を検出するための方法であって、a）上流のハイブリダイゼーション領域（例えば、3’ハイブリダイゼーション領域）および下流のハイブリダイゼーション領域（例えば、5’ハイブリダイゼーション）が標的核酸の一部に相補的であり、その結果、上流および下流のハイブリダイゼーション領域への標的核酸のハイブリダイゼーションが、生産的なライゲーションが起こるのに十分な接合部を第1の核酸またはドメインと第2の核酸またはドメインとの間に作成して、それによって、あらゆる構成要素を動作可能に連結する前述の核酸センサーシステムを提供する工程、b）上流のハイブリダイゼーション領域（例えば、3’ハイブリダイゼーション領域）および下流のハイブリダイゼーション領域（例えば、5’ハイブリダイゼーション領域）との標的核酸のハイブリダイゼーションに適しかつ上流のハイブリダイゼーション領域（例えば、3’ハイブリダイゼーション領域）および下流のハイブリダイゼーション領域（例えば、5’ハイブリダイゼーション領域）のライゲーションに適した条件下、リガーゼの存在下で、核酸センサーシステムと試料とを接触させて、それによって、反応生成物を生成する工程、c）DNA重合、転写および翻訳に適した条件下で、工程b）で生成された反応生成物を、鎖置換DNAポリメラーゼと、タンパク質生成に必要なdNTPおよび他のビルディングブロック材料と、ssDNAプライマーとを含む無細胞発現システムに接触させて、それによって、反応生成物を生成する工程であって、反応生成物がポリペプチドまたは酵素である工程、d）適切な対照のポリペプチド反応生成物または酵素反応生成物の存在と比較した工程c）のポリペプチド反応生成物または酵素反応生成物の存在を直接的または間接的に測定する工程であって、有意な反応生成物の存在が試料中の標的核酸の存在を示す工程を含む方法が記載されている。
本明細書において、試料中の標的核酸を検出するための方法であって、a）上流のハイブリダイゼーション領域（例えば、3’ハイブリダイゼーション領域）および下流のハイブリダイゼーション領域（例えば、5’ハイブリダイゼーション）が標的核酸の一部に相補的であり、その結果、上流および下流のハイブリダイゼーション領域への標的核酸のハイブリダイゼーションが、生産的なライゲーションが起こるのに十分な接合部を第1の核酸またはドメインと第2の核酸またはドメインとの間に作成して、それによって、あらゆる構成要素を動作可能に連結する前述の核酸センサーシステムを提供する工程、b）上流のハイブリダイゼーション領域（例えば、3’ハイブリダイゼーション領域）および下流のハイブリダイゼーション領域（例えば、5’ハイブリダイゼーション領域）との標的核酸のハイブリダイゼーションに適しかつ上流のハイブリダイゼーション領域（例えば、3’ハイブリダイゼーション領域）および下流のハイブリダイゼーション領域（例えば、5’ハイブリダイゼーション領域）のライゲーションに適した条件下、リガーゼの存在下で、核酸センサーシステムと試料とを接触させて、それによって、反応生成物を生成する工程、c）DNA重合、転写および翻訳に適した条件下で、工程b）で生成された反応生成物を、鎖置換DNAポリメラーゼと、タンパク質生成に必要なdNTPおよび他のビルディングブロック材料と、ssDNAプライマーとを含む無細胞発現システムに接触させて、それによって、動作可能に連結されたssDNA反応生成物を生成する工程、d）適切な対照のレポータータンパク質の存在と比較した工程c）の反応生成物中のレポータータンパク質の存在を測定する工程であって、有意なレポータータンパク質の存在が試料中の標的核酸の存在を示す工程を含む方法が記載されている。
本明細書において使用される場合、「適切な対照」は、陽性対照または陰性対照であり得る参照試料を指し得る。本明細書において記載されるように、陽性対照とは、結果をもたらすことが公知である反応である。陰性対照とは、標的配列の非存在下で、結果またはバックグラウンドレベル検出をもたらさないことが公知である反応である。例えば、陰性対照は、標的核酸を有しないか、非標的核酸を有するか、核酸センサーシステムの1つまたは複数の構成要素を欠いている反応を含み得る。
任意の局面のいくつかの態様では、核酸センサーシステム構成要素は、それぞれ、約2〜約500nMで存在する。任意の局面のいくつかの態様では、核酸センサーシステム構成要素は、それぞれ、約16nMで存在する。任意の局面のいくつかの態様では、核酸センサーシステム構成要素は、それぞれ、約2nM、約4nM、約6nM、約8nM、約10nM、約12nM、約14nM、約16nM、約18nM、約20nM、約22nM、約24nM、26nM、約28nM、約30nM、約32nM、約34nM、約36nM、約38nM、約40nM、約42nM、約44nM、46nM、約48nMまたは約50nMで存在する。任意の局面のいくつかの態様では、核酸センサーシステム構成要素は、それぞれ、約60nM、約70nM、約80nM、約90nM、約100nM、約110nM、約120nM、約130nM、約140nM、約150nM、約160nM、約170nM、約180nM、約190nM、約200nM、約210nM、約220nM、約230nM、約240nM、約250nM、約260nM、約270nM、約280nM、約290nM、約300nM、約310nM、約320nM、約330nM、約340nM、約350nM、約360nM、約370nM、約380nM、約390nM、約400nM、約410nM、約420nM、約430nM、約440nM、約450nM、約460nM、約470nM、約480nM、約490nMまたは約500nMで存在する。
任意の局面のいくつかの態様では、核酸センサーシステム構成要素は、それぞれ、2〜500nMで存在する。任意の局面のいくつかの態様では、核酸センサーシステム構成要素は、それぞれ、16nMで存在する。任意の局面のいくつかの態様では、核酸センサーシステム構成要素は、それぞれ、2nM、4nM、6nM、8nM、10nM、12nM、14nM、16nM、18nM、20nM、22nM、24nM、26nM、28nM、30nM、32nM、34nM、36nM、38nM、40nM、42nM、44nM、46nM、48nMまたは50nMで存在する。任意の局面のいくつかの態様では、核酸センサーシステム構成要素は、それぞれ、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、110nM、120nM、130nM、140nM、150nM、160nM、170nM、180nM、190nM、200nM、210nM、220nM、230nM、240nM、250nM、260nM、270nM、280nM、290nM、300nM、310nM、320nM、330nM、340nM、350nM、360nM、370nM、380nM、390nM、400nM、410nM、420nM、430nM、440nM、450nM、460nM、470nM、480nM、490nMまたは500nMで存在する。
任意の局面のいくつかの態様では、リガーゼは、約10〜約1000nMで存在する。任意の局面のいくつかの態様では、リガーゼは、約100nMで存在する。任意の局面のいくつかの態様では、リガーゼは、約10nM、約20nM、約30nM、約40nM、約50nM、約60nM、約70nM、約80nM、約90nM、約100nM、約110nM、約120nM、約130nM、約140nM、約150nM、約160nM、約170nM、約180nM、約190nM、約200nM、約210nM、約220nM、約230nM、約240nM、約250nM、約260nM、約270nM、約280nM、約290nM、約300nM、約310nM、約320nM、約330nM、約340nM、約350nM、約360nM、約370nM、約380nM、約390nM、約400nM、約410nM、約420nM、約430nM、約440nM、約450nM、約460nM、約470nM、約480nM、約490nM、約500nM、約510nM、約520nM、約530nM、約540nM、約550nM、約560nM、約570nM、約580nM、約590nM、約600nM、約610nM、約620nM、約630nM、約640nM、約650nM、約660nM、約670nM、約680nM、約690nM、約700nM、約710nM、約720nM、約730nM、約740nM、約750nM、約760nM、約770nM、約780nM、約790nM、約800nM、約810nM、約820nM、約830nM、約840nM、約850nM、約860nM、約870nM、約880nM、約890nM、約900nM、約910nM、約920nM、約930nM、約940nM、約950nM、約960nM、約970nM、約980nM、約990nMまたは約1000nMで存在する。
任意の局面のいくつかの態様では、リガーゼは、10〜1000nMで存在する。任意の局面のいくつかの態様では、リガーゼは、100nMで存在する。任意の局面のいくつかの態様では、リガーゼは、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、110nM、120nM、130nM、140nM、150nM、160nM、170nM、180nM、190nM、200nM、210nM、220nM、230nM、240nM、250nM、260nM、270nM、280nM、290nM、300nM、310nM、320nM、330nM、340nM、350nM、360nM、370nM、380nM、390nM、400nM、410nM、420nM、430nM、440nM、450nM、460nM、470nM、480nM、490nM、500nM、510nM、520nM、530nM、540nM、550nM、560nM、570nM、580nM、590nM、600nM、610nM、620nM、630nM、640nM、650nM、660nM、670nM、680nM、690nM、700nM、710nM、720nM、730nM、740nM、750nM、760nM、770nM、780nM、790nM、800nM、810nM、820nM、830nM、840nM、850nM、860nM、870nM、880nM、890nM、900nM、910nM、920nM、930nM、940nM、950nM、960nM、970nM、980nM、990nMまたは1000nMで存在する。
任意の局面のいくつかの態様では、リガーゼの存在下で核酸センサーシステムと試料とを接触させる工程を含む工程b）は、1分〜60分の期間にわたりインキュベートまたは維持する工程を含み得る。任意の局面のいくつかの態様では、工程b）のライゲーション反応は、約1分間、約2分間、約3分間、約4分間、約5分間、約6分間、約7分間、約8分間、約9分間、約10分間、約11分間、約12分間、約13分間、約14分間、約15分間、約16分間、約17分、約18分間、約19分間、約20分間、約21分間、約22分間、約23分間、約24分間、約25分間、約26分間、約27分間、約28分間、約29分間、約30分間、約31分間、約32分間、約33分間、約34分間、約35分間、約36分間、約37分間、約38分間、約39分間、約40分間、約41分間、約42分間、約43分間、約44分間、約45分間、約46分間、約47分間、約48分間、約49分間、約50分間、約51分間、約52分間、約53分間、約54分間、約55分間、約56分間、約57分間、約58分間、約59分間または約60分間インキュベートまたは維持される。任意で、工程b）の反応は、ほぼ周囲温度（例えば、24〜26℃）でインキュベートされ得る。
任意の局面のいくつかの態様では、リガーゼの存在下で核酸センサーシステムと試料とを接触させる工程を含む工程b）は、1分〜60分の期間にわたりインキュベートまたは維持する工程を含み得る。任意の局面のいくつかの態様では、工程b）のライゲーション反応は、1分間、2分間、3分間、4分間、5分間、6分間、7分間、8分間、9分間、10分間、11分間、12分間、13分間、14分間、15分間、16分間、17分間、18分間、19分間、20分間、21分間、22分間、23分間、24分間、25分間、26分間、27分間、28分間、29分間、30分間、31分間、32分間、33分間、34分間、35分間、36分間、37分間、38分間、39分間、40分間、41分間、42分間、43分間、44分間、45分間、46分間、47分間、48分間、49分間、50分間、51分間、52分間、53分間、54分間、55分間、56分間、57分間、58分間、59分間または60分間インキュベートまたは維持される。任意で、工程b）の反応は、周囲温度（例えば、24〜26℃）でインキュベートされ得る。
任意の局面のいくつかの態様では、工程b）で生成された反応生成物を無細胞発現システムに接触させる工程を含む工程c）は、15分〜12時間の期間にわたりインキュベートまたは維持する工程を含み得る。任意の局面のいくつかの態様では、工程c）の反応は、約15分間、約30分間、約45分間、約60分間インキュベートされる。いくつかの態様では、工程c）の反応は、約1.0時間、約1.5時間、約2.0時間、約2.5時間、約3.0時間、約3.5時間、約4.0時間、約4.5時間、約5.0時間、約5.5時間、約6.0時間、約6.5時間、約7.0時間、約7.5時間、約8.0時間、約8.5時間、約9.0時間、約9.5時間、約10.0時間、約10.5時間、約11.0時間、約11.5時間または約12.0時間インキュベートされる。任意で、工程c）の反応は、ほぼ周囲温度（例えば、24〜26℃）でインキュベートされ得る。例えば、工程b）は、周囲温度（例えば、24〜26℃）で5分〜15分の期間にわたりインキュベートされ得、および/または工程c）は、周囲温度（例えば、24〜26℃）で、60分〜3時間の期間にわたりインキュベートされ得る。
任意の局面のいくつかの態様では、工程b）で生成された反応生成物を無細胞発現システムに接触させる工程を含む工程c）は、15分〜12時間の期間にわたりインキュベートまたは維持する工程を含み得る。任意の局面のいくつかの態様では、工程c）の反応は、15分間、30分間、45分間、60分間インキュベートされる。いくつかの態様では、工程c）の反応は、1.0時間、1.5時間、2.0時間、2.5時間、3.0時間、3.5時間、4.0時間、4.5時間、5.0時間、5.5時間、6.0時間、6.5時間、7.0時間、7.5時間、8.0時間、8.5時間、9.0時間、9.5時間、10.0時間、10.5時間、11.0時間、11.5時間または12.0時間インキュベートされる。任意で、工程c）の反応は、周囲温度（例えば、24〜26℃）でインキュベートされ得る。例えば、工程b）は、周囲温度（例えば、24〜26℃）で5分〜15分の期間にわたりインキュベートされ得、および/または工程c）は、周囲温度（例えば、24〜26℃）で、60分〜3時間の期間にわたりインキュベートされ得る。
当業者であれば、いくつかの態様では、特定の工程が連続して行われ得、いくつかの態様では、特定の工程が並行してまたは同時に（例えば、「ワンポット」反応で）行われ得ることを理解するであろう。例えば、いくつかの態様では、工程b）およびc）は、連続して行われ得る。いくつかの態様では、これらの工程は、並行してまたは同時に（例えば、そのような「ワンポット」反応で）行われ得る。任意の局面のいくつかの態様では、無細胞発現システムは、RNAse阻害剤をさらに含む。RNase阻害剤は、RNase A、RNase H、RNase III、RNase L、RNase P、RNase PhyM、RNase T1、Rnase T2、Rnase U2またはRnase Vのうちの少なくとも1つを阻害することができる。任意の局面のいくつかの態様では、無細胞発現システムは、第2の核酸またはドメインの3’末端に相補的なssDNAプライマー0.5nM〜5μMをさらに含む。任意の局面のいくつかの態様では、無細胞発現システムは、第2の核酸またはドメインの3’末端に相補的なssDNAプライマー約1.25μMをさらに含む。任意の局面のいくつかの態様では、無細胞発現システムは、第2の核酸またはドメインの3’末端に相補的なssDNAプライマー約0.5nM、約1nM、約5nM、約10nM、約20nM、約30nM、約40nM、約50nM、約60nM、約70nM、約80nM、約90nM、約100nM、約110nM、約125nM、約250nM、約375nM、約500nM、約625nM、約750nM、約875nM、約1.000μM、約1.125μM、約1.250μM、約1.375μM、約1.500μM、約1.625μM、約1.750μM、約1.875μM、約2.000μM、約2.125μM、約2.250μM、約2.375μM、約2.500μM、約2.625μM、約2.750μM、約2.875μM、約3.000μM、約3.125μM、約3.250μM、約3.375μM、約3.500μM、約3.625μM、約3.750μM、約3.875μM、約4.000μM、約4.125μM、約4.250μM、約4.375μM、約4.500μM、約4.625μM、約4.750μM、約4.875μMまたは約5.000μMを含む。
当業者であれば、無細胞発現システムの様々な構成が有用であり得ることを理解するであろう。例えば、いくつかの態様では、無細胞発現システムは、非鋳型発現カセット内の配列に相補的な、または介在するssDNA配列に相補的なssDNAプライマー約1.25μMを含み得る。任意の局面のいくつかの態様では、無細胞発現システムは、非鋳型発現カセット内の配列に相補的な、または介在するssDNA配列に相補的なssDNAプライマー約0.5nM、約1nM、約5nM、約10nM、約20nM、約30nM、約40nM、約50nM、約60nM、約70nM、約80nM、約90nM、約100nM、約110nM、約125nM、約250nM、約375nM、約500nM、約625nM、約750nM、約875nM、約1.000μM、約1.125μM、約1.250μM、約1.375μM、約1.500μM、約1.625μM、約1.750μM、約1.875μM、約2.000μM、約2.125μM、約2.250μM、約2.375μM、約2.500μM、約2.625μM、約2.750μM、約2.875μM、約3.000μM、約3.125μM、約3.250μM、約3.375μM、約3.500μM、約3.625μM、約3.750μM、約3.875μM、約4.000μM、約4.125μM、約4.250μM、約4.375μM、約4.500μM、約4.625μM、約4.750μM、約4.875μMまたは約5.000μMを含む（例えば、図2B（i））。
任意の局面のいくつかの態様では、dNTPの濃度は、約200〜約500μMである。任意の局面のいくつかの態様では、dNTPの濃度は、約230である。任意の局面のいくつかの態様では、dNTPの濃度は、約200μM、約210μM、約220μM、約230μM、約240μM、約250μM、約260μM、約270μM、約280μM、約290μM、約300μM、約310μM、約320μM、約330μM、約340μM、約350μM、約360μM、約370μM、約380μM、約390μM、約400μM、約410μM、約420μM、約430μM、約440μM、約450μM、約460μM、約470μM、約480μM、約490μMまたは約500μMである。
任意の局面のいくつかの態様では、dNTPの濃度は、200〜500μMである。任意の局面のいくつかの態様では、dNTPの濃度は、230μMである。任意の局面のいくつかの態様では、dNTPの濃度は、200μM、210μM、220μM、230μM、240μM、250μM、260μM、270μM、280μM、290μM、300μM、310μM、320μM、330μM、340μM、350μM、360μM、370μM、380μM、390μM、400μM、410μM、420μM、430μM、440μM、450μM、460μM、470μM、480μM、490μMまたは500μMである。
任意の局面のいくつかの態様では、DNAポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ部分を有するクレノウ断片、エキソヌクレアーゼ部分を有しないクレノウ断片、phi29ポリメラーゼ、改変T7 DNAポリメラーゼ、サイクロバチルス由来のポリメラーゼ、鎖置換が増強されたサイクロバチルス由来のポリメラーゼ、およびB. スブチリス由来のポリメラーゼからなる群より選択される。様々な態様では、様々な前述の構成要素は、前述の方法を行うのに適した合わせた混合物中にある。任意の局面のいくつかの態様では、レポータータンパク質はルシフェラーゼであり、レポータータンパク質基質はルシフェラーゼ基質であり、測定は、無細胞発現システム内の発光の検出によるものである。
任意の局面のいくつかの態様では、方法は、RNA転写物へのssDNAプライマーのハイブリダイゼーション、逆転写酵素を使用する逆転写、および内部分解性切断（endolytic cleavage）をさらに含む。例えば、標的核酸を介したライゲーションと、プライマー伸長とによって形成された発現カセットの増幅は、検出システムの感度をさらに改善することができる。RNAへのdsDNA産物の転写に続いて、DNAプライマー、例えば、発現カセットの3’末端にアニーリングする同じプライマー、または異なるDNAプライマーをRNA転写物の相補的な3’末端にハイブリダイゼーションすることができる。逆転写酵素は、DNAプライマーを伸長してRNA/DNAハイブリッド分子を作成することができる。RNaseHエンドヌクレアーゼ活性は、DNA/RNAハイブリッドのRNAを加水分解的に切断して、上流、またはAセンサー部分もしくはAドメイン、または別のDNAプライマーに相補的なssDNA分子を作成する（例えば、図2Aを参照）。本明細書において使用される場合、「Aセンサー部分」は、第1のセンサー部分、第1の核酸、Aドメイン、第1の配列または第1のドメインと区別なく使用され、3’ハイブリダイゼーション領域を含む核酸ハイブリダイゼーション配列の部分を指す。本明細書において使用される場合、「Bセンサー部分」は、第2のセンサー部分、第2の核酸、Bドメイン、B配列または第2のドメインと区別なく使用され、5’ハイブリダイゼーション領域を含む核酸ハイブリダイゼーション配列の部分を指す。ssDNA分子へのAセンサー部分のハイブリダイゼーションにより、DNAポリメラーゼを介した伸長が可能になり、完全な発現カセットが作成される。RNAへの発現カセットの転写により、発現カセット増幅のその後のラウンドが可能になる。任意の局面のいくつかの態様では、システムは、逆転写酵素活性を含む酵素と、RNA/DNAハイブリッド分子内でRNAの加水分解的切断を触媒する非特異的エンドヌクレアーゼとを含み得る。任意の局面のいくつかの態様では、逆転写酵素は、HIV-1、RTx、Luna（登録商標）（New England Biolabs）、RNAse H活性が低下しているか完全に除去された組換えMoloneyマウス白血病ウイルス逆転写酵素（RNase H-）であり得る。任意の局面のいくつかの態様では、エンドヌクレアーゼは、RNaseHであり得る。任意の局面のいくつかの態様では、活性は、単一の酵素、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）逆転写酵素、Moloneyマウス白血病ウイルス逆転写酵素またはそれらの変異体によって触媒され得る。
本明細書において使用される場合、「DNA発現カセット」は、一緒にライゲーションされるとポリペプチドをコードする、第1および第2の核酸またはAドメインおよびBドメインを含む一本鎖DNA（ssDNA）を指す。
本明細書において使用される場合、「標的」または「標的核酸」または「標的配列」または「標的核酸配列」は、第1の核酸またはAドメインの3’ハイブリダイゼーション領域および第2の核酸またはBドメインの5’ハイブリダイゼーション領域の両方とハイブリダイズすることができるRNAまたはssDNAを指す。
また、本明細書において、試料中の標的核酸を検出するための方法であって、a）上流および下流のハイブリダイゼーション領域が標的核酸の一部に相補的であり、その結果、上流および下流のハイブリダイゼーション領域への標的核酸のハイブリダイゼーションが、生産的なライゲーションが起こるのに十分な接合部を第1のドメインと第2のドメインとの間に作成する、前述の核酸センサーシステムを提供する工程、b）上流および下流のハイブリダイゼーション領域との標的核酸のハイブリダイゼーションに適しかつ上流および下流のハイブリダイゼーション領域のライゲーションに適した条件下、リガーゼの存在下で、核酸センサーシステムと試料とを接触させて、それによって、動作可能に連結されたssDNA反応生成物を生成する工程、c）DNA重合、転写および翻訳に適した条件下で、工程b）で生成された反応生成物を、鎖置換DNAポリメラーゼと、タンパク質生成に必要なdNTPおよび他のビルディングブロック構成要素と、ssDNAプライマーとを含む無細胞発現システムに接触させて、それによって、レポータータンパク質を生成する工程、d）工程c）のレポータータンパク質生成物の活性を観察して、試料中の標的核酸の存在を示す工程を含む方法が記載されている。
任意の局面のいくつかの態様では、本明細書において記載されるセンサーシステム、およびその使用方法は、単一の塩基だけ試料中の別の核酸とは異なる標的核酸の検出に使用され、一塩基多型（SNP）の識別を可能にし得る。任意の局面のいくつかの態様では、ハイブリダイゼーション領域内のSNPの位置は、上流または下流のssDNAドメインのいずれかの上の、連結接合部の2つの塩基のうちの1つに位置する。任意の局面のいくつかの態様では、1つまたは複数のミスマッチ塩基が、ハイブリダイゼーション領域内にさらに導入され得る。SNPの存在によるハイブリダイゼーション領域の不安定化は、リガーゼが上流および下流のドメインを首尾よく連結する能力を妨げ、異なったシグナル出力をもたらす。様々な態様では、接合部は、標的核酸の多型に対してハイブリダイズするように構成される。一例として、4つの異なる例示的な変異体（多型）を試験した（例えば、実施例15を参照）。
様々な態様では、ssDNA Aドメインは、5’から3’方向に、（i）プロモーターと、（ii）リボソーム結合部位（RBS）と、（iii）レポータータンパク質コード配列の開始コドンと、（iv）標的核酸の領域に相補的なハイブリダイゼーション領域とを含む。ssDNA Bドメインは、5’から3’方向に、（i）標的核酸の領域に相補的なハイブリダイゼーション領域と、（ii）レポータータンパク質の残りのコード配列とを含む。第3の核酸構成要素は、Bドメインの3’末端にハイブリダイズするssDNA「プライマー」である（例えば、図2Aを参照）。代替的なセンサー構成要素スキームは、（i）Aドメインの5’末端が、介在するssDNA配列によりBドメインの3’末端に連結されているAドメインおよびBドメイン、（ii）Bドメインの末端ヘアピンとしてssDNAプライマーを組み込むAドメインおよびBドメイン、または（iii）Aドメインの5’末端およびBドメインの3’末端の両方にヘアピンを含むAドメインおよびBドメインを含む（例えば、図2Bを参照）。これらの代替的なスキームは、構成要素の数を減少させ、および/またはDNAエキソヌクレアーゼに対して易反応性の露出したssDNA末端の数を減少させることによって利点を提供し得る。
センサーシステム分子は、標的核酸を含有する試料、ならびに転写および翻訳に必要な構成要素およびビルディングブロック材料を含有する無細胞発現システムとともにインキュベートされる。特許請求されるセンサーは、任意のRNAもしくはssDNA（例えば、ssDNAウイルス、またはゲノムdsDNAの変性によって生成されたssDNA）、一塩基多型、またはSNPのインビトロ検出に使用することができる。これにより、感染、またはヒトの健康、動物の健康および植物の健康に関連する他の要因を示す様々な微生物および核酸の検出が可能になる。
RNA標的には、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、ウイルスゲノムRNAおよびリボソームRNAが含まれる。リボソームRNAは、個々の細菌細胞ごとに多数のコピーで存在する可能性があり、細菌の属/種を区別するために使用することができることから、細菌検出の特に有用な標的はリボソームRNA（例えば、16Sまたは23S rRNA）である。感染性細菌標的生物には、連鎖球菌属（Streptococcus）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、バチルス属（Bacillus）、カンピロバクター属（Campylobacter）、クラミジア属（Chlamydia）、クロストリジウム属（Clostridium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、エシェリキア属（Escherichia）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、リステリア属（Listeria）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、サルモネラ属（Salmonella）、ビブリオ属（Vibrio）、エルシニア属（Yersinia）の種が含まれるが、それに限定されるわけではない。病原性細菌の診断のための様々な16SリボソームRNA標的領域の説明が、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるJ.Microbiol Methods 2007 May 69（2）:330-339にさらに記載されている。RNAウイルスは、例えば、ウイルスRNAゲノムの領域用のセンサーを設計することによって検出することができる。例示的なRNAウイルスには、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、インフルエンザウイルス、ジカウイルス、エボラウイルス、ロタウイルス、ポリオウイルス、デングウイルス、黄熱病ウイルス、C型肝炎ウイルス、麻疹ウイルスおよび狂犬病ウイルスが含まれるが、それに限定されるわけではない。
本明細書において引用されるすべての参考文献は、完全に記載されているかのように、参照によりその全体が組み入れられる。別段の定義がない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed.,Revised,J.Wiley＆Sons（New York,NY 2006）およびSambrook and Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press（Cold Spring Harbor,NY 2012）は、本出願で使用される多くの用語の一般的な指針を当業者に提供する。
本明細書において使用される場合、用語「核酸」または「核酸配列」は、任意の分子、好ましくは、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはそれらの類似体の単位を含むポリマー分子を指す。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。一本鎖核酸は、変性した二本鎖DNAのうちの1本の鎖の核酸であり得る。あるいは、一本鎖核酸は、いかなる二本鎖DNAにも由来しない一本鎖核酸であり得る。一局面では、標的核酸はDNAである。別の局面では、標的はRNAである。適切な核酸分子は、ゲノムDNAまたはcDNAを含むDNAである。他の適切な核酸分子は、mRNAおよびリボソームRNAを含むRNAである。
本明細書において使用される場合、用語「DNA」は、デオキシリボ核酸として定義される。用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオシドのポリマーを示すために、本明細書において「核酸」と区別なく使用される。典型的には、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって結合された、DNAまたはRNAに自然に見出されるヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジン）から構成される。ただし、この用語は、天然に存在する核酸に見出されるかどうかにかかわらず、化学的または生物学的に修飾された塩基、修飾された骨格などを含むヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含む分子を包含し、特定の用途では、そのような分子が好ましい場合がある。本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド材料自体および/または特定の核酸を生化学的に特徴付ける配列情報（すなわち、塩基の略号として使用される文字の連続）を指し得る。本明細書において提示されるポリヌクレオチド配列は、別段の指定がない限り、5’から3’の方向に提示される。
本明細書において使用される場合、用語「一本鎖DNA（ssDNA）」は、DNAらせんを形成する、DNAの2本の鎖とは対照的に、ヌクレオチドの1本の鎖のみからなるDNAを指す。この用途がポリヌクレオチドに言及する場合、DNA、RNAの両方、ならびにそれぞれの場合に一本鎖形態および二本鎖形態（および各一本鎖分子の相補体）の両方が提供されることを理解されたい。
本明細書において使用される場合、「プロモーター」は、その天然状態で（すなわち、生物のゲノムに自然に存在するように）、オープンリーディングフレーム（またはタンパク質コード領域）の翻訳開始コドンの上流、または翻訳開始コドンに対して5’に位置するポリヌクレオチド分子を指す。いくつかの態様では、用語「プロモーター」は、本明細書において、所望の特性（例えば、改善された転写効率）を有するように特に設計された修飾ポリヌクレオチド分子を指すために使用され得る。プロモーターは、転写開始部位の5’および/または3’の両方の配列を含むことができる。プロモーターは、RNAポリメラーゼII、またはT7 RNAポリメラーゼなどの他のRNAポリメラーゼ、および他のタンパク質（トランス作用転写因子）の認識および結合に関与して、転写を開始する。プロモーターは、典型的には、長さが約20bp〜約1000bp、例えば、長さが約20bp、長さが約30bp、長さが約40bp、長さが約50bp、長さが約60bp、長さが約70bp、長さが約80bp、長さが約90bp、長さが約100bp、長さが約150bp、長さが約200bp、長さが約250bp、長さが約300bp、長さが約350bp、長さが約400bp、長さが約450bp、長さが約500bp、長さが約550bp、長さが約600bp、長さが約650bp、長さが約700bp、長さが約750bp、長さが約800bp、長さが約850bp、長さが約900bp、長さが約950bpまたは長さが約1000bpであり得る。所与のプロモーターの配列および/または位置は、当技術分野において公知のコンピュータープログラム、例えば、ElDorado、Gene2Promoter、GEMS Launcher、PromoterInspector、Promoter2.0、McPromoter、EP3、ProSOMおよびTREDを使用して予測することができる。
本明細書において使用される場合、用語「相補的」は、2つの所与のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が互いにアニーリングすると、DNA内ではAはTと対合し、GはCと対合し、RNAではGはCと対合し、AはUと対合する、ヌクレオチド塩基G、A、T、CおよびUの間の水素結合塩基対形成の優先順位の階層を指す。本明細書において使用される場合、「実質的に相補的」は、分子の全長、またはその一部にわたって、第2のヌクレオチド配列と少なくとも90％の相補性を有する、例えば、90％相補的、95％相補的、98％相補的、99％相補的または100％相補的な核酸分子またはその一部（例えば、プライマー）を指す。本明細書において使用される場合、「実質的に同一」は、分子の全長、またはその一部にわたって、第2のヌクレオチド配列と少なくとも90％の同一性、例えば、90％の同一性、95％の同一性、98％の同一性、99％の同一性または100％の同一性を有する核酸分子またはその一部を指す。
本明細書において使用される場合、「ハイブリダイズ」は、好ましくは、鋳型依存性ポリメラーゼが二本鎖上で重合を行うことができる程度に鎖が塩基を対合したままである程度まで、物理的塩基対形成に関与する2つの核酸鎖を指す。当業者であれば、標的核酸配列の配列情報を使用して、試料中に存在し得る他の核酸配列ではなく単一の標的に相補的（例えば、完全に相補的）である、本明細書において記載されるセンサーのハイブリダイゼーション領域または配列を設計することができる。バックグラウンドシグナルを最小限に抑えるために、ハイブリダイゼーション条件を常用的に最適化することができる。
本明細書において使用される場合、用語「動作可能に連結された」は、レポータータンパク質をコードする遺伝子などの第2の転写可能なポリヌクレオチド分子に接続された第1のポリヌクレオチド分子、例えば、プロモーターまたは開始コドンを指し、ここで、ポリヌクレオチド分子は、第1のポリヌクレオチド分子が第2のポリヌクレオチド分子の機能に影響を及ぼすように配置される。2つのポリヌクレオチド分子は、単一の隣接するポリヌクレオチド分子の一部であってもなくてもよく、隣接していてもいなくてもよい。例えば、プロモーターが細胞内の関心対象の遺伝子の転写を調節または媒介する場合、プロモーターは、関心対象の遺伝子に動作可能に連結されている。
本明細書において使用される場合、用語「リボソーム結合部位（RBS）」は、タンパク質翻訳の開始中にリボソームを動員するように機能するmRNA転写物の開始コドンの上流に（例えば、5’末端の方に）位置するヌクレオチド配列を指す。真核生物では、リボソームの動員は、通常、真核生物のmRNA上に存在し得る5’キャップによって媒介される。
本明細書において使用される場合、用語「末端ヘアピンループ」は、通常、ヌクレオチド配列内で相補的な、同じ鎖の2つの領域が、反対方向に読み取られると、塩基対を形成して、対になっていないループで終結する二重らせんを形成する際に形成される構造を指す。
本明細書において使用される場合、核酸分子の「一部」は、その分子によって構成されるヌクレオチドの連続したセットを指す。一部は、分子によって構成されるヌクレオチドのサブセットの全部またはそのサブセットのみを含むことができる。一部は二本鎖または一本鎖であり得る。
本明細書において使用される場合、用語「含む（comprising）」または「含む（comprise）」は、組成物、方法、およびこの方法または組成物に必須であるそれらのそれぞれの構成要素に関して使用されるが、必須であるかどうかにかかわらず不特定の要素を含めることが許容される。
用語「からなる」は、本明細書において記載される組成物、方法およびそれらのそれぞれの構成要素を指し、態様のその説明に記載されていないいかなる要素も除外する。
単数形の用語「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈上別途明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という語句は、文脈上別途明確に示されない限り、「および」を含むことを意図している。本明細書において記載されるものと同様または同等の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。略語「例えば（e.g.）」は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書において非限定的な例を示すために使用される。したがって、略語「例えば（e.g.）」は、用語「例えば（for example）」の同義語である。
細胞生物学および分子生物学の一般的な用語の定義は、“The Merck Manual of Diagnosis and Therapy”,19th Edition,published by Merck Research Laboratories,2006（ISBN 0-911910-19-0）;Robert S.Porter et al.（eds.）,The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994（ISBN 0-632-02182-9）に見出すことができる。分子生物学の一般的な用語の定義はまた、Benjamin Lewin,Genes X,published by Jones＆Bartlett Publishing,2009（ISBN-10:0763766321）;Kendrew et al.（eds.）,Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995（ISBN 1-56081-569-8）およびCurrent Protocols in Protein Sciences 2009,Wiley Intersciences,Coligan et al.,eds.に見出すことができる。
任意の局面のいくつかの態様では、本明細書において記載される方法は、少なくとも1つのマーカーのレベルを測定、検出または決定することに関する。本明細書において使用される場合、用語「検出」または「測定」は、例えば、プローブ、標識または標的分子からのシグナルを観察して、試料中の分析物の存在を示すことを指す。生体分子を直接検出するため、および/または特定の標識部分を検出するための、当技術分野において公知の任意の方法を検出に使用することができる。例示的な検出方法には、分光学的方法、蛍光的方法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、電気的方法、光学的方法または化学的方法が含まれるが、それに限定されるわけではない。任意の局面のいくつかの態様では、測定は定量的観察であり得る。
任意の局面のいくつかの態様では、本明細書において記載されるポリペプチド、核酸または細胞を操作することができる。本明細書において使用される場合、「操作された」は、人間の手によって操作されているという側面を指す。例えば、ポリペプチドの少なくとも1つの側面、例えば、その配列が、本来存在する側面とは異なるように人間の手によって操作されている場合、ポリペプチドは「操作された」と考えられる。一般的な慣行であり、当業者によって理解されるように、操作された細胞の子孫は、実際の操作が以前の実体に対して行われたとしても、典型的には依然として「操作された」と呼ばれる。
任意の局面のいくつかの態様では、本明細書において記載される核酸センサーシステムの構成要素は外因性である。任意の局面のいくつかの態様では、本明細書において記載される核酸センサーシステムの構成要素は異所性である。任意の局面のいくつかの態様では、本明細書において記載される核酸センサーシステムの構成要素は内因性ではない。
用語「外因性」は、その天然の供給源以外の細胞に存在する物質を指す。本明細書において使用される場合の用語「外因性」は、核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）またはポリペプチドであって、その核酸またはポリペプチドが通常は見出されず、その核酸またはポリペプチドをそのような細胞または生物に導入することが望まれる生物システム、例えば、細胞、無細胞システムまたは生物に、人間の手を含むプロセスによって導入された核酸またはポリペプチドを指し得る。あるいは、「外因性」は、核酸またはポリペプチドであって、その核酸またはポリペプチドが比較的少量に見出され、細胞、無細胞システムまたは生物内のその核酸またはポリペプチドの量を増加させて、例えば、異所性の発現またはレベルをもたらすことが望まれる生物システム、例えば、細胞、無細胞システムまたは生物に、人間の手を含むプロセスによって導入された核酸またはポリペプチドを指し得る。対照的に、用語「内因性」は、生物システム、無細胞システムまたは細胞に固有の物質を指す。本明細書において使用される場合、「異所性」は、普通でない場所および/または量で見出される物質を指す。異所性物質は、所与の細胞または無細胞システム内に通常見出されるが、はるかに少ない量および/または異なる時間に見出されるものであり得る。異所性には、その天然の環境では所与の細胞内に自然に見出されない、または発現されない物質、例えば、ポリペプチドまたは核酸も含まれる。
任意の局面のいくつかの態様では、本明細書において記載されるポリペプチド（例えば、ポリペプチド）をコードする核酸は、ベクターに含まれる。本明細書において記載される局面のいくつかでは、本明細書において記載される所与のポリペプチドをコードする核酸配列、またはその任意のモジュールは、ベクターに動作可能に連結されている。本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、宿主細胞への送達のために、または異なる宿主細胞間での移動のために設計された核酸構築物を指す。本明細書において使用される場合、ベクターはウイルス性または非ウイルス性であり得る。用語「ベクター」は、適切な制御要素と関連する場合に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移すことができる任意の遺伝子要素を包含する。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどが含まれ得るが、それに限定されるわけではない。
任意の局面のいくつかの態様では、ベクターは組換えであり、例えば、少なくとも2つの異なる供給源に由来する配列を含む。任意の局面のいくつかの態様では、ベクターは、少なくとも2つの異なる種に由来する配列を含む。任意の局面のいくつかの態様では、ベクターは、少なくとも2つの異なる遺伝子に由来する配列を含み、例えば、少なくとも1つの非天然（例えば、異種）遺伝子制御要素（例えば、プロモーター、サプレッサー、アクチベーター、エンハンサー、応答要素など）に動作可能に連結された発現産物をコードする融合タンパク質または核酸を含む。
任意の局面のいくつかの態様では、本明細書において記載されるベクターまたは核酸は、コドン最適化されており、例えば、核酸配列の天然配列または野生型配列は、改変または操作された核酸が天然/野生型配列と同じポリペプチド発現産物をコードするが、所望の発現システムでは改善された効率で転写および/または翻訳されるように代替コドンを含むように改変または操作されている。任意の局面のいくつかの態様では、発現システムは、天然/野生型配列の供給源以外の生物（またはそのような生物から得られた細胞）である。任意の局面のいくつかの態様では、本明細書において記載されるベクターおよび/または核酸配列は、哺乳動物または哺乳動物細胞、例えば、マウス、マウス細胞またはヒト細胞内の発現のためにコドン最適化されている。任意の局面のいくつかの態様では、本明細書において記載されるベクターおよび/または核酸配列は、ヒト細胞内の発現のためにコドン最適化されている。任意の局面のいくつかの態様では、本明細書において記載されるベクターおよび/または核酸配列は、酵母または酵母細胞内の発現のためにコドン最適化されている。任意の局面のいくつかの態様では、本明細書において記載されるベクターおよび/または核酸配列は、細菌細胞内の発現のためにコドン最適化されている。任意の局面のいくつかの態様では、本明細書において記載されるベクターおよび/または核酸配列は、大腸菌細胞内の発現のためにコドン最適化されている。
本明細書において使用される場合、用語「発現ベクター」は、ベクター上の転写制御配列に連結された配列からのRNAまたはポリペプチドの発現を導くベクターを指す。発現される配列は、必ずしもではないが、細胞に対して異種であることが多い。発現ベクターは、追加の要素を含み得、例えば、発現ベクターは、2つの複製システムを有し、したがって、発現ベクターを2つの生物内で、例えば、発現のためのヒト細胞内ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主内で維持することを可能にし得る。
本明細書において使用される場合、用語「ウイルスベクター」は、ウイルス起源の少なくとも1つの要素を含み、かつウイルスベクター粒子に包装される能力を有する核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、必須ではないウイルス遺伝子の代わりに、本明細書において記載されるポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。ベクターおよび/または粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで任意の核酸を細胞に移すために利用され得る。当技術分野において、多数の形態のウイルスベクターが公知である。
本明細書において記載されるベクターは、任意の局面のいくつかの態様では、他の適切な組成物および治療法と組み合わせることができることを理解されたい。任意の局面のいくつかの態様では、ベクターはエピソームである。適切なエピソームベクターの使用は、対象の目的のヌクレオチドを高コピー数の染色体外DNAに維持する手段を提供し、それによって、染色体統合の潜在的な影響を排除する。
本明細書において使用される場合、「接触」は、作用物質を別の作用物質、試薬、配列、細胞または無細胞発現システムに送達または曝露するための任意の適切な手段を指す。例示的な送達方法には、細胞培養培地への直接送達、灌流、注射、または当業者に周知の他の送達方法が含まれるが、それに限定されるわけではない。任意の局面のいくつかの態様では、接触は、物理的な人間の活動、例えば、注射;分配、混合および/またはデカンテーションの行為;および/または送達装置または機械の操作を含む。
用語「統計的に有意」または「有意に」は、統計的有意性を指し、一般に、2標準偏差（2SD）以上の差を意味する。
動作例以外、または他に示されている場合を除き、本明細書において使用される構成要素の量、または反応条件を表すあらゆる数字は、用語「約」によっていずれの場合も修飾されると理解されるべきである。用語「約」は、割合に関連して使用される場合、±1％を意味し得る。
本明細書において使用される場合、用語「対応する」は、第1のポリペプチドもしくは核酸内の列挙された位置にあるアミノ酸もしくはヌクレオチド、または第2のポリペプチドもしくは核酸内の列挙されたアミノ酸もしくはヌクレオチドと同等であるアミノ酸もしくはヌクレオチドを指す。同等の列挙されたアミノ酸またはヌクレオチドは、当技術分野において公知の相同性プログラム、例えば、BLASTの程度を使用して候補配列をアラインメントすることによって決定することができる。
本明細書において使用される場合、用語「特異的結合」は、2つの分子、化合物、細胞および/または粒子間の化学的相互作用を指し、ここで、第1の実体は、非標的である第3の実体に結合するよりも高い特異性および親和性で第2の標的実体に結合する。任意の局面のいくつかの態様では、特異的結合とは、第2の標的実体に対する第1の実体の親和性を指し得、この親和性は、第3の非標的実体に対する親和性の少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍またはそれ以上である。所与の標的に特異的な試薬とは、利用されているアッセイの条件下でその標的に特異的な結合を示す試薬である。
本明細書において開示される、本発明の代替的な要素または態様の群分けは、限定として解釈されるべきではない。各群構成要素は、個別に、または群の他の構成要素もしくは本明細書において見出される他の要素と任意に組み合わせて参照および特許請求され得る。便宜および/または特許性の理由から、ある群の1つまたは複数の構成要素が、ある群に包含されるか、ある群から削除され得る。そのようないずれかの包含または削除が生じる場合、本明細書は、本明細書において、改変された群を含み、したがって、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュ群の記述された説明を満たすと見なされる。
本明細書において別途定義されない限り、本出願に関連して使用される科学用語および技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書において記載される特定の方法、プロトコルおよび試薬などに限定されず、それ自体が変化し得ることを理解されたい。本明細書において使用される用語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、特許請求の範囲によってのみ規定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。免疫学および分子生物学の一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,20th Edition,published by Merck Sharp＆Dohme Corp.,2018（ISBN 0911910190,978-0911910421）;Robert S.Porter et al.（eds.）,The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine,published by Blackwell Science Ltd.,1999-2012（ISBN 9783527600908）;およびRobert A.Meyers（ed.）,Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995（ISBN 1-56081-569-8）;Immunology by Werner Luttmann,published by Elsevier,2006;Janeway’s Immunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver（eds.）,W.W.Norton＆Company,2016（ISBN 0815345054,978-0815345053）;Lewin’s Genes XI,published by Jones＆Bartlett Publishers,2014（ISBN-1449659055）;Michael Richard Green and Joseph Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA（2012）（ISBN 1936113414）;Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA（2012）（ISBN 044460149X）;Laboratory Methods in Enzymology:DNA,Jon Lorsch（ed.）Elsevier,2013（ISBN 0124199542）;Current Protocols in Molecular Biology（CPMB）,Frederick M.Ausubel（ed.）,John Wiley and Sons,2014（ISBN 047150338X,9780471503385）,Current Protocols in Protein Science（CPPS）,John E.Coligan（ed.）,John Wiley and Sons,Inc.,2005;およびCurrent Protocols in Immunology（CPI）（John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,Warren Strobe,（eds.）John Wiley and Sons,Inc.,2003（ISBN 0471142735,9780471142737）に見出すことができ、これらの内容はいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
特に指示しない限り、本発明は、例えば、いずれも参照によりその全体が本明細書に組み入れられるSambrook and Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press（Cold Spring Harbor,NY 2012）およびDavis et al.,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA（1995）に記載されている標準的な手順を使用して行われた。
他の用語は、本発明の様々な局面の説明の中で本明細書において定義されている。
当業者であれば、本発明を実施する際に使用され得る、本明細書において記載されたものと類似または同等の多くの方法および材料を認識するであろう。実際、本発明は、記載された方法および材料に決して限定されるものではない。
本出願にわたって引用された参照文献、交付済み特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含むすべての特許および他の刊行物は、例えば、本明細書において記載される技術に関連して使用され得るそのような刊行物に記述される方法を説明および開示する目的のために、参照により本明細書に明白に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日よりも前のそれらの開示のために単に提供される。この点に関していかなるものも、本発明者らが、先行発明であるとの理由で、または他のいずれかの理由により、そのような開示に先行する権利がないことの承認と解釈されるべきではない。これらの文献の日付に関する言明または内容に関する説明はいずれも、本出願人が入手可能な情報に基づくものであり、これらの文献の日付または内容が正確であると決して認めるものではない。
本開示の態様の説明は、網羅的であることも、本開示を厳密な開示された形式に限定することも意図するものではない。本開示の特定の態様および実施例は、説明目的のために本明細書において記載されているが、関連技術の当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の改変が可能である。例えば、方法の工程または機能は所与の順序で示されているが、代替的な態様は、異なる順序で機能を行ってもよいか、機能が実質的に同時に行われてもよい。本明細書において提供される本開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書において記載される様々な態様を組み合わせて、さらなる態様を提供することができる。本開示の局面は、本開示のなおさらなる態様を提供するために、必要であれば、上記の参考文献および出願の組成物、機能および概念を使用するように変更することができる。さらに、生物学的機能の等価性の考慮に起因して、種類または量の点で生物学的作用または化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくらかの変更を加えることができる。これらおよび他の変更は、詳細な説明に照らして本開示に加えることができる。そのようなすべての改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるように意図される。
前述の態様のいずれかの特定の要素は、他の態様の要素と組み合わせるか、置き換えることができる。さらに、本開示の特定の態様に関連する利点がこれらの態様の文脈において説明されてきたが、他の態様もそのような利点を示し得、また、必ずしもすべての態様が本開示の範囲内に入るためにそのような利点を示す必要はない。
本明細書において記載される様々な方法および技術は、本発明を実施するためのいくつかの方法を提供する。言うまでもなく、記載されたすべての目的または利点が、本明細書において記載されるいずれかの特定の態様に従って達成され得るとは限らないことを理解されたい。したがって、例えば、当業者であれば、本明細書において教示または示唆され得る他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書において教示される1つの利点または利点の群を達成または最適化するように方法を行うことができることを認識するであろう。本明細書において、様々な有利および不利な代替案が記載されている。いくつかの好ましい態様は、1つの、別の、またはいくつかの有利な特徴を具体的に含み、他の態様は、1つの、別の、またはいくつかの不利な特徴を具体的に除外し、さらに他の態様は、1つの、別の、またはいくつかの有利な特徴を含めることによって目下の不利な特徴を具体的に軽減することを理解されたい。
さらに、当業者であれば、異なる態様からの様々な特徴の適用可能性を認識するであろう。同様に、本明細書において記載される原理に従って方法を行うために、本明細書において説明される様々な要素、特徴および工程、ならびにそのような各要素、特徴または工程の他の公知の均等物が、当業者によって混合および適合され得る。多様な態様では、様々な要素、特徴および工程のうちのいくつかが具体的に含まれ、他は具体的に除外される。
特定の態様および実施例に関して本発明を開示してきたが、本発明の態様は、具体的に開示された態様を超えて、他の代替的な態様および/または使用および改変ならびにそれらの均等物にまで及ぶことが当業者によって理解されるであろう。
本発明の態様では、多くの変形例および代替的な要素が開示されている。なおさらなる変形例および代替要素が、当業者には明らかであろう。これらの変形例の中には、限定されることなく、動作可能に連結および/または機能的に組織化された一本鎖核酸ドメイン、リボソーム結合部位、コドンを含む、さらに、そこで使用される技術および組成物、および溶液の使用、ならびに本発明の教示を通じて作成された生成物の特定の使用を含む核酸センサーシステム構成要素がある。本発明の様々な態様は、これらの変形例または要素のいずれかを具体的に含むか除外することができる。
任意の局面のいくつかの態様では、本発明の特定の態様を説明および特許請求するために使用される成分、特性、例えば、濃度、反応条件などの量を表す数字は、ある場合には用語「約」によって修飾されたものであると理解されるべきである。したがって、任意の局面のいくつかの態様では、記述された説明、および添付の特許請求の範囲に示される数値パラメーターは、特定の態様によって得ることが求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。任意の局面のいくつかの態様では、数値パラメーターは、報告された有効桁数を考慮して、通常の丸め技術を適用することによって、解釈されるべきである。本発明のいくつかの態様の広い範囲を示す数値範囲およびパラメーターが近似値であるとしても、特定の実施例に示される数値は、実行可能な程度に正確に報告される。本発明のいくつかの態様に示された数値は、それぞれの試験測定値に見出された標準偏差に必然的に起因する特定の誤差を含み得る。
任意の局面のいくつかの態様では、本発明の特定の態様を説明する文脈において（特に添付の特許請求の範囲の特定の文脈において）使用される用語「1つの（a）」および「1つの（an）」および「その（the）」ならびに同様の言及は、単数形および複数形の両方を包含すると解釈され得る。本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲内に入る各別個の値を個別に言及する簡略方法として機能することを意図しているに過ぎない。本明細書において別段の指定がない限り、各個々の値は、本明細書において個別に記載されているかのように本明細書に組み入れられる。本明細書において記載されるすべての方法は、本明細書において別段の指定がない限り、または状況と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書において特定の態様に関して提供されるいずれかのおよびすべての実施例または例示的な文言（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をさらによく説明することを意図するものであり、他の方法で特許請求される本発明の範囲に対して限定を課すものではない。本明細書中のいかなる文言も、本発明の実施に不可欠な特許請求されていないいずれかの要素を示すものとして解釈されるべきではない。
本明細書において開示される、本発明の代替的な要素または態様の群分けは、限定として解釈されるべきではない。各群構成要素は、個別に、または群の他の構成要素もしくは本明細書において見出される他の要素と任意に組み合わせて参照および特許請求され得る。便宜および/または特許性の理由から、ある群の1つまたは複数の構成要素が、ある群に包含されるか、ある群から削除され得る。そのようないずれかの包含または削除が生じる場合、本明細書は、本明細書において、改変された群を含み、したがって、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュ群の記述された説明を満たすと見なされる。
本発明を実施するために本発明者に公知の最良の形態を含めて、本発明の好ましい態様が本明細書において記載されている。それらの好ましい態様に対する変形例は、前述の説明を読めば当業者に明らかになるであろう。当業者であれば、必要に応じてそのような変形例を使用することができ、本発明は、本明細書において具体的に記載されている以外の方法で実施することができると企図される。したがって、本発明の多くの態様は、適用法が許容する限り、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題のすべての改変および均等物を含む。さらに、そのすべての可能な変形例における、本明細書において記載される要素の任意の組合せは、本明細書において別段の指定がない限り、または状況と明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
さらに、本明細書全体を通して、特許および印刷された刊行物に対して多数の言及が行われてきた。引用された参考文献および印刷された刊行物のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に個別に組み入れられる。
本明細書において開示される本発明の態様は、本発明の原理の例示であることを理解されたい。使用され得る他の改変は、本発明の範囲内であり得る。したがって、限定されることなく例として、本明細書における教示に従って、本発明の代替的な構成を利用することができる。したがって、本発明の態様は、示され記載されたものと正確に同じ態様に限定されない。
本明細書において記載される技術は、以下の実施例によってさらに説明されており、以下の実施例はさらに限定的であると決して解釈されるべきではない。
本明細書において記載される技術のいくつかの態様は、以下の番号が付されたパラグラフのいずれかに従って規定することができる。
1. a）3’ハイブリダイゼーション領域を含む第1の核酸と、5’ハイブリダイゼーション領域を含む第2の核酸とを含む、核酸センサーシステムであって、
b）第1の核酸および第2の核酸が、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域にハイブリダイズする標的核酸によって架橋された場合に、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列とを含む非鋳型カセットをコードするように構成されている、
核酸センサーシステム。
2. 第2の核酸の3’領域に相補的なプライマーを含む、パラグラフ1の核酸センサーシステム。
3. 第1の核酸および第2の核酸がDNAである、パラグラフ1の核酸センサーシステム。
4. 3’ハイブリダイゼーション領域の少なくとも一部が、プロモーター内、リボソーム結合部位内、またはコード配列内にある、パラグラフ1の核酸センサーシステム。
5. 5’ハイブリダイゼーション領域の少なくとも一部が、プロモーター内、リボソーム結合部位内、またはコード配列内にある、パラグラフ1の核酸センサーシステム。
6. 無細胞発現システムを含む、パラグラフ1〜5のいずれか1つの核酸システム。
7. リガーゼを含む、パラグラフ1〜6のいずれか1つの核酸システム。
8. 逆転写酵素を含む、パラグラフ1〜7のいずれか1つの核酸システム。
9. DNAにハイブリダイズしているRNAを加水分解するリボヌクレアーゼを含む、パラグラフ1〜8のいずれか1つの核酸システム。
10. リボヌクレアーゼがRNAse Hである、パラグラフ9のいずれか1つの核酸システム。
11. a）i）プロモーター、
ii）RBS、
iii）レポータータンパク質のコード配列
を含む、非機能的一本鎖非鋳型形態のDNA発現カセットであって、
カセット内に標的核酸ハイブリダイゼーション配列が挿入されており、カセットが2つの分子に分離されており、分離がハイブリダイゼーション領域内で生じている、DNA発現カセットと、
b）発現カセットの3’領域に相補的な一本鎖DNAプライマーと、
c）リガーゼと、
d）無細胞発現システムと
を含む、核酸センサーシステム。
12. a）5’から3’方向に、
i）プロモーター、
ii）リボソーム結合部位（RBS）、
iii）開始コドン、および
iv）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態のハイブリダイゼーション領域の上流部分の非鋳型鎖
を含む、第1の一本鎖DNA（ssDNA）ドメインと、
b）5’から3’方向に
i）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態のハイブリダイゼーション領域の下流部分、および
ii）ハイブリダイゼーション領域の下流部分の下流で、かつハイブリダイゼーション領域の下流部分とインフレームで連結された、レポータータンパク質のコード配列の非鋳型鎖
を含む、第2のssDNAドメインと、
c）第2のドメインの3’領域に相補的なssDNAプライマーと
を含む、核酸センサーシステム。
13. a）5’から3’方向に、
i）プロモーター、および
ii）ハイブリダイゼーション領域の上流部分の非鋳型鎖
を含む、第1の一本鎖DNA（ssDNA）ドメインと、
b）5’から3’方向に、
i）ハイブリダイゼーション領域の下流部分、
ii）リボソーム結合部位（RBS）、および
iii）レポータータンパク質のコード配列とインフレームで連結された開始コドンの非鋳型鎖
を含む、第2のssDNAドメインと、
c）第2のドメインの3’領域に相補的なssDNAプライマーと
を含む、核酸センサーシステム。
14. a）5’から3’方向に、
i）プロモーター、
ii）リボソーム結合部位（RBS）、
iii）レポータータンパク質のコード配列の上流部分とインフレームで連結された開始コドン、および
iv）レポータータンパク質のコード配列の上流部分の下流で、かつレポータータンパク質のコード配列の上流部分とインフレームに連結された、リーディングフレームの形態のハイブリダイゼーション領域の上流部分の非鋳型鎖
を含む、第1の一本鎖DNA（ssDNA）ドメインと、
b）5’から3’方向に、
i）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態のハイブリダイゼーション領域の下流部分、および
ii）ハイブリダイゼーション領域の下流部分の下流で、かつハイブリダイゼーション領域の下流部分とインフレームで連結された、レポータータンパク質のコード配列の残りの部分の非鋳型鎖
を含む、第2のssDNAドメインと、
c）その3’末端で第2のドメインに相補的なssDNAプライマーと
を含む、核酸センサーシステム。
15. 第1および第2のssDNAドメインが別個のDNA断片であり、第2のssDNAドメインが5’ホスフェートを含む、パラグラフ11〜14のいずれかの核酸センサーシステム。
16. 第2のssDNAドメインが、末端ヘアピンループ内にssDNAプライマーを含むその3’末端に、ヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ15の核酸センサーシステム。
17. 第1のドメインの5’末端が、末端ヘアピンループを形成する配列をさらに含む、パラグラフ16の核酸センサーシステム。
18. 第1および第2のドメインが単一のssDNA配列上に存在するように、第1のドメインの5’末端が、介在するssDNA配列を介して第2のドメインの3’末端に連結されている、パラグラフ12〜15のいずれかの核酸センサーシステム。
19. ハイブリダイゼーション領域が、少なくとも12ヌクレオチドである、パラグラフ1〜18のいずれかの核酸センサーシステム。
20. ハイブリダイゼーション領域の上流部分および下流部分が、それぞれ少なくとも6ヌクレオチドである、パラグラフ19の核酸センサーシステム。
21. レポータータンパク質が、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、βガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、カタラーゼ、炭酸脱水酵素、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、トリプシン、プロテアーゼ、短縮型レポータータンパク質を補完および活性化するペプチドからなる群より選択される、パラグラフ11〜20のいずれかの核酸センサーシステム。
22. リガーゼ、鎖置換DNAポリメラーゼ、dNTP、RNAse阻害剤、および無細胞発現システムのうちの1つまたは複数をさらに含む、パラグラフ12〜21のいずれかの核酸センサーシステム。
23. 無細胞発現システムが全細胞抽出物である、パラグラフ22の核酸センサーシステム。
24. 鎖置換DNAポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ部分を有するクレノウ断片、エキソヌクレアーゼ部分を有しないクレノウ断片、phi29ポリメラーゼおよび改変T7 DNAポリメラーゼからなる群より選択される、パラグラフ22または23の核酸センサーシステム。
25. パラグラフ1〜24のいずれかの核酸センサーシステムと、
陽性対照と
を含む、キット。
26. a）上流および下流のハイブリダイゼーション領域が標的核酸の一部に相補的であり、その結果、上流および下流のハイブリダイゼーション領域への標的核酸のハイブリダイゼーションが、接合部を第1のドメインと第2のドメインとの間に作成する、パラグラフ1〜24のいずれかの核酸センサーシステムを提供する工程;
b）上流および下流のハイブリダイゼーション領域との標的核酸のハイブリダイゼーションに適しかつ上流および下流のハイブリダイゼーション領域のライゲーションに適した条件下、リガーゼの存在下で、核酸センサーシステムと試料とを接触させて、それによって、動作可能に連結されたssDNA反応生成物を生成する工程;
c）DNA重合、転写および翻訳に適した条件下で、工程b）で生成された反応生成物を、鎖置換DNAポリメラーゼと、タンパク質生成に必要なdNTPおよび他のビルディングブロック構成要素と、ssDNAプライマーとを含む無細胞発現システムに接触させて、それによって、レポータータンパク質を生成する工程;
d）存在するレポータータンパク質を測定して、試料中の標的核酸の存在を示す工程
を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法。
27. 核酸センサーシステムの構成要素が、それぞれ約16nMで存在する、パラグラフ26の方法。
28. リガーゼが約100nMで存在する、パラグラフ26の方法。
29. 工程b）が、周囲温度（24〜26C）で、5分〜15分の期間にわたりインキュベートされ、および/または工程c）が、周囲温度で、60分〜3時間の期間にわたりインキュベートされる、パラグラフ26の方法。
30. 無細胞発現システムが、RNAse阻害剤をさらに含む、パラグラフ26の方法。
31. 無細胞発現システムが、第2のドメインの3’末端に相補的なssDNAプライマー12.5uMをさらに含む、パラグラフ26の方法。
32. dNTPの濃度が約230uMである、パラグラフ26の方法。
33. DNAポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ部分を有するクレノウ断片、エキソヌクレアーゼ部分を有しないクレノウ断片、phi29ポリメラーゼおよび改変T7 DNAポリメラーゼからなる群より選択される、パラグラフ26の方法。
34. レポータータンパク質がルシフェラーゼであり、測定が、無細胞発現システム内の発光の検出によるものである、パラグラフ26の方法。
35. 転写が、RNA転写物へのssDNAプライマーのハイブリダイゼーション、逆転写酵素を使用する逆転写、および内部分解性切断をさらに含む、パラグラフ26の方法。
36. 接合部が、標的核酸の多型に対してハイブリダイズするように構成されている、パラグラフ26の方法。
本明細書において記載される技術のいくつかの態様は、以下の番号が付されたパラグラフのいずれかに従って規定することができる。
1. a）3’ハイブリダイゼーション領域を含む第1の核酸と、
b）5’ハイブリダイゼーション領域を含む第2の核酸と
を含む、核酸センサーシステムであって、
第1の核酸および第2の核酸が、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域にハイブリダイズする標的核酸によって架橋された場合に、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列とを含む非鋳型カセットをコードするように構成されている、
核酸センサーシステム。
2. a）3’ハイブリダイゼーション領域を含む第1の核酸と、
b）5’ハイブリダイゼーション領域を含む第2の核酸と
を含む、核酸センサーシステムであって、
第1の核酸および第2の核酸が、一緒にライゲーションされた場合に、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列とを含む非鋳型カセットをコードするように構成されている、
核酸センサーシステム。
3. a）3’ハイブリダイゼーション領域を含む第1の核酸と、
b）5’ハイブリダイゼーション領域を含む第2の核酸と
を含む、核酸センサーシステムであって、
第1の核酸および第2の核酸が、一緒にライゲーションされ、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域にハイブリダイズする標的核酸にハイブリダイズした場合に、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列とを含む非鋳型カセットをコードするように構成されている、
核酸センサーシステム。
4. i）プロモーターと、
ii）リボソーム結合部位（RBS）と、
iii）レポータータンパク質のコード配列と
を含む、非機能的一本鎖非鋳型形態のDNA発現カセット
を含む、核酸センサーシステムであって、
カセット内に、標的核酸ハイブリダイゼーション配列が位置しており、カセットが第1の核酸および第2の核酸に分離されており、分離がハイブリダイゼーション領域内で生じている、
核酸センサーシステム。
5. 第1または第2の核酸のいずれかが、レポータータンパク質のコード配列を含み、かつ残りの核酸がプロモーターを含む、パラグラフ1〜4のいずれかの核酸センサーシステム。
6. 第1または第2の核酸のいずれかが、レポータータンパク質のコード配列を含み、かつ残りの核酸が、プロモーターとリボソーム結合部位とを含む、パラグラフ1〜5のいずれかの核酸センサーシステム。
7. 第1または第2の核酸のいずれかが、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列の開始コドンとを含み、かつ残りの核酸が、レポータータンパク質の残りのコード配列を含む、パラグラフ1〜6のいずれかの核酸センサーシステム。
8. 第1の核酸が、5’から3’方向に、
i）プロモーターと、
ii）リボソーム結合部位（RBS）と、
iii）レポータータンパク質のコード配列の開始コドンと、
iv）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態の3’ハイブリダイゼーション領域と
を含み、かつ
第2の核酸が、5’から3’方向に、
i）レポータータンパク質の残りのコード配列とインフレームのリーディングフレームの形態の5’ハイブリダイゼーション領域と、
ii）5’ハイブリダイゼーション領域の下流で、かつ5’ハイブリダイゼーション領域とインフレームで連結された、レポータータンパク質の残りのコード配列と
を含む、
パラグラフ7の核酸センサーシステム。
9. 第1または第2の核酸のいずれかがプロモーターを含み、かつ残りの核酸が、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列とを含む、パラグラフ1〜8のいずれかの核酸センサーシステム。
10. 第1の核酸が、5’から3’方向に、
i）プロモーターと、
ii）3’ハイブリダイゼーション領域と
を含み、かつ
第2の核酸が、5’から3’方向に、
i）5’ハイブリダイゼーション領域と、
ii）リボソーム結合配列と、
iii）レポータータンパク質のコード配列と
を含む、
パラグラフ9の核酸センサーシステム。
11. 第1または第2の核酸のいずれかが、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列の5’部分とを含み、かつ残りの核酸が、レポータータンパク質の残りのコード配列を含む、パラグラフ1〜10のいずれかの核酸センサーシステム。
12. 第1の核酸が、5’から3’方向に、
i）プロモーターと、
ii）RBSと、
iii）開始コドンおよび少なくとも1つの追加のコドンを含む、レポータータンパク質のコード配列の第1の部分と、
iv）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態の3’ハイブリダイゼーション領域と
を含み、かつ
第2の核酸が、5’から3’方向に、
i）レポータータンパク質のコード配列の第1の部分とインフレームかつレポータータンパク質のコード配列の第2の部分とインフレームのリーディングフレームの形態の5’ハイブリダイゼーション領域と、
ii）5’ハイブリダイゼーション領域の下流で、かつ5’ハイブリダイゼーション領域とインフレームで連結された、レポータータンパク質のコード配列の第2の部分と
を含む、
パラグラフ11の核酸センサーシステム。
13. 3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域が、レポータータンパク質のコード配列に位置している、パラグラフ11〜12のいずれかの核酸センサーシステム。
14. 3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域が、レポータータンパク質の溶媒曝露ループをコードする領域内に位置している、パラグラフ11〜13のいずれかの核酸センサーシステム。
15. 3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域が、レポータータンパク質のコード配列に位置しており、かつレポーター遺伝子機能に実質的に影響を及ぼさない、パラグラフ11〜14のいずれかの核酸センサーシステム。
16. 第1の核酸および第2の核酸がDNAである、パラグラフ1〜15のいずれかの核酸センサーシステム。
17. 第2の核酸が5’ホスフェートを含む、パラグラフ1〜16のいずれかの核酸センサーシステム。
18. 3’ハイブリダイゼーション領域の少なくとも一部が、プロモーター内、リボソーム結合部位内、またはコード配列内にある、パラグラフ1〜17のいずれかの核酸センサーシステム。
19. 5’ハイブリダイゼーション領域の少なくとも一部が、プロモーター内、リボソーム結合部位内、またはコード配列内にある、パラグラフ1〜18のいずれかの核酸センサーシステム。
20. 3’ハイブリダイゼーション領域が、プロモーター内にも、リボソーム結合部位内にも、コード配列内にもないか、それらと同一の範囲に及ばない、パラグラフ1〜19のいずれかの核酸センサーシステム。
21. 3’ハイブリダイゼーション領域が、第1の核酸内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の3’である、パラグラフ1〜20のいずれかの核酸センサーシステム。
22. 5’ハイブリダイゼーション領域が、プロモーター内にも、リボソーム結合部位内にも、コード配列内にもないか、それらと同一の範囲に及ばない、パラグラフ1〜21のいずれかの核酸センサーシステム。
23. 5’ハイブリダイゼーション領域が、第2の核酸内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の5’である、パラグラフ1〜22のいずれかの核酸センサーシステム。
24. 2つのハイブリダイゼーション領域が、合計で少なくとも12ヌクレオチド長である、パラグラフ1〜23のいずれかの核酸センサーシステム。
25. 5’および3’ハイブリダイゼーション領域が、それぞれ少なくとも6ヌクレオチド長である、パラグラフ1〜24のいずれかの核酸センサーシステム。
26. 第1および第2の核酸が別個の分子である、パラグラフ1〜25のいずれかの核酸センサーシステム。
27. 第1および第2の核酸が単一のDNA配列または鎖上に存在するように、第1の核酸の5’末端が、介在するssDNA配列を介して第2の核酸の3’末端に連結されている、パラグラフ1〜26のいずれかの核酸センサーシステム。
28. 第1の核酸の5’末端が、末端ヘアピンループを形成する配列をさらに含む、パラグラフ1〜27のいずれかの核酸センサーシステム。
29. 第2の核酸の3’領域に相補的なプライマーをさらに含む、パラグラフ1〜28のいずれかの核酸センサーシステム。
30. 第2の核酸内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の3’である配列に相補的なプライマーをさらに含む、パラグラフ1〜29のいずれかの核酸センサーシステム。
31. 第2の核酸が、末端ヘアピンループ内にプライマーを含むその3’末端に、ヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ1〜30のいずれかの核酸センサーシステム。
32. レポータータンパク質が、ルシフェラーゼ、ナノルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、βガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、カタラーゼ、炭酸脱水酵素、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、トリプシン、プロテアーゼ、ならびに短縮型レポータータンパク質を補完および活性化するペプチドからなる群より選択される、パラグラフ1〜31のいずれかの核酸センサーシステム。
33. 無細胞発現システムをさらに含む、パラグラフ1〜32のいずれかの核酸システム。
34. リガーゼをさらに含む、パラグラフ1〜33のいずれかの核酸システム。
35. 逆転写酵素をさらに含む、パラグラフ1〜34のいずれかの核酸システム。
36. DNAにハイブリダイズしているRNAを加水分解するリボヌクレアーゼをさらに含む、パラグラフ1〜35のいずれかの核酸システム。
37. リボヌクレアーゼがRNAse Hである、パラグラフ1〜36のいずれかの核酸システム。
38. a）i）発現カセットの3’領域に相補的な、ii）第2の核酸の3’領域に相補的な、iii）第2の核酸内の任意のプロモーター、リボソーム結合部位もしくはコード配列の3’である配列に相補的な、またはiv）発現カセット内の任意のプロモーター、リボソーム結合部位もしくはコード配列の3’である配列に相補的な、一本鎖DNA（ssDNA）プライマーと、
b）リガーゼと、
c）無細胞発現システムと
をさらに含む、パラグラフ1〜37のいずれかの核酸システム。
39. リガーゼ、鎖置換DNAポリメラーゼ、dNTP、RNAse阻害剤、および無細胞発現システムのうちの1つまたは複数をさらに含む、パラグラフ1〜38のいずれかの核酸センサーシステム。
40. 無細胞発現システムが全細胞抽出物である、パラグラフ33〜39のいずれかの核酸センサーシステム。
41. DNAポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ部分を有するクレノウ断片、エキソヌクレアーゼ部分を有しないクレノウ断片、phi29ポリメラーゼ、改変T7 DNAポリメラーゼ、サイクロバチルス由来のポリメラーゼ、鎖置換が増強されたサイクロバチルス由来のポリメラーゼ、およびB. スブチリス由来のポリメラーゼからなる群より選択される、パラグラフ1〜40のいずれかの核酸センサーシステム。
42. 接合部が、標的核酸の多型に対してハイブリダイズするように構成されている、パラグラフ1〜41のいずれかの核酸センサーシステム。
43. 3’または5’ハイブリダイゼーション領域が、標的核酸の多型にハイブリダイズするように構成されている、パラグラフ1〜42のいずれかの核酸センサーシステム。
44. 3’または5’ハイブリダイゼーション領域の遊離末端が、標的核酸の多型にハイブリダイズするように構成されている、パラグラフ1〜43のいずれかの核酸センサーシステム。
45. 多型が、上流または下流のssDNAセンサードメインのいずれかまたは両方の上の、ハイブリダイゼーション領域の接合部にある2つの塩基の一方または両方に位置している、パラグラフ1〜44のいずれかの核酸センサーシステム。
46. ハイブリダイゼーション領域が、1つまたは複数の多型を含む、パラグラフ1〜45のいずれかの核酸センサーシステム。
47. a）3’ハイブリダイゼーション領域を含む第1のドメインと、
b）5’ハイブリダイゼーション領域を含む第2のドメインと
を含む、核酸センサーシステムであって、
第1のドメインおよび第2のドメインが、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域にハイブリダイズする標的核酸によって架橋された場合に、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列とを含む非鋳型カセットをコードするように構成されている、
核酸センサーシステム。
48. a）3’ハイブリダイゼーション領域を含む第1のドメインと、
b）5’ハイブリダイゼーション領域を含む第2のドメインと
を含む、核酸センサーシステムであって、
第1のドメインおよび第2のドメインが、一緒にライゲーションされた場合に、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列とを含む非鋳型カセットをコードするように構成されている、
核酸センサーシステム。
49. a）3’ハイブリダイゼーション領域を含む第1のドメインと、
b）5’ハイブリダイゼーション領域を含む第2のドメインと
を含む、核酸センサーシステムであって、
第1のドメインおよび第2のドメインが、一緒にライゲーションされ、3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域にハイブリダイズする標的核酸にハイブリダイズした場合に、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列とを含む非鋳型カセットをコードするように構成されている、
核酸センサーシステム。
50. i）プロモーターと、
ii）リボソーム結合部位（RBS）と、
iii）レポータータンパク質のコード配列と
を含む、一本鎖非鋳型形態のDNA発現カセット
を含む、核酸センサーシステムであって、
カセット内に、標的核酸ハイブリダイゼーション配列が位置しており、カセットが、第1のドメインと第2のドメインとに分離されているかまたは第1のドメインと第2のドメインとを含み、ドメイン間の分離または移行部が、ハイブリダイゼーション領域内に生じている、
核酸センサーシステム。
51. 第1または第2のドメインのいずれかが、レポータータンパク質のコード配列を含み、かつ残りのドメインがプロモーターを含む、パラグラフ47〜50のいずれかの核酸センサーシステム。
52. 第1または第2のドメインのいずれかが、レポータータンパク質のコード配列を含み、かつ残りのドメインが、プロモーターとリボソーム結合部位とを含む、パラグラフ47〜51のいずれかの核酸センサーシステム。
53. 第1または第2のドメインのいずれかが、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列の開始コドンとを含み、かつ残りのドメインが、レポータータンパク質の残りのコード配列を含む、パラグラフ47〜52のいずれかの核酸センサーシステム。
54. 第1のドメインが、5’から3’方向に、
i）プロモーターと、
ii）リボソーム結合部位（RBS）と、
iii）レポータータンパク質のコード配列の開始コドンと、
iv）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態の3’ハイブリダイゼーション領域と
を含み、かつ
第2のドメインが、5’から3’方向に、
i）レポータータンパク質の残りのコード配列とインフレームのリーディングフレームの形態の5’ハイブリダイゼーション領域と、
ii）5’ハイブリダイゼーション領域の下流で、かつ5’ハイブリダイゼーション領域とインフレームで連結された、レポータータンパク質の残りのコード配列と
を含む、
パラグラフ53の核酸センサーシステム。
55. 第1または第2のドメインのいずれかがプロモーターを含み、かつ残りのドメインが、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列とを含む、パラグラフ47〜54のいずれかの核酸センサーシステム。
56. 第1のドメインが、5’から3’方向に、
i）プロモーターと、
ii）3’ハイブリダイゼーション領域と
を含み、かつ
第2のドメインが、5’から3’方向に、
i）5’ハイブリダイゼーション領域と、
ii）リボソーム結合配列と、
iii）レポータータンパク質のコード配列と
を含む、
パラグラフ55の核酸センサーシステム。
57. 第1または第2のドメインのいずれかが、プロモーターと、リボソーム結合部位と、レポータータンパク質のコード配列の5’部分とを含み、かつ残りのドメインが、レポータータンパク質の残りのコード配列を含む、パラグラフ47〜56のいずれかの核酸センサーシステム。
58. 第1のドメインが、5’から3’方向に、
i）プロモーターと、
ii）RBSと、
iii）開始コドンおよび少なくとも1つの追加のコドンを含む、レポータータンパク質のコード配列の第1の部分と、
iv）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態の3’ハイブリダイゼーション領域と
を含み、かつ
第2のドメインが、5’から3’方向に、
i）レポータータンパク質のコード配列の第1の部分とインフレームかつレポータータンパク質のコード配列の第2の部分とインフレームのリーディングフレームの形態の5’ハイブリダイゼーション領域と、
ii）5’ハイブリダイゼーション領域の下流で、かつ5’ハイブリダイゼーション領域とインフレームで連結された、レポータータンパク質のコード配列の第2の部分と
を含む、
パラグラフ57の核酸センサーシステム。
59. 3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域が、レポータータンパク質の溶媒曝露ループをコードする領域内の、レポータータンパク質のコード配列に位置している、パラグラフ57〜58のいずれかの核酸センサーシステム。
60. 3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域が、レポータータンパク質のコード配列に位置しており、かつレポーター遺伝子機能に実質的に影響を及ぼさない、パラグラフ57〜59のいずれかの核酸センサーシステム。
61. 第1のドメインおよび第2のドメインがDNAである、パラグラフ47〜60のいずれかの核酸センサーシステム。
62. 3’ハイブリダイゼーション領域の少なくとも一部が、プロモーター内、リボソーム結合部位内、またはコード配列内にある、パラグラフ47〜61のいずれかの核酸センサーシステム。
63. 5’ハイブリダイゼーション領域の少なくとも一部が、プロモーター内、リボソーム結合部位内、またはコード配列内にある、パラグラフ47〜62のいずれかの核酸センサーシステム。
64. 3’ハイブリダイゼーション領域が、プロモーター内にも、リボソーム結合部位内にも、コード配列内にもないか、それらと同一の範囲に及ばない、パラグラフ47〜63のいずれかの核酸センサーシステム。
65. 3’ハイブリダイゼーション領域が、第1のドメイン内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の3’である、パラグラフ47〜64のいずれかの核酸センサーシステム。
66. 5’ハイブリダイゼーション領域が、プロモーター内にも、リボソーム結合部位内にも、コード配列内にもないか、それらと同一の範囲に及ばない、パラグラフ47〜65のいずれかの核酸センサーシステム。
67. 5’ハイブリダイゼーション領域が、第2のドメイン内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の5’である、パラグラフ47〜66のいずれかの核酸センサーシステム。
68. 2つのハイブリダイゼーション領域が、合計で少なくとも12ヌクレオチド長である、パラグラフ47〜67のいずれかの核酸センサーシステム。
69. 5’および3’ハイブリダイゼーション領域が、それぞれ少なくとも6ヌクレオチド長である、パラグラフ47〜68のいずれかの核酸センサーシステム。
70. 第1および第2のドメインが同じ分子上にある、パラグラフ47〜69のいずれかの核酸センサーシステム。
71. 第1および第2のドメインが単一のDNA配列または鎖上に存在するように、第1のドメインの5’末端が、介在するssDNA配列を介して第2のドメインの3’末端に連結されている、パラグラフ47〜70のいずれかの核酸センサーシステム。
72. 第1のドメインの5’末端が、末端ヘアピンループを形成する配列をさらに含む、パラグラフ47〜71のいずれかの核酸センサーシステム。
73. 第2のドメインの3’領域に相補的なプライマーをさらに含む、パラグラフ47〜72のいずれかの核酸センサーシステム。
74. 第2のドメイン内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の3’である配列に相補的なプライマーをさらに含む、パラグラフ47〜73のいずれかの核酸センサーシステム。
75. 第2のドメインが、末端ヘアピンループ内にプライマーを含むその3’末端に、ヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ47〜74のいずれかの核酸センサーシステム。
76. レポータータンパク質が、ルシフェラーゼ、ナノルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、βガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、カタラーゼ、炭酸脱水酵素、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、トリプシン、プロテアーゼ、ならびに短縮型レポータータンパク質を補完および活性化するペプチドからなる群より選択される、パラグラフ47〜75のいずれかの核酸センサーシステム。
77. 無細胞発現システムをさらに含む、パラグラフ47〜76のいずれかの核酸システム。
78. リガーゼをさらに含む、パラグラフ47〜77のいずれかの核酸システム。
79. 逆転写酵素をさらに含む、パラグラフ47〜78のいずれかの核酸システム。
80. DNAにハイブリダイズしているRNAを加水分解するリボヌクレアーゼをさらに含む、パラグラフ47〜79のいずれかの核酸システム。
81. リボヌクレアーゼがRNAse Hである、パラグラフ47〜80のいずれかの核酸システム。
82. a）i）発現カセットの3’領域に相補的な、ii）第2の核酸の3’領域に相補的な、iii）第2の核酸内の任意のプロモーター、リボソーム結合部位もしくはコード配列の3’である配列に相補的な、またはiv）発現カセット内の任意のプロモーター、リボソーム結合部位もしくはコード配列の3’である配列に相補的な、一本鎖DNAプライマーと、
b）リガーゼと、
c）無細胞発現システムと
をさらに含む、パラグラフ47〜81のいずれかの核酸システム。
83. リガーゼ、鎖置換DNAポリメラーゼ、dNTP、RNAse阻害剤、および無細胞発現システムのうちの1つまたは複数をさらに含む、パラグラフ47〜82のいずれかの核酸センサーシステム。
84. 無細胞発現システムが全細胞抽出物である、パラグラフ77〜83のいずれかの核酸センサーシステム。
85. DNAポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ部分を有するクレノウ断片、エキソヌクレアーゼ部分を有しないクレノウ断片、phi29ポリメラーゼ、改変T7 DNAポリメラーゼ、サイクロバチルス由来のポリメラーゼ、鎖置換が増強されたサイクロバチルス由来のポリメラーゼ、およびB. スブチリス由来のポリメラーゼからなる群より選択される、パラグラフ47〜84のいずれかの核酸センサーシステム。
86. 接合部が、標的核酸の多型に対してハイブリダイズするように構成されている、パラグラフ47〜85のいずれかの核酸センサーシステム。
87. 3’または5’ハイブリダイゼーション領域が、標的核酸の多型にハイブリダイズするように構成されている、パラグラフ47〜86のいずれかの核酸センサーシステム。
88. 3’または5’ハイブリダイゼーション領域の遊離末端が、標的核酸の多型にハイブリダイズするように構成されている、パラグラフ47〜87のいずれかの核酸センサーシステム。
89. 多型が、上流または下流のssDNAセンサードメインのいずれかまたは両方の上の、ハイブリダイゼーション領域の接合部にある2つの塩基の一方または両方に位置している、パラグラフ47〜88のいずれかの核酸センサーシステム。
90. ハイブリダイゼーション領域が、1つまたは複数の多型を含む、パラグラフ47〜89のいずれかの核酸センサーシステム。
91. a）上流のハイブリダイゼーション領域および下流のハイブリダイゼーション領域が標的核酸の一部に相補的であり、その結果、上流および下流のハイブリダイゼーション領域への標的核酸のハイブリダイゼーションが、接合部を第1の核酸と第2の核酸との間または第1のドメインと第2のドメインとの間に作成する、パラグラフ1〜90のいずれかの核酸センサーシステムを提供する工程;
b）上流および下流のハイブリダイゼーション領域との標的核酸のハイブリダイゼーションに適しかつ上流および下流のハイブリダイゼーション領域のライゲーションに適した条件下、リガーゼの存在下で、核酸センサーシステムと試料とを接触させて、それによって、動作可能に連結されたssDNA反応生成物を生成する工程;
c）DNA重合、RNA転写およびRNA翻訳に適した条件下で、工程b）で生成された反応生成物を、DNAポリメラーゼと、mRNAおよびタンパク質生成に必要なdNTPおよび他のビルディングブロック構成要素と、ssDNAプライマーとを含む無細胞発現システムに接触させて、それによって、レポータータンパク質を生成する工程;
d）存在するレポータータンパク質を測定して、試料中の標的核酸の存在を示す工程
を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法。
92. a）3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域が標的核酸の一部に相補的であり、その結果、2つのハイブリダイゼーション領域への標的核酸のハイブリダイゼーションが、接合部を第1の核酸と第2の核酸との間に作成する、パラグラフ1〜90のいずれかの核酸センサーシステムを提供する工程;
b）3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域との標的核酸のハイブリダイゼーションに適しかつハイブリダイゼーション領域のライゲーションに適した条件下、リガーゼの存在下で、核酸センサーシステムと試料とを接触させて、それによって、動作可能に連結された第1および第2の核酸を含む核酸鎖にハイブリダイズした標的核酸の鎖を含む反応生成物を生成する工程;
c）工程b）で生成された反応生成物と無細胞発現システムとを接触させて、それによって、レポータータンパク質を生成する工程;
d）工程c）で生成されたレポータータンパク質を測定して、試料中の標的核酸の量を決定する工程
を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法。
93. 核酸センサーシステムの構成要素が、それぞれ約16nMで存在する、パラグラフ91〜92のいずれかの方法。
94. リガーゼが約100nMで存在する、パラグラフ91〜93のいずれかの方法。
95. 工程b）が、周囲温度（24〜26℃）で、5分〜15分の期間にわたりインキュベートされ、および/または工程c）が、周囲温度で、60分〜3時間の期間にわたりインキュベートされる、パラグラフ91〜94のいずれかの方法。
96. 無細胞発現システムが、RNase阻害剤をさらに含む、パラグラフ91〜95のいずれかの方法。
97. 無細胞発現システムが、第2の核酸または第2のドメインの3’末端に相補的なssDNAプライマー12.5uMをさらに含む、パラグラフ91〜96のいずれかの方法。
98. 無細胞発現システムが、レポータータンパク質基質をさらに含む、パラグラフ91〜97のいずれかの方法。
99. dNTPの濃度が約230uMである、パラグラフ91〜98のいずれかの方法。
100. DNAポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ部分を有するクレノウ断片、エキソヌクレアーゼ部分を有しないクレノウ断片、phi29ポリメラーゼ、改変T7 DNAポリメラーゼ、サイクロバチルス由来のポリメラーゼ、鎖置換が増強されたサイクロバチルス由来のポリメラーゼ、およびB. スブチリス由来のポリメラーゼからなる群より選択される、パラグラフ91〜99のいずれかの方法。
101. レポータータンパク質がルシフェラーゼであり、レポータータンパク質基質がルシフェラーゼ基質であり、測定が、無細胞発現システム内の発光の検出によるものである、パラグラフ91〜100のいずれかの方法。
102. 転写が、RNA転写物へのssDNAプライマーのハイブリダイゼーション、逆転写酵素を使用する逆転写、および内部分解性切断をさらに含む、パラグラフ91〜101のいずれかの方法。
103. 接合部が、標的核酸の多型に対してハイブリダイズするように構成されている、パラグラフ91〜102のいずれかの方法。
104. 3’または5’ハイブリダイゼーション領域が、標的核酸の多型にハイブリダイズするように構成されている、パラグラフ91〜103のいずれかの方法。
105. 3’または5’ハイブリダイゼーション領域の遊離末端が、標的核酸の多型にハイブリダイズするように構成されている、パラグラフ91〜104のいずれかの方法。
106. 多型が、上流または下流のssDNAセンサードメインのいずれかまたは両方の上の、ハイブリダイゼーション領域の接合部にある2つの塩基の一方または両方に位置している、パラグラフ91〜105のいずれかの方法。
107. 1つまたは複数の多型が、ハイブリダイゼーション領域内に任意で導入され得る、パラグラフ91〜106のいずれかの方法。
本明細書において記載される技術のいくつかの態様は、以下の番号が付されたパラグラフのいずれかに従って規定することができる。
1. 一緒にライゲーションされた場合に、
i）プロモーターと、
ii）リボソーム結合部位（RBS）と、
iii）コード配列と
を含むDNA発現カセットの一本鎖
を生成する、第1および第2の一本鎖DNAセンサー部分
を含む、核酸センサーシステムであって、
第1および第2の一本鎖DNAセンサー部分内に、標的核酸ハイブリダイゼーション配列が位置している、
核酸センサーシステム。
2. 一緒にライゲーションされた場合に、
i）プロモーターと、
ii）リボソーム結合部位（RBS）と、
iii）コード配列と
を含むDNA発現カセットの一本鎖
を生成する、第1および第2の一本鎖DNAセンサー部分
を含む、核酸センサーシステムであって、
該一本鎖は、
iv）3’および5’ハイブリダイゼーション領域を含む、標的核酸ハイブリダイゼーション配列
を含み、ここで、該3’ハイブリダイゼーション領域は、第1のセンサー部分に含まれており、かつ該5’ハイブリダイゼーション領域は、第2のセンサー部分に含まれており、そのため、該センサーシステムが、該標的核酸配列とハイブリダイズする標的核酸を含む試料に接触した場合に、該標的核酸とのハイブリダイゼーションによって、該第1の部分と該第2の部分のライゲーションが可能になり、該一本鎖が生成される、
核酸センサーシステム。
3. DNA発現カセットが、非鋳型DNA発現カセットである、パラグラフ1〜2のいずれか1つの核酸センサーシステム。
4. 発現カセットの第1および第2のセンサー部分が、発現カセット内の任意の所与の位置で分離されている、パラグラフ1〜3のいずれか1つの核酸センサーシステム。
5. 前記分離が、前記標的核酸ハイブリダイゼーション配列内で生じている、パラグラフ4記載の核酸センサーシステム。
6. 前記標的核酸ハイブリダイゼーション配列が、発現カセット内の任意の所与の位置に位置している、パラグラフ1〜4のいずれか1つの核酸センサーシステム。
7. 第1または第2のセンサー部分のいずれかがコード配列を含み、かつ残りのセンサー部分がプロモーターを含む、パラグラフ1〜6のいずれか1つの核酸センサーシステム。
8. 第1または第2のセンサー部分のいずれかが、プロモーターと、リボソーム結合部位とを含み、かつ残りのセンサー部分がコード配列を含む、パラグラフ1〜7のいずれか1つの核酸センサーシステム。
9. 第1または第2のセンサー部分のいずれかが、プロモーターと、リボソーム結合部位と、コード配列の開始コドンとを含み、かつ残りのセンサー部分が残りのコード配列を含む、パラグラフ1〜8のいずれか1つの核酸センサーシステム。
10. 第1のセンサー部分が、5’から3’方向に、
i）プロモーターと、
ii）リボソーム結合部位（RBS）と、
iii）コード配列の開始コドンと、
iv）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態の3’ハイブリダイゼーション領域と
を含み、かつ
第2のセンサー部分が、5’から3’方向に、
i）残りのコード配列とインフレームのリーディングフレームの形態の5’ハイブリダイゼーション領域と、
ii）5’ハイブリダイゼーション領域の下流で、かつ5’ハイブリダイゼーション領域とインフレームで連結された、残りのコード配列と
を含む、
パラグラフ9記載の核酸センサーシステム。
11. 第1または第2のセンサー部分のいずれかがプロモーターを含み、かつ残りのセンサー部分がリボソーム結合部位とコード配列とを含む、パラグラフ1〜10のいずれか1つの核酸センサーシステム。
12. 第1のセンサー部分が、5’から3’方向に、
i）プロモーターと、
ii）3’ハイブリダイゼーション領域と
を含み、かつ
第2のセンサー部分が、5’から3’方向に、
i）5’ハイブリダイゼーション領域と、
ii）リボソーム結合配列と、
iii）コード配列と
を含む、
パラグラフ11記載の核酸センサーシステム。
13. 第1または第2のセンサー部分のいずれかが、プロモーターと、リボソーム結合部位と、コード配列の5’部分とを含み、かつ残りのセンサー部分が残りのコード配列を含む、パラグラフ1〜12のいずれか1つの核酸センサーシステム。
14. 第1のセンサー部分が、5’から3’方向に、
i）プロモーターと、
ii）RBSと、
iii）開始コドンおよび少なくとも1つの追加のコドンを含む、コード配列の第1の部分と、
iv）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態の3’ハイブリダイゼーション領域と
を含み、かつ
第2のセンサー部分が、5’から3’方向に、
i）コード配列の第1の部分とインフレームかつコード配列の第2の部分とインフレームのリーディングフレームの形態の5’ハイブリダイゼーション領域と、
ii）5’ハイブリダイゼーション領域の下流で、かつ5’ハイブリダイゼーション領域とインフレームで連結された、コード配列の第2の部分と
を含む、
パラグラフ13記載の核酸センサーシステム。
15. 3’ハイブリダイゼーション領域の少なくとも一部が、プロモーター内、リボソーム結合部位内、またはコード配列内にある、パラグラフ1〜14のいずれか1つの核酸センサーシステム。
16. 5’ハイブリダイゼーション領域の少なくとも一部が、プロモーター内、リボソーム結合部位内、またはコード配列内にある、パラグラフ1〜15のいずれか1つの核酸センサーシステム。
17. 3’ハイブリダイゼーション領域が、プロモーター内にも、リボソーム結合部位内にも、コード配列内にもない、パラグラフ1〜16のいずれか1つの核酸センサーシステム。
18. 3’ハイブリダイゼーション領域が、第1のセンサー部分内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の3’である、パラグラフ1〜17のいずれか1つの核酸センサーシステム。
19. 5’ハイブリダイゼーション領域が、プロモーター内にも、リボソーム結合部位内にも、コード配列内にもない、パラグラフ1〜18のいずれか1つの核酸センサーシステム。
20. 5’ハイブリダイゼーション領域が、第2のセンサー部分内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の5’である、パラグラフ1〜19のいずれか1つの核酸センサーシステム。
21. 3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域が、合計で少なくとも12ヌクレオチド長である、パラグラフ1〜20のいずれか1つの核酸センサーシステム。
22. 3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域が、それぞれ少なくとも6ヌクレオチド長である、パラグラフ1〜21のいずれか1つの核酸センサーシステム。
23. 第1および第2のセンサー部分が同じ分子上にある、パラグラフ1〜22のいずれか1つの核酸センサーシステム。
24. 第1および第2のセンサー部分が単一の分子を形成するように、第1のセンサー部分の5’末端が、介在するssDNA配列を介して第2のセンサー部分の3’末端に連結されている、パラグラフ1〜23のいずれか1つの核酸センサーシステム。
25. 非鋳型発現カセット内の配列に相補的な、または介在するssDNA配列に相補的なプライマーをさらに含む、パラグラフ1〜24のいずれか1つの核酸センサーシステム。
26. 第1および第2のセンサー部分が、少なくとも2つの別個の分子上にある、パラグラフ1〜22のいずれか1つの核酸センサーシステム。
27. 第1のセンサー部分の5’末端が、末端ヘアピンループを形成する配列をさらに含む、パラグラフ1〜22または26のいずれか1つの核酸センサーシステム。
28. 第2のセンサー部分の3’領域に相補的なプライマーをさらに含む、パラグラフ1〜22または26〜27のいずれか1つの核酸センサーシステム。
29. 第2のセンサー部分内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の3’である配列に相補的なプライマーをさらに含む、パラグラフ23〜25のいずれか1つの核酸センサーシステム。
30. 第2のセンサー部分内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の領域5’に相補的なプライマーをさらに含む、パラグラフ23〜25のいずれか1つの核酸センサーシステム。
31. 第2のセンサー部分が、末端ヘアピンループ内にプライマーを含むその3’末端に、ヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ1〜22および26〜30のいずれか1つの核酸センサーシステム。
32. DNA発現カセットのコード配列が、ポリペプチドをコードする、パラグラフ1〜31のいずれか1つの核酸センサーシステム。
33. 前記ポリペプチドがレポータータンパク質である、パラグラフ32記載の核酸センサーシステム。
34. 3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域が、レポータータンパク質の溶媒曝露ループをコードする領域内のコード配列に位置している、パラグラフ13〜14のいずれか1つの核酸センサーシステム。
35. 3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域が、レポータータンパク質のコード配列に位置しており、かつレポーター遺伝子機能に実質的に影響を及ぼさない、パラグラフ13〜14または34のいずれか1つの核酸センサーシステム。
36. レポータータンパク質が、ルシフェラーゼ、ナノルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、βガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、カタラーゼ、炭酸脱水酵素、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、トリプシン、プロテアーゼ、短縮型レポータータンパク質を補完および活性化するペプチド、ならびにアッセイによって検出可能なポリペプチドを含む、パラグラフ33記載の核酸センサーシステム。
37. 無細胞発現システムをさらに含む、パラグラフ1〜36のいずれか1つの核酸システム。
38. リガーゼをさらに含む、パラグラフ1〜37のいずれか1つの核酸システム。
39. 逆転写酵素をさらに含む、パラグラフ1〜38のいずれか1つの核酸システム。
40. DNAにハイブリダイズしているRNAを加水分解するリボヌクレアーゼをさらに含む、パラグラフ1〜39のいずれか1つの核酸システム。
41. リボヌクレアーゼがRNAse Hである、パラグラフ40記載の核酸システム。
42. リガーゼ、鎖置換DNAポリメラーゼ、dNTP、RNAse阻害剤、および無細胞発現システムのうちの1つまたは複数をさらに含む、パラグラフ1〜41のいずれか1つの核酸センサーシステム。
43. 前記無細胞発現システムが全細胞抽出物である、パラグラフ37〜42のいずれか1つの核酸センサーシステム。
44. DNAポリメラーゼをさらに含む、パラグラフ1〜43のいずれか1つの核酸センサーシステム。
45. DNAポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ部分を有するクレノウ断片、エキソヌクレアーゼ部分を有しないクレノウ断片、phi29ポリメラーゼ、改変T7 DNAポリメラーゼ、サイクロバチルス（Psychrobacillus）由来のポリメラーゼ、鎖置換が増強されたサイクロバチルス由来のポリメラーゼ、B. スブチリス（B. subtilis）由来のポリメラーゼ、シーケナーゼバージョン2.0、Bsu DNAポリメラーゼ大断片、Bst 3.0 DNAポリメラーゼ、Phusion（登録商標）高忠実性DNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ部分を有しないVent（登録商標）DNAポリメラーゼ、Vent（登録商標）DNAポリメラーゼ、Q5（登録商標）高忠実性DNAポリメラーゼ、およびDNAポリメラーゼI大（クレノウ）断片からなる群より選択される、パラグラフ44記載の核酸センサーシステム。
46. 標的核酸の多型が、第1のセンサー部分のハイブリダイゼーション領域の3’末端および第2のセンサー部分のハイブリダイゼーション領域の5’にある配列にハイブリダイズする、パラグラフ1〜45のいずれか1つの核酸センサーシステム。
47. 第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域または第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域が、標的核酸の多型にハイブリダイズするように構成されている、パラグラフ1〜46のいずれか1つの核酸センサーシステム。
48. 第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域の遊離末端または第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域の遊離末端が、標的核酸の多型にハイブリダイズするように構成されている、パラグラフ1〜47のいずれか1つの核酸センサーシステム。
49. 多型のハイブリダイゼーション配列が、第1のセンサー部分のハイブリダイゼーション領域の最も3’側の塩基および第2のセンサー部分のハイブリダイゼーション領域の5’側の塩基のうちの一方または両方を含む、パラグラフ1〜48のいずれか1つの核酸センサーシステム。
50. 標的核酸ハイブリダイゼーション領域が、1つまたは複数の多型を含む、パラグラフ1〜49のいずれか1つの核酸センサーシステム。
51. a）標的核酸を含む試料を提供する工程;
b）発現カセットの第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域および第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域に対する標的核酸のハイブリダイゼーションに好適な条件下、リガーゼの存在下で、標的核酸を含む試料と、パラグラフ1〜50のいずれか1つの核酸センサーシステムとを接触させて、それによって、互いに動作可能に連結された第1のセンサー部分および第2のセンサー部分にハイブリダイズした標的核酸を含む反応生成物を生成する工程;
c）レポータータンパク質の生成に好適な条件下、鎖置換DNAポリメラーゼおよびプライマーの存在下で、工程b）で生成された反応生成物と、無細胞発現システムとを接触させる工程;
d）工程c）で生成された反応生成物と、レポータータンパク質の発現の検出を可能にする試薬とを接触させる工程;
e）工程d）で生成されたレポータータンパク質の発現を測定して、試料中の標的核酸の存在および/または量を決定する工程
を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法。
52. リガーゼが無細胞システムの一部として提供される、パラグラフ51記載の方法。
53. a）標的核酸を含む試料を提供する工程;
b）発現カセットの第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域および第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域に対する標的核酸配列のハイブリダイゼーションに好適な条件下、リガーゼおよび任意でプライマーの存在下で、標的核酸を含む試料と、パラグラフ1〜50のいずれか1つの核酸センサーシステムとを接触させて、それによって、互いに動作可能に連結された第1のセンサー部分および第2のセンサー部分にハイブリダイズした標的核酸を含む反応生成物を生成する工程;
c）レポータータンパク質の生成に好適な条件下、鎖置換DNAポリメラーゼの存在下で、工程b）で生成された反応生成物と、無細胞発現システムとを接触させる工程;
d）工程c）で生成された反応生成物と、レポータータンパク質の発現の検出を可能にする試薬とを接触させる工程;
e）工程d）で生成されたレポータータンパク質の発現を測定して、試料中の標的核酸の存在および/または量を決定する工程
を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法。
54. リガーゼが、無細胞システムの一部として提供される、パラグラフ53記載の方法。
55. a）標的核酸を含む試料を提供する工程;
b）発現カセットの第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域および第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域に対する標的核酸のハイブリダイゼーションに好適かつレポータータンパク質の生成に好適な条件下で、標的核酸を含む試料を、i）リガーゼの存在下で、パラグラフ1〜50のいずれか1つの核酸センサーシステムと、ならびにii）鎖置換DNAポリメラーゼおよびプライマーの存在下で、無細胞発現システムと、接触させる工程;
c）工程b）で生成された反応生成物と、レポータータンパク質の発現の検出を可能にする試薬とを接触させる工程;
d）工程d）で生成されたレポータータンパク質の発現を測定して、試料中の標的核酸の存在および/または量を決定する工程
を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法。
56. リガーゼが、無細胞システムの一部として提供される、パラグラフ55記載の方法。
57. a）標的核酸配列を含む試料を提供する工程;
b）発現カセットの第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域および第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域に対する標的核酸のハイブリダイゼーションに好適かつレポータータンパク質の生成に好適な条件下で、標的核酸配列を含む試料を、i）リガーゼの存在下で、パラグラフ1〜50のいずれか1つの核酸センサーシステムと、ii）鎖置換DNAポリメラーゼおよびプライマーの存在下で、無細胞発現システムと、ならびにiii）レポータータンパク質の発現の検出を可能にする試薬と、接触させる工程;
c）工程b）で生成されたレポータータンパク質の発現を測定して、試料中の標的核酸の存在および/または量を決定する工程
を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法。
58. リガーゼが、無細胞システムの一部として提供される、パラグラフ57記載の方法。
59. a）包装材内にパラグラフ1〜50のいずれか1つの核酸センサーシステムを含む、組成物と、
b）試料採取装置と、
c）陽性対照と、
d）使用説明書と
を含む、キット。
実施例1
核酸配列
核酸配列はいずれも、表1に含まれている（示されたDNA配列）。PAGE精製により、Integrated DNA Technologies（IDT、Coralville,IA）から、短いオリゴヌクレオチド（＜200ヌクレオチド（nt））A部分を購入した。以下に詳述するように、IDTから購入したgBlockから、比較的長い（＞200nt）ssDNA構成要素およびRNA標的配列を調製した。
実施例2
ssDNAセンサー構成要素の調製
プライマーおよびQ5 PCRキット（New England Biolabs、NEB、Ipswich,MA）を使用してgBlockを増幅する。200μLのPCR反応には、100μLのQ5マスターミックス、97μLの水、1μLのgBlock（10ng/μL）、1μLの各100μMの非標識フォワードプライマーおよびビオチン化リバースプライマーを含める。PCR反応は、98℃で2分間のホットスタート、10秒間の98℃変性、20秒間の68℃アニーリングおよび30秒間の72℃伸長、続いて2分間の72℃最終伸長の35サイクルにより実行される。PCR反応物をプールし、Zymo Research（Irvine,CA）製のDNA-25 Clean and Concentrateカラム上で精製し、50μLのH2Oに溶出し、確認のために2％E-gel EX（Invitrogen、Carlsbad,CA）上で泳動する。Nanodrop（ThermoFisher Scientific、Waltham,MA）上で濃度を決定する。Dynabeads MyOneストレプトアビジンC1磁気ビーズ（ThermoFisher Scientific）を使用してssDNA構築物を精製する。完全な結合を保証するために約20％過剰なビーズを使用して、PCR濃度と、20μg ds-DNA/1mgビーズのビーズ結合能とに基づいて、ビーズ体積を計算する。ビーズを2.0mLチューブに移し、粒子濃縮器ラック（MPC）を介してペレット化する。1×結合および洗浄バッファー（B/W、5mM Tris-HCl、pH7.5、0.5mM EDTA、1M NaCl）を使用して、ビーズを2回洗浄する。1体積の2×B/Wを1体積のPCR溶出液に加え、PCRミックスをビーズに加え、室温で最低20分間回転させる。ビーズを濃縮し、2回洗浄する。1体積の100mM冷NaOHを用いて、ssDNAを2回溶出する。0.1体積の1M HClおよび0.1体積の3M NaOAc、pH5.0を用いて溶出液を中和し、Zymo Oligo Clean and Concentrateキット（Zymo Research）を使用して精製する。
実施例3
RNA標的の調製
5’T7プロモーターを用いて標的RNA配列をコードするgBlockをIDTから購入し、HiScribeインビトロ転写システム（NEB）に加え、反応を約4時間実行した。Zymo RNA Clean and Concentrateキット（Zymo Research）を使用してRNAを精製し、Nanodropを使用して濃度を決定した。
実施例4
大腸菌内で標的RNAを発現するプラスミドの構築
pUC19に基づくpgRNA-細菌プラスミドを含むDH5α大腸菌細胞をAddgeneから購入し（プラスミド番号44251）、アンピシリンを含むLB中で増殖させ、mini-prep（Zymo Research）によりプラスミドを精製した。Q5部位特異的変異誘発（NEB）を使用して、標的RNAをコードするDNA配列をベクターに挿入し、コロニーPCRを用いて検証した。
実施例5
RNA抽出物の調製
RNA標的配列を発現するプラスミドを用いて形質転換されたDH5α大腸菌細胞をOD600が0.3になるまで37℃で増殖させた。0.75mLのTRIzol LS試薬（Thermo Fisher）を250μLの細胞に加え、ピペッティングにより混合した。この混合物を室温で5分間インキュベートした。0.2mLのクロロホルムを加え、細胞を3分間放置した。次に、反応物を12000×g、4℃で15分間遠心分離した。遠心分離後、水相（上相）をZymo RNA Clean and Concentrate（Zymo Research）精製カラムに加え、25μLで溶出した。精製したRNAをDNase Iを用いて処理し、別のRNA精製カラムに加えてRNA抽出物を生成した。同じ0.3ODまで増殖させ、ペレット化し、RNA保存バッファー（Invitrogen、1mMクエン酸ナトリウム、pH6.4）に再懸濁する間に10倍濃縮した大腸菌細胞から全細胞抽出物を得た。95℃で5分間のインキュベーションにより細胞を熱溶解した。
実施例6
標準的な検出アッセイ条件
0.41単位のPBCV-1 DNAリガーゼ、3uMリバースプライマー、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM ATPおよび10mM DTTと、それぞれ38nMのA部分およびB部分センサー構成要素とを1.2uLで組み合わせ、示されるように室温（24〜26℃）で5〜15分間インキュベートする。センサーの結合およびライゲーション反応後、0.45v/v PURExpress溶液A（NEB）、0.34v/v PURExpress溶液B（NEB）、0.91単位のマウスRNase阻害剤（NEB）、228uM dNTP混合物（NEB）、0.02v/v Nano-Glo基質（Promega）、および0.125単位のDNAポリメラーゼから構成される1.6ulの無細胞発現および基質混合物を加え、光学的に透明なフィルムを用いて発現反応を密封し、Biotek（Winooski,VT）Synergy NEOプレートリーダーを用いて100ゲインでエンドポイントの読み取りを行う。いずれの改変も、以下の実施例の説明に記載する。
実施例7
図1に示すように、システムの主要構成要素には以下が含まれる:
一本鎖DNA「A」ドメイン、
5’リン酸化された一本鎖DNA「B」ドメイン
Bドメインの3’末端にハイブリダイズするssDNAプライマー、
リガーゼ、
DNAポリメラーゼ、および
無細胞発現システム。
実施例8
発現カセットの破壊
上流（またはA）部分と下流（またはB）部分（例えば、図2A参照）の2つの別個の部分に発現カセットを分割することによって、T7プロモーターと、リボソーム結合部位（RBS）と、ルシフェラーゼレポータータンパク質のコード配列とからなる二本鎖DNA発現カセットを破壊した。分割発現カセットの3つのバージョンには以下が含まれる:
バージョン1（v1）-コード配列の開始コドン（ATG）の後に分割、
バージョン2（v2）-プロモーターとRBSとの間で分割、および
バージョン3（v3）-レポータータンパク質のループまたはターン内に埋め込まれた分割。
v1およびv2構築物は、標的の36ヌクレオチドRNA配列に結合するように設計された分割部位に36ヌクレオチドの挿入領域を含む。挿入されたハイブリダイゼーション領域の18ヌクレオチドはA部分の3’末端上にあり、ハイブリダイゼーション領域の18ヌクレオチドはB部分の5’末端上にある。2つの異なるRNA分子（T1およびT2）を標的にするために、v1およびv2設計のそれぞれに対して2つの構築物を作成した。v3構築物は挿入されたハイブリダイゼーション領域を含まず、分割部位の領域に相補的であるように標的RNAを設計した。上記の各バージョンのセンサーssDNA部分を図3に示す。すべての構築物および標的のDNA配列を表1に列挙する。
v1、v2およびv3の完全なインタクトなdsDNA発現カセット、ならびにそれぞれのdsDNA A部分またはB部分をPCRによって生成した。線状産物を無細胞発現システムに加えて、発光を測定することによって、ルシフェラーゼレポーターの転写、翻訳および活性をモニタリングした（例えば、図4A〜図4Cを参照）。200μM dNTP、0.22mg/mL BSAおよびNano-Glo基質（Promega）を添加した無細胞発現システム（PURExpress、NEB）にPCR産物（12.5nM）を直接加え、周囲温度（24〜26℃）で1時間インキュベートした。プレートリーダーを使用して、3つの別個の反応について、およびブランクウェルについて、発光を測定した。
実施例9
バージョン1センサーシステムによる標的RNAの高感度検出
別個のssDNA A部分およびB部分を架橋する同種のRNA標的配列の存在に基づいて、活性化についてv1センサーシステム（図3）を試験した。標的ハイブリダイゼーション部位に相補的ではない追加のオフ標的RNA配列も試験した。5分間のライゲーションと、それに続く1時間の発現反応によるRNA標的（T2）のv1センサー検出を示すデータを図5A〜図5Bに示す。クレノウ断片+exo（例えば、図5Aを参照）およびシーケナーゼ（例えば、図5Bを参照）の2つの異なるDNAポリメラーゼの性能を試験した。
また、標的RNA T1による活性化についてv1センサーシステムを試験した。実験は、ライゲーション時間が5分から15分に増加したことを除いて、上記のように実行した。T1 RNAのフェムトモル検出を図6に示す。
実施例10
大腸菌RNAおよび全細胞抽出物のバックグラウンドにおけるv1センサーの高い特異性
2.6から2600ngまで総大腸菌RNA（ThermoFisher Scientific）の量を増加させながらv1センサー性能を評価した。RNAバックグラウンドからの追加体積に対応するために、ストックssDNAセンサー部分AおよびBの初期濃度を7.5倍増加させることによって標準検出アッセイを改変し、より少ない体積のセンサーが同じ最終センサー濃度を達成できるようにした。これにより、他の反応成分濃度を変化させることなく、異なる体積のバックグラウンドRNAを加えることができた。非特異的大腸菌RNAの様々なバックグラウンドにおけるT1 RNAの検出を図7に示す。
また、標的T1を検出するv1センサーシステムを用いて、バックグラウンド成分として、トリゾール抽出によって大腸菌から得られたRNA（RNAex）、および95℃で5分間加熱することによって溶解された同等量（4x106）の細胞からの粗全細胞抽出物（WCex）を試験した。データを図8に示す。
実施例11
大腸菌内で発現した標的RNAの検出
T2標的を発現するプラスミドを含む大腸菌を回収し、95℃で5分間加熱して溶解するか（WCex）、トリゾールによりRNA抽出物に処理した（RNAex）。図9に示すように、v1センサーシステムを使用して、15分間のライゲーションおよび室温での1時間の発現インキュベーションの両条件で標的RNAを検出した。
実施例12
ヒト唾液のバックグラウンドにおける標的RNAの検出
v1センサーシステムを使用して、プールされたヒト唾液（Innovative Research Inc.、Novi,MI）の濃度（v/v）を増加させながらT1標的RNAの固定濃度（50pM）を検出した。データを図10に示す。
実施例13
代替的なDNAポリメラーゼの性能
コード鎖伸長工程に様々なDNAポリメラーゼを使用して、v3センサーシステム（例えば、図3を参照）の性能を試験した。DNAポリメラーゼの処理能力、エキソヌクレアーゼ活性、および混乱状態はいずれも、性能に影響を及ぼす可能性がある。A部分およびB部分の構成要素をそれぞれ12.5nMで加え、8.6nMの標的RNAとともにインキュベートした。周囲温度（24〜26℃）で5分間インキュベートした後、125nMリバースDNAプライマー、および以下のDNAポリメラーゼ、すなわち、クレノウ断片+exo、クレノウ断片-exo、phi29ポリメラーゼまたはシーケナーゼのうちの1つ（各0.15U）を添加した無細胞発現システム（PurExpress、NEB）にライゲーション反応を加えた。反応物を周囲温度で1時間さらにインキュベートした。標的2による性能を図11A〜図11Dに示す。
実施例14
代替的なセンサー構成要素スキームの性能
A部分およびB部分が同じssDNA配列上にあり、BがAの5’になっている、図2B（i）に示すv1の代替的なセンサー構成要素スキームを作成した。一方はT7ターミネータードメイン（CSt）を用いてRNA転写物を終結させ、他方は3つの反復終止コドン（CSs）を含む2つの構築物を試験した。これらの代替的なスキームの性能を示すデータを図12に示す。
（表１）核酸配列。各センサー設計のA部分およびB部分を列挙する。完全長（AB）対照は、A部分およびB部分の両方の組合せである。小文字は、挿入されたスペーサードメインを示す。
Figure 2021533771
Figure 2021533771
Figure 2021533771
Figure 2021533771
Figure 2021533771
実施例15
一塩基変異（SNV）の識別
一塩基多型または一塩基変異は、上流または下流のssDNAセンサードメインのいずれかの上で、ハイブリダイゼーション領域の接合部にある2つの塩基のうちの1つにSNPまたはSNVの位置を配置することによって、本明細書において記載される方法および組成物を使用して検出することができる。任意の局面のいくつかの態様では、1つまたは複数のミスマッチ塩基が、ハイブリダイゼーション領域内にさらに導入され得る。
v1を使用して4つの異なる例示的な変異体を試験した。標的配列と、SNPまたはSNVを表す試験した変異体とを以下の表2に列挙する。SNVを反映する塩基の変化は太字で示されている。
（表２）核酸配列。一塩基変異（SNV）を有するRNA変異体。
Figure 2021533771
実施例6に記載のセンサーを用いて、上に列挙した一本鎖RNA配列を検出した。図13に示すように、ハイブリダイゼーション領域接合部の一端または両端に一致しないヌクレオチドが存在することに基づいて、異なる応答が観察される。
実施例16
代替的なDNAポリメラーゼの性能
実施例6および13に記載の方法による機能について、v1を使用して、複数のDNAポリメラーゼを試験した。以下に列挙する追加のポリメラーゼおよびポリメラーゼ製剤も試験した:IsoPol（サイクロバチルス由来のポリメラーゼ）:1反応当たり4単位;IsoPol SD+（鎖置換が増強されたサイクロバチルス由来のポリメラーゼ）:1反応当たり4単位（さらに少ない単位の酵素を使用した追加の実施例を示した）;またはBsu（B. スブチリス由来のポリメラーゼ）:1反応当たり4単位。
CT標的RNA配列（+RNA）を標的とするインビトロ検出システムで、標的RNA配列を有しない陰性対照（-RNA）と対比して、これらのポリメラーゼの性能を試験した（例えば、図14A参照）。これらの測定値に基づくシグナル対バックグラウンド比（S:B比）も、各ポリメラーゼについて試験した（例えば、図14Bを参照）。
さらに、該検出方法を用いて、異なる量のIsoPol SD+単位を試験した（例えば、図14Cを参照）。わずか1.7単位の酵素により、効果的な検出が達成された。
実施例17
ssDNAセンサー部分を設計するための、コード配列内で発現カセットを分離する複数の方法の実証
本明細書において、発現カセットを分割し、標的ハイブリダイゼーション配列を挿入するための3つの例示的な位置が記載されている（例えば、図3のバージョン3を参照）。当業者であれば、任意のレポーターまたは他のタンパク質の溶媒曝露ループが、追加のアミノ酸の挿入に適した位置であることを理解するであろう（例えば、DNA配列内のハイブリダイゼーション領域の挿入の結果として）。本明細書において、複数の溶媒曝露ループ部位で発現カセットを分割して、得られたssDNAセンサー部分から機能的な核酸感知システムを作成する能力が実証されている。発現カセットは、ナノルシフェラーゼ酵素（NLuc）をコードする遺伝子を含む。試験したNluc内の溶媒曝露ループ領域（ループ1〜5）を表3に示す。分割/挿入部位の両端のポリペプチド配列内のアミノ酸の1文字略号および番号を示す。例えば、E50-N51は、アミノ酸位置50のグルタメートとアミノ酸位置51のアスパラギンとをコードするコドン間のコード配列へのハイブリダイゼーション配列の挿入を示す。
（表３）Nluc内の溶媒曝露ループ領域（ループ1〜5）の位置
Figure 2021533771
図15Aに示すように、示された溶媒曝露ループ領域にハイブリダイゼーション配列が挿入されたNlucについて活性を試験した。ハイブリダイゼーション配列の挿入に起因するNluc内の追加のアミノ酸は、ルシフェラーゼ機能に実質的に影響を与えなかった。
さらに、記載されているように、これらの分割位置および標的CT配列に基づいてssDNAセンサー部分を構築し、100nMの標的CT RNAの検出についてこれらを試験した。発現カセットの分割位置はいずれも、標的RNAを効果的に検出することができた（例えば、図15Bを参照）。
実施例18
分割ナノルシフェラーゼ構築物
アッセイでバックグラウンドが比較的低いA部分およびB部分を同定するために、ルシフェラーゼコード配列の中央に分割部位を選択した（例えば、図3のバージョン3を参照）。分割部位をルシフェラーゼコード配列に移動することにより、個々の部分の偽の転写および翻訳からのバックグラウンドシグナルが、ルシフェラーゼタンパク質の非機能的断片のみを生じる。
挿入を含めるのに適している可能性がある、ルシフェラーゼタンパク質の14の異なる領域を同定した。これらの領域内の14の異なる分割部位（例えば、SEQ ID NO:28および表4を参照）を試験して、成功したライゲーションの非存在下でインビトロ無細胞発現システムに2つの断片が発現される場合にバックグラウンド酵素シグナルが低い分割部位を同定した。これらの部位は、ナノルシフェラーゼタンパク質の公知のループに位置する。T7プロモーターによって促進される転写および翻訳、最適なRBS部位、ならびにATG開始コドンにより、A部分およびB部分を構築した（例えば、図16を参照）。
SEQ ID NO:28は、これらの試験で使用されたルシフェラーゼの配列であり、開始コドンを含まない。
Figure 2021533771
（表４）SEQ ID NO:28で試験された分割部位の一覧
Figure 2021533771
分割部位2、3、4、5、6、7、10、11、12、13は、A部分およびB部分を含む分割構築物として試験した場合（例えば、図16を参照）、ナノルシフェラーゼ内で発光シグナルが最も低い部位であった（例えば、図17を参照）。
ライゲーション工程が成功した後に機能的な完全長ルシフェラーゼ遺伝子を生じる分割部位を同定するために、T7プロモーターと、RBSと、開始コドンと、トリガー配列を有する完全長ルシフェラーゼ遺伝子とを有するPCR構築物を生成した。トリガー配列は、2つの部分が別個に発現された際にバックグラウンドシグナルが最も低い分割部位に挿入した（例えば、図17を参照）。
翻訳されたタンパク質が、3グリシンの短いリンカーが両側に隣接する以下の配列IYALLTLPPLNN（SEQ ID NO:29）を含むように、ルシフェラーゼ遺伝子の分割部位に挿入された特定のクラミジア-RNA-センサー（トリガー）配列を用いて、バックグラウンドが比較的低い部位（2、3、4、5、6、7、10、11、12、13）を試験した。

Claims (59)

  1. 一緒にライゲーションされた場合に、
    i）プロモーターと、
    ii）リボソーム結合部位（RBS）と、
    iii）コード配列と
    を含むDNA発現カセットの一本鎖
    を生成する、第1および第2の一本鎖DNAセンサー部分
    を含む、核酸センサーシステムであって、
    第1および第2の一本鎖DNAセンサー部分内に、標的核酸ハイブリダイゼーション配列が位置している、
    核酸センサーシステム。
  2. 一緒にライゲーションされた場合に、
    i）プロモーターと、
    ii）リボソーム結合部位（RBS）と、
    iii）コード配列と
    を含むDNA発現カセットの一本鎖
    を生成する、第1および第2の一本鎖DNAセンサー部分
    を含む、核酸センサーシステムであって、
    該一本鎖は、
    iv）3’および5’ハイブリダイゼーション領域を含む、標的核酸ハイブリダイゼーション配列
    を含み、ここで、該3’ハイブリダイゼーション領域は、第1のセンサー部分に含まれており、かつ該5’ハイブリダイゼーション領域は、第2のセンサー部分に含まれており、そのため、該センサーシステムが、該標的核酸配列とハイブリダイズする標的核酸を含む試料に接触した場合に、該標的核酸とのハイブリダイゼーションによって、該第1の部分と該第2の部分のライゲーションが可能になり、該一本鎖が生成される、
    核酸センサーシステム。
  3. DNA発現カセットが、非鋳型DNA発現カセットである、請求項1〜2のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  4. 発現カセットの第1および第2のセンサー部分が、発現カセット内の任意の所与の位置で分離されている、請求項1〜3のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  5. 前記分離が、前記標的核酸ハイブリダイゼーション配列内で生じている、請求項4記載の核酸センサーシステム。
  6. 前記標的核酸ハイブリダイゼーション配列が、発現カセット内の任意の所与の位置に位置している、請求項1〜4のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  7. 第1または第2のセンサー部分のいずれかがコード配列を含み、かつ残りのセンサー部分がプロモーターを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  8. 第1または第2のセンサー部分のいずれかが、プロモーターと、リボソーム結合部位とを含み、かつ残りのセンサー部分がコード配列を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  9. 第1または第2のセンサー部分のいずれかが、プロモーターと、リボソーム結合部位と、コード配列の開始コドンとを含み、かつ残りのセンサー部分が残りのコード配列を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  10. 第1のセンサー部分が、5’から3’方向に、
    i）プロモーターと、
    ii）リボソーム結合部位（RBS）と、
    iii）コード配列の開始コドンと、
    iv）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態の3’ハイブリダイゼーション領域と
    を含み、かつ
    第2のセンサー部分が、5’から3’方向に、
    i）残りのコード配列とインフレームのリーディングフレームの形態の5’ハイブリダイゼーション領域と、
    ii）5’ハイブリダイゼーション領域の下流で、かつ5’ハイブリダイゼーション領域とインフレームで連結された、残りのコード配列と
    を含む、
    請求項9記載の核酸センサーシステム。
  11. 第1または第2のセンサー部分のいずれかがプロモーターを含み、かつ残りのセンサー部分がリボソーム結合部位とコード配列とを含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  12. 第1のセンサー部分が、5’から3’方向に、
    i）プロモーターと、
    ii）3’ハイブリダイゼーション領域と
    を含み、かつ
    第2のセンサー部分が、5’から3’方向に、
    i）5’ハイブリダイゼーション領域と、
    ii）リボソーム結合配列と、
    iii）コード配列と
    を含む、
    請求項11記載の核酸センサーシステム。
  13. 第1または第2のセンサー部分のいずれかが、プロモーターと、リボソーム結合部位と、コード配列の5’部分とを含み、かつ残りのセンサー部分が残りのコード配列を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  14. 第1のセンサー部分が、5’から3’方向に、
    i）プロモーターと、
    ii）RBSと、
    iii）開始コドンおよび少なくとも1つの追加のコドンを含む、コード配列の第1の部分と、
    iv）開始コドンとインフレームのリーディングフレームの形態の3’ハイブリダイゼーション領域と
    を含み、かつ
    第2のセンサー部分が、5’から3’方向に、
    i）コード配列の第1の部分とインフレームかつコード配列の第2の部分とインフレームのリーディングフレームの形態の5’ハイブリダイゼーション領域と、
    ii）5’ハイブリダイゼーション領域の下流で、かつ5’ハイブリダイゼーション領域とインフレームで連結された、コード配列の第2の部分と
    を含む、
    請求項13記載の核酸センサーシステム。
  15. 3’ハイブリダイゼーション領域の少なくとも一部が、プロモーター内、リボソーム結合部位内、またはコード配列内にある、請求項1〜14のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  16. 5’ハイブリダイゼーション領域の少なくとも一部が、プロモーター内、リボソーム結合部位内、またはコード配列内にある、請求項1〜15のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  17. 3’ハイブリダイゼーション領域が、プロモーター内にも、リボソーム結合部位内にも、コード配列内にもない、請求項1〜16のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  18. 3’ハイブリダイゼーション領域が、第1のセンサー部分内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の3’である、請求項1〜17のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  19. 5’ハイブリダイゼーション領域が、プロモーター内にも、リボソーム結合部位内にも、コード配列内にもない、請求項1〜18のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  20. 5’ハイブリダイゼーション領域が、第2のセンサー部分内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の5’である、請求項1〜19のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  21. 3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域が、合計で少なくとも12ヌクレオチド長である、請求項1〜20のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  22. 3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域が、それぞれ少なくとも6ヌクレオチド長である、請求項1〜21のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  23. 第1および第2のセンサー部分が同じ分子上にある、請求項1〜22のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  24. 第1および第2のセンサー部分が単一の分子を形成するように、第1のセンサー部分の5’末端が、介在するssDNA配列を介して第2のセンサー部分の3’末端に連結されている、請求項1〜23のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  25. 非鋳型発現カセット内の配列に相補的な、または介在するssDNA配列に相補的なプライマーをさらに含む、請求項1〜24のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  26. 第1および第2のセンサー部分が、少なくとも2つの別個の分子上にある、請求項1〜22のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  27. 第1のセンサー部分の5’末端が、末端ヘアピンループを形成する配列をさらに含む、請求項1〜22または26のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  28. 第2のセンサー部分の3’領域に相補的なプライマーをさらに含む、請求項1〜22または26〜27のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  29. 第2のセンサー部分内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の3’である配列に相補的なプライマーをさらに含む、請求項23〜25のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  30. 第2のセンサー部分内の任意のプロモーターの、リボソーム結合部位の、またはコード配列の領域5’に相補的なプライマーをさらに含む、請求項23〜25のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  31. 第2のセンサー部分が、末端ヘアピンループ内にプライマーを含むその3’末端に、ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1〜22および26〜30のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  32. DNA発現カセットのコード配列が、ポリペプチドをコードする、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  33. 前記ポリペプチドがレポータータンパク質である、請求項32記載の核酸センサーシステム。
  34. 3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域が、レポータータンパク質の溶媒曝露ループをコードする領域内のコード配列に位置している、請求項13〜14のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  35. 3’ハイブリダイゼーション領域および5’ハイブリダイゼーション領域が、レポータータンパク質のコード配列に位置しており、かつレポーター遺伝子機能に実質的に影響を及ぼさない、請求項13〜14または34のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  36. レポータータンパク質が、ルシフェラーゼ、ナノルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、βガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、カタラーゼ、炭酸脱水酵素、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、トリプシン、プロテアーゼ、短縮型レポータータンパク質を補完および活性化するペプチド、ならびにアッセイによって検出可能なポリペプチドを含む、請求項33記載の核酸センサーシステム。
  37. 無細胞発現システムをさらに含む、請求項1〜36のいずれか一項記載の核酸システム。
  38. リガーゼをさらに含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の核酸システム。
  39. 逆転写酵素をさらに含む、請求項1〜38のいずれか一項記載の核酸システム。
  40. DNAにハイブリダイズしているRNAを加水分解するリボヌクレアーゼをさらに含む、請求項1〜39のいずれか一項記載の核酸システム。
  41. リボヌクレアーゼがRNAse Hである、請求項40記載の核酸システム。
  42. リガーゼ、鎖置換DNAポリメラーゼ、dNTP、RNAse阻害剤、および無細胞発現システムのうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項1〜41のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  43. 前記無細胞発現システムが全細胞抽出物である、請求項37〜42のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  44. DNAポリメラーゼをさらに含む、請求項1〜43のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  45. DNAポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ部分を有するクレノウ断片、エキソヌクレアーゼ部分を有しないクレノウ断片、phi29ポリメラーゼ、改変T7 DNAポリメラーゼ、サイクロバチルス（Psychrobacillus）由来のポリメラーゼ、鎖置換が増強されたサイクロバチルス由来のポリメラーゼ、B. スブチリス（B. subtilis）由来のポリメラーゼ、シーケナーゼバージョン2.0、Bsu DNAポリメラーゼ大断片、Bst 3.0 DNAポリメラーゼ、Phusion（登録商標）高忠実性DNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ部分を有しないVent（登録商標）DNAポリメラーゼ、Vent（登録商標）DNAポリメラーゼ、Q5（登録商標）高忠実性DNAポリメラーゼ、およびDNAポリメラーゼI大（クレノウ）断片からなる群より選択される、請求項44記載の核酸センサーシステム。
  46. 標的核酸の多型が、第1のセンサー部分のハイブリダイゼーション領域の3’末端および第2のセンサー部分のハイブリダイゼーション領域の5’にある配列にハイブリダイズする、請求項1〜45のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  47. 第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域または第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域が、標的核酸の多型にハイブリダイズするように構成されている、請求項1〜46のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  48. 第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域の遊離末端または第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域の遊離末端が、標的核酸の多型にハイブリダイズするように構成されている、請求項1〜47のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  49. 多型のハイブリダイゼーション配列が、第1のセンサー部分のハイブリダイゼーション領域の最も3’側の塩基および第2のセンサー部分のハイブリダイゼーション領域の5’側の塩基のうちの一方または両方を含む、請求項1〜48のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  50. 標的核酸ハイブリダイゼーション領域が、1つまたは複数の多型を含む、請求項1〜49のいずれか一項記載の核酸センサーシステム。
  51. a）標的核酸を含む試料を提供する工程;
    b）発現カセットの第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域および第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域に対する標的核酸のハイブリダイゼーションに好適な条件下、リガーゼの存在下で、標的核酸を含む試料と、請求項1〜50のいずれか一項記載の核酸センサーシステムとを接触させて、それによって、互いに動作可能に連結された第1のセンサー部分および第2のセンサー部分にハイブリダイズした標的核酸を含む反応生成物を生成する工程;
    c）レポータータンパク質の生成に好適な条件下、鎖置換DNAポリメラーゼおよびプライマーの存在下で、工程b）で生成された反応生成物と、無細胞発現システムとを接触させる工程;
    d）工程c）で生成された反応生成物と、レポータータンパク質の発現の検出を可能にする試薬とを接触させる工程;
    e）工程d）で生成されたレポータータンパク質の発現を測定して、試料中の標的核酸の存在および/または量を決定する工程
    を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法。
  52. リガーゼが無細胞システムの一部として提供される、請求項51記載の方法。
  53. a）標的核酸を含む試料を提供する工程;
    b）発現カセットの第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域および第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域に対する標的核酸配列のハイブリダイゼーションに好適な条件下、リガーゼおよび任意でプライマーの存在下で、標的核酸を含む試料と、請求項1〜50のいずれか一項記載の核酸センサーシステムとを接触させて、それによって、互いに動作可能に連結された第1のセンサー部分および第2のセンサー部分にハイブリダイズした標的核酸を含む反応生成物を生成する工程;
    c）レポータータンパク質の生成に好適な条件下、鎖置換DNAポリメラーゼの存在下で、工程b）で生成された反応生成物と、無細胞発現システムとを接触させる工程;
    d）工程c）で生成された反応生成物と、レポータータンパク質の発現の検出を可能にする試薬とを接触させる工程;
    e）工程d）で生成されたレポータータンパク質の発現を測定して、試料中の標的核酸の存在および/または量を決定する工程
    を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法。
  54. リガーゼが、無細胞システムの一部として提供される、請求項53記載の方法。
  55. a）標的核酸を含む試料を提供する工程;
    b）発現カセットの第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域および第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域に対する標的核酸のハイブリダイゼーションに好適かつレポータータンパク質の生成に好適な条件下で、標的核酸を含む試料を、i）リガーゼの存在下で、請求項1〜50のいずれか一項記載の核酸センサーシステムと、ならびにii）鎖置換DNAポリメラーゼおよびプライマーの存在下で、無細胞発現システムと、接触させる工程;
    c）工程b）で生成された反応生成物と、レポータータンパク質の発現の検出を可能にする試薬とを接触させる工程;
    d）工程d）で生成されたレポータータンパク質の発現を測定して、試料中の標的核酸の存在および/または量を決定する工程
    を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法。
  56. リガーゼが、無細胞システムの一部として提供される、請求項55記載の方法。
  57. a）標的核酸配列を含む試料を提供する工程;
    b）発現カセットの第1のセンサー部分の3’ハイブリダイゼーション領域および第2のセンサー部分の5’ハイブリダイゼーション領域に対する標的核酸のハイブリダイゼーションに好適かつレポータータンパク質の生成に好適な条件下で、標的核酸配列を含む試料を、i）リガーゼの存在下で、請求項1〜50のいずれか一項記載の核酸センサーシステムと、ii）鎖置換DNAポリメラーゼおよびプライマーの存在下で、無細胞発現システムと、ならびにiii）レポータータンパク質の発現の検出を可能にする試薬と、接触させる工程;
    c）工程b）で生成されたレポータータンパク質の発現を測定して、試料中の標的核酸の存在および/または量を決定する工程
    を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法。
  58. リガーゼが、無細胞システムの一部として提供される、請求項57記載の方法。
  59. a）包装材内に請求項1〜50のいずれか一項記載の核酸センサーシステムを含む、組成物と、
    b）試料採取装置と、
    c）陽性対照と、
    d）使用説明書と
    を含む、キット。
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