CN104673888B - 检测核酸 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了检测目标核酸的方法和材料。提供了例如，用于检测目标核酸存在与否的方法和材料，用于检测存在于样品中的目标核酸量的方法和材料，用于检测目标核酸存在与否的试剂盒，用于检测存在于样品中的目标核酸量的试剂盒，以及制备这样的试剂盒的方法。

Description

检测核酸
本申请是2009.08.04提交的CN 200980141331.4，题为“检测核酸”的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年8月15日提交的美国临时申请序列号61/089,392和2009年4月6日提交的美国临时申请序列号61/166,843的优先权。在先申请的公开内容被认为是本申请的一部分，并在此引入以供参考。
背景技术
1.技术领域
本申请涉及与检测核酸有关的方法和材料。例如，本申请涉及与用限制性内切核酸酶的酶促扩增级联检测核酸有关的方法和材料。
2.背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种常用的扩增和检测核酸的技术。例如，实时PCR可用于扩增和检测样品中的少量模板DNA。通常PCR涉及向认为含有待扩增目标核酸的样品中加入一对核酸引物和热稳定DNA聚合酶，例如Taq聚合酶。使含有引物对和聚合酶的样品经历热循环启动链式反应，其中位于引物之间的目标核酸模板指数扩增。可用凝胶电泳等技术检测扩增的模板是否存在，或扩增的模板量可以采用涉及使用荧光标记探针的技术评估。
发明内容
本申请提供了检测目标核酸的方法和材料。例如，本申请提供了检测样品中目标核酸存在与否的方法和材料，检测样品中目标核酸量的方法和材料，检测样品中目标核酸存在与否的试剂盒，检测样品中存在的目标核酸量的试剂盒，以及制备该试剂盒的方法。总的说，本文提供的方法和材料可包括进行如本文所述的限制性内切核酸酶的酶促扩增级联，以迅速、低廉、灵敏、特异的方式检测目标核酸。在一些情况下，本文提供的方法和材料能够补充或代替目前基于PCR的核酸检测方法。
本文提供的方法和材料能够让临床人员、专业医生、实验室人员、和研究人员检测任何类型的目标核酸。例如，本文提供的方法和材料能够用于基因定型应用，以检测核酸突变(例如单核苷酸多态性(SNP))、基因组重组和基因组表观遗传事件(例如DNA甲基化事件)，可用于诊断和预后应用，以检测病毒或微生物(例如细菌、真菌、和原生动物)，可用于基因表达应用，以检测特定细胞类型中的mRNA水平，还可用于法医学应用，以比较样品之间的一致性或评估样品来源。在一些情况下，本文提供的方法和材料可被医学/生物技术专业以外的人用于检测目标核酸。例如，本文提供的检测细菌(例如大肠杆菌)的试剂盒可以设计用作家用检测试剂盒，从而让使用者能够检测其获得的生物学样品(例如血样、黏液样品、或唾液样品)中大肠杆菌核酸的存在与否
一般说，本发明的一个方面是一种评估样品中目标核酸的方法。该方法包括或主要由以下组成：(a)使所述样品与探针核酸接触，所述探针核酸包含扩增性限制性内切核酸酶和在下述条件下与所述目标核酸的序列互补的核苷酸序列：如果所述目标核酸存在于所述样品中，所述目标核酸的至少一部分与所述探针核酸的至少一部分杂交，形成含有限制性内切核酸酶酶切位点的核酸的双链部分，(b)使所述核酸的双链部分与识别性限制性内切核酸酶接触，所述限制性内切核酸酶能在下述条件下在所述限制性内切核酸酶酶切位点处切开所述核酸的双链部分：所述识别性限制性内切核酸酶在所述限制性内切核酸酶酶切位点切开所述核酸的双链部分，从而使所述探针核酸中含有所述扩增性限制性内切核酸酶的部分与所述探针核酸的至少一部分分离；(c)使所述探针核酸中含有所述扩增性限制性内切核酸酶的部分与含有核酸双链部分的报道核酸接触，所述核酸双链部分含有所述扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点，所述接触的条件是其中所述扩增性限制性内切核酸酶在所述扩增性限制性内切核酸酶的所述限制性内切核酸酶酶切位点切开所述报道核酸，从而使所述报道核酸的一部分与所述报道核酸的至少另一部分分离，和(d)确定所述报道核酸的所述部分是否存在，其中所述报道核酸的所述部分存在表明所述样品含有所述目标核酸，其中所述报道核酸的所述部分不存在表明所述样品不含所述目标核酸。探针核酸可以是单链探针核酸。探针核酸可以结合在固相载体上。探针核酸可以直接结合在固相载体上。包含扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分通过所述步骤(b)从固相载体上释放。步骤(a)和步骤(b)是在同一区室中进行的。步骤(a)和步骤(b)在第一区室中进行，步骤(c)是在第二区室中进行。步骤(a)和步骤(b)是通过将所述样品加到含有探针核酸和识别性限制性内切核酸酶的区室中进行的。探针核酸包含(i)单链部分，单链部分含有与目标核酸序列互补的核苷酸序列，以及(ii)双链部分。探针核酸包含第一核酸链，其含有与所述目标核酸的序列互补的核苷酸序列，与含有扩增性限制性内切核酸酶的第二核酸链杂交。第一核酸链结合在固相载体上。第一核酸链可直接结合在固相载体上。第二核酸链的一部分与第一核酸链杂交，形成双链部分。包含所述扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分与探针核酸的至少另一个部分在步骤(b)中分离，探针核酸的部分包含第一核酸链的一部分和全部第二链。包含扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分与探针核酸的至少另一部分在步骤(b)中分离，探针核酸的部分包含目标核酸的至少一部分。该方法包括在步骤(a)中使用多个所述探针核酸。该方法包括在步骤(c)中使用多个报道核酸。步骤(c)中的报道核酸相对于来自步骤(b)的含有扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分摩尔过量。在步骤(b)中与所述探针核酸的至少另一部分分离的含有所述扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分的分子数基本上与所述样品中存在的所述目标核酸的分子数成线性关系。报道核酸可结合在固相载体上。报道核酸可直接结合在固相载体上。报道核酸可包含核酸的单链部分。报道核酸可包含标记。标记可以是荧光标记、放射性标记、酶标记、或氧化还原标记。与报道核酸的所述至少另一部分分离的报道核酸的部分可包含所述标记。报道核酸可包含第一核酸链，所述第一核酸链可包含所述标记，与第二核酸链杂交。第二核酸链可结合在固相载体上。第二核酸链可直接结合在固相载体上。第一核酸链的一部分可与第二核酸链杂交，形成包含扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点的核酸的双链部分。报道核酸可包含第三核酸链。第三核酸链的一部分可与所述第二核酸链杂交，形成包含扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点的核酸的双链部分。报道核酸可结合在固相载体上，报道核酸的部分与报道核酸的至少另一部分分离，且含有标记，该部分在步骤(c)中从固相载体上释放。确定步骤(d)可包括检测所述标记。标记可以是荧光标记，确定步骤(d)可包括检测荧光标记。确定步骤(d)可包括用毛细电泳技术检测与报道核酸的至少另一部分分离的报道核酸的部分。步骤(a)、(b)和(c)可不经过核酸扩增。步骤(a),(b),(c),和(d)可不经过核酸扩增。确定步骤可包括确定存在于样品内的目标核酸的量。
在另一个方面，本文描述了一种评估样品中的目标核酸的方法。该方法包括或主要由以下步骤组成：(a)使样品与探针核酸接触，探针核酸包含起始扩增性限制性内切核酸酶和在下述条件下与目标核酸的序列互补的核苷酸序列：如果目标核酸存在于样品中，目标核酸的至少一部分与探针核酸的至少一部分杂交，形成含有限制性内切核酸酶酶切位点的核酸的双链部分，(b)使核酸的双链部分与识别性限制性内切核酸酶接触，限制性内切核酸酶能在下述条件下在限制性内切核酸酶酶切位点处切开核酸的双链部分：识别性限制性内切核酸酶在限制性内切核酸酶酶切位点切开核酸的双链部分，从而使探针核酸含有起始扩增性限制性内切核酸酶的部分与探针核酸的至少一部分分离；(c)使探针核酸含有起始扩增性限制性内切核酸酶的部分与第一信号放大核酸接触，第一信号放大核酸包含第二扩增性限制性内切核酸酶和核酸的双链部分，双链部分包含起始扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点，接触的条件是起始扩增性限制性内切核酸酶在起始扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点切开第一信号放大核酸，从而将包含第二扩增性限制性内切核酸酶的第一信号放大核酸的部分与第一核酸的至少另一部分分离；(d)使包含第二扩增性限制性内切核酸酶的第一信号放大核酸的部分与第二信号放大核酸接触，第二信号放大核酸包含起始扩增性限制性内切核酸酶和核酸的双链部分，双链部分包含第二扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点，接触的条件是第二扩增性限制性内切核酸酶在第二扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点切开第二信号放大核酸，从而使含有起始扩增性限制性内切核酸酶的第二核酸的部分与第二信号放大核酸的至少另一部分分离；(e)使(i)包含起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分，(ii)包含起始扩增性限制性内切核酸酶的第二信号放大核酸的部分，(iii)包含第二扩增性限制性内切核酸酶的第一信号放大核酸的部分，或(iv)其任何组合与包含核酸的双链部分的报道核酸接触，该部分包含起始扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点和/或第二扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点，接触的条件是起始扩增性限制性内切核酸酶在起始扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点切开报道核酸，从而将报道核酸的一部分与报道核酸的至少另一部分分开，和(f)确定所述报道核酸部分是否存在，其中所述报道核酸部分存在表明样品含有目标核酸，其中所述报道核酸部分不存在表明样品不含目标核酸。探针核酸可以是单链探针核酸。探针核酸可结合在固相载体上。探针核酸可直接结合在固相载体上。包含起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸部分通过所述步骤(b)从固相载体上释放。步骤(a)和步骤(b)可在同一区室中进行。步骤(c)和步骤(d)可在同一区室中进行。步骤(a)和步骤(b)可在第一区室中进行，步骤(c)和步骤(d)可在第二区室中进行。步骤(a)和步骤(b)是通过将所述样品加到含有所述探针核酸和所述识别性限制性内切核酸酶的区室中进行的。步骤(c)和步骤(d)是通过将含有起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分加入到含有所述第一信号放大核酸和第二信号放大核酸的区室中进行的。探针核酸可包含(i)单链部分，单链部分含有与目标核酸的序列互补的核苷酸序列，以及(ii)双链部分。探针核酸可包含第一核酸链，第一核酸链可含有与目标核酸的序列互补的核苷酸序列，与含有起始扩增性限制性内切核酸酶的第二核酸链杂交。第一核酸链可结合在固相载体上。第一核酸链可直接结合在固相载体上。第二核酸链的一部分可与第一核酸链杂交，形成双链部分。包含起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分与探针核酸的至少另一部分在步骤(b)中分离，探针核酸的该部分可包含第一核酸链的一部分和全部第二链。包含起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分与探针核酸的至少另一部分在步骤(b)中分离，探针核酸的该部分可包含目标核酸的至少一部分。该方法可包括在步骤(a)中使用多个所述探针核酸。该方法可包括在步骤(e)中使用多个报道核酸。步骤(e)中的报道核酸相对于来自步骤(b)的含有起始扩增性限制性内切核酸酶的所述探针核酸的部分摩尔过量。在步骤(b)中与所述探针核酸的至少另一部分分离的含有起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分的分子数基本上与样品中存在的目标核酸的分子数成线性关系。第一信号放大核酸和第二信号放大核酸可结合在固相载体上。第一信号放大核酸和第二信号放大核酸可直接结合在固相载体上。第一信号放大核酸和第二信号放大核酸在同一区室中结合在固相载体上。第一信号放大核酸中包含第二扩增性限制性内切核酸酶的部分通过步骤(c)从固相载体上释放。第二信号放大核酸中包含起始扩增性限制性内切核酸酶的部分通过步骤(d)从固相载体上释放。第一信号放大核酸可包含第一核酸链，该第一核酸链包含第二扩增性限制性内切核酸酶，与第二核酸链杂交，形成核酸的双链部分，该双链部分包含起始扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点。第一核酸链可结合在固相载体上。第一核酸链可直接结合在固相载体上。第二核酸链可结合在固相载体上。第二核酸链可直接结合在固相载体上。第二信号放大核酸可包含第一核酸链，其包含所述起始扩增性限制性内切核酸酶，第一核酸链与第二核酸链杂交，形成核酸的双链部分，该双链部分包含第二扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点。第一核酸链可结合在固相载体上。第一核酸链可直接结合在固相载体上。第二核酸链可结合在固相载体上。第二核酸链可直接结合在固相载体上。报道核酸可结合在固相载体上。报道核酸可直接结合在固相载体上。报道核酸可包含核酸的单链部分。报道核酸可包含标记。标记可以是荧光标记、放射性标记、酶标记、或氧化还原标记。与报道核酸的至少另一部分分离的报道核酸的部分包含标记。报道核酸可包含第一核酸链，所述第一核酸链包含标记，与第二核酸链杂交。第二核酸链可结合在固相载体上。第二核酸链可直接结合在固相载体上。第一核酸链的一部分与第二核酸链杂交，形成核酸的双链部分，该部分包含起始扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点。报道核酸可包含第三核酸链。第三核酸链可与第二核酸链杂交，形成核酸的双链部分，包含起始扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点。报道核酸可结合在固相载体上，报道核酸中与报道核酸的至少另一部分分离并含有标记的部分在步骤(e)中从固相载体上释放。确定步骤(f)可包括检测标记。标记可以是荧光标记，确定步骤(f)可包括检测荧光标记。确定步骤(f)可包括用毛细电泳技术检测与报道核酸的至少另一部分分离的报道核酸部分。步骤(a)、(b)、(c)、(d)和(e)可不经过核酸扩增。步骤(a),(b),(c),(d)，(e)和(f)可不经过核酸扩增。确定步骤可包括确定存在于样品内的目标核酸的量。
在另一方面，本文描述了一种评估样品中的目标核酸的方法。该方法包括，或主要由以下步骤组成：(a)使样品与探针核酸接触，探针核酸包含起始扩增性限制性内切核酸酶和在下述条件下与目标核酸的序列互补的核苷酸序列：如果目标核酸存在于样品中，目标核酸的至少一部分与探针核酸的至少一部分杂交，形成含有限制性内切核酸酶酶切位点的核酸的双链部分，(b)使核酸的双链部分与识别性限制性内切核酸酶接触，限制性内切核酸酶能在下述条件下在限制性内切核酸酶酶切位点处切开核酸的双链部分：识别性限制性内切核酸酶在限制性内切核酸酶酶切位点切开核酸的双链部分，从而使探针核酸中含有起始扩增性限制性内切核酸酶的部分与探针核酸的至少另一部分分离；(c)使探针核酸中含有起始扩增性限制性内切核酸酶的部分与第一报道核酸(或第一信号放大核酸)接触，其包含第二扩增性限制性内切核酸酶和核酸的双链部分，双链部分包含起始扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点，接触的条件是起始扩增性限制性内切核酸酶在起始扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点切开第一报道核酸，从而将包含第二扩增性限制性内切核酸酶的第一核酸的部分与第一核酸的至少另一部分分离；(d)使包含第二扩增性限制性内切核酸酶的第一报道核酸的部分与第二报道核酸(或第二信号放大核酸)接触，其包含起始扩增性限制性内切核酸酶和核酸的双链部分，双链部分包含第二扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点，接触的条件是起始扩增性限制性内切核酸酶在第二扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点切开第二核酸，从而使含有起始扩增性限制性内切核酸酶的第二核酸的部分与第二核酸的至少另一部分分离；和(e)确定第一报道核酸，第二报道核酸，或第一和第二报道核酸的部分是否存在，其中存在表明样品含有目标核酸，而不存在表明样品不含目标核酸。探针核酸可以是单链探针核酸。探针核酸可结合在固相载体上。探针核酸可直接结合在固相载体上。包含起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分通过步骤(b)从固相载体上释放。步骤(a)和步骤(b)可在同一区室中进行。步骤(c)和步骤(d)可在同一区室中进行。步骤(a)和步骤(b)可在第一区室中进行，步骤(c)和步骤(d)可在第二区室中进行。步骤(a)和步骤(b)可通过将所述样品加到含有探针核酸和识别性限制性内切核酸酶的区室中进行。步骤(c)和步骤(d)可通过将含有起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分加入含有第一报道核酸和所述第二报道核酸的区室中进行。探针核酸可包含(i)单链部分，单链部分含有与目标核酸的序列互补的核苷酸序列，以及(ii)双链部分。探针核酸包含第一核酸链，其含有与目标核酸的序列互补的核苷酸序列，与含有起始扩增性限制性内切核酸酶的第二核酸链杂交。第一核酸链可结合在固相载体上。第一核酸链可直接结合在固相载体上。第二核酸链的一部分可与第一核酸链杂交，形成双链部分。包含起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分与探针核酸的至少另一部分在步骤(b)中分离，探针核酸的部分包含第一核酸链的一部分和全部第二链。包含起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分与探针核酸的至少另一个部分在步骤(b)中分离，探针核酸的该部分可包含目标核酸的至少一部分。该方法可包括在步骤(a)中使用多个所述探针核酸。该方法可包括在步骤(c)中使用多个所述第一报道核酸。步骤(c)中的所述第一报道核酸相对于来自步骤(b)的含有起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分摩尔过量。该方法可包括在步骤(d)中使用多个第二报道核酸。步骤(d)中的第二报道核酸相对于来自步骤(b)的含有起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分摩尔过量。在步骤(b)中与探针核酸的至少另一部分分离的含有起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分的分子数基本上与样品中存在的目标核酸的分子数成线性关系。第一报道核酸和第二报道核酸可结合在固相载体上。第一报道核酸和第二报道核酸可直接结合在固相载体上。第一报道核酸和第二报道核酸在同一区室中结合在固相载体上。第一报道核酸中包含第二扩增性限制性内切核酸酶的部分通过步骤(c)从固相载体上释放。第二报道核酸中包含起始扩增性限制性内切核酸酶的部分通过步骤(d)从固相载体上释放。第一报道核酸可包含标记。该标记可以是荧光标记、放射性标记、酶标记、或氧化还原标记。第二报道核酸可包含标记。标记可以是荧光标记、放射性标记、酶标记、或氧化还原标记。第一报道核酸和第二报道核酸可包含标记。第一报道核酸和第二报道核酸可包含相同标记。标记可以是荧光标记、放射性标记、酶标记、或氧化还原标记。第一报道核酸可结合在固相载体上，其中第一报道核酸中与第一报道核酸的至少另一部分分离的部分含有标记，与第一报道核酸的至少另一部分分离并含有标记的第一报道核酸的部分在步骤(c)中从固相载体上释放。第一报道核酸可包含第一核酸链，所述第一核酸链可包含第二扩增性限制性内切核酸酶，与第二核酸链杂交，形成包含所述起始扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点的核酸的双链部分。第一核酸链可结合在固相载体上。第一核酸链可直接结合在固相载体上。第二核酸链可结合在固相载体上。第二核酸链可直接结合在固相载体上。第一核酸链可包含标记。标记可以是荧光标记、放射性标记、酶标记、或氧化还原标记。第二核酸链可包含标记。标记可以是荧光标记、放射性标记、酶标记、或氧化还原标记。第二报道核酸可结合在固相载体上，其中第二报道核酸中与第二报道核酸的至少另一部分分离的部分含有标记，与第二报道核酸的至少另一部分分离并含有标记的第二报道核酸的部分在步骤(d)中从固相载体上释放。第二报道核酸可包含第一核酸链，第一核酸链可包含起始扩增性限制性内切核酸酶，与第二核酸链杂交，形成包含第二扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点的核酸的双链部分。第一核酸链可结合在固相载体上。第一核酸链可直接结合在固相载体上。第二核酸链可结合在固相载体上。第二核酸链可直接结合在固相载体上。第一核酸链可包含标记。标记可以是荧光标记、放射性标记、酶标记、或氧化还原标记。第二核酸链可包含标记。标记可以是荧光标记、放射性标记、酶标记、或氧化还原标记。第一报道核酸中与第一报道核酸的至少另一部分分离的部分包含荧光标记，其中第二报道核酸中与第二报道核酸的至少另一部分分离的部分包含荧光标记，和其中确定步骤(e)包括检测荧光标记。确定步骤(e)可包括用毛细电泳技术检测与第一报道核酸的所述至少另一部分分离的第一报道核酸的部分。确定步骤(e)可包括用毛细电泳技术检测与第二报道核酸的至少另一部分分离的第二报道核酸的部分。步骤(a)、(b)、(c)和(d)可不经过核酸扩增。步骤(a),(b),(c),(d)和(e)可不经过核酸扩增。确定步骤包括确定存在于样品内的目标核酸的量。
在另一方面，本文描述了一种用于评估样品中目标核酸的试剂盒。该试剂盒包含，或主要由以下组成：包含扩增性限制性内切核酸酶，和与目标核酸序列互补的核苷酸序列的探针核酸，其中目标核酸的至少一部分能够与探针核酸的至少一部分杂交，形成含有限制性内切核酸酶酶切位点的核酸的双链部分。探针核酸可以是单链探针核酸。试剂盒可包含固相载体，其中探针核酸可结合在固相载体上。探针核酸中包含扩增性限制性内切核酸酶的部分可以通过用识别性限制性内切核酸酶切割从固相载体上释放，识别性限制性内切核酸酶能够在限制性内切核酸酶酶切位点切割。该试剂盒还包含识别性限制性内切核酸酶。探针核酸可包含：(i)单链部分，其包含与目标核酸的序列互补的核苷酸序列,和(ii)双链部分。探针核酸可包含第一核酸链，其包含与目标核酸的序列互补的核苷酸序列，与包含扩增性限制性内切核酸酶的第二核酸链杂交。该试剂盒还可包含报道核酸，其包含核酸的双链部分，核酸的双链部分包含扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点。试剂盒可包含固相载体，其中报道核酸可结合在固相载体上。报道核酸可直接结合在所述固相载体上。报道核酸可包含核酸的单链部分。报道核酸可包含标记。标记可以是荧光标记、放射性标记、酶标记、或氧化还原标记。报道核酸中包含标记的一部分能通过由扩增性限制性内切核酸酶切割与报道核酸的至少另一部分分离。报道核酸可包含含有标记的第一核酸链，并与第二核酸链杂交。该试剂盒还可包含：(a)第一信号放大核酸，核酸包含第二扩增性限制性内切核酸酶和双链区段，双链区段具有扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点，和(b)第二信号放大核酸，核酸含有扩增性限制性内切核酸酶和双链区段，双链区段具有第二扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点。
在另一个方面，本文描述了一种组合物，其包含，或主要由以下组成：与能够切割双链DNA分子的限制性内切核酸酶共价结合的核酸。核酸可包含能够与目标核酸杂交的单链区段。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的意思与本发明所属领域的普通技术人员所共知的一样。虽然与本文所描述的方法和材料类似或等效的方法和材料可被用来实施本发明，但在下文描述合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他文献都全文参考结合于本文。在抵触的情况，以本说明书包括定义在内为准。此外，材料、方法和例子都只是说明性的，并不构成限制。
在附图和以下描述中详细说明了本发明的一种或多种实施方式。通过描述、附图以及权利要求书，本发明的其它特征、目的和优点将是显而易见的。
附图说明
图1是示意图，描述了用探针核酸、识别性限制性内切核酸酶和报道核酸检测目标核酸的示范性方法。
图2是可用于本文所述方法和材料来检测目标核酸的探针核酸的示范性结构。
图3是示意图，描述了用探针核酸、识别性限制性内切核酸酶、第一信号放大核酸、第二信号放大核酸、和报道核酸检测目标核酸的示范性方法。
图4是可用于本文所述方法和材料来检测目标核酸的第一信号放大核酸和第二信号放大核酸的示范性结构。这样的第一信号放大核酸和第二信号放大核酸可以与或不与报道核酸一起使用。当不经独立的报道核酸步骤使用时，这样的信号放大核酸可称为报道核酸。
图5显示了可用于本文所述方法和材料来检测目标核酸的第一信号放大核酸和第二信号放大核酸的示范性结构。这样的第一信号放大核酸和第二信号放大核酸可以与或不与报道核酸一起使用。当不经独立的报道核酸步骤使用时，这样的信号放大核酸可称为报道核酸。
图6含有线状图，显示目标寡核苷酸浓度(A)与识别性限制性内切核酸酶浓度(B)通过形成着色反应产物对HRP-标记的核酸酶切的作用。
发明详述
本文提供了检测目标核酸的方法和材料。例如，本文提供了用于检测样品中目标核酸存在与否的方法和材料，用于检测样品中目标核酸存在量的方法和材料，用于检测样品中目标核酸存在与否的试剂盒，用于检测样品中目标核酸存在量的试剂盒，和制备这些试剂盒的方法。
在一个实施例中，检测目标核酸的方法可包括使样品(例如要测试或怀疑含有目标核酸的样品)与探针核酸接触。探针核酸可被设计成具有单链部分，其核苷酸序列与要检测的目标核酸的至少一部分互补。在这种情况下，样品内存在的目标核酸可与探针核酸的该单链部分的互补序列杂交，形成双链区段，其中一条链是目标核酸，另一条链是探针核酸。另外，具有与要检测的目标核酸的至少一部分互补的核苷酸序列的探针核酸的单链部分可以设计成与目标核酸杂交时，形成限制性内切核酸酶酶切位点。因此，样品内的目标核酸可与探针核酸的单链部分的互补序列杂交，形成双链区段，从而产生限制性内切核酸酶的酶切位点。目标核酸和探针核酸杂交产生的酶切位点可称作识别性限制性内切核酸酶酶切位点。另外，在这样的限制性内切核酸酶酶切位点酶切核酸的限制性内切核酸酶可被称作识别性限制性内切核酸酶。
探针核酸也可被设计成含有限制性内切核酸酶。该限制性内切核酸酶可以是探针核酸的一个组分，可被称作扩增性限制性内切核酸酶。扩增性限制性内切核酸酶通常是与用作识别性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶的不同限制性内切核酸酶。例如，当用EcoRI限制性内切核酸酶作为识别性限制性内切核酸酶时，除EcoRI限制性内切核酸酶以外的限制性内切核酸酶(例如HindIII限制性内切核酸酶)用作扩增性限制性内切核酸酶。因此一般来说，探针核酸设计成含有扩增性限制性内切核酸酶并具有这样的核苷酸序列，即，使目标核酸能与探针核酸杂交，产生识别性限制性内切核酸酶的识别性限制性内切核酸酶酶切位点。在一些情况下，探针核酸可结合在固相载体上(例如微量滴定板孔上)。例如，探针核酸可结合在固相载体上，从而当识别性限制性内切核酸酶在识别性限制性内切核酸酶酶切位点酶切时，释放探针核酸含有扩增性限制性内切核酸酶的一部分。
当可能含或不含目标核酸的样品接触与固相载体结合的探针核酸后，如果存在于样品中，目标核酸会与探针核酸杂交，形成识别性限制性内切核酸酶酶切位点。此时，加到反应中或已经存在于反应中的识别性限制性内切核酸酶会在通过目标核酸和探针核酸杂交形成的识别性限制性内切核酸酶酶切位点酶切探针核酸，从而从固相载体上释放含有扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸部分。从固相载体上释放的含扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸部分的数量和与探针核酸杂交，形成识别性限制性内切核酸酶酶切位点的目标核酸分子数量成基本线性关系(例如基本是1对1的关系)。
可收集从固相载体上释放的含有扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸部分，使其与报道核酸接触。例如，如果存在，探针核酸释放的部分可从微量滴定板(例如96孔板)的一个含有探针核酸的孔转移到微量滴定板的另一个含有报道核酸的孔中。可设计报道核酸具有双链部分，其中含有探针核酸的扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点。该扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点可称作扩增性限制性内切核酸酶酶切位点。如果含有扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸部分存在并与报道核酸接触，那么可在扩增性限制性内切核酸酶酶切酶切位点用扩增性限制性内切核酸酶酶切报道核酸。由于探针核酸释放部分的扩增性限制性内切核酸酶能够自由地反复进行酶切，被酶切的报道核酸分子数将能够大大超过反应中存在的扩增性限制性内切核酸酶数。例如，酶切的报道核酸分子数可以大大超过(例如指数性超过)反应中的扩增性限制性内切核酸酶数，从而能大大超过(例如指数性超过)存在于样品中与探针核酸接触的目标核酸分子数。这样的高度放大关系(例如指数关系)能轻易检测于样品中存在的极少量目标核酸。
如存在，在探针核酸释放部分与报道核酸接触后，可确定经酶切的报道核酸的存在与否。酶切的报道核酸的存在可表明样品中含有目标核酸，而不存在酶切的报道核酸可表明样品中不含目标核酸。在一些情况下，可测定酶切的报道核酸量。在这些情况下，酶切的报道核酸量可表示样品中存在的目标核酸量。用已知量的目标核酸绘制的标准曲线可帮助确定样品中存在的目标核酸量。
在一些情况下，报道核酸可含有标记，以帮助测定酶切的报道核酸。例如，报道核酸可含有荧光标记和淬灭剂，从而使酶切的报道核酸提供荧光信号，而未酶切的报道核酸不提供荧光信号。在一些情况下，报道核酸可含有标记(例如比色标记，荧光标记或酶，如辣根过氧化物酶)，并结合在固相载体上(例如微量滴定板孔)上。例如，报道核酸可结合在固相载体上，从而使得扩增性限制性内切核酸酶在扩增性限制性内切核酸酶酶切位点的酶切释放含有标记的报道核酸部分。可收集得到的反应混合物，利用标记评估其中报道核酸释放部分的存在与否及其量。例如，如存在，报道核酸的释放部分可从含有报道核酸的微量滴定板(例如96孔板)的孔中转移到微量滴定板的另一个孔中，在该处评估被转移物质中来自标记的信号。
包括用探针核酸和报道核酸检测目标核酸的方法的一个例子如图1所示。参考图1，第一反应室100(例如微量滴定板孔)可含有探针核酸101。探针核酸101可以结合在(例如固定在)固相载体102上，并可包含扩增性限制性内切核酸酶103(Ra)。探针核酸101可以结合在固相载体102上，从而在探针核酸101的核酸部分酶切后使扩增性限制性内切核酸酶103从固相载体102上释放。探针核酸101可以具有单链部分，其核苷酸序列与目标核酸104的至少一部分互补。探针核酸101可以与含或不含目标核酸104的样品接触。如果目标核酸104存在，目标核酸104的至少一部分与探针核酸101可以杂交，形成核酸的双链区段。这样的双链区段可以含有至少一个识别性限制性内切核酸酶酶切位点105。在第一反应室100中加入识别性限制性内切核酸酶106(Rr)可导致在识别性限制性内切核酸酶酶切位点105酶切探针核酸101，该位点由探针核酸的一条链和目标核酸的一条链形成，从而从固相载体102释放探针核酸101的部分107。部分107可包含扩增性限制性内切核酸酶103。
如果目标核酸104存在，来自第一反应室100的含有释放部分107的反应产物可转移到(例如手工或自动化)第二反应室120中。第二反应室120可含有报道核酸121。报道核酸121可结合在(例如固定在)固相载体122上，可包括标记物(marker)(例如标记)123(M)。报道核酸121可结合在固相载体122上，从而在酶切报道核酸121的核酸组分后从固相载体122上释放标记123。报道核酸121可具有至少一个双链部分，其中含有至少一个扩增性限制性内切核酸酶酶切位点124。将来自第一反应室100的反应产物加到第二反应室120中可导致报道核酸121在扩增性限制性内切核酸酶酶切位点124被切开，如果反应产物含有部分107的话。报道核酸121这样的酶切可导致部分127从固相载体122上释放。部分127可包含标记物123。
可评估来自第二反应室120的反应产物，测定部分127的存在与否及其量。部分127的存在可表示样品含有目标核酸104，而部分127不存在则表示样品不含目标核酸104。在一些情况下，可测定部分127的量。在这样的情况下，目标127的量可表示存在于样品中的目标核酸104的量。部分127的存在与否及其量可用标记物123测定，具有标记123的部分127可与未酶切的报道核酸121区分开，因为在这个例子中，部分127从固相载体122上释放，而未酶切的报道核酸121仍然与固相载体122结合。例如，在一些情况下，来自第二反应室120的反应产物可以转移到第三反应室中，在其中通过标记物123评估部分127的存在与否。如果部分127存在，可定量部分127的存在量。
探针核酸101和报道核酸121可具有不同构型。例如，参考图1，可将探针核酸101设计成具有一条核酸链，在与目标核酸104接触前，探针核酸101的整个核酸组成都是单链。在另一个例子中，参考图2，可将探针核酸101设计成具有第一链128和第二链108。第一链128可结合于固相载体102，并可设计成具有单链区段，其核苷酸序列与目标核酸104的至少一部分互补。第二链108可包含扩增性限制性内切核酸酶103，可以具有单链区段，其核苷酸序列可与第一链128杂交。在一些情况下，第一链128和第二链108可分别合成或获得，然后混合在一起，形成探针核酸101。例如，可合成第一链128，生物素化并结合在链霉亲和素包被的固相载体上。合成第二链108的核酸组分并将扩增性限制性内切核酸酶103结合到合成的核酸组分上后，可将第二链108与第一链128一起温育，形成核酸探针101。在一些情况下，探针核酸101可含有两条以上的链。例如，探针核酸可包含第一链150、第二链152，和第三链154。在这种情况下，第一链150可结合在固相载体102上，第二链152可与第一链150杂交，并可包含单链区段，其核苷酸序列与目标核酸104的至少一部分互补，而第三链154可与第二链152杂交，并可与扩增性限制性内切核酸酶103结合。类似的，可用一条、两条、三条或更多链的构型制备报道核酸。
在另一个实施方式中，检测目标核酸的方法可包括使样品(例如要测试或怀疑含有目标核酸的样品)接触探针核酸。探针核酸可设计成具有单链部分，其核苷酸序列与要检测的目标核酸的至少一部分互补。在这种情况下，样品内存在的目标核酸可与探针核酸的该单链部分的互补序列杂交，形成双链区段，其中一条链是目标核酸，另一条链是探针核酸。另外，具有与要检测的目标核酸的至少一部分互补的核苷酸序列的探针核酸的单链部分可以设计成当与目标核酸杂交时，形成识别性限制性内切核酸酶酶切位点。因此，样品内的目标核酸可与探针核酸的单链部分的互补序列杂交，形成双链区段，从而产生识别性限制性内切核酸酶的识别性限制性内切核酸酶酶切位点。还可将探针核酸设计成含有扩增性限制性内切核酸酶。由于该方法包括使用两种或多种不同的扩增性限制性内切核酸酶，作为探针核酸的一个组分的扩增性限制性内切核酸酶可被称作第一或起始扩增性限制性内切核酸酶，而额外的扩增性限制性内切核酸酶被称作第二、第三或类推，或称作二级、三级或类推的扩增性限制性内切核酸酶。该起始扩增性限制性内切核酸酶通常是与用作识别性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶不同的限制性内切核酸酶。例如，当用EcoRI限制性内切核酸酶作为识别性限制性内切核酸酶时，用与EcoRI限制性内切核酸酶不同的限制性内切核酸酶(例如HindIII限制性内切核酸酶)作为起始扩增性限制性内切核酸酶。因此一般来说，探针核酸设计成含有起始扩增性限制性内切核酸酶并具有这样的核苷酸序列，即，使目标核酸能与探针核酸杂交，产生识别性限制性内切核酸酶的识别性限制性内切核酸酶酶切位点。在一些情况下，探针核酸可结合在固相载体上(例如微量滴定板孔上)。例如，探针核酸可结合在固相载体上，从而当识别性限制性内切核酸酶在识别性限制性内切核酸酶酶切位点酶切时，释放探针核酸中含有起始扩增性限制性内切核酸酶的一部分。
当可能含或不含目标核酸的样品接触与固相载体结合的探针核酸后，如果存在于样品中，目标核酸会与探针核酸杂交，形成识别性限制性内切核酸酶酶切位点。此时，加到反应中或已经存在于反应中的识别性限制性内切核酸酶会在通过目标核酸和探针核酸杂交形成的识别性限制性内切核酸酶酶切位点酶切探针核酸，从而从固相载体上释放含有起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸部分。从固相载体上释放的含起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸部分的数量和与探针核酸杂交，形成识别性限制性内切核酸酶酶切位点的目标核酸分子数量成基本线性关系(例如基本是1对1的关系)。
可收集从固相载体上释放出的含有起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸部分，使其与第一信号放大核酸和第二信号放大核酸接触。可将第一信号放大核酸设计成具有双链部分，其中含有探针核酸的起始扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点。该起始扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点可称作起始扩增性限制性内切核酸酶酶切位点。第一信号放大核酸还可设计成含有第二扩增性限制性内切核酸酶。可将第二信号放大核酸设计成具有双链部分，其含有第一信号放大核酸的第二扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点。第二扩增性限制性内切核酸酶的该限制性内切核酸酶酶切位点可称作第二扩增性限制性内切核酸酶酶切位点。第二信号放大核酸也可设计成含有起始扩增性限制性内切核酸酶。例如，当用EcoRI限制性内切核酸酶作为识别性限制性内切核酸酶和HindIII限制性内切核酸酶作为探针核酸的起始扩增性限制性内切核酸酶时，用SmaI限制性内切核酸酶作为第一信号放大核酸的第二扩增性限制性内切核酸酶，并用HindIII限制性内切核酸酶作为第二信号放大核酸的起始扩增性限制性内切核酸酶。
在一些情况下，第一信号放大核酸和第二信号放大核酸可结合在固相载体(例如微量滴定板)上。例如，第一信号放大核酸可结合在固相载体上，从而当起始扩增性限制性内切核酸酶在起始扩增性限制性内切核酸酶酶切位点酶切时，释放含有第二扩增性限制性内切核酸酶的第一信号放大核酸的一部分，第二信号放大核酸可结合在固相载体上，从而当第二扩增性限制性内切核酸酶在第二扩增性限制性内切核酸酶酶切位点酶切时，释放含有起始扩增性限制性内切核酸酶的第二信号放大核酸的一部分。第一信号放大核酸可结合在含有第二信号放大核酸的同一固相载体上(例如较大区室中的两个不同亚区室)，条件是未酶切的第一信号放大核酸的第二扩增性限制性内切核酸酶不能酶切第二信号放大核酸，而且未酶切的第二信号放大核酸的起始扩增性限制性内切核酸酶不能酶切第一信号放大核酸。在一些情况下，第一信号放大核酸可结合在一个联合区室内的同一固相载体上，从而使第一信号放大核酸在联合区室的第一区室内，第二信号放大核酸在联合区室的第二区室内。在这种情况下，第一区室内的未酶切的第一信号放大核酸的第二扩增性限制性内切核酸酶不能酶切位于第二区室内的第二信号放大核酸，而切开的第一信号放大核酸的第二扩增性限制性内切核酸酶能够从第一区室移动(例如扩散)到第二区室，酶切第二区室中的第二信号放大核酸。另外，第二区室中的未酶切的第二信号放大核酸的起始扩增性限制性内切核酸酶不能酶切位于第一区室中的第一信号放大核酸，而经酶切的第二信号放大核酸的起始扩增性限制性内切核酸酶能够从第二区室移动(例如扩散)到第一区室，酶切位于第一区室中的第一信号放大核酸。
如果含有起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸部分存在并与第一信号放大核酸接触，那么第一信号放大核酸可以在起始扩增性限制性内切核酸酶酶切位点由起始扩增性限制性内切核酸酶酶切，从而从固相载体上释放含有第二扩增性限制性内切核酸酶的第一信号放大核酸的部分。含有第二扩增性限制性内切核酸酶的第一信号放大核酸的释放部分可自由地在第二扩增性限制性内切核酸酶酶切位点酶切第二信号放大核酸，从而从固相载体上释放含有起始扩增性限制性内切核酸酶的第二信号放大核酸的部分。由于探针核酸释放部分的起始扩增性限制性内切核酸酶、第二信号放大核酸释放部分的起始扩增性限制性内切核酸酶和第一信号放大核酸释放部分的第二扩增性限制性内切核酸酶能自由进行反复酶切，含有起始扩增性限制性内切核酸酶的释放部分的数量会从识别性限制性内切核酸酶释放的数量大大增加。例如，经酶切的第一信号放大核酸分子数会大大超过(例如指数性超过)探针核酸释放部分的数量，而经酶切的第二信号放大核酸分子数会大大超过(例如指数性超过)探针核酸释放部分的数量。这样的高度放大关系(例如指数关系)能轻易检测样品中存在极少量的目标核酸。
在一些情况下，该方法可用结合在固相载体上的第一信号放大核酸进行，该固相载体不同于含有第二信号放大核酸的固相载体。例如，第一信号放大核酸可以结合在微量滴定板的一个孔上，而第二信号放大核酸可结合在微量滴定板的不同孔上。在这种情况下，可从第一孔收集含第一信号放大核酸的所得反应物，转移到含有第二信号放大核酸的孔中。
可收集该反应中从含有第二信号放大核酸的固相载体释放的含起始扩增性限制性内切核酸酶的第二信号放大核酸的部分，以及任何其它在该反应中释放的部分(例如含起始扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的释放部分和含第二扩增性限制性内切核酸酶的第一信号放大核酸的释放部分)，使其与报道核酸接触。例如，如果存在，释放的部分能从微量滴定板(96孔板)的含有第二信号放大核酸的一个孔转移到含有报道核酸的微量滴定板的另一个孔中。报道核酸可设计成具有双链部分，其含有起始扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点。如果含有起始扩增性限制性内切核酸酶的释放部分存在，并与报道核酸接触，那么可在起始扩增性限制性内切核酸酶酶切位点由起始扩增性限制性内切核酸酶酶切报道核酸。由于释放部分的起始扩增性限制性内切核酸酶能自由反复酶切，经酶切的报道核酸分子数大大超过存在于反应中的起始扩增性限制性内切核酸酶分子数。例如，经酶切的报道核酸分子数可大大超过(例如指数性超过)反应中的起始扩增性限制性内切核酸酶数，从而大大超过(例如指数性超过)存在于样品中与探针核酸接触的目标核酸分子数。这样的高度放大关系(例如指数关系)能轻易检测样品中存在极少量的目标核酸。
如存在，在含有起始扩增性限制性内切核酸酶的释放部分与报道核酸接触后，可确定经酶切的报道核酸存在与否。酶切的报道核酸的存在可表明样品中含有目标核酸，而不存在酶切的报道核酸可表明样品中不含目标核酸。在一些情况下，可测定酶切的报道核酸量。在这些情况下，酶切的报道核酸量可表示样品中存在的目标核酸量。
在一些情况下，报道核酸可含有标记，以帮助测定酶切的报道核酸。例如，报道核酸可含有荧光标记和淬灭剂，从而使酶切的报道核酸提供荧光信号，而未酶切的报道核酸不提供荧光信号。在一些情况下，报道核酸可含有标记(例如比色标记，荧光标记或酶，如辣根过氧化物酶)，并可结合在固相载体上(例如微量滴定板孔)上。例如，报道核酸可结合在固相载体上，从而使得起始扩增性限制性内切核酸酶在起始扩增性限制性内切核酸酶酶切位点的酶切释放含有标记的报道核酸部分。可收集得到的反应混合物并用标记评估报道核酸释放部分的存在与否及其量。例如，如存在，报道核酸的释放部分可从含有报道核酸的微量滴定板(例如96孔板)的一个孔中转移到微量滴定板的另一个孔中，在该处评估被转移物质中来自标记的信号。
在一些情况下，可测定经酶切的第一信号放大核酸，经酶切的第二信号放大核酸，或两者的存在与否。这些经酶切的核酸的存在表明样品含有目标核酸，而这些经酶切的核酸不存在表明样品不含目标核酸。在一些情况下，可测定经酶切的第一信号放大核酸，经酶切的第二信号放大核酸，或两者的量。在这些情况下，经酶切的核酸的量可表示样品中目标核酸的存在量。在这些情况下，除了用独立的报道核酸步骤以外，还可用经酶切的第一信号放大核酸，经酶切的第二信号放大核酸，或两者评估样品中的目标核酸，或可代替使用独立的报道核酸步骤。在一些情况下，第一信号放大核酸、第二信号放大核酸或两者可用与本文所述报道核酸相似的方式标记以帮助检测。当测定经酶切的第一信号放大核酸、经酶切的第二信号放大核酸，或两者的存在与否或量，以评估样品中的目标核酸时，第一信号放大核酸可称作第一报道核酸，而第二信号放大核酸可称作第二报道核酸，甚至它们可包括扩增性限制性内切核酸酶。
包括使用探针核酸、第一信号放大核酸、第二信号放大核酸、和报道核酸的检测目标核酸的方法的一个例子如图3-5所示。参考图3，第一反应室200(例如微量滴定板孔)可含有探针核酸201。探针核酸201可结合在(例如固定在)固相载体202上，并可包含起始扩增性限制性内切核酸酶203(Ra)。探针核酸201可固定在固相载体202上，从而在酶切探针核酸201的核酸组件后，从固相载体202释放起始扩增性限制性内切核酸酶203。探针核酸201可以具有单链区段，其核苷酸序列与目标核酸204的至少一部分互补。探针核酸201可与含或不含目标核酸204的样品接触。如果存在目标核酸204，目标核酸204的至少一部分与探针核酸201可杂交，形成核酸的双链区段。这样的双链区段可含有至少一个识别性限制性内切核酸酶酶切位点205。在第一反应室200中加入识别性限制性内切核酸酶206(Rr)可导致在识别性限制性内切核酸酶酶切位点205酶切探针核酸201，该酶切位点205是由探针核酸的一条链和目标核酸的一条链形成的，从而从固相载体202上释放探针核酸201的部分207。部分207可包含起始扩增性限制性内切核酸酶203。
如果目标核酸204存在，含有释放部分207的第一反应室200的反应产物可转移(手工或自动化)到第二反应室220。第二反应室220可含有第一信号放大核酸226和第二信号放大核酸225。第一信号放大核酸226可具有至少一个双链部分，其包含至少一个起始扩增性限制性内切核酸酶酶切位点230。第一信号放大核酸226可结合于(例如固定在)固相载体222上，并可包含第二扩增性限制性内切核酸酶223(Rb)。第一信号放大核酸226可结合在固相载体222上，从而在起始扩增性限制性内切核酸酶酶切位点230酶切第一信号放大核酸226后，使含第二扩增性限制性内切核酸酶223的部分234从固相载体222上释放。出于清楚，图3的框E部分省略了第一信号放大核酸226和第二信号放大核酸核酸225经酶切形式的一条链。
第二信号放大核酸225可具有至少一个双链部分，其含有至少一个第二扩增性限制性内切核酸酶酶切位点232。第二信号放大核酸225可结合在(例如固定在)固相载体222上，并可包含起始扩增性限制性内切核酸酶224。第二信号放大核酸225可结合在固相载体222上，从而在第二扩增性限制性内切核酸酶酶切位点232酶切第二信号放大核酸225后，使含起始扩增性限制性内切核酸酶224的部分236从固相载体222上释放。探针核酸201的起始扩增性限制性内切核酸酶203和第二信号放大核酸225的起始扩增性限制性内切核酸酶224可以是相同的限制性内切核酸酶。例如，它们都可以是EcoRI限制性内切核酸酶。
在第二反应室220中加入来自第一反应室200的反应产物可导致第一信号放大核酸226在起始扩增性限制性内切核酸酶酶切位点230酶切，如果反应产物含有部分207的话。对第一信号放大核酸226的该酶切可导致部分234从固相载体222上释放。可包含第二扩增性限制性内切核酸酶223的部分234可导致第二信号放大核酸225在第二扩增性限制性内切核酸酶酶切位点232酶切。第二信号放大核酸225的这种酶切可导致部分236从固相载体222上释放。因此，该反应导致释放部分234和236的聚集。
如果目标核酸204存在，含有释放部分207、释放部分234和释放部分236的来自第二反应室220的反应产物可转移到(手工或自动)第三反应室240。第三反应室240可含有报道核酸241。报道核酸241可结合在(例如固定在)固相载体242上，并可包含标记物(例如标记)243(M)。报道核酸241可结合在固相载体242上，从而使标记物243在报道核酸241的核酸组件酶切后从固相载体242上释放。报道核酸241可具有至少一个双链部分，其含有至少一个起始扩增性限制性内切核酸酶酶切位点246。将来自第二反应室220的反应产物加到第三反应室240中，可导致报道核酸241在起始扩增性限制性内切核酸酶酶切位点246酶切，如果反应产物含有部分207和236的话。在一些情况下，报道核酸241可含有至少一个双链部分，其含有第二扩增性限制性内切核酸酶223的至少一个酶切位点。在这样的情况下，在第三反应室240中加入来自第二反应室220的反应产物可导致报道核酸241在第二扩增性限制性内切核酸酶223的酶切位点酶切，如果反应产物含有部分234的话。酶切报道核酸241可导致部分247从固相载体242上释放。部分247可含有标记物243。
可评估来自第三反应室240的反应产物，测定部分247的存在与否及其量。部分247的存在可表明样品含有目标核酸204，而部分247不存在可表明样品不含目标核酸204。在一些情况下，可测定部分247的量。在这些情况下，部分247的量可表明存在于样品中的目标核酸量。可用标记物243测定部分247的存在与否及其量，具有标记物243的部分247可与具有标记物243的未酶切的报道核酸241区分开，因为在这个例子中，部分247从固相载体242上释放，而未酶切的报道核酸241仍然于固相载体242结合。例如，在一些情况下，来自第三反应室24的反应产物可转移到第四反应室中，在其中通过标记物243评估部分247的存在与否及其量。如果存在部分347，可定量测定部分247的存在量。
在一些情况下，参考图4和5，第一信号放大核酸226可包含标记物(例如标记)243(M)，第二信号放大核酸225可包含标记物(例如标记)243(M)。在这些情况下，可用标记物243评估第一信号放大核酸226的酶切和第二信号放大核酸225的酶切，以评估样品中目标核酸的存在与否及其量。例如，可用检测器250检测从固相载体222上释放的标记物243。
探针核酸201、第一信号放大核酸226、第二信号放大核酸225和报道核酸241可具有不同构型。例如，参考图3，探针核酸201可设计成具有一条核酸链，其中探针核酸201的整个核酸组件在与目标核酸204接触前是单链的。在另一个例子中，探针核酸201可设计成象探针核酸101一样，具有两条或多条链。见例如图2。例如，探针核酸201可具有第一链和第二链。第一链可结合在固相载体上，可设计成具有单链区段，其核苷酸序列与目标核酸的至少一部分互补。第二链可包含起始扩增性限制性内切核酸酶，并可具有单链区段，其核苷酸序列可与第一链杂交。在一些情况下，第一链和第二链可分别合成或获得，然后混合在一起，形成探针核酸201。例如，可合成第一链并生物素化，然后结合在链霉亲和素包被的固相载体上。在合成第二链的核酸组件，并将起始扩增性限制性内切核酸酶结合到合成的核酸组件上以后，可将第二链和第一链一起温育，形成核酸探针201。在一些情况下，探针核酸201可含有两条以上的链。例如，探针核酸可包括第一链、第二链和第三链。在这种情况下，第一链可与固相载体结合，第二链可与第一链杂交，并可包括单链区段，其核苷酸序列与目标核酸的至少一部分互补，而第三链可与第二链杂交，并可与起始扩增性限制性内切核酸酶结合。类似的一条、两条、三条、或更多条链的构型可用于制备第一信号放大核酸，第二信号放大核酸，或报道核酸。例如，第一信号放大核酸和第二信号放大核酸可设计成具有如图4和5所示的构型。
本文所述的探针核酸通常包括至少一个单链DNA区段，其设计成与所需的目标核酸杂交，从而形成识别性限制性内切核酸酶酶切位点。探针核酸的其它部分可包含DNA、RNA或其它分子。例如，探针核酸可包含生物素，从而使探针核酸能够与链霉亲和素包被的固相载体结合。在一些情况下，探针核酸的单链部分设计成与所需的目标核酸杂交，产生识别性限制性内切核酸酶酶切位点，该单链部分可以是RNA或核酸类似物(例如肽核酸(PNA))，只要这种单链部分可以(i)与所需目标核酸杂交，和(i i)与互补目标核酸序列产生识别性限制性内切核酸酶酶切位点，其能够被识别性限制性内切核酸酶酶切。可用作识别性限制性内切核酸酶，在探针核酸的RNA区段和目标核酸的DNA区段之间形成的识别性限制性内切核酸酶酶切位点酶切的限制性内切核酸酶的例子包括但不限于HhaI,AluI,TaqI,HaeIII,EcoRI,HindII,SalI,和MspI限制性内切核酸酶。
本文所述的探针核酸可以是任意长度，只要设计成与所需目标核酸杂交的探针核酸的单链区段能与目标核酸杂交并在探针核酸被识别性限制性内切核酸酶酶切后，探针核酸的扩增性限制性内切核酸酶能酶切其扩增性限制性内切核酸酶酶切位点。一般说来，设计成与所需目标核酸杂交的探针核酸的单链区段可以长约10-500个或更多的核苷酸(例如在约10-400个核苷酸之间，在约10-300个核苷酸之间，在约10-200个核苷酸之间，在约10-100个核苷酸之间，在约10-50个核苷酸之间，在约10-25个核苷酸之间，在约20-500个核苷酸之间，在约30-500个核苷酸之间，在约40-500个核苷酸之间，在约50-500个核苷酸之间，在约15-50个核苷酸之间，在约15-25个核苷酸之间)。通过目标核酸与该探针核酸的单链区段杂交产生的识别性限制性内切核酸酶酶切位点可以位于单链区段的任何位置。例如，识别性限制性内切核酸酶酶切位点可朝向5’末端，朝向3’末端，或靠近探针核酸单链区段的中间产生。一般来说，本文所述探针核酸的总长度可以是约10-2500个或更多核苷酸(例如，约10-2000个核苷酸之间，约10-1000个核苷酸之间，约10-500个核苷酸之间，约10-400个核苷酸之间，约10-300个核苷酸之间，约10-200个核苷酸之间，约10-100个核苷酸之间，约10-50个核苷酸之间，约10-25个核苷酸之间，约20-500个核苷酸之间，约30-500个核苷酸之间，约40-500个核苷酸之间，约50-500个核苷酸之间，约75-500个核苷酸之间，约100-500个核苷酸之间，约15-50个核苷酸之间，约15-25个核苷酸之间，约20-50个核苷酸之间，或约18-25个核苷酸之间)。
通过目标核酸与探针核酸杂交产生的识别性限制性内切核酸酶酶切位点可以是任何类型的限制性内切核酸酶的酶切位点。另外，可用任何类型的限制性内切核酸酶作为识别性限制性内切核酸酶在目标核酸杂交后酶切探针核酸。可用作识别性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶的例子包括但不限于EcoRI,EcoRII,BamHI,HindIII,TaqI,NotI,HinfI,Sau3A,PovII,SmaI,HaeIII,HgaI,AluI,EcoRV,EcoP15I,KpnI,PstI,SacI,SalI,ScaI,SphI,StuI,XbaI,AarI,BanII,BseGI,BspPI,CfrI,EcoNI,Hsp92II,NlaIV,RsaI,TaiI,AasI,BbsI,BseJI,BspTI,ClaI,EcoO109I,I-PpoI,NmuCI,RsrII,TaqaI,AatII,BbuI,BseLI,BsrBI,CpoI,,KasI,Acc65I,BbvCI,BseMI,BsrDI,Csp45I,,Kpn2I,NruI,SacII,TasI,AccB7I,BbvI,BseMII,BsrFI,Csp6I,EheI,KpnI,NsbI,SalI,TatI,AccI,BceAI,BseNI,BsrGI,CspI,Esp3I,KspAI,NsiI,SapI和TauI限制性内切核酸酶。在一些情况下，编码天然存在的限制性内切核酸酶的核酸可经遗传工程改造，产生修饰的限制性内切核酸酶，它能够识别独特酶切位点。可用常规的计算机算法确定任何所需目标核酸的核苷酸序列上限制性内切核酸酶酶切位点。一旦确定，可用沿着额外侧接序列(例如5’侧接序列，3’侧接序列或5’和3’侧接序列两者)的限制性内切核酸酶酶切位点的序列设计用于和目标核酸杂交的探针核酸的互补序列，并在目标核酸杂交后产生识别性限制性内切核酸酶酶切位点。
一般说，探针核酸可以设计成具有单链区段，该单链区段设计成与所需目标核酸杂交，在与目标核酸杂交后形成一个识别性限制性内切核酸酶酶切位点。在一些情况下，探针核酸可设计成具有单链区段，其设计成与所需目标核酸杂交，在与目标核酸杂交后形成一个以上(例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多)识别性限制性内切核酸酶酶切位点。当使用一个以上的识别性限制性内切核酸酶酶切位点时，多个识别性限制性内切核酸酶酶切位点可以是同一限制性内切核酸酶的酶切位点，或不同限制性内切核酸酶的酶切位点。例如，探针核酸可设计成具有单链区段，其设计成与所需目标核酸杂交，在目标核酸杂交后形成EcoRI识别性限制性内切核酸酶的一个识别性限制性内切核酸酶酶切位点和XbaI识别性限制性内切核酸酶的一个识别性限制性内切核酸酶酶切位点。在这样的情况下，各识别性限制性内切核酸酶可单独或联合使用(例如作为混合物)酶切与目标核酸杂交，并通过此类杂交形成相应的识别性限制性内切核酸酶酶切位点的探针核酸。
探针核酸可设计成能够检测任何目标核酸。可用本文提供的方法和材料检测的目标核酸的例子包括但不限于人类核酸、微生物核酸(例如细菌、真菌或原生动物核酸)、病毒核酸、含点突变、SNP或基因重排的核酸、哺乳动物核酸、甲基化核酸和mRNA。当检测RNA目标核酸时，可用能够酶切识别性限制性内切核酸酶酶切位点(该酶切位点在探针核酸的DNA区段和RNA目标核酸之间形成)的限制性内切核酸酶作为识别性限制性内切核酸酶。这样的限制性内切核酸酶的例子包括但不限于HhaI,AluI,TaqI,HaeIII,EcoRI,HindII,SalI,和MspI限制性内切核酸酶。当检测甲基化目标核酸时(例如与癌症相关的甲基化目标核酸)，能够酶切包括要评估的甲基化核苷酸的识别性限制性内切核酸酶酶切位点的限制性内切核酸酶可用作识别性限制性内切核酸酶。能够识别甲基化核苷酸的限制性内切核酸酶的例子包括但不限于DpnI,GlaI,HpaII,MspI,AciI,HhaI,和SssI限制性内切核酸酶。在这种情况下，对照可包括检测不含甲基化核苷酸的相同目标核酸。在一些情况下，可用甲基化不敏感和甲基化敏感的限制性内切核酸酶组合评估样品中甲基化的目标核酸。例如，用为相同位点设计的甲基化不敏感和甲基化敏感的限制性内切核酸酶都产生类似酶切产物，可指示目标核酸在该位点缺少甲基化，而用甲基化不敏感的限制性内切核酸酶产生的酶切产物与使用为相同位点设计的甲基化敏感的限制性内切核酸酶产生的酶切产物水平相比有所增加，可表示该目标核酸在该位点有甲基化。
要检测的目标核酸的核苷酸序列可获自例如，常规核酸数据库，如等。可用基于计算机的程序选择目标核苷酸序列的部分。例如，可用基于计算机的程序检测目标核酸一部分中的限制性内切核酸酶酶切位点。这样的信息可用于设计探针核酸，从而使得单链区段在与目标核酸杂交后形成至少一个识别性限制性内切核酸酶酶切位点。
可用任何合适的方法获得探针核酸的核酸组分。例如，可用常规的分子克隆和化学核酸合成技术获得探针核酸的核酸组分。在一些情况下，探针核酸的核酸组分可以用市售自动化核苷酸合成仪，例如加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司(AppliedBiosystems,Foster City，CA)的那些合成。在一些情况下，可用任何数量的本领域广泛应用的方法从头合成探针核酸。这样的合成方法的例子包括但不限于β-氰基乙基亚磷酰胺法(Beaucage等,四面体通信,22:1859-1862(1981))和核苷H-膦酸盐法(Garegg等，四面体通信,27:4051-4054(1986)；Froehler等，核酸研究,14:5399-5407(1986)；Garegg等.,四面体通信,27:4055-4058(1986)；和Gaffney等,四面体通信，29:2619-2622(1988))。这些方法可以用各种市售自动化核苷酸合成仪进行。在一些情况下，诸如PCR等重组核酸技术和包括使用限制性酶消化和连接现存核酸序列(例如基因组DNA或cDNA的)的那些可用于获得探针核酸的核酸组分。
本文所述的探针核酸结合在固相载体上。固相载体的例子包括但不限于微量滴定板孔(例如96-孔微量滴定板孔或ELISA板)，珠(例如磁性、玻璃、塑料或金包被的珠)，载玻片(例如玻璃或金包被的载玻片)、微米或纳米颗粒(例如碳纳米管)、铂固相载体、钯固相载体和微流化装置中室或通道的表面。在一些情况下，固相载体可以是基于氧化硅的固相载体、基于塑料聚合物的固相载体(例如尼龙、硝基纤维素或基于聚氟乙烯的固相载体)，或基于生物聚合物(例如交联葡聚糖或基于纤维素的固相载体)的固相载体。探针核酸可直接或间接结合于固相载体。例如，生物素可以是探针核酸的组分，含有生物素的探针核酸可通过生物素-链霉亲和素相互作用间接结合在链霉亲和素包被的固相载体上。在一些情况下，探针核酸可通过共价或非共价作用结合于固相载体。例如，探针核酸可与他处描述的磁珠共价结合(Albretsen等,分析生物化学,189(1):40-50(1990))。
探针核酸可设计成含有任何类型的限制性内切核酸酶作为扩增性限制性内切核酸酶。一般说，探针核酸的扩增性限制性内切核酸酶通常是与用作识别性限制性内切核酸酶不同的限制性内切核酸酶。例如，当EcoRI限制性内切核酸酶用作识别性限制性内切核酸酶时，用EcoRI限制性内切核酸酶以外的限制性内切核酸酶(例如HindIII限制性内切核酸酶)作为扩增性限制性内切核酸酶。可用作扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶的例子包括但不限于EcoRI,EcoRII,BamHI,HindIII,TaqI,NotI,HinfI,Sau3A,PovII,SmaI,HaeIII,HgaI,AluI,EcoRV,EcoP15I,KpnI,PstI,SacI,SalI,ScaI,SphI,StuI,XbaI,AarI,BanII,BseGI,BspPI,CfrI,EcoNI,Hsp92II,NlaIV,RsaI,TaiI,AasI,BbsI,BseJI,BspTI,ClaI,EcoO109I,I-PpoI,NmuCI,RsrII,TaqaI,AatII,BbuI,BseLI,BsrBI,CpoI,KasI,Acc65I,BbvCI,BseMI,BsrDI,Csp45I,,Kpn2I,NruI,SacII,TasI,AccB7I,BbvI,BseMII,BsrFI,Csp6I,EheI,KpnI,NsbI,SalI,TatI,AccI,BceAI,BseNI,BsrGI,CspI,Esp3I,KspAI,NsiI,SapI,和TauI限制性内切核酸酶。任何数量的同一扩增性限制性内切核酸酶的分子可结合于一个探针核酸分子。例如，一个探针核酸分子可含有一个、两个、三个、四个、五个、或更多个EcoRI扩增性限制性内切核酸酶分子。在一些情况下，一个探针核酸分子可含有两个或多个(例如两个、三个、四个、五个或更多个)不同类型的扩增性限制性内切核酸酶。例如，一个探针核酸分子可含有三个EcoRI扩增性限制性内切核酸酶分子和两个BanII扩增性限制性内切核酸酶分子。
可用任何合适的方法将扩增性限制性内切核酸酶与探针核酸的核酸组分结合。在一些情况下，可通过离子或共价结合使扩增性限制性内切核酸酶结合。例如，可用共价键，例如酰胺键、二硫键、和硫醚键，或交联剂形成的键。在一些情况下，可使用非共价键。结合可以是直接结合或间接结合。例如，可用连接基将扩增性限制性内切核酸酶与探针核酸的核酸组分结合。在一些情况下，核酸可包含巯基修饰，限制性内切核酸酶可基于4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，使用与他处所述类似的技术偶联于含巯基的核酸(Dill等,生物传感器和生物电子学,20:736-742(2004))。在一些情况下，可将生物素化核酸和含链霉亲和素的限制性内切核酸酶通过生物素-链霉亲和素作用互相结合。可用例如6-(3’-[2-吡啶基二巯基]-丙酰胺)己酸磺基琥珀酯使限制性内切核酸酶与链霉亲和素偶联。可将扩增性限制性内切核酸酶结合于探针核酸的核酸组分的任何位置。例如，扩增性限制性内切核酸酶可结合在核酸组分的任何一端(例如5’末端或3’末端)，核酸组分的中间，或沿核酸组分长度的任何位置。
本文所述的信号放大核酸(例如第一信号放大核酸和第二信号放大核酸)和报道核酸通常包含至少一个双链DNA区段，其包括扩增性限制性内切核酸酶酶切位点(例如起始扩增性限制性内切核酸酶酶切位点，第二扩增性限制性内切核酸酶酶切位点，或第三扩增性限制性内切核酸酶酶切位点)。信号放大核酸或报道核酸的其它部分可包括DNA、RNA或其它分子。例如，报道核酸可包括生物素，从而使报道核酸能够结合于链霉亲和素包被的固相载体。在一些情况下，包含扩增性限制性内切核酸酶的信号放大核酸或报道核酸的双链区段的一条或两条链可以是RNA或核酸类似物(例如肽核酸(PNA))，条件是这样的双链区段能够被扩增性限制性内切核酸酶酶切。可以用作扩增性限制性内切核酸酶酶切信号放大核酸或报道核酸的DNA:RNA杂交区段的限制性内切核酸酶的例子包括但不限于HhaI,AluI,TaqI,HaeIII,EcoRI,HindII,SalI,和MspI限制性内切核酸酶。
本文所述的信号放大核酸或报道核酸可以是任何长度，条件是含有扩增性限制性内切核酸酶酶切位点的双链区段能够被扩增性限制性内切核酸酶酶切。一般说，信号放大核酸或报道核酸的双链部分可以长约10-500个或更多个核苷酸(例如约10-400个核苷酸、约10-300个核苷酸、约10-200个核苷酸、约10-100个核苷酸、约10-50个核苷酸、约10-25个核苷酸、约20-500个核苷酸、约30-500个核苷酸、约40-500个核苷酸、约30-500个核苷酸、约40-500个核苷酸、约50-500个核苷酸、约15-50个核苷酸、约15-25个核苷酸、约20-50个核苷酸、约18-25个核苷酸)。在一些情况下，信号放大核酸或报道核酸的双链区段可以长5-50个核苷酸。信号放大核酸或报道核酸的扩增性限制性内切核酸酶酶切位点可位于双链区段的任何位置。例如，扩增性限制性内切核酸酶酶切位点可以朝向5’端，朝向3’端，或靠近信号放大核酸或报道核酸的双链区段的中央。一般说，本文所述的信号放大核酸或报道核酸的总长度可以是约10-2500或更多个核苷酸(例如约10-2000个核苷酸,约10-1000个核苷酸,约10-500个核苷酸,约10-400个核苷酸,约10-300个核苷酸,约10-200个核苷酸,约10-100个核苷酸,约10-50个核苷酸,约10-25个核苷酸,约20-500个核苷酸,约30-500个核苷酸,约40-500个核苷酸,约50-500个核苷酸,约75-500个核苷酸,约100-500个核苷酸,约150-500个核苷酸,约15-50个核苷酸,约15-25个核苷酸,约20-50个核苷酸,或约18-25个核苷酸)。
本文所述的信号放大核酸或报道核酸的扩增性限制性内切核酸酶酶切位点可以是任何类型的限制性内切核酸酶的酶切位点。另外，可用任何类型的限制性内切核酸酶作为扩增性限制性内切核酸酶来酶切信号放大核酸或报道核酸。可用作扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶的例子包括但不限于EcoRI,EcoRII,BamHI,HindIII,TaqI,NotI,HinfI,Sau3A,PovII,SmaI,HaeIII,HgaI,AluI,EcoRV,EcoP15I,KpnI,PstI,SacI,SalI,ScaI,SphI,StuI,XbaI,AarI,BanII,BseGI,BspPI,CfrI,EcoNI,Hsp92II,NlaIV,RsaI,TaiI,AasI,BbsI,BseJI,BspTI,ClaI,EcoO109I,I-PpoI,NmuCI,RsrII,TaqaI,AatII,BbuI,BseLI,BsrBI,CpoI,KasI,Acc65I,BbvCI,BseMI,BsrDI,Csp45I,,Kpn2I,NruI,SacII,TasI,AccB7I,BbvI,BseMII,BsrFI,Csp6I,EheI,KpnI,NsbI,SalI,TatI,AccI,BceAI,BseNI,BsrGI,CspI,Esp3I,KspAI,NsiI,SapI,和TauI限制性内切核酸酶。
一般说，信号放大核酸或报道核酸可设计成具有双链区段，其含有一个扩增性限制性内切核酸酶酶切位点。在一些情况下，本文所述的信号放大核酸或报道核酸可设计成具有双链区段，其含有一个以上(例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多)的扩增性限制性内切核酸酶酶切位点。当使用一个以上扩增性限制性内切核酸酶酶切位点时，多个扩增性限制性内切核酸酶酶切位点可以是同一限制性内切核酸酶的酶切位点或不同限制性内切核酸酶的酶切位点。例如，报道核酸可设计成具有双链区段，其含有EcoRI起始扩增性限制性内切核酸酶的一个起始扩增性限制性内切核酸酶酶切位点和XbaI第二扩增性限制性内切核酸酶的一个第二扩增性限制性内切核酸酶酶切位点。
可用任何合适的方法获得信号放大核酸或报道核酸的核酸组分。例如，可用常用的分子克隆和化学核酸合成技术获得信号放大核酸或报道核酸的核酸组分。在一些情况下，信号放大核酸或报道核酸的核酸组分可以用市售的自动化核苷酸合成仪合成，例如那些购自加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司的。在一些情况下，信号放大核酸或报道核酸可用任意数量的本领域广泛应用的方法从头合成。这样的合成方法的例子包括但不限于β-氰基乙基亚磷酰胺法(Beaucage等,四面体通信,22:1859-1862(1981))和核苷H-膦酸盐法(Garegg等，四面体通信,27:4051-4054(1986)；Froehler等，核酸研究,14:5399-5407(1986)；Garegg等.,四面体通信,27:4055-4058(1986)；和Gaffney等,四面体通信，29:2619-2622(1988))。这些方法可以用各种市售自动化核苷酸合成仪进行。在一些情况下，诸如PCR等重组核酸技术和包括使用限制性酶消化和连接现存核酸序列(例如基因组DNA或cDNA的)的那些技术可用于获得探针核酸的核酸组分。
本文所述的信号放大核酸或报道核酸可结合在固相载体上。固相载体的例子包括但不限于微量滴定板孔(例如96-孔微量滴定板孔或ELISA板)，珠(例如磁性、玻璃、塑料或金包裹的珠)，载玻片(例如玻璃或金包裹的载玻片)、微米或纳米颗粒(例如碳纳米管)、铂固相载体、钯固相载体和微流化装置中室或通道的表面。在一些情况下，固相载体可以是基于氧化硅的固相载体、基于塑料聚合物的固相载体(例如尼龙、硝基纤维素或基于聚氟乙烯的固相载体)，或基于生物聚合物(例如交联葡聚糖或基于纤维素的固相载体)的固相载体。
信号放大核酸或报道核酸可直接或间接结合于固相载体。例如，生物素可以是信号放大核酸或报道核酸的组分，含有生物素的信号放大核酸或报道核酸可通过生物素-链霉亲和素相互作用间接结合在链霉亲和素包被的固相载体上。在一些情况下，信号放大核酸或报道核酸可通过共价或非共价相互作用结合于固相载体。例如，信号放大核酸或报道核酸可与他处描述的磁珠共价结合(Albretsen等,分析生物化学,189(1):40-50(1990))。
信号放大核酸可设计成含有任何类型的限制性内切核酸酶作为扩增性限制性内切核酸酶(例如起始扩增性限制性内切核酸酶、第二扩增性限制性内切核酸酶、或第三扩增性限制性内切核酸酶)。一般说，信号放大核酸的扩增性限制性内切核酸酶通常是与用作识别性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶不同的限制性内切核酸酶。例如，当EcoRI限制性内切核酸酶用作识别性限制性内切核酸酶时，用EcoRI限制性内切核酸酶以外的限制性内切核酸酶(例如HeaIII限制性内切核酸酶)作为扩增性限制性内切核酸酶。可用作扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶的例子包括但不限于EcoRI,EcoRII,BamHI,HindIII,TaqI,NotI,HinfI,Sau3A,PovII,SmaI,HaeIII,HgaI,AluI,EcoRV,EcoP15I,KpnI,PstI,SacI,SalI,ScaI,SphI,StuI,XbaI,AarI,BanII,BseGI,BspPI,CfrI,EcoNI,Hsp92II,NlaIV,RsaI,TaiI,AasI,BbsI,BseJI,BspTI,ClaI,EcoO109I,I-PpoI,NmuCI,RsrII,TaqaI,AatII,BbuI,BseLI,BsrBI,CpoI,KasI,Acc65I,BbvCI,BseMI,BsrDI,Csp45I,,Kpn2I,NruI,SacII,TasI,AccB7I,BbvI,BseMII,BsrFI,Csp6I,EheI,KpnI,NsbI,SalI,TatI,AccI,BceAI,BseNI,BsrGI,CspI,Esp3I,KspAI,NsiI,SapI,和TauI限制性内切核酸酶。任何数量的同一扩增性限制性内切核酸酶的分子可结合于一个信号放大核酸分子。例如，一个信号放大核酸分子可含有一个、两个、三个、四个、五个、或更多个EcoRI扩增性限制性内切核酸酶分子。在一些情况下，一个信号放大核酸分子可含有两个或多个(例如两个、三个、四个、五个或更多个)不同类型的扩增性限制性内切核酸酶。例如，一个信号放大核酸分子可含有三个BanII扩增性限制性内切核酸酶分子和两个SacII扩增性限制性内切核酸酶分子。
报道核酸可设计成含有标记，以帮助检测酶切的报道核酸。在一些情况下，信号放大核酸可设计成含有标记。在这些情况下，含有标记的信号放大核酸可与报道核酸一起使用，或代替报道核酸检测目标核酸。可以是报道核酸或信号放大核酸的组分的标记的例子包括但不限于荧光标记(使用或不使用淬灭剂)、染料、抗体、放射性物质、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、漆酶、半乳糖苷酶、或荧光酶)、氧化还原标记物(例如铁氧还标记)、金属颗粒(例如金纳米颗粒)、基于绿色荧光蛋白的标记。在一些情况下，对于氧化还原标记例如二茂铁，检测仪可以是氧化还原分子的安培测试的电极。例如，如果氧还标记以二茂铁的还原形式存在，那么在高电极电势下的电极可氧化还原形式的二茂铁，从而将其转换成二茂铁的氧化形式。产生的电流与溶液中的二茂铁标记浓度成比例。
在一个实施例中，报道核酸或信号放大核酸可含有荧光标记和淬灭剂，从而使得酶切的报道核酸提供荧光信号，未酶切的报道核酸不提供荧光信号。在一些情况下，报道核酸或信号放大核酸可以含有标记(例如荧光标记或辣根过氧化物酶等酶)，并可结合于固相载体(例如微量滴定板孔)。例如，报道核酸或信号放大核酸可结合于固相载体，使得扩增性限制性内切核酸酶在扩增性限制性内切核酸酶酶切位点酶切能够释放报道核酸或信号放大核酸中含有标记的部分。可收集得到的混合物，用标记评估报道核酸或信号放大核酸释放部分的存在与否及其量。例如，报道核酸或信号放大核酸释放的部分如果存在，可从含有报道核酸或信号放大核酸的微量滴定板孔(例如96-孔板)的一个孔转移到微量滴定板孔的另一个孔，在该处评估转移的物质来自标记的信号。可将任何数量的标记分子结合于一个报道核酸分子或一个信号放大核酸分子。例如，一个报道核酸分子或一个信号放大核酸分子可含有一个、两个、三个、四个、五个或更多个荧光分子。
可用任何合适的方法将标记结合在报道核酸或信号放大核酸的核酸组分上。在一些情况下，标记可通过离子或共价结合结合。例如，可用共价键，例如酰胺键、二硫键、和硫醚键，或交联剂形成的键。在一些情况下，可使用非共价键。结合可以是直接结合或间接结合。例如，可用连接基将标记与报道核酸或信号放大核酸的核酸组分结合。在一些情况下，核酸可包含巯基修饰，标记可基于4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，使用与他处所述类似的技术偶联于含巯基的核酸(Dill等,生物传感器和生物电子学,20:736-742(2004))。在一些情况下，可将生物素化核酸和含链霉亲和素的限制性内切核酸酶通过生物素-链霉亲和素作用互相结合。可用例如6-(3’-[2-吡啶基二巯基]-丙酰胺)己酸磺酸琥珀酯使标记与链霉亲和素偶联。可将标记结合于报道核酸或信号放大核酸的核酸组分的任何位置。例如，标记可结合在报道核酸或信号放大核酸的核酸组分的任何一端(例如5’末端或3’末端)，核酸组分的中间，或沿核酸组分长度的任何位置。
本文提供的方法和材料可用于检测任何类型样品中的目标核酸。例如，可收集血液样品、血清样品、唾液样品、鼻拭子样品、粪便样品、尿样、组织样(例如组织活检样品)、环境样品(例如水样、土样和空气样品)、食物样品(例如肉样、产品样品或饮料样)、和工业样品(例如空气过滤器样品和从工作站收集到的样品)并评估目标核酸。一旦获得，可处理要评估的样品以获得目标核酸。例如，可在组织样上进行核酸抽提，以获得富含核酸的样品。在一些情况下，可加热样品或用细胞裂解剂处理，以从存在于样品中的细胞内释放核酸。
一旦获得，将要评估的样品与本文所述的探针核酸接触。该接触步骤可以在任意长度的时间和任何温度下进行以便目标核酸与探针核酸杂交。例如，该步骤可以在10秒到24小时间(例如30秒到12小时，30秒到8小时，30秒到4小时，30秒到2小时，30秒到1小时，1分钟到24小时，1分钟到12小时，1分钟到8小时，1分钟到4小时，1分钟到2小时，1分钟到1小时，5分钟到1小时，10分钟到1小时，15分钟到1小时，或30分钟到1小时之间)进行。起始温度可以是15℃到100℃(；例如23℃到98℃,23℃到90℃,23℃到85℃,23℃到75℃,23℃到65℃,23℃到55℃,23℃到45℃,23℃到35℃,30℃到95℃,30℃到85℃,30℃到75℃,30℃到65℃,30℃到55℃,30℃到45℃,20℃到40℃,20℃到30℃,到25℃到35℃)。该接触步骤中的温度可以维持稳定或可以升高或下降。例如，起始温度可以是约40℃-85℃，然后温度可以在30秒到30分钟内(例如约30秒到15分钟，约30秒到10分钟，约1分钟到30分钟，约1分钟到15分钟，或约1分钟到5分钟)下降到室温。
样品(例如要测试或怀疑含有目标核酸的样品)与探针核酸的接触可以在识别性限制性内切核酸酶的存在下发生，或可进行单独的在反应中加入识别性限制性内切核酸酶的步骤。识别性限制性内切核酸酶步骤可以在允许识别性限制性内切核酸酶酶切目标核酸和探针核酸杂交形成的识别性限制性内切核酸酶酶切位点的任何时间和任意温度下进行。例如，该步骤可以在1秒到24小时(例如1秒到30分钟，1秒到1小时，5秒到1小时，30秒到24小时，30秒到12小时，30秒到8小时，30秒到4小时，30秒到2小时，30秒到1小时，1分钟到24小时，1分钟到12小时，1分钟到8小时，1分钟到4小时，1分钟到2小时，1分钟到1小时，5分钟到1小时，10分钟到1小时，15分钟到1小时或30分钟到1小时)之间进行。温度可以是15℃到75℃(例如15℃到75℃,15℃到65℃,15℃到55℃,15℃到45℃,15℃到35℃,15℃到30℃,23℃到55℃,23℃到45℃,30℃到65℃,30℃到55℃,30℃到45℃,30℃到40℃,35℃到40℃,到36℃到38℃)。可使用识别性限制性内切核酸酶的任意合适浓度。例如，可使用约0.001单位到1000单位(例如约0.001单位到750单位，约0.001单位到500单位，约0.001单位到250单位，约0.001单位到200单位，约0.001单位到150单位，约0.001单位到100单位，约0.001单位到50单位，约0.001单位到25单位，约0.001单位到10单位，约0.001单位到1单位,约0.001单位到0.1单位，约0.01单位到1000单位，约0.1单位到1000单位，约1单位到1000单位，约10单位到1000单位，约50单位到1000单位，约0.5单位到100单位，或约1单位到100单位)的限制性内切核酸酶。可根据厂商的说明书使用其它限制性内切核酸酶条件，例如盐浓度。
当本文所提供的方法中的一个步骤完成时，可将得到的含有酶切核酸的反应产物用于下一步。例如，可将反应产物的酶切核酸与未酶切核酸分开，用于方法的下一步。例如，当探针核酸结合于固相载体时，可收集释放的含有扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸部分，如本文所述与报道核酸或信号放大核酸接触。特定步骤得到的反应产物可手工或自动化(例如用机器人)转移到含有下一步的核酸(例如报道核酸或信号放大核酸)的位置，其中核酸可以与固相载体结合或不结合。在一些情况下，本文所述的方法的一个反应可以在微流体装置或泡罩包装装置的一个位置(例如一个室)中进行，产生的反应产物可通过通道移动到含有下一步的核酸(例如报道核酸或信号放大核酸)的另一个位置(例如另一个室)。在一些情况下，可通过从反应产物中分离未酶切的核酸，在方法的下一步中使用反应产物的经酶切核酸。例如，当用磁珠作为固相载体时，可用磁力将磁珠和任何结合的未酶切的核酸与反应产物分离。
可用任何合适的方法检测经酶切的报道核酸和/或信号放大核酸，以测定样品中目标核酸的存在与否及其量。例如，可用尺寸分选技术评估反应产物中经酶切的报道核酸和/或信号放大核酸。这种尺寸分选技术的例子包括但不限于凝胶电泳和毛细电泳技术。在一些情况下，可进行解链曲线分析以评估反应产物中经酶切的报道核酸和/或信号放大核酸。如本文所述，可用标记帮助检测经酶切的核酸(例如报道核酸和/或信号放大核酸)。可用的标记的例子包括但不限于荧光标记(使用或不使用淬灭剂)、染料、抗体、放射性物质、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、漆酶、半乳糖苷酶、或荧光酶)、氧化还原标记物(例如铁氧还标记)、金属颗粒(例如金纳米颗粒)、基于绿色荧光蛋白的标记。例如，可用常规荧光标记检测仪评估报道核酸和/或信号放大核酸的荧光标记部分从固相载体上的释放。在一些情况下，经酶切的报道核酸和/或信号放大核酸可用电化学方法检测。对于电化学检测，报道核酸和/或信号放大核酸可包括二茂铁氧还标记。含有二茂铁的报道核酸和/或信号放大核酸可在过量二茂铁羧酸存在下，采用碳二亚胺反应通过使二茂铁羧酸与氨基修饰的寡核苷酸偶联获得。在一个实施例中，对于氧化还原标记例如二茂铁，检测仪可以是氧化还原分子的安培测试的电极。例如，如果氧还标记以二茂铁的还原形式存在，那么在高电极电势下的电极可氧化还原形式的二茂铁，从而将其转换成二茂铁的氧化形式。产生的电流与溶液中二茂铁标记的浓度成比例。
本文所述的方法和材料可用于实时评估一个或多个样品中的目标核酸。例如，可用荧光标记/淬灭剂系统或电化学氧化还原标记系统实时检测报道核酸和/或信号放大核酸的酶切。
本文提供的方法和材料可用于评估一个或多个(例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个,20个,50个,100个,500个,1000个,或更多)样品中一种类型的目标核酸。在一些情况下，本文提供的方法和材料可以多重形式使用，以评估一个或多个样品中一种以上(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种,20,50,100,500,1000种或更多种)类型的目标核酸。例如，可用十种不同序列(例如来自一种菌种或菌株的十种不同序列，或来自十种不同细菌菌种或菌株的不同序列)的目标核酸设计10种不同的探针核酸分子。在这些情况下，可用不同标记对应于各探针核酸，从而使得检测的信号可表示十种目标核酸中的哪一种被检测。
本文还提供用于进行本文所述方法的试剂盒。例如，本文提供的试剂盒可包含与固相载体结合或不结合的探针核酸，和/或与固相载体结合或不结合的报道核酸。在一些情况下，这样的试剂盒可包含识别性限制性内切核酸酶，第一信号放大核酸，第二信号放大核酸，或其组合。在一些情况下，试剂盒可配制成微流体装置，其允许探针核酸、第一信号放大核酸、第二信号放大核酸、报道核酸或识别性限制性内切核酸酶(或其任何组合)，以及任何这些核酸的酶切部分以一定方式运动，所述方式能够实施本文提供的检测方法，其中核酸可结合或不结合于固相载体。例如，本文提供的试剂盒可以是能够接受样品并使样品与探针核酸接触的微流体装置。可将探针核酸设计成包含一定长度的核苷酸，其后是与目标核酸互补的序列，其可产生识别性限制性内切核酸酶酶切位点，然后是扩增性限制性内切核酸酶。识别性限制性内切核酸酶酶切位点与扩增性限制性内切核酸酶之间的距离可以较短(例如100,50,25,10,或更少的核苷酸),而识别性限制性内切核酸酶酶切位点到核苷酸长度起始的距离可以较长(例如50,100,150,200,500,1000,2000,个或更长)。在这样的情况下，在识别性限制性内切核酸酶酶切位点酶切探针核酸可得到较小部分，其含有扩增性限制性内切核酸酶，能比较大的未酶切的探针核酸移动更快速。该区别能够使含有扩增性限制性内切核酸酶的经酶切的部分到达含有信号放大核酸或报道核酸的微流体装置的区域，从而能在不存在未酶切探针核酸的情况下进行下一步反应。在一些情况下，含有扩增性限制性内切核酸酶的较小的部分到达含有信号放大核酸或报道核酸的区域后，可用阀门防止未酶切的探针核酸进入。在一些情况下，可用滤膜限制较大的未酶切的探针核酸进入下一步反应位置。可在本文提供的方法的其它步骤中使用类似方法分离酶切的核酸与未酶切的核酸。
在一些情况下，本文提供的试剂盒可以是便携式或自持装置、包装、器皿或容器，可用于例如现场应用。例如，这样的试剂盒可配制成让用户插入样品用于分析。一旦插入，可用试剂盒内的加热或冷却机构加热样品(例如加热到约25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,75,80,85,90,95℃或以上)和/或冷却。例如，可在试剂盒内引发放热或吸热化学反应，从而提高、降低或保持温度。这样的放热或吸热化学反应可以在试剂盒内进行，而不需要与目标核酸检测方法的反应物有液体交换。铁氧化反应是可用于加热本文提供的试剂盒的一种放热化学反应。可用于冷却本文提供的试剂盒的一种吸热化学反应可以是包括使用氯化铵和水、氯化钾和水、或碳酸钠和乙醇酸在内的反应。一般说，当检测DNA目标核酸时，试剂盒可设计成在需要的情况下可产生足够热量，以使得样品内存在的双链DNA变性。试剂盒还可设计成产生足够的加热和冷却温度，从而能进行本文提供的检测方法的每一步。在一些情况下，本文提供的试剂盒可包括温度指示计(例如显色指示剂或温度计)，让用户评估温度。
在一些情况下，试剂盒可设计成对用户提供测试样品中目标核酸存在的“是”或“否”的指示。例如，可使用能够产生pH变化的标记和可视指示剂(例如基于pH的显色剂)，以通过pH的改变通知用户目标核酸的存在。
以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求书所述的本发明范围。
实施例
实施例1－目标－探针杂交物的形成和酶切
用巯基在5’末端和生物素分子在3’末端修饰的寡核苷酸探针(5’-巯基-GGT AGTGCG AAA TGC CAT TGC TAG TTG TTT-生物素-3’；SEQ ID NO:1)与辣根过氧化物酶(HRP)偶联。用SMCC试剂根据Dill等(生物传感器和生物电子学，20:736-742(2004))所述的改良技术进行偶联。HRP偶联物溶液与链霉亲和素包被的ELISA板一起保温，将HRP-寡核苷酸探针通过生物素－链霉亲和素作用固定在其表面。然后，ELISA板与不同浓度的目标寡核苷酸(5’-AAA CAA CTA GCA ATG GCA TTT-3’；SEQ ID NO:2)一起温育。目标寡核苷酸序列与探针序列反向互补，形成双链的杂交分子。洗涤后，板在含有限制性内切核酸酶BfaI的溶液中温育。BfaI特异性识别序列5’-CTAG-3’，并切割双链的目标探针杂交物，将HRP-寡核苷酸释放到反应溶液中。37℃温育2小时后，将反应溶液转移到新的ELISA板中。切开的HRP-寡核苷酸与3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)接触，形成有色反应产物。
当反应混合物中加入过量的限制性内切核酸酶BfaI时，观察到释放的HRP-探针和寡核苷酸目标浓度之间有明显的直接依赖性(图6A)。可检测目标浓度约为1nM。不经过任何第二信号放大，通过直接测定获得该检测极限。如本文所述，加入限制性内切核酸酶信号放大级联可以进一步提高几个数量级的检测极限。
当HRP－寡核苷酸探针与过量目标寡核苷酸(500nM)预温育时，酶切的HRP-寡核苷酸探针量受到识别性限制性内切核酸酶BfaI含量的限制(图6B)。综上所述，这些数据显示识别性限制性内切核酸酶能够用于引发本文所述的限制性内切核酸酶级联反应。
实施例2－用探针核酸和报道核酸检测目标核酸
选择目标核酸。一旦选定，用常用基因数据库，例如和/或基于计算机的序列分析程序鉴定出目标核酸中含有限制性内切核酸酶酶切位点的部分。设计与目标核酸中至少一个含有酶切位点的部分互补的探针核酸。一旦设计并用标准寡核苷酸合成法获得探针核酸，将其与扩增性限制性内切核酸酶偶联，固定在微量滴定板第一孔表面。要测试的样品在第一孔中温育。如果样品中存在目标核酸，目标核酸的至少一部分与探针核酸杂交，从而形成识别性限制性内切核酸酶酶切位点。在具有样品和探针核酸的第一孔中加入识别性限制性内切核酸酶。微量滴定板在37℃温育合适的时间，使酶切反应进行。
识别性限制性内切核酸酶酶切探针核酸后，含有探针核酸释放部分的反应溶液被转移到第二孔中。第二孔含有固定在表面上并含有具有扩增性限制性内切核酸酶酶切位点的至少一个双链部分的报道核酸。报道核酸还具有荧光标记。转移到第二室后，结合在探针核酸释放部分的扩增性限制性内切核酸酶与报道核酸接触。扩增性限制性内切核酸酶在双链化的扩增性限制性内切核酸酶酶切位点酶切报道核酸，形成至少两个部分。将含有荧光标记的报道核酸的释放部分转移到第三微量滴定板孔中，用标准荧光读数计测定任何荧光信号。
用已知量目标核酸的标准曲线定量测试样品中的目标核酸量。
实施例3－用探针核酸、第一信号放大核酸，第二信号放大核酸和报道核酸检测目 标核酸
一旦选定，用常用基因数据库，例如和/或基于计算机的序列分析程序鉴定出目标核酸中含有限制性内切核酸酶酶切位点的部分。根据本文所述，基于所需的目标核酸设计探针核酸。使用标准寡核苷酸合成法制备探针核酸，然后将其偶联到起始扩增性限制性内切核酸酶上，固定在微量滴定板第一孔表面。在第一孔中温育将要测试目标核酸的样品。如果目标核酸存在于样品中，目标核酸的至少一部分与探针核酸杂交，因此形成识别性限制性内切核酸酶酶切位点。将识别性限制性内切核酸酶加到具有样品和探针核酸的第一孔中。微量滴定板在37℃温育一段合适的时间，让酶切反应进行。
在识别性限制性内切核酸酶酶切探针核酸:目标核酸杂交物以后，含有探针核酸游离部分的反应溶液被转移到另一个包含第一信号放大核酸和第二信号放大核酸的孔中。第一信号放大核酸和第二信号放大核酸产生了正反馈循环，导致起始扩增性限制性酶的释放指数加快。该孔的反应产物被转移到另一个含有报道核酸的孔中，采用酶切报道核酸确定样品中目标核酸的存在与否及其量。用已知量的目标核酸的标准曲线定量测试样品中的目标核酸量。
实施例4-检测细菌的存在与否
用酶扩增级联反应检测样品中甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(MRSA)的存在与否。用常规基因数据库，例如GenBank和/或基于计算机的序列分析程序分析MRSA特异性目标核酸，以鉴定出含有限制性内切核酸酶酶切位点的目标核酸部分。设计与所选目标核酸至少一部分互补的探针核酸。一旦设计并用标准寡核苷酸合成法获得探针核酸，将其与扩增性限制性内切核酸酶偶联，固定在微量滴定板的第一孔表面。获得怀疑含有MRSA的生物学样品(例如组织样品或鼻拭子)，在第一孔中保温来自该样品的核酸。如果样品中存在MRSA，至少一部分MRSA特异性核酸与探针核酸杂交，从而形成识别性限制性内切核酸酶酶切位点。在含有样品和探针核酸的第一孔中加入识别性限制性内切核酸酶。微量滴定板在37℃保温一段合适的时间，以进行酶切反应。
在用识别性限制性内切核酸酶酶切探针核酸:目标核酸杂交物后，第一孔中的反应溶液被转移到含有报道核酸的第二孔中，该报道核酸被固定在第二孔表面并具有含扩增性限制性内切核酸酶酶切位点的至少一个双链部分。报道核酸也具有荧光标记。在某些情况下，在报道核酸步骤前使用第一信号放大核酸和第二信号放大核酸，以提高目标核酸的检测水平。第一信号放大核酸和第二信号放大核酸可以包括标记，此时它们与报道核酸一起使用或者代替报道核酸使用。
将反应混合物转移到第二室后，探针核酸被释放部分的扩增性限制性核酸内切酶接触报道核酸，将微量滴定板在合适的温度下(例如37℃下)培养一段合适的时间，以进行酶切反应。扩增性限制性内切核酸酶在双链扩增性限制性内切核酸酶酶切位点切开报道核酸，形成至少两部分。第二孔的反应溶液被转移到第三孔，用荧光微量滴定板读数计检测荧光。第三孔中的荧光表明在样品中存在MRSA特异性核酸。如果样品获自病人，这样的结果表示在该病人中有MRSA感染。如果在第三孔中没有检测到荧光，这样的结果表明在样品中不存在MRSA。
其它实施方式
应理解，虽然已经结合发明详述描述了本发明，但是上面的详述旨在说明而非限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、益处和修改落在所附权利要求的范围内。

Claims (15)

1.一种非诊断性的评估样品中的目标核酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)使所述样品与探针核酸接触，所述探针核酸包含扩增性限制性内切核酸酶和在下述条件下与所述目标核酸的序列互补的核苷酸序列：如果所述目标核酸存在于所述样品中，所述目标核酸的至少一部分与所述探针核酸的至少一部分杂交，形成含有限制性内切核酸酶切割位点的核酸的双链部分，
(b)使所述核酸的双链部分与识别性限制性内切核酸酶接触，所述识别性限制性内切核酸酶能在下述条件下在所述限制性内切核酸酶酶切位点处切开所述核酸的双链部分：所述识别性限制性内切核酸酶在所述限制性内切核酸酶酶切位点切开所述核酸的双链部分，从而使所述探针核酸中含有所述扩增性限制性内切核酸酶的部分与所述探针核酸的至少另一部分分离；
(c)使所述探针核酸中含有所述扩增性限制性内切核酸酶的所述部分与含有扩增性限制性内切核酸酶的报道核酸接触，所述报道核酸包含扩增性限制性内切核酸酶、标记、以及含有所述扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点的核酸双链部分，所述接触的条件是其中所述扩增性限制性内切核酸酶在所述扩增性限制性内切核酸酶的所述限制性内切核酸酶酶切位点切开所述报道核酸，从而使所述报道核酸的第一部分与所述报道核酸的至少另一部分分离，其中所述第一部分包含所述标记，和
(d)用所述标记确定所述第一部分的存在与否，其中所述第一部分的存在表明所述样品含有所述目标核酸，其中所述第一部分不存在表明所述样品不含所述目标核酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针核酸包含第一核酸链，所述第一核酸链含有与所述目标核酸的所述序列互补的核苷酸序列，与含有所述限制性内切核酸酶的第二核酸链杂交。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针核酸结合在固相载体上。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述探针核酸中包含所述扩增性限制性内切核酸酶的所述部分通过所述步骤(b)从所述固相载体上释放。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述探针核酸包含核酸链，所述核酸链含有与所述目标核酸的所述序列互补的所述核苷酸序列、所述限制性内切核酸酶、和生物素。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述探针核酸通过链霉亲和素结合在固相载体上。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)和步骤(b)是在同一区室中进行的。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)和步骤(b)是通过将所述样品加到含有所述探针核酸和所述识别性限制性内切核酸酶的区室中进行的。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述报道核酸包含第一核酸链，所述第一核酸链包含所述扩增性限制性内切核酸酶；和包含所述标记的第二核酸链。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述报道核酸结合在固相载体上。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述报道核酸包含含有生物素的核酸链。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述含有生物素的报道核酸通过生物素-链霉亲和素相互作用间接结合在链霉亲和素包被的固相载体上。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记是荧光标记、放射性标记、酶标记、或氧化还原标记。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)、(b)和(c)不经过核酸扩增，或所述步骤(a),(b),(c),和(d)不经过核酸扩增。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述确定步骤包括确定存在于所述样品内的所述目标核酸的量。
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