BR112021002609A2 - detecção in vitro de ácido nucleico - Google Patents

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Carl W. Brown Iii
Frederic Vigneault
James J. Collins
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Abstract

DETECÇÃO IN VITRODE ÁCIDO NUCLEICO. A presente invenção se refere a composições e métodos para detecção in vitro de ácidos nucleicos. Os sensores de ácido nucleico são ativados para a expressão livre de células de uma proteína repórter codificada com base na presença de um ácido nucleico alvo. O sistema é projetado para funcionar em extrato celular de baixo custo, sem a necessidade de instrumentação ou controle de temperatura rigoroso. Esses recursos são vantajosos para aplicações de diagnóstico molecular in loco na saúde do consumidor, saúde animal, segurança alimentar e outras áreas onde o custo e a portabilidade são fatores-chave.

Description

“DETECÇÃO IN VITRO DE ÁCIDO NUCLEICO” REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] O presente pedido reivindica o benefício sob a Lei Norte-Americana No. 35 (§119(e)) do Pedido Provisório Norte-Americano No. 62/718,427 depositado em 14 de agosto de 2018, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi submetida em formato ASCII via EFS-Web e é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 29 de julho de 2019, é denominada 002806-092060WOPT_SL.txt e possui 15.781 bytes.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0003] O presente documento descreve sistemas e métodos para detecção de ácidos nucleicos usando sistema de expressão livre de células.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0004] As técnicas tradicionais de detecção de ácido nucleico requerem infraestrutura e investimento operacional significativos. Em particular, os sistemas de marcação e amplificação requerem plataformas de ciclo térmico e tecnologias de imagem que são volumosas e caras. Esses sistemas também limitam as oportunidades de implantação em campo. Nos casos em que a expressão da proteína é uma leitura de detecção, os sistemas de expressão de células in vivo adicionam uma camada suplementar de complexidade, sem implantação viável para uso em campo. Assim, há uma grande necessidade na técnica no que tange sistemas e métodos de complexidade reduzida, proporcionando implantação flexível com infraestrutura mínima.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0005] São fornecidos aqui métodos e composições que se referem a sistemas sensores para detectar a presença de uma molécula alvo de ácido nucleico. Na ausência do alvo, esses sensores existem como partes não funcionais. Na presença do alvo, as partes do sistema sensor que compreendem a sequência de ligação ao ácido nucleico alvo ligam-se especificamente ao alvo e, quando ligadas ao alvo, são posicionadas em estreita proximidade entre si, tornando possível formar um sistema sensor. Quando funcional, o sistema sensor pode expressar uma proteína repórter. Dessa forma, os sensores aqui descritos têm sinais de fundo muito baixos e são prontamente adaptados para uso com a tecnologia existente para a medição de produção de proteínas.
[0006] São descritos aqui composições e métodos para a detecção in vitro de ácidos nucleicos. Os sensores de ácido nucleico são ativados para a expressão livre de células de uma proteína repórter codificada com base na presença de um ácido nucleico alvo. O sistema é projetado para funcionar em extratos de células de baixo custo, sem a necessidade de instrumentação ou controle de temperatura rigoroso. Esses recursos são vantajosos para aplicações de diagnóstico molecular in loco na saúde do consumidor, saúde animal, segurança alimentar e outras áreas onde o custo e a portabilidade são fatores-chave.
[0007] Os aspectos da presente invenção fornecem um sistema sensor de ácido nucleico compreendendo uma primeira e uma segunda partes do sensor de DNA de fita simples que, quando ligadas entre si, geram uma fita simples de um cassete de expressão de DNA que compreende: (i) um promotor; (ii) um sítio de ligação ao ribossomo (RBS); e (iii) uma sequência de codificação. Em algumas modalidades, uma sequência de hibridização de ácido nucleico alvo está localizada dentro da primeira e da segunda partes do sensor de DNA de fita simples.
[0008] Os aspectos da presente invenção descrevem um sistema sensor de ácido nucleico que compreende uma primeira e uma segunda partes do sensor de DNA de fita simples que, quando ligadas entre si, geram uma fita simples de um cassete de expressão de DNA que compreende: (i) um promotor; (ii) um sítio de ligação ao ribossomo (RBS); (iii) uma sequência de codificação, cuja fita simples compreende uma sequência de hibridização de ácido nucleico alvo compreendendo regiões de hibridização 3’ e 5’, em que a região de hibridização 3’ está incluída na primeira parte do sensor e a região de hibridização 5’ está incluída na segunda parte do sensor de modo que, quando o sistema sensor entra em contato com uma amostra que inclui um ácido nucleico alvo que hibridiza com a sequência de ácido nucleico alvo, a hibridização com o ácido nucleico alvo permite a ligação da primeira e segunda partes.
[0009] Em algumas modalidades, o cassete de expressão de DNA é um cassete de expressão de DNA não molde.
Em algumas modalidades, a primeira e a segunda partes do sensor do cassete de expressão são separadas em qualquer posição dentro do cassete de expressão. Em algumas modalidades, a separação ocorre dentro da sequência de hibridização de ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, a sequência de hibridização de ácido nucleico alvo está localizada em qualquer posição dentro do cassete de expressão.
[0010] Em algumas modalidades, a primeira ou a segunda partes do sensor compreende a sequência de codificação e a parte remanescente do sensor compreende o promotor. Em algumas modalidades, a primeira ou a segunda parte do sensor compreende o promotor e o sítio de ligação ao ribossomo e a parte remanescente do sensor compreende a sequência de codificação. Em algumas modalidades, a primeira ou a segunda parte do sensor compreende o promotor, o sítio de ligação ao ribossomo e um códon de iniciação da sequência de codificação e a parte remanescente do sensor compreende a sequência de codificação restante. Em algumas modalidades, a primeira parte do sensor compreende, de 5’ a 3’: (i) o promotor; (ii) o sítio de ligação ao ribossomo (RBS); (iii) o códon de iniciação para a sequência de codificação; e (iv) a região de hibridização 3’ na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; e a segunda parte do sensor compreende de 5’ a 3’: (i) a região de hibridização 5’ na forma de um quadro de leitura em quadro com a sequência de codificação restante; e (ii) uma sequência de codificação remanescente ligada a jusante e em quadro com a região de hibridização 5’.
[0011] Em algumas modalidades, a primeira ou a segunda parte do sensor compreende o promotor e a parte remanescente do sensor compreende o sítio de ligação ao ribossomo e a sequência de codificação. Em algumas modalidades, a primeira parte do sensor compreende, de 5’ a 3’: (i) o promotor; e (ii) a região de hibridização 3’; e a segunda parte do sensor compreende, de 5’ a 3’: (i) a região de hibridização 5’; (ii) a sequência de ligação ao ribossomo; e (iii) a sequência de codificação.
[0012] Em algumas modalidades, a primeira ou a segunda parte do sensor compreende o promotor, o sítio de ligação ao ribossomo e uma porção 5’ da sequência de codificação e a parte remanescente do sensor compreende a sequência de codificação restante. Em algumas modalidades, a primeira parte do sensor compreende, de 5’ a 3’: (i) o promotor; (ii) o RBS; (iii) uma primeira porção da sequência de codificação, compreendendo um códon de iniciação e pelo menos um códon adicional; e (iv) a região de hibridização 3’ na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; e a segunda parte do sensor compreende, de 5’ a 3’: (i) a região de hibridização 5’ na forma de um quadro de leitura em quadro com a primeira porção da sequência de codificação e em quadro com a segunda porção da sequência de codificação; e (ii) uma segunda porção da sequência de codificação ligada a jusante e em quadro com a região de hibridização 5’.
[0013] Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da região de hibridização 3’ está no promotor, no sítio de ligação ao ribossomo ou na sequência de codificação. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da região de hibridização 5’ está no promotor, no sítio de ligação ao ribossomo ou na sequência de codificação. Em algumas modalidades, a região de hibridização 3’ não está no interior do promotor, do sítio de ligação ao ribossomo ou da sequência de codificação. Em algumas modalidades, a região de hibridização 3’ é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação na primeira parte do sensor. Em algumas modalidades, a região de hibridização 5’ não está no interior do promotor, do sítio de ligação ao ribossomo ou da sequência de codificação. Em algumas modalidades, a região de hibridização 5’ é 5’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação na segunda parte do sensor.
[0014] Em algumas modalidades, a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ têm, coletivamente, pelo menos 12 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ têm, cada uma, pelo menos 6 nucleotídeos de comprimento.
[0015] Em algumas modalidades, a primeira e a segunda partes do sensor estão na mesma molécula. Em algumas modalidades, a extremidade 5’ da primeira parte do sensor está ligada à extremidade 3’ da segunda parte do sensor por meio de sequências intervenientes de ssDNA, de modo que a primeira e a segunda parte do sensor formem uma única molécula. Em algumas modalidades, o sistema compreende ainda um primer complementar a uma sequência dentro do cassete de expressão não molde ou sequências intervenientes de ssDNA.
Em algumas modalidades, a primeira e a segunda partes do sensor estão em pelo menos duas moléculas separadas.
[0016] Em algumas modalidades, a extremidade 5’ da primeira parte do sensor compreende ainda uma sequência que forma uma alça em forma de grampo de cabelo terminal. Em algumas modalidades, o sistema compreende ainda um primer complementar a uma região 3’ da segunda parte do sensor. Em algumas modalidades, o sistema compreende ainda um primer complementar a uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação na segunda parte do sensor. Em algumas modalidades, o sistema compreende ainda um primer complementar a uma região 5’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação na segunda parte do sensor. Em algumas modalidades, a segunda parte do sensor compreende ainda uma sequência de nucleotídeos em sua extremidade 3’ compreendendo o primer em uma alça em forma de grampo de cabelo terminal.
[0017] Em algumas modalidades, a sequência de codificação do cassete de expressão de DNA codifica um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é uma proteína repórter. Em algumas modalidades, a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ estão localizadas na sequência de codificação, dentro de uma região que codifica para uma alça exposta a solvente da proteína repórter. Em algumas modalidades, a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ estão localizadas na sequência de codificação da proteína repórter e não afetam substancialmente a função do gene repórter. Em algumas modalidades, a proteína repórter compreende uma luciferase, nanoluciferase, beta-lactamase, beta-galactosidase, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, catalase, anidrase carbônica, proteína verde fluorescente, proteína vermelha fluorescente, proteína ciano fluorescente, proteína amarela fluorescente, tripsina, protease, um peptídeo que complementa e ativa uma proteína repórter truncada e um polipeptídeo que é detectável por ensaio.
[0018] Em algumas modalidades, o sistema sensor de ácido nucleico compreende ainda um sistema de expressão livre de células. Em algumas modalidades, o sistema sensor de ácido nucleico compreende ainda uma ligase. Em algumas modalidades, o sistema sensor de ácido nucleico compreende ainda uma transcriptase reversa. Em algumas modalidades, o sistema sensor de ácido nucleico compreende ainda uma ribonuclease que hidrolisa o RNA que é hibridizado em DNA.
Em algumas modalidades, a ribonuclease é RNAse H.
[0019] Em algumas modalidades, o sistema sensor de ácido nucleico compreende ainda um ou mais dentre uma ligase, uma DNA polimerase de deslocamento de fita, dNTPs, inibidor de RNAse e um sistema de expressão livre de células. Em algumas modalidades, o sistema de expressão livre de células é o extrato de células inteiras. Em algumas modalidades, o sistema sensor de ácido nucleico compreende ainda uma DNA polimerase. Em algumas modalidades, a DNA polimerase é selecionada a partir do grupo que consiste em um fragmento Klenow com porção exonuclease, um fragmento Klenow sem porção exonuclease, uma phi29 polimerase, uma DNA polimerase T7 modificada, uma polimerase de Psychrobacillus, uma polimerase de Psychrobacillus com deslocamento de fita aprimorado, uma polimerase de B. subtilis, Sequenase Versão
2.0, um fragmento grande de DNA polimerase Bsu, uma DNA polimerase Bst 3.0, uma DNA polimerase de alta fidelidade Phusion®, uma DNA polimerase Vent® sem a porção exonuclease, uma DNA polimerase Vent®, uma DNA polimerase Q5® de alta fidelidade e um fragmento grande de DNA polimerase I (Klenow).
[0020] Em algumas modalidades, um polimorfismo do ácido nucleico alvo hibridiza com uma sequência na extremidade 3’ da região de hibridização da primeira parte do sensor e na extremidade 5’ da região de hibridização da segunda parte do sensor. Em algumas modalidades, a região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor ou região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor é configurada para hibridizar com um polimorfismo do ácido nucleico alvo.
Em algumas modalidades, a extremidade livre da região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor ou a extremidade livre da região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor é configurada para hibridizar com um polimorfismo do ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, a sequência de hibridização do polimorfismo compreende uma ou ambas as bases 3’ da região de hibridização da primeira parte do sensor e a base 5’ da região de hibridização da segunda parte do sensor. Em algumas modalidades, a região de hibridização de ácido nucleico alvo compreende um ou mais polimorfismos.
[0021] Aspectos da presente invenção descrevem métodos para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra, compreendendo: (a) fornecer uma amostra compreendendo o ácido nucleico alvo; (b) contatar a amostra compreendendo o ácido nucleico alvo com o sistema sensor de ácido nucleico conforme aqui descrito na presença de uma ligase sob condições favoráveis à hibridização do ácido nucleico alvo à região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor e à região de hibridização 5’
da segunda parte do sensor do cassete de expressão para, assim, gerar um produto reacional compreendendo o ácido nucleico alvo hibridizado com a primeira parte do sensor e a segunda parte do sensor operacionalmente ligadas entre si; (c) contatar o produto reacional produzido na etapa (b) com um sistema de expressão livre de células na presença de uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um primer, em condições favoráveis à produção de uma proteína repórter; (d) contatar o produto reacional produzido na etapa (c) com um reagente que permite a detecção da expressão da proteína repórter; (e) medir a expressão da proteína repórter produzida na etapa (d) para determinar a presença e/ou quantidade do ácido nucleico alvo na amostra. Em algumas modalidades, a ligase é fornecida como parte do sistema livre de células.
[0022] Aspectos da presente invenção descrevem métodos para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra, compreendendo: (a) fornecer uma amostra compreendendo o ácido nucleico alvo; (b) contatar a amostra compreendendo o ácido nucleico alvo com o sistema sensor de ácido nucleico conforme aqui descrito, na presença de uma ligase e opcionalmente um primer em condições favoráveis à hibridização da sequência de ácido nucleico alvo à região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor e à região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor do cassete de expressão para, desse modo, gerar um produto reacional compreendendo o ácido nucleico alvo hibridizado com a primeira parte do sensor e a segunda parte do sensor operacionalmente ligadas entre si; (c) contatar o produto reacional produzido na etapa (b) com um sistema de expressão livre de células na presença de uma DNA polimerase de deslocamento de fita, sob condições favoráveis à produção de uma proteína repórter; (d) contatar o produto reacional produzido na etapa (c) com um reagente que permite a detecção da expressão da proteína repórter; (e) mensurar a expressão da proteína repórter produzida na etapa d) para determinar a presença e/ou quantidade do ácido nucleico alvo na amostra.
[0023] Aspectos da presente invenção descrevem métodos para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra, compreendendo: (a) proporcionar uma amostra compreendendo o ácido nucleico alvo; (b) contatar a amostra compreendendo o ácido nucleico alvo com: (i) o sistema sensor de ácido nucleico conforme aqui descrito na presença de uma ligase; e (ii) um sistema de expressão livre de células na presença de uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um primer, sob condições favoráveis à hibridização do ácido nucleico alvo à região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor e à região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor do cassete de expressão e à produção de uma proteína repórter; (c) contatar o produto reacional produzido na etapa (b) com um reagente que permite a detecção da expressão da proteína repórter; (d) medir a expressão da proteína repórter produzida na etapa (c) para determinar a presença e/ou quantidade do ácido nucleico alvo na amostra. Em algumas modalidades, a ligase é fornecida como parte do sistema livre de células.
[0024] Aspectos da presente invenção descrevem métodos para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra, compreendendo: (a) proporcionar uma amostra compreendendo a sequência de ácido nucleico alvo; (b) contatar a amostra compreendendo a sequência de ácido nucleico alvo com: (i) o sistema sensor de ácido nucleico como aqui descrito, na presença de uma ligase; (ii) um sistema de expressão livre de células na presença de uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um primer; e (iii) um reagente que permite a detecção da expressão da proteína repórter, em condições favoráveis à hibridização do ácido nucleico alvo à região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor e à região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor do cassete de expressão e para a produção de uma proteína repórter; (c) medir a expressão da proteína repórter produzida na etapa (b) para determinar a presença e/ou quantidade do ácido nucleico alvo na amostra. Em algumas modalidades, a ligase é fornecida como parte do sistema livre de células.
[0025] Aspectos da presente invenção descrevem um kit que compreende uma composição que abrange um sistema sensor de ácido nucleico em um material de embalagem, um dispositivo de coleta de amostra, um controle positivo e instruções de uso.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0026] Figura 1: Ilustração da tecnologia de detecção de ácido nucleico. Uma amostra contendo um ácido nucleico alvo (linha tracejada) é combinada com as partes do sensor de ácido nucleico (A, B, p) em um sistema de expressão livre de células. A junção das partes do sensor (i’, ii’) é projetada para hibridizar com o ácido nucleico alvo (i, ii), permitindo a ligação de A e B em uma única fita por uma ligase. A DNA polimerase estende um primer, p, para criar um cassete de expressão de fita dupla funcional que é transcrito e traduzido em um repórter detectável (por exemplo, uma enzima ou um polipeptídeo não catalítico prontamente detectável) pelo sistema de expressão livre de células.
[0027] Figura 2A e Figura 2B: Ilustrações mostrando componentes de ácido nucleico do sistema sensor. (Figura 2A) Uma modalidade do sistema sensor com cadeias de ssDNA não molde (sense) e sítio de divisão após o códon de iniciação da sequência de codificação. A região de hibridização e o RNA alvo estão sombreados e o fosfato 5’ (P) no domínio B é mostrado. O domínio A compreende um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo (RBS), um códon de iniciação ATG e uma região de hibridização 3’ (sombreado). O domínio B compreende um fosfato 5’ (P), um domínio de hibridização 5’ (sombreado) e uma sequência de codificação. O primer também é mostrado.
(Figura 2B) Esquemas de componentes alternativos do sensor: (i) domínios A e B ligados nas extremidades 5’ e 3’, respectivamente; (ii) incorporação do primer de ssDNA como um grampo de cabelo terminal do domínio B; ou (iii) incluindo grampos de cabelo na extremidade 5’ do domínio A e na extremidade 3’ do domínio B.
[0028] Figura 3: Ilustrações mostrando três versões dos componentes do sistema sensor. Na versão 1, o cassete de expressão é dividido em Parte A e Parte B após o códon de iniciação (ATG) da sequência de codificação. Na versão 2, o cassete de expressão é dividido em Parte A e Parte B entre o promotor (P) e o sítio de ligação ao ribossomo (RBS). Na versão 3, o cassete de expressão é dividido em Parte A e Parte B dentro da sequência de codificação. As regiões de hibridização alvo inseridas são mostradas como caixas tracejadas nos designs das versões 1 e 2. A versão 3 não inclui a sequência inserida e, em vez disso, possui uma sequência alvo que corresponde às sequências de codificação do repórter que flanqueiam o sítio de junção. Um primer que hibridiza com a extremidade 3’ da Parte B é mostrado.
[0029] Figura 4A a Figura 4C: Gráficos de barras que mostram a luminescência medida do cassete de expressão de dsDNA intacto (AB) versus partes de dsDNA A ou B individuais (B_T1, B_T2, A_T3) para cada versão do design. (Figura 4A) Cassetes de expressão com duas regiões de hibridização diferentes inseridas, AB_T1 e AB_T2, foram comparadas com a parte B apenas para o sistema da versão 1. (Figura 4B) Cassetes de expressão com duas regiões de hibridização diferentes inseridas, AB_T1 e AB_T2, foram comparadas com a parte B apenas para o sistema da versão 2. (Figura 4C) O cassete de expressão da Versão 3 foi comparado com a parte A correspondente. RLU = unidades de luz relativa.
[0030] Figura 5A e Figura 5B: Gráficos de barras mostrando a detecção de diferentes quantidades de RNA alvo
(T2) pelo sistema sensor de Versão 1 (v1). As reações incluíram RNA alvo em concentrações de 0 pM a 10,9 nM. Uma sequência de RNA não complementar (fora do alvo) também foi testada a 10,9 nM. (Figura 5A) A DNA polimerase com fragmento Klenow +exo foi usada para a extensão do primer através da junção ligada. (Figura 5B) A DNA polimerase Sequenase foi usada para extensão do primer através da junção ligada. Em branco = poço vazio; RLU = unidades de luz relativa.
[0031] Figura 6: Gráfico de barras mostrando a detecção de diferentes quantidades de RNA T1 alvo pelo sistema sensor v1. As reações incluíram RNA alvo em concentrações de 0 pM a 1,44 pM. A etapa de ligação nessas reações durou 15 minutos e a luminescência foi medida após 1 hora. RLU = unidades de luz relativa.
[0032] Figura 7: Gráfico de barras que mostra a comparação de desempenho do sensor v1 em várias concentrações de RNA T1 alvo (0 pM a 50 pM) com quantidades crescentes de RNA de “fundo” (bg), de 0 ng a 2600 ng. RLU = unidades de luz relativa.
[0033] Figura 8: Gráfico de barras que mostra a comparação de desempenho do sensor v1 de alvo T1 “spiked” em “fundos” de água, extrato de RNA (RNAex) e extrato de célula inteira lisado por calor (WCex). RLU = unidades de luz relativa.
[0034] Figura 9: Gráfico de barras mostrando a comparação de desempenho do sensor v1 com detecção de T2 diretamente a partir do extrato de RNA (RNAex) ou extrato de célula inteira lisado por calor (WCex) correspondendo a equivalentes de material celular. RLU = unidades de luz relativa.
[0035] Figura 10: Gráfico de barras que mostra o desempenho do sensor v1 com detecção de T1 em “fundos” crescentes de saliva humana agrupada (0% a 70,8%). RLU = unidades de luz relativa.
[0036] Figura 11A a Figura 11D: Gráficos de barras que mostram o desempenho de diferentes DNA polimerases no processo de ativação mediada por RNA da versão 3 do sistema sensor. (Figura 11A) fragmento Klenow +exo; (Figura 11B) fragmento Klenow -exo; (Figura 11C) polimerase phi29; e (Figura 11D) As DNA polimerases sequenase foram todas eficazes na ativação do cassete de expressão na presença de ligase e RNA T2 alvo (+ LT) em comparação com a reação sem ligase e alvo (-LT). RLU = unidades de luz relativa.
[0037] Figura 12: Gráfico de barras mostrando testes de esquema alternativo do componente sensor v1, onde ambas as partes A e B estão na mesma sequência de ssDNA, de modo que B seja agora 5’ de A. Dois construtos foram testados, um terminando o transcrito de RNA com o uso de um domínio terminador T7 (CSt) e o outro contendo três códons de terminação de repetição (CSs). O gráfico de barras mostra a comparação de desempenho com a detecção de RNA alvo T1 ou T2 em concentrações variáveis (0 pM a 200 pM). RLU = unidades de luz relativa.
[0038] Figura 13: Gráfico de barras mostrando a discriminação de variações de nucleotídeo único (SNVs) ou polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) introduzidos na região de hibridização do alvo de v1. Quatro variantes diferentes foram testadas (por exemplo, SNP-UG, SNP-AA, SNP- GA, SNP-GG). RLU = unidades de luz relativa.
[0039] Figura 14A a Figura 14C: Gráficos de barras mostrando o teste de múltiplas DNA polimerases usando v1.
(Figura 14A). Desempenho das polimerases (4 unidades por reação, a menos que especificado de outra forma) no sistema de detecção in vitro visando a sequência de RNA alvo CT (+RNA) versus um controle negativo sem a sequência de RNA alvo (-RNA). IsoPol (polimerase de Psychrobacillus); IsoPol SD+ (polimerase de Psychrobacillus com deslocamento de fita aprimorado); Bsu (polimerase de B. subtilis). RLU = unidades de luz relativa. (Figura 14B) A razão sinal / “fundo” com base nessas medições (razão S:B) é mostrada para cada polimerase. (Figura 14C) Razão S:B usando diferentes quantidades de unidades de IsoPol SD+, de 1,7 U a 4 U.
[0040] Figura 15A e Figura 15B: Gráficos de barras mostrando o teste de fracionamento do cassete de expressão de enzima nanoluciferase (NLuc) e inserção da sequência de hibridização alvo em alças expostas a solvente. (Figura 15A) Atividade de Nluc com a sequência de hibridização inserida nas regiões de alça indicadas expostas a solvente. (Figura 15B) As partes do sensor de ssDNA foram construídas com base nas localizações divididas em A e na sequência CT alvo conforme descrito, e foram testadas para detecção de 100 nM de RNA alvo CT. RLU = unidades de luz relativa.
[0041] Figura 16: Diagrama esquemático dos construtos usados para testar o “fundo” da transcrição / tradução independente de construtos de luciferase dividida.
Cada produto de PCR tem um promotor T7 seguido por um códon de iniciação RBS e ATG, o fragmento de Nanoluciferase e um códon de terminação. Por exemplo, para o sítio de divisão 1, a parte A seria uma sequência de DNA que codifica os aminoácidos 1 a 17 da sequência 1, e a parte B seria uma sequência de DNA que codifica os aminoácidos 18 a 170.
[0042] Figura 17: Gráfico de barras mostrando o sinal de luminescência de construtos de luciferase dividida testados em um sistema de expressão livre de células. O construto de comprimento total é uma luciferase completa contendo produto de PCR conduzido por T7, enquanto o construto negativo é uma reação sem produto de PCR adicionado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0043] É aqui descrito um sistema sensor de ácido nucleico com base em um cassete de expressão inativo não funcional projetado para ativação na presença de um ácido nucleico alvo. A ativação pode ocorrer, por exemplo, por hibridização de múltiplas moléculas do cassete separadas com uma molécula alvo, trazendo, assim, as moléculas de cassete em associação e fornecendo um cassete completo, que seja funcional. O cassete de expressão funcional e ativo é transcrito e traduzido para uma proteína ou polipeptídeo codificado em um sistema de expressão livre de células. Os sistemas de expressão livres de células contêm maquinaria celular operando fora do contexto de uma célula viva e sem as restrições de uma membrana celular. A proteína ou polipeptídeo codificado pode ser detectado direta ou indiretamente.
[0044] Um sistema de expressão livre de células é um sistema in vitro contendo toda a maquinaria molecular, componentes do bloco de construção e moléculas de energia necessárias para a produção de proteínas a partir de um cassete de expressão, incluindo a transcrição de DNA em RNA e a tradução de RNA em proteína. A maquinaria molecular necessária para a produção de proteínas a partir de um cassete de expressão inclui, mas não está limitada, a RNA polimerases, ribossomos e tRNAs. Os sistemas de expressão livres de células podem ser baseados em extrato celulares, onde células inteiras são lisadas por ruptura de membrana para permitir a expressão externa, ou com base na transcrição e tradução de maquinaria purificada de células. Em ambos os casos, esses sistemas podem ser complementados com componentes básicos, tais como dNTPs e aminoácidos, juntamente com componentes de energia, tal como ATP.
[0045] Conforme descrito no presente documento, um promotor, sítio de ligação ao ribossomo (RBS) e sequência de codificação de proteína de um cassete de expressão são separados em dois ácidos nucleicos ou domínios de DNA de fita simples (ssDNA). A separação do cassete de expressão em duas partes (por exemplo, um primeiro ácido nucleico ou domínio e um segundo ácido nucleico ou domínio) e o uso de ssDNA não molde (sentido) renderiza o cassete de expressão não funcional para transcrição e tradução da proteína repórter. Tal como aqui utilizado, "não molde" indica a fita de DNA que é complementar à fita molde a partir da qual o mRNA pode ser transcrito; como tal, a fita não molde não pode ser transcrita diretamente em mRNA. Tal como aqui utilizado, "sentido" indica que a fita de DNA é a mesma fita que o mRNA codificado. Um ácido nucleico que "codifica" uma unidade ou componente específico é um ácido nucleico que compreende a sequência necessária para transcrever (e opcionalmente traduzir) a unidade ou componente especificado. Uma etapa intermediária de síntese de uma fita molde pode ser necessária para que tal transcrição ocorra, mas ainda se diz que o ácido nucleico codifica a unidade ou componente, pois a informação genética é intrínseca à sequência ou estrutura do ácido nucleico. Tal como aqui utilizado, "não funcional" indica que a fita ou molécula de DNA não pode ser transcrita em mRNA que codifica uma proteína repórter, uma vez que o promotor, RBS e a sequência de codificação não estão todos presentes na mesma fita e/ou molécula.
[0046] As partes do sistema sensor de ácido nucleico são projetadas de modo que um ácido nucleico alvo (RNA ou ssDNA) possa hibridizar e unir os ácidos nucleicos ou domínios no sítio de hibridização e/ou sítio de junção permitindo que uma ligase conecte os dois ácidos nucleicos ou domínios em uma única fita. O alongamento subsequente de um "primer" complementar a uma região 3’ da fita não molde (sentido) unida / conectada / ligada por uma DNA polimerase resulta na formação de um cassete de expressão de dsDNA funcional que pode ser transcrito pela RNA polimerase e traduzido em uma proteína repórter (ver, por exemplo, Figura 1).
[0047] É aqui descrito um sistema sensor de ácido nucleico, incluindo um primeiro ácido nucleico e um segundo ácido nucleico. O primeiro e o segundo ácidos nucleicos podem ser, cada um, uma molécula ou uma sequência. O primeiro ácido nucleico compreende uma região de hibridização 3’. A região de hibridização 3’ está localizada na extremidade 3’ do primeiro ácido nucleico. A região de hibridização 3’ é complementar a uma primeira região de um ácido nucleico alvo.
O segundo ácido nucleico compreende uma região de hibridização 5’. A região de hibridização 5’ está localizada na extremidade 5’ do segundo ácido nucleico. A região de hibridização 5’ é complementar a uma segunda região do ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a primeira e a segunda regiões do ácido nucleico alvo são adjacentes, contíguas e/ou consecutivas entre si.
[0048] O primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico podem ser ligados ou colocados em estreita proximidade por um ácido nucleico alvo. A primeira região do ácido nucleico alvo hibridiza com a região de hibridização a montante (por exemplo, região de hibridização 3’) do primeiro ácido nucleico. A segunda região do ácido nucleico alvo hibridiza com a região de hibridização a jusante (por exemplo, região de hibridização 5’) do segundo ácido nucleico. Uma vez que a primeira e a segunda regiões do ácido nucleico alvo são adjacentes, contíguas e/ou consecutivas entre si, a região de hibridização 3’ do primeiro ácido nucleico é colocada em estreita proximidade com a região de hibridização 5’ do segundo ácido nucleico. A região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’, que em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos inclui um fosfato 5’, podem ser unidas, conectadas ou ligadas por uma ligase.
Os primeiro e segundo ácidos nucleicos ligados formam um cassete não molde que codifica um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo e uma sequência de codificação para uma proteína repórter. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primeiro e o segundo ácidos nucleicos, uma vez ligados entre si por uma ligase, são referidos como o primeiro e o segundo domínios. O primeiro e o segundo ácidos nucleicos podem ser moléculas ou sequências separadas, enquanto o primeiro e o segundo domínios podem estar localizados na mesma molécula ou sequência após hibridização e ligação do primeiro e segundo ácidos nucleicos.
[0049] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico, quando ligados entre si, são configurados para codificar um cassete não molde compreendendo um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo e uma sequência de codificação para uma proteína repórter. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico, quando ligados entre si e hibridizados com um ácido nucleico alvo que hibridiza com a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’, são configurados para codificar um cassete não molde compreendendo um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo e uma sequência de codificação para uma proteína repórter.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, uma sequência de hibridização de ácido nucleico alvo está localizada dentro do cassete e o cassete é separado em um primeiro ácido nucleico e um segundo ácido nucleico, em que a separação ocorre dentro da região de hibridização.
[0050] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primeiro ácido nucleico inclui o promotor e o segundo ácido nucleico inclui a sequência de codificação para uma proteína repórter. Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos, o primeiro ácido nucleico inclui o promotor e sítio de ligação ao ribossomo e o segundo ácido nucleico inclui a sequência de codificação para uma proteína repórter.
[0051] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o sistema compreende ainda um primer complementar a uma região 3’ do segundo ácido nucleico ou complementar a uma sequência que é 3’ da sequência de codificação no segundo ácido nucleico ou domínio. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o sistema compreende ainda um primer complementar a uma região 3’ do segundo ácido nucleico ou complementar a uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no segundo ácido nucleico ácido ou domínio. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico são DNA. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico são ssDNA.
[0052] É descrito adicionalmente aqui um sistema sensor de ácido nucleico, incluindo: (a) uma forma não funcional, de fita simples, não molde de um cassete de expressão de DNA, incluindo: (i) um promotor; (ii) um RBS; e (iii) uma sequência de codificação para uma proteína repórter, em que uma sequência de hibridização de ácido nucleico alvo é inserida no cassete, e o cassete é separado em dois ácidos nucleicos, ou domínios, em que a separação ocorre dentro da região de hibridização; (b) um primer de DNA de fita simples complementar a uma região 3’ do cassete de expressão ou complementar a uma sequência que é 3’ da sequência de codificação no segundo ácido nucleico ou domínio; e (c) uma ligase e um sistema de expressão livre de células.
[0053] É descrito adicionalmente aqui um sistema sensor de ácido nucleico, incluindo: (a) uma forma não funcional, de fita simples, não molde de um cassete de expressão de DNA incluindo: (i) um promotor; (ii) um RBS; e (iii) uma sequência de codificação para uma proteína repórter, em que uma sequência de hibridização de ácido nucleico alvo é inserida dentro do cassete e o cassete é separado em duas moléculas, sequências, ácidos nucleicos ou domínios, em que a separação ocorre dentro da região de hibridização; (b) um primer de DNA de fita simples complementar a uma região 3’ do cassete de expressão ou complementar a uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no segundo ácido nucleico ou domínio; e (c) uma ligase e um sistema de expressão livre de células.
[0054] É descrito aqui um sistema sensor de ácido nucleico, referido em alguns aspectos ou modalidades como um sistema de ácido nucleico versão 1 (v1) (ver, por exemplo, Figura 3). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primeiro ácido nucleico ou domínio compreende o promotor, o sítio de ligação ao ribossomo e um códon de iniciação da sequência de codificação para a proteína repórter e o segundo ácido nucleico ou domínio compreende a sequência de codificação restante para a proteína repórter.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, este sistema de ácido nucleico compreende: (a) um primeiro ácido nucleico de ssDNA ou domínio incluindo, de 5’ a 3’, uma fita não molde (sentido) de: (i) um promotor; (ii) um RBS; (iii) um códon de iniciação; e (iv) uma região de hibridização 3’, na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; (b) um segundo ácido nucleico de ssDNA ou domínio incluindo, de 5’ a 3’, uma fita não molde (sentido) de: (i) uma região de hibridização 5’, na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; e (ii) uma sequência de codificação para uma proteína repórter ou polipeptídeo ligado a jusante da região de hibridização e em quadro com o códon de iniciação; e (c) um primer de ssDNA complementar a uma região 3’ do segundo ácido nucleico ou domínio.
[0055] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primeiro ou o segundo ácido nucleico ou domínio compreende o promotor, o sítio de ligação ao ribossomo e um códon de iniciação da sequência de codificação para a proteína repórter e o ácido nucleico ou domínio remanescente compreende a sequência de codificação restante para a proteína repórter. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, este sistema de ácido nucleico compreende: (a) um primeiro ácido nucleico de ssDNA ou domínio incluindo, de 5’ a 3’, uma fita não molde (sentido) de: (i) um promotor; (ii) um RBS; (iii) um códon de iniciação; e (iv) uma porção a montante de uma região de hibridização (por exemplo, região de hibridização 3’), na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; (b) um segundo ácido nucleico de ssDNA ou domínio incluindo, de 5’ a 3’, uma fita não molde (sentido) de: (i) uma porção a jusante da região de hibridização (por exemplo, região de hibridização 5’), na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; e (ii) uma sequência de codificação para uma proteína repórter ligada a jusante da região de hibridização e em quadro com o códon de iniciação; e (c) um primer de ssDNA complementar a uma região 3’ do segundo domínio.
[0056] Adicionalmente, é descrito no presente documento um sistema sensor de ácido nucleico, referido em alguns aspectos ou modalidades como um sistema de ácido nucleico versão 2 (v2) (ver, por exemplo, Figura 3). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primeiro ácido nucleico ou domínio compreende o promotor e o segundo ácido nucleico ou domínio compreende o sítio de ligação ao ribossomo e a sequência de codificação para a proteína repórter. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, este sistema de ácido nucleico compreende: (a) um primeiro ácido nucleico de ssDNA ou domínio incluindo, de 5’ a 3’, uma fita não molde (sentido) de: (i) um promotor; e (ii) uma região de hibridização 3’; (b) um segundo domínio de ssDNA incluindo, de 5’ a 3’, uma fita não molde (sentido) de: (i) uma região de hibridização 5’; (ii) um RBS; e (iii) um códon de iniciação ligado em quadro com uma sequência de codificação para uma proteína repórter; e (c) um primer de ssDNA complementar a uma região 3’ do segundo ácido nucleico ou domínio ou complementar a uma sequência que é 3’ da sequência de codificação no segundo ácido nucleico ou domínio.
[0057] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primeiro ou o segundo ácido nucleico ou domínio compreende o promotor e o ácido nucleico ou domínio restante compreende o sítio de ligação ao ribossomo e a sequência de codificação para a proteína repórter. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, este sistema de ácido nucleico compreende: (a) um primeiro ácido nucleico de ssDNA ou domínio incluindo, de 5’ a 3’, uma fita não molde (sentido) de: (i) um promotor; e (ii) uma porção a montante de uma região de hibridização (por exemplo, região de hibridização 3’); (b) um segundo domínio de ssDNA incluindo, de 5’ a 3’, uma fita não molde (sentido) de: (i) uma porção a jusante da região de hibridização (por exemplo, região de hibridização 5’); (ii) um RBS; e (iii) um códon de iniciação ligado em quadro com uma sequência de codificação para uma proteína repórter; e (c) um primer de ssDNA complementar a uma região 3’ do segundo ácido nucleico ou domínio ou complementar a uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no segundo ácido nucleico ou domínio.
[0058] É descrito aqui um sistema sensor de ácido nucleico, referido em alguns aspectos ou modalidades como um sistema de ácido nucleico versão 3 (v3) (ver, por exemplo, Figura 3). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primeiro ácido nucleico ou domínio compreende o promotor, o sítio de ligação ao ribossomo e uma porção 5’ da sequência de codificação para a proteína repórter e o segundo ácido nucleico ou domínio compreende a sequência de codificação restante para a proteína repórter.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, este sistema de ácido nucleico compreende:
(a) um primeiro ácido nucleico de ssDNA ou domínio incluindo, de 5’ a 3’, uma fita não molde (sentido) de: (i)
um promotor; (ii) o RBS; (iii) um códon de iniciação ligado em quadro com uma porção a montante de uma sequência de codificação para uma proteína repórter, por exemplo,
compreendendo um códon de iniciação e pelo menos um códon adicional; e (iv) uma região de hibridização 3’ na forma de um quadro de leitura ligado a jusante e em quadro com a porção a montante de uma sequência de codificação para uma proteína repórter;
(b) um segundo ácido nucleico de ssDNA ou domínio incluindo, de 5’ a 3’, uma fita não molde (sentido) de: (i)
uma região de hibridização 5’ na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; e (ii) uma porção a jusante de uma sequência de codificação para a proteína repórter ligada a jusante e em quadro com a porção a jusante da região de hibridização; e
(c) um primer de ssDNA complementar ao segundo domínio de ácido nucleico em sua extremidade 3’ ou complementar a uma sequência que é 3’ da sequência de codificação no segundo ácido nucleico ou domínio.
[0059] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primeiro ou o segundo ácido nucleico ou domínio compreende o promotor, o sítio de ligação ao ribossomo e uma porção 5’ da sequência de codificação para a proteína repórter e o ácido nucleico remanescente ou domínio compreende a sequência de codificação restante para a proteína repórter. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, este sistema de ácido nucleico compreende: (a) um primeiro ácido nucleico de ssDNA ou domínio incluindo, de 5’ a 3’, uma fita não molde (sentido) de: (i) um promotor; (ii) o RBS; (iii) um códon de iniciação ligado em quadro com uma porção a montante de uma sequência de codificação para uma proteína repórter, por exemplo, compreendendo um códon de iniciação e pelo menos um códon adicional; e (iv) uma porção a montante de uma região de hibridização (por exemplo, região de hibridização 3’) na forma de um quadro de leitura ligado a jusante e em quadro com a porção a montante de uma sequência de codificação para uma proteína repórter; (b) um segundo ácido nucleico de ssDNA ou domínio incluindo, de 5’ a 3’, a fita não molde (sentido) de: (i) uma porção a jusante da região de hibridização (por exemplo, região de hibridização 5’) na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; e (ii) uma porção a jusante de uma sequência de codificação para a proteína repórter ligada a jusante e em quadro com a porção a jusante da região de hibridização; e (c) um primer de ssDNA complementar ao segundo domínio de ácido nucleico em sua extremidade 3’ ou complementar a uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no segundo ácido nucleico ou domínio.
[0060] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ estão localizadas na sequência de codificação da proteína repórter ou polipeptídeo (por exemplo, o sistema sensor de ácido nucleico v3). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ estão localizadas dentro de uma região que codifica para uma alça exposta a solvente da proteína repórter. Conforme usado no presente documento, uma "alça exposta a solvente" se refere a uma região de uma proteína que está no lado externo (solvente) de uma proteína. Uma alça exposta a solvente pode ser mais flexível do ponto de vista conformacional do que outras regiões da proteína. Uma alça exposta a solvente pode representar um sítio ideal para a inserção de uma sequência(s) exógena(s) de ácido nucleico (por exemplo, as regiões de hibridização 3’ e 5’). A inserção de uma sequência exógena de ácido nucleico em uma alça exposta a solvente pode ter maior probabilidade de não interromper a estrutura e/ou função normal da proteína. A título de exemplo não limitativo, sítios de alça específicos expostos a solvente testados ou usados para inserção das regiões de hibridização 3’ e 5’ em Nanoluciferase incluem E50-N51, L66-S67, G123- K124, G135-N136 ou N145-P146 (ver por exemplo, Exemplo 17).
Como exemplo não limitativo adicional, sítios de alça específicos expostos a solvente testados ou usados para inserção das regiões de hibridização 3’ e 5’ em Nanoluciferase incluem Y17-N18, G26-G27, S29-S30, G36-G37, E50-N51, L66-S67, K79-V80, D86-H87, D101-G102, R113-P114, G123-K124, G135-N136, N145-P146 e N157-G148 (ver, por exemplo, Exemplo 18). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ estão localizadas na sequência de codificação da proteína repórter e não afetam substancialmente a função do gene repórter, ou em regiões estruturadas que permitem a detecção via interação proteína- proteína ou proteína-molécula pequena.
[0061] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos uma porção da região de hibridização 3’
está no promotor, no sítio de ligação ao ribossomo ou na sequência de codificação. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos uma porção da região de hibridização 5’ está no promotor, no sítio de ligação ao ribossomo ou na sequência de codificação. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização 3’ não está dentro ou é coextensiva com o promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização 3’ é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no primeiro ácido nucleico ou domínio. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização 5’ não está dentro ou é coextensiva com o promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização 5’ é 5’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no segundo ácido nucleico.
[0062] Em várias modalidades mencionadas acima, o primeiro e o segundo ácidos nucleicos ou domínios de ssDNA são fragmentos de DNA separados e o segundo ácido nucleico ou domínio de ssDNA inclui um fosfato 5’. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o segundo ácido nucleico ou domínio de ssDNA inclui ainda uma sequência de nucleotídeos ou um ligante em sua extremidade 3’ incluindo o primer de ssDNA em uma alça em forma de grampo de cabelo terminal (ver, por exemplo, Figura 2B (ii) ou Figura 2B (iii)). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a extremidade 5’ do primeiro ácido nucleico ou domínio inclui ainda uma sequência ou ligante que forma uma alça em forma de grampo de cabelo terminal (ver, por exemplo, Figura 2B (iii)). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a extremidade 5’ do primeiro ácido nucleico ou domínio está ligada à extremidade 3’ do segundo ácido nucleico ou domínio por meio de sequências intervenientes de ssDNA de modo que o primeiro e o segundo domínios estejam presentes em uma única sequência de ssDNA (ver, por exemplo, Figura 2B (i)).
[0063] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização completa (por exemplo, ambas as regiões de hibridização 3’ e 5’) possui pelo menos 12 a 60 nucleotídeos. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização completa possui pelo menos 12 a 40 nucleotídeos. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização completa possui pelo menos 12 a 36 nucleotídeos. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização completa possui pelo menos 12 nucleotídeos. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização 3’ (por exemplo, a porção a montante da região de hibridização) e a região de hibridização 5’ (por exemplo, a porção a jusante da região de hibridização) possuem, cada uma, pelo menos 6 a 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ possuem, cada uma, pelo menos 6 a 18 nucleotídeos. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ possuem, cada uma, pelo menos 18 nucleotídeos. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ possuem, cada uma, pelo menos 6 nucleotídeos.
[0064] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ são complementares a uma porção do ácido nucleico alvo, de modo que a hibridização do ácido nucleico alvo para as regiões de hibridização 3’ e 5’ cria uma junção, entre o primeiro e o segundo ácidos nucleicos ou domínios, suficiente para que ocorra a ligação produtiva. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, as regiões de hibridização e a porção alvo complementar do ácido nucleico alvo são complementares de 80% a 85%, de 85% a 90%, de 90% a 95%, de 95% a 99%, ou de 99% ou mais de identidade percentual, em que a identidade percentual é estabelecida selecionando-se uma janela de comparação entre duas sequências de n nucleotídeos e o grau de pares de bases complementares dentro da comparação é dividido por n nucleotídeos na janela de comparação, ou qualquer outra técnica para determinar prontamente a identidade percentual conhecida por um versado na técnica. Uma junção dos ácidos nucleicos ou domínios pode se referir a um ponto em que as duas moléculas ou domínios estão em contato físico, ou posicionados de modo que as duas moléculas ou domínios sejam capazes de serem ligadas entre si na junção.
[0065] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o sistema sensor de ácido nucleico inclui um primer complementar a uma região 3’ do segundo ácido nucleico. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primer é complementar a uma sequência que é 3’ da sequência de codificação no segundo ácido nucleico ou domínio. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primer é complementar a uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no segundo ácido nucleico ou domínio. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primer é ssDNA. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primer se liga ao segundo ácido nucleico ou domínio e permite a polimerização do DNA da fita molde que é complementar à fita não molde. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primer é SEQ ID NO: 19.
[0066] As proteínas repórter são aquelas que fornecem um sinal detectável e/ou compreendem a capacidade de gerar um sinal detectável (por exemplo, catalisando a reação, convertendo um composto em um produto detectável ou ligando-se a outra molécula que permite a detecção). Os sinais detectáveis podem compreender, por exemplo, fluorescência ou luminescência. Sinais detectáveis, métodos para detectá-los e métodos para incorporá-los em reagentes (por exemplo, polipeptídeos compreendendo uma proteína repórter) são bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os sinais detectáveis podem incluir sinais que podem ser detectados por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, eletromagnéticos, radioquímicos ou químicos, tais como fluorescência, quimiofluorescência ou quimioluminescência, ou qualquer outro meio apropriado. Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos, a proteína repórter é selecionada a partir do grupo que consiste em luciferase, nanoluciferase, beta-lactamase, beta- galactosidase, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, catalase, anidrase carbônica, proteína verde fluorescente,
proteína vermelha fluorescente, proteína ciano fluorescente, proteína amarela fluorescente, tripsina, protease, um peptídeo que complementa e ativa uma proteína repórter truncada, uma quinase.
[0067] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os sistemas incluem um ou mais dentre uma ligase, uma RNA polimerase, uma DNA polimerase de deslocamento de fita, dNTPs, inibidor de RNAse e um sistema de expressão livre de células. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os sistemas também podem incluir uma transcriptase reversa com um domínio RNaseH funcional. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os sistemas podem incluir atividades separadas de transcriptase reversa e RNaseH. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o sistema de expressão livre de células é o extrato de células inteiras.
[0068] Conforme descrito no presente documento, o sistema de ácido nucleico pode compreender: (a) um primer de DNA de fita simples (ssDNA) complementar a: (i) uma região 3’ do cassete de expressão; (ii) uma região 3’ do segundo ácido nucleico ou domínio; (iii) uma sequência que é 3’ da sequência de codificação no segundo ácido nucleico ou domínio; ou (iv) uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no cassete de expressão; (b) uma ligase; e/ou (c) um sistema de expressão livre de células.
[0069] Conforme descrito no presente documento, o sistema de ácido nucleico pode compreender: (a) um primer de DNA de fita simples (ssDNA) complementar a: (i) uma região 3’ do cassete de expressão; (ii) uma região 3’ do segundo ácido nucleico ou domínio; (iii) uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no segundo ácido nucleico ou domínio; ou (iv) uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no cassete de expressão; (b) uma ligase; e/ou (c) um sistema de expressão livre de células.
[0070] Conforme usado no presente documento, uma "polimerase" se refere a uma enzima que catalisa a síntese de ácidos nucleicos longos. Tal como aqui utilizado, uma "polimerase de deslocamento de fita" se refere a uma polimerase que tem a capacidade de deslocar ou desalojar DNA ou RNA a jusante (por exemplo, o DNA ou RNA alvo hibridizado com o sistema sensor de ácido nucleico) encontrado durante a síntese. As DNA polimerases exibem vários graus de atividade de deslocamento de fita. As DNA polimerases com baixa atividade de deslocamento de fita são frequentemente incapazes de sintetizar DNA além de um DNA ou RNA a jusante, resultando potencialmente em polimerização incompleta do DNA. As DNA polimerases com alta atividade de deslocamento de fita são frequentemente capazes de sintetizar DNA além de um DNA ou RNA a jusante, resultando na polimerização completa do DNA. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a DNA polimerase de deslocamento de fita é selecionada a partir do grupo que consiste em um fragmento Klenow com porção exonuclease, um fragmento Klenow sem porção exonuclease, uma polimerase phi29, uma DNA polimerase T7 modificada, uma polimerase de Psychrobacillus, uma polimerase de Psychrobacillus com deslocamento de fita melhorado e uma polimerase de B. subtilis (ver, por exemplo, Exemplo 13, Exemplo 16).
[0071] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a junção (por exemplo, a região de hibridização 3’ ou 5’) é configurada para hibridizar contra um polimorfismo do ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a extremidade livre da junção ou a região de hibridização 3’ ou 5’ é configurada para hibridizar com um polimorfismo do ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o polimorfismo está localizado em uma ou ambas as bases na junção da região de hibridização, em um ou ambos o domínio do sensor de ssDNA a montante ou a jusante. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um ou mais polimorfismos podem ser opcionalmente introduzidos na região de hibridização. Como um exemplo não limitativo, quatro variantes exemplificativas diferentes (polimorfismos) foram testadas (ver por exemplo, Exemplo 15).
[0072] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primeiro e o segundo ácidos nucleicos podem ser moléculas ou sequências separadas. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o primeiro e o segundo ácidos nucleicos, quando ligados entre si, após serem ligados entre si, ou após serem ligados entre si por uma ligase, são referidos como o primeiro e o segundo domínios. O primeiro e o segundo ácidos nucleicos podem ser moléculas ou sequências separadas, enquanto o primeiro e o segundo domínios podem estar localizados na mesma molécula ou sequência após hibridização e ligação do primeiro e segundo ácidos nucleicos.
[0073] Em algumas modalidades, um ou mais componentes dos sistemas sensores de ácido nucleico aqui descritos podem ser conjugados a um substrato sólido. O substrato sólido pode ser selecionado a partir de um grupo que consiste em: uma esfera, uma microesfera magnética, uma microesfera paramagnética, uma membrana microporosa, uma fibra oca, qualquer membrana de filtração de fluido, um dispositivo de fluxo, uma placa de microtitulação, um tubo de ensaio, uma placa de cultura de células, uma placa de microarray, esferas de vidro, esferas de látex, uma célula viva, uma matriz extracelular de um tecido ou órgão biológico, e um fagócito. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o substrato sólido pode ser anexado ou conjugado ao primeiro ácido nucleico, ao segundo ácido nucleico, ao primeiro domínio, ao segundo domínio, ao primer e/ou ao ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o substrato sólido é anexado ou conjugado ao primeiro ácido nucleico e/ou ao segundo ácido nucleico.
[0074] Conforme usado no presente documento, "componentes do sistema sensor de ácido nucleico" refere-se à primeira parte, a segunda parte ou o primeiro ácido nucleico, ao segundo ácido nucleico ou ao primeiro domínio, ao segundo domínio ou domínio A, domínio B, ou primeira sequência, segunda sequência e/ou ao primer e/ou ao ácido nucleico alvo. Sem limitações, os tipos exemplificativos de substratos que podem ser empregados incluem, mas não estão limitados, a: uma estrutura de ácido nucleico, uma molécula biológica (por exemplo, uma célula viva) ou uma superfície sólida. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a superfície sólida pode ser funcionalizada com uma molécula de acoplamento, por exemplo, um grupo amino, para facilitar a conjugação de componentes do sistema sensor de ácido nucleico à superfície sólida.
[0075] A fixação de componentes do sistema sensor de ácido nucleico a uma superfície do substrato pode ser realizada com múltiplas abordagens, por exemplo, por reticulação direta dos componentes do sistema sensor de ácido nucleico à superfície do substrato; reticulação dos componentes do sistema sensor de ácido nucleico à superfície do substrato por meio de uma matriz de ácido nucleico (por exemplo, matriz de DNA ou estruturas de origami de DNA / oligonucleotídeo); reticulação dos componentes do sistema sensor de ácido nucleico à superfície do substrato por meio de uma estrutura tipo dendrímero (por exemplo, estrutura Quitina / PEG); atração de microesferas magnéticas revestidas com componentes do sistema sensor de ácido nucleico para a superfície do substrato com um gradiente de campo magnético focado aplicado à superfície do substrato, anexação de componentes do sistema sensor de ácido nucleico a um substrato via interação biotina-avidina ou interação semelhante a biotina-avidina, ou quaisquer outros métodos reconhecidos na arte.
[0076] Os componentes do sistema sensor de ácido nucleico podem ser adaptados para orientar a região de hibridização para longe do substrato.
Um componente do sistema sensor de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ácido nucleico ou sequência polipeptídica que se liga a uma sequência alvo ou parceira de ligação no substrato sólido.
Alternativamente, ou adicionalmente, a superfície de um substrato pode ser funcionalizada para incluir moléculas de acoplamento aqui descritas.
Tal como aqui utilizado, o termo "molécula de acoplamento" refere-se a qualquer molécula ou qualquer grupo funcional que seja capaz de se ligar seletivamente a um componente do sistema sensor de ácido nucleico aqui descrito.
Exemplos representativos de moléculas de acoplamento incluem, mas não estão limitados a, anticorpos, antígenos, lectinas,
proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos (DNA, RNA, PNA e ácidos nucleicos que são misturas dos mesmos ou que incluem derivados ou análogos de nucleotídeos); moléculas receptoras, tais como o receptor de insulina; ligantes para receptores (por exemplo, insulina para o receptor de insulina); e moléculas biológicas, químicas ou outras que tenham afinidade para outra molécula, tais como biotina e avidina.
As moléculas de acoplamento não precisam compreender uma molécula de ocorrência natural inteira, mas podem consistir em apenas uma porção, fragmento ou subunidade de uma molécula de ocorrência natural ou não natural, tais como por exemplo o fragmento Fab de um anticorpo. A molécula de acoplamento pode ainda compreender um marcador detectável. A molécula de acoplamento também pode abranger vários grupos funcionais que podem acoplar o substrato aos componentes do sistema sensor de ácido nucleico. Exemplos de tais grupos funcionais incluem, mas não estão limitados a: um grupo amino, um grupo de ácido carboxílico, um grupo epóxi e um grupo tosil.
[0077] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os componentes do sistema sensor de ácido nucleico podem ser conjugados a uma superfície de substrato por meio de uma interação covalente ou não covalente. O componente do sistema sensor de ácido nucleico e/ou a molécula de acoplamento podem ser conjugados à superfície de um substrato sólido de forma covalente ou não covalente usando qualquer um dos métodos conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, a imobilização covalente pode ser realizada através de, por exemplo, acoplamento de silano. Veja, por exemplo, Weetall, 15 Adv. Mol. Cell Bio. 161 (2008); Weetall, 44 Meths. Enzymol. 134 (1976). A interação covalente entre os componentes do sistema sensor de ácido nucleico e/ou molécula de acoplamento e a superfície também pode ser mediada por outras reações químicas reconhecidas na técnica, tais como reação NHS ou um agente de conjugação. A interação não covalente entre o componente do sistema sensor de ácido nucleico e/ou molécula de acoplamento e a superfície pode ser formada com base em interações iônicas, interações de Van der Waals, interações dipolo-dipolo, ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas e/ou interações de reconhecimento de forma.
[0078] Sem limitações, a conjugação pode incluir uma ligação estável ou lábil (por exemplo, clivável) ou um agente de conjugação. Conjugações exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a: ligação covalente, ligação amida, adições a ligações múltiplas carbono-carbono, cicloadição azida- alquino de Huisgen, reação de Diels-Alder, ligação dissulfeto, ligação éster, adições de Michael, ligação silano, uretano, reações de abertura de anel nucleofílico: epóxidos, química não-aldólica de carbonila, reações de cicloadição: cicloadição 1,3-dipolar, ligação sensível à temperatura, ligação sensível à radiação (IV, quase IV, UV) ou agente de conjugação, ligação sensível ao pH ou agente de conjugação, ligações não covalentes (por exemplo, formação de complexo de carga iônica, ligações de hidrogênio, interações pi-pi, ciclodextrina / interação hóspede hospedeiro inflexível) e semelhantes.
[0079] Tal como aqui utilizado, o termo "agente de conjugação" significa uma porção orgânica que liga duas partes de um composto.
Ligantes tipicamente compreendem uma ligação direta ou um átomo, tal como oxigênio ou enxofre,
uma unidade, tal como NR1, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH ou uma cadeia de átomos, tal como alquil substituído ou não substituído, alquenil substituído ou não substituído,
alquinil substituído ou não substituído, arilalquil,
arilalcenil, arilalcinil, heteroarilalquil,
heteroarilalcenil, heteroarilalcinil, heterociclilalquil,
heterociclilalcenil, heterociclilalcinil, aril, heteroaril,
heterociclil, cicloalquil, cicloalcenil, alquilarilalcenil,
alquilarilalquinil, alquenilarilalquil,
alquenilarilalcenil, alquenilarilalquinil,
alquinilarilalquil, alcinilarilalcenil,
alcinilarilalquinil, alquil-heteroarilalquil, alquil-
heteroarilalcenil, alquil-heteroarilalquinil,
alquenilheteroarilalquil, alquenilheteroarilalquenil,
alquenilheteroarilalquinil, alquinilheteroarilalquil,
alquinilheteroarilalquenil, alquinilheteroarilalquinil,
alquil-heterociclilalquil, alquil-heterociclilalcenil,
alquilhererociclilalquinil, alquenil-heterociclilalquil,
alquenil-heterociclilalcenil, alquenil-
heterociclilalquinil, alquinil-heterociclilalquil,
alquinil-heterociclilalcenil, alquinil- heterociclilalquinil, alquilaril, alquenilaril, alquinilaril, alquil-heteroaril, alquenilheteroaril, alquinilhereroaril, onde um ou mais grupos metileno pode(m) ser interrompido(s) ou terminado(s) por O, S, S(O), SO2, NH, C(O)N(R1)2, C(O), grupo de ligação clivável, aril substituído ou não substituído, heteroaril substituído ou não substituído, heterocíclico substituído ou não substituído; onde R1 é hidrogênio, acil, alifático ou alifático substituído.
[0080] Sem limitações, qualquer química de conjugação conhecida na técnica para conjugar duas moléculas ou diferentes partes de uma composição pode ser usada para ligar pelo menos um componente do sistema sensor de ácido nucleico a um substrato. Moléculas de acoplamento exemplificativas e/ou grupos funcionais para conjugar pelo menos um componente do sistema sensor de ácido nucleico a um substrato incluem, mas não estão limitados a, um polietilenoglicol (PEG, NH2-PEGX-COOH que pode ter um PEG com braço espaçador de vários comprimentos X, onde 1 < X < 100, por exemplo, PEG-2K, PEG-5K, PEG-10K, PEG-12K, PEG-15K, PEG-20K, PEG-40K e semelhantes), agente de conjugação de maleimida, PASilação, HESilação, agente de conjugação de suberato de bis(sulfosuccinimidil), agente de conjugação de
DNA, agente de conjugação de peptídeo, agente de conjugação de silano, agente de conjugação de polissacarídeo, agente de conjugação hidrolisável e quaisquer combinações dos mesmos.
[0081] Em modalidades alternativas, os componentes do sistema sensor de ácido nucleico podem ser conjugados na superfície do substrato sólido por um par de moléculas de acoplamento. Os termos "par de moléculas de acoplamento" e "par de acoplamentos", conforme usados de forma intercambiável no presente documento, referem-se à primeira e à segunda moléculas que se ligam especificamente uma à outra. Um membro do par de ligação é conjugado com o substrato sólido enquanto o segundo membro é conjugado com o componente do sistema sensor de ácido nucleico. Tal como aqui utilizado, a frase "primeira e segunda moléculas que se ligam especificamente uma à outra" refere-se à ligação do primeiro membro do par de acoplamento ao segundo membro do par de acoplamento com maior afinidade e especificidade do que a outras moléculas.
[0082] Pares de moléculas de acoplamento exemplificativas incluem, sem limitações, qualquer composto haptênico ou antigênico em combinação com um anticorpo correspondente ou porção de ligação ou fragmento do mesmo (por exemplo, digoxigenina e anti-digoxigenina; imunoglobulina de camundongo e imunoglobulina de cabra anti-
camundongo) e pares de ligação não imunológica (por exemplo, biotina-avidina, biotina-estreptavidina), hormônio (por exemplo, tiroxina e proteína de ligação do hormônio cortisol), agonista receptor-receptor, antagonista receptor- receptor (por exemplo, receptor de acetilcolina-acetilcolina ou um análogo do mesmo), IgG-proteína A, lectina- carboidrato, cofator de enzima-enzima, inibidor de enzima- enzima e pares de oligonucleotídeos complementares capazes de formar duplexes de ácido nucleico). O par de moléculas de acoplamento também pode incluir uma primeira molécula que está carregada negativamente e uma segunda molécula que está carregada positivamente.
[0083] Um exemplo do uso de conjugação de par de acoplamento é a conjugação biotina-avidina ou biotina- estreptavidina. Nesta abordagem, um dos membros do par de acoplamento (por exemplo, uma porção do componente do sistema sensor de ácido nucleico, tal como a extremidade 5’, ou um substrato) é biotinilado e o outro (por exemplo, um substrato ou o componente do sistema sensor de ácido nucleico) é conjugado com avidina ou estreptavidina. Muitos kits comerciais também estão disponíveis para moléculas de biotinilação, tais como ácidos nucleicos ou proteínas. Por exemplo, uma aminooxi-biotina (AOB) pode ser usada para anexar covalentemente a biotina a uma molécula com um grupo aldeído ou cetona. Em uma modalidade, a AOB está ligada ao domínio de ligação ao substrato (por exemplo, compreendendo o oligopeptídeo AKT) dos componentes do sistema sensor de ácido nucleico.
[0084] Um exemplo não limitativo do uso de conjugação com um par de moléculas de acoplamento é o método sanduíche de biotina. Ver, por exemplo, Davis et al., 103 PNAS 8155 (2006). As duas moléculas a serem conjugadas são biotiniladas e então conjugadas usando estreptavidina tetravalente. Além disso, um peptídeo pode ser acoplado à sequência de 15 aminoácidos de um peptídeo aceitador para biotinilação (referido como AP; Chen et al., 2 Nat. Methods 99 (2005)).
A sequência do peptídeo aceitador permite a biotinilação específica do local pela enzima biotina ligase de E. coli (BirA; Id.). Um componente do sistema sensor de ácido nucleico pode ser biotinilado de forma semelhante para conjugação com um substrato sólido. Muitos kits comerciais também estão disponíveis para ácidos nucléicos ou proteínas de biotinilação. Outro exemplo de conjugação a uma superfície sólida seria usar bioconjugação mediada por PLP. Ver, por exemplo, Witus et al., 132 JACS 16812 (2010). Conforme descrito anteriormente, uma sequência AKT conjugada à extremidade 5’ de um componente do sistema sensor de ácido nucleico pode permitir que o domínio de ligação do substrato seja biotinilado em um único sítio e ainda ser conjugado à superfície sólida revestida com estreptavidina.
[0085] Adicionalmente, outro exemplo da utilização de conjugação de par de acoplamento é a conjugação de ácido nucleico de fita dupla. Nesta abordagem, um dos membros do par de acoplamento (por exemplo, um componente do sistema sensor de ácido nucleico) pode ser conjugado com uma primeira fita do ácido nucleico de fita dupla, e o outro (por exemplo, um substrato ou componente do sistema sensor de ácido nucleico) é conjugado com a segunda fita do ácido nucleico de fita dupla. Os ácidos nucleicos podem incluir, sem limitação, os segmentos de sequência definida e sequências compreendendo nucleotídeos, ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos, nucleotídeos análogos, nucleotídeos modificados e os nucleotídeos que compreendem modificações do esqueleto, pontos na cadeia e nucleotídeos não-resíduos, grupos ou pontes.
[0086] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o ligante pode compreender pelo menos um grupo de ligação clivável. Um grupo de ligação clivável é aquele que é suficientemente estável sob um conjunto de condições, mas que é clivado sob um conjunto diferente de condições, para liberar as duas partes que o ligante mantém juntas.
[0087] Os grupos de ligação cliváveis são suscetíveis a agentes de clivagem, por exemplo, hidrólise, pH, potencial redox ou a presença de moléculas degradativas.
Exemplos de tais agentes degradantes incluem: agentes redox que são selecionados para substratos particulares ou que não têm especificidade de substrato, incluindo, por exemplo, enzimas oxidativas ou redutoras ou agentes redutores, tais como mercaptanos presentes nas células, que podem degradar um grupo de ligação clivável redox por redução; esterases; amidases; endossomos ou agentes que podem criar um ambiente ácido, por exemplo, aqueles que resultam em um pH igual a 5 ou inferior; enzimas que podem hidrolisar ou degradar um grupo de ligação clivável por ácido agindo como um ácido geral, peptidases (que podem ser específicas do substrato) e proteases e fosfatases. Um ligante pode incluir um grupo de ligação clivável, o qual é clivável por uma enzima particular. O tipo de grupo de ligação clivável incorporado em um ligante pode depender da célula, órgão ou tecido a ser direcionado.
[0088] Grupos de ligação cliváveis exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, ligantes hidrolisáveis, grupos de ligação cliváveis redox (por exemplo, -SS- e - C(R)2-SS-, em que R é H ou alquil C1-C6 e em que pelo menos um R é alquil C1-C6, tal como CH3 ou CH2CH3); grupos de ligação cliváveis baseados em fosfato (por exemplo, -
OP(O)(OR)-O-, -OP(S)(OR)-O-, -OP(S)(SR)-O-, -SP(O)(OR)-O-,
-OP(O)(OR)-S-, -SP(O)(OR)-S-, -OP(S)(ORk)-S-, -SP(S)(OR)-O-
, -OP(O)(R)-O-, -OP(S)(R)-O-, -SP(O)(R)-O-, -SP(S)(R)-O-, - SP(O)(R)-S-, -OP(S)(R)-S-, -OP(O)(OH)-O-, -OP(S)(OH)-O-, - OP(S)(SH)-O-, -SP(O)(OH)-O-, -OP(O)(OH)-S-, -SP(O)(OH)-S-, -OP(S)(OH)-S-, -SP(S)(OH)-O-, -OP(O)(H)-O-, -OP(S)(H)-O-, -
SP(O)(H)-O-, -SP(S)(H)-O-, -SP(O)(H)-S-, e -OP(S)(H)-S-, em que R é alquil C1-C10 linear ou ramificado opcionalmente substituído); grupos de ligação cliváveis por ácido (por exemplo, hidrazonas, ésteres e ésteres de aminoácidos, -
C=NN- e -OC(O)-); grupos de ligação cliváveis baseados em éster (por exemplo, -C(O)O-); grupos de ligação cliváveis baseados em peptídeos (por exemplo, grupos de ligação que são clivados por enzimas, tais como peptidases e proteases em células, por exemplo, -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, onde RA e RB são os grupos R dos dois aminoácidos adjacentes). Um grupo de ligação clivável baseado em peptídeo compreende dois ou mais aminoácidos.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a ligação de clivagem baseada em peptídeo compreende a sequência de aminoácidos que é substrato para uma peptidase ou uma protease.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um grupo de ligação clivável com ácido é clivável em um ambiente ácido com um pH de cerca de
6,5 ou inferior (por exemplo, cerca de 6,5, 6,0, 5,5, 5,0 ou inferior), ou por agentes como enzimas que pode atuar como um ácido geral.
[0089] Os agentes de ativação podem ser usados para ativar os componentes a serem conjugados entre si (por exemplo, a superfície de um substrato). Sem limitações, qualquer processo e/ou reagente conhecido na técnica para ativação de conjugação pode ser usado. O método ou reagentes de ativação de superfície exemplificativos incluem, mas não estão limitados, a cloridrato de 1-etil-3-[3- dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC ou EDAC), hidroxibenzotriazol (HOBT), N-Hidroxissuccinimida (NHS), hexafluorofosfato de 2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3- tetrametil urônio metanamínio (HATU), silanização, ativação de superfície através de tratamento de plasma e semelhantes.
[0090] Novamente, sem limitações, qualquer grupo reativo conhecido na técnica pode ser usado para o acoplamento. Por exemplo, vários grupos reativos de superfície podem ser usados para o acoplamento de superfície, incluindo, mas não se limitando a, haleto de alquila, aldeído, amino, bromo ou iodoacetil, carboxil, hidroxil, epóxi, éster, silano, tiol e semelhantes.
[0091] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os sistemas e/ou condições aqui descritos podem ser fornecidos com um controle positivo. Conforme aqui usado,
um controle positivo é uma reação que é conhecida por produzir resultados ou gerar um produto reacional. Como exemplo, um controle positivo pode ser o Alvo 1 ou T1 (SEQ ID NO: 20) e um sistema de ácido nucleico conhecido por hibridar com T1. Os sistemas de ácido nucleico conhecidos por hibridizar com T1 incluem, mas não estão limitados, a v1_A_T1 (SEQ ID NO: 1) e v1_B_T1 (SEQ ID NO: 2); v1_CSs_T1 (SEQ ID NO: 6); v2_A_T1 (SEQ ID NO: 9) e v2_B_T1 (SEQ ID NO: 10); v3_A_T1 (SEQ ID NO: 13) e v3_B_T1 (SEQ ID NO: 14). Como exemplo adicional, um controle positivo pode ser o Alvo 2 ou T2 (SEQ ID NO: 21) e um sistema de ácido nucleico conhecido por hibridizar com T2. Os sistemas de ácido nucleico que se hibridizam com T2 incluem, mas não estão limitados a v1_A_T2 (SEQ ID NO: 3) e v1_B_T2 (SEQ ID NO: 5); v1_A2_T2 (SEQ ID NO: 4) e v1_B_T2 (SEQ ID NO: 5); v1_CSt_T2 (SEQ ID NO: 7); v1_CSs_T2 (SEQ ID NO: 8); v2_A_T2 (SEQ ID NO: 11) e v2_B_T2 (SEQ ID NO: 12); v3_A_T2 (SEQ ID NO: 15) e v3_B_T2 (SEQ ID NO: 16). Como exemplo adicional, um controle positivo pode ser o Alvo 3 ou T3 (SEQ ID NO: 22) e um sistema de ácido nucleico conhecido por hibridizar com T3. Os sistemas de ácido nucleico conhecidos por hibridizar com T3 incluem, mas não estão limitados a v3_A_T3 (SEQ ID NO: 17) e v3_B_T3 (SEQ ID NO: 18).
[0092] Em alguma modalidade de qualquer um dos aspectos, um sistema ou composição aqui descrito pode ser fornecido em um kit. Em várias modalidades, o kit inclui instruções de uso. O kit é um conjunto de materiais ou componentes, incluindo pelo menos um dos sistemas sensores de ácido nucleico aqui descrito. A natureza exata dos componentes configurados no kit inventivo depende de sua finalidade. Em uma modalidade, o kit é configurado particularmente para indivíduos humanos. Em outras modalidades, o kit é configurado para aplicações veterinárias, tratando indivíduos tais como, mas não se limitando a, animais de fazenda, animais domésticos e animais de laboratório. Em algumas modalidades, o kit é configurado para aplicações agrícolas, tratando, por exemplo, doenças de plantações ou detecção de características. Em algumas modalidades, o kit é configurado para aplicações industriais. Em algumas modalidades, o kit é configurado para aplicações de consumidor final, por exemplo, teste caseiro.
[0093] As instruções de uso podem ser incluídas no kit. "Instruções de uso" normalmente incluem uma expressão tangível que descreve a técnica a ser empregada no uso dos componentes do kit para atingir um resultado desejado em um indivíduo. Ainda de acordo com a presente invenção, "instruções de uso" podem incluir uma expressão tangível que descreve a preparação de sistemas sensores de ácido nucleico e/ou pelo menos um parâmetro de método, tais como as quantidades relativas de sistemas sensores de ácido nucleico, requisitos de dosagem e instruções de administração e semelhantes, tipicamente para uma finalidade pretendida. Opcionalmente, o kit também contém outros componentes úteis, tais como ferramentas de medição, diluentes, tampões, dispositivos de coleta de amostra (por exemplo, cotonetes), instruções de uso e/ou outra parafernália útil que será prontamente reconhecida pelos versados na técnica.
[0094] Os materiais ou componentes montados no kit podem ser fornecidos ao profissional, armazenados de quaisquer formas convenientes e adequadas que preservem sua operabilidade e utilidade. Por exemplo, os componentes podem estar na forma dissolvida, desidratada ou liofilizada; eles podem ser fornecidos em temperatura ambiente, refrigerada ou congelada. Os componentes estão normalmente contidos em materiais de embalagem adequada. Conforme empregado no presente documento, a frase "material de embalagem" se refere a uma ou mais estruturas físicas usadas para abrigar o conteúdo do kit, tais como composições inventivas e semelhantes. O material de embalagem é construído por métodos bem conhecidos, de preferência, para fornecer um ambiente estéril e livre de contaminantes. A embalagem também pode, de preferência, proporcionar um ambiente que proteja contra luz, umidade e oxigênio. Tal como aqui utilizado, o termo "embalagem" refere-se a uma matriz sólida ou material adequado, tal como vidro, plástico, papel, cartolina, poliéster (tal como tereftalato de polietileno ou Mylar) e semelhantes, capaz de conter os componentes individuais do kit em um formato adequado para uso. Assim, uma embalagem pode, por exemplo, ser um frasco de vidro, frasco de plástico ou tira de fluxo lateral usada para conter quantidades adequadas de uma composição contendo um volume de um sistema sensor de ácido nucleico aqui descrito. O material de embalagem geralmente possui uma etiqueta externa que indica o conteúdo e/ou a finalidade do kit e/ou seus componentes.
[0095] É aqui descrito um método para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra, incluindo: (a) proporcionar os sistemas sensores de ácido nucleico mencionados acima, em que a região de hibridização a montante (por exemplo, região de hibridização 3’) e a região de hibridização a jusante (por exemplo, região de hibridização 5’) são complementares a uma porção do ácido nucleico alvo, de modo que a hibridização do ácido nucleico alvo com as regiões de hibridização a montante e a jusante cria uma junção, entre o primeiro e o segundo ácidos nucleicos ou domínios suficiente, para que a ligação produtiva ocorra para assim ligar operativamente todos os componentes;
(b) contatar o sistema sensor de ácido nucleico com a amostra na presença de ligase sob condições apropriadas para hibridização do ácido nucleico alvo com a região de hibridização a montante (por exemplo, região de hibridização
3’) e região de hibridização a jusante (por exemplo, região de hibridização 5’) e ligação da região de hibridização a montante (por exemplo, região de hibridização 3’) e região de hibridização a jusante (por exemplo, região de hibridização 5’), para assim produzir um produto reacional;
(c) contatar o produto reacional produzido na etapa (b)
com um sistema de expressão livre de células, incluindo uma
DNA polimerase de deslocamento de fita, dNTPs e outros materiais de bloco de construção necessários para a produção de proteínas e um primer de ssDNA sob condições apropriadas para polimerização, transcrição e tradução de DNA para assim produzir um produto reacional, em que o produto reacional é um polipeptídeo ou enzima;
(d) medir direta ou indiretamente a presença do polipeptídeo ou produto da reação enzimática da etapa (c) em comparação com aquele de um controle apropriado, em que a presença significativa do produto reacional indica a presença do ácido nucleico alvo na amostra.
[0096] É aqui descrito um método para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra, incluindo:
(a) proporcionar os sistemas sensores de ácido nucleico mencionados acima, em que a região de hibridização a montante
(por exemplo, região de hibridização 3’) e a região de hibridização a jusante (por exemplo, região de hibridização
5’) são complementares a uma porção do ácido nucleico alvo,
de modo que a hibridização do ácido nucleico alvo com as regiões de hibridização a montante e a jusante cria uma junção, entre o primeiro e o segundo ácidos nucleicos ou domínios, suficiente para que a ligação produtiva ocorra para assim ligar operativamente todos os componentes;
(b) contatar o sistema sensor de ácido nucleico com a amostra na presença de ligase sob condições apropriadas para hibridização do ácido nucleico alvo com a região de hibridização a montante (por exemplo, região de hibridização
3’) e região de hibridização a jusante (por exemplo, região de hibridização 5’) e ligação da região de hibridização a montante (por exemplo, região de hibridização 3’) e região de hibridização a jusante (por exemplo, região de hibridização 5’), para assim produzir um produto reacional;
(c) contatar o produto reacional produzido na etapa (b)
com um sistema de expressão livre de células, incluindo uma
DNA polimerase de deslocamento de fita, dNTPs e outros materiais de bloco de construção necessários para a produção de proteínas e um primer de ssDNA sob condições apropriadas para polimerização, transcrição e tradução de DNA para, dessa forma, produzir um produto reacional de ssDNA operacionalmente ligado; (d) mensurar a proteína repórter presente no produto reacional da etapa (c) em comparação com a proteína de um controle apropriado, em que a presença significativa de proteína repórter indica a presença do ácido nucleico alvo na amostra.
[0097] Conforme usado no presente documento, "controle apropriado" pode se referir a uma amostra de referência que pode ser um controle positivo ou negativo.
Conforme descrito no presente documento, um controle positivo é uma reação que produz resultados. Um controle negativo é uma reação conhecida por não produzir resultados ou detecção de nível de “fundo” na ausência de uma sequência alvo. Por exemplo, um controle negativo pode incluir uma reação sem um ácido nucleico alvo, com um ácido nucleico não alvo ou faltando um ou mais componentes do sistema sensor de ácido nucleico.
[0098] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os componentes do sistema sensor de ácido nucleico estão, cada um, presentes em cerca de 2 nM a cerca de 500 nM.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os componentes do sistema sensor de ácido nucleico estão, cada um, presentes em cerca de 16 nM.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os componentes do sistema sensor de ácido nucleico estão, cada um, presentes em cerca de 2 nM, cerca de 4 nM, cerca de 6 nM, cerca de 8 nM, cerca de 10 nM, cerca de 12 nM, cerca de 14 nM, cerca de 16 nM, cerca de
18 nM, cerca de 20 nM, cerca de 22 nM, cerca de 24 nM, cerca de 26 nM, cerca de 28 nM, cerca de 30 nM, cerca de 32 nM,
cerca de 34 nM, cerca de 36 nM, cerca de 38 nM, cerca de 40 nM, cerca de 42 nM, cerca de 44 nM, cerca de 46 nM, cerca de
48 nM ou cerca de 50 nM.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os componentes do sistema sensor de ácido nucleico estão, cada um, presentes em cerca de 60 nM, cerca de 70 nM, cerca de 80 nM, cerca de 90 nM, cerca de 100 nM,
cerca de 110 nM, cerca de 120 nM, cerca de 130 nM, cerca de
140 nM, cerca de 150 nM, cerca de 160 nM, cerca de 170 nM,
cerca de 180 nM, cerca de 190 nM, cerca de 200 nM, cerca de
210 nM, cerca de 220 nM, cerca de 230 nM, cerca de 240 nM,
cerca de 250 nM, cerca de 260 nM, cerca de 270 nM, cerca de
280 nM, cerca de 290 nM, cerca de 300 nM, cerca de 310 nM,
cerca de 320 nM, cerca de 330 nM, cerca de 340 nM, cerca de
350 nM, cerca de 360 nM, cerca de 370 nM, cerca de 380 nM,
cerca de 390 nM, cerca de 390 nM, cerca de 400 nM, cerca de
410 nM, cerca de 420 nM, cerca de 430 nM, cerca de 440 nM, cerca de 450 nM, cerca de 460 nM, cerca de 470 nM, cerca de 480 nM, cerca de 490 nM ou cerca de 500 nM.
[0099] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os componentes do sistema sensor de ácido nucleico estão, cada um, presentes de 2 nM a 500 nM. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os componentes do sistema sensor de ácido nucleico estão, cada um, presentes a 16 nM. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os componentes do sistema sensor de ácido nucleico estão, cada um, presentes a 2 nM, a 4 nM, a 6 nM, a 8 nM, a 10 nM, a 12 nM, a 14 nM, a 16 nM, a 18 nM, a 20 nM, a 22 nM, a 24 nM, 26 nM, a 28 nM, a 30 nM, a 32 nM, a 34 nM, a 36 nM, a 38 nM, a 40 nM, a 42 nM, a 44 nM, 46 nM, a 48 nM ou a 50 nM. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os componentes do sistema sensor de ácido nucleico estão, cada um, presentes a 60 nM, a 70 nM, a 80 nM, a 90 nM, a 100 nM, a 110 nM, a 120 nM, a 130 nM, a 140 nM, a 150 nM, a 160 nM, a 170 nM, a 180 nM, a 190 nM, a 200 nM, a 210 nM, a 220 nM, a 230 nM, a 240 nM, a 250 nM, a 260 nM, a 270 nM, a 280 nM, a 290 nM, a 300 nM, a 310 nM, a 320 nM, a 330 nM, a 340 nM, a 350 nM, a 360 nM, a 370 nM, a 380 nM, a 390 nM, a 400 nM, a 410 nM, a 420 nM, a 430 nM, a 440 nM, a 450 nM, a 460 nM, a 470 nM, a 480 nM, a 490 nM ou a 500 nM.
[00100] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a ligase está presente de cerca de 10 nM a 1000 nM.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a ligase está presente em cerca de 100 nM.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a ligase está presente em cerca de 10 nM, cerca de 20 nM, cerca de 30 nM,
cerca de 40 nM, cerca de 50 nM, cerca de 60 nM, cerca de 70 nM, cerca de 80 nM, cerca de 90 nM, cerca de 100 nM, cerca de 110 nM, cerca de 120 nM, cerca de 130 nM, cerca de 140 nM, cerca de 150 nM, cerca de 160 nM, cerca de 170 nM, cerca de 180 nM, cerca de 190 nM, cerca de 200 nM, cerca de 210 nM, cerca de 220 nM, cerca de 230 nM, cerca de 240 nM, cerca de 250 nM, cerca de 260 nM, cerca de 270 nM, cerca de 280 nM, cerca de 290 nM, cerca de 300 nM, cerca de 310 nM, cerca de 320 nM, cerca de 330 nM, cerca de 340 nM, cerca de 350 nM, cerca de 360 nM, cerca de 370 nM, cerca de 380 nM, cerca de 390 nM, cerca de 400 nM, cerca de 410 nM, cerca de 420 nM, cerca de 430 nM, cerca de 440 nM, cerca de 450 nM, cerca de 460 nM, cerca de 470 nM, cerca de 480 nM, cerca de 490 nM, cerca de 500 nM, cerca de 510 nM, cerca de 520 nM, cerca de 530 nM, cerca de 540 nM, cerca de 550 nM, cerca de 560 nM, cerca de 570 nM, cerca de 580 nM, cerca de 590 nM, cerca de 600 nM, cerca de 610 nM, cerca de 620 nM, cerca de 630 nM, cerca de 640 nM, cerca de 650 nM, cerca de 660 nM, cerca de 670 nM, cerca de 680 nM, cerca de 690 nM, cerca de 700 nM, cerca de 710 nM, cerca de 720 nM, cerca de 730 nM, cerca de 740 nM, cerca de 750 nM, cerca de 760 nM, cerca de 770 nM, cerca de 780 nM, cerca de 790 nM, cerca de 800 nM, cerca de 810 nM, cerca de 820 nM, cerca de 830 nM, cerca de 840 nM, cerca de 850 nM, cerca de 860 nM, cerca de 870 nM, cerca de 880 nM, cerca de 890 nM, cerca de 900 nM, cerca de 910 nM, cerca de 920 nM, cerca de 930 nM, cerca de 940 nM, cerca de 950 nM, cerca de 960 nM, cerca de 970 nM, cerca de 980 nM, em cerca de 990 nM, ou cerca de 1000 nM.
[00101] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a ligase está presente de 10 nM a 1000 nM. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a ligase está presente a 100 nM. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a ligase está presente a 10 nM, a 20 nM, a 30 nM, a 40 nM, a 50 nM, a 60 nM, a 70 nM, a 80 nM, a 90 nM, a 100 nM, a 110 nM, a 120 nM, a 130 nM, a 140 nM, a 150 nM, a 160 nM, a 170 nM, a 180 nM, a 190 nM, a 200 nM, a 210 nM, a 220 nM, a 230 nM, a 240 nM, a 250 nM, a 260 nM, a 270 nM, a 280 nM, a 290 nM, a 300 nM, a 310 nM, a 320 nM, a 330 nM, a 340 nM, a 350 nM, a 360 nM, a 370 nM, a 380 nM, a 390 nM, a 400 nM, a 410 nM, a 420 nM, a 430 nM, a 440 nM, a 450 nM, a 460 nM, a 470 nM, a 480 nM, a 490 nM, a 500 nM, a 510 nM, a 520 nM, a 530 nM, a 540 nM, a 550 nM, a 560 nM, a 570 nM,
a 580 nM, a 590 nM, a 600 nM, a 610 nM, a 620 nM, a 630 nM, a 640 nM, a 650 nM, a 660 nM, a 670 nM, a 680 nM, a 690 nM, a 700 nM, a 710 nM, a 720 nM, a 730 nM, a 740 nM, a 750 nM, a 760 nM, a 770 nM, a 780 nM, a 790 nM, a 800 nM, a 810 nM, a 820 nM, a 830 nM, a 840 nM, a 850 nM, a 860 nM, a 870 nM, a 880 nM, a 890 nM, a 900 nM, a 910 nM, a 920 nM, a 930 nM, a 940 nM, a 950 nM, a 960 nM, a 970 nM, a 980 nM, a 990 nM ou a 1.000 nM.
[00102] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a etapa (b) que compreende o contato do sistema sensor de ácido nucleico com a amostra na presença de ligase pode compreender a incubação ou manutenção por um período de 1 minuto a 60 minutos. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a reação de ligação da etapa (b) é incubada ou mantida por cerca de 1 minuto, por cerca de 2 minutos, por cerca de 3 minutos, por cerca de 4 minutos, por cerca de 5 minutos, por cerca de 6 minutos, por cerca de 7 minutos, por cerca de 8 minutos, por cerca de 9 minutos, por cerca de 10 minutos, por cerca de 11 minutos, por cerca de 12 minutos, por cerca de 13 minutos, por cerca de 14 minutos, por cerca de 15 minutos, por cerca de 16 minutos, por cerca de 17 minutos, por cerca de 18 minutos, por cerca de 19 minutos, por cerca de 20 minutos, por cerca de 21 minutos, por cerca de 22 minutos, por cerca de 23 minutos, por cerca de 24 minutos, por cerca de 25 minutos, por cerca de 26 minutos, por cerca de 27 minutos, por cerca de 28 minutos, por cerca de 29 minutos, por cerca de 30 minutos, por cerca de 31 minutos, por cerca de 32 minutos, por cerca de 33 minutos, por cerca de 34 minutos, por cerca de 35 minutos, por cerca de 36 minutos, por cerca de 37 minutos, por cerca de 38 minutos, por cerca de 39 minutos, por cerca de 40 minutos, por cerca de 41 minutos, por um cerca de 42 minutos, por cerca de 43 minutos, por cerca de 44 minutos, por cerca de 45 minutos, por cerca de 46 minutos, por cerca de 47 minutos, por cerca de 48 minutos, por cerca de 49 minutos, por cerca de 50 minutos, por cerca de 51 minutos, por cerca de 52 minutos, cerca de 53 minutos, cerca de 54 minutos, cerca de 55 minutos, cerca de 56 minutos, cerca de 57 minutos, cerca de 58 minutos, cerca de 59 minutos ou cerca de 60 minutos.
Opcionalmente, a reação da etapa b) pode ser incubada próximo à temperatura ambiente (por exemplo, de 24°C a 26°C).
[00103] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a etapa (b) que compreende o contato do sistema sensor de ácido nucleico com a amostra na presença de ligase pode compreender a incubação ou manutenção por um período de 1 minuto a 60 minutos. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a reação de ligação da etapa (b) é incubada ou mantida por 1 minuto, por 2 minutos, por 3 minutos, por 4 minutos, por 5 minutos, por 6 minutos, por 7 minutos, por 8 minutos, por 9 minutos, por 10 minutos, por 11 minutos, por 12 minutos, por 13 minutos, por 14 minutos, por 15 minutos, por 16 minutos, por 17 minutos, por 18 minutos, por 19 minutos, por 20 minutos, por 21 minutos, por 22 minutos, por 23 minutos, por 24 minutos, por 25 minutos, por 26 minutos, por 27 minutos, por 28 minutos, por 29 minutos, por 30 minutos, por 31 minutos, por 32 minutos, por 33 minutos, por 34 minutos, por 35 minutos, por 36 minutos, por 37 minutos, por 38 minutos, por 39 minutos, por 40 minutos, por 41 minutos, por 42 minutos, por 43 minutos, por 44 minutos, por 45 minutos, por 46 minutos, por 47 minutos, por 48 minutos, por 49 minutos, por 50 minutos, por 51 minutos, por 52 minutos, por 53 minutos, por 54 minutos, por 55 minutos, por 56 minutos, por 57 minutos, por 58 minutos, por 59 minutos ou por 60 minutos. Opcionalmente, a reação da etapa b) pode ser incubada à temperatura ambiente (por exemplo, de 24°C a 26°C).
[00104] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a etapa (c) compreendendo o contato do produto reacional produzido na etapa (b) com um sistema de expressão livre de células pode compreender a incubação ou manutenção por um período de tempo de 15 minutos a 12 horas. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a reação da etapa
(c) é incubada por cerca de 15 minutos, por cerca de 30 minutos, por cerca de 45 minutos, por cerca de 60 minutos.
Em algumas modalidades, a reação da etapa (c) é incubada por cerca de 1,0 hora, por cerca de 1,5 horas, por cerca de 2,0 horas, por cerca de 2,5 horas, por cerca de 3,0 horas, por cerca de 3,5 horas, por cerca de 4,0 horas, por cerca de 4,5 horas, por cerca de 5,0 horas, por cerca de 5,5 horas, por cerca de 6,0 horas, por cerca de 6,5 horas, por cerca de 7,0 horas, por cerca de 7,5 horas, por cerca de 8,0 horas, por cerca de 8,5 horas, por cerca de 9,0 horas, por cerca de 9,5 horas, por cerca de 10,0 horas, por cerca de 10,5 horas, por cerca de 11,0 horas, por cerca de 11,5 horas, ou por cerca de 12,0 horas. Opcionalmente, a reação da etapa (c) pode ser incubada próximo à temperatura ambiente (por exemplo, de 24°C a 26°C). Por exemplo, a etapa b) pode ser incubada por um período de 5 minutos a 15 minutos à temperatura ambiente (por exemplo, de 24°C a 26°C) e/ou a etapa (c) pode ser incubada por um período de 60 minutos a 3 horas, à temperatura ambiente (por exemplo, de 24°C a 26°C).
[00105] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a etapa (c) compreendendo o contato do produto reacional produzido na etapa (b) com um sistema de expressão livre de células pode compreender a incubação ou manutenção por um período de tempo de 15 minutos a 12 horas. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a reação da etapa (c) é incubada por 15 minutos, por 30 minutos, por 45 minutos, por 60 minutos. Em algumas modalidades, a reação da etapa (c) é incubada por 1,0 hora, por 1,5 horas, por 2,0 horas, por 2,5 horas, por 3,0 horas, por 3,5 horas, por 4,0 horas, por 4,5 horas, por 5,0 horas, por 5,5 horas, por 6,0 horas, por 6,5 horas, por 7,0 horas, por 7,5 horas, por 8,0 horas, por 8,5 horas, por 9,0 horas, por 9,5 horas, por 10,0 horas, por 10,5 horas, por 11,0 horas, por 11,5 horas, ou por 12 horas. Opcionalmente, a reação da etapa (c) pode ser incubada à temperatura ambiente (por exemplo, de 24°C a 26°C). Por exemplo, a etapa (b) pode ser incubada por um período de 5 minutos a 15 minutos à temperatura ambiente (por exemplo, de 24°C a 26°C) e/ou a etapa (c) pode ser incubada por um período de tempo de 60 minutos a 3 horas, à temperatura ambiente (por exemplo, de 24°C a 26°C).
[00106] Os versados na técnica apreciarão que, em algumas modalidades, etapas particulares podem ser realizadas em série; em algumas modalidades, etapas particulares podem ser realizadas em paralelo ou simultaneamente (por exemplo, em uma reação de "one-pot").
Por exemplo, em algumas modalidades, as etapas (b) e (c) podem ser realizadas em série; em algumas modalidades, essas etapas podem ser realizadas em paralelo ou simultaneamente
(por exemplo, em tal reação "one-pot"). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o sistema de expressão livre de células compreende ainda um inibidor de
RNAse.
O inibidor de RNase pode inibir pelo menos um dentre
RNAse A, RNAse H, RNAse III, RNAse L, RNAse P, RNAse PhyM,
RNAse T1, RNAse T2, RNAse U2 ou RNAse V.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, sistema de expressão livres de células compreende ainda de 0,5 nM a 5 M de primer de ssDNA complementar à extremidade 3’ do segundo ácido nucleico ou domínio.
Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos, o sistema de expressão livre de células compreende ainda cerca de 1,25 M de primer de ssDNA complementar à extremidade 3’ do segundo ácido nucleico ou domínio.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o sistema de expressão livre de células compreende cerca de 0,5 nM,
cerca de 1 nM, cerca de 5 nM, cerca de 10 nM, cerca de 20 nM, cerca de 30 nM, cerca de 40 nM, cerca de 50 nM, cerca de
60 nM, cerca de 70 nM, cerca de 80 nM, cerca de 90 nM, cerca de 100 nM, cerca de 110 nM, cerca de 125 nM, cerca de 250 nM, cerca de 375 nM, cerca de 500 nM, cerca de 625 nM, cerca de 750 nM, cerca de 875 nM, cerca de 1,000 M, cerca de 1,125
M, cerca de 1,250 M, cerca de 1,375 M, cerca de 1,500 M,
cerca de 1,625 M, cerca de 1,750 M, cerca de 1,875 M,
cerca de 2,000 M, cerca de 2,125 M, cerca de 2,250 M, cerca de 2,375 M, cerca de 2,500 M, cerca de 2,625 M, cerca de 2,750 M, cerca de 2,875 M, cerca de 3,000 M, cerca de 3,125 M, cerca de 3,250 M, cerca de 3,375 M, cerca de 3,500 M, cerca de 3,625 M, cerca de 3,750 M, cerca de 3,875 M, cerca de 4,000 M, cerca de 4,125 M, cerca de 4,250 M, cerca de 4,375 M, cerca de 4,500 M, cerca de 4,625 M, cerca de 4,750 M, cerca de 4,875 M, ou cerca de 5,000 M do primer de ssDNA complementar à extremidade 3’ do segundo ácido nucleico ou domínio.
[00107] Os versados na técnica apreciarão que várias configurações de sistemas de expressão livres de células podem ser úteis. Por exemplo, em algumas modalidades, um sistema de expressão livre de células pode incluir cerca de 1,25 M de primer de ssDNA complementar a uma sequência dentro do cassete de expressão não molde ou sequências intervenientes de ssDNA. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o sistema de expressão livre de células compreende cerca de 0,5 nM, cerca de 1 nM, cerca de 5 nM, cerca de 10 nM, cerca de 20 nM, cerca de 30 nM, cerca de 40 nM, cerca de 50 nM, cerca de 60 nM, cerca de 70 nM, cerca de 80 nM, cerca de 90 nM, cerca de 100 nM, cerca de 110 nM,
cerca de 125 nM, cerca de 250 nM, cerca de 375 nM, cerca de 500 nM, cerca de 625 nM, cerca de 750 nM, cerca de 875 nM, cerca de 1,000 M, cerca de 1,125 M, cerca de 1,250 M, cerca de 1,375 M, cerca de 1,500 M, cerca de 1,625 M, cerca de 1,750 M, cerca de 1,875 M, cerca de 2,000 M, cerca de 2,125 M, cerca de 2,250 M, cerca de 2,375 M, cerca de 2,500 M, cerca de 2,625 M, cerca de 2,750 M, cerca de 2,875 M, cerca de 3,000 M, cerca de 3,125 M, cerca de 3,250 M, cerca de 3,375 M, cerca de 3,500 M, cerca de 3,625 M, cerca de 3,750 M, cerca de 3,875 M, cerca de 4,000 M, cerca de 4,125 M, cerca de 4,250 M, cerca de 4,375 M, cerca de 4,500 M, cerca de 4,625 M, cerca de 4,750 M, cerca de 4,875 M, ou cerca de 5,000 M do primer de ssDNA complementar a uma sequência dentro do cassete de expressão não molde ou sequências intervenientes de ssDNA (por exemplo, Figura 2B(i)).
[00108] Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos, a concentração de dNTP é de cerca de 200 M a 500 M. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a concentração de dNTPS é de cerca de 230 M  Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a concentração de dNTPs é de cerca de 200 M, cerca de 210 M, cerca de 220
M, cerca de 230 M, cerca de 240 M, cerca de 250 M, cerca de 260 M, cerca de 270 M, cerca de 280 M, cerca de 290 M, cerca de 300 M, cerca de 310 M, cerca de 320 M, cerca de 330 M, cerca de 340 M, cerca de 350 M, cerca de 360 M, cerca de 370 M, cerca de 380 M, cerca de 390 M, cerca de 400 M, cerca de 410 M, cerca de 420 M, cerca de 430 M, cerca de 440 M, cerca de 450 M, cerca de 460 M, cerca de 470 M, cerca de 480 M, cerca de 490 H, ou cerca de 500 M.
[00109] Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos, a concentração de dNTP está entre 200 M e 500 M.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a concentração de dNTPS é de 230 M Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a concentração de dNTPs é de 200 M, de 210 M, de 220 M, de 230 M, de 240 M, de 250 M, de 260 M, de 270 M, de 280 M, de 290 M, de 300 M, de 310 M, de 320 M, de 330 M, de 340 M, de 350 M, de 360 M, de 370 M, de 380 M, de 390 M, de 400 M, de 410 M, de 420 M, de 430 M, de 440 M, de 450 M, de 460 M, de 470 M, de 480 M, de 490 H, ou de 500 M.
[00110] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a DNA polimerase é selecionada a partir do grupo que consiste em um fragmento Klenow com porção exonuclease, um fragmento Klenow sem porção exonuclease, uma phi29 polimerase, uma DNA polimerase T7 modificada, uma polimerase de Psychrobacillus, uma polimerase de Psychrobacillus com deslocamento de fita aprimorado e uma polimerase de B.
subtilis. Em várias modalidades, os vários componentes acima mencionados estão em uma mistura combinada adequada para realizar o método acima mencionado. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a proteína repórter é luciferase e o substrato da proteína repórter é um substrato de luciferase e a medição é feita por detecção de luminescência no sistema de expressão livre de células.
[00111] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o método inclui ainda a hibridização do primer de ssDNA com o transcrito de RNA, transcrição reversa usando uma transcriptase reversa e clivagem endolítica. Por exemplo, a amplificação do cassete de expressão formado por ligação mediada por ácido nucleico alvo e extensão do primer pode melhorar ainda mais a sensibilidade do sistema de detecção. A transcrição do produto de dsDNA para RNA pode ser seguida por hibridização do primer de DNA, por exemplo, o mesmo primer que emparelha com a extremidade 3’ do cassete de expressão ou um primer de DNA diferente, com a extremidade 3’ complementar do transcrito de RNA. Uma transcriptase reversa pode estender o primer de DNA para criar uma molécula híbrida de RNA/DNA.
A atividade da RNaseH endonuclease pode clivar hidroliticamente o RNA do híbrido de DNA/RNA para criar uma molécula de ssDNA complementar a montante, ou parte do sensor A ou domínio A, ou outro primer de DNA (ver, por exemplo, Figura 2A). Tal como aqui utilizado, "uma parte do sensor" é usada indistintamente com a primeira parte do sensor, primeiro ácido nucleico, domínio A, primeira sequência ou primeiro domínio e refere-se à porção da sequência de hibridização de ácido nucleico que compreende uma região de hibridização 3’. Tal como aqui utilizado,
"parte do sensor B" é usada indistintamente com a segunda parte do sensor, segundo ácido nucleico, domínio B, sequência
B ou segundo domínio e refere-se à porção da sequência de hibridização de ácido nucleico que compreende uma região de hibridização 5’. A hibridização da parte do sensor A com a molécula de ssDNA permite a extensão por meio da DNA polimerase para criar um cassete de expressão completa.
A transcrição do cassete de expressão para RNA permite rodadas subsequentes de amplificação do cassete de expressão.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os sistemas podem incluir uma enzima contendo atividade de transcriptase reversa e uma endonuclease não específica que catalisa a clivagem hidrolítica de RNA em uma molécula híbrida de
RNA/DNA. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a transcriptase reversa pode ser HIV-1, RTx, Luna® (New England Biolabs), transcriptases reversas do vírus da leucemia murina Moloney recombinante com atividade de RNAse H reduzida ou totalmente removida (RNAse H-). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a endonuclease pode ser RNaseH. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, as atividades podem ser catalisadas por uma única enzima, tal como a transcriptase reversa do vírus da mieloblastose aviária (AMV), a transcriptase reversa do vírus da leucemia murina Moloney ou variantes do mesmo.
[00112] Tal como aqui utilizado, "cassete de expressão de DNA" refere-se a um DNA de fita simples (ssDNA) que compreende o primeiro e o segundo ácidos nucleicos ou domínios A e B, que, quando ligados entre si, codificam um polipeptídeo.
[00113] Tal como aqui utilizado, um "alvo" ou "ácido nucleico alvo" ou "sequência alvo" ou "sequência de ácido nucleico alvo" refere-se a um RNA ou ssDNA que pode hibridizar com a região de hibridização 3’ do primeiro ácido nucleico ou domínio A e a região de hibridização 5’ do segundo ácido nucleico ou domínio B.
[00114] Também é descrito no presente documento um método para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra, incluindo:
(a) proporcionar os sistemas sensores de ácido nucleico acima mencionados, em que as regiões de hibridização a montante e a jusante são complementares a uma porção do ácido nucleico alvo, de tal forma que a hibridização do ácido nucleico alvo com as regiões de hibridização a montante e a jusante cria uma junção, entre o primeiro e o segundo domínios, suficiente para que a ligação produtiva ocorra;
(b) contatar o sistema sensor de ácido nucleico com a amostra na presença de ligase sob condições apropriadas para hibridização do ácido nucleico alvo com as regiões de hibridização a montante e a jusante e ligação da região de hibridização a montante e a jusante, para assim produzir um produto reacional de ssDNA operacionalmente ligado;
(c) contatar o produto reacional produzido na etapa (b)
com um sistema de expressão livre de células, incluindo uma
DNA polimerase de deslocamento de fita, dNTPs e outros componentes do bloco de construção necessários para a produção de proteínas e um primer de ssDNA sob condições apropriadas para a polimerização, transcrição e tradução de
DNA para assim produzir uma proteína repórter;
(d) observação da atividade do produto de proteína repórter da etapa c) para indicar a presença do ácido nucleico alvo na amostra.
[00115] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o sistema sensor aqui descrito e os métodos de utilização do mesmo podem ser usados para a detecção de um ácido nucleico alvo que difere de outro ácido nucleico na amostra por uma única base, permitindo a discriminação de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a localização do SNP dentro da região de hibridização é posicionada em uma das duas bases da junção de ligação, no domínio de ssDNA a montante ou a jusante. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, uma ou mais bases incompatíveis podem ser adicionalmente introduzidas na região de hibridização. A desestabilização das regiões de hibridização devido à presença do SNP impediria a capacidade da ligase de se ligar com sucesso os domínios a montante e a jusante, resultando em uma saída de sinal diferencial. Em várias modalidades, a junção é configurada para hibridizar contra um polimorfismo do ácido nucleico alvo. Como um exemplo, quatro variantes exemplificativas diferentes (polimorfismos) foram testadas (ver, por exemplo, Exemplo 15).
[00116] Em várias modalidades, o domínio ssDNA A incluiria, na direção 5’ para 3’: (i) um promotor; (ii) um sítio de ligação ao ribossomo (RBS); (iii) o códon de iniciação de uma sequência de codificação da proteína repórter; e (iv) uma região de hibridização complementar a uma região do ácido nucleico alvo. O domínio ssDNA B incluiria, na direção de 5’ para 3’: (i) uma região de hibridização complementar a uma região do ácido nucleico alvo; e (ii) a sequência de codificação restante de uma proteína repórter. Um terceiro componente de ácido nucleico seria um ’primer’ de ssDNA que hibridiza com a extremidade 3’ do domínio B (ver por exemplo, Figura 2A). Os esquemas de componentes sensores alternativos incluem: (i) domínios A e B, em que a extremidade 5’ do domínio A está ligada à extremidade 3’ do domínio B com sequências intervenientes de ssDNA; (ii) incorporação do primer de ssDNA como um grampo de cabelo terminal do domínio B; ou (iii) incluindo grampos de cabelo em ambas as extremidades 5’ do domínio A e 3’ do domínio B (ver, por exemplo, Figura 2B). Estes esquemas alternativos podem oferecer vantagens, reduzindo o número de componentes e/ ou o número de extremidades de ssDNA expostas suscetíveis a exonucleases de DNA.
[00117] As moléculas do sistema sensor são incubadas com uma amostra contendo um ácido nucleico alvo e um sistema de expressão livre de células contendo componentes necessários e materiais de bloco de construção para a transcrição e tradução. Os sensores reivindicados podem ser usados para detecção in vitro de qualquer RNA ou ssDNA (por exemplo, vírus ssDNA ou ssDNA gerado por desnaturação de dsDNA genômico), variantes de nucleotídeo único ou SNPs.
Isso permite a detecção de uma variedade de microrganismos e ácidos nucleicos indicativos de infecção ou outros fatores associados à saúde humana, animal e vegetal.
[00118] Alvos de RNA incluem RNA mensageiro, microRNA, RNA genômico viral e RNA ribossômico. Um alvo particularmente útil para a detecção bacteriana é o RNA ribossômico (por exemplo, rRNA 16S ou 23S), pois pode estar presente em muitas cópias por célula bacteriana individual e pode ser usado para distinguir gênero / espécie bacteriana.
Organismos infecciosos bacterianos alvo incluem, mas estão limitados a espécies de Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Campylobacter, Chlamydia, Clostridium, Enterococcus, Escherichia, Helicobacter, Listeria, Mycobacterium, Salmonella, Vibrio, Yersinia. Uma descrição de uma variedade de regiões alvo de RNA ribossômico 16S para o diagnóstico de bactérias patogênicas é ainda descrita em, por exemplo, J. Microbiol Methods 2007 69(2):330-339, que é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade. Os vírus RNA podem ser detectados, por exemplo, projetando sensores para regiões de genomas de RNA viral.
Vírus RNA exemplificativos incluem, mas não estão limitados a vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus influenza,
vírus zika, vírus ebola, rotavírus, vírus da poliomielite, vírus da dengue, vírus da febre amarela, vírus da hepatite C, vírus do sarampo e vírus da raiva.
[00119] Todas as referências citadas no presente documento são incorporadas por referência em sua totalidade como se estivessem totalmente estabelecidas. A menos que definido de outra forma, os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado como comumente entendido por um versado na técnica à qual a presente invenção pertence. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 3ª ed., J. Wiley & Sons (Nova Iorque, NY 2006), e Sambrook e Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4ª, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012), fornecem a um especialista na técnica um guia geral para muitos dos termos usados no presente pedido.
[00120] Tal como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico" ou "sequência de ácido nucleico" refere-se a qualquer molécula, de preferência uma molécula polimérica, incluindo unidades de ácido ribonucleico, ácido desoxirribonucleico ou um análogo. O ácido nucleico pode ser de fita simples ou dupla. Um ácido nucleico de fita simples pode ser ácido nucleico de fita única de um DNA de fita dupla desnaturado. Alternativamente, pode ser um ácido nucleico de fita simples não derivado de nenhum DNA de fita dupla. Em um aspecto, o ácido nucleico alvo é o DNA. Em outro aspecto, o alvo é o RNA. Moléculas de ácido nucleico adequadas são DNA, incluindo DNA genômico ou cDNA. Outras moléculas de ácido nucleico adequadas são RNA, incluindo mRNA e RNA ribossômico.
[00121] Tal como aqui utilizado, o termo "DNA" é definido como ácido desoxirribonucleico. O termo "polinucleotídeo" é usado aqui indistintamente com "ácido nucleico" para indicar um polímero de nucleosídeos.
Normalmente, um polinucleotídeo é composto de nucleosídeos que são encontrados naturalmente no DNA ou RNA (por exemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina e desoxicitidina) unidos por ligações fosfodiéster. No entanto, o termo abrange moléculas que compreendem nucleosídeos ou análogos de nucleosídeos contendo bases quimicamente ou biologicamente modificadas, estruturas modificadas, etc., quer sejam encontradas ou não em ácidos nucleicos de ocorrência natural, e tais moléculas podem ser preferidas para certas aplicações. "Sequência polinucleotídica", tal como aqui utilizado, pode referir-se ao próprio material polinucleotídico e/ou à informação da sequência (isto é, a sucessão de letras usadas como abreviaturas para bases) que caracteriza bioquimicamente um ácido nucleico específico. Uma sequência polinucleotídica é aqui apresentada na direção 5’ para 3’, a menos que indicado de outra forma.
[00122] Tal como aqui utilizado, o termo "DNA de fita simples (ssDNA)" refere-se ao DNA que consiste apenas em uma cadeia de nucleotídeos, em oposição as duas fitas de DNA que formam a hélice de DNA. Quando o presente pedido se refere a um polinucleotídeo, deverá ser entendido que tanto DNA, RNA e, em cada caso, ambas as formas de fita simples e dupla (e complementos de cada molécula de fita simples) são fornecidas.
[00123] Tal como aqui utilizado, "promotor" refere- se a uma molécula de polinucleotídeo que, em seu estado nativo (isto é, como está naturalmente no genoma de um organismo), está localizada a montante de 5’ para um códon de iniciação de tradução de uma estrutura de leitura aberta (ou região de codificação de proteína). Em algumas modalidades, o termo "promotor" pode ser usado aqui para se referir a uma molécula de polinucleotídeo modificada, especificamente projetada para ter as propriedades desejadas (por exemplo, eficiência de transcrição melhorada). Um promotor pode compreender a sequência 5’ e/ou 3’ do sítio de início da transcrição. Um promotor está envolvido no reconhecimento e ligação de RNA polimerase II, ou outras RNA polimerases, tal como RNA polimerase T7, e outras proteínas (fatores de transcrição de ação trans) para iniciar a transcrição. Um promotor tipicamente pode ter de cerca de 20 bp a cerca de 1.000 bp de comprimento, por exemplo, cerca de 20 bp de comprimento, cerca de 30 bp de comprimento, cerca de 40 bp de comprimento, cerca de 50 bp de comprimento, cerca de 60 bp de comprimento, cerca de 70 bp de comprimento, cerca de 80 bp de comprimento, cerca de 90 bp de comprimento, cerca de 100 bp de comprimento, cerca de 150 bp de comprimento, cerca de 200 bp de comprimento, cerca de 250 bp de comprimento, cerca de 300 bp de comprimento, cerca de 350 bp de comprimento, cerca de 400 bp de comprimento, cerca de 450 bp de comprimento, cerca de 500 bp de comprimento, cerca de 550 bp de comprimento, cerca de 600 bp de comprimento, cerca de 650 bp de comprimento, cerca de 700 bp de comprimento, cerca de 750 bp de comprimento, cerca de 800 bp de comprimento, cerca de 850 bp de comprimento, cerca de 900 bp de comprimento, cerca de 950 bp de comprimento ou cerca de
1.000 bp de comprimento. A sequência e/ou localização de um determinado promotor pode ser prevista usando programas de computador conhecidos na técnica, por exemplo, ElDorado; Gene2Promoter; GEMS Launcher; PromoterInspector; Promoter2.0; McPromoter; EP3; ProSOM; e TRED.
[00124] Tal como aqui utilizado, o termo
"complementar" refere-se à hierarquia de preferências de formação de par de bases ligadas por hidrogênio entre as bases de nucleotídeos G, A, T, C e U, de modo que quando dois polinucleotídeos ou sequências de polinucleotídeos anelam com cada outro, pares A pareia T e G pareia com C no DNA, e G pareia com C e A pareia com U no RNA. Tal como aqui utilizado, "substancialmente complementar" refere-se a uma molécula de ácido nucleico ou parte dela (por exemplo, um primer) que possui pelo menos 90% de complementaridade ao longo de todo o comprimento da molécula ou parte dela com uma segunda sequência de nucleotídeos, por exemplo, 90% complementar, 95% complementar, 98% complementar, 99% complementar ou 100% complementar. Tal como aqui utilizado, "substancialmente idêntico" refere-se a uma molécula de ácido nucleico ou porção desta que possui pelo menos 90% de identidade ao longo de todo o comprimento de uma molécula ou porção desta com uma segunda sequência de nucleotídeos, por exemplo, 90% de identidade, 95% de identidade, 98% identidade, 99% de identidade ou 100% de identidade.
[00125] Conforme usado no presente documento, "hibridizar" se refere a duas fitas de ácido nucleico engajadas no emparelhamento de bases físicas, de preferência na medida em que as fitas permanecem emparelhadas de tal forma que uma polimerase dependente do molde pode conduzir a polimerização no duplex. Um versado na técnica, usando a informação de sequência das sequências de ácido nucleico alvo, pode projetar regiões de hibridização ou sequências para os sensores descritos no presente documento, os quais são complementares (por exemplo, totalmente complementares) a um único alvo e não a outras sequências de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra. As condições de hibridização podem ser rotineiramente otimizadas para minimizar o sinal de “fundo”.
[00126] Tal como aqui utilizado, o termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma primeira molécula de polinucleotídeo, tal como um promotor ou códon de iniciação, conectado a uma segunda molécula de polinucleotídeo transcritível, tal como um gene que codifica para uma proteína repórter, onde as moléculas de polinucleotídeo estão dispostas de modo que a primeira molécula de polinucleotídeo afete a função da segunda molécula de polinucleotídeo. As duas moléculas polinucleotídicas podem ou não fazer parte de uma única molécula polinucleotídica contígua e podem ou não ser adjacentes. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a um gene de interesse se o promotor regula ou medeia a transcrição do gene de interesse em uma célula.
[00127] Conforme usado no presente documento, o termo
"sítio de ligação ao ribossomo (RBS)" refere-se a uma sequência de nucleotídeos posicionada a montante (por exemplo, em direção à extremidade 5’) do códon de iniciação para a transcrição de mRNA que funciona para recrutar ribossomos durante o início da tradução da proteína. O recrutamento de ribossomos em eucariotas é geralmente mediado pelo cap 5’ presente em mRNAs eucarióticos.
[00128] Conforme usado no presente documento, o termo "alça em forma de grampo de cabelo terminal" refere-se a uma estrutura que se forma quando duas regiões da mesma fita, geralmente complementares na sequência de nucleotídeos quando lidas em direções opostas, desenvolvem um par de bases para formar uma dupla hélice que termina em uma alça desemparelhada.
[00129] Conforme usado no presente documento, uma "porção" de uma molécula de ácido nucleico se refere a um conjunto contíguo de nucleotídeos compreendidos por essa molécula. Uma porção pode compreender todos ou apenas um subconjunto dos nucleotídeos compreendidos pela molécula.
Uma porção pode ser de fita dupla ou fita simples.
[00130] Conforme usado no presente documento, o termo "compreendendo" ou "compreende" é usado em referência a composições, métodos e respectivos componentes, que são essenciais para o método ou composição, mas abertos à inclusão de elementos não especificados, sejam estes essenciais ou não.
[00131] O termo "consistindo" refere-se a composições, métodos e respectivos componentes, conforme descrito no presente documento, que são exclusivos de qualquer elemento não recitado nessa descrição da modalidade.
[00132] Os termos singulares "um/uma", e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra "ou" pretende incluir "e", a menos que o contexto indique claramente o contrário. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos no presente documento possam ser usados na prática ou no teste desta divulgação, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. A expressão, "por exemplo" é usada aqui para indicar um exemplo não limitativo.
[00133] As definições de termos comuns em biologia celular e biologia molecular podem ser encontradas em The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19ª edição, publicado pela Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0- 632-02182-9). As definições de termos comuns em biologia molecular também podem ser encontradas em Genes X, Benjamin Lewin, publicado por Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN- 10: 0763766321); Kendrew et al. (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) e Current Protocols in Protein Sciences, 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al.
[00134] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os métodos descritos no presente documento se referem à medição, detecção ou determinação do nível de pelo menos um marcador. Conforme usado no presente documento, o termo "detecção" ou "medição" refere-se a observar um sinal de, por exemplo, uma sonda, marcador ou molécula alvo para indicar a presença de um analito em uma amostra. Qualquer método conhecido na técnica para detectar uma biomolécula diretamente e/ou detectar uma porção de marcador particular pode ser usado para detecção. Métodos de detecção exemplificativos incluem, mas não estão limitados a: métodos espectroscópicos, fluorescentes, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, ópticos ou químicos. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a medição pode ser uma observação quantitativa.
[00135] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um polipeptídeo, ácido nucleico ou célula,
conforme descrito no presente documento, pode ser projetado.
Conforme usado no presente documento, "projetado" refere-se ao aspecto de ter sido manipulado pela mão do homem. Por exemplo, um polipeptídeo é considerado "projetado" quando pelo menos um aspecto do polipeptídeo, por exemplo, sua sequência, foi manipulada pela mão do homem para diferir em relação ao aspecto como ele existe na natureza. Como é prática comum, e é entendido pelos versados na técnica, a descendência de uma célula de engenharia são tipicamente ainda referidos como “projetado", mesmo que a manipulação real fosse realizada em uma entidade anterior.
[00136] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os componentes do sistema sensor de ácido nucleico aqui descritos são exógenos. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os componentes do sistema sensor de ácido nucleico aqui descrito são ectópicos. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os componentes do sistema sensor de ácido nucleico aqui descrito não são endógenos.
[00137] O termo "exógeno" refere-se a uma substância presente em uma célula diferente de sua fonte nativa. O termo "exógeno", quando usado no presente documento, pode se referir a um ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo) ou um polipeptídeo que foi introduzido por um processo envolvendo manipulação humana em um sistema biológico, tal como uma célula, sistema livre de células, ou organismo no qual não é normalmente encontrado e se deseja introduzir o ácido nucleico ou polipeptídeo em tal célula ou organismo. Alternativamente, "exógeno" pode se referir a um ácido nucleico ou um polipeptídeo que foi introduzido por um processo envolvendo manipulação humana em um sistema biológico, tal como uma célula, um sistema livre de células ou organismo no qual é encontrado em quantidades baixas e deseja-se aumentar a quantidade de ácido nucleico ou polipeptídeo na célula, um sistema livre de células ou organismo, por exemplo, para criar expressão ou níveis ectópicos. Em contraste, o termo "endógeno" refere-se a uma substância que é nativa do sistema biológico, um sistema livre de células ou uma célula. Conforme usado no presente documento, "ectópico" se refere a uma substância que é encontrada em um local e/ou quantidade incomum. Uma substância ectópica pode ser aquela normalmente encontrada em uma determinada célula ou sistema livre de células, mas em uma quantidade muito menor e/ou em um momento diferente.
Ectópico também inclui uma substância, tal como um polipeptídeo ou ácido nucleico que não é expresso ou encontrado naturalmente em uma determinada célula em seu ambiente natural.
[00138] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo conforme descrito no presente documento (por exemplo, um polipeptídeo) é compreendido por um vetor. Em alguns dos aspectos descritos no presente documento, uma sequência de ácido nucleico que codifica um determinado polipeptídeo, conforme descrito no presente documento, ou qualquer módulo do mesmo, está operacionalmente ligada a um vetor. O termo "vetor", tal como aqui utilizado, refere-se a uma construção de ácido nucleico projetada para entrega a uma célula hospedeira ou para transferência entre células hospedeiras diferentes. Conforme usado aqui, um vetor pode ser viral ou não viral. O termo "vetor" abrange qualquer elemento genético que é capaz de replicação quando associado aos elementos de controle adequados e que pode transferir sequências de genes para células. Um vetor pode incluir, mas não está limitado a: um vetor de clonagem, um vetor de expressão, um plasmídeo, bacteriófago, transposon, cosmídeo, cromossomo, vírus, vírion, etc.
[00139] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o vetor é recombinante, por exemplo, compreende sequências originadas de pelo menos duas fontes diferentes.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o vetor compreende sequências originadas de pelo menos duas espécies diferentes. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o vetor compreende sequências originadas de pelo menos dois genes diferentes, por exemplo, compreende uma proteína de fusão ou um ácido nucleico que codifica um produto de expressão que está operacionalmente ligado a pelo menos um elemento de controle genético (por exemplo, um promotor, supressor, ativador, intensificador, elemento de resposta ou semelhantes) não nativo (por exemplo, heterólogo).
[00140] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o vetor ou ácido nucleico aqui descrito é um códon otimizado, por exemplo, a sequência nativa ou de tipo selvagem da sequência de ácido nucleico foi alterada ou projetada para incluir códons alternativos, de modo que ou ácido nucleico modificado codifica o mesmo produto de expressão de polipeptídeo que a sequência nativa / de tipo selvagem, mas será transcrito e/ou traduzido com uma eficiência melhorada em um sistema de expressão desejado. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o sistema de expressão é um organismo diferente em relação a fonte da sequência nativa / de tipo selvagem (ou uma célula obtida de tal organismo). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o vetor e/ou sequência de ácido nucleico aqui descrito é otimizado por códons para expressão em um mamífero ou célula de mamífero, por exemplo, um camundongo, uma célula murina ou uma célula humana. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o vetor e/ou a sequência de ácido nucleico aqui descrita é otimizada por códons para expressão em uma célula humana. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o vetor e/ou a sequência de ácido nucleico aqui descrita é otimizada por códons para expressão em uma levedura ou célula de levedura. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o vetor e/ou a sequência de ácido nucleico aqui descrita é otimizada por códons para expressão em uma célula bacteriana. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o vetor e/ou a sequência de ácido nucleico aqui descrita é otimizada por códons para expressão em uma célula de E. coli.
[00141] Tal como aqui utilizado, o termo "vetor de expressão" refere-se a um vetor que direciona a expressão de um RNA ou polipeptídeo a partir de sequências ligadas a sequências regulatórias da transcrição no vetor. As sequências expressas serão frequentemente, mas não necessariamente, heterólogas para a célula. Um vetor de expressão pode compreender elementos adicionais, por exemplo, o vetor de expressão pode ter dois sistemas de replicação, permitindo assim que seja mantido em dois organismos, por exemplo, em células humanas para expressão e em um hospedeiro procariótico para clonagem e amplificação.
[00142] Conforme usado no presente documento, o termo "vetor viral" refere-se a um construto de vetor de ácido nucleico que inclui pelo menos um elemento de origem viral e tem a capacidade de ser empacotado em uma partícula de vetor viral. O vetor viral pode conter o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, conforme descrito no presente documento, no lugar de genes virais não essenciais. O vetor e/ou partícula pode ser utilizado com a finalidade de transferir quaisquer ácidos nucleicos para as células in vitro ou in vivo. Numerosas formas de vetores virais são conhecidas na técnica.
[00143] Deverá ser entendido que os vetores descritos no presente documento podem, em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, ser combinados com outras composições e terapias adequadas. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o vetor é epissomal. O uso de um vetor epissomal adequado fornece um meio de manter o nucleotídeo de interesse no indivíduo em um alto número de cópias de DNA cromossômico extra, eliminando assim os efeitos potenciais de integração cromossômica.
[00144] Conforme usado no presente documento, "contato" refere-se a qualquer meio adequado para entrega ou exposição de um agente a outro agente, um reagente, uma sequência, uma célula ou um sistema de expressão livre de células. Métodos de entrega exemplificativos incluem, mas não estão limitados a: entrega direta ao meio de cultura celular, perfusão, injeção ou outro método de entrega bem conhecido por um versado na técnica. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o contato compreende a atividade física humana, por exemplo, uma injeção; ato de dispensar, misturar e/ou decantar; e/ou manipulação de um dispositivo de distribuição ou máquina.
[00145] O termo "estatisticamente significativo" ou "significativamente" refere-se à significância estatística e geralmente significa dois desvios padrão (2 SD) ou uma diferença maior.
[00146] Exceto nos exemplos operacionais, ou onde indicado de outra forma, todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições de reação usados no presente documento devem ser entendidos como modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". O termo “cerca de” quando usado em conexão com porcentagens pode significar ± 1%.
[00147] Tal como aqui utilizado, o termo "correspondendo a" refere-se a um aminoácido ou nucleotídeo na posição enumerada em um primeiro polipeptídeo ou ácido nucleico, ou um aminoácido ou nucleotídeo que é equivalente a um aminoácido ou nucleotídeo enumerado em um segundo polipeptídeo ou ácido nucleico. Aminoácidos ou nucleotídeos enumerados equivalentes podem ser determinados por alinhamento de sequências candidatas usando programas de grau de homologia conhecidos na técnica, por exemplo, BLAST.
[00148] Tal como aqui utilizado, o termo "ligação específica" se refere a uma interação química entre duas moléculas, compostos, células e/ou partículas em que a primeira entidade se liga à segunda entidade alvo com maior especificidade e afinidade do que se liga a uma terceira entidade que não é alvo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a ligação específica pode se referir a uma afinidade da primeira entidade para a segunda entidade alvo que é pelo menos 10 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 1.000 vezes ou mais do que a afinidade para a terceira entidade não alvo.
Um reagente específico para um determinado alvo é aquele que exibe ligação específica para esse alvo nas condições do ensaio a ser utilizado.
[00149] Os agrupamentos de elementos alternativos ou modalidades da invenção divulgados no presente documento não devem ser interpretados como limitações. Cada membro do grupo pode ser referido e reivindicado individualmente ou em qualquer combinação com outros membros do grupo ou outros elementos aqui encontrados. Um ou mais membros de um grupo podem ser incluídos ou excluídos de um grupo por razões de conveniência e/ou patenteabilidade. Quando ocorre qualquer inclusão ou exclusão, a especificação é aqui considerada como contendo o grupo modificado, cumprindo assim a descrição escrita de todos os grupos Markush usados nas reivindicações anexas.
[00150] A menos que definido de outra forma no presente documento, os termos científicos e técnicos usados em conexão com o presente pedido devem ter os significados que são comumente compreendidos pelos versados na técnica à qual a presente divulgação pertence. Deverá ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes específicos etc., aqui descritos e, como tal, podem variar. A terminologia usada no presente documento tem o propósito de descrever modalidades particulares apenas, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, o qual é definido apenas pelas reivindicações. As definições de termos comuns em imunologia e biologia molecular podem ser encontradas em The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 20ª Edição, publicado pela Merck Sharp & Dohme Corp., 2018 (ISBN 0911910190, 978-0911910421); Robert S. Porter et al.
(eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, publicado por Blackwell Science Ltd.,
1999-2012 (ISBN 9783527600908); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1- 56081-569-8); Immunology de Werner Luttmann, publicado pela Elsevier, 2006; Janeway’s Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), W. W. Norton & Company, 2016 (ISBN 0815345054, 978-0815345053); Lewin’s Genes XI, publicado por Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN- 1449659055); Michael Richard Green e Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, EUA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., Nova Iorque, EUA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; e Current Protocols in Immunology (CPI) (John E.
Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737), conteúdos os quais são todos incorporados por referência no presente documento em sua totalidade.
[00151] Salvo indicação em contrário, a presente invenção foi realizada usando procedimentos padrão, conforme descrito, por exemplo, em Sambrook e Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012) e Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., Nova Iorque, EUA (1995), que são todos incorporados aqui por referência em sua totalidade.
[00152] Outros termos são definidos no presente documento dentro da descrição dos vários aspectos da invenção.
[00153] Um versado na técnica reconhecerá muitos métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento, os quais podem ser usados na prática da presente invenção. Na verdade, a presente invenção não está, de forma alguma, limitada aos métodos e materiais descritos.
[00154] Todas as patentes e outras publicações; incluindo referências de literatura, patentes emitidas, pedidos de patentes publicados e pedidos de patentes co- pendentes citados ao longo deste pedido são expressamente incorporados no presente documento por referência com a finalidade de descrever e divulgar, por exemplo, as metodologias descritas em tais publicações que podem ser usadas em conexão com a tecnologia aqui descrita. Estas publicações são fornecidas apenas para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada a este respeito deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm o direito de antecipar tal divulgação em virtude de invenção anterior ou por qualquer outro motivo. Todas as declarações quanto à data ou representação e em relação ao conteúdo desses documentos são baseadas nas informações disponíveis aos solicitantes e não constituem qualquer admissão quanto à exatidão das datas ou do conteúdo desses documentos.
[00155] A descrição das modalidades não se destina a ser exaustiva ou a limitar a divulgação à forma precisamente divulgada. Embora modalidades e exemplos específicos da presente divulgação sejam descritos neste documento para fins ilustrativos, várias modificações equivalentes são possíveis dentro do escopo da divulgação, tais como aqueles reconhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, embora as etapas ou funções do método sejam apresentadas em uma determinada ordem, modalidades alternativas podem executar funções em uma ordem diferente, ou as funções podem ser executadas substancialmente de forma simultânea. Os ensinamentos da divulgação fornecidos no presente documento podem ser aplicados a outros procedimentos ou métodos, conforme apropriado. As várias modalidades aqui descritas podem ser combinadas para fornecer outras modalidades.
Aspectos da divulgação podem ser modificados, se necessário, para empregar as composições, funções e conceitos das referências e aplicações para fornecer ainda outras modalidades da divulgação. Além disso, devido a considerações de equivalência funcional biológica, algumas mudanças podem ser feitas na estrutura da proteína sem afetar a ação biológica ou química em espécie ou quantidade. Essas e outras alterações podem ser feitas na divulgação à luz da descrição detalhada. Todas essas modificações devem ser incluídas no escopo das reivindicações anexas.
[00156] Elementos específicos, de qualquer uma das modalidades anteriores, podem ser combinados ou substituídos por elementos em outras modalidades. Além disso, embora as vantagens associadas a certas modalidades da presente divulgação tenham sido descritas no contexto dessas modalidades, outras modalidades também podem exibir tais vantagens, e nem todas as modalidades precisam necessariamente apresentar tais vantagens para estar dentro do escopo da presente divulgação.
[00157] Os vários métodos e técnicas aqui descritos fornecem uma série de modalidades da invenção. Deverá ser entendido que nem necessariamente todos os objetivos ou vantagens descritas podem ser alcançados de acordo com qualquer modalidade particular aqui descrita. Assim, os versados na técnica reconhecerão, por exemplo, que os métodos podem ser realizados de uma maneira que atinge ou otimiza uma vantagem ou grupo de vantagens tal como ensinado no presente documento, sem necessariamente atingir outros objetivos ou vantagens como podem ser ensinados ou sugeridos no presente documento. Uma variedade de alternativas vantajosas e desvantajosas são mencionadas aqui. Deverá ser entendido que algumas modalidades preferencias incluem especificamente uma, outra ou várias características vantajosas, enquanto outras excluem especificamente uma, outra ou várias características desvantajosas, enquanto outras ainda atenuam especificamente uma característica desvantajosa presente pela inclusão de um, outro ou vários recursos vantajosos.
[00158] Além disso, o versado na técnica reconhecerá a aplicabilidade de vários recursos de diferentes modalidades. Da mesma forma, os vários elementos, recursos e etapas discutidos no presente documento, bem como outros equivalentes conhecidos para cada um desses elementos, recursos ou etapas, podem ser misturados e combinados por um versado na técnica para executar métodos de acordo com os princípios descritos no presente documento. Entre os vários elementos, recursos e etapas, alguns serão especificamente incluídos e outros especificamente excluídos em diversas modalidades.
[00159] Embora a invenção tenha sido divulgada no contexto de certas modalidades e exemplos, será entendido pelos versados na técnica que as modalidades da invenção se estendem além das modalidades especificamente divulgadas para outras modalidades alternativas e/ou usos e modificações e seus equivalentes.
[00160] Muitas variações e elementos alternativos foram divulgados nas modalidades da presente invenção.
Adicionalmente, outras variações e elementos alternativos serão evidentes para um versado na técnica. Entre essas variações, sem limitação, estão os componentes do sistema sensor de ácido nucleico, incluindo domínios de ácido nucleico de fita simples, sítios de ligação ao ribossomo, códons operativamente ligados e/ou funcionalmente organizados, incluindo ainda técnicas e composição e uso de soluções usadas nos mesmos, e a particular utilização dos produtos criados através dos ensinamentos da invenção.
Várias modalidades da invenção podem incluir ou excluir especificamente qualquer uma dessas variações ou elementos.
[00161] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os números que expressam quantidades de ingredientes, propriedades, tais como concentração, condições de reação e assim por diante, usados para descrever e reivindicar certas modalidades da invenção devem ser entendidos como sendo modificados em algumas instâncias pelo termo "cerca de". Consequentemente, em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os parâmetros numéricos estabelecidos na descrição escrita e nas reivindicações anexas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se buscam obter por uma modalidade particular. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os parâmetros numéricos devem ser interpretados à luz do número de dígitos significativos relatados e aplicando técnicas comuns de arredondamento. Não obstante, os intervalos numéricos e parâmetros que estabelecem o amplo escopo de algumas modalidades da invenção são aproximações, os valores numéricos estabelecidos nos exemplos específicos são relatados tão precisamente quanto praticável. Os valores numéricos apresentados em algumas modalidades da invenção podem conter certos erros necessariamente resultantes do desvio padrão encontrado em suas respectivas medições.
[00162] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os termos "um/uma" e "o/a" e referências semelhantes usadas no contexto da descrição de uma modalidade particular da invenção (especialmente no contexto de algumas reivindicações) podem ser interpretados para cobrir tanto o singular quanto o plural. A citação de intervalos de valores aqui se destina meramente a servir como um método abreviado de referência individual a cada valor separado dentro do intervalo. A menos que indicado de outra forma no presente documento, cada valor individual é incorporado ao relatório descritivo como se fosse individualmente citado no presente documento. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma aqui ou de outra forma claramente contradito pelo contexto. O uso de todo e qualquer exemplo ou linguagem exemplificativo (por exemplo, "tal como") fornecido com relação a certas modalidades no presente documento se destina apenas a iluminar melhor a invenção e não representa uma limitação ao escopo da invenção reivindicada de outra forma.
Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento essencial não reivindicado para a prática da invenção.
[00163] Os agrupamentos de elementos alternativos ou modalidades da invenção divulgados no presente documento não devem ser interpretados como limitações. Cada membro do grupo pode ser referido e reivindicado individualmente ou em qualquer combinação com outros membros do grupo ou outros elementos aqui encontrados. Um ou mais membros de um grupo podem ser incluídos ou excluídos de um grupo por razões de conveniência e/ou patenteabilidade. Quando ocorre qualquer inclusão ou exclusão, a especificação é aqui considerada como contendo o grupo modificado, cumprindo assim a descrição escrita de todos os grupos Markush usados nas reivindicações anexas.
[00164] As modalidades preferenciais da presente invenção são descritas no presente documento, incluindo o melhor modo conhecido pelo inventor para realizar a invenção.
Variações nessas modalidades preferenciais tornar-se-ão aparentes para os versados na técnica após a leitura da descrição anterior. É contemplado que os versados na técnica podem empregar tais variações conforme apropriado, e a invenção pode ser praticada de outra forma que não especificamente aqui descrita. Consequentemente, muitas modalidades a presente invenção incluem todas as modificações e equivalentes do assunto recitado nas reivindicações anexas, conforme permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos aqui descritos em todas as variações possíveis dos mesmos é abrangida pela invenção, a menos que indicado de outra forma aqui ou de outra forma claramente contradita pelo contexto.
[00165] Além disso, várias referências foram feitas às patentes e publicações impressas ao longo desta especificação. Cada uma das referências citadas e publicações impressas são aqui incorporadas individualmente por referência em sua totalidade.
[00166] Deverá ser entendido que as modalidades aqui divulgadas são princípios ilustrativos da presente invenção.
Outras modificações que podem ser empregadas podem estar dentro do escopo da invenção. Assim, a título exemplificativo, mas não limitativo, configurações alternativas da presente invenção podem ser utilizadas de acordo com os ensinamentos deste documento.
Consequentemente, as modalidades da presente invenção não estão limitadas àquilo precisamente mostrado e descrito.
[00167] A tecnologia aqui descrita é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que, de forma alguma, devem ser interpretados como sendo limitativos.
[00168] Algumas modalidades da tecnologia aqui descrita podem ser definidas de acordo com qualquer um dos seguintes parágrafos numerados:
1. Sistema sensor de ácido nucleico, caracterizado por compreender: (a) um primeiro ácido nucleico compreendendo uma região de hibridização 3’ e um segundo ácido nucleico compreendendo a região de hibridização 5’;
(b) em que o primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico, quando ligados por um ácido nucleico alvo que hibridiza com a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’, são configurados para codificar um cassete não molde compreendendo um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo e uma sequência de codificação para uma proteína repórter.
2. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 1, caracterizado por compreender um primer complementar a uma região 3’ do segundo ácido nucleico.
3. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 1, caracterizado por o primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico serem DNA.
4. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 1, caracterizado por pelo menos uma porção da região de hibridização 3’ estar no promotor, no sítio de ligação ao ribossomo ou na sequência de codificação.
5. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 1, caracterizado por pelo menos uma porção da região de hibridização 5’ estar no promotor, no sítio de ligação ao ribossomo ou na sequência de codificação.
6. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 5, caracterizado por compreender um sistema de expressão livre de células.
7. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 6, caracterizado por compreender uma ligase.
8. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 7, caracterizado por compreender uma transcriptase reversa.
9. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 8, caracterizado por compreender uma ribonuclease que hidrolisa o RNA que é hibridizado em DNA.
10. Sistema de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 9, caracterizado por a ribonuclease ser RNAse H.
11. Sistema sensor de ácido nucleico, caracterizado por compreender: (a) uma forma não funcional, de fita simples e não molde de um cassete de expressão de DNA que compreende: (i) um promotor; (ii) um RBS; (iii) uma sequência de codificação para uma proteína repórter; em que uma sequência de hibridização de ácido nucleico alvo é inserida dentro do cassete, e o cassete é separado em duas moléculas em que a separação ocorre dentro da região de hibridização;
(b) um primer de DNA de fita simples complementar a uma região 3’ do cassete de expressão; (c) uma ligase; e (d) um sistema de expressão livre de células.
12. Sistema sensor de ácido nucleico, caracterizado por compreender: (a) um primeiro domínio de DNA de fita simples (ssDNA) compreendendo, de 5’ a 3’, uma fita não molde de: (i) um promotor; (ii) um sítio de ligação ao ribossomo (RBS); (iii) um códon de iniciação; e (iv) uma porção a montante de uma região de hibridização na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; (b) um segundo domínio de ssDNA compreendendo, de 5’ a 3’, uma fita não molde de: (i) uma porção a jusante da região de hibridização na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; e (ii) uma sequência de codificação para uma proteína repórter ligada a jusante e em quadro com a porção a jusante da região de hibridização; e (c) um primer de ssDNA complementar a uma região 3’ do segundo domínio.
13. Sistema sensor de ácido nucleico, caracterizado por compreender: (a) um primeiro domínio de DNA de fita simples (ssDNA) compreendendo, de 5’ a 3’, uma fita não molde de: (i) um promotor; e (ii) uma porção a montante de uma região de hibridização; (b) um segundo domínio de ssDNA compreendendo, de 5’ a 3’, uma fita não molde de: (i) uma porção a jusante da região de hibridização; (ii) um sítio de ligação ao ribossomo (RBS); e (iii) um códon de iniciação ligado em quadro com uma sequência de codificação para uma proteína repórter; c) um primer de ssDNA complementar a uma região 3’ do segundo domínio.
14. Sistema sensor de ácido nucleico, caracterizado por compreender: (a) um primeiro domínio de DNA de fita simples (ssDNA) compreendendo, de 5’ a 3’, uma fita não molde de: (i) um promotor; (ii) um sítio de ligação ao ribossomo (RBS); (iii) um códon de iniciação ligado em quadro com uma porção a montante de uma sequência de codificação para uma proteína repórter; e
(iv) uma porção a montante de uma região de hibridização na forma de um quadro de leitura ligado a jusante e em quadro com a porção a montante de uma sequência de codificação para uma proteína repórter; (b) um segundo domínio de ssDNA compreendendo, de 5’ a 3’, uma fita não molde de: (i) uma porção a jusante da região de hibridização na forma de um quadro de leitura no quadro com o códon de iniciação; e (ii) a porção restante de uma sequência de codificação para a proteína repórter ligada a jusante e em quadro com a porção a jusante da região de hibridização; e (c) um primer de ssDNA complementar ao segundo domínio em sua extremidade 3’.
15. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 11 a 14, caracterizado por o primeiro e o segundo domínios de ssDNA são fragmentos de DNA separados e o segundo domínio de ssDNA compreende um fosfato 5’.
16. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 15, caracterizado por o segundo domínio de ssDNA compreender ainda uma sequência de nucleotídeos em sua extremidade 3’ compreendendo o primer de ssDNA em uma alça em forma de grampo de cabelo terminal.
17. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 16, caracterizado por a extremidade 5’ do primeiro domínio compreender ainda uma sequência que forma uma alça em forma de grampo de cabelo terminal.
18. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 12 a 15, caracterizado por a extremidade 5’ do primeiro domínio estar ligada à extremidade 3’ do segundo domínio por meio de sequências intervenientes de ssDNA de modo que o primeiro e o segundo domínios estejam presentes em uma única sequência de ssDNA.
19. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18, caracterizado por a região de hibridização ter pelo menos 12 nucleotídeos.
20. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 19, caracterizado por a porção a montante e a jusante da região de hibridização terem, cada uma, pelo menos 6 nucleotídeos.
21. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 11 a 20, caracterizado por a proteína repórter ser selecionada a partir do grupo que consiste em luciferase, beta-lactamase, beta-galactosidase, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, catalase, anidrase carbônica, proteína verde fluorescente, proteína vermelha fluorescente, proteína ciano fluorescente, proteína amarela fluorescente, tripsina, uma protease, e um peptídeo que complementa e ativa uma proteína repórter truncada
22. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 12 a 21, caracterizado por compreender ainda um ou mais dentre uma ligase, uma DNA polimerase de deslocamento de fita, dNTPs, inibidor de RNAse e um sistema de expressão livre de células.
23. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 22, caracterizado por o sistema de expressão livre de células ser o extrato de células inteiras.
24. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 22 ou 23, caracterizado por a DNA polimerase de deslocamento de fita ser selecionada a partir do grupo que consiste em fragmento Klenow com porção exonuclease, fragmento Klenow sem porção exonuclease, phi29 polimerase e uma DNA polimerase T7 modificada.
25. Kit, caracterizado por compreender: - um sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 24; e - um controle positivo.
26. Método para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra, caracterizado por compreender: (a) proporcionar um sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 24, em que as regiões de hibridização a montante e a jusante são complementares a uma porção do ácido nucleico alvo, de modo que a hibridização do ácido nucleico alvo com as regiões de hibridização a montante e a jusante cria uma junção entre o primeiro e o segundo domínios; (b) contatar o sistema sensor de ácido nucleico com a amostra na presença de ligase sob condições apropriadas para hibridização do ácido nucleico alvo com as regiões de hibridização a montante e a jusante e ligação da região de hibridização a montante e a jusante, para assim produzir um produto reacional de ssDNA operacionalmente ligado; (c) contatar o produto reacional produzido na etapa (b) com um sistema de expressão livre de células compreendendo uma DNA polimerase de deslocamento de fita, dNTPs e outros componentes de bloco de construção necessários para a produção de proteínas e um primer de ssDNA sob condições apropriadas para polimerização, transcrição e tradução de DNA para, dessa forma, produzir uma proteína repórter; (d) medir a proteína repórter presente para indicar a presença do ácido nucleico alvo na amostra.
27. Método de acordo com o parágrafo 26, caracterizado por os componentes do sistema sensor de ácido nucleico estarem, cada um, presentes em cerca de 16 nM.
28. Método de acordo com o parágrafo 26, caracterizado por a ligase estar presente em cerca de 100 nM.
29. Método de acordo com o parágrafo 26, caracterizado por a etapa (b) ser incubada por um período de 5 minutos a 15 minutos à temperatura ambiente (24°C a 26°C) e/ou a etapa (c) ser incubada por um período de 60 minutos a 3 horas, à temperatura ambiente.
30. Método de acordo com o parágrafo 26, caracterizado por o sistema de expressão livre de células compreender ainda um inibidor de RNAse.
31. Método de acordo com o parágrafo 26, caracterizado por o sistema de expressão livre de células compreender ainda 12,5 uM do primer de ssDNA complementar à extremidade 3’ do segundo domínio.
32. Método de acordo com o parágrafo 26, caracterizado por a concentração de dNTPs ser de cerca de 230 uM.
33. Método de acordo com o parágrafo 26, caracterizado por a DNA polimerase ser selecionada a partir do grupo que consiste em fragmento Klenow com porção exonuclease, fragmento Klenow sem porção exonuclease, phi29 polimerase e uma DNA polimerase T7 modificada.
34. Método de acordo com o parágrafo 26, caracterizado por a proteína repórter ser luciferase e a medição ser feita por detecção de luminescência no sistema de expressão livre de células.
35. Método de acordo com o parágrafo 26, caracterizado por a transcrição compreender ainda hibridização do primer de ssDNA sendo hibridizado com RNA transcrito, transcrição reversa usando uma transcriptase reversa e clivagem endolítica.
36. Método de acordo com o parágrafo 26, caracterizado por a junção ser configurada para hibridizar contra um polimorfismo do ácido nucleico alvo.
[00169] Algumas modalidades da tecnologia aqui descrita podem ser definidas de acordo com qualquer um dos seguintes parágrafos numerados:
1. Sistema sensor de ácido nucleico, caracterizado por compreender: (a) um primeiro ácido nucleico compreendendo uma região de hibridização 3’; e (b) um segundo ácido nucleico compreendendo uma região de hibridização 5’; em que o primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico, quando ligados por um ácido nucleico alvo que hibridiza com a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’, são configurados para codificar um cassete não molde compreendendo um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo e uma sequência de codificação para uma proteína repórter.
2. Sistema sensor de ácido nucleico, caracterizado por compreender: (a) um primeiro ácido nucleico compreendendo uma região de hibridização 3’; e (b) um segundo ácido nucleico compreendendo uma região de hibridização 5’; em que o primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico, quando ligados entre si, são configurados para codificar um cassete não molde compreendendo um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo e uma sequência de codificação para uma proteína repórter.
3. Sistema sensor de ácido nucleico, caracterizado por compreender: (a) um primeiro ácido nucleico compreendendo uma região de hibridização 3’; e (b) um segundo ácido nucleico compreendendo uma região de hibridização 5’; em que o primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico, quando ligados entre si e hibridizados com um ácido nucleico alvo que hibridiza com a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’, são configurados para codificar um cassete não molde compreendendo um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo e uma sequência de codificação para uma proteína repórter.
4. Sistema sensor de ácido nucleico, caracterizado por compreender uma forma não funcional, de fita simples e não molde de um cassete de expressão de DNA que compreende: i) um promotor; ii) um sítio de ligação ao ribossomo (RBS); e iii) uma sequência de codificação para uma proteína repórter; em que uma sequência de hibridização de ácido nucleico alvo está localizada dentro do cassete, e o cassete está separado em um primeiro ácido nucleico e segundo ácido nucleico, em que a separação ocorre dentro da região de hibridização.
5. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 4, caracterizado por o primeiro ou o segundo ácido nucleico compreender a sequência de codificação para uma proteína repórter e o ácido nucleico restante compreende o promotor.
6. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 5, e caracterizado por o primeiro ou o segundo ácido nucleico compreender a sequência de codificação para uma proteína repórter e o ácido nucleico restante compreende o promotor e o sítio de ligação ao ribossomo.
7. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 6, caracterizado por o primeiro ou o segundo ácido nucleico compreender o promotor, o sítio de ligação ao ribossomo e um códon de iniciação da sequência de codificação para a proteína repórter e o ácido nucleico remanescente compreende a sequência de codificação restante para a proteína repórter.
8. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 7, caracterizado por o primeiro ácido nucleico compreender, de 5’ a 3’: (i) o promotor; (ii) o sítio de ligação ao ribossomo (RBS); (iii) o códon de iniciação para a sequência de codificação da proteína repórter; e (iv) a região de hibridização 3’ na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; e o segundo ácido nucleico compreende, de 5’ a 3’: (i) a região de hibridização 5’na forma de um quadro de leitura em quadro com a sequência de codificação restante para a proteína repórter; e (ii) uma sequência de codificação remanescente para a proteína repórter ligada a jusante e em quadro com a região de hibridização 5’.
9. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 8, caracterizado por o primeiro ou o segundo ácido nucleico compreender o promotor e o ácido nucleico restante compreende o sítio de ligação ao ribossomo e a sequência de codificação para a proteína repórter.
10. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 9, caracterizado por o primeiro ácido nucleico compreender, de 5’ a 3’: (i) o promotor; e (ii) a região de hibridização 3’; e o segundo ácido nucleico compreende, de 5’ a 3’: (i) a região de hibridização 5’; (ii) a sequência de ligação ao ribossomo; e (iii) a sequência de codificação para a proteína repórter.
11. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, caracterizado por o primeiro ou o segundo ácido nucleico compreender o promotor, o sítio de ligação ao ribossomo e uma porção 5’ da sequência de codificação para a proteína repórter e o ácido nucleico remanescente compreender a sequência de codificação restante para a proteína repórter.
12. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 11, caracterizado por o primeiro ácido nucleico compreender, de 5’ a 3’: (i) o promotor;
(ii) o RBS; (iii) uma primeira porção da sequência de codificação para a proteína repórter, compreendendo um códon de iniciação e pelo menos um códon adicional; e (iv) a região de hibridização 3’ na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; e o segundo ácido nucleico compreender, de 5’ a 3’: (i) a região de hibridização 5’ na forma de um quadro de leitura em quadro com a primeira porção da sequência de codificação para a proteína repórter e em quadro com a segunda porção da sequência de codificação para a proteína repórter; e (ii) uma segunda porção da sequência de codificação para a proteína repórter ligada a jusante e em quadro com a região de hibridização 5’.
13. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 12, caracterizado por a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ estarem localizadas na sequência de codificação da proteína repórter.
14. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 13, caracterizado por a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ estarem localizadas dentro de uma região que codifica uma alça exposta a solvente da proteína repórter.
15. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 14, caracterizado por a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ estarem localizadas na sequência de codificação da proteína repórter e não afetam substancialmente a função do gene repórter.
16. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 15, caracterizado por o primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico serem DNA.
17. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 16, caracterizado por o segundo ácido nucleico compreender um fosfato 5’.
18. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 17, caracterizado por pelo menos uma porção da região de hibridização 3’ estar no promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação.
19. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 18, caracterizado por pelo menos uma porção da região de hibridização 5’ estar no promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação.
20. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 19, caracterizado por a região de hibridização 3’ não estar dentro ou ser coextensiva com o promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação.
21. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 20, caracterizado por a região de hibridização 3’ ser 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no primeiro ácido nucleico.
22. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 21, caracterizado por a região de hibridização 5’ não estar dentro ou ser coextensiva com o promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação.
23. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 22, caracterizado por a região de hibridização 5’ ser 5’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no segundo ácido nucleico.
24. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 23, caracterizado por as duas regiões de hibridização terem coletivamente pelo menos 12 nucleotídeos de comprimento.
25. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 24, caracterizado por as regiões de hibridização 5’ e 3’ terem, cada um, pelo menos 6 nucleotídeos de comprimento.
26. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 25, caracterizado por o primeiro e o segundo ácido nucleico serem moléculas separadas.
27. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 26, caracterizado por a extremidade 5’ do primeiro ácido nucleico estar ligada à extremidade 3’ do segundo ácido nucleico através de sequências intervenientes de ssDNA de modo que o primeiro e o segundo ácido nucleico estão presentes em uma única sequência ou fita de DNA.
28. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 27, caracterizado por a extremidade 5’ do primeiro ácido nucleico compreender ainda uma sequência que forma uma alça em forma de grampo de cabelo terminal.
29. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 28, caracterizado por o sistema compreender ainda um primer complementar a uma região 3’ do segundo ácido nucleico.
30. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 29, caracterizado por compreender ainda um primer complementar a uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no segundo ácido nucleico.
31. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 30, caracterizado por o segundo ácido nucleico compreender ainda uma sequência de nucleotídeos na sua extremidade 3’ que compreende o primer em uma alça em forma de grampo de cabelo terminal.
32. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 31, caracterizado por a proteína repórter ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma luciferase, nanoluciferase, beta-lactamase, beta-galactosidase, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, catalase, anidrase carbônica, proteína verde fluorescente, proteína vermelha fluorescente, proteína ciano fluorescente, proteína amarela fluorescente, tripsina, uma protease, e um peptídeo que complementa e ativa uma proteína repórter truncada.
33. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 32, caracterizado por adicionalmente compreender um sistema de expressão livre de células.
34. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 33, caracterizado por adicionalmente compreender uma ligase.
35. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 34, caracterizado por adicionalmente compreender uma transcriptase inversa.
36. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 35, caracterizado por adicionalmente compreender uma ribonuclease que hidrolisa o RNA que é hibridado em DNA.
37. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 36, caracterizado por a ribonuclease ser RNAse H.
38. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 37, caracterizado por adicionalmente compreender: (a) um primer de DNA de fita simples (ssDNA) complementar a: (i) uma região 3’ do cassete de expressão; (ii) uma região 3’ do segundo ácido nucleico; (iii) uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo, ou sequência de codificação do segundo ácido nucleico; ou (iv) uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo, ou sequência de codificação do cassete de expressão;
(b) uma ligase; e (c) um sistema de expressão livre de células.
39. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 38, caracterizado por adicionalmente compreender um ou mais dentre uma ligase, uma DNA polimerase de deslocamento de fita, dNTPs, inibidor de RNAse e um sistema de expressão livre de células.
40. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 33 a 39, caracterizado por o sistema de expressão livre de células ser extrato de célula completa.
41. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 40, caracterizado por a DNA polimerase ser selecionada a partir do grupo que consiste em um fragmento Klenow com porção exonuclease, um fragmento Klenow sem porção exonuclease, uma phi29 polimerase, uma DNA polimerase T7 modificada, uma polimerase de Psychrobacillus, uma polimerase de Psychrobacillus com deslocamento de fita aprimorado, uma polimerase de B. subtilis.
42. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 41, caracterizado por a junção ser configurada para hibridizar contra um polimorfismo do ácido nucleico alvo.
43. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 42, caracterizado por a região de hibridização 3’ ou a região de hibridização 5’ ser configurada para hibridizar com um polimorfismo do ácido nucleico alvo.
44. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 43, caracterizado por a extremidade livre da região de hibridização 3’ ou a região de hibridização 5’ ser configurada para hibridizar com um polimorfismo do ácido nucleico alvo.
45. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 44, caracterizado por o polimorfismo estar localizado em uma ou em ambas as duas bases na junção da região de hibridização, em um em ambos no que tange o domínio sensor de ssDNA a montante ou a jusante.
46. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 45, caracterizado por a região de hibridização compreender um ou mais polimorfismos.
47. Sistema sensor de ácido nucleico, caracterizado por compreender: (a) um primeiro domínio compreendendo uma região de hibridização 3’; e (b) um segundo domínio compreendendo uma região de hibridização 5’; em que o primeiro domínio e o segundo domínio, quando ligados por um ácido nucleico alvo que hibridiza com a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’, são configurados para codificar um cassete não molde compreendendo um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo e uma sequência de codificação para uma proteína repórter.
48. Sistema sensor de ácido nucleico, caracterizado por compreender: a) um primeiro domínio compreendendo uma região de hibridização 3’; e b) um segundo domínio compreendendo uma região de hibridização 5’; em que o primeiro domínio e o segundo domínio, quando ligados entre si, são configurados para codificar um cassete não molde compreendendo um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo e uma sequência de codificação para uma proteína repórter.
49. Sistema sensor de ácido nucleico, caracterizado por compreender: (a) um primeiro domínio compreendendo uma região de hibridização 3’; e (b) um segundo domínio compreendendo uma região de hibridização 5’; em que o primeiro domínio e o segundo domínio, quando ligados e hibridizados com um ácido nucleico alvo que hibridiza com a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’, são configurados para codificar um cassete não molde compreendendo um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo e uma sequência de codificação para uma proteína repórter.
50. Sistema sensor de ácido nucleico, caracterizado por compreender uma forma não molde de fita simples de um cassete de expressão de DNA compreendendo: (i) um promotor; (ii) um sítio de ligação ao ribossomo (RBS); e (iii) uma sequência de codificação para uma proteína repórter; em que uma sequência de hibridização de ácido nucleico alvo está localizada dentro do cassete, e o cassete é separado em ou compreende um primeiro domínio e um segundo domínio em que a separação ou transição entre domínios ocorre dentro da região de hibridização.
51. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 50, caracterizado por o primeiro ou o segundo domínio compreender a sequência de codificação para uma proteína repórter e o domínio restante compreende o promotor.
52. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 51, caracterizado por o primeiro ou o segundo domínio compreender a sequência de codificação para uma proteína repórter e o domínio restante compreende o promotor e o sítio de ligação ao ribossomo.
53. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 52, caracterizado por o primeiro ou o segundo domínio compreende o promotor, o sítio de ligação ao ribossomo e um códon de iniciação da sequência de codificação para a proteína repórter e o domínio restante compreende a sequência de codificação restante para a proteína repórter.
54. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 53, caracterizado por o primeiro domínio compreender, de 5’ a 3’: (i) o promotor; (ii) o sítio de ligação ao ribossomo (RBS); (iii) o códon de iniciação para a sequência de codificação da proteína repórter; e (iv) a região de hibridização 3’ na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; e o segundo domínio compreende, de 5’ a 3’: (i) a região de hibridização 5’ na forma de um quadro de leitura em quadro com a sequência de codificação restante para a proteína repórter; e (ii) uma sequência de codificação remanescente para a proteína repórter ligada a jusante e em quadro com a região de hibridização 5’.
55. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 54, caracterizado por o primeiro ou o segundo domínio compreender o promotor e o domínio restante compreende o sítio de ligação ao ribossomo e a sequência de codificação para a proteína repórter.
56. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 55, caracterizado por o primeiro domínio compreender, de 5’ a 3’: (i) o promotor; e (ii) a região de hibridização 3’; e o segundo domínio compreende, de 5’ a 3’: (i) a região de hibridização 5’; (ii) a sequência de ligação ao ribossomo; e (iii) a sequência de codificação para a proteína repórter.
57. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 56, caracterizado por o primeiro ou o segundo domínio compreender o promotor, o sítio de ligação ao ribossomo e uma porção 5’ da sequência de codificação para a proteína repórter e o domínio remanescente compreende a sequência de codificação restante para a proteína repórter.
58. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 57, caracterizado por o primeiro domínio compreender, de 5’ a 3’: (i) o promotor; (ii) o RBS; (iii) uma primeira porção da sequência de codificação para a proteína repórter, compreendendo um códon de iniciação e pelo menos um códon adicional; e (iv) a região de hibridização 3’ na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; e o segundo domínio compreende, de 5’ a 3’: (i) a região de hibridização 5’ na forma de um quadro de leitura em quadro com a primeira porção da sequência de codificação para a proteína repórter e em quadro com a segunda porção da sequência de codificação para a proteína repórter; e (ii) uma segunda porção da sequência de codificação para a proteína repórter ligada a jusante e em quadro com a região de hibridização 5’.
59. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 57 a 58, caracterizado por a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ estarem localizadas na sequência de codificação da proteína repórter, dentro de uma região de codificação para uma alça exposta a solvente da proteína repórter.
60. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 57 a 59, caracterizado por a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ estarem localizadas na sequência de codificação da proteína repórter e não impactam substancialmente a função do gene repórter.
61. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 60, caracterizado por o primeiro domínio e o segundo domínio serem DNA.
62. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 61, caracterizado por pelo menos uma porção da região de hibridização 3’ estar no promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação.
63. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 62, caracterizado por pelo menos uma porção da região de hibridização 5’ estar no promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação.
64. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 63, caracterizado por a região de hibridização 3’ não estar dentro ou ser coextensiva com o promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação.
65. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 64, caracterizado por a região de hibridização 3’ ser 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no primeiro domínio.
66. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 65, caracterizado por a região de hibridização 5’ não estar dentro ou ser coextensiva com o promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação.
67. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 66, caracterizado por a região de hibridização 5’ ser 5’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no segundo domínio.
68. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 67, caracterizado por as duas regiões de hibridização terem, coletivamente, de pelo menos 12 nucleotídeos de comprimento.
69. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 68, caracterizado por as regiões de hibridização 5’ e 3’ terem, cada uma, pelo menos 6 nucleotídeos de comprimento.
70. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 69, caracterizado por o primeiro e o segundo domínio estarem na mesma molécula.
71. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 70, caracterizado por a extremidade 5’ do primeiro domínio estar ligada à extremidade 3’ do segundo domínio através de sequências intervenientes de ssDNA de modo que o primeiro e segundo domínio estão presentes em uma única sequência ou fita de DNA.
72. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 71, caracterizado por a extremidade 5’ do primeiro domínio compreender ainda uma sequência que forma uma alça em forma de grampo de cabelo terminal.
73. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 72, caracterizado por compreender ainda um primer complementar a uma região 3’ do segundo domínio.
74. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 73, caracterizado por compreender ainda um primer complementar a uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no segundo domínio.
75. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 74, caracterizado por o segundo domínio compreender ainda uma sequência de nucleotídeos na sua extremidade 3’ que compreende o primer em uma estrutura em forma de alça em forma de grampo de cabelo terminal.
76. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 75, caracterizado por a proteína repórter ser selecionada a partir do grupo que consiste em luciferase, nanoluciferase, beta-lactamase, beta-galactosidase, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, catalase, anidrase carbônica, proteína verde fluorescente, proteína vermelha fluorescente, proteína ciano fluorescente, proteína amarela fluorescente, tripsina, protease, um peptídeo que complementa e ativa uma proteína repórter truncada.
77. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 76, caracterizado por adicionalmente compreender um sistema de expressão livre de células.
78. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 77, caracterizado por adicionalmente compreender uma ligase.
79. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 78, caracterizado por adicionalmente compreender uma transcriptase inversa.
80. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 79, caracterizado por adicionalmente compreender uma ribonuclease que hidrolisa o RNA que é hibridado em DNA.
81. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 80, caracterizado por a ribonuclease ser RNAse H.
82. Sistema de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 81, caracterizado por compreender ainda: (a) um primer de DNA de fita simples complementar a: (i) uma região 3’ do cassete de expressão; (ii) uma região 3’ do segundo ácido nucleico; (iii) uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação no segundo ácido nucleico; ou (iv) uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo, ou sequência de codificação do cassete de expressão; (b) uma ligase; e (c) um sistema de expressão livre de células.
83. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 82, caracterizado por compreender ainda um ou mais dentre uma ligase, uma DNA polimerase de deslocamento de fita, dNTPs, inibidor de RNase,
e um sistema de expressão livre de células.
84. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 77 a 83, caracterizado por o sistema de expressão livre de células ser extrato de células inteiras.
85. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 84, caracterizado por a DNA polimerase ser selecionada a partir do grupo que consiste em um fragmento Klenow com porção exonuclease, um fragmento Klenow sem porção exonuclease, uma phi29 polimerase, uma DNA polimerase T7 modificada, uma polimerase de Psychrobacillus, uma polimerase de Psychrobacillus com deslocamento de fita aprimorado, uma polimerase de B. subtilis.
86. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 85, caracterizado por a junção ser configurada para hibridizar contra um polimorfismo do ácido nucleico alvo.
87. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 86, caracterizado por a região de hibridização 3’ ou a região de hibridização 5’ ser configurada para hibridizar com um polimorfismo do ácido nucleico alvo.
88. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 87, caracterizado por a extremidade livre da região de hibridização 3’ ou a região de hibridização 5’ ser configurada para hibridizar com um polimorfismo do ácido nucleico alvo.
89. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 88, caracterizado por o polimorfismo estar localizado em uma ou ambas as duas bases na junção da região de hibridização, em qualquer ou ambos no que tange o domínio sensor de ssDNA a montante ou a jusante.
90. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos 47 a 89, caracterizado por a região de hibridização compreender um ou mais polimorfismos.
91. Método para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra, caracterizado por compreender: (a) proporcionar um sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 90, em que uma região de hibridização a montante e uma região de hibridização a jusante são complementares a uma porção do ácido nucleico alvo de modo que a hibridização do ácido nucleico alvo para as regiões de hibridização a montante e a jusante criam uma junção entre o primeiro e o segundo ácido nucleico ou primeiro e segundo domínio; (b) colocar em contato o sistema sensor de ácido nucleico com a amostra na presença de ligase sob condições adequadas para a hibridização do ácido nucleico alvo com as regiões de hibridização a montante e a jusante e a ligação das regiões de hibridização a montante e a jusante, para desse modo produzir um produto reacional de ssDNA operacionalmente ligado; (c) colocar em contato o produto da reacional produzido na etapa (b) com um sistema de expressão livre de células, compreendendo uma DNA polimerase, dNTPs e outros componentes de bloco de construção necessários para a produção de mRNA e proteína, e um primer de ssDNA, sob condições adequadas para a polimerização de DNA, transcrição de RNA, e tradução de RNA para assim produzir uma proteína repórter; (d) medir a proteína repórter presente para indicar a presença do ácido nucleico alvo na amostra.
92. Método para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra, caracterizado por compreender: (a) proporcionar um sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 90, em que a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ são complementares para uma porção do ácido nucleico alvo de modo a que a hibridização do ácido nucleico alvo para as duas regiões de hibridização cria uma junção entre o primeiro e o segundo ácido nucleico; (b) colocar em contato o sistema sensor de ácido nucleico com a amostra na presença de ligase sob condições adequadas para a hibridização do ácido nucleico alvo com a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ e a ligação das regiões de hibridização, para dessa forma, produzir um produto reacional compreendendo uma fita do ácido nucleico alvo hibridizado com uma fita nucleica compreendendo o primeiro e o segundo ácido nucleico operativamente ligados; (c) colocar em contato o produto de reacional produzido na etapa (b) com um sistema de expressão livre de células para assim produzir uma proteína repórter; (d) medir a proteína repórter produzida na etapa (c) para determinar a quantidade do ácido nucleico alvo na amostra.
93. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 91 a 92, caracterizado por os componentes do sistema sensor de ácido nucleico estarem, cada um, presentes em cerca de 16 nM.
94. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 91 a 93, caracterizado por a ligase estar presente em cerca de 100 nM.
95. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 91 a 94, caracterizado por a etapa (b) ser incubada durante um período entre 5 minutos e 15 minutos à temperatura ambiente (24°C a 26°C) e/ou a etapa (c) ser incubada durante um período entre 60 minutos e 3 horas, à temperatura ambiente.
96. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 91 a 95, caracterizado por o sistema de expressão livre de células compreender ainda um inibidor de RNAse.
97. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 91 a 96, caracterizado por o sistema de expressão livre de células compreender ainda 12,5 µM de primer de ssDNA complementar para a extremidade 3’ do segundo ácido nucleico ou segundo domínio.
98. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 91 a 97, caracterizado por o sistema de expressão livre de células compreender ainda um substrato de proteína repórter.
99. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 91 a 98, caracterizado por a concentração de dNTP ser de cerca de 230 µM.
100. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 91 a 99, caracterizado por a DNA polimerase ser selecionada a partir do grupo que consiste em um fragmento Klenow com porção exonuclease, um fragmento Klenow sem porção exonuclease, uma phi29 polimerase, uma DNA polimerase T7 modificada, uma polimerase de Psychrobacillus, uma polimerase de Psychrobacillus com deslocamento de fita aprimorado e uma polimerase de B. subtilis.
101. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 91 a 100, caracterizado por a proteína repórter ser luciferase e o substrato de proteína repórter ser um substrato de luciferase e a medição ser feita por detecção de luminescência no sistema de expressão livre de células.
102. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 91 a 101, caracterizado por a transcrição compreender ainda a hibridização do primer de ssDNA com o transcrito de RNA, transcrição reversa usando uma transcriptase reversa e clivagem endolítica.
103. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 91 a 102, caracterizado por a junção ser configurada para hibridizar contra um polimorfismo do ácido nucleico alvo.
104. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 91 a 103, caracterizado por a região de hibridização 3’ ou a região de hibridização 5’ ser configurada para hibridizar com um polimorfismo do ácido nucleico alvo.
105. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 91 a 104, caracterizado por a extremidade livre da região de hibridização 3’ ou a região de hibridização 5’ ser configurada para hibridizar com um polimorfismo do ácido nucleico alvo.
106. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 91 a 105, caracterizado por o polimorfismo estar localizado em uma ou ambas as bases na junção da região de hibridização, em um ou ambos no que tange o domínio do sensor de ssDNA a montante ou a jusante.
107. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 91 a 106, caracterizado por um ou mais polimorfismos poder ser opcionalmente introduzidos na região de hibridização.
[00170] Algumas modalidades da tecnologia aqui descrita podem ser definidas de acordo com qualquer um dos seguintes parágrafos numerados:
1. Sistema sensor de ácido nucleico caracterizado por compreender uma primeira e uma segunda parte do sensor de DNA de fita simples que, quando ligadas entre si, geram uma fita simples de um cassete de expressão de DNA que compreende: (i) um promotor; (ii) um sítio de ligação ao ribossomo (RBS); e (iii) uma sequência de codificação; em que uma sequência de hibridização de ácido nucleico alvo está localizada dentro da primeira e da segunda parte do sensor de DNA de fita simples.
2. Sistema sensor de ácido nucleico caracterizado por compreender uma primeira e uma segunda parte do sensor de DNA de fita simples que, quando ligadas entre si, geram uma fita simples de um cassete de expressão de DNA que compreende: (i) um promotor;
(ii) um sítio de ligação ao ribossomo (RBS); (iii) uma sequência de codificação, cuja fita simples compreende: (iv) uma sequência de hibridização de ácido nucleico alvo compreendendo regiões de hibridização 3’ e 5’, em que a região de hibridização 3’ está incluída na primeira parte do sensor e a região de hibridização 5’ está incluída na segunda parte do sensor de modo que, quando o sistema sensor é contatado com uma amostra que inclui um ácido nucleico alvo que hibridiza com a sequência de ácido nucleico alvo, a hibridização com o ácido nucleico alvo permite a ligação da primeira e segunda parte para gerar a fita simples.
3. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 2, caracterizado por o cassete de expressão de DNA ser um cassete de expressão de DNA não molde.
4. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 3, caracterizado por a primeira e a segunda partes do sensor do cassete de expressão serem separadas em qualquer posição dentro do cassete de expressão.
5. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 4, caracterizado por a separação ocorrer dentro da sequência de hibridização de ácido nucleico alvo.
6. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 4, caracterizado por a sequência de hibridização de ácido nucleico alvo estar localizada em qualquer posição dentro do cassete de expressão.
7. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 6, caracterizado por a primeira ou a segunda parte do sensor compreender a sequência de codificação e a parte remanescente do sensor compreende o promotor.
8. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 7, caracterizado por a primeira ou a segunda parte do sensor compreender o promotor e o sítio de ligação ao ribossomo e a parte remanescente do sensor compreende a sequência de codificação.
9. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 8, caracterizado por a primeira ou a segunda parte do sensor compreender o promotor, o sítio de ligação do ribossomo e um códon de iniciação da sequência de codificação e a parte remanescente do sensor compreende a sequência de codificação restante.
10. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 9, caracterizado por a primeira parte do sensor compreender, de 5’ a 3’: (i) o promotor; (ii) o sítio de ligação ao ribossomo (RBS); (iii) o códon de iniciação para a sequência de codificação; e (iv) a região de hibridização 3’ na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; e a segunda parte do sensor compreender, de 5’ a 3’: (i) a região de hibridização 5’ na forma de um quadro de leitura em quadro com a sequência de codificação restante; e ii) uma sequência de codificação remanescente ligada a jusante e em quadro com a região de hibridização 5’.
11. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 10, caracterizado por a primeira ou a segunda parte do sensor compreender o promotor e a parte remanescente do sensor compreender o sítio de ligação ao ribossomo e a sequência de codificação.
12. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 11, caracterizado por a primeira parte do sensor compreender, de 5’ a 3’: (i) o promotor; e (ii) a região de hibridização 3’; e a segunda parte do sensor compreender, de 5’ a 3’:
(i) a região de hibridização 5’; (ii) a sequência de ligação ao ribossomo; e (iii) a sequência de codificação.
13. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 12, caracterizado por a primeira ou a segunda parte do sensor compreender o promotor, o sítio de ligação ao ribossomo e uma porção 5’ da sequência de codificação e a parte remanescente do sensor compreender a sequência de codificação restante.
14. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 13, caracterizado por a primeira parte do sensor compreender, de 5’ a 3’: (i) o promotor; (ii) o RBS; (iii) uma primeira porção da sequência de codificação, compreendendo um códon de iniciação e pelo menos um códon adicional; (iv) a região de hibridização 3’ na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; e a segunda parte do sensor compreender, de 5’ a 3’: (i) a região de hibridização 5’ na forma de um quadro de leitura em quadro com a primeira porção da sequência de codificação e em quadro com a segunda porção da sequência de codificação; e
(ii) uma segunda porção da sequência de codificação ligada a jusante e em quadro com a região de hibridização 5’.
15. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 14, caracterizado por pelo menos uma porção da região de hibridização 3’ estar no promotor, no sítio de ligação ao ribossomo ou na sequência de codificação.
16. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 15, caracterizado por pelo menos uma porção da região de hibridização 5’ estar no promotor, no sítio de ligação ao ribossomo ou na sequência de codificação.
17. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 16, caracterizado por a região de hibridização 3’ não estar dentro do promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação.
18. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 17, caracterizado por a região de hibridização 3’ ser 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação na primeira parte do sensor.
19. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18, caracterizado por a região de hibridização 5’ não estar dentro do promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação.
20. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 19, caracterizado por a região de hibridização 5’ ser 5’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação na segunda parte do sensor.
21. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 20, caracterizado por a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ terem, coletivamente, pelo menos 12 nucleotídeos de comprimento.
22. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 21, caracterizado por a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ terem, cada uma, pelo menos 6 nucleotídeos de comprimento.
23. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 22, caracterizado por a primeira e a segunda parte do sensor estarem na mesma molécula.
24. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 23, caracterizado por a extremidade 5’ da primeira parte do sensor estar ligada à extremidade 3’ da segunda parte do sensor por meio de sequências intervenientes de ssDNA de modo que a primeira e a segunda parte do sensor formem uma única molécula.
25. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 24, caracterizado por compreender ainda um primer complementar a uma sequência dentro do cassete de expressão não molde ou sequências intervenientes de ssDNA.
26. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 22, caracterizado por a primeira e a segunda parte do sensor estarem em pelo menos duas moléculas separadas.
27. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 22 ou parágrafo 26, caracterizado por a extremidade 5’ da primeira parte do sensor compreender ainda uma sequência que forma uma alça em forma de grampo de cabelo terminal.
28. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 22 ou de 26 a 27, caracterizado por compreender ainda um primer complementar a uma região 3’ da segunda parte do sensor.
29. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 23 a 25, caracterizado por compreender ainda um primer complementar a uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação na segunda parte do sensor.
30. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 23 a 25, caracterizado por compreender ainda um primer complementar a uma região 5’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação na segunda parte do sensor.
31. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 22 e de 26 a 30, caracterizado por a segunda parte do sensor compreender ainda uma sequência de nucleotídeos em sua extremidade 3’ compreendendo o primer em uma alça em forma de grampo de cabelo terminal.
32. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 31, caracterizado por a sequência de codificação do cassete de expressão de DNA codifica um polipeptídeo.
33. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 32, caracterizado por o polipeptídeo ser uma proteína repórter.
34. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 13 a 14, caracterizado por a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ estarem localizadas na sequência de codificação, dentro de uma região que codifica para uma alça exposta ao solvente da proteína repórter.
35. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 13 a 14 ou parágrafo 34, caracterizado por a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ estarem localizadas na sequência de codificação da proteína repórter e não afetarem substancialmente a função do gene repórter.
36. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 33, caracterizado por a proteína repórter compreender uma luciferase, nanoluciferase, beta-lactamase, beta-galactosidase, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, catalase, anidrase carbônica, proteína verde fluorescente, proteína vermelha fluorescente, proteína ciano fluorescente, proteína amarela fluorescente, tripsina, protease, um peptídeo que complementa e ativa uma proteína repórter truncada e um polipeptídeo que é detectável por um ensaio.
37. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 36, caracterizado por compreender ainda um sistema de expressão livre de células.
38. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 37, caracterizado por compreender ainda uma ligase.
39. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 38, caracterizado por compreender uma transcriptase reversa.
40. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 39, caracterizado por compreender ainda uma ribonuclease que hidrolisa o RNA que é hibridizado em DNA.
41. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 40, caracterizado por a ribonuclease ser RNAse H.
42. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 41, caracterizado por compreender ainda um ou mais dentre uma ligase, uma DNA polimerase de deslocamento de fita, dNTPs, inibidor de RNAse e um sistema de expressão livre de células.
43. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 37 a 42, caracterizado por o sistema de expressão livre de células ser extrato de células inteiras.
44. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 43, caracterizado por compreender ainda uma DNA polimerase.
45. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com o parágrafo 44, caracterizado por a DNA polimerase ser selecionada a partir do grupo que consiste em um fragmento Klenow com porção exonuclease, um fragmento de Klenow sem porção exonuclease, uma phi29 polimerase, uma DNA polimerase T7 modificada, uma polimerase de Psychrobacillus, uma polimerase de Psychrobacillus com deslocamento de fita aprimorado, uma polimerase de B. subtilis, Sequenase Versão
2.0, um fragmento grande de DNA polimerase Bsu, uma DNA polimerase Bst 3.0, uma DNA polimerase de alta fidelidade Phusion®, uma DNA polimerase Vent® sem a porção exonuclease, uma DNA polimerase Vent®, uma DNA polimerase Q5® de alta fidelidade e um fragmento grande de DNA polimerase I (Klenow).
46. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 45, caracterizado por um polimorfismo do ácido nucleico alvo hibridizar uma sequência na extremidade 3’ da região de hibridização da primeira parte do sensor e na extremidade 5’ da região de hibridização da segunda parte do sensor.
47. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 46, caracterizado por a região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor ou região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor ser configurada para hibridizar com um polimorfismo do ácido nucleico alvo.
48. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 47, caracterizado por a extremidade livre da região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor ou a extremidade livre da região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor ser configurada para hibridizar com um polimorfismo do ácido nucleico alvo.
49. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 48, caracterizado por a sequência de hibridização do polimorfismo compreender uma ou ambas as bases 3’ da região de hibridização da primeira parte do sensor e a base 5’ da região de hibridização da segunda parte do sensor.
50. Sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 49, caracterizado por a região de hibridização de ácido nucleico alvo compreender um ou mais polimorfismos.
51. Método para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma amostra compreendendo o ácido nucleico alvo; (b) contatar a amostra compreendendo o ácido nucleico alvo com o sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 50 na presença de uma ligase sob condições favoráveis à hibridização do ácido nucleico alvo com a região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor e região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor do cassete de expressão, para desse modo gerar um produto reacional compreendendo o ácido nucleico alvo hibridizado com a primeira parte do sensor e a segunda parte do sensor operacionalmente ligadas entre si; (c) colocar em contato o produto de reacional produzido na etapa (b) com um sistema de expressão livre de células na presença de uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um primer, em condições favoráveis à produção de uma proteína repórter; (d) contatar o produto reacional produzido na etapa (c) com um reagente que permite a detecção da expressão da proteína repórter; (e) medir a expressão da proteína repórter produzida na etapa (d) para determinar a presença e/ou a quantidade de ácido nucleico alvo na amostra.
52. Método de acordo com parágrafo 51, caracterizado por a ligase ser fornecida como uma parte do sistema livre de células.
53. Método para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma amostra compreendendo o ácido nucleico alvo; (b) colocar em contato a amostra compreendendo o ácido nucleico alvo com o sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 50 na presença de uma ligase e opcionalmente um primer sob condições favoráveis à hibridização da sequência de ácido nucleico alvo para a hibridização de região 3’ da primeira parte do sensor e para a região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor do cassete de expressão, para assim gerar um produto reacional compreendendo o ácido nucleico alvo hibridizado com a primeira parte do sensor e a segunda parte do sensor operacionalmente ligadas entre si; (c) colocar em contato o produto reacional produzido na etapa (b) com um sistema de expressão livre de células na presença de uma DNA polimerase de deslocamento de fita, sob condições favoráveis à produção de uma proteína repórter; (d) contatar o produto reacional produzido na etapa (c) com um reagente que permite a detecção da expressão da proteína repórter; (e) medir a expressão da proteína repórter produzida na etapa (d) para determinar a presença e/ou a quantidade de ácido nucleico alvo na amostra.
54. Método de acordo com o parágrafo 53, caracterizado por a ligase ser fornecida como uma parte do sistema livre de células.
55. Método para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma amostra compreendendo o ácido nucleico alvo; (b) contato da amostra compreendendo o ácido nucleico alvo com: (i) o sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 50 na presença de uma ligase; e (ii) um sistema de expressão livre de células na presença de uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um primer, em condições favoráveis à hibridização do ácido nucleico alvo para a região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor e para a região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor do cassete de expressão, e para a produção de um repórter proteína; (c) contatar o produto reacional produzido na etapa (b) com um reagente que permite a detecção da expressão da proteína repórter; (d) medir a expressão da proteína repórter produzida na etapa (c) para determinar a presença e/ou a quantidade de ácido nucleico alvo na amostra.
56. Método de acordo com o parágrafo 55, caracterizado por a ligase ser fornecida como uma parte do sistema livre de células.
57. Método para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma amostra compreendendo a sequência de ácido nucleico alvo; (b) contatar a amostra compreendendo a sequência de ácido nucleico alvo com: (i) o sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 50 na presença de uma ligase; (ii) um sistema de expressão livre de células na presença de uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um primer; e (iii) um reagente que permite a detecção da expressão da proteína repórter, em condições favoráveis à hibridização do ácido nucleico alvo para a região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor e para a região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor do cassete de expressão e para a produção de uma proteína repórter; (c) medir a expressão da proteína repórter produzida na etapa (b) para determinar a presença e/ou quantidade do ácido nucleico alvo na amostra.
58. Método de acordo com o parágrafo 57, caracterizado por a ligase ser fornecida como uma parte do sistema livre de células.
59. Kit caracterizado por compreender: (a) uma composição que compreende um sistema sensor de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 50 em um material de embalagem; (b) um dispositivo de coleta de amostra; (c) um controle positivo; e (d) instruções de uso.
EXEMPLOS Exemplo 1
Sequências de ácido nucleico
[00171] Todas as sequências de ácido nucleico estão incluídas na Tabela 1 (sequências de DNA). As partes A de oligonucleotídeo curto (< 200 nucleotídeos (nt)) foram adquiridas a partir da Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA), com purificação PAGE. Componentes de ssDNA mais longos (> 200 nt) e sequências alvo de RNA foram preparados a partir de gBlocks adquiridos a partir da IDT, conforme detalhado abaixo.
Exemplo 2 Preparação de componentes sensores de ssDNA
[00172] gBlocks são amplificados usando primers e kit PCR Q5 (New England Biolabs, NEB, Ipswich, MA). As reações de 200 L de PCR incluem 100 L de Q5 mastermix, 97 L de água, 1 L de gBlock (10 ng/L), 1 L cada 100 M não marcado de primer direto e primer reverso biotinilado. As reações de PCR são executadas com início quente a 98C por 2 minutos, 35 ciclos de 98C desnaturante por 10 segundos, recozimento a 68C por 20 segundos e extensão a 72C por 30 segundos, seguido por extensão final a 72C por 2 minutos. As reações de PCR são agrupadas e purificadas em uma coluna DNA-25 Clean and Concentrate da Zymo Research (Irvine, CA), eluída em 50 L de H2O e executada em um E-gel EX a 2% (Invitrogen,
Carlsbad, CA) para confirmação. A concentração é determinada em um Nanodrop (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Os construtos de ssDNA são purificados usando esferas magnéticas Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (ThermoFisher Scientific). O volume da esfera é calculado com base na concentração de PCR e na capacidade de ligação da esfera: 20 g ds-DNA/1mg de esfera, usando ~20% de partículas em excesso para assegurar a ligação completa. As esferas são transferidas para tubos de 2,0 mL e peletizadas por meio de um rack concentrador de partículas (MPC). As esferas são lavadas duas vezes usando tampão de ligação e lavagem 1x (B/W, Tris-HCl 5 mM, pH 7,5, EDTA 0,5 mM, NaCl 1 M). Um volume de 2x B/W é adicionado a um volume de eluição de PCR e a mistura de PCR é adicionada às esferas, girando em temperatura ambiente por um mínimo de 20 minutos. As esferas são concentradas e lavadas duas vezes. ssDNA é eluido duas vezes com um volume de NaOH 100 mM frio. O eluato é neutralizado com 0,1 volume de HCl 1 M e 0,1 volume de NaOAc 3 M, pH 5,0 e purificado usando um kit Zymo Oligo Clean and Concentrate (Zymo Research).
Exemplo 3 Preparação de RNA alvo
[00173] gBlocks que codificam as sequências de RNA alvo com promotores 5’ T7 foram adquiridos a partir da IDT e adicionados ao sistema de transcrição in vitro HiScribe (NEB), e as reações foram executadas por aproximadamente 4 horas. O RNA é purificado usando um kit Zymo RNA Clean and Concentrate (Zymo Research) e a concentração foi determinada usando um Nanodrop.
Exemplo 4 Construção de plasmídeo expressando RNA alvo em E. coli.
[00174] Células E. coli DH5 contendo o plasmídeo pgRNA-bactéria baseado em pUC19 foram adquiridas a partir da Addgene (plasmídeo #44251), cultivadas em LB com ampicilina e o plasmídeo foi purificado por mini-prep (Zymo Research).
A sequência de DNA que codifica um RNA alvo foi inserida no vetor usando mutagênese direcionada ao sítio Q5 (NEB) e verificada com PCR de colônia.
Exemplo 5 Preparação de extratos de RNA
[00175] Células E. coli DH5 transformadas com um plasmídeo que expressa uma sequência alvo de RNA foram cultivadas a 37C até OD600 de 0,3. 0,75 mL de reagente TRIzol LS (Thermo Fisher) foi adicionado a 250 L de células, e misturado via pipetagem. Esta mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos. 0,2 mL de clorofórmio foram adicionados e as células foram deixadas em repouso por
3 minutos. Em seguida, a reação foi centrifugada por 15 minutos @ 12000 x g e 4C. Após centrifugação, a fase aquosa (fase superior) foi adicionada a uma coluna de purificação Zymo RNA Clean and Concentrate (Zymo Research) e eluída em 25 L. O RNA purificado foi tratado com DNase I e adicionado a outra coluna de purificação de RNA para gerar o extrato de RNA. Extratos de células inteiras foram obtidos a partir de células de E. coli que foram cultivadas até os mesmos 0,3 OD, sedimentados e concentrados 10x durante a ressuspensão em tampão de armazenamento de RNA (Invitrogen, citrato de sódio 1 mM, pH 6,4). As células foram lisadas por calor com incubação a 95C durante 5 minutos.
Exemplo 6 Condições de ensaio de detecção padrão
[00176] 0,41 unidades de PBCV-1 DNA ligase, primer reverso 3 µM, Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, ATP 1 mM e DTT 10 mM são combinados com 38 nM de cada componente do sensor de parte A e B em 1,2 µL e incubado à temperatura ambiente (24°C a 26°C) por 5 a 15 minutos conforme indicado. Após a ligação do sensor e a reação de ligação, 1,6 µL de uma expressão livre de células e mistura de substrato composta por 0,45 v/v solução A (NEB) PURExpress, 0,34 v/v solução B (NEB) PURExpress, 0,91 unidades de inibidor de RNase de murino
(NEB), mistura de dNTPs (NEB) 228 µM, substrato Nano-Glo 0,02 v/v (Promega) e 0,125 unidades de DNA polimerase são adicionadas, a reação de expressão é selada com filme opticamente transparente e as leituras finais são feitas em um leitor de placas Synergy NEO Biotek (Winooski, VT) com ganho de 100. Quaisquer modificações são observadas nas descrições do exemplo abaixo.
Exemplo 7
[00177] Conforme ilustrado na Figura 1, os principais componentes do sistema incluem: - um domínio ‘A’ de DNA de fita simples; - um domínio ‘B’ de DNA de fita simples que é fosforilado em 5’; - um primer de ssDNA que hibridiza com a extremidade 3’ do domínio B; - uma ligase; - uma DNA polimerase; e - um sistema de expressão livre de células.
Exemplo 8 Interrupção do cassete de expressão.
[00178] Um cassete de expressão de DNA de fita dupla consistindo em um promotor T7, sítio de ligação ao ribossomo (RBS), e a sequência de codificação de uma proteína repórter de luciferase foi interrompida pela divisão do cassete de expressão em duas partes separadas - a parte a montante (A) e a parte a jusante (B) (ver, por exemplo, Figura 2A). Três versões do cassete de expressão dividida incluem: - Versão 1 (v1) - dividido após o códon de iniciação (ATG) da sequência de codificação; - Versão 2 (v2) - dividido entre o promotor e o RBS; e - Versão 3 (v3) - divisão embutida em uma alça ou volta da proteína repórter.
[00179] Os construtos v1 e v2 incluem uma região inserida de 36 nucleotídeos no sítio de divisão projetado para se ligar a uma sequência de RNA de 36 nucleotídeos alvo; 18 nucleotídeos da região de hibridização inserida estão na extremidade 3’ da parte A e 18 nucleotídeos da região de hibridização estão na extremidade 5’ da parte B. Dois construtos para cada um dos designs v1 e v2 foram criados para atingir duas moléculas de RNA diferentes (T1 e T2). O construto v3 não inclui uma região de hibridização inserida e um RNA alvo foi projetado para ser complementar à região do sítio de divisão. As partes do sensor de ssDNA para cada uma das versões descritas acima são ilustradas na Figura 3.
As sequências de DNA de todas os construtos e alvos estão listadas na Tabela 1.
[00180] Cassetes de expressão inteiros e intactos de dsDNA para v1, v2 e v3, e suas respectivas partes de dsDNA
A ou B foram gerados por PCR. Produtos lineares foram adicionados a um sistema de expressão livre de células para monitorar a transcrição, tradução e atividade de um repórter de luciferase medindo a luminescência (ver, por exemplo, Figuras de 4A a 4C). Os produtos de PCR (12,5 nM) foram adicionados diretamente a um sistema de expressão livre de células (PURExpress, NEB) suplementado com 200 µM de dNTPs, 0,22 mg/mL de BSA e substrato Nano-Glo (Promega) e incubados à temperatura ambiente (24°C a 26°C) durante uma hora. A luminescência foi medida para três reações separadas, bem como para poços em branco, usando um leitor de placas.
Exemplo 9 Detecção sensível de RNA alvo com sistema sensor de versão
1.
[00181] O sistema sensor v1 (Figura 3) foi testado quanto à ativação com base na presença de sequências alvo de RNA cognato ligando partes A e B separadas de ssDNA. Uma sequência adicional de RNA fora do alvo que não é complementar ao sítio de hibridização alvo também foi testada. Os dados que mostram a detecção do sensor v1 de RNA alvo (T2) com uma ligação de 5 minutos seguida por uma reação de expressão de 1 hora são mostrados nas Figuras 5A e 5B. O desempenho de duas DNA polimerases diferentes foi testado, fragmento Klenow +exo (ver por exemplo, Figura 5A) e
Sequenase (ver por exemplo, Figura 5B).
[00182] O sistema sensor v1 também foi testado para ativação por RNA alvo T1. As experiências foram realizadas como descrito acima, exceto pelo fato de que o tempo de ligação foi aumentado de 5 para 15 minutos. A detecção ao nível femtomolar de RNA T1 é mostrada na Figura 6.
Exemplo 10 Alta especificidade do sensor v1 em “fundo” de RNA de E.
coli e extrato de célula inteira
[00183] O desempenho do sensor v1 foi avaliado na presença de quantidades crescentes de RNA total de E. coli (ThermoFisher Scientific) de 2,6 ng a 2600 ng. Para acomodar o volume adicional do “fundo” de RNA, o ensaio de detecção padrão foi modificado, aumentando-se a concentração inicial das partes A e B do sensor de ssDNA de estoque em 7,5x para permitir que um volume menor de sensor atinja a mesma concentração final do sensor. Isso permitiu a adição de diferentes volumes de RNA de fundo sem alterar as concentrações de outros componentes da reação. A detecção de RNA T1 em “fundo” de RNA de E. coli não específico é mostrada na Figura 7.
[00184] O RNA obtido a partir de E.coli por extração de trizol (RNAex) e extratos de células inteiras em bruto a partir de quantidades comparáveis (4 x 106) de células lisadas por aquecimento a 95°C por 5 minutos (WCex) também foram testados como componentes de “fundo” com o sistema sensor v1 detectando T1 alvo. Os dados são mostrados na Figura 8.
Exemplo 11 Detecção de RNA alvo expresso em E. coli.
[00185] E. coli contendo um plasmídeo que expressa o alvo T2 foi colhida e lisada por aquecimento a 95°C por 5 minutos (WCex) ou tratada para extração de RNA por trizol (RNAex). O sistema sensor v1 foi usado para detectar o RNA alvo em ambas as condições com uma ligação de 15 minutos e incubação de expressão por 1 hora à temperatura ambiente, tal como mostrado na Figura 9.
Exemplo 12 Detecção de RNA alvo no “fundo” da saliva humana
[00186] O sistema sensor v1 foi usado para detectar uma concentração fixa (50 pM) de RNA alvo T1 em concentrações crescentes (v/v) de saliva humana agrupada (Innovative Research Inc., Novi, MI). Os dados são mostrados na Figura
10.
Exemplo 13 Desempenho de DNA polimerases alternativas.
[00187] O sistema sensor v3 (ver, por exemplo, Figura 3) foi testado quanto ao desempenho usando diferentes DNA polimerases para a etapa de extensão de fita de codificação.
A processabilidade da DNA polimerase, a atividade da exonuclease e a promiscuidade podem ter um impacto no desempenho. Os componentes das partes A e B foram adicionados a 12,5 nM cada e foram incubados com 8,6 nM de RNA alvo.
Após uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente (24°C a 26°C), a reação de ligação foi adicionada a um sistema de expressão livre de células (PurExpress, NEB) suplementado com 125 nM de primer de DNA reverso e uma das seguintes DNA polimerases (0,15 U cada): fragmento Klenow + exo; Fragmento Klenow - exo; phi29 polimerase; ou Sequenase.
As reações foram incubadas posteriormente à temperatura ambiente durante uma hora. O desempenho com o Alvo 2 é mostrado nas Figuras de 11A a 11D.
Exemplo 14 Desempenho de esquemas de componentes sensores alternativos.
[00188] O esquema de componente sensor alternativo de v1 ilustrado na Figura 2B(i) foi criado onde ambas as partes A e B estão na mesma sequência de ssDNA de modo que B é agora 5’ de A. Dois construtos foram testados, um terminando a transcrição de RNA com o uso de um domínio terminador T7 (CSt) e o outro contendo três códons de terminação de repetição (CSs). Os dados que mostram o desempenho desses esquemas alternativos são mostrados na Figura 12.
Tabela 1 - Sequências de ácido nucleico. As partes A e B de cada projeto de sensor são listadas. Os controles de comprimento total (AB) são a combinação das partes A e B.
Letras minúsculas indicam domínios espaçadores inseridos Nome SEQ Sequência
ID NO: v1_A_T 1 GAATTAATACGACTCACTATAGGGATCTATCCACTACTCCTA 1 AGGAGACTTTTTATGAATTATCTATGCATTACT v1_B_T 2 AACCCTTCCGCCACTAAAGTGTTCACATTGGAGGACTTTGTA 1 GGGGACTGGCGCCAGACAGCGGGCTACAACCTTGATCAGGTT
CTGGAGCAGGGAGGTGTAAGTTCACTTTTCCAGAATTTGGGT GTGAGTGTCACCCCGATCCAACGTATCGTGCTTTCCGGAGAA AATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTTATTATTCCTTATGAA GGGCTTAGCGGAGATCAAATGGGCCAAATCGAAAAGATTTTC AAAGTGGTATATCCTGTTGACGACCATCATTTTAAGGTCATT CTGCATTACGGAACTTTAGTCATCGACGGCGTCACACCTAAC ATGATTGACTATTTTGGCCGTCCGTATGAGGGCATCGCAGTG TTTGACGGAAAAAAAATCACCGTGACAGGGACACTGTGGAAC GGCAATAAGATTATCGACGAGCGCCTTATTAACCCAGATGGG TCGCTTTTATTCCGTGTCACTATTAATGGTGTCACTGGCTGG
CGTTTGTGCGAACGCATCCTGGCATAA v1_A_T 3 GAATTAATACGACTCACTATAGGGGTCCTCCCCCCCAAAACT
Nome SEQ Sequência
ID NO: 2 ACAATAAGGGGGTTTTTTATGTCCATTCCTGGCTTTAAT v1_A2_ 4 GAATTAATACGACTCACTATAGGGATCTATCCACTACTCCTA T2 AGGAGACTTTTTATGTCCATTCCTGGCTTTAAT v1_B_T 5 TTTACTGGTACAGTTTCAGTGTTCACATTGGAGGACTTTGTA 2 GGGGACTGGCGCCAGACAGCGGGCTACAACCTTGATCAGGTT
CTGGAGCAGGGAGGTGTAAGTTCACTTTTCCAGAATTTGGGT GTGAGTGTCACCCCGATCCAACGTATCGTGCTTTCCGGAGAA AATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTTATTATTCCTTATGAA GGGCTTAGCGGAGATCAAATGGGCCAAATCGAAAAGATTTTC AAAGTGGTATATCCTGTTGACGACCATCATTTTAAGGTCATT CTGCATTACGGAACTTTAGTCATCGACGGCGTCACACCTAAC ATGATTGACTATTTTGGCCGTCCGTATGAGGGCATCGCAGTG TTTGACGGAAAAAAAATCACCGTGACAGGGACACTGTGGAAC GGCAATAAGATTATCGACGAGCGCCTTATTAACCCAGATGGG TCGCTTTTATTCCGTGTCACTATTAATGGTGTCACTGGCTGG
CGTTTGTGCGAACGCATCCTGGCATAA v1_CSs 6 AACCCTTCCGCCACTAAAGTGTTCACATTGGAGGACTTTGTA _T1 GGGGACTGGCGCCAGACAGCGGGCTACAACCTTGATCAGGTT
CTGGAGCAGGGAGGTGTAAGTTCACTTTTCCAGAATTTGGGT GTGAGTGTCACCCCGATCCAACGTATCGTGCTTTCCGGAGAA
Nome SEQ Sequência
ID NO: AATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTTATTATTCCTTATGAA GGGCTTAGCGGAGATCAAATGGGCCAAATCGAAAAGATTTTC AAAGTGGTATATCCTGTTGACGACCATCATTTTAAGGTCATT CTGCATTACGGAACTTTAGTCATCGACGGCGTCACACCTAAC ATGATTGACTATTTTGGCCGTCCGTATGAGGGCATCGCAGTG TTTGACGGAAAAAAAATCACCGTGACAGGGACACTGTGGAAC GGCAATAAGATTATCGACGAGCGCCTTATTAACCCAGATGGG TCGCTTTTATTCCGTGTCACTATTAATGGTGTCACTGGCTGG CGTTTGTGCGAACGCATCCTGGCATAATAATAAGAATTAATA CGACTCACTATAGGGATCTATCCACTACTCCTAAGGAGACTT
TTTATGAATTATCTATGCATTACT v1_CSt 7 TTTACTGGTACAGTTTCAGTGTTCACATTGGAGGACTTTGTA _T2 GGGGACTGGCGCCAGACAGCGGGCTACAACCTTGATCAGGTT
CTGGAGCAGGGAGGTGTAAGTTCACTTTTCCAGAATTTGGGT GTGAGTGTCACCCCGATCCAACGTATCGTGCTTTCCGGAGAA AATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTTATTATTCCTTATGAA GGGCTTAGCGGAGATCAAATGGGCCAAATCGAAAAGATTTTC AAAGTGGTATATCCTGTTGACGACCATCATTTTAAGGTCATT CTGCATTACGGAACTTTAGTCATCGACGGCGTCACACCTAAC ATGATTGACTATTTTGGCCGTCCGTATGAGGGCATCGCAGTG
Nome SEQ Sequência
ID NO: TTTGACGGAAAAAAAATCACCGTGACAGGGACACTGTGGAAC GGCAATAAGATTATCGACGAGCGCCTTATTAACCCAGATGGG TCGCTTTTATTCCGTGTCACTATTAATGGTGTCACTGGCTGG CGTTTGTGCGAACGCATCCTGGCATAACTAGCATAACCCCTC TCTAAACGGAGGGGTTTGAATTAATACGACTCACTATAGGGG TCCTCCCCCCCAAAACTACAATAAGGGGGTTTTTTATGTCCA
TTCCTGGCTTTAAT v1_CSs 8 TTTACTGGTACAGTTTCAGTGTTCACATTGGAGGACTTTGTA _T2 GGGGACTGGCGCCAGACAGCGGGCTACAACCTTGATCAGGTT
CTGGAGCAGGGAGGTGTAAGTTCACTTTTCCAGAATTTGGGT GTGAGTGTCACCCCGATCCAACGTATCGTGCTTTCCGGAGAA AATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTTATTATTCCTTATGAA GGGCTTAGCGGAGATCAAATGGGCCAAATCGAAAAGATTTTC AAAGTGGTATATCCTGTTGACGACCATCATTTTAAGGTCATT CTGCATTACGGAACTTTAGTCATCGACGGCGTCACACCTAAC ATGATTGACTATTTTGGCCGTCCGTATGAGGGCATCGCAGTG TTTGACGGAAAAAAAATCACCGTGACAGGGACACTGTGGAAC GGCAATAAGATTATCGACGAGCGCCTTATTAACCCAGATGGG TCGCTTTTATTCCGTGTCACTATTAATGGTGTCACTGGCTGG CGTTTGTGCGAACGCATCCTGGCATAATGATAATAGTTTGGT
Nome SEQ Sequência
ID NO: TTGAATTAATACGACTCACTATAGGGGTCCTCCCCCCCAAAA
CTACAATAAGGGGGTTTTTTATGTCCATTCCTGGCTTTAAT v2_A_T 9 GAATTAATACGACTCACTATAGGAATTATCTATGCATTACT 1 v2_B_T 10 AACCCTTCCGCCACTAAAGGGTCAATTAAGGAGGTATATATG 1 GTGTTCACATTGGAGGACTTTGTAGGGGACTGGCGCCAGACA
GCGGGCTACAACCTTGATCAGGTTCTGGAGCAGGGAGGTGTA AGTTCACTTTTCCAGAATTTGGGTGTGAGTGTCACCCCGATC CAACGTATCGTGCTTTCCGGAGAAAATGGGCTGAAGATCGAC ATCCATGTTATTATTCCTTATGAAGGGCTTAGCGGAGATCAA ATGGGCCAAATCGAAAAGATTTTCAAAGTGGTATATCCTGTT GACGACCATCATTTTAAGGTCATTCTGCATTACGGAACTTTA GTCATCGACGGCGTCACACCTAACATGATTGACTATTTTGGC CGTCCGTATGAGGGCATCGCAGTGTTTGACGGAAAAAAAATC ACCGTGACAGGGACACTGTGGAACGGCAATAAGATTATCGAC GAGCGCCTTATTAACCCAGATGGGTCGCTTTTATTCCGTGTC ACTATTAATGGTGTCACTGGCTGGCGTTTGTGCGAACGCATC
CTGGCATAA v2_A_T 11 GAATTAATACGACTCACTATAGGTCCATTCCTGGCTTTAAT 2
Nome SEQ Sequência
ID NO: v2_B_T 12 TTTACTGGTACAGTTTCAAAACTGTAAGCCCGTAGAAAGGAC 2 TTTCAAACAATAAGCGGGTAAGGAGGTATTAAATGGTGTTCA
CATTGGAGGACTTTGTAGGGGACTGGCGCCAGACAGCGGGCT ACAACCTTGATCAGGTTCTGGAGCAGGGAGGTGTAAGTTCAC TTTTCCAGAATTTGGGTGTGAGTGTCACCCCGATCCAACGTA TCGTGCTTTCCGGAGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATG TTATTATTCCTTATGAAGGGCTTAGCGGAGATCAAATGGGCC AAATCGAAAAGATTTTCAAAGTGGTATATCCTGTTGACGACC ATCATTTTAAGGTCATTCTGCATTACGGAACTTTAGTCATCG ACGGCGTCACACCTAACATGATTGACTATTTTGGCCGTCCGT ATGAGGGCATCGCAGTGTTTGACGGAAAAAAAATCACCGTGA CAGGGACACTGTGGAACGGCAATAAGATTATCGACGAGCGCC TTATTAACCCAGATGGGTCGCTTTTATTCCGTGTCACTATTA ATGGTGTCACTGGCTGGCGTTTGTGCGAACGCATCCTGGCAT
AA v3_A_T 13 GAATTAATACGACTCACTATAGGTGAGTATATAGGTAGAAGA 1 GGTATTGGAGGTATTGATGGTGTTCACATTGGAGGACTTTGT
AGGGGACTGGCGCCAGACAGCGGGCTACAACCTTGATCAGGT TCTGGAGCAGGGAGGTGTAAGTTCACTTTTCCAGAATTTGGG TGTGAGTGTCACCCCGATCCAACGTATCGTGCTTTCCGGAGA
Nome SEQ Sequência
ID NO: AAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTTATTATTCCTTATGA AGGGCTTAGCGGAGATCAAATGGGCCAAATCGAAAAGATTTT
CAAAGTGGTATATCCTGTTGACGACCATCATTTTAAGGTCAT TCTGCATTACGGAACTTTAGTCATCGACGGCggtggcgggAA
TTATCTATGCATTACT v3_B_T 14 AACCCTTCCGCCACTAAAggcggtgggGTCACACCTAACATG 1 ATTGACTATTTTGGCCGTCCGTATGAGGGCATCGCAGTGTTT
GACGGAAAAAAAATCACCGTGACAGGGACACTGTGGAACGGC AATAAGATTATCGACGAGCGCCTTATTAACCCAGATGGGTCG CTTTTATTCCGTGTCACTATTAATGGTGTCACTGGCTGGCGT
TTGTGCGAACGCATCCTGGCATAA v3_A_T 15 GAATTAATACGACTCACTATAGGTGAGTATATAGGTAGAAGA 2 GGTATTGGAGGTATTGATGGTGTTCACATTGGAGGACTTTGT
AGGGGACTGGCGCCAGACAGCGGGCTACAACCTTGATCAGGT TCTGGAGCAGGGAGGTGTAAGTTCACTTTTCCAGAATTTGGG TGTGAGTGTCACCCCGATCCAACGTATCGTGCTTTCCGGAGA AAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTTATTATTCCTTATGA AGGGCTTAGCGGAGATCAAATGGGCCAAATCGAAAAGATTTT CAAAGTGGTATATCCTGTTGACGACCATCATTTTAAGGTCAT TCTGCATTACGGAACTTTAGTCATCGACGGCGGTGGCGGGTC
Nome SEQ Sequência
ID NO:
CATTCCTGGCTTTAAT v3_B_T 16 TTTACTGGTACAGTTTCAGGCGGTGGGGTCACACCTAACATG 2 ATTGACTATTTTGGCCGTCCGTATGAGGGCATCGCAGTGTTT
GACGGAAAAAAAATCACCGTGACAGGGACACTGTGGAACGGC AATAAGATTATCGACGAGCGCCTTATTAACCCAGATGGGTCG CTTTTATTCCGTGTCACTATTAATGGTGTCACTGGCTGGCGT
TTGTGCGAACGCATCCTGGCATAA v3_A_T 17 GAATTAATACGACTCACTATAGGTGAGTATATAGGTAGAAGA 3 GGTATTGGAGGTATTGATGGTGTTCACATTGGAGGACTTTGT
AGGGGACTGGCGCCAGACAGCGGGCTACAACCTTGATCAGGT TCTGGAGCAGGGAGGTGTAAGTTCACTTTTCCAGAATTTGGG TGTGAGTGTCACCCCGATCCAACGTATCGTGCTTTCCGGAGA AAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTTATTATTCCTTATGA AGGGCTTAGCGGAGATCAAATGGGCCAAATCGAAAAGATTTT CAAAGTGGTATATCCTGTTGACGACCATCATTTTAAGGTCAT
TCTGCATTACGGAACTTTAGTCATCGACGGC v3_B_T 18 GTCACACCTAACATGATTGACTATTTTGGCCGTCCGTATGAG 3 GGCATCGCAGTGTTTGACGGAAAAAAAATCACCGTGACAGGG
ACACTGTGGAACGGCAATAAGATTATCGACGAGCGCCTTATT AACCCAGATGGGTCGCTTTTATTCCGTGTCACTATTAATGGT
Nome SEQ Sequência
ID NO:
GTCACTGGCTGGCGTTTGTGCGAACGCATCCTGGCATAA Primer 19 TTATGCCAGGATGCGTTCGC Rev T1 20 TTTAGTGGCGGAAGGGTTAGTAATGCATAGATAATT T2 21 TGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGA T3 22 AATCATGTTAGGTGTGACGCCGTCGATGACTAAAGT Exemplo 15 Discriminação de variações de nucleotídeo único (SNVs).
[00189] Os sinais de polimorfismos de nucleotídeo ou variações de nucleotídeo único podem ser detectados usando os métodos e composições conforme aqui descritos, posicionando a localização do SNP ou SNV em uma das duas bases na junção da região de hibridização, tanto no domínio do sensor de ssDNA a montante quanto a jusante. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, uma ou mais bases incompatíveis podem ser adicionalmente introduzidas na região de hibridização.
[00190] Quatro variantes exemplificativas diferentes foram testadas usando v1. A sequência alvo e as variantes testadas que representam SNPs ou SNVs estão listadas na Tabela 2 abaixo. As alterações de base que refletem os SNVs estão em negrito.
Tabela 2 - Sequências de ácido nucleico. Variantes de RNA com variações de nucleotídeo único (SNVs) Variantes SEQ ID Sequência de RNA NO: Alvo (UA) 23 UUUAGUGGCGGAAGGGUUAGUAAUGCAUAGAUAAUU SNP-UG 24 UUUAGUGGCGGAAGGGUUGGUAAUGCAUAGAUAAUU SNP-AA 25 UUUAGUGGCGGAAGGGUAAGUAAUGCAUAGAUAAUU SNP-GA 26 UUUAGUGGCGGAAGGGUGAGUAAUGCAUAGAUAAUU SNP-GG 27 UUUAGUGGCGGAAGGGUGGGUAAUGCAUAGAUAAUU
[00191] As sequências de RNA de fita simples listadas acima foram detectadas com um sensor conforme descrito no Exemplo 6. Tal como mostrado na Figura 13, a resposta diferencial é observada com base na presença de um nucleotídeo não correspondente em uma ou ambas as extremidades de junção da região de hibridização.
Exemplo 16 Desempenho de DNA polimerases alternativas
[00192] Múltiplas DNA polimerases foram testadas usando v1, para função com o método conforme descrito nos
Exemplos 6 e 13. Polimerases adicionais e formulações de polimerase listadas abaixo também foram testadas: IsoPol (polimerase de Psychrobacillus): 4 unidades por reação; IsoPol SD+ (polimerase de Psychrobacillus com deslocamento de fita aprimorado): 4 unidades por reação (com exemplos adicionais usando menos unidades de enzima mostradas); ou Bsu (polimerase de B. subtilis): 4 unidades por reação.
[00193] O desempenho dessas polimerases foi testado no sistema de detecção in vitro visando a sequência de RNA alvo CT (+RNA) versus um controle negativo sem a sequência de RNA alvo (-RNA) (ver, por exemplo, Figura 14A). O sinal para a razão de “fundo” com base nessas medições (razão S:B) também foi testada para cada polimerase (ver, por exemplo, Figura 14B).
[00194] Além disso, diferentes quantidades de unidades de IsoPol SD+ foram testadas com o método de detecção (ver, por exemplo, Figura 14C). A detecção eficaz foi alcançada com apenas 1,7 unidade de enzima.
Exemplo 17 Demonstração de várias maneiras de separar um cassete de expressão dentro de uma sequência de codificação para projetar partes do sensor de ssDNA.
[00195] Três localizações exemplificativas são descritas no presente documento para dividir um cassete de expressão, e inserção da sequência de hibridização alvo (ver, por exemplo, Figura 3, versão 3). Um versado na técnica entenderia que as alças expostas a solvente de qualquer proteína repórter ou outra proteína seriam sítios adequados para inserção de aminoácidos adicionais (por exemplo, como resultante da inserção de uma região de hibridização na sequência de DNA). O presente documento demonstra a capacidade de dividir o cassete de expressão em vários sítios de alça exposta a solvente para criar um sistema de detecção de ácido nucleico funcional a partir das partes do sensor de ssDNA resultantes. O cassete de expressão inclui um gene que codifica para uma enzima nanoluciferase (NLuc). As regiões de alça expostas ao solvente (Alça de 1 a 5) dentro da Nluc que foram testadas são indicadas na Tabela 3. As abreviaturas de uma única letra do aminoácido e o número dentro da sequência polipeptídica em cada extremidade do sítio de divisão / inserção são fornecidos. Por exemplo, E50-N51 indica a inserção da sequência de hibridização na sequência de codificação entre os códons que codificam para glutamato na posição de aminoácido 50 e asparagina na posição de aminoácido 51.
Tabela 3 - Localização das regiões de alça exposta a solvente (Alça de 1 a 5) dentro da Nluc
Sítio de Inserção Localização na NLuc Alça 1 E50-N51 Alça 2 L66-S67 Alça 3 G123-K124 Alça 4 G135-N136 Alça 5 N145-P146
[00196] Conforme mostrado na Figura 15A, a atividade foi testada para Nluc com a sequência de hibridização inserida nas regiões de alça indicadas expostas a solvente.
Aminoácidos adicionais dentro do Nluc, resultantes da inserção da sequência de hibridização, não impactaram substancialmente a função da luciferase.
[00197] Além disso, as partes do sensor de ssDNA foram construídas com base nesses sítios de divisão e na sequência de CT alvo, conforme descrito, e foram testadas para detecção de 100 nM de RNA de CT alvo. Todos os sítios de divisão do cassete de expressão foram capazes de detectar o RNA alvo de forma eficaz (ver, por exemplo, Figura 15B).
Exemplo 18 Construtos de Nanoluciferase Dividida
[00198] Para identificar as partes A e B que têm um “fundo” inferior no ensaio, os sítios de divisão foram escolhidos no meio da sequência de codificação da luciferase (ver, por exemplo, Figura 3, versão 3). Ao mover o sítio dividido para a sequência de codificação da luciferase, o sinal de “fundo” da transcrição e tradução espúrias de partes individuais renderá apenas fragmentos não funcionais da proteína luciferase.
[00199] Quatorze regiões diferentes da proteína luciferase foram identificadas como passíveis de abrigar uma inserção. Quatorze sítios de divisão diferentes dentro dessas regiões (ver, por exemplo, SEQ ID NO: 28 e Tabela 4) foram testados para identificar sítios de divisão que têm baixo sinal enzimático de “fundo” se as duas partes são expressas em um sistema de expressão livre de células in vitro na ausência de ligação bem sucedida. Esses sítios estão localizados nas alças conhecidas da proteína nanoluciferase.
As partes A e B foram construídas com transcrição e tradução conduzidas por um promotor T7, um sítio de RBS ótimo e um códon de iniciação ATG (ver, por exemplo, Figura 16).
[00200] SEQ ID NO: 28 é a sequência de luciferase usada nestes estudos, não incluindo o códon de iniciação.
VFTLRDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLK IDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGR
PYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA (SEQ ID NO: 28)
Tabela 4. Lista de sítios de divisão testados na SEQ ID NO: 28 Sítio de Divisão Região Localização da Divisão 1 G16-L19 Y17-N18 2 Q25-L32 G26-G27 3 Q25-L31 S29-S30 4 L35-I42 G36-G37 5 L47-L53 E50-N51 6 P62-G68 L66-S67 7 F78-P83 K79-V80 8 V84-F89 D86-H87 9 L98-N106 D101-G102 10 D109-Y115 R113-P114 11 V120-K125 G123-K124 12 T131-K137 G135-N136 13 L141-L150 N145-P146 14 I156-V159 N157-G148
[00201] Sítios de divisão 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 13 foram os sítios em NanoLuciferase com o sinal de luminescência mais baixo (ver, por exemplo, Figura 17) quando testados como construtos de divisão com partes A e B (ver, por exemplo, Figura 16).
[00202] Para identificar sítios de divisão que produziriam um gene de luciferase de comprimento total funcional após uma etapa de ligação bem-sucedida, os construtos de PCR foram gerados com um promotor T7, RBS, códon de iniciação e gene de luciferase de comprimento total com uma sequência gatilho. A sequência gatilho foi inserida nos sítios de divisão com o “fundo” mais baixo quando as duas partes foram expressas separadamente (ver, por exemplo, Figura 17).
[00203] Os sítios com “fundo” menor (2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 13) foram testados com uma sequência Chlamydia-RNA-sensor (gatilho) específica interessada nos sítios de divisão do gene da luciferase, de modo que a proteína traduzida contenha a seguinte sequência IYALLTLPPLNN (SEQ ID NO: 29) flanqueada em cada lado por um ligante curto de 3 glicinas.

Claims (59)

REIVINDICAÇÕES
1. Sistema sensor de ácido nucleico caracterizado por compreender uma primeira e uma segunda partes de sensor de DNA de fita simples que, quando ligadas entre si, geram uma fita simples de um cassete de expressão de DNA que compreende: i) um promotor; ii) um sítio de ligação ao ribossomo (RBS); e iii) uma sequência de codificação; em que uma sequência de hibridização de ácido nucleico alvo está localizada dentro da primeira e da segunda partes do sensor de DNA de fita simples.
2. Sistema sensor de ácido nucleico caracterizado por compreender uma primeira e uma segunda partes de sensor de DNA de fita simples que, quando ligadas entre si, geram uma fita simples de um cassete de expressão de DNA que compreende: i) um promotor; ii) um sítio de ligação ao ribossomo (RBS); iii) uma sequência de codificação, cuja fita simples compreende: iv) uma sequência de hibridização de ácido nucleico alvo que compreende regiões de hibridização 3’ e 5’, em que a região de hibridização 3’ está incluída na primeira parte do sensor e a região de hibridização 5’ está incluída na segunda parte do sensor de modo que, quando o sistema sensor é contatado com uma amostra que inclui um ácido nucleico alvo que hibridiza com a sequência de ácido nucleico alvo, a hibridização com o ácido nucleico alvo permite a ligação da primeira e segunda partes para gerar a fita simples.
3. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por o cassete de expressão de DNA ser um cassete de expressão de DNA não molde.
4. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a primeira e a segunda partes de sensor do cassete de expressão serem separadas em qualquer posição dentro do cassete de expressão.
5. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a separação ocorrer dentro da sequência de hibridização de ácido nucleico alvo.
6. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a sequência de hibridização de ácido nucleico alvo estar localizada em qualquer posição dentro do cassete de expressão.
7. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por tanto a primeira ou a segunda parte do sensor compreender a sequência de codificação e a parte remanescente do sensor compreender o promotor.
8. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por tanto a primeira ou a segunda parte do sensor compreender o promotor e o sítio de ligação ao ribossomo e a parte remanescente do sensor compreender a sequência de codificação.
9. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por tanto a primeira ou a segunda parte do sensor compreender o promotor, o sítio de ligação ao ribossomo e um códon de iniciação da sequência de codificação e a parte remanescente do sensor compreender a sequência de codificação restante.
10. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a primeira parte do sensor compreender, de 5’ a 3’: i) o promotor; ii) o sítio de ligação ao ribossomo (RBS); iii) o códon de iniciação para a sequência de codificação; e iv) a região de hibridização 3’ na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; e a segunda parte do sensor compreender, de 5’ a 3’: i) a região de hibridização 5’ na forma de um quadro de leitura em quadro com a sequência de codificação restante; e ii) uma sequência de codificação restante ligada a jusante de e em quadro com a região de hibridização 5’.
11. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por tanto a primeira ou a segunda parte do sensor compreender o promotor e a parte remanescente do sensor compreender o sítio de ligação ao ribossomo e a sequência de codificação.
12. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a primeira parte do sensor compreender, de 5’ a 3’: i) o promotor; e ii) a região de hibridização 3’; e a segunda parte do sensor compreender, de 5’ a 3’: i) a região de hibridização 5’; ii) a sequência de ligação ao ribossomo; e iii) a sequência de codificação.
13. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por tanto a primeira ou a segunda parte do sensor compreender o promotor, o sítio de ligação ao ribossomo e uma porção 5’ da sequência de codificação, e a parte remanescente do sensor compreender a sequência de codificação restante.
14. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a primeira parte do sensor compreender, de 5’ a 3’: i) o promotor; ii) o RBS; iii) uma primeira porção da sequência de codificação, compreendendo um códon de iniciação e pelo menos um códon adicional; iv) a região de hibridização 3’ na forma de um quadro de leitura em quadro com o códon de iniciação; e a segunda parte do sensor compreender, de 5’ a 3’: i) a região de hibridização 5’ na forma de um quadro de leitura em quadro com a primeira porção da sequência de codificação e em quadro com a segunda porção da sequência de codificação; e ii) uma segunda porção da sequência de codificação ligada a jusante de e em quadro com a região de hibridização 5’.
15. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por pelo menos uma porção da região de hibridização 3’ estar no promotor, no sítio de ligação ao ribossomo ou na sequência de codificação.
16. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por pelo menos uma porção da região de hibridização 5’ estar no promotor, no sítio de ligação ao ribossomo ou na sequência de codificação.
17. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado por a região de hibridização 3’ estar fora do promotor, do sítio de ligação ao ribossomo ou da sequência de codificação.
18. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado por a região de hibridização 3’ ser 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação na primeira parte do sensor.
19. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado por a região de hibridização 5’ estar fora do promotor, do sítio de ligação ao ribossomo ou da sequência de codificação.
20. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado por a região de hibridização 5’ ser 5’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação na segunda parte do sensor.
21. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ terem, coletivamente, pelo menos 12 nucleotídeos de comprimento.
22. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado por a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ terem, cada uma, pelo menos 6 nucleotídeos de comprimento.
23. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado por a primeira e a segunda partes do sensor estarem na mesma molécula.
24. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado por a extremidade 5’ da primeira parte do sensor estar ligada à extremidade 3’ da segunda parte do sensor por meio de sequências intervenientes de ssDNA, de modo que a primeira e a segunda parte do sensor formem uma única molécula.
25. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado por compreender ainda um primer complementar a uma sequência dentro do cassete de expressão não molde ou sequências intervenientes de ssDNA.
26. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado por a primeira e a segunda partes do sensor estarem em pelo menos duas moléculas separadas.
27. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou 26, caracterizado por a extremidade 5’ da primeira parte do sensor compreender ainda uma sequência que forma uma alça em forma de grampo de cabelo terminal.
28. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou 26 a 27, caracterizado por compreender ainda um primer complementar a uma região 3’ da segunda parte do sensor.
29. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado por compreender ainda um primer complementar a uma sequência que é 3’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação na segunda parte do sensor.
30. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado por compreender ainda um primer complementar a uma região 5’ de qualquer promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sequência de codificação na segunda parte do sensor.
31. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 e 26 a 30, caracterizado por a segunda parte do sensor compreender ainda uma sequência de nucleotídeos em sua extremidade 3’ compreendendo o primer em uma alça em forma de grampo de cabelo terminal.
32. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado por a sequência de codificação do cassete de expressão de DNA codificar um polipeptídeo.
33. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o polipeptídeo ser uma proteína repórter.
34. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 14, caracterizado por a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ estarem localizadas na sequência de codificação, dentro de uma região que codifica uma alça exposta a solvente da proteína repórter.
35. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 14 ou 34, caracterizado por a região de hibridização 3’ e a região de hibridização 5’ estarem localizadas na sequência de codificação da proteína repórter sem afetar substancialmente a função do gene repórter.
36. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por a proteína repórter compreender uma luciferase, nanoluciferase, beta-lactamase, beta-galactosidase, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, catalase, anidrase carbônica, proteína verde fluorescente, proteína vermelha fluorescente, proteína ciano fluorescente, proteína amarela fluorescente, tripsina, uma protease, um peptídeo que complementa e ativa uma proteína repórter truncada e um polipeptídeo que é detectável por um ensaio.
37. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado por compreender ainda um sistema de expressão livre de células.
38. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado por compreender ainda uma ligase.
39. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado por compreender ainda uma transcriptase reversa.
40. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizado por compreender ainda uma ribonuclease que hidrolisa o RNA que é hibridizado em DNA.
41. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por a ribonuclease ser RNAse H.
42. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado por compreender ainda um ou mais dentre uma ligase, uma DNA polimerase de deslocamento de fita, dNTPs, inibidor de RNAse e um sistema de expressão livre de células.
43. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 42, caracterizado por o sistema de expressão livre de células ser o extrato de células inteiras.
44. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado por compreender ainda uma DNA polimerase.
45. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por a DNA polimerase ser selecionada a partir do grupo que consiste em um fragmento Klenow com porção exonuclease, um fragmento Klenow sem porção exonuclease, uma phi29 polimerase, uma DNA polimerase T7 modificada, uma polimerase de Psychrobacillus, uma polimerase de Psychrobacillus com deslocamento de fita aprimorado, uma polimerase de B. subtilis, Sequenase Versão
2.0, um fragmento grande de DNA polimerase Bsu, uma DNA polimerase Bst 3.0, uma DNA polimerase de alta fidelidade Phusion®, uma DNA polimerase Vent® sem a porção exonuclease, uma DNA polimerase Vent®, uma DNA polimerase Q5® de alta fidelidade e um fragmento grande de DNA polimerase I (Klenow).
46. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizado por um polimorfismo do ácido nucleico alvo hibridizar com uma sequência na extremidade 3’ da região de hibridização da primeira parte do sensor e na extremidade 5’ da região de hibridização da segunda parte do sensor.
47. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 46, caracterizado por a região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor ou a região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor ser configurada para hibridizar com um polimorfismo do ácido nucleico alvo.
48. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizado por a extremidade livre da região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor ou a extremidade livre da região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor ser configurada para hibridizar com um polimorfismo do ácido nucleico alvo.
49. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 48, caracterizado por a sequência de hibridização do polimorfismo compreender uma ou ambas a base 3’ da região de hibridização da primeira parte do sensor e a base 5’ da região de hibridização da segunda parte do sensor.
50. Sistema sensor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 49, caracterizado por a região de hibridização de ácido nucleico alvo compreender um ou mais polimorfismos.
51. Método para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra caracterizado por compreender: a) fornecer uma amostra compreendendo o ácido nucleico alvo; b) contatar a amostra compreendendo o ácido nucleico alvo com o sistema sensor de ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 na presença de uma ligase sob condições favoráveis à hibridização do ácido nucleico alvo para a região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor e para a região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor do cassete de expressão, para, assim, gerar um produto de reação compreendendo o ácido nucleico alvo hibridizado com a primeira parte do sensor e a segunda parte do sensor operacionalmente ligadas entre si; c) contatar o produto de reação produzido na etapa b)
com um sistema de expressão livre de células na presença de uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um primer, em condições favoráveis à produção de uma proteína repórter; d) contatar o produto de reação produzido na etapa c) com um reagente que permite a detecção da expressão da proteína repórter; e) medir a expressão da proteína repórter produzida na etapa d) para determinar a presença e/ou quantidade do ácido nucleico alvo na amostra.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por a ligase ser fornecida como uma parte do sistema livre de células.
53. Método para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra caracterizado por compreender: a) fornecer uma amostra compreendendo o ácido nucleico alvo; b) contatar a amostra compreendendo o ácido nucleico alvo com o sistema sensor de ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 na presença de uma ligase e, opcionalmente, um primer sob condições favoráveis à hibridização da sequência de ácido nucleico alvo para a região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor e para a região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor do cassete de expressão, para, assim, gerar um produto de reação compreendendo o ácido nucleico alvo hibridizado com a primeira parte do sensor e a segunda parte do sensor operacionalmente ligadas entre si; c) contatar o produto de reação produzido na etapa b) com um sistema de expressão livre de células na presença de uma DNA polimerase de deslocamento de fita, sob condições favoráveis à produção de uma proteína repórter; d) contatar o produto de reação produzido na etapa c) com um reagente que permite a detecção da expressão da proteína repórter; e) medir a expressão da proteína repórter produzida na etapa d) para determinar a presença e/ou quantidade do ácido nucleico alvo na amostra.
54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por a ligase ser fornecida como uma parte do sistema livre de células.
55. Método para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra caracterizado por compreender: a) fornecer uma amostra compreendendo o ácido nucleico alvo; b) contatar a amostra compreendendo o ácido nucleico alvo com i) o sistema sensor de ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 na presença de uma ligase, e ii) um sistema de expressão livre de células na presença de uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um primer, sob condições favoráveis à hibridização do ácido nucleico alvo para a região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor e para a região de hibridização 5’ da segunda parte do sensor do cassete de expressão, e para a produção de uma proteína repórter; c) contatar o produto de reação produzido na etapa b) com um reagente que permite a detecção da expressão da proteína repórter; d) medir a expressão da proteína repórter produzida na etapa c) para determinar a presença e/ou quantidade do ácido nucleico alvo na amostra.
56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado por a ligase ser fornecida como uma parte do sistema livre de células.
57. Método para detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra caracterizado por compreender: a) fornecer uma amostra compreendendo a sequência de ácido nucleico alvo; b) contatar a amostra compreendendo a sequência de ácido nucleico alvo com i) o sistema sensor de ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 na presença de uma ligase, ii) um sistema de expressão livre de células na presença de uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um primer, e iii) um reagente que permite a detecção da expressão da proteína repórter, sob condições favoráveis à hibridização do ácido nucleico alvo para a região de hibridização 3’ da primeira parte do sensor e para a região de hibridização 5’ do segunda parte do sensor do cassete de expressão e para a produção de uma proteína repórter; c) medir a expressão da proteína repórter produzida na etapa b) para determinar a presença e/ou quantidade do ácido nucleico alvo na amostra.
58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado por a ligase ser fornecida como uma parte do sistema livre de células.
59. Kit caracterizado por compreender: a) uma composição que compreende um sistema sensor de ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 em um material de embalagem; b) um dispositivo de coleta de amostra; c) um controle positivo; e d) instruções para uso.
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