JP2000300285A - 光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸誘導体の製造方法 - Google Patents

光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸誘導体の製造方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］
ヘキサン−６−カルボン酸誘導体の製造法を提供するこ
と。 【解決手段】 一般式（１） （式中、Ｒ1はＣ1−Ｃ8アルコキシなど、Ｘ1、Ｘ2は単
結合、Ｓ、Ｏなど、Ｒ2、Ｒ3は、水素、ハロゲンな
ど。）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘ
キサン−６−カルボン酸エステル類を、特定の光学活性
体を優先的に加水分解する能力を有する酵素を用いて不
斉加水分解することを特徴とする一般式（２） で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］
ヘキサン−６−カルボン酸類および一般式（３） で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］
ヘキサン−６−カルボン酸エステル類の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、光学活性２−オキ
ソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エ
ステル類及び光学活性２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸類の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】光学活性２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類及び光学活性
２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カル
ボン酸類は、医薬などの中間体として有用な化合物であ
る。従来、かかる光学活性２−オキソビシクロ［３．
１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類を製造する方法と
しては、光学分割法と、光学活性な物質からの誘導法が
公知である。光学分割法としては、例えばラセミの（１
ＳＲ，５ＲＳ，６ＳＲ）−２−オキソビシクロ［３．
１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類を光学活性なフェ
ニルエチルアミンなどの光学活性アミン類を光学分割剤
として用いて光学分割する方法が知られている（特開平
０８−１８８５６１号公報，ＷＯ９６／０４９００号明
細書）。光学活性な物質からの誘導法としては、光学活
性なジシクロペンタンジエノンを出発物質として使用す
ることにより光学活性２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸類へ導く方法が知られて
いる（特開平０８−１８８５６１号公報）。しかしなが
ら、光学分割法は工業的製造においては、光学分割剤の
回収リサイクル工程が必要で工程数が多くなる、光学活
性な物質からの誘導法は、出発物質に光学活性化合物を
使用するため原料コストが高くなるという問題があっ
た。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
光学分割剤を用いないで光学活性２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類及び光学活
性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カ
ルボン酸エステル類を得る方法、特に、２−オキソビシ
クロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル
類の光学活性体の混合物を光学選択的に加水分解するこ
とによって光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］
ヘキサン−６−カルボン酸エステル類及び光学活性２−
オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン
酸類を製造する方法について鋭意検討した結果、酵素を
用いることによって光学活性２−オキソビシクロ［３．
１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類及び光学
活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−
カルボン酸類を容易に効率よく製造できることを見い出
し、本発明に至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、一般
式（１） （式中、Ｒ1はＣ1−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしくは
ニトロで１個以上置換されていてもよいＣ1−Ｃ10アル
キル基；アリル基；アリールがＣ1−Ｃ8アルキル、Ｃ1
−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしくはニトロで１個以上
置換されていてもよいアリールアルキル基；またはＣ1
−Ｃ8アルキル、Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしく
はニトロで１個以上置換されていてもよいアリール基を
示し、Ｘ1およびＸ2は互いに独立して、単結合、Ｓ、
Ｏ、ＳＯ、ＳＯ2、またはＮＲ4を示し、ここでＲ4は、
水素または式（ＣＯ）nＲ5で示される基を示し、ｎは０
または１を示し、Ｒ5は、水素またはハロゲン原子；Ｃ1
−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニ
トロ、チオールもしくはチオアルキルで１個以上置換さ
れていてもよいＣ1−Ｃ10アルキル基；Ｃ1−Ｃ8アルコ
キシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオー
ルもしくはチオアルキルで１個以上置換されていてもよ
いＣ2−Ｃ10アルケニル基；Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒド
ロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオールもしくは
チオアルキルで１個以上置換されていてもよいＣ2−Ｃ
10アルキニル基；Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニ
ル、Ｃ2−Ｃ8アルキニル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒド
ロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオールもしくは
チオアルキルで１個以上置換されていてもよいアリール
基；アリールがＣ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニ
ル、Ｃ2−Ｃ8アルキニル、Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロ
キシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオールもしくはチ
オアルキルで１個以上置換されていてもよいアリールア
ルキル基；Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ
2−Ｃ8アルキニル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキ
シ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオールもしくはチオ
アルキルで１個以上置換されていてもよい芳香族複素
環；またはＣ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ
2−Ｃ8アルキニル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキ
シ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオールもしくはチオ
アルキルで１個以上置換されていてもよい非芳香族複素
環を示し、Ｒ2およびＲ3は互いに独立して、水素、ハロ
ゲン原子またはニトロ基；Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロ
キシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオールもしくはチ
オアルキルで１個以上置換されていてもよいＣ1−Ｃ10
アルキル基；Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲ
ン、アミノ、ニトロ、チオールもしくはチオアルキルで
１個以上置換されていてもよいＣ2−Ｃ10アルケニル
基；Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミ
ノ、ニトロ、チオールもしくはチオアルキルで１個以上
置換されていてもよいＣ2−Ｃ10アルキニル基；Ｃ1−Ｃ
8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニ
ル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、ア
ミノ、ニトロ、チオールもしくはチオアルキルで１個以
上置換されていてもよいアリール基；アリールがＣ1−
Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニ
ル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、ア
ミノ、ニトロ、チオールもしくはチオアルキルで１個以
上置換されていてもよいアリールアルキル基；Ｃ1−Ｃ8
アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニル、
Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミ
ノ、ニトロ、チオールもしくはチオアルキルで１個以上
置換されていてもよい芳香族複素環；Ｃ1−Ｃ8アルキ
ル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニル、 Ｃ1−
Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニト
ロ、チオールもしくはチオアルキルで１個以上置換され
ていてもよい非芳香族複素環； Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2
−Ｃ8アルケニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニル、 Ｃ1−Ｃ8アル
コキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオ
ールもしくはチオアルキルで１個以上置換されていても
よい、１個もしくは２個の芳香族炭化水素環または芳香
族複素環と縮合した非芳香族炭化水素環；またはＣ1−
Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニ
ル、Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミ
ノ、ニトロ、チオールもしくはチオアルキルで１個以上
置換されていてもよい、１個もしくは２個の芳香族炭化
水素環または芳香族複素環と縮合した非芳香族複素環を
示す。）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］
ヘキサン−６−カルボン酸エステル類を、特定の光学活
性体を優先的に加水分解する能力を有する酵素を用いて
不斉加水分解することを特徴とする一般式（２） （式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ2およびＲ3は前記と同じ意味を示
し、＊は不斉炭素原子であることを示す。）で示される
光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸類および一般式（３） （式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3および＊は前記と同
じ意味を示す。）で示される光学活性２−オキソビシク
ロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類
の製造方法（以下、本発明製造方法と略する。）を提供
するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明製造方法において用いられ
る原料である一般式（１）で示される２−オキソビシク
ロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類
は、種々の方法で合成されるが、例えば、James A.Monn
らの方法（Journal of Medicinal Chemistry,1997,Vol.
40,No.4,528-537）に準じて行うことで合成される。一
般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類には、１位、
５位、６位の不斉炭素原子を不斉中心とする８種類の光
学活性体が存在するが、本発明の方法に用いられる一般
式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］
ヘキサン−６−カルボン酸エステル類は、これらの光学
活性体をそれぞれ等量ずつ含む混合物であってもよい
し、どれかの光学活性体を過剰に含む光学活性な化合物
であってもよい。
【０００６】本発明の一般式で示される化合物におい
て、「Ｃ1−Ｃ10アルキル」とは、炭素数１〜１０の直
鎖、分岐鎖、または環状アルキル鎖を示す。例えば直鎖
または分岐鎖Ｃ1−Ｃ10アルキルには、メチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブ
チル、ｓｅｃ−ブチル、 ｔ−ブチル、 ｎ−ペンチル、
イソペンチル、ネオペンチル、 ｎ−ヘキシル、 ２−メ
チルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチ
ル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチ
ル、３，３−ジメチルブチル、ヘプチル、 ｎ−オクチ
ル、２，２−ジメチルヘキシル、２，５−ジメチルヘキ
シル、２−メチルヘプチル、４−メチルヘプチル、２，
２，４−トリメチルペンチル、２，３，４−トリメチル
ペンチル、ノニル、３，５，５−トリメチルペンチル、
デシル、３，７−ジメチルオクチルなどが挙げられる。
環状アルキル基には、例えば、シクロプロピル、シクロ
ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプ
チル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシルな
どの単環状アルキル基、あるいは１−アダマンチル、２
−アダマンチル、１−デカリル、２−デカリル、４−デ
カリル、ビシクロ［３．３．０］オクト−１−イル、−
２−イルまたは−３−イル、ビシクロ［４．３．０］ノ
ン−１−イル、−２−イル、−３−イルまたは−７−イ
ル、ビシクロ［５．３．０］デシ−１−イル、−２−イ
ル、−３−イル、−４−イル、−８−イルまたは−９−
イル、ビシクロ［３．３．１］ノン−１−イル、−２−
イル、−３−イルまたは−９−イルなどの複環状アルキ
ル基が挙げられる。
【０００７】「Ｃ2−Ｃ10アルケニル」とは、１つまた
はそれ以上の炭素−炭素二重結合（ジエン、トリエンな
ど）を有する、炭素数２〜１０の直鎖または分岐鎖不飽
和アルキル鎖を示す。この基には、Ｅ異性体とＺ異性体
の両方が含まれる。この基の代表的な例には、ビニル、
アリル、アレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、２−
メチル−１−プロペニル、ブタジエニル、１−ペンテニ
ル、２−ペンテニル、２−メチル−２−ブテニル、４−
ペンテニル、３−メチル−２−ブテニル、３−メチル−
１，２−ブタジエニル、３−ヘキセニル、２−ヘキセニ
ル、４−メチル−３−ペンテニル、４−ヘキセニル、５
−ヘキセニル、３−メチル−１−ペンテン−３−イル、
６−メチル−５−ヘプテン−２−イル、７−オクテニ
ル、１−オクテン−３−イル、３−ノンエニル、２，４
−ジメチル−２，６−ヘプタジエニル、３，７−ジメチ
ル−６−オクテニル、５−デセニル、９−デセニル、お
よび２，６−ジメチル−７−オクテニルなどが挙げられ
る。
【０００８】「 Ｃ1−Ｃ4アルコキシ」としては、例え
ば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロピ
ル、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシな
どが挙げらる。「ハロゲン原子」としては、フルオロ、
クロロ、ブロモ、ヨード原子が挙げられる。「アルコキ
シカルボニル基」としては、例えば、メトキシカルボニ
ル、エトキシカルボニル、 ｎ−プロポキシカルボニ
ル、 ｎ−ブトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニ
ルなどが挙げられる。好ましくはメトキシカルボニルが
挙げられる。
【０００９】「アリール」とは、ハロゲン、ヒドロキ
シ、シアノ、ニトロ、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アル
コキシ、Ｃ1−Ｃ6アルキルチオ、カルボキシ、Ｃ1−Ｃ6
アルコキシカルボニル、カルバモイル、保護基を有する
カルボキシル、カルボキシメチル、ヒドロキシメチル、
アミノ、 Ｃ1−Ｃ6アルカノイルアミノ、保護基を有す
るアミノ、アミノメチル、 Ｃ1−Ｃ6アルキルスルホニ
ル、 Ｃ1−Ｃ6アルキルスルホニルアミノ、フェニル、
フェノキシ、フェニルチオ、フェニルスルホニル、フェ
ニルスルホニルアミノ、トルエンスルホニルアミノ、ま
たはＣ1−Ｃ6フルオロアルキルからなるグループから選
ばれる１個以上で置換されていてもよいフェニル基、ナ
フチル基、ビフェニル基などの芳香族基を表わす。この
基の代表的な例としては、１−ナフチル、２−ナフチ
ル、フェニル、２−ビフェニル、３−ビフェニル、４−
ビフェニル、２−ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシ
フェニル、４−ヒドロキシフェニル、２，４−ジヒドロ
キシフェニル、２−フルオロフェニル、３−フルオロフ
ェニル、４−フルオロフェニル、２，３−ジフルオロフ
ェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，６−ジフル
オロフェニル、３，４−ジフルオロフェニル、２，４，
６−トリフルオロフェニル、ペンタフルオロフェニル、
２−クロロフェニル、３−クロロフェニル、４−クロロ
フェニル、２，４−ジクロロフェニル、２，５−ジクロ
ロフェニル、２，６−ジクロロフェニル、３，４−ジク
ロロフェニル、３，５−ジクロロフェニル、２−ブロモ
フェニル、３−ブロモフェニル、４−ブロモフェニル、
３，４−ジブロモフェニル、３−クロロ−４−フルオロ
フェニル、２−メチルフェニル、３−メチルフェニル、
４−メチルフェニル、２，６−ジメチルフェニル、４−
エチルフェニル、４−プロピルフェニル、４−ブチルフ
ェニル、４−ｔ−ブチルフェニル、２−メトキシフェニ
ル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェニル、
２，３−ジメトキシフェニル、２，５−ジメトキシフェ
ニル、３，４−ジメトキシフェニル、３，５−ジメトキ
シフェニル、４−エトキシフェニル、４−（ヒドロキシ
メチル）フェニル、３−フルオロ−２−メチルフェニ
ル、２−フルオロ−５−メチルフェニル、２−トリフル
オロメチルフェニル、３−トリフルオロメチルフェニ
ル、４−トリフルオロメチルフェニル、２−フルオロ−
３−トリフルオロメチルフェニル、２−フルオロ−５−
トリフルオロメチルフェニル、３−トリフルオロメチル
−４−フルオロフェニル、３−トリフルオロメチル−５
−フルオロフェニル、２−クロロ−５−トリフルオロメ
チルフェニル、２−フェノキシフェニル、３−フェノキ
シフェニル、３−カルボキシフェニル、４−カルボキシ
フェニル、３−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、
２，４−ジニトロフェニル、４−シアノフェニル、４−
アミノフェニル、２，４−ビス（トリフルオロメチル）
フェニル、３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニ
ル、４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル、３，５−ジ
メチル−４−ヒドロキシフェニル、４−ヒドロキシ−３
−（ヒドロキシメチル）フェニル、２−アミノ−５−メ
チルフェニル、４−アミノ−３−トリフルオロメチルフ
ェニル、３−アミノ−４−ヒドロキシフェニル、２−メ
チル−４−ニトロフェニル、４−メトキシ−２−ニトロ
フェニル、および３−シアノ−４−ニトロフェニルなど
の基が挙げられる。
【００１０】「アリールアルキル」としては、１または
それ以上のアリールを有するＣ1−Ｃ4アルキル基を表わ
す。この代表的なものとしては、ベンジル、２−ニトロ
ベンジル、４−ニトロベンジル、１−フェニルエチル、
２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−フェ
ニルブチル、２−メチル−２−フェニルプロピル、（４
−クロロフェニル）メチル、（２，６−ジクロロフェニ
ル）メチル、ビス（２，６−ジクロロフェニル）メチ
ル、（４−ヒドロキシフェニル）メチル、（２，４−ジ
ニトロフェニル）メチル、トリフェニルメチル、（４−
メトキシフェニル）ジフェニルメチル、ビス（４−メト
キシフェニル）メチル、α−ナフチルジフェニルメチ
ル、ビス（２−ニトロフェニル）メチルなどが挙げられ
る。
【００１１】「芳香族複素環」としては、酸素，硫黄，
窒素のうちから選ばれる１個から４個の複素原子を含む
芳香族の５〜６員環、および、酸素，硫黄，窒素のうち
から選ばれる１個から４個の複素原子を含む芳香族の５
〜６員環と、ベンゼン環または酸素，硫黄，窒素のうち
から選ばれる１個から４個の複素原子を含む芳香族の５
〜６員環とで構成されるビシクロ環などが挙げられる。
これらの基の代表的なものとしては、フリル、チオフェ
ニル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イ
ソチアゾリル、イミダゾリル、ピリミジル、ベンゾフリ
ル、ベンゾチオフェニル、ベンズイミダゾリル、ベンズ
オキサゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリルなどが挙
げられる。
【００１２】「非芳香族複素環」としては、酸素，硫
黄，窒素のうちから選ばれる１個から２個の複素原子を
含む４〜７員環などが挙げられる。この基の代表的なも
のとしては、アゼチジン−１−イル，または−２−イ
ル、ピロリジン−１−イル，−２−イルまたは−３−イ
ル、ピペリジン−１−イル，−２−イル，−３−イルま
たは−４−イル、ヘキサヒドロアゼピン−１−イル，−
２−イル，−３−イルまたは−４−イル、オキセタン−
２−イルまたは−３−イル、テトラヒドロフラン−２−
イルまたは−３−イル、テトラヒドロピラン−２−イ
ル，−３−イルまたは−４−イル、ヘキサヒドロオキセ
ピン−２−イル，−３−イルまたは−４−イル、チエタ
ン−２−イルまたは−３−イル、テトラヒドロチオフェ
ン−２−イルまたは−３−イル、テトラヒドロチオピラ
ン−２−イル，−３−イルまたは−４−イル、ヘキサヒ
ドロチエピン−２−イル，−３−イルまたは−４−イ
ル、ピペラジン−１−イル，または−２−イル、モルフ
ォリン−１−イル，−２−イルまたは−３−イル、チオ
モルフォリン−１−イル，−２−イルまたは−３−イ
ル、テトラヒドロピリミジン−１−イル，−２−イル，
−４−イルまたは−５−イル、イミダゾリン−１−イ
ル，−２−イルまたは−４−イル、イミダゾリジン−１
−イル，−２−イルまたは−４−イル、オキサゾリン−
２−イル，−３−イル，−４−イルまたは−５−イル、
オキサゾリジン−２−イル，−３−イル，−４−イルま
たは−５−イル、チアゾリン−２−イル，−３−イル，
−４−イルまたは−５−イル、チアゾリジン−２−イ
ル，−３−イル，−４−イルまたは−５−イルなどが挙
げられる。
【００１３】「１個もしくは２個の芳香族炭化水素環ま
たは芳香族複素環と縮合した非芳香族炭化水素環」とし
ては、Ｃ3−Ｃ10環状アルキル基が、ベンゼン環もしく
は酸素，硫黄，窒素のうちから選ばれる１個から４個の
複素原子を含む芳香族の５〜６員環などと縮合した基が
挙げられる。この基の代表的なものとしては、インダニ
ル、１，２，３，４−テトラヒドロナフト−１−イルま
たは−２−イル、５，６，７，８−テトラヒドロキノリ
ン−５−イル，−６−イル，−７−イルまたは−８−イ
ル、５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリン−５−
イル，−６−イル，−７−イルまたは−８−イル、４，
５，６，７−テトラヒドロベンゾチオフェン−４−イ
ル，−５−イル，−６−イルまたは−７−イル、ジベン
ゾ［２，３，６，７］シクロヘプタン−１−イルまたは
−４−イル、ジベンゾ［２，３，６，７］シクロヘプト
−４−エン−１−イルまたは−４−イル、あるいは９−
フルオレニルなどが挙げられる。
【００１４】「１個もしくは２個の芳香族炭化水素環ま
たは芳香族複素環と縮合した非芳香族複素環」として
は、酸素，硫黄，窒素のうちから選ばれる１個から２個
の複素原子を含む非芳香族の４〜７員環基が、ベンゼン
環もしくは酸素，硫黄，窒素のうちから選ばれる１個か
ら４個の複素原子を含む芳香族の５〜６員環などと縮合
した基が挙げられる。この基の代表的なものとしては、
２，３−ジヒドロベンゾピラン−２−イル，−３−イル
または−４−イル、キサンテン−９−イル、１，２，
３，４−テトラヒドロキノリン−１−イル，−２−イ
ル，−３−イルまたは−４−イル、９，１０−ジヒドロ
アクリジン−９−イルまたは−１０−イル、２，３−ジ
ヒドロベンゾチオピラン−２−イル，−３−イルまたは
−４−イル、あるいはジベンゾチオピラン−４−イルな
どが挙げられる。
【００１５】本発明製造方法において用いられる一般式
（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘ
キサン−６−カルボン酸エステル類において、Ｒ1で示
される基としては例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プ
ロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル
基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル
基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル
基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、シクロヘキシル
基、シクロヘプチル基等の、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ハ
ロゲンもしくはニトロで１個以上置換されていてもよい
Ｃ1−Ｃ10アルキル基、あるいはアリル基、あるいはベ
ンジル基、４−クロロベンジル基、４−メトキシベンジ
ル基、４−ニトロベンジル基、４−メチルベンジル基、
２，４−ジメトキシベンジル基、２，４，６−トリメチ
ルベンジル基、α−フェニルエチル基、β−フェニルエ
チル基、フェニルプロピル基、ベンズヒドリル基、トリ
フェニルメチル基等の、芳香環上にＣ1−Ｃ8アルキル、
Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしくはニトロで１個
以上置換されていてもよいアリールアルキル基、あるい
はフェニル基、４−メチルフェニル基、４−クロロフェ
ニル基、４−メトキシフェニル基、４−ニトロフェニル
基、２−ナフチル基等の、芳香環上にＣ1−Ｃ8アルキ
ル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしくはニトロで
１個以上置換されていてもよいアリール基などが挙げら
れるが、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基、
イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ
−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペン
チル基、ネオペンチル基等のＣ1−Ｃ5アルキル基、ある
いはアリル基、あるいはベンジル基、４−クロロベンジ
ル基等の芳香環上に置換基を複数有していてもよいベン
ジル基、あるいはフェニル基、４−メチルフェニル基等
の芳香環上に置換基を複数有していてもよいフェニル基
が挙げられ、さらに好ましくは、メチル基、エチル基、
プロピル基またはｎ−ブチル基、イソブチル基等のＣ1
−Ｃ4アルキル基が挙げられる。かかるＲ1で示される基
は、場合によっては不斉炭素原子を有していてもよい。
【００１６】本発明製造方法において用いられる一般式
（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘ
キサン−６−カルボン酸エステル類において、 Ｘ1およ
びＸ2としては単結合、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＨ、ＮＨＣ
Ｏ、などが挙げられるが、好ましくは単結合が挙げられ
る。
【００１７】本発明製造方法において用いられる一般式
（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘ
キサン−６−カルボン酸エステル類において、Ｒ2およ
びＲ3で示される基としては例えば、水素原子、ハロゲ
ン原子またはニトロ基、あるいはメチル基、エチル基、
ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソ
ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペン
チル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシ
ル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、シクロヘキシ
ル基、シクロヘプチル基等の、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、
ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオールもし
くはチオアルキルで１個以上置換されていてもよいＣ1
−Ｃ10アルキル基、あるいはアリル基等の、 Ｃ1−Ｃ8
アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、
チオールもしくはチオアルキルで１個以上置換されてい
てもよいＣ2−Ｃ10アルケニル基、あるいはプロピニル
基等の、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲ
ン、アミノ、ニトロ、チオールもしくはチオアルキルで
１個以上置換されていてもよいＣ2−Ｃ10アルキニル
基、あるいは２−ナフチル基、フェニル基、２−フルオ
ロフェニル基、３−フルオロフェニル基、４−フルオロ
フェニル基、３，４−ジフルオロフェニル基、ペンタフ
ルオロフェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロ
フェニル基、４−クロロフェニル基、３，４−ジクロロ
フェニル基、２，５−ジクロロフェニル基、２−ブロモ
フェニル基、３−ブロモフェニル基、４−ブロモフェニ
ル基、２−メチルフェニル基、３−メチルフェニル基、
４−メチルフェニル基、２−メトキシフェニル基、３−
メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、３−ト
リフルオロメチルフェニル基、４−トリフルオロメチル
フェニル基、４−ニトロフェニル基等の、芳香環上にＣ
1−Ｃ8アルキル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、
ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオール、チオアルキルも
しくはフェニルで１個以上置換されていてもよいアリー
ル基あるいはベンジル基、２−フルオロベンジル基、３
−フルオロベンジル基、４−フルオロベンジル基、２，
３−ジフルオロベンジル基、２，４−ジフルオロベンジ
ル基、２，５−ジフルオロベンジル基、３，５−ジフル
オロベンジル基、３，４−ジフルオロベンジル基、２，
３，４−トリフルオロベンジル基、２−クロロベンジル
基、３−クロロベンジル基、４−クロロベンジル基、
２，３−ジクロロベンジル基、２−クロロ−５−トリフ
ルオロメチルベンジル基、３−クロロ−４−フルオロベ
ンジル基、２−メチルベンジル基、３−メチルベンジル
基、４−メチルベンジル基、４−フルオロ−３−メチル
ベンジル基、３−フルオロ−２−メチルベンジル基、
３，５−ジメチルベンジル基、４−イソプロピルベンジ
ル基、２，４−ジメチルベンジル基、２，５−ジメチル
ベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、２−
メトキシベンジル基、３−メトキシベンジル基、４−メ
トキシベンジル基、２，４−ジメトキシベンジル基、３
−フルオロ−４−メトキシベンジル基、３−メチル−４
−メトキシベンジル基、４−トリフルオロメチルベンジ
ル基、３−フルオロ−５−トリフルオロメチルベンジル
基、３−トリフルオロメトキシベンジル基、３−テトラ
フルオロエトキシベンジル基、４−フェニルベンジル
基、３−フェノキシベンジル基、３−（３−トリフルオ
ロメチルフェノキシ）ベンジル基、３−（４−クロロ−
フェノキシ）ベンジル基、４−ニトロベンジル基、α−
フェニルエチル基、β−フェニルエチル基、フェニルプ
ロピル基、ベンズヒドリル基、トリフェニルメチル基等
の、芳香環上にＣ1−Ｃ8アルキル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキ
シ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオール
もしくはチオアルキルもしくはフェニルで１個以上置換
されていてもよいアリールアルキル基、あるいは２−ピ
リミジル基等の、 Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケ
ニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニル、Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒド
ロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオールもしくは
チオアルキルで１個以上置換されていてもよい芳香族複
素環基、あるいはアゼチジン−１−イル基、アゼチジン
−２−イル基、ピロリジン−２−イル基、ピペリジン−
３−イル基等の、 Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケ
ニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニル、Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒド
ロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオールもしくは
チオアルキルで１個以上置換されていてもよい非芳香族
複素環基、あるいはインダニル基、１，２，３，４−テ
トラヒドロナフト−１−イル基等の、 Ｃ1−Ｃ8アルキ
ル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニル、Ｃ1−
Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニト
ロ、チオールもしくはチオアルキルで１個以上置換され
ていてもよい、１個もしくは２個の芳香族炭化水素環ま
たは芳香族複素環と縮合した非芳香族炭化水素環基、あ
るいは２，３−ジヒドロベンゾピラン−２−イル、キサ
ンテン−９−イル等の、 Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8
アルケニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニル、Ｃ1−Ｃ8アルコキ
シ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオール
もしくはチオアルキルで１個以上置換されていてもよ
い、１個もしくは２個の芳香族炭化水素環または芳香族
複素環と縮合した非芳香族複素環基が挙げられるが、好
ましくは水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、メチル基
またはアリル基等が挙げられ、さらに好ましくは水素原
子が挙げられる。
【００１８】かかる一般式（１）で示される２−オキソ
ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エス
テル類としては、例えば２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸メチルエステル、２−オ
キソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸
エチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘ
キサン−６−カルボン酸ｎ−プロピルエステル、２−オ
キソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸
イソプロピルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−ブチルエステル、２
−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボ
ン酸イソブチルエステル、２−オキソビシクロ［３．
１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｓｅｃ−ブチルエス
テル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６
−カルボン酸ｔ−ブチルエステル、２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−ペンチル
エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン
−６−カルボン酸イソペンチルエステル、２−オキソビ
シクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ネオペ
ンチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘ
キサン−６−カルボン酸−（ｎ−ヘキシル）エステル、
２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カル
ボン酸シクロヘキシルエステル、２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（ｎ−ヘプ
チル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘ
キサン−６−カルボン酸シクロヘプチルエステル、２−
オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン
酸−（ｎ−オクチル）エステル、２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸アリルエステ
ル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−
カルボン酸ベンジルエステル、２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−クロ
ロベンジル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メトキシベンジ
ル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキ
サン−６−カルボン酸−（４−ニトロベンジル）エステ
ル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−
カルボン酸−（４−メチルベンジル）エステル、２−オ
キソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸
−（２，４−ジメトキシベンジル）エステル、２−オキ
ソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−
（２，４，６−トリメチルベンジル）エステル、２−オ
キソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸
−（（Ｓ）−フェニルエチル）エステル、２−オキソビ
シクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−
（（Ｒ）−フェニルエチル）エステル、２−オキソビシ
クロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（β−
フェニルエチル）エステル、２−オキソビシクロ［３．
１．０］ヘキサン−６−カルボン酸フェニルプロピルエ
ステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸ベンズヒドリルエステル、２−オキソビ
シクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸トリフ
ェニルメチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸フェニルエステル、２−
オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン
酸−（４−メチルフェニル）エステル、２−オキソビシ
クロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−
クロロフェニル）エステル、２−オキソビシクロ［３．
１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メトキシフ
ェニル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］
ヘキサン−６−カルボン酸−（４−ニトロフェニル）エ
ステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸−（２−ナフチル）エステルなど、およ
び上記各化合物における３位および４位が、それぞれ独
立してハロゲン原子、ニトロ基、メチル基、エチル基、
ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソ
ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペン
チル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシ
ル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、シクロヘキシ
ル基、シクロヘプチル基、アリル基、プロピニル基、２
−ナフチル基、フェニル基、２−フルオロフェニル基、
３−フルオロフェニル基、４−フルオロフェニル基、
３，４−ジフルオロフェニル基、ペンタフルオロフェニ
ル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、
４−クロロフェニル基、３，４−ジクロロフェニル基、
２，５−ジクロロフェニル基、２−ブロモフェニル基、
３−ブロモフェニル基、４−ブロモフェニル基、２−メ
チルフェニル基、３−メチルフェニル基、４−メチルフ
ェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェ
ニル基、４−メトキシフェニル基、３−トリフルオロメ
チルフェニル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、
４−ニトロフェニル基、ベンジル基、２−フルオロベン
ジル基、３−フルオロベンジル基、４−フルオロベンジ
ル基、２，３−ジフルオロベンジル基、２，４−ジフル
オロベンジル基、２，５−ジフルオロベンジル基、３，
５−ジフルオロベンジル基、３，４−ジフルオロベンジ
ル基、２，３，４−トリフルオロベンジル基、２−クロ
ロベンジル基、３−クロロベンジル基、４−クロロベン
ジル基、２，３−ジクロロベンジル基、２−クロロ−５
−トリフルオロメチルベンジル基、３−クロロ−４−フ
ルオロベンジル基、２−メチルベンジル基、３−メチル
ベンジル基、４−メチルベンジル基、４−フルオロ−３
−メチルベンジル基、３−フルオロ−２−メチルベンジ
ル基、３，５−ジメチルベンジル基、４−イソプロピル
ベンジル基、２，４−ジメチルベンジル基、２，５−ジ
メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル
基、２−メトキシベンジル基、３−メトキシベンジル
基、４−メトキシベンジル基、２，４−ジメトキシベン
ジル基、３−フルオロ−４−メトキシベンジル基、３−
メチル−４−メトキシベンジル基、４−トリフルオロメ
チルベンジル基、３−フルオロ−５−トリフルオロメチ
ルベンジル基、３−トリフルオロメトキシベンジル基、
３−テトラフルオロエトキシベンジル基、４−フェニル
ベンジル基、３−フェノキシベンジル基、３−（３−ト
リフルオロメチルフェノキシ）ベンジル基、３−（４−
クロロ−フェノキシ）ベンジル基、４−ニトロベンジル
基、α−フェニルエチル基、β−フェニルエチル基、フ
ェニルプロピル基、ベンズヒドリル基、トリフェニルメ
チル基、２−ピリミジル基、アゼチジン−１−イル基、
アゼチジン−２−イル基、ピロリジン−２−イル基、ピ
ペリジン−３−イル基、インダニル基、１，２，３，４
−テトラヒドロナフト−１−イル基、２，３−ジヒドロ
ベンゾピラン−２−イル基、キサンテン−９−イル基等
で置換された化合物などが挙げられるが、好ましくは２
−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボ
ン酸メチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルエステル、２−オ
キソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸
ｎ−プロピルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸イソプロピルエステル、
２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カル
ボン酸ｎ−ブチルエステル、２−オキソビシクロ［３．
１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソブチルエステ
ル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−
カルボン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、２−オキソビシク
ロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｔ−ブチル
エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン
−６−カルボン酸ｎ−ペンチルエステル、２−オキソビ
シクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソペ
ンチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘ
キサン−６−カルボン酸ネオペンチルエステル、２−オ
キソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸
アリルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘ
キサン−６−カルボン酸ベンジルエステル、２−オキソ
ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−
（４−クロロベンジル）エステル、２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メト
キシベンジル）エステル、２−オキソビシクロ［３．
１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−ニトロベン
ジル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘ
キサン−６−カルボン酸−（４−メチルベンジル）エス
テル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６
−カルボン酸−（２，４−ジメトキシベンジル）エステ
ル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−
カルボン酸−（２，４，６−トリメチルベンジル）エス
テル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６
−カルボン酸フェニルエステル、２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メチ
ルフェニル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−クロロフェニ
ル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキ
サン−６−カルボン酸−（４−メトキシフェニル）エス
テル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６
−カルボン酸−（４−ニトロフェニル）エステルなど、
および上記各化合物における３位および４位が、それぞ
れ独立してハロゲン原子、ニトロ基、メチル基またはア
リル基等で置換された化合物などが挙げられ、さらに好
ましくは２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸メチルエステル、２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルエステ
ル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−
カルボン酸ｎ−プロピルエステル、２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソプロピル
エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン
−６−カルボン酸ｎ−ブチルエステル、２−オキソビシ
クロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソブチ
ルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサ
ン−６−カルボン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、２−オキ
ソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｔ
−ブチルエステルなどが挙げられる。
【００１９】本発明製造方法において用いることのでき
る一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．
１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類に対して
不斉加水分解能を有する酵素（以下、本酵素と記す）
は、微生物由来の酵素であってもよいし、動物由来の酵
素であってもよい。
【００２０】微生物由来の本酵素としては、例えばアク
ロモバクター（Achromobacter）属、アルカリゲネス（A
lcaligenes）属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、
アスペルギルス(Aspergillus)属、バチルス(Bacillus)
属、バークホルデリア(Burkholderia)属、キャンディダ
(Candida)属、クロモバクテリウム(Chromobacterium)
属、フミコーラ(Humicola)属、ムコール(Mucor)属、シ
ュードモナス(Pseudomonas)属、またはリゾムコール（R
hizomucor ）属の微生物由来の加水分解酵素を挙げるこ
とができ、好ましくは、アルスロバクター属、アスペル
ギルス属、バチルス属、バークホルデリア属、キャンデ
ィダ属、クロモバクテリウム属、フミコーラ属、シュー
ドモナス属の微生物由来の酵素を挙げることができ、特
に好ましくは、バチルス属、キャンディダ属、クロモバ
クテリウム属、シュードモナス属の微生物由来の酵素を
挙げることができる。また、これらの微生物由来の本酵
素としては、これらの微生物から突然変異剤もしくは紫
外線等の処理により誘導された突然変異体由来の酵素で
あっても、これらの微生物が有する本酵素をコードする
遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物により産
生される酵素であっても、あるいは遺伝子工学的手法に
より上記本酵素のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸が１
個ないしは数個、欠失、付加あるいは置換されてなる変
異型酵素であってもよく、一般式（１）で示される２−
オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン
酸エステル類に対して不斉加水分解能を有していれば本
発明製造方法に使用することができる。
【００２１】本酵素としてさらに具体的には、アスペル
ギルス・メレウス（Aspergillus melleus）、アスペル
ギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、バチルス・
リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス
・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・サー
モグルコシデシウス（Bacillus thermoglucosidasiu
s）、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepac
ia) 、キャンディダ・アンタークティカ（Candida anta
rctica）、キャンディダ・シリンドラッセ（Candida cy
lindracea）、キャンディダ・ルゴサ（Candida rugos
a）、クロモバクテリウム・ビスコサム（Chromobacteri
um viscosum） 、ムコール・ミーヘイ（Mucormiehe
i）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aer
uginosa） 、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas
cepacia）、シュードモナス・フルオレセン（Pseudomon
as fluorescens）、もしくはリゾムコール・ミーヘイ
（Rhizomucor miehei）等に属する微生物株由来、また
はクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−
１４００９）株、アルスロバクターＳＣ−６−９８−２
８（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６５８）株もしくはバークホル
デリア・セパシアＳＣ−２０株等由来の酵素を挙げるこ
とができ、好ましくは、アスペルギルス・オリザエ、バ
チルス・サーモグルコシデシウス、バークホルデリア・
セパシア、キャンディダ・アンタークティカ、キャンデ
ィダ・シリンドラッセ、キャンディダ・ルゴサ、もしく
はシュードモナス・アエルギノサに属する微生物株由
来、またはクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４００９）株、アルスロバクターＳＣ−６−
９８−２８（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６５８）株もしくはバ
ークホルデリア・セパシアＳＣ−２０株由来の酵素を挙
げることができ、特に好ましくは、バチルス・サーモグ
ルコシデシウス、キャンディダ・アンタークティカ、も
しくはキャンディダ・シリンドラッセに属する微生物株
由来、またはクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４００９）株由来の酵素を挙げることがで
きる。
【００２２】本酵素をコードする遺伝子が導入され形質
転換された組換え微生物を作製する方法としては、例え
ばJ.Ｓambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著；モレキュラ
ー クローニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edi
tion)、コールドスプリングハーバー ラボラトリー(Co
ld Spring Harbor Laboratory)発行、１９８９年、等に
記載の通常の遺伝子工学的手法に準じた方法を挙げるこ
とができる。さらに具体的には、特開平７−１６３３６
４号公報、特開平５−５６７８７号公報または特開平１
０−２１０９７５号公報記載の方法に準じた方法を挙げ
ることができる。このようにして作製することのできる
組換え微生物によって産生される本酵素の例としては、
アルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３６５８）由来のエステラーゼ（特開平５−５６
７８７号公報）、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４００９）由来のエステラーゼ（特
開平７−１６３３６４号公報）またはバークホルデリア
・セパシアＳＣ−２０株由来のリパーゼ（特開平１０−
２１０９７５号公報）等を挙げることができる。
【００２３】また、遺伝子工学的手法による変異型酵素
の作製方法としては、 例えば、Olfert Landtら（Gene
96 125-128 1990） の方法を挙げることができる。さら
に具体的には、特開平７−２１３２８０号公報記載の方
法に準じた方法を挙げることができる。このようにして
作製することのできる変異型酵素の例としては、クロモ
バクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ、ア
ルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラ
ーゼまたはバークホルデリア・セパシア由来のリパーゼ
から作製される変異型エステラーゼまたはリパーゼ等を
挙げることができる。
【００２４】本酵素を産生する微生物は、いずれも通常
の方法によって液体培養することができる。培地として
は、通常の微生物培養に使用される炭素源、窒素源、無
機物等を適宜含む各種の培地を使用することができる。
例えば、炭素源としては、グルコース、グリセリン、有
機酸、糖蜜など、窒素源としては、ペプトン、酵母エキ
ス、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティープリカー、綿
実粉、乾燥酵母、カザミノ酸、塩化アンモニウム、硝酸
アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素など、無機物と
しては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マ
ンガン、コバルト、亜鉛等の塩類、硫酸塩類、およびリ
ン酸塩類、具体的には、塩化カリウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩
化コバルト、硫酸亜鉛、リン酸カリウム、リン酸ナトリ
ウムなどを使用することができる。また、上記微生物の
有する一般式（１）で示される２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類の
不斉水解能を高めるために、オリーブ油またはトリブチ
リン等のトリグリセリドあるいは一般式（１）で示され
る２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カ
ルボン酸エステル類を適宜培地に添加してもよい。
【００２５】培養は、通常、好気的に行うのが良く、振
とう培養、または通気撹拌培養が適当である。培養温度
は、２０〜４０℃程度、好ましくは、２５〜３５℃程度
で、ｐＨは６〜８程度が好ましい。培養時間は、種々の
条件によって異なるが、１〜７日間程度が好ましい。ま
た、必要に応じて固体培養法も、一般式（１）で示され
る２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カ
ルボン酸エステル類の不斉水解能を有する微生物菌体が
得られる方法であれば適宜採用することができる。
【００２６】本酵素を、上記のようにして培養された微
生物培養物から精製するには、通常一般の酵素の精製に
おいて使用される方法に従って行えばよい。例えば、ま
ず超音波処理、ダイノミル処理あるいはフレンチプレス
処理等の方法により微生物培養物中の菌体の破砕を行
う。得られた破砕液から遠心分離等により不溶物を除去
した後、通常酵素の精製に使用される陽イオン交換カラ
ムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグ
ラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カ
ラムクロマトグラフィー等をひとつまたは複数適当に組
み合わせることによって目的の酵素を精製することがで
きる。これらカラムクロマトグラフィーに使用する担体
の一例として、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓ
ｔｆｌｏｗ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社
製）や ＢｕｔｙｌーＴｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ（東洋
曹達工業株式会社製）等を挙げることができる。
【００２７】動物由来の本酵素としては、例えば、豚内
蔵、牛内蔵、羊内蔵由来の酵素などが挙げられるが、さ
らに具体的には、豚腎臓、牛膵臓由来の加水分解酵素が
挙げられる。
【００２８】本酵素としては市販品の酵素を使用するこ
ともできる。本酵素の市販品としては、例えば、コレス
テロールエステラーゼ(cholesterol esterase)(Candida
rugosa由来)、キラザイム(CHIRAZYME)Ｅ−３(好熱性微
生物由来)、キラザイムＥ−４(好熱性微生物由来)、キ
ラザイムＥ−５、キラザイムＬ−２(Candida antarctic
a由来)、キラザイムＬ−５(Candida antarctica由来)、
キラザイムＬ−６(Pseudomonas cepacia由来)、キラザ
イムＬ−８(Humicola sp.由来)、キラザイムＬ−９(Muc
or miehei由来)、キラザイムＬ−１０(Alcalogines sp.
由来)、キラザイムＰ−１(Bacillus licheniformis由
来)（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Di
agnostics)社製）、リパーゼＯＦ(Candida cylindracea
由来)、リパーゼＡＬ(Achromobacter sp.由来)、リパー
ゼＱＬ(Alcaligenes sp.由来)、リパーゼＰＬ(Alcalige
nes sp.由来)（以上、名糖産業製）、トヨチーム(Pseud
omonas aeruginosa由来)（東洋紡績製）、プロテアーゼ
Ｐ(Aspergillus melleus由来)、プロテアーゼＮ(Bacill
us subtilis由来)、プロレザー(Bacillus sp.由来)、リ
パーゼＡＨ(Pseudomonas cepacia由来)、リパーゼＡＫ
(Pseudomonas fluorescens由来)（以上、天野製薬
製）、リポサム(Pseudomonas sp.由来)（昭和電工
製）、リパーゼ(Cromobacterium viscosum由来)（旭化
成製）、α−キモトリプシン(chymotrypsin)(ウシ膵臓
由来)、γ−キモトリプシン(ウシ膵臓由来)δ−キモト
リプシン(ウシ膵臓由来)（以上、シグマ(Sigma)社
製）、リパーゼ(lipase)(Mucor miehei由来)（Biocatal
ysts社製）、エステラーゼ(esterase)４６０５４(Bacil
lus thermoglucosidasius由来)、リパーゼ６２２８５(A
spergillus oryzae由来)、リパーゼ６２２９１(Rhizomu
cor miehei由来)（以上、フルカ(Fluka)社製）、キトパ
ール コレステロールエステラーゼ−ＣＥＮ(Pseudomon
as sp.由来)、キトパール リパーゼ−ＡＰ(Bacteria由
来)、キトパール リパーゼ−ＣＶ(Cromobacterium vis
cosum由来)（以上、富士紡績製）、コレステロールエス
テラーゼ(Pseudomonas sp.由来)、リパーゼ(Pseudomona
s sp.由来)、アシラーゼＩ(Acylase I)(豚腎臓由来)
（以上、和光純薬製）等が挙げられ、好ましくは、コレ
ステロールエステラーゼ(Candida rugosa由来)、キラザ
イムＥ−３(好熱性微生物由来)、キラザイムＥ−４(好
熱性微生物由来)、キラザイムＥ−５(好熱性微生物由
来)、キラザイムＬ−２(Candida antarctica由来)、キ
ラザイムＬ−５(Candida antarctica由来)、キラザイム
Ｌ−６(Pseudomonas cepacia由来)、キラザイムＬ−８
(Humicola sp.由来)（以上、ロシュ・ダイアグノスティ
ックス社製）、リパーゼＯＦ(Candida cylindracea由
来)（名糖産業製）、トヨチーム(Pseudomonas aerugino
sa由来)（東洋紡績製）、リポサム(Pseudomonas sp.由
来)（昭和電工製）、エステラーゼ４６０５４(Bacillus
thermoglucosidasius由来)、リパーゼ６２２８５(Aspe
rgillus oryzae由来)（以上、フルカ(Fluka)社製）、コ
レステロールエステラーゼ(Pseudomonas sp.由来)、リ
パーゼ(Pseudomonas sp.由来)（以上、和光純薬製）が
挙げられ、特に好ましくは、キラザイムＥ−４(好熱性
微生物由来)、キラザイムＬ−５(Candida antarctica由
来)、キラザイムＬ−６(Pseudomonas cepacia由来)（以
上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、リパーゼ
ＯＦ(Candida cylindracea由来)（名糖産業製）、エス
テラーゼ４６０５４(Bacillus thermoglucosidasius由
来)（以上、フルカ(Fluka)社製）が挙げられる。
【００２９】本酵素は、精製酵素、粗酵素、微生物培養
物、菌体、およびそれらの処理物などの種々の形態で用
いることができる。ここで処理物とは、例えば、凍結乾
燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消
化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物、または菌体の
アルカリ処理物等をいう。さらに、上記のような種々の
純度あるいは形態の酵素を、例えば、シリカゲルやセラ
ミックス等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等
への吸着法、ポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法
（例えばカラギーナンゲル法）、アルギン酸ゲル法、寒
天ゲル法等の公知方法により固定化して用いてもよい。
【００３０】かかる本酵素は、目的とする一般式（３）
で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］
ヘキサン−６−カルボン酸エステル類及び一般式（２）
で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］
ヘキサン−６−カルボン酸類に応じて適宜選択するとよ
い。酵素の使用量は反応時間の遅延や選択性の低下が起
こらないように適宜選択され、例えば精製酵素、粗酵
素、または市販品酵素を用いる場合、その使用量は一般
式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］
ヘキサン−６−カルボン酸エステル類に対して通常は
０．００１〜２重量倍、好ましくは０．００２〜０．５
重量倍であり、微生物培養物、菌体、およびそれらの処
理物を用いる場合、その使用量は一般式（１）で示され
る２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カ
ルボン酸エステル類に対して通常は０．０１〜２００重
量倍程度、好ましくは０．１〜５０重量倍程度である。
【００３１】不斉加水分解反応に用いられる水は、緩衝
水溶液であってもよい。緩衝水溶液としては、例えばリ
ン酸ナトリウム水溶液、リン酸カリウム水溶液などとい
ったリン酸アルカリ金属塩水溶液などの無機酸塩の緩衝
水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液な
どといった酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩の緩衝水
溶液などが挙げられる。かかる水の使用量は一般式
（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘ
キサン−６−カルボン酸エステル類に対して通常０．５
モル倍以上であればよく、場合によっては溶媒量用いら
れ、通常は２００重量倍以下である。
【００３２】不斉加水分解反応は、疎水性有機溶媒、親
水性有機溶媒などの有機溶媒の存在下に行われてもよ
い。かかる有機溶媒は、得られる一般式（３）で示され
る光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン
−６−カルボン酸エステル類及び一般式（２）で示され
る光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン
−６−カルボン酸類の光学純度がより向上するため好ま
しく用いられる。
【００３３】疎水性有機溶媒としては、例えばｔ−ブチ
ルメチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテ
ル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタ
ン、オクタン、イソオクタンなどの炭化水素類などが、
親水性有機溶媒としては、例えばｔ−ブタノール、メタ
ノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノー
ル、ｎ−ブタノールなどのアルコール類、テトラヒドロ
フランなどのエーテル類、ジメチルスルホキサイドなど
のスルホキサイド類、アセトンなどのケトン類、アセト
ニトリルなどのニトリル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミドなどのアミド類などがそれぞれ挙げられる。これら
の疎水性有機溶媒や親水性有機溶媒はそれぞれ単独また
は２種以上を組み合わせて用いられ、疎水性有機溶媒と
親水性有機溶媒とを組み合わせて用いてもよい。
【００３４】かかる有機溶媒を用いる場合、その使用量
は通常一般式（１）で示される２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類に
対して２００重量倍以下、好ましくは０．１〜１００重
量倍程度の範囲である。
【００３５】不斉加水分解反応は、例えば水、一般式
（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘ
キサン−６−カルボン酸エステル類および本酵素を混合
する方法により行われ、有機溶媒を用いる場合には該有
機溶媒、水、一般式（１）で示される２−オキソビシク
ロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類
および本酵素を混合すればよい。
【００３６】反応系のｐＨは本酵素による不斉加水分解
が選択性よく進行する値が適宜選択され、特に限定され
ないが、通常はｐＨ４〜１０程度の範囲である。反応温
度は、高すぎると酵素の安定性が低下する傾向にあり、
また低すぎると反応速度が低下する傾向にあるため、通
常５〜６５℃程度であり、好ましくは２０〜５０℃程度
の範囲である。
【００３７】かかる不斉加水分解によって一般式（１）
で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン
−６−カルボン酸エステル類の光学活性体が、＊で示さ
れる不斉炭素原子の周りの立体配置を維持したまま光学
選択的に加水分解されて、目的とする一般式（２）で示
される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキ
サン−６−カルボン酸類が生成する。
【００３８】反応後の反応混合物を水層と有機層とに分
液し、水層として一般式（２）で示される光学活性２−
オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン
酸類の水溶液を得る。先の反応において疎水性有機溶媒
を用いた場合などには、得られた反応混合物をそのまま
分液してもよいが、先の反応において疎水性有機溶媒を
用いなかった場合や、その使用量が少ないために容易に
は分液できない場合、あるいは水の使用量が少ないため
に容易には分液できない場合には、疎水性有機溶媒また
は水などを適宜加えた後に分液すればよい。疎水性有機
溶媒としては例えばｔ−ブチルメチルエーテル、イソプ
ロピルエーテルなどのエーテル類、トルエン、ヘキサ
ン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタ
ンなどの炭化水素類、ジクロロメタン、ジクロロエタ
ン、クロロホルム、クロロベンゼン、オルトジクロロベ
ンゼンなどのハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル、酢酸
メチル、酢酸ブチルなどのエステル類などが挙げられ
る。
【００３９】次いで、得られた一般式（２）で示される
光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸類の水溶液から水を留去することによっ
て、目的の一般式（２）で示される光学活性２−オキソ
ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類を
取り出すことができる。また、反応液に酸を加えた後、
適当な有機溶媒を用いて抽出し、その有機溶媒を留去す
ることによっても取り出すことができる。得られた一般
式（２）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．
１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類はさらに再結晶、
カラムクロマトグラフィーなどによって精製されてもよ
い。
【００４０】かくして得られる一般式（２）で示される
光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸類としては、例えば、（＋）−（１Ｓ，
５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキ
サン−６−カルボン酸および、（−）−（１Ｒ，５Ｓ，
６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸、および上記各化合物における３位およ
び４位が、それぞれ独立してハロゲン原子、ニトロ基、
メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル
基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、
ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオ
ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オ
クチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、アリ
ル基、プロピニル基、２−ナフチル基、フェニル基、２
−フルオロフェニル基、３−フルオロフェニル基、４−
フルオロフェニル基、３，４−ジフルオロフェニル基、
ペンタフルオロフェニル基、２−クロロフェニル基、３
−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、３，４−
ジクロロフェニル基、２，５−ジクロロフェニル基、２
−ブロモフェニル基、３−ブロモフェニル基、４−ブロ
モフェニル基、２−メチルフェニル基、３−メチルフェ
ニル基、４−メチルフェニル基、２−メトキシフェニル
基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル
基、３−トリフルオロメチルフェニル基、４−トリフル
オロメチルフェニル基、４−ニトロフェニル基、ベンジ
ル基、２−フルオロベンジル基、３−フルオロベンジル
基、４−フルオロベンジル基、２，３−ジフルオロベン
ジル基、２，４−ジフルオロベンジル基、２，５−ジフ
ルオロベンジル基、３，５−ジフルオロベンジル基、
３，４−ジフルオロベンジル基、２，３，４−トリフル
オロベンジル基、２−クロロベンジル基、３−クロロベ
ンジル基、４−クロロベンジル基、２，３−ジクロロベ
ンジル基、２−クロロ−５−トリフルオロメチルベンジ
ル基、３−クロロ−４−フルオロベンジル基、２−メチ
ルベンジル基、３−メチルベンジル基、４−メチルベン
ジル基、４−フルオロ−３−メチルベンジル基、３−フ
ルオロ−２−メチルベンジル基、３，５−ジメチルベン
ジル基、４−イソプロピルベンジル基、２，４−ジメチ
ルベンジル基、２，５−ジメチルベンジル基、２，４，
６−トリメチルベンジル基、２−メトキシベンジル基、
３−メトキシベンジル基、４−メトキシベンジル基、
２，４−ジメトキシベンジル基、３−フルオロ−４−メ
トキシベンジル基、３−メチル−４−メトキシベンジル
基、４−トリフルオロメチルベンジル基、３−フルオロ
−５−トリフルオロメチルベンジル基、３−トリフルオ
ロメトキシベンジル基、３−テトラフルオロエトキシベ
ンジル基、４−フェニルベンジル基、３−フェノキシベ
ンジル基、３−（３−トリフルオロメチルフェノキシ）
ベンジル基、３−（４−クロロ−フェノキシ）ベンジル
基、４−ニトロベンジル基、α−フェニルエチル基、β
−フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ベンズヒド
リル基、トリフェニルメチル基、２−ピリミジル基、ア
ゼチジン−１−イル基、アゼチジン−２−イル基、ピロ
リジン−２−イル基、ピペリジン−３−イル基、インダ
ニル基、１，２，３，４−テトラヒドロナフト−１−イ
ル基、２，３−ジヒドロベンゾピラン−２−イル基、キ
サンテン−９−イル基等で置換された化合物などが挙げ
られる。
【００４１】なお、不斉加水分解に際して加水分解され
なかった他方の光学活性体である一般式（３）で示され
る２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カ
ルボン酸エステル類は、分液後の有機層に含まれてお
り、これは溶媒留去などの方法によって容易に有機層か
ら取り出すことができる。得られた一般式（３）で示さ
れる光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサ
ン−６−カルボン酸エステル類はさらに再結晶、カラム
クロマトグラフィーなどによって精製されてもよい。
【００４２】かくして得られる一般式（３）で示される
光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸エステル類としては、例えば、（１Ｓ，
５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキ
サン−６−カルボン酸メチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，
６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸エチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）
−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カ
ルボン酸ｎ−プロピルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）
−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カ
ルボン酸イソプロピルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）
−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カ
ルボン酸ｎ−ブチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−
２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カル
ボン酸イソブチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２
−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボ
ン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−
２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カル
ボン酸ｔ−ブチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２
−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボ
ン酸ｎ−ペンチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２
−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボ
ン酸イソペンチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２
−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボ
ン酸ネオペンチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２
−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボ
ン酸−（ｎ−ヘキシル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６
Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６
−カルボン酸シクロヘキシルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，
６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸−（ｎ−ヘプチル）エステル、（１Ｓ，
５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキ
サン−６−カルボン酸シクロヘプチルエステル、（１
Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］
ヘキサン−６−カルボン酸−（ｎ−オクチル）エステ
ル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．
１．０］ヘキサン−６−カルボン酸アリルエステル、
（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸ベンジルエステル、（１
Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］
ヘキサン−６−カルボン酸−（４−クロロベンジル）エ
ステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メト
キシベンジル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−
オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン
酸−（４−ニトロベンジル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，
６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸−（４−メチルベンジル）エステル、
（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸−（２，４−ジメトキシ
ベンジル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキ
ソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−
（２，４，６−トリメチルベンジル）エステル、（１
Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］
ヘキサン−６−カルボン酸−（（Ｓ）−フェニルエチ
ル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシ
クロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−
（（Ｒ）−フェニルエチル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，
６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸−（β−フェニルエチル）エステル、
（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸フェニルプロピルエステ
ル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．
１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ベンズヒドリルエス
テル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸トリフェニル
メチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビ
シクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸フェニ
ルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシク
ロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メ
チルフェニル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−
オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン
酸−（４−クロロフェニル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，
６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸−（４−メトキシフェニル）エステル、
（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−ニトロフェニ
ル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシ
クロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（２−
ナフチル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキ
ソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸メ
チルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシ
クロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルエ
ステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−プロピル
エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソプロピル
エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−ブチルエ
ステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソブチルエ
ステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｓｅｃ−ブチ
ルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシク
ロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｔ−ブチル
エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−ペンチル
エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソペンチル
エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ネオペンチル
エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（ｎ−ヘキ
シル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビ
シクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸シクロ
ヘキシルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソ
ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−
（ｎ−ヘプチル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２
−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボ
ン酸シクロヘプチルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−
２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カル
ボン酸−（ｎ−オクチル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６
Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６
−カルボン酸アリルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−
２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カル
ボン酸ベンジルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−
オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン
酸−（４−クロロベンジル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，
６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸−（４−メトキシベンジル）エステル、
（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−ニトロベンジ
ル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシ
クロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−
メチルベンジル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２
−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボ
ン酸−（２，４−ジメトキシベンジル）エステル、（１
Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］
ヘキサン−６−カルボン酸−（２，４，６−トリメチル
ベンジル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキ
ソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−
（（Ｓ）−フェニルエチル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，
６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸−（（Ｒ）−フェニルエチル）エステ
ル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．
１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（β−フェニルエ
チル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビ
シクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸フェニ
ルプロピルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキ
ソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ベ
ンズヒドリルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オ
キソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸
トリフェニルメチルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−
２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カル
ボン酸フェニルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−
オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン
酸−（４−メチルフェニル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，
６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸−（４−クロロフェニル）エステル、
（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メトキシフェニ
ル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシ
クロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−
ニトロフェニル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２
−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボ
ン酸−（２−ナフチル）エステル、および上記各化合物
における３位および４位が、それぞれ独立してハロゲン
原子、ニトロ基、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル
基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ
ｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソ
ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘ
プチル基、ｎ−オクチル基、シクロヘキシル基、シクロ
ヘプチル基、アリル基、プロピニル基、２−ナフチル
基、フェニル基、２−フルオロフェニル基、３−フルオ
ロフェニル基、４−フルオロフェニル基、３，４−ジフ
ルオロフェニル基、ペンタフルオロフェニル基、２−ク
ロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフ
ェニル基、３，４−ジクロロフェニル基、２，５−ジク
ロロフェニル基、２−ブロモフェニル基、３−ブロモフ
ェニル基、４−ブロモフェニル基、２−メチルフェニル
基、３−メチルフェニル基、４−メチルフェニル基、２
−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−
メトキシフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル
基、４−トリフルオロメチルフェニル基、４−ニトロフ
ェニル基、ベンジル基、２−フルオロベンジル基、３−
フルオロベンジル基、４−フルオロベンジル基、２，３
−ジフルオロベンジル基、２，４−ジフルオロベンジル
基、２，５−ジフルオロベンジル基、３，５−ジフルオ
ロベンジル基、３，４−ジフルオロベンジル基、２，
３，４−トリフルオロベンジル基、２−クロロベンジル
基、３−クロロベンジル基、４−クロロベンジル基、
２，３−ジクロロベンジル基、２−クロロ−５−トリフ
ルオロメチルベンジル基、３−クロロ−４−フルオロベ
ンジル基、２−メチルベンジル基、３−メチルベンジル
基、４−メチルベンジル基、４−フルオロ−３−メチル
ベンジル基、３−フルオロ−２−メチルベンジル基、
３，５−ジメチルベンジル基、４−イソプロピルベンジ
ル基、２，４−ジメチルベンジル基、２，５−ジメチル
ベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、２−
メトキシベンジル基、３−メトキシベンジル基、４−メ
トキシベンジル基、２，４−ジメトキシベンジル基、３
−フルオロ−４−メトキシベンジル基、３−メチル−４
−メトキシベンジル基、４−トリフルオロメチルベンジ
ル基、３−フルオロ−５−トリフルオロメチルベンジル
基、３−トリフルオロメトキシベンジル基、３−テトラ
フルオロエトキシベンジル基、４−フェニルベンジル
基、３−フェノキシベンジル基、３−（３−トリフルオ
ロメチルフェノキシ）ベンジル基、３−（４−クロロ−
フェノキシ）ベンジル基、４−ニトロベンジル基、α−
フェニルエチル基、β−フェニルエチル基、フェニルプ
ロピル基、ベンズヒドリル基、トリフェニルメチル基、
２−ピリミジル基、アゼチジン−１−イル基、アゼチジ
ン−２−イル基、ピロリジン−２−イル基、ピペリジン
−３−イル基、インダニル基、１，２，３，４−テトラ
ヒドロナフト−１−イル基、２，３−ジヒドロベンゾピ
ラン−２−イル基、キサンテン−９−イル基等で置換さ
れた化合物などが挙げられる。
【００４３】
【発明の効果】本発明の方法によれば、特定の酵素を用
いることによって、一般式（２）で示される光学活性２
−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボ
ン酸類および一般式（３）で示される光学活性２−オキ
ソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エ
ステル類を、容易に効率よく製造することができる。
【００４４】
【実施例】以下、実施例により本発明をより詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
【００４５】実施例中、ラセミの（１ＳＲ，５ＲＳ，６
ＳＲ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸エチルとは、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２
−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボ
ン酸エチルと（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシク
ロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルとの
等量混合物を示す。
【００４６】実施例１〜８ 表１に示した種々の市販の本酵素を表２に示した量、１
００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに加え溶解
させた。これにラセミの（１ＳＲ，５ＲＳ，６ＳＲ）−
２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カル
ボン酸エチル１０ｍｇをｎ−ヘキサン１ｍｌに溶解して
加え、４０℃に昇温し、攪拌した。表２に反応時間とし
て示した時間後、反応液の一部を取って、ＨＰＬＣ〔カ
ラム：スミキラル ＯＡ−５０００、４．６ｍｍφ×１
５ｃｍ（住化分析センター社製）〕にて分析し、生成し
た２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カ
ルボン酸の光学純度および反応収率を求めた。（−）−
（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸が過剰に得られた。結果
を表２に示す。
【００４７】実施例９〜３６ 表３に示した種々の市販酵素を表４に示した量、１００
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに加え溶解させ
た。これにラセミの（１ＳＲ，５ＲＳ，６ＳＲ）−２−
オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン
酸エチル１０ｍｇをｎ−ヘキサン１ｍｌに溶解して加
え、４０℃に昇温し、攪拌した。表４に反応時間として
示した時間後、反応液の一部を取って、実施例１〜８と
同様にして分析し、生成した２−オキソビシクロ［３．
１．０］ヘキサン−６−カルボン酸の光学純度および反
応収率を求めた。（＋）−（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−
オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン
酸が過剰に得られた。結果を表４に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
【表２】
【００５０】
【表３】
【００５１】
【表４】
【００５２】参考例１ クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の本酵素遺伝
子が導入され形質転換された組換え微生物は特開平７−
２１３２８０号公報記載の方法に準じて作製した。即
ち、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１４００９）由来のエステラーゼ遺伝子に部位特異
的変異が導入された遺伝子を含むプラスミド ｐＣＣＡ
３６３ｔｅｒｍ、 ｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍ、
ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍおよびｐＣＣ１
６０Ｓ１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍを構築し、それぞれを大
腸菌ＪＭ１０９株に導入することにより組換え微生物を
作製した。以下に、これら組換え微生物の作製方法に付
いて記す。
【００５３】１．変異プライマーの作製 アミノ酸置換Ａｓｎ４３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ１６０Ｓｅｒ、
Ｇｌｙ１８９Ｔｙｒ、Ｇｌｙ１８９ＰｈｅまたはＡｌａ
３６３Ｔｅｒｍ（終始コドン）を導入するための変異プ
ライマーとして、各アミノ酸に対応する塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチド（変異プライマーＮ４３Ｓ（配列
番号１）、１６０Ｓ（配列番号２）、１８９Ｙ（配列番
号３）、１８９Ｆ（配列番号４）、Ａ３６３Ｔｅｒｍ
（配列番号５）、ＲＶ−Ｇ（配列番号６）、ＲＶ−Ｃ
（配列番号７）、ＲＶ−Ｄ（配列番号８）、 ＭＹ−３
（配列番号９）、ＭＹ−１（配列番号１０）、ＭＹ−２
（配列番号１１））を合成した。これらの変異プライマ
ーはアプライドバイオシステムズ社製ＤＮＡ合成機３９
４型を用いて合成した後、同社製のオリゴヌクレオチド
精製カートリッジにて精製した。
【００５４】２．部位特異的変異の導入 変異エステラーゼを、 Olfert Landtら（Gene 96 125-1
28 1990） の方法に準じて作製した。
【００５５】２−１）プラスミドｐＣＣＮ４３Ｓの作製 クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エス
テラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＣＣ１０１（図１）
を、特開平７−２１３２８０号公報の実施例１〜５記載
の方法に準じて作製した。こうして得られたｐＣＣ１０
１ ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、変異プライマ−ＲＶ
−Ｇ（配列番号６） （１００ｐｍｏｌ）、変異プライ
マーＮ４３Ｓ（配列番号１）（１００ｐｍｏｌ）および
GeneAmpTM PCR Reagent キット（宝酒造株式会社製）を
用いてＰＣＲを行うことによりＤＮＡ断片を増幅した。
得られたＰＣＲ産物（１９０ｂｐ断片）をＳＵＰＲＥＣ
−０２（宝酒造株式会社製）カラムを使用して精製し
た。続いて、同様にｐＣＣ１０１ ５００ｎｇを鋳型Ｄ
ＮＡとし、変異プライマーＭＹ−３（配列番号９）（５
０ｐｍｏｌ）および先に調製した１９０ｂｐＤＮＡ断片
（５０ｐｍｏｌ）をプライマーとしてGeneAmpTM PCR Re
agentキットを用いてＰＣＲを行うことによりＤＮＡ断
片を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素Ｎｄｅ
ＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉで消化し、サンプルを４％ア
ガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ宝
酒造株式会社製）で電気泳動後、約３７０ｂｐのＤＮＡ
断片を回収し、ジーンクリーンＤＮＡ精製キット（バイ
オ１０１社製）を用いて精製した。一方、ｐＣＣ１０１
３μｇをＮｄｅＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉで消化し、
アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐ
ＣＣ１０１のＮｄｅＩ−Ｂｐｕ１１０２Ｉ断片（４.２
Ｋｂｐ） と先に作製した変異の導入されたＮｄｅＩ-Ｂ
ｐｕ１１０２Ｉ断片（２４０ｂｐ）をＤＮＡライゲーシ
ョンキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、大腸
菌ＪＭ１０９株に導入し、ｐＣＣＮ４３Ｓを作製した
（図２）。
【００５６】２−２)プラスミドｐＣＣ１６０Ｓの作製 プラスミドｐＣＣ１０１（０．５μｇ）を鋳型ＤＮＡと
し、変異プライマ−ＭＹ−１（配列番号１０）（１００
ｐｍｏｌ）、変異プライマー１６０Ｓ（配列番号２）
（１００ｐｍｏｌ）およびGeneAmp PCR Reagentキット
（宝酒造株式会社製）を用いてＰＣＲを行うことにより
ＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物（２７０ｂ
ｐＤＮＡ断片）をＳＵＰＲＥＣ−０２カラム（宝酒造株
式会社製）を使用して精製した。続いて、同様にプラス
ミドｐＣＣ１０１（０．５μｇ）を鋳型ＤＮＡとし、変
異プライマーＲＶ−Ｃ（配列番号７）（５０ｐｍｏｌ）
および先に調製した２７０ｂｐＤＮＡ断片（５０ｐｍｏ
ｌ）をプライマーとしてGeneAmp PCR Reagentキット
（宝酒造株式会社製）を用いてＰＣＲを行いＤＮＡ断片
を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＣｅｌＩ
ＩＩおよびＣｌａＩで消化し、サンプルを４％アガロー
スゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ宝酒造株
式会社製）で電気泳動後、約２４０ｂｐのＤＮＡ断片を
回収し、ジーンクリーンＤＮＡ精製キット（Ｂｉｏ１０
１社製）を用いて精製した。一方、プラスミドｐＣＣ１
０１（３μｇ）を制限酵素ＣｅｌＩＩＩおよびＣｌａＩ
で消化後、アルカリフォスファターゼ処理を行った。つ
いでこのＤＮＡ断片（４.２ｋｂｐ）と先に作製した変
異の導入された約２４０ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライ
ゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結
し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、プラスミドｐＣＣ１
６０Ｓを作製した。
【００５７】２−３）プラスミドｐＣＣ１８９Ｙの作製 ｐＣＣ１６０Ｓの作製の場合に用いた変異プライマー１
６０Ｓに替えて変異プライマー１８９Ｙ（配列番号３）
を使用して、その他はプラスミドｐＣＣ１６０Ｓの作製
の場合と同様にして、プラスミドｐＣＣ１８９Ｙを作製
した。
【００５８】２−４）プラスミドｐＣＣ１８９Ｆの作製 ｐＣＣ１６０Ｓの作製の場合に用いた変異プライマー１
６０Ｓに替えて変異プライマー１８９Ｆ（配列番号４）
を使用して、その他はプラスミドｐＣＣ１６０Ｓの作製
の場合と同様にして、プラスミドｐＣＣ１８９Ｆを作製
した。
【００５９】２−５）ｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍの作製 ｐＣＣ１０１ ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、変異プラ
イマ−ＭＹ−２（配列番号１１） （１００ｐｍｏ
ｌ）、変異プライマーＡ３６３ｔｅｒｍ（配列番号５）
（１００ｐｍｏｌ）およびGeneAmpTM PCR Reagent キッ
ト（宝酒造株式会社製）を用いてＰＣＲを行いＤＮＡ断
片を増幅した。得られたＰＣＲ産物（１５０ｂｐ断片）
をＳＵＰＲＥＣ−０２（宝酒造株式会社製）カラムを使
用して精製した。続いて、同様にｐＣＣ１０１ ５００
ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、変異プライマーＲＶ−Ｄ（配列
番号５）（５０ｐｍｏｌ）および先に精製した１５０ｂ
ｐＤＮＡ断片（５０ｐｍｏｌ）をプライマーとしてGene
AmpTM PCR Reagentキットを用いてＰＣＲを行いＤＮＡ
断片を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素Ｂｓ
ｔＰＩおよびＸｂａＩで消化し、サンプルを４％アガロ
ースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ宝酒造
株式会社製）で電気泳動後、約２２０ｂｐのＤＮＡ断片
を分離し、ジーンクリーンＤＮＡ精製キットを用いて精
製した。一方、ｐＣＣ１０１ ３μｇをＢｓｔＰＩおよ
びＸｂａＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を
行った。ついでこのｐＣＣ１０１のＢｓｔＰＩ−Ｘｂａ
Ｉ断片（４.２Ｋｂｐ） と先に作製した変異の導入され
たＢｓｔＰＩ−ＸｂａＩ断片（２２０ｂｐ）をＤＮＡラ
イゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結
し、通常の方法に従って大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、
ｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍ（図３）を作製した。
【００６０】３．多重変異の導入 ３−１）ｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍの作製 2-1)で得られたｐＣＣＮ４３Ｓ １０μｇをＮｄｅＩお
よびＢｐｕ１１０２Ｉで消化して３７０ｂｐの断片を得
た。一方、2-5)で得られたｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍ ３
μｇをＮｄｅＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉで消化し、アル
カリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＣＣ
Ａ３６３ｔｅｒｍのＮｄｅＩ−Ｂｐｕ１１０２Ｉ断片
（４．２ＫｂＰ）と先に作製したＮｄｅＩ−Ｂｐｕ１１
０２Ｉ断片（３７０ｂｐ）をＤＮＡライゲーションキッ
ト（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１
０９株に導入し、多重変異型エステラーゼ遺伝子を含有
するプラスミドｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍを得た
（図４）。
【００６１】３−２）プラスミドｐＣＣ１６０Ｓ１８９
ＹＡ３６３ｔｅｒｍの作製 2-2)で得られた変異体プラスミドｐＣＣ１６０Ｓ（１０
μｇ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＦｓｐＩで消化して
得られた０. ６ｋｂｐのＤＮＡ断片、2-3)で得られた変
異体プラスミドｐＣＣ１８９Ｙ（１０μｇ）をＦｓｐＩ
およびＢｓｔＰＩで消化して得られた０.４ｋｂｐの断
片および2-5)で得られたプラスミドｐＣＣＡ３６３ｔｅ
ｒｍ（３μｇ）を制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＥｃｏＲＩ
で消化して得られた３. ４ｋｂｐのＤＮＡ断片の３種の
ＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式
会社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入
し、多重変異型エステラーゼ遺伝子を含有するプラスミ
ドｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍを得た。
【００６２】３−３）プラスミドｐＣＣ１６０Ｓ１８９
ＦＡ３６３ｔｅｒｍの作製 2-2)で得られた変異体プラスミドｐＣＣ１６０Ｓ（１０
μｇ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＦｓｐＩで消化して
得られた０. ６ｋｂｐのＤＮＡ断片、2-4)で得られた変
異体プラスミドｐＣＣ１８９Ｆ（１０μｇ）をＦｓｐＩ
およびＢｓｔＰＩで消化して得られた０.４ｋｂｐの断
片および2-5)で得られたプラスミドｐＣＣＡ３６３ｔｅ
ｒｍ（３μｇ）を制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＥｃｏＲＩ
で消化して得られた３. ４ｋｂｐのＤＮＡ断片の３種の
ＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式
会社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入
し、多重変異型エステラーゼ遺伝子を含有するプラスミ
ドｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＦＡ３６３ｔｅｒｍを得た。
【００６３】４．形質転換体の作製 プラスミドｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍ、ｐＣＣ１
６０Ｓ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ、ｐＣＣ１６０Ｓ１８
９ＦＡ３６３ｔｅｒｍおよびｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍ
を、大腸菌ＪＭ１０９株にそれぞれ導入し、組換え微生
物ＪＭ１０９／ｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍ、 Ｊ
Ｍ１０９／ ｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒ
ｍ、 ＪＭ１０９／ ｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＦＡ３６３ｔ
ｅｒｍおよびＪＭ１０９／ ｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍを
調製した。
【００６４】参考例２ ５００ｍｌ容三角フラスコに液体培地（水１Ｌにグリセ
ロ−ル５ｇ、酵母エキス６ｇ及びリン酸一カリウム９
ｇ、リン酸二カリウム４ｇを溶解し、ｐＨ７．０とす
る。）１００ｍｌを入れて滅菌した後、アンピシリンを
５０μｇ／ｍｌになるように加え、参考例１にて調製さ
れた組換え微生物ＪＭ１０９／ ｐＣＣＮ４３ＳＡ３６
３ｔｅｒｍの斜面培養から１白金耳接種し、３０℃で２
４時間回転振とう培養した。次に３Ｌ容の小型培養槽
（丸菱バイオエンジ社製、ＭＤＬ型）に滅菌した液体培
地（水１Ｌにグリセロ−ル１５ｇ、酵母エキス２５ｇ及
びリン酸一カリウム０．４ｇ、硫酸マグネシウム２ｇ硫
酸第一鉄０．１ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）１５
００ｍｌを仕込み、そこへ上記の三角フラスコで培養し
た培養液１５ｍｌを接種した。３０℃で通気攪拌培養
し、対数増殖期中期（培養１０〜１５時間）にＩＰＴＧ
（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度
１ｍＭになるように添加した後、滅菌した培地を流加
し、さらに培養を継続、計４０時間培養することによ
り、上記微生物培養物を得た。
【００６５】参考例３〜６ 参考例２と同様にして、 遺伝子組換え微生物ＪＭ１０
９／ ｐＣＣ１６０Ａ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ、 ＪＭ
１０９／ ｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ、
ＪＭ１０９／ ｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＦＡ３６３ｔｅｒ
ｍおよびＪＭ１０９／ ｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍのそれ
ぞれの微生物培養物を得た。
【００６６】参考例７ 参考例２と同様に培養して得られた組換え微生物ＪＭ１
０９／ ｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍの微生物培養
物を遠心分離（１２０００×ｇ、３０分間、４℃）し湿
菌体を得た。この湿菌体を超音波処理（２０ＫＨｚ、１
５分間、４℃）した後、遠心分離（１２０００×ｇ、３
０分間、４℃）を行い、その上清を得た。得られた上清
１５０ｍｌを陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅｆａｓｔｆｌｏｗ ファルマシア社製）２００
ｍｌを充填したカラムに通した。０.１５ＭＮａＣｌ＋
１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）でカラムを洗
浄した後、０.１５ー０.３５ＭＮａＣｌ直線濃度勾配法
にて目的酵素を溶出した。溶出画分の活性測定はエステ
ラーゼの一般的な基質であるｐ-ニトロフェニルアセテ
ート（ｐＮＰＡ）を用いて行った。具体的には、溶出画
分を含む１．０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.
５）に、アセトニトリルに溶解した基質を５ｍＭになる
ように加え、３７℃で保温し、４１０ｎｍの吸光度の増
加を測定した。エステラーゼ活性のある画分を集め、該
画分を疎水性樹脂（ＢｕｔｙｌーＴｏｙｏｐｅａｒｌ６
５０Ｓ、東洋曹達工業社製）２００ｍｌを充填したカラ
ムに通した。１０％(W/V)の（ＮＨ4）2ＳＯ4 ＋１０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）でカラムを洗浄した
後、１０ー０％(W/V) 飽和硫酸アンモニウム直線濃度勾
配法にて目的酵素を溶出した。エステラーゼ活性のある
画分を集め、精製酵素を得た（以下、この精製エステラ
ーゼをＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍ と記す）。
【００６７】参考例８〜１１ 組換え微生物ＪＭ１０９／ ｐＣＣ１６０Ａ１８９ＹＡ
３６３ｔｅｒｍ、 ＪＭ１０９／ ｐＣＣ１６０Ｓ１８９
ＹＡ３６３ｔｅｒｍ、 ＪＭ１０９／ ｐＣＣ１６０Ｓ１
８９ＦＡ３６３ｔｅｒｍおよびＪＭ１０９／ ｐＣＣＡ
３６３ｔｅｒｍの微生物培養物から参考例７と同様にし
てそれぞれ精製酵素を得た（以下、これらの精製エステ
ラーゼを １６０Ａ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ、１６０
Ｓ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ、１６０Ｓ１８９ＦＡ３６
３ｔｅｒｍおよびＡ３６３ｔｅｒｍと記す）。
【００６８】参考例１２ アルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来の本酵素
遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物を特開平
５−５６７８７号公報記載の方法に準じて作成した。即
ち、特開平５−５６７８７号公報の実施例記載の方法に
準じてアルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来の
エステラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＡＧＥ−１を作
製した。これを制限酵素ＮｓｐＶ、ＨｉｎｄＩＩＩで消
化することによりエステラーゼの翻訳領域を切り出し、
エステラーゼ遺伝子の開始コドンＧＴＧをＡＴＧに変換
するために合成したＤＮＡ断片および、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＵＣ１
１８（宝酒造株式会社製）とライゲーションを行った。
このようにして、ｐＵＣ１１８が保有するｌａｃプロモ
ーターの下流にアルスロバクターＳＣ−６−９８−２８
株由来のエステラーゼ遺伝子を有する大腸菌用発現プラ
スミドを構築した後、大腸菌ＪＭ１０５株に導入するこ
とにより組換え微生物を調製した。
【００６９】参考例１３ ５００ｍｌ容三角フラスコに液体培地（水１Ｌにグリセ
ロ−ル５ｇ、酵母エキス６ｇ及びリン酸一カリウム９
ｇ、リン酸二カリウム４ｇを溶解し、ｐＨ７．０とす
る。）１００ｍｌを入れて滅菌した後、アンピシリンを
５０μｇ／ｍｌになるように加え、参考例１２で示した
方法で作製された組換え微生物の斜面培養から１白金耳
接種し、３０℃で２４時間回転振とう培養した。次に３
Ｌ容の小型培養槽（丸菱バイオエンジ社製、ＭＤＬ型）
に滅菌した液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル１５ｇ、酵
母エキス２５ｇ及びリン酸一カリウム０．４ｇ、硫酸マ
グネシウム２ｇ硫酸第一鉄０．１ｇを溶解し、ｐＨ７．
０とする。）１５００ｍｌを仕込み、そこへ上記の三角
フラスコで培養した培養液１５ｍｌを接種した。３０℃
で通気攪拌培養を始め、対数増殖期中期（培養１０〜１
５時間）にＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラ
クトシド）を終濃度１ｍＭになるように添加した後、滅
菌した培地を流加し、さらに培養を継続、計４０時間培
養することにより、微生物培養物を得た。
【００７０】参考例１４ バークホルデリア・セパシアＳＣ−２０株由来の本酵素
遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物ＪＭ１０
９／ｐＡＬ６１２株（ＦＥＲＭ−ＢＰ５７４０）を、５
０ｍｇ／Ｌのアンピシリンと１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプ
ロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を含む１００ｍｌ
のＬＢ培地（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製）で、３７
℃、１６時間培養した後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、
１０分間）することにより菌体を回収した。回収された
菌体を、１０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に懸濁した後、超音波処理（１０分間）し、該処理
物を遠心分離することにより粗酵素抽出液を得た。さら
に得られた粗酵素抽出液を凍結乾燥することにより粗酵
素粉末を得た。
【００７１】実施例３７〜４１ 参考例７〜１１で得られた精製酵素を、表５に示したよ
うに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに
加え懸濁させた。これにラセミの（１ＳＲ，５ＲＳ，６
ＳＲ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
６−カルボン酸エチル１０ｍｇをｎ−ヘキサン１ｍｌに
溶解して加え、４０℃に昇温し、攪拌した。表７に反応
時間として示した時間後、反応液の一部を取って、実施
例１〜８と同様にして分析し、生成した２−オキソビシ
クロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸の光学純
度および反応収率を求めた。結果を表５に示す。
【００７２】
【表５】
【００７３】実施例４２ 参考例１３で得られたアルスロバクターＳＣ−６−９８
−２８株由来の本酵素遺伝子が導入され形質転換された
組換え微生物培養物２．０ｍｇを 、１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに加え懸濁させた。これに
ラセミの（１ＳＲ，５ＲＳ，６ＳＲ）−２−オキソビシ
クロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチル１
０ｍｇをｎ−ヘキサン１ｍｌに溶解して加え、４０℃に
昇温し、攪拌した。１３時間後、反応液の一部を取っ
て、実施例１〜８と同様にして分析し、生成した２−オ
キソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸
の光学純度および反応収率を求めた。その結果、（＋）
−（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．
１．０］ヘキサン−６−カルボン酸が光学純度６５．０
％、収率３３．４％で得られた。
【００７４】実施例４３ 参考例１４で得られたバークホルデリア・セパシアＳＣ
−２０株由来の本酵素の粗酵素粉末を２．０ｍｇ 、１
００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに加え懸濁
させた。これにラセミの（１ＳＲ，５ＲＳ，６ＳＲ）−
２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カル
ボン酸エチル１０ｍｇをｎ−ヘキサン１ｍｌに溶解して
加え、４０℃に昇温し、攪拌した。１３時間後、反応液
の一部を取って、実施例１〜８と同様にして分析し、生
成した２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６
−カルボン酸の光学純度および反応収率を求めた。その
結果、（＋）−（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシ
クロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸が光学純
度６２．９％、収率１４．８％で得られた。
【００７５】実施例４４ 参考例８で得られたクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１
由来の精製本酵素１６０Ａ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ１
０μｌを、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍ
ｌに加え懸濁させた。これにラセミの（１ＳＲ，５Ｒ
Ｓ，６ＳＲ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキ
サン−６−カルボン酸エチル１０ｍｇをｎ−ヘキサン１
ｍｌに溶解して加え、４０℃に昇温し、攪拌した。８時
間後、反応液を分液し、水層を実施例１〜８と同様にし
て分析し、生成した２−オキソビシクロ［３．１．０］
ヘキサン−６−カルボン酸の光学純度および反応収率を
求めた。また、有機層をＧＣ〔カラム：ＣＰ−シクロデ
キストリンβ−２，３，６−Ｍ−１９、０．２５ｍｍφ
×５０ｍ，０．２５μｍ（クロムパック（CHROMPACK）
社製）〕にて分析し、反応せずに残存した２−オキソビ
シクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチル
の光学純度および収率を求めた。その結果、（−）−
（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸が光学純度６７．２％、
収率５５．１％で得られ、（＋）−（１Ｓ，５Ｒ，６
Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６
−カルボン酸エチルが光学純度８２．３％、収率４４．
９％で得られた。
【００７６】実施例４５ 参考例７で得られたクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１
由来の精製本酵素Ｎ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍ ４０μｌ
を、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに加
え懸濁させた。これにラセミの（１ＳＲ，５ＲＳ，６Ｓ
Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６
−カルボン酸エチル１０ｍｇをｎ−ヘキサン１ｍｌに溶
解して加え、４０℃に昇温し、攪拌した。８時間後、反
応液を分液し、実施例４４と同様にして生成した２−オ
キソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸
の光学純度および反応収率および反応せずに残存した２
−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボ
ン酸エチルの光学純度および収率を求めた。その結果、
（−）−（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ
［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸が光学純度６
８．７％、収率５８．７％で得られ、（＋）−（１Ｓ，
５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキ
サン−６−カルボン酸エチルが光学純度９７．６％、収
率４１．３％で得られた。
【００７７】実施例４６ 参考例３で得られたクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１
由来の本酵素遺伝子が導入され形質転換された組換え微
生物ＪＭ１０９／ ｐＣＣ１６０Ａ１８９ＹＡ３６３ｔ
ｅｒｍの培養物を６．０ｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）４００ｍｌに加え懸濁させた。これにラ
セミの（１ＳＲ，５ＲＳ，６ＳＲ）−２−オキソビシク
ロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチル４
０．０ｇをｎ−ヘキサン４００ｍｌに溶解して加え、４
０℃に昇温し、１０％ＮａＯＨを適宜加えてｐＨ７〜ｐ
Ｈ８に保持しながら、４０℃で４時間攪拌した。反応液
に１２ＮのＨＣｌ水溶液を加えてｐＨ４．２とし、セラ
イトを用いてろ過後、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液を加えて
ｐＨ７．６として、トルエン４００ｍｌで４回抽出分液
し、反応せずに残存した２−オキソビシクロ［３．１．
０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルを有機層側から取
得した。実施例４４と同様にして光学純度および収率を
求めた結果、（＋）−（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキ
ソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エ
チルが光学純度１００％、収率２６．５％で得られた。
【００７８】配列表フリーテキスト 配列番号１ クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エス
テラーゼに部位特異的変異Ａｓｎ４３Ｓｅｒを導入する
ために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号２ クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エス
テラーゼに部位特異的変異Ｇｌｙ１６０Ｓｅｒを導入す
るために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号３ クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エス
テラーゼに部位特異的変異Ｇｌｙ１８９Ｔｙｒを導入す
るために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号４ クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エス
テラーゼに部位特異的変異Ｇｌｙ１８９Ｐｈｅを導入す
るために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号５ クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エス
テラーゼのＡｌａ３６３を終始コドンに変換するために
設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号６ クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エス
テラーゼに部位特異的変異Ａｓｎ４３Ｓｅｒを導入する
ために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号７ クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エス
テラーゼに部位特異的変異Ｇｌｙ１６０Ｓｅｒ、Ｇｌｙ
１８９ＴｙｒあるいはＧｌｙ１８９Ｐｈｅを導入するた
めに設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号８ クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エス
テラーゼのＡｌａ３６３を終始コドンに変換するために
設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号９ クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エス
テラーゼに部位特異的変異Ａｓｎ４３Ｓｅｒを導入する
ために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１０ クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エス
テラーゼに部位特異的変異Ｇｌｙ１６０Ｓｅｒ、Ｇｌｙ
１８９ＴｙｒあるいはＧｌｙ１８９Ｐｈｅを導入するた
めに設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１１ クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エス
テラーゼのＡｌａ３６３を終始コドンに変換するために
設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００７９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Chemical Company Limited <120>Method of preparing chiral 2-oxobicyclo [3.1.0] hexane-6-carboxylat e. <130> Ｐ１５００８１ <160> 11 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to introduce the site-directed mut agenesis Asn43Ser into the wild-type esterase from Chromobacterium SC-YM -1. <400> 1 cagcgcggag gacacagacc cgtggacgaa 30 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to introduce the site-directed mut agenesis Gly160Ser into the wild-type esterase from Chromobacterium SC-Y M-1. <400> 2 tgccggttgc ggtggcggca gtgcgaaccc cg 32 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to introduce the site-directed mut agenesis Gly189Tyr into the wild-type esterase from Chromobacterium SC-Y M-1. <400> 3 cgtcttccgc gccgtcatcg tcgcctcgga 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to introduce the site-directed mut agenesis Gly189Phe into the wild-type esterase from Chromobacterium SC-Y M-1. <400> 4 cgtcttccgc gccttcatcg tcgcctcgga 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to change the Ala363 of the wild-t ype esterase from Chromobacterium SC-YM-1 to termination codon. <400> 5 ccgccgaccg agtgaatcta aatccgctcc 30 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to introduce the site-directed mut agenesis Asn43Ser into the wild-type esterase from Chromobacterium SC-YM -1. <400> 6 gaccatgatt acgaattctt ttttaata 28 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to introduce the site-directed mut agenesis Gly160Ser, Gly189Tyr or Gly189Phe into the wild-type esterase f rom Chromobacterium SC-YM-1. <400> 7 gaccacccgg tgctgagcct gaccctgcag 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to change the Ala363 of the wild-t ype esterase from Chromobacterium SC-YM-1 to termination codon. <400> 8 ggcggaacgg tcaccgaggt cgccgtcgag 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to introduce the site-directed mut agenesis Asn43Ser into the wild-type esterase from Chromobacterium SC-YM -1. <400> 9 gtcgatgagg cgctggatga agtcggggtt 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to introduce the site-directed mut agenesis Gly160Ser, Gly189Tyr or Gly189Phe into the wild-type esterase f rom Chromobacterium SC-YM-1. <400> 10 tactgcgggg ccatggtgtt cagcacgccg 30 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to change the Ala363 of the wild-t ype esterase from Chromobacterium SC-YM-1 to termination codon. <400> 11 cgacggccag tgccaagctt gcatgccgc 29
【図面の簡単な説明】
【図１】発現プラスミドｐＣＣ１０１の制限酵素地図を
示す図である。図中白抜きは、Chromobacterium SC-YM
-1(FERM P-14009)株由来のＤＮＡを、黒塗り部はChromo
bacterium SC-YM-1(FERM P-14009)株由来の本酵素（野
生型）の翻訳領域を示す図である。
【図２】組換えプラスミドｐＣＣＮ４３Ｓの構築工程を
示す図である。
【図３】組換えプラスミドｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍの構
築工程を示す図である。
【図４】組換えプラスミドｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅ
ｒｍの構築工程を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年４月１７日（２０００．４．１
７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】「Ｃ1−Ｃ4アルコキシ」としては、例え
ば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロピ
ル、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシな
どが挙げらる。「ハロゲン原子」としては、フルオロ、
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成１１年８月９日（１９９
９．８．９）
【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所
【旧受託番号】 微工研菌寄第Ｐ−１４００９
号
【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三根 早苗 大阪府高槻市塚原２丁目10番１号 住友化 学工業株式会社内 Ｆターム(参考） 4B064 AD56 AD82 CA02 CA06 CA10 CA21 CC24 CD27 DA01 DA11 4H006 AA02 AC46 AC81 BE60 BJ30 BR70 BS20

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式（１） （式中、Ｒ1はＣ1−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしくは
    ニトロで１個以上置換されていてもよいＣ1−Ｃ10アル
    キル基；アリル基；アリールがＣ1−Ｃ8アルキル、Ｃ1
    −Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしくはニトロで１個以上
    置換されていてもよいアリールアルキル基；またはＣ1
    −Ｃ8アルキル、Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしく
    はニトロで１個以上置換されていてもよいアリール基を
    示し、Ｘ1およびＸ2は互いに独立して、単結合、Ｓ、
    Ｏ、ＳＯ、ＳＯ2、またはＮＲ4を示し、ここでＲ4は、
    水素または式（ＣＯ）nＲ5で示される基を示し、ｎは０
    または１を示し、Ｒ5は、水素またはハロゲン原子；Ｃ1
    −Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニ
    トロ、チオールもしくはチオアルキルで１個以上置換さ
    れていてもよいＣ1−Ｃ10アルキル基；Ｃ1−Ｃ8アルコ
    キシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオー
    ルもしくはチオアルキルで１個以上置換されていてもよ
    いＣ2−Ｃ10アルケニル基；Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒド
    ロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオールもしくは
    チオアルキルで１個以上置換されていてもよいＣ2−Ｃ
    10アルキニル基；Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニ
    ル、Ｃ2−Ｃ8アルキニル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒド
    ロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオールもしくは
    チオアルキルで１個以上置換されていてもよいアリール
    基；アリールがＣ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニ
    ル、Ｃ2−Ｃ8アルキニル、Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロ
    キシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオールもしくはチ
    オアルキルで１個以上置換されていてもよいアリールア
    ルキル基；Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ
    2−Ｃ8アルキニル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキ
    シ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオールもしくはチオ
    アルキルで１個以上置換されていてもよい芳香族複素
    環；またはＣ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ
    2−Ｃ8アルキニル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキ
    シ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオールもしくはチオ
    アルキルで１個以上置換されていてもよい非芳香族複素
    環を示し、Ｒ2およびＲ3は互いに独立して、水素、ハロ
    ゲン原子またはニトロ基；Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロ
    キシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオールもしくはチ
    オアルキルで１個以上置換されていてもよいＣ1−Ｃ10
    アルキル基；Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲ
    ン、アミノ、ニトロ、チオールもしくはチオアルキルで
    １個以上置換されていてもよいＣ2−Ｃ10アルケニル
    基；Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミ
    ノ、ニトロ、チオールもしくはチオアルキルで１個以上
    置換されていてもよいＣ2−Ｃ10アルキニル基；Ｃ1−Ｃ
    8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニ
    ル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、ア
    ミノ、ニトロ、チオールもしくはチオアルキルで１個以
    上置換されていてもよいアリール基；アリールがＣ1−
    Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニ
    ル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、ア
    ミノ、ニトロ、チオールもしくはチオアルキルで１個以
    上置換されていてもよいアリールアルキル基；Ｃ1−Ｃ8
    アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニル、
    Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミ
    ノ、ニトロ、チオールもしくはチオアルキルで１個以上
    置換されていてもよい芳香族複素環；Ｃ1−Ｃ8アルキ
    ル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニル、 Ｃ1−
    Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニト
    ロ、チオールもしくはチオアルキルで１個以上置換され
    ていてもよい非芳香族複素環；Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2
    −Ｃ8アルケニル、Ｃ 2−Ｃ8アルキニル、 Ｃ1−Ｃ8アル
    コキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、チオ
    ールもしくはチオアルキルで１個以上置換されていても
    よい、１個もしくは２個の芳香族炭化水素環または芳香
    族複素環と縮合した非芳香族炭化水素環；またはＣ1−
    Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニ
    ル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、ア
    ミノ、ニトロ、チオールもしくはチオアルキルで１個以
    上置換されていてもよい、１個もしくは２個の芳香族炭
    化水素環または芳香族複素環と縮合した非芳香族複素環
    を示す。）で示される２−オキソビシクロ［３．１．
    ０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類を、特定の光
    学活性体を優先的に加水分解する能力を有する酵素を用
    いて不斉加水分解することを特徴とする一般式（２） （式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ2およびＲ3は前記と同じ意味を示
    し、＊は不斉炭素原子であることを示す。）で示される
    光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−
    ６−カルボン酸類および一般式（３） （式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3および＊は前記と同
    じ意味を示す。）で示される光学活性２−オキソビシク
    ロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類
    の製造方法。
  2. 【請求項２】前記一般式（１）で示される２−オキソビ
    シクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステ
    ル類が、２種の光学活性体の混合物である請求項１に記
    載の製造方法。
  3. 【請求項３】前記一般式（１）で示される２−オキソビ
    シクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステ
    ル類において、 Ｘ1およびＸ2が単結合で、Ｒ2およびＲ
    3が水素原子である請求項１または２に記載の製造方
    法。
  4. 【請求項４】前記一般式（１）で示される２−オキソビ
    シクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステ
    ル類において、Ｒ1がＣ1−Ｃ5アルキル基である請求項
    １、２または３に記載の製造方法。
  5. 【請求項５】請求項１、２、３または４に記載の一般式
    （２）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．
    １．０］ヘキサン−６−カルボン酸類の製造方法。
  6. 【請求項６】酵素が微生物起源の加水分解酵素または動
    物起源の加水分解酵素である請求項１、２、３、４また
    は５に記載の製造方法。
  7. 【請求項７】酵素がアクロモバクター（Achromobacte
    r）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アルスロバ
    クター(Arthrobacter)属、アスペルギルス(Aspergillu
    s)属、バチルス(Bacillus)属、バークホルデリア(Burkh
    olderia)属、キャンディダ(Candida)属、クロモバクテ
    リウム(Chromobacterium)属、フミコーラ(Humicola)
    属、ムコール(Mucor)属、シュードモナス(Pseudomonas)
    属、またはリゾムコール（Rhizomucor ）属の微生物を
    起源とする加水分解酵素である請求項１、２、３、４ま
    たは５に記載の製造方法。
  8. 【請求項８】酵素がアクロモバクター・エスピー（Achr
    omobacter sp.）、アルカリゲネス・エスピー（Alcalig
    enes sp.）、アスペルギルス・メレウス（Aspergillus
    melleus）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus o
    ryzae）、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）、バチ
    ルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バ
    チルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス
    ・サーモグルコシデシウス（Bacillus thermoglucosida
    sius）、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia ce
    pacia) 、キャンディダ・アンタークティカ（Candida a
    ntarctica）、キャンディダ・シリンドラッセ（Candida
    cylindracea）、キャンディダ・ルゴサ（Candida rugo
    sa）、クロモバクテリウム・ビスコサム（Chromobacter
    ium viscosum） 、フミコーラ・エスピー（Humicola s
    p.） 、ムコール・ミーヘイ（Mucor miehei）、シュー
    ドモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）、シュードモ
    ナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa） 、シ
    ュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）、シ
    ュードモナス・フルオレセン（Pseudomonas fluorescen
    s）、またはリゾムコール・ミーヘイ（Rhizomucor mieh
    ei）の微生物を起源とする加水分解酵素である請求項
    １、２、３、４または５に記載の製造方法。
  9. 【請求項９】酵素が、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−
    １株またはアルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株由
    来のエステラーゼである請求項１、２、３、４または５
    に記載の製造方法。
  10. 【請求項１０】酵素が、バークホルデリア・セパシア(B
    urkholderia cepacia) ＳＣ−２０株由来のリパーゼで
    ある請求項１、２、３、４または５に記載の製造方法。
  11. 【請求項１１】酵素が、豚腎臓、牛膵臓の加水分解酵素
    である請求項１、２、３、４または５に記載の製造方
    法。
  12. 【請求項１２】酵素が、請求項６、７、８、９、１０ま
    たは１１記載の酵素の特定のアミノ酸が１個ないしは複
    数個、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素で
    ある請求項１、２、３、４または５に記載の製造方法。
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