JP2000189200A

JP2000189200A - ヒトの発癌性乳頭腫ウイルスｈｐｖ１８の検出方法

Info

Publication number: JP2000189200A
Application number: JP2000043673A
Authority: JP
Inventors: Brian James Morris; モーリス、ブライヤン・ジェイムズ; Brian Nightingale; ナイチンゲイル、ブライアン
Original assignee: Biosearch International Pty Ltd
Current assignee: Biosearch International Pty Ltd
Priority date: 1987-02-26
Filing date: 2000-02-21
Publication date: 2000-07-11
Also published as: AU611135B2; WO1988006634A1; JP2001197894A; JPH02502334A; US6218104B1; JP3096704B2; EP0357611A1; DE3853678T2; EP0357611B1; DE3853678D1; EP0357611A4; ATE121794T1; US5783412A; AU1393888A

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒト組織におけるHPV18感染の有無を正確に
検出する方法を提供する。【解決手段】ヒトの発癌性乳頭腫ウイルスHPV18の検
出方法であって、HPV18のE6領域の塩基配列を示した配
列番号１における位置418−527の塩基配列からなる特徴
的DNA部分の量を増大させるように、連続的な加熱と冷
却とからなるポリメラーゼ連鎖反応法を、ヒト頚部組織
細胞の試料に適用し、そして増幅した試料中のHPV18に
特徴的な上記特徴的DNA部分の存在または非存在を検出
する、ことからなることを特徴とするヒトの発癌性乳頭
腫ウイルスHPV18の検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【発明の属する技術分野】本発明は臨床試料中の乳頭腫
ウイルスHPV18の特別の検出方法に関する。特に、該試
験は、性器等の領域から得た細胞が癌と関係のある乳頭
腫ウイルスのタイプを有しているかどうかまたは該細胞
が一般に良性病変に関係のある乳頭腫ウイルスのタイプ
を有しているかどうかを、最も短かい時間で識別するこ
とを目的とする。このような識別は、患者評価および追
跡において重要な関係がある。

【従来の技術】１．ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）につい
て子宮等の頚部(Cervix)癌は女性に最も一般的な癌である
（女性の全部の癌の約25％）。更に、発生率はより若い
女性で増加している。実際、定型的な子宮等の頚部塗沫
標本の約２％は異常な細胞学を示し、流行性であること
を示唆している。このような流行病は多くの西欧および
発展途上国で流行している。性的活動は発癌現象および
前癌病変の疫学での重要な素因ファクターであると思わ
れる。早期年令の性交および性パートナーの多様性は悪
性の危険度の増加と統計的に関係がある〔Harris等、B
r. J. Cancer 42、359〜363、1980年〕。その配偶者は
しばしば陰茎ゆうぜい（疣贅）を有する男性（「高危険
度の男性」）であり、そして子宮等の頚部癌組織は非常
に高い割合（＞90％）でヒトの乳頭腫ウイルス(HPV)の
既知品種の検出可能なDNAを有している。これにより、
関係のある性的伝播ファクターとして或るタイプのHPV
が頚部扁平細胞の発現に関与していることを示す証拠か
ら増殖体が支持される〔zur Hausen等、Progr. Med. Vi
rol. 30、170〜186、1984年；zur Hausen, Progr. Med.
Virol. 32、15〜21、1985年；zur Hausen, Cancer 5
9、1692〜1696；Campion等、Lancet １、943〜946、198
5年〕。頸部癌および前癌病変の罹患率はより若い女性
で増々急速に一般的になってきている。治療をしなけれ
ば致命的となり、死亡率は西欧諸国では１年で100万の
女性当たり約100人である。幸運にも、早期に検出され
た場合、致命的な結果を除去できる有効な治療を利用す
ることができる。今後もまだ子供を産みたいと願ってい
る、異常な細胞学的塗沫標本をもつ若い女性を即座に管
理しその後追跡すると多くの問題が現われる。乳頭腫ウ
イルス感染(「匙状細胞(koilocyte)」)並びに異形成の
特徴を有する塗沫標本の解釈の不確実性によって問題が
増加する。更に、頚部癌スクリーニング用の現在の細胞
学的試験器具、即ちパパニコロー(Pap)塗沫標本は約20
％の偽陰性を有する。かなりの数の異形成組織は自然発
生的に退行し、他の組織は進行しない。しかし２、３の
異形成は急速に進行する。かくして、形態学的異常性を
間違って定義された集団から時折癌が発現することがあ
る。現在、パパニコロー塗沫標本がたまたま異常となっ
た場合に癌が生じるかどうかを予言する明確な方法はな
い。これら患者の多くの臨床試験では外性器または、実
際には、子宮頸部自体上のゆうぜい病変（尖形コンジロ
ーム）は見い出され損っている。扁平（非コンジローム
性）ゆうぜい（肉眼では見えない）の存在を明らかにす
るためには、３％の酢酸を適用した後、更に困難な膣鏡
検査法が実際には必要である。これらには前癌性組織変
化の疑いがあると思われる。ゆうぜいは元の位置での癌
および明らかな悪性物に組織病理学的に進行することが
はっきりと記載されている〔例えば、Dyson等、J. Cli.
Path. 37、126〜131、1984年〕。驚く程増えている問
題は陰性のパパニコロー塗沫の３年以内に浸潤性癌が生
起することである〔Berkowitz等、Gynecol. Oncol.
８、311、1979年；Holman等、Med. J. Aust. ２、597、
1981年〕。乳頭腫ウイルス複製が存在することはウイル
ス粒子またはその群に特異的な抗原の形成によって頚部
コンジロームで確認することができるが、粒子と抗原の
どちらも扁平細胞癌組織では見い出されていない。形態
学に基づく試験の解釈を取りまく不確実性や論争とは対
照的に、分子生物学における新しい技術がこのような問
題を迂回し且つ更に客観的な情報を提供するために利用
できる。核酸ハイブリッド形成技術を使用することによ
って、ウイルス性DNAを直接且つ感染初期に同定するこ
とができる。実際、これらの試みを使用して、HPVタイ
プが良性および前癌性病変の両方で見い出されている。
現在、約50タイプの乳頭腫ウイルスがヒトの感染で識別
されている。異なるウイルスは異なる上皮領域を感染さ
せる。一般に生殖器を感染させる特別のタイプのHPVに
は番号６、11、16、18が付されたものおよび幾つかのよ
り珍しいタイプ(31、33、35、39、43および44)がある。
HPV6〔de Villiers等、J. Viol. 40、932〜935、1981
年〕およびHPV11〔Gissmann等、J. Virol. 44、393〜40
0、1982年；Gissmann等、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. 80、560〜563、1983年；Dartmann等、Virology 15
1、124〜130、1986年〕は良性の尖形コンジローマ、即
ち肛門および生殖器の古典的組織変化に関係がある〔Gi
ssmann等、J. Invest. Dermatol.83、265〜285、1984
年〕。対照的に、HPV16〔Durst等、Proc. Natl. Acad.
Sci.U.S.A. 80、3812〜3815、1983年〕および HPV18〔B
oshart等、EMBO J. ３、1151〜1157、1984年；Coleおよ
びDanos、J. Mol. Biol. 193、599〜608、1987年〕は外
陰部および頚部の異形成扁平病変並びに頚部および陰茎
の扁平癌でより頻繁に検出される〔Crum等、Cancer 4
9、468〜471、1982年；Campion等、Lancet i、943〜94
6、1985年〕。かくして、肛門性器間領域を感染させるHPVのタイプは
次のように２つのカテゴリーに割り付ることができる：１．「低危険度」：HPV6およびHPV11、タイプ６は全て
の肛門性器間タイプの内で最も一般的なものである。２．「高危険度」：HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV3
5、HPV39、HPV43およびHPV44。危険度がより高いタイプの生起頻度は順に少なくなって
いる。かくして、高危険度のカテゴリーの中で、HPV16
は最も一般的（45〜60％）であり、HPV18はその次に最
も一般的（20〜30％）であり、そして他のものはよりま
れであり、最後の４つは最近発見されたばかりであっ
て、1986年に報告されている（これらのよりまれなタイ
プのものの全総頻度はひとまとめにして約15％であ
る）。より稀な他のタイプがやがて発見されるものと思
われる。子宮等の頚部癌におけるHPVの役割を支持するものとし
ては次の知見が注目に値する；（i）既知の高危険度HPVのDNAは頚部腺癌および扁平細
胞癌の約90％で検出されている〔Zachow等、Nature 30
0、771〜773、 1982年；Gissmann等、1984年、同上〕。（ii）高危険度HPV DNAは頚部腫瘍に起因する転移部で
見い出されている〔Lancaster等、Am. J. Obstet. Gyne
col, 154、115〜119、1986年〕。（iii）高危険度HPVのDNAは、通常のエピソーム形態で
細胞中に存在する代わりにヒトのゲノムDNA中に集まっ
ていることが見い出されている〔Schwartz等、Nature 3
14、111〜114、1985年； Lehn等、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 82、5540〜5544、1985年；Kreider等、Nature
317、639〜641、1985年；Matsukura等、J.Virol 58、97
9〜982、1986年；Schneider・GadickeおよびSchwartz、
EMBO J.５、2285〜2292、1986年；Di Luca等、J. Gen.
Virol. 67、583〜589、1986年〕。このような集積は細
胞の悪性への転換にとって必要であることが示唆されて
おり、前癌組織中にも集積しているとの所見によって支
持されている〔Shirasawa等、J. Gen. Virol. 67、2011
〜2015、1986年〕。（iv）集積パターンは通常HPV16または18のDNAの特異的
領域を中断しているかまたは欠失しているが、一定して
E6およびE7開始読み取りフレーム(ORF)は無傷のままで
あり〔Pater and Pater, Virology 145、313〜318、198
5年〕、そしてこれらは少なくとも頚部癌に由来する細
胞株中で発現し続ける〔SmotkinおよびWettstein、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 83、4680〜4684、1986年；An
drophy等、EMBO J. ６、989〜992、1987年；Baker等、
J. Virol.61、962〜971、1987年；Takebe等、Biochem.
Biohys. Res. Commun.143、837〜844、1987年〕。（v）スプライスドナーは、翻訳時に表皮性増殖ファク
ターに類似するORFの生成を生じさせ得るHPV16および18
(HPV6および11ではない)のE6 ORF中に存在する〔zur Ha
usen, Lancet 489〜491、1986年〕。（vi）頚部細胞株（HeLa, CaSki, SiHa, SW756等）での
集積はしばしば原腫瘍遺伝子に似ている〔Durst等、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 84、1070〜1074、1987年；Po
pescu等、Cytogenet. Cell Genet. 44、58〜62、1987
年；Popescu等、J.Virol.51、1682〜1685、1987年；Shi
rasawa等、J. Gen. Virol. 68、583〜591、1987年〕。（vii）このような集積は、HPVによる細胞性腫瘍遺伝子
のcis-活性化が頚部細胞の悪性形質転換に関係があると
の示唆と一致して、c-mycおよびc-ras mRNAの発現増加
に関連がある（Durst等、1987年、同上；Shirasawa等、
1987年、同上）。（viii）ヒトの腺維芽細胞およびケリタノサイト(kerit
anocyte)は、NIH3T3細胞〔Tsunokawa等、Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 83、2200〜2203、1986年；Yasumoto
等、J. Virol. 57、572〜577、1986年〕と同様にHPV16
でのトランスフェクションによって形質転換することが
できる〔Pirisi等、J. Virol. 61、1061〜1066、1987
年〕。（ix）集積は細胞干渉ファクターをコードする遺伝子を
分裂させ；このことによって、ウイルスの非制御増殖お
よび転写を抑制する細胞の正常な防御メカニズムが駄目
になることがある〔zur Hausen, Lancer 487〜491、198
6年〕。男性の陰茎ゆうぜいは極くまれにしか陰茎の癌を生じさ
せないが、子宮等の頚部に伝染したとき、癌は更に一層
容易に生じる。組織学的に確認された頚部HPV感染を有
する患者の約３分の１は１年以内に頚部上皮内腫瘍形成
(CIN)を発現すると思われる〔Nashet等、Obstet, Gynec
ol 69、160〜162、1987年〕。しかし乍ら、感染と癌と
の間の時差はしばしば10〜30年である。かくして、頚部
の独特の環境が、また、喫煙のような他のファクターと
一緒になって〔Trevathan等、J.Am. Med. Ass. 250、49
9〜504、1983年〕、癌の開始に寄与する。後者によるDN
Aの損傷は、細胞増殖を生じさせるHPVの作用と一緒にな
って、悪性物の開始を説明することができよう。前癌病
巣を有する女性の治療には影響を受けた領域の外科的摘
出が含まれる。更に、男性による再感染および他の女性
への感染を避けるために、治療には女性の男性感染配偶
者も含めなければならないことは現在多くの人に信じら
れている。頚部細胞の定型的スクリーニングに現在使用
されている細胞学的試験（パプ塗沫）は主観的なものと
考えられ、病変中の特別のタイプのHPVの同定は可能で
ないので、本発明者はウイルスを直接摘出するDNA-DNA
ハイブリッド形成の更に特異的な試みがやがて定型的に
初期スクリーニングの細胞学に代用されまたは代替して
使用されることさえあろうと予見する。患者の臨床評価
では、潜在的発癌性（高危険度）タイプが潜伏している
組織変化を更に良性（低危険度）タイプに関連する組織
変化と区別することが重要である。患者標本のHPV感染
の評価はフィルターハイブリッド形成の技術によって促
進されている。このような技術は、定型的な細胞学用の
試料と平行して採集した頚部細片中のHPV DNAを検出す
るために使用されている〔Wagner等、Obstet. Gynecol.
64、767〜772、1984年；Wickenden等、Lancet i、65〜
67、1984年；Schneider等、Science 216、1065〜1070、
1982年〕。1985年１月に１つのプロジェクトが性器タイ
プのHPVの直接試験を開発するためにシドニー大学でモ
リス(Morris)博士によって開始された；このプロジェク
トは感染が高危険度タイプの１つによるのかまたは低危
険度タイプの１つによるのかを評価するという特別の目
的をもっていた。組換え体ウイルスDNAに係わる試験の
予備的方法を記載している最初の刊行物は、ビー・アー
ル・ヘンダーソン(B. R. Henderson)、シー・エイチ・
トンプソン(C. H. Thompson)、ビー・アール・ローズ
(B. R. Rose)、ワイ・イー・コサート(Y. E. Cossart)
およびビー・ジェイ・モリス(B. J. Morris)の「頚部か
き取り物、肛門かきとり物および性器生検物中の特異的
タイプのヒト乳頭腫ウイルスのDNAハイブリッド形成に
よる検出」、ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロ
ジー(Journal of Medical Virology) 12、381〜393、19
87年である。この報文は1986年の始めに提出された。そ
れ以後組換え体DNA試験の感度は100倍に上昇し、そして
更に改良が間断なくなされている。5,000を超える臨床
標本が現在までに試験されている。これらは主としてシ
ドニーS.T.D.クリニックからのものである。今までのと
ころ、このデータによって、頚部かき取り物および他の
性器標本でのHPV感染の存在および性質を決定するため
の直接的ウイルス検出の実行可能性および有用性が確立
された。この方法を使用している本発明者等の他の最近
の刊行物には、ビー・アール・ローズ、シー・エイチ・
トンプソン、エイ・エム・マクドナルド(A. M. McDonal
d)、ビー・アール・ヘンダーソン、ワイ・イー・コサー
トおよびビー・ジェイ・モリスの「肛門性器間ゆうぜい
培養物の細胞生物学」、ブリティッシュ・ジャーナル・
オブ・デルマトロジー(British Journal of Dermatolog
y) 116、311〜322、1987年；ビー・ジェイ・パーカー
(B. J. Parker)、ワイ・イー・コサート・シー・エイチ
・トンプソン、ビー・アール・ローズおよびビー・アー
ル・ヘンダーソンの「肛門ゆうぜいの臨床的管理および
実験室評価」、メディカル・ジャーナル・オブ・オース
トラリア(Medical Journal of Australia) 147、59〜6
3、1987年；ピー・エム・カテラリス(P. M. Katelari
s)、ワイ・イー・コサート、ビー・アール・ローズ、ビ
ー・ナイチンゲール(B. Nightingale)、イー・ソリッチ
(E. Sorich)、シー・エイチ・トンプソン、ピー・ビー
・ダラス(P. B. Dallas)およびビー・ジェイ・モリスの
「ヒト乳頭腫ウイルス：未治療男性保持者」、ジャーナ
ル・オブ・ウロロジー(Journal ofUrology)、印刷中、1
988年。他の多くの研究が更に発表されるはずである。最も一般的な肛門性器間HPVタイプの主要ストランドDNA
シーケンスについては次のものを参照：HPV 6bのシーケ
ンスはシュバルツ(Schwartz)等、EMBO J. ２、2361〜23
68、1983年に示されている。HPV 11のシーケンスはダル
トマン(Dartmann)等、バイロロジー(Virology) 151、12
4〜130、1986年に示されている。HPV 16のシーケンスは
ゼードルフ(Seedorf)等、バイロロジー145、181〜185、
1985年に示されている。HPV 18のシーケンスはマトラシ
ェウスキイ(Matlashewski)等、J. Gen. Virol.67、1909
〜1916、1986年に示されている。すなわち、この報文
は、HPV18 E6領域の塩基配列（配列番号１）を開示して
いる。HPV 33のシーケンスはコール(Cole)およびストリ
ーク(Streek)、J. Virol. 58、991〜995、1986年に示さ
れている。２．ハイブリッド形成による特異的ウイルスDNA検出の
原理 DNAは二重鎖(double-strand)である。DNAの各ストラン
ドは他のストライドの相補的「鏡像」である。DNAスト
ランドは水素結合によって一緒に保持されている。ウイ
ルスDNAを検出する本発明者の技術は、１つのDNAストラ
ンド中のヌクレオチドの独特のシーケンスがそれと相補
的なシーケンスに結合する（「ハイブリッドを形成す
る」）能力に基づいている。それ故、乳頭腫ウイルスタ
イプの全部分または特有部分のDNAシーケンスを備えた
ものを、患者の子宮頚部細胞の試料中のウイルスを検出
するために「帰巣プローブ」として使用することが可能
である。プローブとして使用するDNAは放射性同位元素
かまたは非放射性標識かのどちらかで標識されているの
で、後で検出することができる。この試験の感度を高め
るために、本発明者は試料中のHPV DNAシーケンスの増
幅方法を利用した。３．ウイルスDNAを増幅するために使用した試みの背景検出技術の感度を高めるために、本発明者は遺伝子病の
診断用にもともと記載された方法を使用する。これは
「ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reactio
n)」(PCR)として知られている。これは、合成オリゴヌ
クレオチドプローブとハイブリッドを形成させる前に特
定のDNAシーケンスを酵素的に増幅するために使用され
る。典型的な増幅ファクターは、ウイルスDNAの１つの
コピーから出発した約250,000個のコピーである。この
ような試みは感度を高めるだけでなく、更に多用途の試
験法に期待される非放射性検出方法での特異性、スピー
ド、簡易性および使用し易さの要件を充たしている。キ
ットとして組み立てることやオートメ化することも可能
であり、その両者共本発明者が達成した。PCR技術は、
特定の遺伝子異常の出生前診断試験を扱った論文に記載
されている〔Sakii等、Science 230、1350〜1354、1985
年；Sakii等、Nature 324、163〜166、1986年；Scharf
等、Science 233、1076〜1078、1986年〕。PCR技術は次
の特許出願の対象である：1985年３月28日付米国優先権
日のオーストラリア公開特許出願55322/86、シータス・
コーポレーション(Cetus Corp.)の「核酸シーケンスの
増幅法」；1985年３月28日付米国優先権日のオーストラ
リア公開特許出願55323/86、「ハイブリッド形成プロー
ブによる標的核酸の増幅と検出」。簡単に言えば、HPV
DNAシーケンスの小さな特有部分、即ち長さ約100〜200b
pがPCR法で増幅される。実施例では、E6領域の１つの領
域を選択した。PCR工程には、増幅すべき領域の側面に
位置する２つの約20merのオリゴヌクレオチドプライマ
ーが必要である。１つのプライマーはDNAの１つの領域
の（＋）−ストランドに相補的であり、もう一方は
（−）−ストランドに相補的である。変性させた試料ウ
イルスDNAの（＋）−ストランドにプライマーをアニー
リングし、次いで、例えば大腸菌DNAポリメラーゼ、ま
たは同様の反応を行う他の酵素のクレノウ(Klenow)フラ
グメントおよびデオキシヌクレオチドトリホスフェート
とで拡大すると、プライマーのハイブリッド形成部位間
に存在している「標的」シーケンスを含有する（−）−
ストランドフラグメントが合成される。同時に、同様な
反応が他のプライマーで生じ、新しい（＋）−ストラン
ドが創生される。本方法の原理を図１に示す。これらの
新たに合成されたDNAストランドはそれ自体PCRプライマ
ーの鋳型であるので、変性化の繰り返しサイクル、プラ
イマーアニーリングおよび拡大によってプライマーで特
定された約100〜200bp領域の典型的集積が生じる。次
に、特定のDNAを検出する。種々の手段がこの検出の実
施に可能である。生成した DNA量はゲルトでの電気泳動
および染色後に直接目で十分見える量であろう。

【発明が解決しようとする課題】本発明は、HPVの遺伝
子配列情報ならびにハイブリッド形成技術とPCR法を利
用して、ヒト組織におけるHPV18感染の有無を正確に検
出する方法を提供することを課題としている。

【課題を解決するための手段】特に、本願発明はヒトの
発癌性乳頭腫ウイルスHPV18の検出方法を提供し、該方
法は、(a) HPV18のE6領域の塩基配列を示した配列番号
１における位置418−527の塩基配列からなる特徴的DNA
部分の量を増大させるように、(i) 加熱してDNAストラ
ンドを解離させ、(ii) 上記特徴的DNA部分の各末端を
特定するオリゴヌクレオチドプライマーを添加し、(ii
i) 冷却して解離したDNAストランドをプライマーにア
ニーリングさせ、(iv) DNAポリメラーゼを添加し、(v)
冷却した温度で上記特徴的DNA部分の各ストランドに
相補的なDNAを形成させ、(vi) 解離温度に加熱し、そ
して熱に安定なDNAポリメラーゼを使用する場合には工
程(iv)は任意に省略して工程(iii)から(vi)を繰り返
す、工程からなるポリメラーゼ連鎖反応法を、ヒト頚部
組織細胞の試料に適用し、そして(b) 増幅した試料中
のHPV18に特徴的な上記特徴的DNA部分の存在または非存
在を検出する、ことからなる。本発明はまた、使用した
特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよび以下に記載
するような特定の標識をしたオリゴヌクレオチドプライ
マーにも及ぶ。例示の目的で本発明の実施例を以下に記
載する。

【実施例】使用した典型的な技術の要約１．かき取り物またはゆうぜい組織は定型的方法によっ
て病院で採集し、必要な場合、分析実験室に輸送する前
に３日間まで貯蔵する。２．細胞は溶解させ、そのDNAを変性させる。３．ウイルスDNAはポリメラーゼ連鎖反応によって増幅
する。４．ウイルスDNAは、例えば電気泳動および染色〔二試
験の終了点〕によって直接検出するかまたは 4a. 試料（複数）はドット複写を使用して、負荷したナ
イロン膜に適当な標準および対照と共に適用する。５．フィルターは予備ハイブリッド化させる。６．フィルターは、標識した混合ウイルスDNAプロー
ブ、即ち「高危険度」（潜在的に発癌性）用のプローブ
および「低危険度」HPV用の他のプローブを含有する１
つの混合物を用いてハイブリッド化させる。７．フィルターは適当な張力条件下で洗浄し、その際密
接に関連したシーケンスだけが付着したままである（各
々の相補的DNAストランドの水素結合によって）。８．オートラジオグラフィー、（試料を適用したＸ線フ
ィルム上の暴露物の黒いスポットは、精査されるカテゴ
リーのHPVウイルスを含有していることを示す）、また
は 8a. 非放射性検出方法を実施する。（適当な場合、着色
スポットまたは他のシグナルは探査されるカテゴリーの
HPVウイルスを含有していることを示す。）記載した試験で作用するオリゴヌクレオチドの実施例プライマー各HPVタイプまたはカテゴリーに関して、２つの合成オ
リゴヌクレオチドをPCRの拡大および増幅工程のプライ
マーとして使用するために合成した。これらのオリゴヌ
クレオチドは重要な特異的「標的」シーケンスの側面に
位置するDNAに対応し、この標的シーケンスはHPVに独特
のものであり且つその隣りの１つのHPVタイプまたはカ
テゴリー（「高危険度」対「低危険度」）とは異なって
いるウイルスゲノム中のDNAシーケンスである。本発明
者は以下に記載したオリゴヌクレオチドが適切であるこ
とを見い出したが、他の適当なシーケンスを指示された
特定のウイルスタイプまたは他のタイプの乳頭腫ウイル
スに対して選択することもできる。低危険度HPV HPV6及びHPV11に関して、適当な標的シーケンスをウイ
ルスゲノムの開始読み取りフレーム内で選択した。この
標的シーケンスの側面に位置し、プライマーとして使用
するのに適当なDNAシーケンスは次のとおりであり（そ
の際、位置番号はウイルスゲノムのヌクレオチドシーケ
ンスを指す）、上記HPVの各々について同一である：これらのプライマーはHPV6およびHPV11上に相補的シー
ケンスを有する。これらはHPV16およびHPV33のゲノム中
のシーケンスとは異なっており、その際、選択したDNA
標的シーケンスの側面に位置する別個のプライマーが、
上記および下記と同じ原則を用いて、各々HPV6およびHP
V11用のプローブとして使用するのに適当なオリゴヌク
レオチドと一緒にされHPV用に合成される。高危険度HPV HPV16およびHPV33に関して、選択した標的シーケンスの
側面に位置する適当なシーケンスは次のとおりである： HPV16/33プライマー１：5′TGAGGTATATGACTTTGCTTTT3′ 位置： 223 244 HPV16/33プライマー２：3′AATTAATCCACATAAT5′ 位置： 401 416 また、HPV18に関して使用するプライマー１および２は
次のとおりである： HPV18プライマー１：配列番号１の（−）ストラ
ンドにおける位置418−237の塩基配列に相補的なオリゴ
ヌクレオチド HPV18プライマー２：配列番号１の（＋）ストラ
ンドにおける位置508−527の塩基配列に相補的なオリゴ
ヌクレオチドこのようなHPV18のプライマーの具体的なシークエンス
は、次のとおりである：各試料に全HPVタイプ用のプライマーを添加することが
最も便利である。次いで、試料を分割し、HPVタイプの
各カテゴリー（高危険度対低危険度）について探査する
ことができる。プローブとして使用する標的オリゴヌクレオチド低危険度HPV プローブとして使用するためにオリゴヌクレオチド（標
的）を合成する。これは２つのプライマー間の領域に相
当し、ウイルスタイプHPV6およびHPV11の各々について
同一であるが、他のどんなウイルス性または他のDNAシ
ーケンスとも勿論異なっている。これらシーケンスは次
のとおりである： HPV6/11標的オリゴヌクレオチド：5′GCAAGACGTTTAATCT3′ 位置： 151 166 HPV16およびHPV33の検出用に、次のオリゴヌクレオチド
（標的）シーケンスをプローブとして使用するために合
成する： HPV16/33標的オリゴヌクレオチド：5′GTGAGTATAGACATTAT3′ 位置： 324 340 HPV18を特定的に検出するために、または高危険度HPVの
カテゴリー内で、次のオリゴヌクレオチド（標的）シー
ケンスをプローブとして使用するために合成する： HPV18標的オリゴヌクレオチド：5'GATTTATTTGTGGTGTATAGA3' 位置：460 480 これらシーケンス全ての正確な位置は公表されたウイル
スゲノムのシーケンスの検査によって知ることができ
る。この同じ原理、即ちHPV中の特異的標的シーケンス
の側面に位置するDNAの反対側ストランドとハイブリッ
ドを形成するオリゴヌクレオチドの合成が、上記した刊
行物中に記載されたHPVのシーケンス内および公表され
たときには他のHPVのシーケンス中の他の組合わせのシ
ーケンスに同様に適用され得ることが強調されるべきで
ある。標的オリゴヌクレオチドの標識化放射性標識 T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用して〔γ−³²P〕dAT
Pで約30merの5'末端を標識化する〔BerknerおよびFolk,
J. Biol. Chem. 252、3176〜3180、1977年〕。キット
はデュポン（ニューイングランドNuclear)から入手可能
であり、この工程に使用することができる。 i．下記を混合する： 5'末端りん酸塩を有するDNA 1〜50pmol 10×交換反応緩衝液^* 5μl ５mM ADP 3μl 〔γ−³²P〕dATP（比活性3000Ci/mmol) 100pmol （即ち、10mCi/ml溶液30μl) 蒸留水加えて50μlとする。 T4ポリヌクレオチドキナーゼ１μl（20単位） ^*10×交換反応緩衝液： 0.5MイミダゾールCl(pH6.6) 0.1M MgCl２ 50mMジチオスレイオール１mMスペルミジン１mM EDTA ii．37℃で30分間インキュベートする。 iii．0.5M EDTA ２μlを加える。 iv．フェノール／クロロホルムで１度抽出する。非放射性標識化ハイブリッド形成プローブとして使用するオリゴヌクレ
オチドの非放射性標識化には種々の方法が利用できるよ
うになってきている。放射性標識物は一般に長い半減期
を有しており危険を避けなければならずまた放射能の使
用には許可が必要であるので、上記方法はHPV検出キッ
トでの使用に一層適している。本発明者は、アルカリホ
スファクターゼが直接標的オリゴヌクレオチドに結合し
ている、新規技術（アデライド(Adelaide)のBRESAによ
って実施）によって製造された非放射性オリゴヌクレオ
チドを使用した。アルカリホスファクターゼで標識した
任意の特定のシーケンスのオリゴヌクレオチドはBRESA
から注文で入手可能である。試薬採集緩衝液＝りん酸塩緩衝生理食塩水(PBS) ＝140mM Na
Cl、3mM KCl、8mM Na₂HPO₄・12H₂O、1.5mM KH₂PO₄ 溶解緩衝液＝50mM NaCl、50mMトリス、pH7.5、0.5%SD
S、10mM EDTA 酸素粉末＝プロティナーゼK（10mlの溶解緩衝液を添加
後の濃度＝50μg／ml）除蛋白試薬１＝フェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール（25：24：１、v/v) 除蛋白試薬２＝クロロホルム／イソアミルアルコール
（24：１、v/v) 抽出溶液＝３Ｍの酢酸ナトリウム PCR緩衝液（通常のクレノウを使用する場合）＝50mM Na
Cl、10mM トリス・HCl、pH7.6、10mM MgCl₂ PCR緩衝液（熱に安定なDNA ポリメラーゼを使用する場
合）＝50mM トリス・HCl、pH8.8(25℃で）、10mM 硫酸
アンモニウム、10mM MgCl₂ PCR試薬緩衝液＝ 10×PCR緩衝液 10μl dNTPs 16μl（各50mMストックを４μlずつ）ジメチルスルフォキシド 10μl プライマー各500ng/μlストックを1μl ずつ（＝合計４μl) DNA(細胞またはDNA) ｘμl dH₂O 容量を100μlにする。 DNAポリメラーゼ溶液＝１U/μlのDNAポリメラーゼ（ク
レノウフラグメント）予備ハイブリッド形成溶液＝６×SSC、25×デンハート
(Denhardt)溶液、0.5 ％ドデシル硫酸ナトリウムハイブリッド形成溶液＝６×SSC、１×デンハート溶液
および0.5％SDS、オリゴヌクレオチドプローブと結合し
たアルカリホスファターゼ100ng/mlと共に。洗浄溶液１＝６×SSC、0.1 ％SDS 洗浄溶液２＝６×SSC、洗浄溶液３＝１M NaCl、0.1Mトリス・HCl、pH9.5、５mM
MgCl₂ 色試薬溶液＝0.33mg/mlのニトロブルーテトラゾリウム
(NBT)、 0.17mg/mlの５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドイルホスフェート(BCIP)、0.1M トリス・HCl(pH9.
5)中0.33％(v/v)のジメチルホルムアミド、0.1M NaCl、
５mM MgCl₂ ＴＥ＝10mM トリス・HCl、pH8.0、１mM EDTA ＳＳＣ＝生理的クエン酸食塩標準溶液（１×SSC ＝0.15
M 塩化ナトリウム、0.015M クエン酸三ナトリウム、pH
7.0) デンハート溶液＝フィコール５ｇ、ポリビニルピロリド
ン５ｇ、ウシ結成アルブミン５ｇ、蒸留水で500mlにす
る。ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム子宮等の頚部または他の性器かき取り物用のプロトコー
ル患者の標本採集１．脱鏡を用いて病院の患者からまたは、好ましくは、
頚スクリーニングの場合には子宮頚膣洗浄によってかき
取り物（即ち、パプ塗抹標本用）を採集する。２．かき取り物を付けたスティックを用意した採集管に
入れる。（この管には滅菌採集緩衝液が入れてある。）３．かき取り物組織は４℃で２〜３日またはより長期に
貯蔵するためには−20℃で冷凍して保存することができ
る。試料調製１．採集管を取り、膣鏡上の残存細胞を管中の採集緩衝
液に振り入れる。懸濁物をエッペンドルフ(Eppendorf)
管に注ぐ。２．15分間微量遠心分離(microfuge)する。ペレットか
らPBS を流し捨てる。細胞を暫時回転させて新鮮な採集
緩衝液500μl に再懸濁させる。再び微量遠心分離す
る。３．工程を更に２回繰り返す。４．血球計を用いて１ml当たりの細胞数を測定する。ポリメラーゼ連鎖反応の手順（通常のクレノウ）１．エッペンドルフ管中の35μlの蒸留水に約10,000個
の細胞を含有する量の細胞懸濁液を加える。２．管を95〜98℃に加熱した水浴に入れる。３．10分後に管を取り出し、そして暫時微量遠心分離し
て濃縮物を取り出す。４．直ちにPCR試薬緩衝液65μlを加える。５．管を37℃に加熱した別の水浴に入れる。６．２分後にDNAポリメラーゼ溶液１μlを加え37℃で２
分間反応させる。７．管を95〜98℃の水浴に２分間戻し、次いで暫時微量
遠心分離する。８．工程５〜７を25回繰り返す。ポリメラーゼ連鎖反応の手順（サーマス・アクアチカス
(Thermus aquaticus)由来の好熱ポリメラーゼ） 95℃に耐性であるDNAポリメラーゼを代わりに使用す
る。この酵素を使用するとある程度反応が促進され、そ
して最も重要なことは、コストが約20％減少する。本発
明者はニューイングランドバイオラボラトリーズ(New E
ngland Biolabs)が販売している酵素を使用した。この
酵素はニュージーランドロトルア (Rotorua)の温泉から
得た株から精製することができる。プロトコールは、93
℃で５分間、蒸発を防ぐため50μlの液体パラフィンを
加え、次いでポリメラーゼ４Ｕを加え、その後50℃の水
浴中で30秒、63℃の水浴中で90秒そして93℃の水浴中で
30秒間インキュベートする以外は上記のとおりである。
このサイクルを例えば50回繰り返す。 PCR法によって製造したウイルスDNAの検出この時点からは多くの試みが可能である。本発明者が使
用する方法の幾つかを記載する。Ａ．PCR生成物を直接視覚化するポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動１．12％の未変性ポリアクリルアミドゲルを注ぐ。２．ゲルが固まったとき、各PCR混合物の半分(50μl)を
入れ、15V/cmで２時間電気泳動する。分子量マーカーと
してpBR322/HpaII消化物0.5μgを含有させる。３．電気泳動後、ゲルをエチジウムブロミド溶液（蒸留
水中 50μg/ml）に浸し、30分間染色する。４．HPV16またはHPV33に対する試料陽性は約200bpの不
連続バンドとして示される。HPV6またはHPV11に対する
試料陽性は約120bpの不連続バンドとして示される。HPV
6/11およびHPV16/33に対する試料陽性は200bpおよび120
bpの不連続バンドとして示される。さらに、HPV18に対
する試料陽性は約100bpの不連続バンドとして示され
る。またはＢ．トッドプロット上のアルカリホスファターゼオリゴ
ヌクレオチドプローブ１．試料の膜の適用 i）エッペンドルフ管に試料25μlを入れる。1.0Mの水酸
化ナトリウム溶液25μlを加え、次いで蒸留水12.5μlを
加える。 ii）管を95〜98℃の水浴中に３分間入れる。 iii）全混合物をハイブロッド(Hybri-dotR)複写を使用
して、用意したナイロン膜に適用する。 iv）２×SSCで洗浄する。 v）膜を乾燥させる。２．アルカリホスファターゼ結合オリゴヌクレオチドプ
ローブによる膜の探査ｉ）予備ハイブリッド形成＝膜を用意したプラスチック
バッグに入れ、予備ハイブリッド形成溶液10mlを加え
る。バッグを閉じ、攪拌し乍ら30℃で40分間インキュベ
ートする。 ii）ハイブリッド形成＝バッグの中味を出し、ハイブリ
ッド形成溶液10mlで置換する。プラスチックバッグを再
び閉じ、攪拌し乍ら30℃で40分間インキュベートする。 iii）洗浄＝バッグから膜を取り出し、37℃に予熱した5
00mlの洗浄溶液１を含有する皿に入れる。この温度で10
分間攪拌する。溶液を500mlの洗浄溶液２と取り替え、3
7℃で更に10分間攪拌する。溶液を今後200mlの洗浄溶液
３で置換し、室温で５分間攪拌する。洗浄溶液３の工程
を更に５回繰り返す。 iv）発色＝膜を色試薬溶液25mlを含有する浅皿に入れ
る。室温で数時間または一夜発色させる。またはＣ．ドットプロット上の放射性オリグヌクレオチドプロ
ーブ i）予備ハイブリッド形成。膜は30℃で少なくとも１時
間予備ハイブリッド形成させる。これには幾つかの試み
を使用することができる。 (a) １つの方法は、実験室の機械的作業で構築した特別
設計のパースペックス（透明アクリル樹脂）ブロックを
使用する。このブロックは、内部を下記溶液に浸して、
膜と共に30℃の水浴中に垂直に立てる。 (b) もう１つの方法は、ホワットマン(Whatman)タイプ5
42の２枚の紙を膜より僅かに大きい寸法に切る。次に、
膜を１枚の紙の上部に置き、膜を予備ハイブリッド形成
溶液２mlで湿めらせる。次いで、ホワットマンの他の１
枚を上部に置き、得られた「サンドイッチ」をプラスチ
ックバッグに残りの予備ハイブリッド形成溶液と共に入
れる。予備ハイブリッド形成混合物：（総量10ml） 10％(w/v) 無脂肪乳粉末 0.5ml （例えば、ジプロマ(DiplomaR)） 20×SSC 2.5ml （3M NaCl 、0.3M クエン酸ナトリウム） 20％(w/v)SDS （ドデシル硫酸ナトリウム）0.5ml 10mg/ml キャリアDNA 2.0ml （例えば、ニシンの精子から）滅菌蒸留水 4.5ml ii）ハイブリッド形成。予備ハイブリッド形成混合物を
流し出し、ハイブリッド形成混合物と取り替える。この
混合物は放射性標識化ウイルスDNAが添加（ハイブリッ
ド形成混合物１ml中１ng）される以外は上記と同じであ
る。ハイブリッド形成はパースペックスブロックまたは
プラスチックバッグ中30℃で一夜進行させる。 iii）膜の洗浄。膜フィルターは高張度条件下で洗浄す
る。これは試料中に存在する可能性のある同一のウイル
スDNAシーケンスに水素結合によって特異的に結合して
いる放射性DNAプローブ以外のプローブを全て除去する
ためである。 iv）オートラジオグラフィー１．膜はフィルター紙を用いて水気を取るが、乾燥はさ
せない。その後まだ湿っている間に１枚の３MMホワット
マン紙にテープで止め、次いで粘着ラップで覆う。２．これを暗室で適当なＸ線フィルム（例えば、コダッ
クのXR−５）に適用し、そして２枚の捕力スクリーン
（デュポン）と共にオートラジオグラフィーカセット中
に閉じ込める。３．オートラジオグラフィーは約80℃で2.5〜12時間進
行させる。４．オートラジオグラフ上の黒ずんだ点はHPVタイプが
存在することを示す。ゆうぜいおよび生検物用プロトコール試薬調製蒸留水１mlを溶解緩衝粉末に加え、次いでこれをバイア
ル中で酵素粉末と混合して溶解緩衝液を調製する。試料調製１．組織を採集緩衝液500μl中で３回すすぐ（上記のか
き取り物の場合と同じ）。２．組織を約１mmの小片に切断する。３．組織に溶解緩衝酵素溶液700μlを添加する。４．37℃で組織が完全に消化されるまで、または37℃で
一夜放置する。５．350μlの除蛋白試薬１および350μlの除蛋白試薬２
を加える。激しく攪拌する。６．15秒間微量遠心分離し、上層を新たな管に取り出す
（下層は棄てる）。７．工程５および６を３回繰り返す。８．700μlの除蛋白試薬２を加え、混合し、15秒間微量
遠心分離する。９．上層を新たな管に取り出し、抽出溶液100μlを加え
る。直ちに氷冷無水エタノール1.4mlを加える。−20℃
で１時間または−80℃で15分間放置する。 10．10分間微量遠心分離し、次いでエタノールを注意深
く流し去る。ペレット(＝DNA)を15分間乾燥させる。 11．DNAをTE50ml中に再懸濁し、可能な場合には、分光
光度計を用いて260nmでDNA濃度を測定する。(1 O.D.₂₆₀
単位＝50μg/ml) ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の手順１．約１μgのDNAを含有する量のDNA溶液をエッペンド
ルフ管中のPCR反応混合物100μlに加える。２．管を95〜98℃に加熱した水浴に入れる。３．10分後に管を暫時（約５秒）微量遠心分離し、濃縮
物を取り出す。４．管を３７℃に予熱した水浴に入れる。５．２分後にDNAポリメラーゼ溶液１μl を加え、そし
て37℃で２分間インキュベーションを続行する。６．管を95〜98℃の水浴に２分間戻す。７．工程４〜６を25回繰り返す。 PCR法で製造したウイルスDNAの検出かき取り物プロトコールについては上記参照。標準および対照標準：HPV6、HPV11、HPV16およびHPV33の純粋なウイル
スDNAまたは少なくとも各HPVのハイブリッド形成標的領
域に対応するオリゴヌクレオチドを、全HPVについては1
25, 12.5, 1.25 および0.125pgの量で、そしてオリゴヌ
クレオチドについては対応して更に少ない量で膜に加え
る。対照：ｉ）新生児包皮DNA（ヒト皮膚DNAに対する非特異的ハイ
ブリッド形成が生起しそうにないことを検出する）を10
ng，50ng，100ngおよび２μgの量で各膜に適用する。 ii）陽性対照：HPV6/11およびHPV16/33に感染した試料
から得たDNA。 iii）Alu−反復シーケンスDNA（Aluプローブにハイブリ
ッドを形成させるために）を10pg，50pg，100pgおよ
び２ngの量で各膜に適用する。（任意）オートメーション化本発明者は、自動的にPCR反応を実施する実用的な標準
機械を設計し構築した。試験結果を得るための総時間（実験室で試料を受理後）数時間〜２日間。本試験で得られる結果結果は患者評価における直接的なHPV検出の重要性を示
している。例えば、頚部細胞に関し正常な細胞学を有し
ている多数の患者が発癌性のHPV種に感染していること
が解った。このことは、本発明者の試験が初期段階、多
分ウイルスが細胞内で形態学的変化を起こす機会を持つ
前に感染を堅守できるという事実を反映していると思わ
れる。更に、HPVの潜在的発癌性種に関係のある組織変
化は、より良性の種によって生じる大きく明瞭なコンジ
ロームよりむしろしばしば扁平であり、それ故、臨床で
は容易には見い出されない。操作方法の例を表わす特別の実験写真複写では良い解像が得られないので、図面は写真の
代わりに図で示す。Ａ．通常のクレノウを使用する純粋なHPV16ウイルスDNA
のPCR増幅。１ngのHPV16/pBR322は、95℃で２分間（ス
トランド解離）、次いで37℃で２分間（アニーリング）
を20ラウンド行った。次いで１Ｕのクレノウ酵素を加
え、37℃で２分間インキュベーションした。得られた混
合物の半分(50μl)は２％のアガロースゲル上で電気泳
動を行い、その結果を図２に示す。量＝2.5×100ng＝25
0ng。増幅領域＝総HPV16シーケンスの40分の１。総増幅
＝250×40＝10,000倍（即ち、反応の効率は各サイクル
で60％であった）。Ｂ．HPV16/33試験でのゆうぜい生検物DNAのPCR増幅。肛
門ゆうぜいGap289のDNAはフェノール／クロロホルムで
抽出し、エタノールで沈殿させた。次いでDNA １μgを2
3回の増幅（各々： 95℃で２分間、次いで37℃で２分
間、１Ｕのクレノウを加えそして37で２分間）に付し
た。40％(50μl)を２％のアガロースゲル上で電気泳動
させた。エチジウムプロミドで染色したDNAを図３に示
す。PCR試料および標準は膜上にスポットし、そして³²
Ｐ−標識HPV16/33標的オリゴヌクレオチドプローブを用
いて一夜ハイブリッド形成させた。洗浄条件は22℃で５
分間、次いで５×SSPE/0.1％SDS中38℃で10分間であっ
た。オートラジオグラフィーの結果を図４に示す。その
量は使用した組換え体ウイルスDNAに対するものであ
り、増幅されたシーケンスは上記DNAの１部分だけであ
り、またそのシーケンスの内部に標的領域があることに
注意。Ｃ．通常のクレノウを使用する純粋なHPV16組換え体DNA
のPCR増幅。１ngのHPV16/pBR322、10mMのトリス・HCl、
pH7.6、10mM MgCl２、50mM NaCl、500ngの各HPV16/33プ
ライマー、４μlの各dNTP（50mMストック）。98℃で２
分間、次いで37℃で２分間、クレノウを加え、次いで37
℃で２分間、以上を23回。２％アガロースゲル上での電
気泳動。エチジウムブロミドで染色したゲルを図５に示
す。レーン１および３はDNAサイズのマーカー、即ちそ
れぞれHpaIIで切断したpBR322およびSPP-1である。予期
される大きさ（約200塩基対）のDNA単一バンドはレーン
２にみることができる。次いで、これを探査するため
に、次のハイブリッド形成条件：５×SSPE、２％SDS、
0.5mlBLOTTO、10mg/mlのサケ精子DNA 0.5ml、蒸留水5.5
ml、を用いて上記ゲル上でサザン法を実施した。予備ハ
イブリッド形成は30℃で１時間であり、ハイブリッド形
成は約１ng/mlの末端標識標的HPV16/33オリゴヌクレオ
チドプローブと共に上記溶液中30℃で一夜行った。洗浄
は１×SSPE、0.1％SUS中38℃で10分間であった。塊状の
ハイブリッド形成がレーン２の予期される位置（即ち、
図５レーン２の染色DNAバンドと同一の位置）で１つの
バンドで示される図６が得られた。Ｄ．肛門ゆうぜいの生検物。患者標本：Gap119, Gap27
8, Km, Gap289, 11912C。条件は上記Ｃで記載したのと
同じ。図７は放射線探査後のオートラジオグラフ。Kmお
よびGap289は＋ve、即ちHPV16を含有していた。Ｅ．HPV16に関し＋veの生検物のサザン法。この実験はH
PV16/33オリゴプローブが増幅していない生検物および
純粋なウイルスDNA中の正しい制限フラグメントにハイ
ブリッドを形成すること並びに他のHPVタイプへの交叉
ハイブリッド形成がないことを示す。レーン１−BamHI／PstIで切断した８μgのGap289 レーン２−ブランクレーン３−BglII／PstIで切断した100ngのHPV33 レーン４−BamHI／PstIで切断した100ngのHPV16 レーン５−EcoRI／XbaIで切断した100ngのHPV18 レーン６−BamHI／PstIで切断した100ngのHPV11 レーン７−EcoRI／PstIで切断した100ngのHPV6 オートラジオグラフ（図８で図式的に示されている）は
放射性HPV16/33でオリゴプローブのレーン４ではHPV16
とのそしてレーン３ではHPV33とのハイブリッド形成を
示す。レーン７、６および５はそれぞれHPV6、11および
18とのハイブリッド形成は生起せず、このプローブはHP
V16および33に特異的であることを示している。Ｆ．頚部かき取り物−HPV16/33のPCR増幅。これは、こ
の技術がかき取り物標本中の特定のHPVを検出できるこ
とを示すものである。かき取り物：PtおよびMo.約10,00
0個の細胞を水3.5μl に懸濁し、98℃に10分間加熱し、
PCR混合物65μlを加え、通常のクレノウを使用する30回
の増幅を用いて通常のプロトコールを続けた。試料は膜
上にドットし、放射性オリゴプローブで探査した。結果
を図９に示す：Ptかき取り物は＋veであり、HPV16/33プ
ローブを有していた。Moは−veであった。Ｇ．かき取り物のサザン法。これは、Ptかき取り物が本
当に増幅されていることを確認するためのものであっ
た。（即ち、Ｈに示した結果の有効性の証明であ
る。）。使用したゲルは1.5％アガロースであった（図
１０）：レーン１−PCR緩衝液中BglI/BamHIで消化したPt PCR 25
μl レーン２−HPV33挿入物40ng レーン３−HPV16挿入物40ng レーン４−HpaIIで消化した0.5μgのpBR322 レーン５−HindIIIで消化したバクテリオファージλ 図１０は染色されたゲルの結果を示す。図１１は放射性
標的オリゴ探査の結果を示す。図１２はアルカリホスフ
ァターゼ標的オリゴ探査の結果を示す。黒いバンドのハ
イブリッド形成は、患者標本のPCR生成物についてはレ
ーン１の正規Iで見ることができ、レーン２および３の
バンドは全ウイルスの位置に対応している。これにより
頚部かき取り物中のHPV16の存在が確認される。以下の
実施例（Ｈ〜Ｊ）は種々の生検物およびかき取り物に対
して使用した技術による陽性結果を更に示す。Ｈ．種々のかき取り物および性器ゆうぜい生検物−HPV6
/11のPCR。（図１３および図１４参照）：レーン１−HpaIIで切断した0.4μgのpBR322 レーン２−0.9μgのF9885ゆうぜいDNA、HPV6/11オリゴ
だけレーン３−1μgの0wゆうぜいDNA、HPV6/11およびHPV16/
33オリゴだけレーン４−F11912頚部かき取り物から得た３μlの細
胞、HPV6/11オリゴだけレーン５−F11912膣かき取り物から得た３μlの細胞、H
PV6/11オリゴだけレーン６−F11912直腸かき取り物から得た５μlの細
胞、HPV6/11オリゴだけ通常のプロトコール条件下で30回実施した。PCR混合物
各50μlを12％の非変性ポリアクリルアミドゲル上に置
いた。染色したゲルを図１３に示す。（約34bpのバンド
はHPV6/11プライマーと関係のある人工物である。）こ
の膜を20V/100mAで１時間電気泳動させ、放射性HPV6/11
オリゴプローブで探査した。Ｘ線フィルムに２時間暴露
した結果を図１４に示す。レーン４および５のバンド
は、この患者から得た頚部および膣部細胞はHPV6/11で
感染しているが直腸細胞はそうでないことを示してい
る。Ｉ．ゆうぜい−HPV6/11のPCR。結果を図１５に示す。レーン１−HpaIIで切断したpBR322 レーン２−750ngのF8408 陰唇ゆうぜいレーン３−１μgのGap252肛門ゆうぜいレーン４−860ngのTr肛門ゆうぜいレーン５−750ngのBi肛門ゆうぜい（条件：25回、HPV6/11プライマーだけ；各PCR混合物50
μlをゲル上で実施。）Ｊ．頚部ゆうぜい−HPV6/11およびHPV16/33プライマ
ー。50μlを12％ポリアクリルアミドゲル上で実施；結
果を図１６に示す。レーン１−HpaIIで切断したpBR322 レーン２−500ngのHn生検物レーン３−500ngのHs生検物レーン４−500ngのLs生検物Ｋ．頚部かき取り物−HPV6/11およびHPV16/33。この実
施例は異なるHPVに対するプライマーを同一の反応混合
物中で一緒に使用して各HPVタイプに独特の増幅生成物
を生成させることができることを示す。結果を図１７に
示す。レーン１−HpaIIで切断したpBR322 レーン２−1ngのHPV6/pAT153および1ngのHPV16/pBR322;
HPV6/11およびHPV16/33プライマーレーン３−CSCO19かき取り物の３μlの細胞、HPV6/11お
よびHPV16/33プライマーレーン４−CSC328かき取り物の３μlの細胞、HPV6/11プ
ライマーレーン５−Ptかき取り物の３μlの細胞、HPV6/11プライ
マー（条件：25回、通常のプロトコール条件。）図１７のレ
ーン２では、200bpのHPV16/33増幅生成物（うすい）お
よび120bpのHPV6/11生成物（より黒い）が見られる。レ
ーン３〜５は陰性である（プライマーバンドだけが見ら
れる）、即ちHPV6/11は含有していない。Ｌ．かき取り物および生検物−HPV16/33のPCR。この実
験はPCR法でHPVを検出する放射性探査と非放射性探査と
を比較するものである。図１３：レーン１−HpaIIで切断したpBR322 レーン２−ブランクレーン３−Ｉから得たHPV6/pAT153とHPV16/pBR322のPCR レーン４−15μlのKm PCR レーン５−15μlのGap289 PCR レーン６−15μlのPtかき取り物PCR ゲル（12％ポリアクリルアミド）を実施し、染色し（図
１８）、次いでエレクトロプロットし、そしてアルカリ
ホスファターゼ（図１９）および放射性（図２０）HPV1
6/33オリゴプローブで探査した。図１２で、HPV16/33を
示す約200bpのバンドはレーン６、５、４および３で見
ることができ、120bpのHPV6/11バンドはレーン３で見る
ことができる。図１９では、約200bpのHPV16/33の増幅
生成物とハイブリッドを形成しているシングルバンドが
レーン６〜３の各々で見られる。図２０はＸ線フィルム
への1.5時間暴露の結果を示す：約200bpのHPV16/33の増
幅生成物とのハイブリッド形成が見られる。図２１は放
射性標的オリゴプローブで探査したドットプロットであ
る（右：ドットプロットの試料の位置の図；左：ハイブ
リッド形成の結果）。Ｍ．熱に安定なポリメラーゼHPV6PCR。１μgのHPV6/pAT
153、２単位のサーマス・アクアチカスDNAポリメラーゼ
を初めに加え、そして40回について10回毎に後に加え
た。使用した条件はニューイングランドバイオラボラト
リーズのプロトコールで規定されたものと全く同じであ
った。結果（図２２）は熱に安定なポリメラーゼも所望
の増幅生成物を生成し得ることを示している。この図
で：レーン１−pBR322/HpaII レーン２−40μlのHPV6/pAT153 PCR Ｎ．熱に安定なポリメラーゼ−HPV16および生検物。増
幅後、HinfIで切断したHPV16/pBR322は52bpと142bpの２
つのフラグメントを生じさせるだろう。５ngのHPV33/pl
inkおよび１μgのGap289は、熱に安定なポリメラーゼと
共に40回の増幅に付した（図２３のレーン４および
５）。使用した条件は50mMのトリス・HCl、25℃でpH8.
8、10nM MgCl２、10mM(NH４)２SO４、10μl DSMO、500n
gの各HPV16/33プライマー、４μlの各dNTP（50mMストッ
ク）および50μlの液状パラフィンであった。４ＵのDNA
ポリメラーゼを開始時に加えた。インキュベーションは
93℃のインキュベーター中30秒、次いで50℃で30秒、次
に63℃で45秒であった。図２３中：レーン１−pBR322/HpaII レーン２−HinfIで切断したHPV16/pBR322（20μl PCR＋
2μlの10×HinfI緩衝液＋1μl酵素＋6μl H２O）レーン３−20μlのHPV16/pBR322 PCR レーン４−20μlのHPV33/plink PCR レーン５−20μlのGap289 Ｏ．希釈した生検部。熱に安定なポリメラーゼを使用し
てPCRを100回。ゆうぜい生検物Gap289(１μg/μl)は
１：10³、１：10⁶および１：10⁷に希釈し、各希釈液1μ
lを用いて増幅を100回実施し、熱に安定なDNAポリメラ
ーゼ４Ｕは最初に加え、次に50回後に更に２Ｕを加え
た。他の生検物およびかき取り物は50回だけに付した。
要件は例Ｐのとおりであった。結果はこの試験の極端な
感度を示している；この過剰回数の増幅による最上の結
果は最もうすい試料で得られた。図２４はエチジウムプ
ロミドで染色したDNAゲルを示す。このゲルをエレクト
ロプロットし、放射性標識HPV6/11（図２５）およびHPV
16/33（図２６）標的オリゴプローブで探査した。結果
はこの試験の極端な特異性を示している。図１６(b)
で、HPV6/11プライマーを使用したレーン５および６で
のみ120bpバンド、即ちHPV6/11増幅生成物の大きさとの
ハイブリッド形成があったことが見られる。HPV16/33プ
ライマーだけを使用して使用を増幅したレーンではハイ
ブリッド形成は全く見られなかった。図１６(c)で、約2
00bpのバンドのHPV16/33増幅生成物とのハイブリッド形
成が生検物（レーン２〜４）および肛門かき取り物（レ
ーン５）で見られる。図２４、図２５および図２６中、
レーンは次のとおりである。レーン１−HpaIIで切断したpBR322 レーン２−Gap289（1：10³)PCR(HPV16/33プライマーだ
け) レーン３−Gap289（1：10⁶)PCR(HPV16/33プライマーだ
け) レーン４−Gap289（1：10⁹)PCR(HPV16/33プライマーだ
け) レーン５−肛門かき取り物Gap402 PCR(HPV6/11およびHP
V16/33プライマー) レーン６−BsゆうぜいPCR(HPV6/11およびHPV16/33プラ
イマー) レーン７−頚部かき取り物11912(HPV16/33プライマーだ
け) レーン８−膣かき取り物11912(HPV16/33プライマーだ
け) Ｐ．標的オリゴプローブの増幅していないHPV16、HPV33
および生検物とのハイブリッド形成。制限酵素で切断し
た通常のHPVおよび生検物をゲル上で実施し、染色し
（図２７）、次いでHPV16/33標的オリゴプローブで探査
した。結果を図２８に示す。図２８ではハイブリッド形
成は各事例で見られ（レーン２〜５）、組換え体ウイル
スDNAの場合には適切な制限フラグメントに見られる。
この増幅していないDNAについてはＸ線フィルムに６日
間暴露することが必要である。図２７および図２８中：レーン１−HindIII/EcoRIで切断したバクテリオファー
ジλ レーン２−５μgのBsゆうぜいDNA、BglII／BamHI レーン３−５μgのGap289、BglII／BamHI レーン４−HPV16/pBR322、BamHI レーン５−HPV33/plink、BglII レーン６−SPP１Ｑ．HPV16/33アルカリホスファターゼオリゴプローブの
HPV16とのハイブリッド形成を示しているドットプロッ
トは図２９に示す。Ｒ．HPV18のPCR。通常のクレノウDNAポリメラーゼを用
いて30回。結果は図３０に示し、その際レーンは：レーン１−HPV16挿入PCR生成物；HPV16/33プライマーレーン２−HPV18挿入PCR生成物；HPV18プライマーを使
用である。約100bpのHPV18 PCR生成物はレーン２に見ることができ
る。レーン１には約200bpのHPV16 PCR生成物がある。

【配列表】配列表 SEQUENCE LISTING <110> Biosearch International Pty Limted <120> A Method of Detection of Carcinogenic Human Papillomavirus <130> <140> <141> <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1188 <212> DNA <213> Papillomavirus <300> <301> Matlashewski, G. et al. <302> The expression of human papillomavirus type 18 E6 protein in bacte ria and the production of anti-E6 antibodies. <303> J. Gen. Virol. <304> 67 <305> <306> 1909-1916 <307> 1986 <308> GenBank X04354 <400> 1 gcataactat atccactccc taagtaataa aactgcttta ggcacatatt tagttgtttt 60 acttaagcta attgcatact tggctgtaca actactttca tgtccaacat tctgtctacc 120 cttaacatga actataatat gactaagctg tgcatacata gtttatgcaa ccgaaatagg 180 ttgggcagca catactatac ttttcattaa tacttttaac aattgtagta tataaaaaag 240 ggagtaaccg aaaacggtcg ggaccgaaaa cggtgtatat aaaagatgtg agaaacacac 300 cacaatacta tggcgcgctt tgaggatcca acacggcgac cctacaagct acctgatctg 360 tgcacggaac tgaacacttc actgcaagac atagaaataa cctgtgtata ttgcaagaca 420 gtattggaac ttacagaggt atttgaattt gcatttaaag atttatttgt ggtgtataga 480 gacagtatac cgcatgctgc atgccataaa tgtatagatt tttattctag aattagagaa 540 ttaagacatt attcagactc tgtgtatgga gacacattgg aaaaactaac taacactggg 600 ttatacaatt tattaataag gtgcctgcgg tgccagaaac cgttgaatcc agcagaaaaa 660 cttagacacc ttaatgaaaa acgacgattt cacaacatag ctgggcacta tagaggccag 720 tgccattcgt gctgcaaccg agcacgacag gaacgactcc aacgacgcag agaaacacaa 780 gtataatatt aagtatgcat ggacctaagg caacattgca agacattgta ttgcatttag 840 agccccaaaa tgaaagttcc ggttgacctt ctatgtcacg agcaattaag cgactcagag 900 gaagaaaacg atgaaataga tggagttaat gatgaagatt taccagcccg acgagccgaa 960 ccacaacgtc acacaatgtg tgtatgtgtg taagtgtgaa gccagaattg agctagtagt 1020 agaaagctca gcagacgacc ttcgagcatt ccagcagctg tttctgaaca ccctgtcctt 1080 tgtgtgccgt ggtgtgcacc cagcagtaag caacaatggc tgatcccggg tccataaggt 1140 acagacgggg agggcacggg ttgtaacggc tggttttatg tacaagct 1188

【図面の簡単な説明】

【図１】PCR法の原理を示した図である。

【図２】実験Ａの結果を示した図である。

【図３】実験Ｂの結果を示した図である。

【図４】実験Ｂの結果を示した図である。

【図５】実験Ｃの結果を示した図である。

【図６】実験Ｃの結果を示した図である。

【図７】実験Ｄの結果を示した図である。

【図８】実験Ｅの結果を示した図である。

【図９】実験Ｆの結果を示した図である。

【図１０】実験Ｇの結果を示した図である。

【図１１】実験Ｇの結果を示した図である。

【図１２】実験Ｇの結果を示した図である。

【図１３】実験Ｈの結果を示した図である。

【図１４】実験Ｈの結果を示した図である。

【図１５】実験Ｉの結果を示した図である。

【図１６】実験Ｊの結果を示した図である。

【図１７】実験Ｋの結果を示した図である。

【図１８】実験Ｌの結果を示した図である。

【図１９】実験Ｌの結果を示した図である。

【図２０】実験Ｌの結果を示した図である。

【図２１】実験Ｌの結果を示した図である。

【図２２】実験Ｍの結果を示した図である。

【図２３】実験Ｎの結果を示した図である。

【図２４】実験Ｏの結果を示した図である。

【図２５】実験Ｏの結果を示した図である。

【図２６】実験Ｏの結果を示した図である。

【図２７】実験Ｐの結果を示した図である。

【図２８】実験Ｐの結果を示した図である。

【図２９】実験Ｑの結果を示した図である。

【図３０】実験Ｒの結果を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者モーリス、ブライヤン・ジェイムズオーストラリア、2006、ニューサウスウエイルズ、シドニー、ザ・ユニバーシテイオブ・シドニー、デパートメントオブフイジオロジー、モレキュラーバイオロジーラボラトリー（番地なし) (72)発明者ナイチンゲイル、ブライアンオーストラリア、2050、ニューサウスウエイルズ、キヤンパーダウン、ロイヤル・プリンス・アルフレッド・ホスピタル、デパートメントオブクリニカルバイオケミストリー（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトの発癌性乳頭腫ウイルスHPV18の検
出方法であって、(a) HPV18のE6領域の塩基配列を示し
た配列番号１における位置418−527の塩基配列からなる
特徴的DNA部分の量を増大させるように、 (i) 加熱してDNAストランドを解離させ、 (ii) 上記特徴的DNA部分の各末端を特定するオリゴヌ
クレオチドプライマーを添加し、 (iii) 冷却して解離したDNAストランドをプライマーに
アニーリングさせ、 (iv) DNAポリメラーゼを添加し、 (v) 冷却した温度で上記特徴的DNA部分の各ストランド
に相補的なDNAを形成させ、 (vi) 解離温度に加熱し、そして熱に安定なDNAポリメラーゼを使用する場合には
工程(iv)は任意に省略して工程(iii)から(vi)を繰り返
す、工程からなるポリメラーゼ連鎖反応法を、ヒト頚部組織
細胞の試料に適用し、そして(b) 増幅した試料中のHPV
18に特徴的な上記特徴的DNA部分の存在または非存在を
検出する、ことからなることを特徴とするヒトの発癌性
乳頭腫ウイルスHPV18の検出方法。
【請求項２】 DNAポリメラーゼが、解離温度で安定な
ポリメラーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項３】 DNAポリメラーゼが、サーマスアクアチ
カスから得た好熱性ポリメラーゼである請求項２に記載
の方法。
【請求項４】増幅した試料の成分をゲル上で分離し、
上記特徴的DNA部分と同じ数のヌクレオチドを有するDNA
の存在または非存在を検出することによって、上記特徴
的DNA部分の存在または非存在を検出する請求項１に記
載の方法。
【請求項５】上記特徴的DNA部分の存在または非存在
を検出するために、上記特徴的DNA部分の任意の領域に
対応する標識オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プロ
ーブが加えられている請求項１に記載の方法。
【請求項６】オリゴヌクレオチドプローブが、^5' GATTTATTTGTGGTGTATAGA^3' である請求項５に記載の方法。
【請求項７】オリゴヌクレオチドプローブが、³²P放
射性標識またはアルカリホスファターゼ酵素標識で標識
されている請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】以下のプライマー１およびプライマー
２：プライマー１：配列番号１の（−）ストランドに
おける位置418−437の塩基配列に相補的なオリゴヌクレ
オチド、プライマー２：配列番号１の（＋）ストランドに
おける位置508−527の塩基配列に相補的なオリゴヌクレ
オチドの混合物からなるプライマー組成物。
【請求項９】各々のオリゴヌクレオチドの塩基配列
が、プライマー１：^5'ACAGTATTGGAACTTACAGA^3' プライマー２：^3'TTTACATATCTAAAAATAAG^5' である請求項８に記載のプライマー組成物。
【請求項１０】請求項１の(b)において、増幅した試
料中のHPV18に特徴的な上記特徴的DNA部分の存在または
非存在を検出するために用いられるオリゴヌクレオチド
プローブであって、オリゴヌクレオチドが、^5' GATTTATTTGTGGTGTATAGA^3' である標識オリゴヌクレオチドプローブ。