JPH02502334A - ヒトの発癌性乳頭腫ウイルスの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトの発癌性丸頭腫ウィルスの検出方法発明の技術分野 本発明は臨床試料中の乳！ＩＩＩウィルスの特別の検出方法に関する。特に、該 試験は、性器等のＭ域から得た細胞が癌と関係のある乳頭腫ウィルスのタイプを をしているかどうかまたは該細胞が一般に良性病変に関係のある乳頭腫ウィルス のタイプを有しているかどうかを、最も短かい時間で識別することを目的とする 。このような識別は、患者評価および追跡において重要な関係がある。

背　　　景 子宮等の頚部（Ｃｅｒｖｉｘ）癌は女性に最も一般的な癌である（女性の全部の 癌の約２５％）、更に、発生率はより若い女性で増加している。実際、定型的な 子宮等の頚部塗抹標本の約２％は異常な細胞学を示し、流行性であることを示唆 している。このような流行病は多くの西欧および発展途上国で流行している。性 的活動は発癌現象および前癌病変の疫学での重要な素因ファクターであると思わ れる。早期年令の性交および性パートナ−の多様性は悪性の危険度の増加と統計 的に関係がある（Ｈａｒｒｉｓ等、Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｑ、３５９〜３６ ３．１９８０年〕、その配偶者はしばしば陰茎ゆうぜい（皮贅）を有する男性（ 「高危険度の男性」）であり、そして子宮等の頚部癌組織は非常に高い割合（〉 ９０％）でヒトの乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）の既知品種の検出可能なりＮＡを有 している。これにより、関係のある性的伝播ファクターとして成るタイプのＲＰ Ｖが頚部扁平細胞の発現に関与していることを示す証拠から増殖体が支持される （ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ等、Ｐｒｏｇｒ、Ｍｅｄ。

Ｖｉｒｏｌ、　ａ％１７０〜１８６．１９８４年；　　ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ＊ Ｐｒｏｇｒ、Ｍｅｄ。

Ｖｉｒｏｌ、　！、１５〜２１．１９８５年；　　ｚｕｒ　ＨａｕｓｅｎｓＣａ ｎｃｅｒ　」迫、１６９２〜１６９６　；　Ｃａｍｐｉｏｎ等、Ｌａｎｃｅｔ土 、９４３〜９４６．１９８５年〕、頚部癌および前癌病変の罹患率はより若い女 性で増々急速に一般的になってきている。治療をしなければ致命的となり、死亡 率は西早期に検出された場合、致命的な結果を除去できるを効な治療を利用する ことができる。

今後もまだ子供を産みたいと願っている、異常な細胞学的塗抹標本をもつ若い女 性を即座に管理しその後追跡すると多くの問題が現われる。乳頭腫ウィルス感染 （「匙状細胞（ｋｏｉｌｏｃｙｔｅ）　Ｊ　）並びに異形成の特徴を有する塗抹 標本の解釈の不確実性によってｒｌｌｎが増加する。更に、頚部癌スクリーニン グ用の現在の細胞学的試験器具、即ちバパニコロー（Ｐａｐ）　！！！沫標本は 約２０％の偽陰性を有する。かなりの数の異形成組織は自然発生的に退行し、他 の組織は進行しない、しかし２．３の異形成は急速に進行する。かくして、形態 学的異常性を間違って定義された集団から時折癌が発現することがある。現在、 パパニコロー塗沫標本がたまたま異常となった場合に癌が生じるかどうかを予言 する明確な方法はない、これら患者の多くの臨床試験では外性器または、実際に は、子宮頚部自体上のゆうぜい病変（尖形コンジローム）は見い出され損ってい る。扁平（非コンジローム性）ゆうぜい（肉眼では見えない）の存在を明らかに するためには、３％の酢酸を適用した後、更に困難な腟鏡検査法が実際には必要 である。これらには前癌性組織変化の疑いがあると思われる。

ゆうぜいは元の位置での癌および明らかな悪性物に組織病理学的に進行すること がはっきりと記載されている【例えば、Ｄｙ５ｏｎ等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈ 、　ｌ１％１２６〜１３１．１９８４年）、！＜程増えている問題は陰性のババ ニコロー塗沫の３年以内に浸潤性癌が生起することである（Ｂｅｒｋｏｗｉ　ｔ ｚ等、Ｇｙｎｅｃｏｌ　、　０ｎｃｏｌ　、Ｊ、３１１．１９７９年：　　Ｈｏ ｌｍａｎ等、Ｍｅｄ、Ｊ、Ａｕ５ｔ、　ｉ、５９７．１９８１年）、乳頭腫ウィ ルス複製が存在することはウィルス粒子またはその群に特異的な抗原の形成によ って頚部コンジロームで確認することができるが、粒子と抗原のどちらも扁平細 胞癌組織では見い出されていない。

形態学に基づく試験の解釈を取りまく不確実性や論争とは対照的に、分子住物学 における新しい技術がこのような問題を迂回し且つ更に客観的な情報を提供する ために利用できる。核酸ハイブリッド形成技術を使用することによって、ウィル ス性ＤＮＡを直接且つ感染初期に同定することができる。実際、これらの試みを 使用して、ＲＰＶタイプが良性および前癌性病変の両方で見い出されている。

現在、約５０タイプの乳頭腫ウィルスがヒトの感染で識別されている。異なるウ ィルスは異なる上皮領域を感染させる。一般に生殖器を感染させる特別のタイプ のＢＰＶには番号６、ＩＬ　１６．１８が付されたものおよび幾つかのより珍し いタイプ（３１，３３，３５，３９，４３および４４）がある、　１ＩＰＶ６　 （ｄｅ　ｌ！１ｌｌｉｅｒｓ等、Ｊ、Ｖｉｏｌ。

、４Ｊ）、−９３２〜９３５．１９８１年〕およびＨＰＶＩＩ　（Ｇｉｓｓｓａ ｎｎ等、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。

４３９３〜４００．１９８２年；　　Ｇｉｓｓｍａｎｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０．５６０〜５６３．１９８３年；　　Ｄａｒｔｍａｎｎ等、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」■、１２４〜１３０．１９８６年〕は良性の尖形コンジロー マ、即ち肛門および生殖器の古典的組織変化に関係がある［Ｇｉｓｓｍａｎｎ等 、Ｊ。

Ｉｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒ＋ａａｔｏ１．　ｆＱ、２６５〜２８５．１９８４年〕、 対照的に、ＨＰＶｌＢ（Ｄｕｒｓｔ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０．３８１２〜３８１５．１９８３年〕およびＩＰＶ１８ 　［Ｂｏｓｈａｒｔ等、ＥＭＢＯＪ、　　３．１１５１〜１１５７．１９８４年 ；　　Ｃｏ１ｇおよびＤａｎｏｓ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１９３．５９９ 〜６０８．１９８７年〕は外陰部および頚部の異形成扁平病変並びに頚部およ４ ６８〜４７１．１９８２年：　　Ｃａａ＋ｐｉｏｎ等、Ｌａｎｃｅｒ土、９４３ 〜９４６．１９８５年〕。

かくして、肛門性器間領域を感染させる）ＩＰＶのタイプは次のように２つのカ テゴリーに割り付ることかできる：１、「低危険度Ｊ：ＨＰシロおよびＩＩＰν １１、タイプ６は全ての肛門性器間タイプの内で最も一般的なものである。

λ　「高危険度Ｊ　：ＨＰＶｌＢ、ＨＰＶｌＢ、ｌ］ＰＶ３１、ＩＰＶ３３、Ｉ ＰＶ３５、ＩＰＶ３９、ＩＰＶ４３およびｌ（Ｐν４４゜危険度がより高いタイ プの生起頻度は順に少なくなっている。

かくして、高危険度°のカテゴリーの中で、ＨＰＶｌＢは最も一般的（４５〜６ ０％）であり、）ＩＰＶ１８はその次に最も一般的（２０〜３０％）であり、そ して他のものはよりまれであり、最後の４つは最近発見されたばかりであって、 １９８６年に報告されている（これらのよりまれなタイプのものの全総頻度はひ とまとめにして約１５％である）、より稀な他のタイプがやがて発見されるもの と思われる。

子宮等の頚部癌におけるＲＰＶの役割を支持するものとしては次の知見が注目に 値する： （ｉ）既知の高危険度ＨＰνのＤＮＡは頚部腺癌および扁平細胞癌の約９０％で 検出されている［Ｚａｃｈｏ−等、Ｎａｔｕｒｅ　３００．７７１−７７３．１ ９８２年；　　にｉｓｓｍａｎｎ等、１９８４年、同上〕。

（ｉｉ　）高危険度）ＩＰＶ　ＤＮＡは頚部ＩＩ瘍に起因する転移部で見い出さ れている［Ｌａｎｃａｓｔｅｒ等、Ａｇｅ、Ｊ−Ｏｂｓｔｅｔ、Ｇｙｎｅｃｏｌ 、ユ８．１１５〜１１９．１９８６年〕。

存在する代わりにヒトのゲノムＤＮＡ中に集まっていることが見い出されている （Ｓｃｈｗａｒｔｚ等、Ｎａｔｕｒｅ」■、１１１〜１１４．１９８５年；Ｌｅ ｈｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　録、５５４０〜５ ５４４．１９８５年；Ｋｒｅｉｄｅｒ等、ＮａｔｕｒｅＪ、６３９〜６４１．１ ９８５年；　　Ｍａｔｓｕｋｕｒａ等・Ｊ、Ｖｉｒｏｌ　５ｆｌ、９７９〜９８ ２．１９８６年；　　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ−ＧａｄｉｃｋｅおよびＳｃｈｗａｒ ｔｚ、　ＥＭＢＯＪ、　　５．２２８５〜２２９２．１９８６年；　　Ｄｉ　Ｌ ｕｃａ等、Ｊ。

Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６７　５８３〜５８９．１９８６年〕、このような集積は 細胞の悪性への転換にとって必要であることが示唆されており、前癌組織中にも 集積しているとの所見によって支持されている（Ｓｈｉｒａｓａｓｏａ等、Ｊ、 Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、　６７、２０１１〜２０１５．１９８６年〕。

（ｉｖ）集積パターンは通常ｔｌＰＶ１６または１８のＤＮＡの特異的領域を中 断しているかまたは欠失しているが、一定してＥ６およびＥ７開始読み取りフレ ーム（ＯＲＦ）は無傷のままであり（Ｐａｔｅｒ　ａｎｄＰａｔｅｒ＋　Ｖｉｒ ｏｌｏｇｙ　ｌｊＱ、３１３〜３１８．１９８５年〕、そしてこれらは少なくと も頚部癌に由来する細胞株中で発現し続ける［ＳｍｏｔｋｉｎおよびＷｅｔｔｓ ｔｅｉｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＤＮＡ益、４６８０〜４ ６８４．１９８６年；　　Ａｎｄｒｏｐｈｙ等、ＥＭＢＯＪ、　　６．９８９〜 ９９２．１９８７年；　　Ｂａｋｅｒ等、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　ｆｌｌ、、９６２ 〜９７１．１９８７年；τａｋｅｂｅ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｈｙｓ、Ｒｅ ｓ、Ｃｏ＊ｗｕｎ、、ＪＪＪｓ　８３７〜８４４．１９８７年〕。

（Ｖ）スプライスドナーは、翻訳時に表皮性増殖ファクターに類僚するＯＲＦの 生成を生じさせ得るＨＰＶｌＢおよび１８（ＩＰＶ６および１１ではない）のＥ ６０ＲＦ中に存在する（ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ、　Ｌａｎｃｅｔ４８９〜４９１ ．１９８６年〕。

（ｖｉ）頚部細胞株（１’１ｅＬａ、　Ｃａ５ｋｉ、　５ｉＨａ、　５Ｗ７５６ 等）での集積はしばしば原腫瘍遺伝子に似ている（Ｄｉｉｒｓｔ等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　１１４．１０７０〜１０７４．１９８７年；　　Ｐｏｐｅ ｓｃｕ等、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ。

Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、　［５８〜６２．１９８７年ＨＰｏｐｅｓｃｕ等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ。

４１６８２〜１６８５．１９８７年；　　Ｓｈｉｒａｓａｅｍａ等、Ｊ、Ｇｅｎ 、ν１ｒｏ１．ｊｉｆｉ、５８３〜５９１．１９８７年〕。

（ｖｉ）このような集積は、ＲＰＶによる細胞性ｌｌＩ瘍遺伝子のｃｉｓ　−活 性化が頚部細胞の悪性形質転換に関係があるとの示唆と一致して、ｃ−＠ｙｃお よびｃ−ｒａｓ　＋５ＲＮＡの発現増加に関連がある（Ｄｉｒｓｔ等、１９８７ 年、同上；　　Ｓｈｉｒａｓａｗａ等、１９８７年、同上）。

（ｖｉ）ヒトの腺維芽細胞およびケリタノサイト（ｋｅｒｉ　ｔａｎｏｃｙｔｅ ）は、Ｎ１１１３Ｔ３細胞（Ｔｓｕｎｏｋａｗａ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　ＦＪＩ、２２００〜２２０３．１９８６年；　　Ｙ６ ｓｕｍｏｔｏ等、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　５７．５７２〜５７７．１９８６年）と同 様にＩＰＶ１６でのトランスフェクションによって形質転換することができる（ Ｐｉｒｉｓｉ等、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、Ｊ６．１０６１〜１０６６．１９８７年〕。

（ｔｘ）集積は細胞干渉ファクターをコードする遺伝子を分裂させ；このことに よって、ウィルスの非制御増殖および転写を抑制する細胞の正常な防御メカニズ ムが駄目になることがある［ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ＋　Ｌａｎｃｅｒ　４８７〜 ４９１．１９８６年〕。

男性の陰茎ゆうぜいは極くまれにしか陰茎の癌を生じさせないが、子宮等の頚部 に伝染したとき、癌は更に一層容易に生じる。！Ｉｌ織学的に確認された頚部Ｒ ＰＶ感染を有する患者の約３分の１は１年以内に頚部上皮肉腫瘍形成（ＣＩＮ） を発現すると思われる（Ｎａｓｈｅｔ等、０ｂｓｔｅｔ、　Ｇｙｎｅｃｏｌ　Ｆ ）ｌ、１６０〜１６２．１９８７年〕。

しかし乍ら、感染と癌との間の時差はしばしば１０〜３０年である。

かくして、頚部の独特の環境が、また、喫煙のような他のファクターと一緒にな って〔丁ｒｅｖａｔｈａｎ等、Ｊ、Ａｍ、Ｍｅｄ、Ａｓｓ、　釘曵、４９９〜５ ０４．１９８３年〕、癌の開始に寄与する。後者によるＤＮＡの損傷は、細胞増 殖を生じさせるａｐｖの作用と一緒になって、悪性物の開始を説明することがで きよう、前癌病巣を有する女性の治療には影響を受けた領域の外科的摘出が含ま れる。更に、男性による再感染および他の女性への感染を避けるために、治療に は女性の男性感染配偶者も含めなければならないことは現在多くの人に信じられ ている。

頚部細胞の定型的スクリーニングに現在使用されている細胞学的試験（パブ塗抹 ）は主観的なものと考えられ、病変中の特別のタイプのＲＰＶの同定は可能でな いので、本発明者はウィルスを直接検出するＤＮＡ　−ＤＮＡハイブリッド形成 の更に特異的な試みがやがて定型的に初期スクリーニングの細胞学に代用されま たは代替して使用されることさえあろうと予見する。

患者の臨床評価では、潜在的発癌性（高危険度）タイプが潜伏している組織変化 を更に良性（低危険度）タイプに関連する組織変化と区別することが重要である 。

患者標本のＢＰＶ感染の評価はフィルターハイブリッド形成の技術によって促進 されている。このような技術は、定型的な細胞学用の試料と平行して採集した頚 部細片中のＩＩＰＶ　ＤＮＡを検出するために使用されている（ＷａＢｅｒ等、 ０ｂｓｔｅｔ、Ｇｙｎｅｃｏｌ、　餞、７６７〜？７２．１９８４年；　　Ｗｉ ｃｋｅｎｄｅｎ等、Ｌａｎｃｅｔ土、６５〜６）、１９８４年：　　５ｃｈｎｅ ｉｄｅｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ　Ｌ玉−１０６５〜１０７０．１９８２年〕。

１９８５年１月に１つのプロジェクトが性器タイプのＲＰＶの直接試験を開発す るためにシトニー大学でモリス０１ｏｒｒｉｓ）博士によって開始された；　こ のプロジェクトは感染が高危険度タイプの１つによるのかまたは低危険度タイプ の１つによるのかを評価するという特別の目的をもっていた０組換え体ウィルス ＤＮＡに係わる試験の予備的方法を記載している最初の刊行物は、ビー・アール ・ヘンダーソン（Ｂ、Ｒ，Ｂｅｎｄｅｒｓｏｎ）　、シー・エイチ・トンプソン （Ｃ，Ｈ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、ビー・アール−ｏ−ズ（Ｂ、Ｒ，Ｒｏｓｅ）、 ワイ・イー・コサート（Ｙ、Ｅ、Ｃｏ５５ａｒｔ）およびビー・ジェイ・モリス （Ｂ、ＪＪｏｒｒｉｓ）の「頚部かき取り物、肛門かきとり物および性器生検物 中の特異的タイプのヒト乳頭腫ウィルスのＤＮＡハイブリッド形成による検出」 、ジャーナル・オプ・メディカル・パイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅ ｄｉｃａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　ｌｌ、３８１〜３９３．１９８７年である。

この報文は１９８６年の始°めに提出された。それ以後組換え体Ｄ）ＩＩＡ試験 の感度は１００倍に上昇し、そして更に改良が間断なくなされている。　ｓ、ｏ ｏｏを超える臨床標本が現在までに試験されている。これらは主としてシトニー Ｓ、Ｔ、Ｄ、クリニックからのものである。今までのところ、このデータによっ て、頚部かき取り物および他の性器標本でのＲＰＶ惑染感染在および性質を決定 するための直接的ウィルス検出の実行可能性および有用性が確立された。この方 法を使用している本発明者等の他の最近の刊行物には、ビー・アール・ローズ、 シー・エイチ・トンプソン、エイ・エム・マクドナルド（Ａ、Ｍ、ＭｃＤｏｎａ ｌｄ）、ビー・アール・ヘンダーソン、ワイ・イー・コサートおよびビー・ジェ イ・モリスの「肛門性器間ゆうぜい培養物の細胞生物学」、プリティッシュ・ジ ャーナル・オブ・デルマトロジー（ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄｅ ｒｍａｔｏｌｏｇｙ）　１ｌｆｉ、３１１〜３２２．１９８７年；　ビー・ジェ イ、パーカー（Ｂ、Ｊ、Ｐａｒｋｅｒ）、ワイ・イー・コサート、シー・エイチ ・トンプソン、ビー・アール・ローズおよびビー・アール・ヘンダーソンの「肛 門ゆうぜいの臨床的管理および実験室評価」、メディカル・ジャーナル・オブ・ オーストラリア（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ ）Ｊｊｊ：、５９〜６３．１９８７年；ビー・エム・カテラリス（Ｐ、Ｍ、Ｋａ ｔｅｌａｒｉｓ）、ワイ・イー・コサート、ビー・アール・ローズ、ビー・ナイ チンゲール（Ｂ。

Ｎｉｇｈｔｉｎｇａｌｅ）、イー・ソリッチ（Ｅ、５ｏｒｉｃｈ）、シー・エイ チ・トンプソン、ビー・ビー・ダラス（Ｐ、Ｂ、Ｄａｌｌａｓ）およびビー・ジ ェイ・モリスの「ヒト乳頭腫ウィルス：未治療男性保持者」、ジャーナル・オブ ・ウロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｕｒｏｌｏｇｙ）、印刷中、１９８８年 、他の多くの研究が更に発表されるはずである。

最も一般的な肛門性器間ＨＰｖタイプの主要ストランドＤＮＡシーケンスについ ては次のものを参照： ＨＰＶ　６ｂのシーケンスはシュバルッ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）等、ＥＭＢＯＪ、 　−２−１２３６１〜２３６８．１９８３年に示されている。

ＲＰＶ　１１のシーケンスはダルトマン（Ｄａｒｔ簡ａｎｎ）等、パイロロジ− （Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）皿、１２４〜１３０．１９８６年に示されている。

ｆｌＰＶ　１６のシーケンスはゼードルフ（Ｓｅｅｄｏｒｆ）等、パイロロジー 　υ匝、１８１〜１８５．１９８５年に示されている。

ＲＰＶ　１８のシーケンスはマトラシェウスキイ（Ｍａｔｌａｓｈｅｗｓｋｉ） 等、Ｊ、ＧｅｎＪｉｒｏｌ、　　ｆｉｌ、１９０９〜１９１６．１９８６年に示 されている。

ＨＰＶ　３３のシーケンスはコール（Ｃｏｌｅ）およびストリーク（Ｓｔｒｅｅ ｋ）、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　　５）ＪＪ、−９９１〜９９５．１９８６年に示され ている。

ハイブリッド形成による特異的ウィルスＤＮＡ検出の原理Ｄ）ｉＡは二重ｖＡ（ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ）である、　ＤＮＡの各ストランドは他のストライ ドの相補的「鏡像」である、　ＤＮＡストランドは水素結合によって一緒に保持 されている。ウィルスＤＮＡを検出する本発明者の技術は、１つのＤＮＡストラ ンド中のヌクレオチドの独特のシーケンスがそれと相補的なシーケンスに結合す る（「ハイブリッドを形成する」）能力に基づいている。それ故、乳頭腫ウィル スタイプの全部分または特を部分のＤＮＡシーケンスを備えたものを、患者の子 宮頚部細胞の試料中のウィルスを検出するために「帰巣プローブ」として使用す ることが可能である。プローブとして使用するＤＮＡは放射性同位元素かまたは 非放射性標識かのどちらかで標識されているので、後で検出することができる。

この試験の感度を高めるために、本発明者は試料中のＲＰＶ　ＤＮＡシーケンス の増幅方法を利用した。

ウィルスＤＮＡを増幅するために使用した試みの背景検出技術の感度を高めるた めに、本発明者は遺伝子病の診断用にもともと記載された方法を使用する。これ は「ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉ ｏｎ）　Ｊ　（ＰＣＢ）として知られている。これは、合成オリゴヌクレオチド プローブとハイブリッドを形成させる前に特定のＤＮＡシーケンスを酵素的に増 幅するために使用される。典型的な増幅ファクターは、ウィルスＤＮＡの１つの コピーから出発した約２５０．０００個のコピーである。

このような試みは感度を高めるだけでなく、更に多用途の試験法に期待される非 放射性検出方法での特異性、スピード、簡易性および使用し易さの要件を充たし ている。キットとして組み立てることやオートメ化することも可能であり、その 両者共本発明者が達成した。　ＰＣＲ技術は、特定の遺伝子異常の出生前診断試 験を扱った論文に記載されている（Ｓａｋｉｉ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２Ｍ、１３５ ０〜１３５４．１９８５年；　　５ａｋｉｉ等、ＮａｔｕｒｅＪ３ｊ４．１６３ 〜１６６．１９８６年；　　５ｃｈａｒｆ等、５ｃｉｅｎｃｅ　」困、１０７６ 〜１０７Ｂ、１９８６年］、ＰＣＲ技術は次の特許出願の対象である：　１９８ ５年３月２８日付米国優先権日のオーストラリア公開特許出１１１５５３２２／ ８６、シータス・コーポレーション（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐ、）の「核酸シーケ ンスの増幅法に１９８５年３月２８日付米国優先権日のオーストラリア公開特許 出１１１５５３２３／８６、「ハイブリッド形成プローブによる標的核酸の増幅 と検出」。

簡単に言えば、ＲＰＶ　ＤＮＡシーケンスの小さな特有部分、即ち長さ約１００ 〜２００ｂｐがＰＣＲ法で増幅される。実施例では、Ｅ６領域の１つの領域を選 択した。しかし乍ら、ウィルスＤＮＡの任意の他の領域も選択することができる 。　ＰＣＲ工程には、増幅すべき領域の側面に位置する２つの約２０ｓｅｒのオ リゴヌクレオチドブライマーが必要である。１つのブライマーはＤＮＡの１つの 領域の（＋）−ストランドに相補的であり、もう一方は（−）−ストランドに相 補的である。変性させた試料ウィルスＤＮＡの　（＋）−ストランドにブライマ ーをアニーリングし、次いで、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、または同様の 反応を行う他の酵素のフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントおよびデオキシヌ クレオチドトリホスフェートとで拡大すると、ブライマーのハイブリッド形成部 位間に存在している「標的」シーケンスを含有する（−）−ストランドフラグメ ントが合成される。同時に、同様な反応が他のブライマーで生じ、新しい（＋） −ストランドが創生される０本方法の原理を次の図で示す。

これらの新たに合成されたＤＮＡストランドはそれ自体ＰＣＲプライマーの型板 であるので、変性化の繰り返しサイクル、ブライマーアニーリングおよび拡大に よってブライマーで特定された約１００〜２００ｂｐ領域の典型的集積が生じる ０次に、特定のＤＮＡを検出する０種々の手段がこの検出の実施に可能である。

生成したＤＮＡ量はゲル上での電気泳動および染色後に直接目で十分見える量で あろう。

本発明の開示 特に、本願発明はヒトの発癌性乳頭腫ウィルスＨＰＶ１６および／または１ＩＰ Ｖ１８の検出方法を提供し、該方法は、ｉ　（ａ） （ｉ）加熱してＤＮＡストランドを解離させ、（ｉｉ　）下記の特徴的ＤＮＡ部 分の各末端を特定するオリゴヌクレオチドブライマーを添加し、 （ｉｉｉ）冷却してブライマーを解離したＤＮＡストランドにアニーリングさせ 、 （ｔｖ）　ＤＮＡポリメラーゼを添加し、（ｖ）冷却した温度で下記の特徴的Ｄ ＮＡ部分の各ストランドに相補的であるＤＮＡを形成させ、 （ｖｉ）解離温度に加熱し、 そして、熱に安定なりＮＡポリメラーゼを使用する工程（ｉｖ）は任意に省略し て、工程（ｔｉ）から（ｖｉ）を繰り返す、工程からなるポリメラーゼ連鎖反応 技術を１．任意の上記発癌性ＨＰνの選択した特徴的ＤＮＡ部分の量を増幅させ るように、ヒトの頚部組繊細胞の試料に適用し、 そして （ロ）増幅した試料中の１ＩＰＶ１６または１８に特徴的な上記特徴的ＤＮＡ部 分の存在／非存在を検出する、ことからなる。

本発明はまた、使用した特異的オリゴヌクレオチドブライマーおよび以下に記載 するような特定の標識をしたオリゴヌクレオチドブライマーにも及ぶ。

例示の目的で本発明の実施例を以下に記載する。

実施例 使用した典型的な技術の要約 １、かき取り物またはゆうゼい＆Ｕ織は定型的方法によって病院で採集し、必要 な場合、分析実験室に輸送する前に３日間まで貯蔵する。

２、細胞は溶解させ、そのＤＮＡを変性させる。

３、　ウィルスＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。

４、　ウィルスＤＮＡは、例えば電気泳動および染色〔二試験の終了点〕によっ て直接検出するか または ４ａ、試料（複数）はドツト複写を使用して、負荷したナイロン膜に適当な標準 および対照と共に適用する。

５、　フィルターは予備ハイブリッド化させる。

６、　フィルターは、標識した混合ウィルスＤＮＡプローブ、即ちｒ高危険度Ｊ 　　（ＰｔＩ在的に発癌性）用のプローブおよび「低危険度Ｊ　ＩＩＰＶ用の他 のプローブを含有する１つの混合物を用いてハイブリッド化させる。

７、　フィルターは適当な張力条件下で洗浄し、その際密接に関連したシーケン スだけが付着したままである（各々の相補的ＤＮＡストランドの水素結合によっ て）。

８、オートラジオグラフィー、（試料を適用したＸ線フィルム上の暴露物の黒い スポットは、精査されるカテゴリーのＨＰｖウィルスを含有していることを示す ）、または８ａ、非放射性検出方法を実施する。（適当な場合、着色スポットま たは他のシグナルは探査されるカテゴリーのＨＰνウイルスを含をしていること を示す、） 記載した試験で作用するオリゴヌクレオチドの実施例ブライマー 各ＲＰＶタイプまたはカテゴリーに関して、２つの合成オリゴヌクレオチドをＰ ＣＢの拡大および増幅工程のブライマーとして使用するために合成した。これら のオリゴヌクレオチドは重要な特異的「標的」シーケンスの側面に位置するＤＮ Ａに対応し、この標的シーケンスはＩＩＰＶに独特のものであり且つその隣りの １つの）ＩＰＶタイプまたはカテゴリー（ｒ高危険度」対「低危険度」）とは異 なっているウィルスゲノム中のＤＮＡシーケンスである０本発明者は以下に記載 したオリゴヌクレオチドが適切であることを見い出したが、他の適当なシーケン スを指示された特定のウィルスタイプまたは他のタイプの乳頭腫ウィルスに対し て選択することもできる。

低危険度ＨＰＶ ＨＰシロ及びＨＰＶＩＩに関して、適当な標的シーケンスをウィルスゲノムの開 始読み取りフレーム内で選択した。この標的シーケンスの側面に位置し、ブライ マーとして使用するのに適当なりＮＡクシ−ンスは次のとおりであり（その際、 位置番号はウィルスゲノムのヌクレオチドシーケンスを指す）、上記ＲＰＶの各 々について同一である： これらのブライマーはＨＰＶ　６およびＨＰＶＩＩ上に相補的シーケンスを有す る。これらはＨＰＶ１６、ＨＰＶＩＢおよびＨＰＶ３３のゲノム中のシーケンス とは異なっており、その際、選択したＤＮＡ標的シーケンスの側面に位置する別 個のプライマーが、上記および下記と同じ原則を用いて、各々ＩＩＰシロおよび ＨＰＶＩＩ用のプローブとして使用するのに適当なオリゴヌクレオチドと一緒に されＨＰＶ用に合成される。

高危険度ＲＰＶ ）ｌＰＶ１６およびＩＩＰＶ３３に関して、選択した標的シーケンスの側面に位 置する適当なシーケンスは次のとおりである：ＨＰＶ１Ｂに関して、選択した標 的シーケンス側面に位置する適当なシーケンスは次のとおりである： 各試料に全ＲＰＶタイプ用のプライマーを添加することが最も便利である０次い で、試料を分割し、ＲＰＶタイプの各カテゴリー（高危険度対低危険度）につい て探査することができる。

プローブとして使用する標的オリゴヌクレオチド低危険度ｎｐｖ プローブとして使用するためにオリゴヌクレオチド（標的）を合成する。これは ２つのプライマー間の領域に相当し、ウィルスタイプＢＰ１１６およびＨＰＶＩ Ｉの各々について同一であるが、他のどんなウィルス性または他のＤ）ＩＩＡシ ーケンスとも勿論具なっている。これらシーケンスは次のとおり−である：ＢＰ Ｖ１６およびＨＰＶ３３の検出用に、次のオリゴヌクレオチド（標的）シーケン スをプローブとして使用するために合成する：ＨＰＶ１Ｂを特定的に検出するた めに、または高危険度ＲＰＶのカテゴリー内で、次のオリゴヌクレオチド（標的 ）シーケンスをプローブとして使用するために合成する：これらシーケンス全て の正確な位置は公表されたウィルスゲノムのシーケンスの検査によって知ること ができる。この同じ原理、即ちＩＩＰＶ中の特異的標的シーケンスの側面に位置 するＤＮＡの反対側ストランドとハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドの 合成が、上記した刊行物中に記載されたＩＩＰＶのシーケンス内および公表され たときには他のＨＰＶのシーケンス中の他の組合わせのシーケンスに同様に適用 され得ることが強調されるべきである。

標的オリゴヌクレオチドのＩｓ急化 放射性ｍ識 Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してＣＴ−”Ｐ）　ｄＡＴＰで約３０＋ｓ ｅｔの５′末端を標識化する［ＢｅｒｋｎｅｒおよびＦｏｌｋ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ 。

Ｃｈｅｗ、　ｍ、３１７６〜３１８０．１９７７年〕、キットはデュポンにュー イングランドＮｕｃｌｅａｒ）から入手可能であり、この工程に使用することが できる。

ｉ、下記を混合する： ５′末端りん酸塩を存するＤＮＡ　　　　　　　　１〜５０ｐｍｏ１１０×交換 反応緩衝液＊５ｊｉ ５ｍＭＡＤＰ　　　　　　　　　　　　　　　　３４（Ｔ−”Ｐ　）　ｄＡＴＰ 　Ｃ比活性３０００Ｃｉ／ｓｍｏｌ）　　１００ｐ１００ｐ即ち、１０ｓ＋Ｃｉ ／ｄ溶液３０ｍ）蒸留水　　　　　　　加えて５０ｍとする。

Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ　　　　１ｍ（２０単位）′″１０×交換反応緩 衝液：　０．５ＭイミダゾールＣｊ　（ｐＨ６，６）０．１Ｍ　　Ｍｇ（Ｊｔ ５０■Ｈジチオスレイオール １■ガスペルミジン １　ｓＭ　ＥＤＴＡ ■、３７℃で３０分間インキエベートする。

Ｌ　０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　２ｍを加える。

Ｎ、フェノール／クロロホルムで１度抽出する。

非放射性標識化 ハイブリッド形成プローブとして使用するオリゴヌクレオチドの非放射性標識化 には種々の方法が利用できるようになってきている。放射性標識物は一般に長い 半減期を有しており危険を避けなければならずまた放射能の使用には許可が必要 であるので、上記方法はＢＰＶ検出キットでの使用に一層適している。

本発明者は、アルカリホスファクターゼが直接標的オリゴヌクレオチドに結合し ている、新規技術（アプライド（Ａｄｅｌａｉｄｅ）のＢＲＥＳＡによって実施 ）によって製造された非放射性オリゴヌクレオチドを使用した。アルカリホスフ ァクターゼで標識した任意の特定のシーケンスのオリゴヌクレオチドはＢＲＥＳ Ａから注文で入手可能である。

試　　薬 採集緩衝液−りん酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）　−１４０■？Ｉ　Ｎａ（Ｊ、 ３ｍＭＫ（ｊ、　８　ｍＷ　　ＮａｚＨＰＯａ　　・　１２Ｂ！０、１．５ｓｔ ｌ’ｌ　　ＫＢｚＰ（ｌａ溶解緩衝液＝５０ｓＭ　Ｎａ（Ｊ、５ＱｍＭ　）リス 、ｐＨ７，５，０，５％ＳＤＳ、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ酸素粉末＝ブロティナー ゼＫ　（１０ｄの溶解緩衝液を添加後の濃度−５０１！ｇ／ｄ） 除蛋白試薬１−フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：　２ ４　：　１　、ｖ／ｖ）除３ｉ白１ｅｔｉ２−クロロホルム／イソアミルアルコ ール（２４：１、ｖ／ν） 抽出溶液−３Ｍの酢酸ナトリウム ＰＣＲ緩衝液（通常のフレノウを使用する場合）　＝５０ｍＭ　　Ｎａα、１０ ｍＭ　　）すＸ　−ＨＣｊ、　ｐ［，６，１０ｍＭ　ＭｇＣＪｌＰＣＲ緩衝液（ 熱に安定なりＮＡポリメラーゼを使用する場合）−５０ｍＭ　　）　！Ｊ　：Ａ 　・Ｈ（Ｊ、ｐＨ８，８（２５℃で）、１０＋ｓＭ　　硫酸アンモニウム、１０ １ガｇ（Ｊ富ＰＣＲ試薬緩衝液− １０Ｘ　ＰＣＲ緩衝液　　　　　　１０ｍｄＮＴＰｓ　　　　　　　　　　　　 １６Ｉｉ（各５０ｍＭストックを４ｕｉずつ） ジメチルスルフオキシド　　ＩＯＪ ブライマー　　　　　　　　　各５００ｎｇ／ｍストックをＩＪＩＩｌずつ（− 合計４ＩＪ１） ＤＮＡ　（細胞またはＤＮＡ）　　　　　Ｘ　ｄｄ）ｌ！Ｏ容量を１００　ｕｉ にする。

ＤＮＡポリメラーゼ溶液−Ｉ　Ｕ／ｍのＤＮＡポリメラーゼ（フレノウフラグメ ント） 予備ハイブリッド形成溶液−６ｘｓｓｃ、２５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ ）溶液、０．５％ドデシルＰｘ酸ナナトリウムハイブリッド形成溶液６ｘｓｓｃ 、１×デンハート溶液および０．５％ＳＯＳ、オリゴヌクレオチドプローブと結 合したアルカリホスファターゼ１１００ｎ／ａａｆと共に。

洗浄溶液１−６　ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ洗浄溶液２−６　Ｘ５ＳＣ１ 洗浄溶液３−ＩＭＮａｌＪ、０．１Ｍ　）リス・）ｌ（Ｊ、ｐｕｓ、ｓ、５ｍＭ Ｍｇ（Ｊｚ 色試薬溶液−０，３３ｍｇ／−のニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、０． １７＋＋＋ｇ／ｄの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホス７　ｓ−）　 （ＢＣＩＰ）、０．１Ｍ　　）　！Ｊ　ス−ＨＣＪ　（ｐｊ９．５）中０．３３ ％（ｖ／ｖ）のジメチルホルムアミド、０．ＩＭ　　ＮａＣＪ、５ｍＭ　　Ｍｇ α。

ＴＥ＝１０ｍｌ’！　　）リス−ＨＣｌ１．　ｐａｓ、ｏ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ ＳＳＣ＝生理的クエン酸食塩標準溶液 （Ｉ　Ｘ５ＳＣ−０，１５？Ｉ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ　　クエン酸三ナ トリウム、ｐＨ７，０） デンハート溶液−フイコール５ｇ１ポリビニルピロリドン５ｇ、ウシ血清アルブ ミン５ｇ２蒸留水で５００ｊｄにする。

５ＤＳ−ドデシル硫酸ナトリウム 子宮等の頚部または他の性器かき取り物用のプロトコール患者の標本採集 １、腟鏡を用いて病院の患者からまたは、好ましくは、類スクリーニングの場合 には子宮頚膣洗浄によってかき取り物（ＥＩち、バブ塗抹標本用）を採集する。

２、かき取り物を付けたスティックを用意した採集管に入れる。（この管には滅 菌採集緩衝液が入れである。）３、かき取り物組織は４℃で２〜３日またはより 長期に貯蔵するためには一２０℃で冷凍して保存することができる。

試料調製 １、採集管を取り、膣鏡上の残存細胞を管中の採集緩衝液に振り入れる。懸濁物 をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　）管に注ぐ。

２．１５分間微量遠心分Ｈ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）する、ペレットからＰＢＳを 流し捨てる。細胞を暫時回転させて新鮮な採集緩衝液５００Ｉｉに再懸濁させる 。再び微量遠心分離する。

３、工程を更に２回繰り返す。

４、血球計を用いて１ｍｌ当たりの細胞数を測定する。

ポリメラーゼ連鎖反応の手順（通常のフレノウ）１、　エンペンドルフ管中の３ ５ｕ１の蒸留水に約１０．０００個の細胞を含有する量の細胞懸濁液を加える。

２、管を９５〜９８℃に加熱した水浴に入れる。

３．１０分後に管を取り出し、そして暫時微量遠心分離して濃縮物を取り出す。

４、　直ちにＰＣＲ試薬緩衝液６５βを加える。

５、管を３７℃に加熱した別の水浴に入れる。

６．２分後にＤＮＡポリメラーゼ溶液１１ｉを加え、３７℃で２分間反応させる 。

７、管を９５〜９８℃の水浴に２分間戻し、次いで暫時微量遠心分離する。

８、　工程５〜７を２５回繰り返す。

ポリメラーゼ連鎖反応の手順（サーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒａ＋ｕｓ　ａ ｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の好熱ポリメラーゼ）９５℃に耐性であるＤＮＡポリメ ラーゼを代わりに使用する。この酵素を使用するとある程度反応が促進され、そ して最も重要なことは、コストが約２０％減少する０本発明者はニューイングラ ンドバイオラボラトリーズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）が販売 している酵素を使用した。この酵素はニュージーランドロトルア（Ｒｏｔｏｒｕ ａ　）の温泉から得た株から精製することができる。プロトコールは、９３°Ｃ で５分間、蒸発を防ぐため５０μの液体パラフィンを加え、次いでポリメラーゼ ４Ｕを加え、その後５０°Ｃの水浴中で３０秒、６３°Ｃの水浴中で９０秒そし て９３℃の水浴中で３０秒間インキュベートする以外は上記のとおりである。こ のサイクルを例えば５０回繰り返す。

ＰＣＲ法によって製造したウィルスＤＮＡの検出この時点からは多くの試みが可 能である０本発明者が使用する方法の幾つかを記載する。

Ａ、ＰＣＲ生成物を直接視覚化するポリアクリルアミドゲル電気泳動 １．１２％の未変性ポリアクリルアミドゲルを注ぐ。

２、ゲルが固まったとき、各ＰＣＲ混合物の半分（５０ｕｉ）を入れ、１５Ｖ／ ＣＩで２時間電気泳動する０分子量マーカーとしてｐＢＲ３２２／Ｈｐａ　ＩＩ 消化物０．５．を含有させる。

３、を気泳動後、ゲルをエチジウムプロミド溶液（蒸留水中５０悶／ｄ）に浸し 、３０分間染色する。

４、　　ＨＰＶ１６またはＨＰＶ３３に対する試料陽性は約ｚｏｏｂｐの不連続 バンドとして示される。ＨＰＶ６またはＩＩＰＶＩＩに対する試料陽性は約１２ ０ｂｐ（７）不連続ハンドとして示される。　）ｌＰＶ６／１１およびＨＰＶ１ ６／３３に対する試料陽性は２００ｂｐおよび１２０ｂｐの不連続バンドとして Ｂ、ドツトプロット上のアルカリホスファターゼオリゴヌクレオチドプローブ １、　試料の膜への通用 ｉ）エッペンドルフ管に試料２５Δを入れる。　１．０Ｍの水酸化ナトリウム溶 液２５ｍを加え、次いで蒸留水１２．５ｍを加える。

ｉｉ）管を９５〜９８℃の水浴中に３分間入れる。

ｉｉ）全混合物をハイブリッド（Ｈｙｂｒｉ−ｄｏｔ■）複写を使用して、用意 したナイロン膜に適用する。

ｔｖ）２ＸＳＳＣで洗浄する。

■）膜を乾燥させる。

２、　アルカリホスファターゼ結合オリゴヌクレオチドプローブによる膜の探査 １）予備ハイブリッド形成−膜を用意したプラスチックバッタに入れ、予備ハイ ブリッド形成溶液１０ｄを加える。バッグを閉じ、攪拌し乍ら３０℃で４０分間 インキエベートする。

ｔ）へイブリッド形成冨バッグの中味を出し、ハイブリッド形成溶液１０ｄで置 換する。プラスチックバッグを再び閉じ、攪拌し乍ら３０℃で４０分間インキエ ベートする。

ｆｆ１）洗浄−バッグから膜を取り出し、３７℃に予熱した５０〇−の洗浄溶液 １を含有する皿に入れる。この温度で１０分間攪拌する。溶液を５００ｍの洗浄 溶液２と取り替え、３７℃で更に１０分間撹拌する。溶液を今度２００ｊｄの洗 浄溶液３で置換し、室温で５分間攪拌する。洗浄溶液３の工程を更に５回繰り返 す。

〜）発色−腹を色試薬溶液２５ｄを含有する浅皿に入れる。

室温で数時間または一夜発色させる。

または Ｃ，ドツトプロット上の放射性オリゴヌクレ牙チドプローブｉ）予備ハイブリッ ド形成、膜は３０℃で少な（とも１時間予備ハイブリッド形成させる。これには 幾つかの試みを使用することができる。

（ａ）　　１つの方法は、実験室の機械的作業で構築した特別設計のパースペッ クス（透明アクリル樹脂）ブロックを使用する。このブロックは、内部を下記溶 液に浸して、膜と共に３０℃の水浴中に垂直に立てる。

（ロ）もう１つの方法は、ホワフトマン（Ｗｈａ　ｔｓｉａｎ　）タイプ５４２ ０２枚の紙を膜より僅かに大きい寸法に切る０次に、膜を１枚の紙の上部に置き 、膜を予備ハイブリッド形成溶液２ｍで湿めらせる０次いで、ホヮットマンの他 の１枚を上部に置き、得られた「サントイフチ」をプラスチックバッグに残りの 予備ハイブリッド形成溶液と共に入れる。

予備ハイブリッド形成混合物：　（総量１０ｄ）１０％（ｗＺｖ）無脂肪乳粉末 　　　　　　　　　０．５ｊｄ（例えば、ジプロマ（Ｄｉｐｌｏｍａ＠））２０ ＸＳＳＣ２，５ｄ （３Ｍ　Ｎａ（Ｊ％０．３）ｌクエン酸ナトリウム）２０％（ｗ／ｖ）ＳＯ５（ ドデシル硫酸ナトリウム）　　０．５ｄ１０４／Ｍ１キャリアＤＮＡ　　　　　 　　　　、　　　２．（ｌｄ（例えば、ニシンの精子から） 滅菌蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　４．５ｄ■）ハイブリッド形成、予 備ハイブリッド形成混合物を流し出し、ハイブリッド形成混合物と取り替える。

この混合物は放射性標識化ウィルスＤＮＡが添加（ハイブリッド形成混合物１． ｄ中１ｎｇ）される以外は上記と同じである。

ハイブリッド形成はパースペックスブロックまたはプラスチックバッグ中３０” Ｃで一夜進行させる。

ｉｉ）膜の洗浄、膜フィルターは高張度条件下で洗浄する。

これは試料中に存在する可能性のある同一のウィルスＤＮＡシーケンスに水素結 合によって特異的に結合している放射性ＤＮＡプローブ以外のプローブを全て除 去するためである。

ｔｖ）オートラジオグラフィー １、膜はフィルター紙を用いて水気を取るが、乾燥はさせない、その後まだ湿っ ている間に１枚の３ＭＭホヮフトマン紙にテープで止め、次いで粘着ラップで覆 う。

２、　これを暗室で適当なＸ線フィルム（例えば、コダックのＸＲ−５）に適用 し、そして２枚の補力スクリーン（デュポン）と共にオートラジオグラフィーカ セット中に閉じ込める。

３、　オートラジオグラフィーは約８０’Ｃで２．５〜１２時間進行させる。

４、　オートラジオグラフ上の黒ずんだ点はＲＰＶタイプが存在することを示す 。

ゆうぜいおよび生検物用プロトコール 試薬調製 蒸留水１ｉを溶解緩衝粉末に加え、次いでこれをバイアル中で酵素粉末と混合し て溶解緩衝液を調製する。

試料調製 １、組織を採集緩衝液５００ｄ中で３回すすぐ（上記のがき取り物の場合と同じ ）。

２、組織を約１ｍの小片に切断する。

３、組織に溶解緩衝酵素溶液７００Ｉを添加する。

４．３７℃でｔｊｌＩＩａが完全に消化されるまで、または３７℃で一夜放置す る。

５、　３５０Ｉｉの除蛋白試薬ｌおよび３５０１ｉの除蛋白試薬２を加える。激 しく撹拌する。

６．１５秒間微量遠心分離し、上層を新たな管に取り出す（下層は棄てる）。

７、工程５および６を３回繰り返す。

８、　７００ｍの除蛋白試薬２を加え、混合し、１５秒間微量遠心分離する。

９、　上層を新たな管に取り出し、抽出溶液１００ｕ１を加える。直ちに水冷無 水エタノール１．４Ｊｄを加える。−２０℃で１時間または一８０°Ｃで１５分 間放置する。

１０、１０分間微量遠心分離し、次いでエタノールを注意深く流し去る。ペレッ ト（＝　ＤＮＡ）を１５分間乾燥させる。

１１、　ＤＮＡをＴＥ５０ｍＵ中に再懸濁し、可能な場合には、分光光度計を用 いて２６０ｎ−でＤＮＡ濃度を測定する。（１ｏ、ｎ、ｚ＊。単位−５０属／Ｉ ｄ） ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の手順１、約ＬｕｇのＤＮＡを含有する量のＤ ＮＡ溶液をエッペンドルフ管中のＰＣＲ反応混合物１００Ｊ！１に加える。

２、管を９５〜９８℃に加熱した水浴に入れる。

３．１０分後に管を暫時（約５秒）微量遠心分離し、濃縮物を取り出す。

４、管を３７℃に予熱した水浴に入れる。

５．２分後にＤＮＡポリメラーゼ溶液ｌｕ１を加え、そして３７℃で２分間イン キュベーションを続行する。

６、管を９５〜９８°Ｃの水浴に２分間戻す。

７、　工程４〜６を２５回繰り返す。

ＰＣＲ法で製造したウィルスＤＮＡの検出かき取り物プロトコールについては上 記参照。

標準および対照 ）　　標準：ＨＰＶ６、ＢＰＶＩＩ、ＨＰＶ１６、ＢＰＶｌＢおよびＨＰＶ３３ 　ｔｙ）純粋ナウィルスＤＮＡまたは少なくとも各ＨＰＶのハイブリッド形成標 的領域に対応するオリゴヌクレオチドを、全ＲＰＶについては１２５．１２．５ ゜１．２５および０．１２５ｐｇＯ量で、そしてオリゴヌクレオチドについては 対応して更に少ない量で膜に加える。

対　　照： ｉ）新生児包皮ＤＮＡ　（ヒト皮膚ＤＮＡに対する非特異的ハイブリッド形成が 生起しそうにないことを検出する）を１０ｎｇ、　５０□。

１００ｔ＋ｇおよび２周の量で各膜に適用する。

ｊ）陽性対照：　Ｉ］ＰＶ６／１１およびＢＰＶ１６／１Ｂ／３３ニ感染した試 料から得たＤＮＡ。

ＤＩ）Ａｆｕ−反復シーケンスＤＮＡ（Ａｆｕプローブにハイブリッドを形成さ せるために）を１０Ｐｇ、　５０Ｐｇ、　１１００ｐおよび２ｎｇの量で各膜に 通用する。（任意） オートメーション化 本発明者は、自動的にＰＣＲ反応を実施する実用的な標準機械を設計し構築した 。

試験結果を得るための総時間（実験室で試料を受理後）数時間〜２日間。

本試験で得られる結果 結果は患者評価における直接的なＲＰＶ検出の重要性を示している０例えば、頚 部細胞に関し正常な細胞学を有している多数の患者が発癌性のＨＰＶ種に感染し ていることが解った。このことは、本発明者の試験が初期段階、多分ウィルスが 細胞内で形態学的変化を起こす機会を持つ前に感染を検出できるという事実を反 映していると思われる。更に、ＲＰＶの潜在的発癌性種に瞭なコンジロームより むしろしばしば扁平であり、それ故、臨床では容易には見い出されない。

操作方法の例を表わす特別の実験 写真複写では良い解像が得られないので、図面は写真の代わりに図で示す。

Ａ０通常のフレノウを使用する純粋なＩＩＰＶ１６ウイルスＤＮＡのＰＣＲ増幅 ＊１ｎｇのＨＰＶ１６／ｐＢＲ３２２は、９５℃で２分間（ストランド解離プミ 次いで３７℃で２分間（アニーリング）を２０ラウンド行った０次いでＩＵのフ レノウ酵素を加え、３７℃で２分間インキエベーションした。得られた混合物の 半分（５０ｍ）は２％のアガロースゲル上で電気泳動を行い、その結果を第１図 に示す、量＝２．５Ｘ　１００ｎｇ＝２５１００ｎ増幅領域＝総ＨＰＶ１６シー ケンスの４０分の１゜総増幅＝　２５０　Ｘ　４０−１０．０００倍（即ち、反 応の効率は各サイクルで６０％であった）。

Ｂ、　ＥＰＶ１６／３３試験でのゆうぜい生検物ＤＮＡのＰＣＲ増幅、肛門ゆう ゼいＧａｐ２８９のＤＮＡはフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで 沈殿させた０次いでＤＮＡ　１　／Ｊｇを２３回の増幅（各々：９５℃で２分間 、次いで３７℃で２分間、ＩＵのフレノウを加えそして３７℃で２分間）に付し た。　４０％（５０ｍ）を２％のアガロースゲル上で電気泳動させた。エチジウ ムプロミドで染色したＤＮＡを第２図に示す、　ＰＣＲ試料および標準は膜上に スポットし、そして３２Ｐ−標ｍＨＰＶ１６／３３標的オリゴヌクレオチドプロ ーブを用いて一夜ハイブリッド形成させた。洗浄条件は２２℃で５分間、次いで ５　Ｘ　５ＳＰＥ１０．１％ＳＤＳ中３８°Ｃで１０分間であった。オートラジ オグラフィーの結果を第３図に示す、その量は使用した組換え体ウィルスＤＮＡ に対するものであり、増幅されたシーケンスは上記ＤＮＡの１部分だけであり、 またそのシーケンスの内部に標的領域があることに注意。

ＰＣＲ増幅ａｌｎｇのＨＰＶ１６／ｐＢＲ３２２，１０ｍＭのトリス−ＨＣ７、 ｐＨ７，６，１０ｍＭ　Ｍｇｅｔ’、、５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ、５００ｎｇの各Ｈ ＰＶ１６／３３ブライマー、４Δの各ｄＮＴＰ　（５０＋ｓＭストック）、９８ ℃で２分間、次いで３７゛Ｃで２分間、フレノウを加え、次いで３７°Ｃで２分 間、以上を２３回、２％アガロースゲル上での電気泳動、エチジウムプロミドで 染色したゲルを第４図に示す、レーン１および３はＤＮＡサイズのマーカー、即 ちそれぞれＨｐａ　Ｕで切断したｐＢＲ３２２および５ＰＰ−１である。予期さ れる大きさく約２００塩基対）のＤＮＡ単一バンドはレーン２にみることができ る０次いで、これを探査するために、次のハイブリッド形成条件：　５　Ｘ５Ｓ ＰＥ、　２％ＳＤＳ、　０．５ｄＢＬＯ’ｒＴＯ。

ｌｋ／ｄのサケ精子ＤＮＡ　０．５ｄ、蒸留水５．５ｄ、を用いて上記ゲル上で サチン法を実施した。予備ハイブリッド形成は３０℃で１時間であり、ハイブリ ッド形成は約１ｎｇ／ｄの末端標識標的１１ＰＶ１６／３３オリゴヌクレオチド プローブと共に上記溶液中３０℃で一夜行った。洗浄はｌ　ｘｓｓＰＥ、０．１ ％ＳＤＳ中３８℃で１０分間であった。塊状のハイブリッド形成がレーン２の予 期される位置（！ｌｌｔち、第４図レーン２の染色ＤＮＡバンドと同一の位置） で１つのバンドで示される第５図が得られた。

Ｄ、肛門ゆうぜいの生検物、患者標本：　ＧａｐＨ９，Ｇａｐ２７８．　Ｋｍ。

Ｇａｐ２Ｂ９．１１９１２Ｃ，条件は上記Ｃで記載したのと同じ、第６図は放射 線探査後のオートラジオグラフ、に■およびＧａｐ２８９は＋ｖｅ。

即ちＢＰＶ１６を含有していた。

Ｅ、　ＢＰＶ１６に関し＋νｅの生検物のサチン法、この実験はＲＰＶ１６／３ ３オリゴプローブが増幅していない生検物および純粋なウィルスＤＮＡ中の正し い制限フラグメントにハイブリッドを形成すること並びに他のＩＩＰＶタイプへ の交叉ハイブリッド形成がないことを示す。

レーンＩ　　Ｂａ５ＨＴ　／　Ｐｓｔ　Ｉで切断した８／ｊｇのＧａｐ２８９ミ ル２８９レーンク レーン３　８ｇＩ　ｎ　／Ｐｓｔ　Ｉで切断した１１００ｎのＢＰＶ３３レーン ４−ＢａｍＨＩ　／Ｐｓｔ　Ｉで切断した１１００ｎのＨＰＶ１６レーン５−Ｅ ｃｏＲＩ　／　Ｘｂａ　Ｉで切断した１１００ｎのＨＰＶ１８レーン６−　Ｂａ ｍＨＩ　／　Ｐｓ　ｔ　Ｉで切断したｌｏＯｎｇのＨＰシ１ル−ン７−ＥｃｏＲ Ｉ　／　Ｐｓｔ　Ｉで切断した１１００ｎのＨＰシロオートラジオグラフ（第７ 図で図式的に示されている）は放射性ＨＰＶ６６／３３でオリゴプローブのレー ン４ではＢＰＶ１６とのそしてレーン３ではＨＰＶ３３とのハイブリッド形成を 示す、レーン７．６および５はそれぞれＲＰＶ　６．１１および１８とのハイブ リッド形成は生起せず、このプローブがＩＩＰＶ１６および３３に特異的である ことを示している。

Ｆ、頚部かき取り物−ＨＰＶ１６／３３のＰＣＲ増幅、これは、この技術がかき 取り物標氷中の特定のＨＰＶを検出できることを示すものである、かき取り物： ＰｔおよびＭＯ０約１０．０００個の細胞を水３５Ｉに懸濁し、９８℃に１０分 間加熱し、ＰＣＲ混合物６５１Ｊ１を加え、通常のフレノウを使用する３０回の 増幅を用いて通常のプロトコールを続けた。試料は膜上にドツトし、放射性オリ ゴプローブで探査した。結果を第８図に示す：Ｐｔかき取り物は＋ｖｅであり、 ＨＰＶ１６／３３プローブををしていた。　Ｎｏは−ｖｅであった。

Ｇ、かき取り物のサザン法、これは、ｐｔかき取り物が本当に増幅されているこ とを確認するためのものであった。（即ち、Ｈを生じさせる有効性の証明である 。）、使用したゲルは１．５％アガロースであった（第７図中）： レーン１−ＰＣＲ緩衝液中Ｂｇｌ　１　／Ｂａｗｌ　１で消化したＰｔ　ｐｃＲ ２５ｍレーン２−ＨＰＶ３３挿入物４０ｎｇ レーン３−ＨＰＶ１６挿入物４０ｎｇ レーン４−ＢＰａｎで消化した０、５１４のｐＢＲ３２２レーン５−１１ｉｎｄ ＩＩ［で消化したバタテリオファージ人第９図は染色されたゲルの結果を示す、 第１０図は放射性標的オリゴ探査の結果を示す、第１１図はアルカリホスファタ ーゼ標的オリゴ探査の結果を示す、黒いバンドのハイブリッド形成は、患者標本 のＰＣＢ生成物についてはレーン１の正規位置で見ることができ、レーン２およ び３のバンドは全ウィルスの位置に対応している。これにより頚部かき取り物中 のＨＰＶ１６の存在が確認される。

以下の実施例（Ｈ−Ｊ）は種々の生検物およびかき取り物に対して使用した技術 による陽性結果を更に示す。

Ｈ０種々のかき取り物および性器ゆうぜい生検物−ＨＰＶ６／１１のＰＣＲ，（ 第１２図および第１３図参照）：レーン１−ＨｐａＩ［−で切断した。、４Ｉ４ のｐＢＲ３２２レ−ン２−０．９．ｎ０Ｆ９８８５ゆうぜイＤＮＡ、　ＢＰＶ６ ／１１　ｔ　１７ゴだけＬ／　−ン３−１．１４（７）Ｏ−ゆうぜ＆ＮＤＮＡ、 　ＨＰｖ６／１１およびＩＩＰＶ１６／３３オリゴ レーン４−Ｆ１１９１２頚部かき取り物から得た３Ａ１１の細胞、１１ＰＶ６／ １１オリゴだけ レーン５−Ｆ１１９１２膣かき取り物から得た３Ｉｄの細胞、ＨＰＶ６／１１オ リゴだけ レーン６−Ｆ１１９１２直腸かき取り物から得た５Ｉの細胞、１ＰＶ６／１１オ リゴだけ 通常のプロトコール条件下で３０回実施した。　ＰＣＢ混合物各５０Ｉを１２％ の非変性ポリアクリルアミドゲル上に置いた。染色したゲルを第１２図に示す、 （約３４ｂｐのバンドはＨＰＶ６／１１ブライマーと関係のある人工物である。

）この膜を２０Ｖ／１ｏｏｓＡで１時間電気泳動させ、放射性ＨＰＶ６／１１オ リゴプローブで探査した。Ｘ線フィルムに２時間暴露した結果を第１３図に示す 、レーン４および５のバンドは、この患者から得た頚部および膣部紺胞は肝Ｖ６ ／１１で感染しているが直腸細胞はそうでないことを示している。

■、ゆうぜイー　ＢＰＶ６／１１のＰＣＲ，結果を第１４図に示す。

レーン１−Ｈｐａｌｌで切断したｐＢＲ３２２レーン２　７５０ｎｇのＦ８４０ ８陰唇ゆうぜいレーン３−ＩＩ４のＧａｐ２５２肛門ゆうゼいレーン４　８６０ ｎｇのＴｒ肛門ゆうぜいレーン５−７５０ｎｇのＢｉ肛門ゆうゼい（条件：２５ 回、ＨＰＶ６／１１プライマーだけ；各ＰＣＲ混合物５０Ａ１１をゲル上で実施 、） Ｊ、頚部ゆうゼＩ、Ｎ　−１１ＰＶ６／１１およびＨＰＶ１６／３３プライ？− ＊ＳＯＩを１２％ポリアクリルアミドゲル上で実施；結果を第１５図に示す。

レーン１−Ｒｐａｌｌで切断したｐＢＲ３２２レーン２　５００ｎｇのＩｎ生検 物 レーン３−５００ｎｇのＲａ生検吻 レーン４−５００ｎｇのＬｓ生検物 に、頚部かき取り物−ＨＰＶ６／１１およびＨＰＶ１６／３３．この実施例は異 なるＲＰＶに対するプライマーを同一の反応混合物中で一緒に使用して各ＲＰＶ タイプに独特の増幅生成物を生成させることができることを示す、結果を第１６ 図に示す。

レーン１−ＨｐａＩ［で切断したｐＢＲ３２２レーン２２−１ｎのＨＰＶ６／ｐ Ａ丁１５３およびｌｎｇのＩＩＰＶ１６／ｐＢＲ３２２；ＨＰＶ６／１１および １ＩＰＶ１６／３３プライマーレーン３−Ｃ３ＣＯ１９かき取り物の３ｕ１の細 胞、ＢＰＶ６／１１およびＩＩＰＶ１６／３３７’　ライｖ　−レーン４−Ｃ３ Ｃ３２８かき取り物の３ＩＪ１の細胞、ＢＰＶ６／１１プライマー レーン５−Ｐｔかき取り物の３Ｉの細胞、ＨＰＶ６／１１プライマー （条件：２５回、通常のプロトコール条件、）第１６図のレーン２では、２００ ｂｐのＨＰＶ１６／３３増幅生成物（うすい）および１２０ｂｐのＨＰＶ６／１ １生成物（より黒い）が見られる。レーン３〜５は陰性である（グラ４マーバン ドだけが見られる）、即ちＨＰＶ６／１１は含有していない。

Ｌ、かき取り物および生検物−ＨＰＶ１６ノ３３のＰＣＲｏこの実験はＰＣＲ法 でｆｌＰＶを検出する放射性探査と非放射性探査とを比較するものである。第１ ２図中： レーン１−ＨｐａＩ［で切断したｐＢＲ３２２レーン２−ブランク Ｌ／−７３−１から得た１１ＰＶ６／ｐＡＴ１５３とＨＰＶ１６／ｐＢＲ３２２ のＰＣＲレーン４−１５ｄのに秦ＰＣＲ レーン５−１５ＪのＧａｐ２８９　ＰＣＲレーン６−１５ｄのＰｔかき取り物Ｐ ＣＲゲル（１２％ポリアクリルアミド）を実施し、染色しく第１７図）、次いで エレクトロプロットし、そしてアルカリホスファターゼ（第１８図）および放射 性（第１９図）　ＨＰＶ１６／３３オリゴプローブで探査した。第１１図で、） ｌＰＶ１６／３３を示す約２００ｂｐノハントはレーン６．５．４および３で見 ることができ、１２０ｂｐ（７）ＨＰＶ６／ｌｌハンドはレーン３で見ることが できる。第１８図では、約２００ｂｐの１１ＰＶ１６／３３の増幅生成物とハイ ブリッドを形成しているシングルバンドがレーン６〜３の各々で見られる。第１ ９図はＸ線フィルムへの１．５時間暴露の結果を示す：約２００ｂＰのＨＰＶ１ ６／３３の増幅生成物とのハイブリッド形成が見られる。第２０図は放射性標的 オリゴプローブで探査したドツトプロットである（右：ドツトプロットの試料の 位置の図；左：ハイブリッド形成の結果）。

Ｍ、熱に安定なポリメラーゼＨＰＶ６ＰＣＲ，ｌｎｇのＨＰＶ６／ｐＡＴ１５３ 、２単位のサーマス・アクア千カスＤＮＡポリメラーゼを初めに加え、そして４ ０回について１０回毎に後に加えた。使用した条件はニューイングランドバイオ ラボラトリーズのプロトコールで規定されたものと全く同じであった。結果（第 ２１図）は熱に安定なポリメラーゼも所望の増幅生成物を生成し得ることを示し ている。この図で： レーン１　　ｐＢＲ３２２／Ｈｐａ　ＩＩＬ／　−７２−４０ｉｉ（ＤＨＰＶ６ ／ｐＡＴ１５３　ＰＣＲＮ、熱に安定なポリメラーゼ−ＢＰＶ１６および生検物 。増幅後、Ｈｉｎｆ　Ｉで切断したＨＰＶ１６／ｐＢＲ３２２は５２ｂｐと１４ ２ｂｐの２つのフラグメントを生じさせるだろう、５ｎｇのＨＰＶ３３／ｐ２　 ｉｎｋおよびｌＡ＋のＧａｐ２８９は、熱に安定なポリメラーゼと共に４０回の 増幅に付した（第２２図のレーン４および５）、使用した条件は５０ｍＭのトリ ス・Ｈα、２５℃でｐＨ８，８，１０ｍＰＩ　ＭｇＣＪ、、１０ｓ＋Ｍ（ＮＨａ ）ｚｓＯａ、１０ｄＤＳＭＯ１５００ｎｇの各ＨＰシ１６／３３プライマー、４ Ａの各ｄＮＴＰ　（５０ｓＭストック）および５０ｄの液状パラフィンであった 。４ＵのＤＮＡポリメラーゼを開始時に加えた。インキュベーションは９３°Ｃ のインキュベーター中３０秒、次いで５０°Ｃで３０秒、次に６３℃で４５秒で あった。

第２２図中： レーン１−ｐＢＲ３２２／Ｈｐａ　ｎ レーン２−Ｈｌｎｆ　Ｉで切断したｎＰＶ１６／ｐＢＲ３２２（２０ｕＩＰＣＲ ＋２　Ａの１ＱＸｌｉｎｆ　Ｉ緩衝液＋ＩＡ！１酵素＋６　ｄｌｌ！Ｏ）レーン ３−２０Ｉｉ（７））ｌＰＶ１６／ｐＢＲ３２２ＰＣＲレーン４−２０／７のＲ ＰＶ３３／Ｐｌｉｎｋ　ＰＣＲレーン５−２０ｔｉのＧａｐ２８９ ０、希釈した生検物、熱に安定なポリメラーゼを使用してＰＣＲを１００回、ゆ うぜい生検物Ｇａｐ２８９　（１ｇ／Ｉｉ）は１：１０’、ｌ：１０−および１ ：１０”に希釈し、各希釈液ｌｕ１を用いて増幅を１００回実施し、熱に安定な りＮＡポリメラーゼ４Ｕは最初に加え、次に５０回後に更に２Ｕを加えた。他の 生検物およびかき取り物は５０回だけに付した０条件は例Ｐのとおりであった。

結果はこの試験の極端な感度を示している：この過剰回数の増幅による最上の結 果は最もうすい試料で得られた。第２３図はエチジウムプロミドで染色したＤＮ Ａゲルを示す、このゲルをエレクトロブ０７トし、放射性標１ＨＰＶ６／１１　 （第２４図）およびＨＰＶ１６／３３　（第２５図）標的オリゴプローブで探査 した。結果はこの試験の極端な特異性を示している。第１５図中）で、）ｌＰＶ ６／１１プライマーを使用したレーン５および６でのみ１２０ｂｐバンド、即ち ＨＰＶ６／１１増幅生成物の大きさとのハイブリッド形成があったことが見られ る。

ＨＰＶ１６／３３ブライマーだけを使用して試料を増幅したレーンではハイブリ ッド形成は全く見られなかった。第１５図（Ｃ）で、約２ｏｏｂｐのバンドのＨ ＰＶ１６／３３増幅生成物とのハイブリッド形成が生検物（レーン２〜４）およ び肛門かき取り物（レーン５）で見られる。第２３図、第２４図および第２５図 中、レーンは次のとおりである： レーン１−ＨｐａＩ［で切断したｐＢＲ３２２レーン２−Ｇａｐ２８９　（１： 　１０”）ＰＣＲ（ＨＰＶ１６／３３プライマーだけ）レーン３−Ｇａｐ２８９ 　（１：　１０’）ＰＣＲ（ＨＰＶ１６／３３ブライマーだけ）レーン４−Ｇａ ｐ２８９　（１：　１０’）ＰＣＲ（ＨＰＶ１６／３３ブライマーだけ）レーン ５−肛門かき取り物Ｇａｐ４０２　ＰＣＲ（ＨＰＶ６／１１および）ｌＰＶ１６ ／３３ブライマー） Ｌｚ−７６−ＢｓゆうせイＰＣＲ（ＨＰＶ６／１１およびＨＰＶ１６／３３ブラ イマー） レーン７−頚部かき取り物１１９１２（ｌｌＰＶ１６／３３プライマーだけ）レ ーン８−膣かき取り物１１９１２（ＨＰＶ１６／３３プライマーだけ）Ｐ、標的 オリゴプローブの増幅していないＨＰＶ１６、ＨＰＶ３３および生検物とのハイ ブリッド形成、制限酵素で切断した通常のＲＰＶおよび生検物をゲル上で実施し 、染色しく第２６図）、次いでＨＰＶ１６／３３標的オリゴプローブで探査した 。結果を第２７図に示す、第２７図ではハイブリッド形成は各事例で見られ（レ ーン２〜５）、組換え体ウィルスＤＮＡの場合には適切な制限フラグメントに見 られる。この増幅していないＤＮＡについてはＸ線フィルムに６日間暴露するこ とが必要である。第２６図および第２７図中： レーン１−ＨｌｎｄＩ［［／ＥｃｏＲＩで切断したバタテリオファージ人レーン ２−５１４のＢｓゆうぜいＤＮＡ％Ｂｇｌ　ＩＩ　／Ｂａ＋＊）ｌ　Ｉレーン３ −５縄のＧａｐ２８９、Ｂｇｌ　Ｉ［／Ｂａ＋＋＋ＨＩレーン４−ＨＰＶ１６／ ｐＢＲ３２２、ＢａｗＨＴレーン５−ＨＰＶ３３／Ｉ）ｌｉｎｋ％Ｂｇｌ　ＩＩ レーン６−５ＰＰ−１ Ｑ、ＨＰＶ１６／３３アルカリホスファターゼオリゴプローブのＨＰＶ１６との ハイブリッド形成を示しているドツトプロットは第２８図に示す。

Ｒ９ＨＰＶ１８のＰＣ！？、通常のフレノウＤＮＡポリメラーゼを用いて３０回 、結果は第２９図に示し、その際レーンは：！ｚ　−７１−１１ＰＶ１６挿入Ｐ ＣＲ生成物；　）ＩＰＶ１６／３３プライマーレーン２−ＨＰＶ１８挿入ＰＣＲ 生成物、　）ｌＰＶ１Ｂプライマーを使用である。

約１００ｂｐのＢＰＶ１８　ＰＣＲ生成物はレーン２に見ることができる。

レーンＨ：は約２００ｂｐ（７））ｌＰＶ１６　ＰＣＲ生成物がある。

ＦＩＧ；ＬＪＲＥ　Ｉ ＦＩＧＵＲＥ２ ＦｌにＵＲＥ　４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＦＩＧυＲ Ｅ５ＦＩＧυＲＥ’　　　　ＨＰＶ６５ｔａｎｄａｒｄｓ　　　ＨＰＶ１６５ｔ ａｎｄａｒｄｓ）ＩＧＵＲＥフ ”ＵＲ”　　　ＨＰＶ６ｓｕｎｄａｒｃｌｓ　　　ＨＰＶ１６ｘｄ３３ｓｔａｎ ｄａｒｄｓ１０ｎｇ　５ｎｇ　ｌｎｇ　　　１０ｎｇ　５ｎｇ　ｌｎｇＦＩＧＵ ＲＥ９ ＦＩＧＵＲＥ　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＦＩＧＵＲＥ 　１１ＦＩＧＵＲＥ　１７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　日ＧＵＲＥ １ｊ１Ｆ夏ＧＵＲＥ２０ ＦＩＧＵＲＥ　２１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＦＩＧＵＲＥ　 ２２ＦＩＧＵＲＥ　２３　　　　　　　　　　　　ＦＩＧＵＲＥ　２４ＦＩＧＵ ＲＥ　１６　　　　　　　　　　　　　　　　　ＦＩＧＵＲＥ　２７手続補補正 子成　１年１０月　６日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトの発癌性乳頭腫ウイルスＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８の検出方 法であって、 （ａ）（ｉ）加熱してＤＮＡストランドを解離させ、（ｉｉ）下記特徴的ＤＮＡ 部分の各末端を特定するオリゴヌクレオチドプライマーを添加し、 （ｉｉｉ）冷却して解離したＤＮＡストランドにプライマーをアニーリングさせ 、 （ｉｖ）ＤＮＡポリメラーゼを添加し、（ｖ）冷却した温度で下記特徴的ＤＮＡ 部分の各ストランドに相補的であるＤＮＡを形成させ、 （ｖｉ）解離温度に加熱し、 そして熱に安定なＤＮＡポリメラーゼを使用する工程（ｉｖ）は任意に省略して 、工程（ｉｉｉ）から（ｉｖ）を繰り返す、工程からなるポリメラーゼ連鎖反応 技術を、任意の上記発癌性ＨＰＶの選択した特徴的ＤＮＡ部分の量を増幅させる ように、頚部組織細胞の試料に適用し、そして （ｂ）増幅した試料中のＨＰＶ１６または１８に特徴的な上記特徴的ＤＮＡ部分 の存在／非存在を検出する、ことからなることを特徴とするヒトの発癌性乳頭腫 ウイルスＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８の検出方法。
2. ２．選択した特徴的ＤＮＡ部分を特定する１対のプライマーが（ｉ）ＨＰＶ１６ に関しては ＴＧＡＧＧＴＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴおよび ＡＡＴＴＡＡＴＣＣＡＣＡＴＡＡＴ （ｉｉ）ＨＰＶ１８に関しては ＴＧＴＣＡＴＡＡＣＣＴＴＧＡＡＴＧＴＣＴおよび ＡＡＡＴＧＴＡＴＡＧＡＴＴＴＴＴＡＴＴＣである請求の範囲第１項に記載の方 法。
3. ３．ＤＮＡポリメラーゼが解離温度で安定なポリメラーゼである請求の範囲第１ 項に記載の方法。
4. ４．ＤＮＡポリメラーゼがサーマスアクアチカスから得た好熱性ポリメラーゼで ある請求の範囲第３項に記載の方法。
5. ５．増幅した試料の成分をゲル上で分離しそして上記特徴的ＤＮＡ部分と同じ数 のヌクレオチドを有するＤＮＡの存在／非存在を検出することによって上記特徴 的ＤＮＡ部分の存在／非存在を検出する請求の範囲第１項に記載の方法。
6. ６．上記特徴的ＤＮＡ部分の存在／非存在を検出するために、上記特徴的ＤＮＡ 部分の領域に相当する標識オリゴヌクレオチドハイブリツド形成プローブが加え られている請求の範囲第１項に記載の方法。
7. ７．オリゴヌクレオチドプローブが （ｉ）ＨＰＶ１６に関しては ＧＴＧＡＧＴＡＴＡＧＡＣＡＴＴＡＴ （ｉｉ）ＨＰＶ１８に関しては ＧＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＡＧＡである請求の範囲第６項に記載の 方法。
8. ８．オリゴヌクレオチドプローブが２２Ｐ放射性標識またはアルカリホスファタ ーゼ酵素標識で標識されている請求の範囲第６項または第７項に記載の方法。
9. ９．（ｉ）ＨＰＶ１６については ＴＧＡＧＧＴＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴおよび ＡＡＴＴＡＡＴＣＣＡＣＡＴＡＡＴ の混合物 または（ｉｉ）ＨＰＶ１８については ＴＧＴＣＡＴＡＡＣＣＴＴＧＡＡＴＧＴＣＴおよび ＡＡＡＴＧＴＡＴＡＧＡＴＴＴＴＴＡＴＴＣの混合物 からなるプライマー組成物。
10. １０．オリゴヌクレオチドが （ｉ）ＨＰＶ１６については ＧＴＧＡＧＴＡＴＡＧＡＣＡＴＴＡＴ または（ｉｉ）ＨＰＶ１８については ＧＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＡＧＡである標識オリゴヌクレオチドプ ローブ。