JP2000128899A

JP2000128899A - ヒトタンパク質Ｇｒｆ４０とそのｃＤＮＡ

Info

Publication number: JP2000128899A
Application number: JP10296464A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Sugamura; 和夫菅村; Yoji Asada; 洋司浅田
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1998-10-19
Filing date: 1998-10-19
Publication date: 2000-05-09
Also published as: WO2000023586A1; AU6124899A

Abstract

(57)【要約】【課題】サイトカイン系シグナル伝達分子ＡＭＳＨに
相互作用する新規シグナル伝達分子と、この分子をコー
ドするヒトｃＤＮＡなどの遺伝子材料を提供する。【解決手段】配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトタ
ンパク質Ｇrf40、このタンパク質をコードするヒト遺伝
子、配列番号２の塩基配列を含むｃＤＮＡ、および上記
タンパク質に対する抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願は、ヒトタンパク質
Ｇrf40と、このタンパク質をコードするｃＤＮＡに関す
るものである。さらに詳しくは、この出願は、ヒト細胞
における新規なシグナル伝達分子Ｇrf40と、このタンパ
ク質をコードするヒト遺伝子およびそのｃＤＮＡ、なら
びにタンパク質に対する抗体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】造血、免疫、神経系等の生体高次機能の
発現には、機能の異なる多種多様な細胞が共同して作用
する必要があり、そのためには細胞間のコミュニケーシ
ョンが不可欠である。サイトカインは、このような細胞
間のコミュニケーションを担うタンパク質であり、イン
ターロイキン（ＩＬ）−１〜１８、コロニー刺激因子
（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、ケモカイン
等の各分子が知られている。

【０００３】サイトカインが細胞膜上の特異的受容体に
結合することによって細胞内にシグナルが発生し、この
シグナル伝達によって細胞の生存、増殖、分化、機能発
現等が制御されている。従って、サイトカイン−受容体
−シグナル伝達の一連の作用に機能不全が生じた場合に
は生体防御に関わる免疫、造血系が破綻し、重症感染
症、がん、自己免疫疾患等が惹起される。

【０００４】このような理由から、サイトカインとその
受容体、および細胞内シグナル伝達経路の解明は、細胞
の増殖や分化といった基本的な現象を分子レベルで理解
するため、そしてさらには各種の疾患の原因解明、診
断、治療法等を開発するためにも極めて重要である。こ
の出願の発明者らは、これまでにサイトカイン受容体の
中で、複数のサイトカインに共有される「共有γ鎖」の
遺伝子単離を行い、サイトカイン受容体の構造と機能の
解明に大きく貢献している。特に、γ鎖がＩＬ−２、Ｉ
Ｌ−４、ＩＬ−７およびＩＬ−９の機能発現に必須の受
容体サブユニットであり、ヒトＸ連鎖重症複合免疫不全
症においてγ鎖変異がＩＬ−７の機能不全を介してＴ細
胞初期発生障害を惹起していることなどを明らかにして
いる（Science, 262:1874-1877, 1993; Int. Immunol.,
6:1451-1454, 1994; Science, 263:1453-1454, 1994;E
ur. J. Immunol., 25:3001-3005, 1995）。

【０００５】最近、この出願の発明者らは、サイトカイ
ンによる細胞内増殖シグナル伝達に関与する新たなシグ
ナル分子として「ＳＴＡＭ」を同定し、このＳＴＡＭが
ＩＬ−２／ＧＭ−ＣＳＦ受容体の下流に存在してＪＡＫ
３／２と直接会合し、かつｃ−ｍｙｃ発現とＤＮＡ合成
のシグナル伝達に重要な役割を果たしていることを見出
している（Immunity, 6:449-457, 1997 ）。また、この
ＳＴＡＭのＳＨ３領域に会合し、ＳＴＡＭより下流のシ
グナル伝達に必須の作用を及ぼす新規機能分子として
「ＡＭＳＨ」を同定してもいる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】前記のとおり、この出
願人の発明者らによって、サイトカインの受容体結合に
よる細胞内シグナル伝達経路の重要な幾つかの機構が明
らかにされつつあるが、その全体の構造と機能を解明す
るためには、さらなる新規分子の同定が不可欠である。
シグナル伝達経路は、複数の分子が連続的かつ複合的に
関与し、いわゆるカスケードを構成することによって最
終的な機能発現に到達すると考えられるからである。

【０００７】この出願は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであって、この出願の発明者らが見出した
シグナル伝達分子ＡＭＳＨと相互作用する新規のシグナ
ル伝達分子を提供することを目的としている。この出願
はまた、この新規分子の遺伝子とそのｃＤＮＡ、および
この新規分子に対する抗体等を提供することを目的とし
ている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】この出願は、上記の課題
を解決する発明として、配列番号１のアミノ酸配列を有
するヒトタンパク質Ｇrf40を提供する。また、この出願
は、上記のヒトタンパク質Ｇrf40をコードするヒト遺伝
子、この遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基
配列を含むｃＤＮＡ、並びに配列番号２の一部配列から
なるＤＮＡ断片を提供する。

【０００９】さらにまた、この出願は、上記ｃＤＮＡま
たはその一部配列を保有する組換えベクター、および上
記のヒトタンパク質Ｇrf40に対する抗体を提供する。以
下、この発明の実施の形態について詳しく説明する。

【００１０】

【発明の実施の形態】先ず、この発明のヒトタンパク質
Ｇrf40およびそのｃＤＮＡについて、取得の経緯および
機能について説明する。この発明のヒトタンパク質Ｇrf
40のｃＤＮＡは、発明者等が既に同定しているＡＭＳＨ
遺伝子をバイト（Ｂait ）とするYeast Two Hybrid法に
より、ヒトｃＤＮＡライブラリー（ＰＨＡ−ＰＢＬ）を
スクリーニングすることによって単離されたヒトｃＤＮ
Ａである。このｃＤＮＡは、配列番号２に示した1482塩
基対からなるヌクレオチド配列を有しており、配列番号
１にアミノ酸配列を示したタンパク質Ｇrf40をコードし
ている。

【００１１】このタンパク質Ｇrf40は、２個のＳＨ３ド
メインと１個のＳＨ２ドメインを有し、Ｇrb２ファミリ
ーに属するタンパク質であることが確認されたが、タン
パク質データベースには対応する分子が存在しないこと
から、新規分子であるることが確認された。このタンパ
ク質Ｇrf40が、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を介するシ
グナル伝達経路における新規シグナル伝達分子であるこ
とは、以下によって確認されている。 (1) Ｇrf40が、ＴＣＲシグナル伝達に必須の分子として
証明されているＳＬＰ−７６やＬＡＴ分子に直接会合す
ること。 (2) Ｇrf40を強制発現させるとＴＣＲシグナル伝達が増
強されるが、ＳＬＰ−７６との会合ドメインを欠失した
変異Ｇrf40にはこの増強作用がないこと。 (3) ＬＡＴ会合ドメインを欠失した変異Ｇrf40はＴＣＲ
シグナル伝達を抑制すること。

【００１２】この発明のヒトタンパク質Ｇrf40は、公知
の方法、すなわちヒトの臓器、細胞株などから単離する
方法、この発明によって提供されるアミノ酸配列に基づ
き化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいは
この発明によって提供されるｃＤＮＡ断片を用いて組換
えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することが
できる。例えば、組換えＤＮＡ技術によってタンパク質
Ｇrf40を取得する場合には、配列番号２のｃＤＮＡ断片
を有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを
調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうこと
によりインビトロで発現できる。また翻訳領域を公知の
方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、
枯草菌、酵母、動植物細胞等で、ｃＤＮＡがコードして
いるタンパク質を大量に発現させることができる。

【００１３】この発明のタンパク質をインビトロ翻訳で
ＤＮＡを発現させて生産する場合には、前記ｃＤＮＡま
たはその翻訳領域をＲＮＡポリメラーゼプロモーターを
有するベクターに組換え、プロモーターに対応するＲＮ
Ａポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚
芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、この発
明のタンパク質をインビトロで生産することができる。
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ
３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラ
ーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、
ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７１８、ｐＴ７／３１９、
ｐＢluescript IIなどが例示できる。

【００１４】この発明のタンパク質を大腸菌などの微生
物で生産する場合には、微生物中で複製可能なオリジ
ン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクロ
ーニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクター
に、この発明のｃＤＮＡまたはその翻訳領域を挿入して
発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を
形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、
このｃＤＮＡがコードしているタンパク質を微生物内で
大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の
前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させれ
ば、任意の領域を含むタンパク質分子を得ることができ
る。あるいは、他のタンパク質との融合蛋白質として発
現させ、この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断す
ることによって目的タンパク質部分のみを取得すること
もできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、
ｐＢluescript II、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現
システムなどが例示できる。

【００１５】この発明のタンパク質を真核細胞で生産す
る場合には、このｃＤＮＡまたはその翻訳領域を、プロ
モーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等
を有する真核細胞用発現ベクターに挿入し、この組換え
ベクターを真核細胞内に導入することによって、この発
明のタンパク質を動物細胞内で生産することができる。
発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶ
Ｋ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−
ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例
示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、
チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物
培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカ
ツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、この発明
のタンパク質を発現できるものであれば、いかなる真核
細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するに
は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、
ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることが
できる。

【００１６】この発明のタンパク質を微生物や真核細胞
で発現させたのち、培養物から目的タンパク質を単離精
製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うこ
とができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤に
よる処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、
透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。

【００１７】この発明のタンパク質Ｇrf40には、配列番
号１で表されるアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配
列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれ
る。これらのペプチド断片は抗体を作製するための抗原
として用いることができる。また、この発明のタンパク
質には、他の任意のタンパク質との融合蛋白質も含まれ
る。

【００１８】この発明の遺伝子は、上記タンパク質をコ
ードするヒトの遺伝子であって、例えば、この発明のｃ
ＤＮＡまたはその一部配列をプローブとして、既存のゲ
ノムライブラリーから単離することができる。この発明
のｃＤＮＡは、配列番号２の塩基配列に基づいて合成し
たオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト細胞由来
のｃＤＮＡライブラリーを公知のコロニーあるいはプラ
ークハイブリダイゼーションによってスクリーニングす
ることにより得ることができる。また、ｃＤＮＡ断片の
両末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを合成
し、これをプライマーとして用いて、ヒト細胞から単離
したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により、この発明のｃ
ＤＮＡ断片を調製することもできる。

【００１９】一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻
繁に認められる。従って配列番号２において、１または
複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他の
ヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの
発明のｃＤＮＡに含まれる。同様に、これらの変更によ
って生じる、１または複数個のアミノ酸の付加、欠失お
よび／または他のアミノ酸による置換がなされているタ
ンパク質も、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有す
るタンパク質の活性を有する限り、この発明のタンパク
質に含まれる。

【００２０】この発明のＤＮＡ断片には、配列番号２で
表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含むｃＤＮ
Ａ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、センス鎖お
よびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片もこの範疇に入
る。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプローブ等と
して用いることができる。この発明のタンパク質に対す
る抗体は、タンパク質それ自体、またはその部分ペプチ
ドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体として得ることができる。

【００２１】

【実施例】５mgＫＬＨ（Keyhole Limpets Hemocyanin）
を化学架橋剤ＭＢＳ（3-maleimidobenzoic acid N-hydr
oxy-succinimide ）で処理後にＰＤ−１０カラムにか
け、ＭＢＳ結合ＫＬＨを得た。ＳＴＡＭ２ａの部分ペプ
チド（配列番号１のアミノ酸番号１７４−１９４）のＣ
端にシステインを付加した合成ペプチドを作成し、これ
らのペプチドとＭＢＳ結合ＫＬＨを反応させ、ＫＬＨ結
合ＳＴＡＭ２ａペプチドを得た。このペプチドを抗原と
して家兔に常法により免疫を行い、抗血清を得た。抗血
清を40％飽和硫安沈殿した後、ＰroteinＡアフィニティ
ーカラムにより精製し、ＩｇＧ抗体を得た。

【００２２】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、サイトカイン系シグナル伝達経路に関与する新
規のシグナル伝達分子とその遺伝子操作材料が提供され
る。これらの分子および遺伝子操作材料は、重症感染
症、がん、自己免疫疾患等のサイトカイン系シグナル伝
達経路の機能障害によるヒト疾患の診断や治療のための
方法、薬剤等の開発に有用である。

【００２３】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：３３０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質ハイポセティカル：Ｎｏ起源：生物名：ホモサピエンス配列 Met Glu Ala Val Ala Lys Phe Asp Phe Thr Ala Ser Gly Glu Asp Glu 1 5 10 15 Leu Ser Phe His Thr Gly Asp Val Leu Lys Ile Leu Ser Asn Gln Glu 20 25 30 Glu Trp Phe Lys Ala Glu Leu Gly Ser Gln Glu Gly Tyr Val Pro Lys 35 40 45 Asn Phe Ile Asp Ile Gln Phe Pro Lys Trp Phe His Glu Gly Leu Ser 50 55 60 Arg His Gln Ala Glu Asn Leu Leu Met Gly Lys Glu Val Gly Phe Phe 65 70 75 80 Ile Ile Arg Ala Ser Gln Ser Ser Pro Gly Asp Phe Ser Ile Ser Val 85 90 95 Arg His Glu Asp Asp Val Gln His Phe Lys Val Met Arg Asp Asn Lys 100 105 110 Gly Asn Tyr Phe Leu Trp Thr Glu Lys Phe Pro Ser Leu Asn Lys Leu 115 120 125 Val Asp Tyr Tyr Arg Thr Asn Ser Ile Ser Arg Gln Lys Gln Ile Phe 130 135 140 Leu Arg Asp Arg Thr Arg Glu Asp Gln Gly His Arg Gly Asn Ser Leu 145 150 155 160 Asp Arg Arg Ser Gln Gly Gly Pro His Leu Ser Gly Ala Val Gly Glu 165 170 175 Glu Ile Arg Pro Ser Met Asn Arg Lys Leu Ser Asp His Pro Pro Thr 180 185 190 Leu Pro Leu Gln Gln His Gln His Gln Pro Gln Pro Pro Gln Tyr Ala 195 200 205 Pro Ala Pro Gln Gln Leu Gln Gln Pro Pro Gln Gln Arg Tyr Leu Gln 210 215 220 His His His Phe His Gln Glu Arg Arg Gly Gly Ser Leu Asp Ile Asn 225 230 235 240 Asp Gly His Cys Gly Thr Gly Leu Gly Ser Glu Met Asn Ala Ala Leu 245 250 255 Met His Arg Arg His Thr Asp Pro Val Gln Leu Gln Ala Ala Gly Arg 260 265 270 Val Arg Trp Ala Arg Ala Leu Tyr Asp Phe Glu Ala Leu Glu Asp Asp 275 280 285 Glu Leu Gly Phe His Ser Gly Glu Val Val Glu Val Leu Asp Ser Ser 290 295 300 Asn Pro Ser Trp Trp Thr Gly Arg Leu His Asn Lys Leu Gly Leu Phe 305 310 315 320 Pro Ala Asn Tyr Val Ala Pro Met Thr Arg 325 330 配列番号：２配列の長さ：１４８２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ起源：生物名：ホモサピエンス配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：193..1185 特徴を決定した方法：Ｅ配列 TGGATCTGTA AACTTGCACC CTCTTTCAGA GTGGTACATG GAAGACAGCA CAAAGTGGAT 60 CCATACTCTG AAATGCAGTA ACTCTGATGC TTGAATTTGT CTCCCTTCTT GCCAGAAAGG 120 ATTCTAATAA CTCGGTGTCA AAGCCAAGAC ATAAACTCAA CCCCTTCTCT TCCAAAAGCT 180 TCACGTTACA GCATGGAAGC TGTTGCCAAG TTTGATTTCA CTGCTTCAGG TGAGGATGAA 240 CTGAGCTTTC ACACTGGAGA TGTTTTGAAG ATTTTAAGTA ACCAAGAGGA GTGGTTTAAG 300 GCGGAGCTTG GGAGCCAGGA AGGATATGTG CCCAAGAATT TCATAGACAT CCAGTTTCCC 360 AAATGGTTTC ACGAAGGCCT CTCTCGACAC CAGGCAGAGA ACTTACTCAT GGGCAAGGAG 420 GTTGGCTTCT TCATCATCCG GGCCAGCCAG AGCTCCCCAG GGGACTTCTC CATCTCTGTC 480 AGGCATGAGG ATGACGTTCA ACACTTCAAG GTCATGCGAG ACAACAAGGG TAATTACTTT 540 CTGTGGACTG AGAAGTTTCC ATCCCTAAAT AAGCTGGTAG ACTACTACAG GACAAATTCC 600 ATCTCCAGAC AGAAGCAGAT CTTCCTTAGA GACAGAACCC GAGAAGACCA GGGTCACCGG 660 GGCAACAGCC TGGACCGGAG GTCCCAGGGA GGCCCACACC TCAGTGGGGC TGTGGGAGAA 720 GAAATCCGAC CTTCGATGAA CCGGAAGCTG TCGGATCACC CCCCGACCCT TCCCCTGCAG 780 CAGCACCAGC ACCAGCCACA GCCTCCGCAA TATGCCCCAG CGCCCCAGCA GCTGCAGCAG 840 CCCCCACAGC AGCGATATCT GCAGCACCAC CATTTCCACC AGGAACGCCG AGGAGGCAGC 900 CTTGACATAA ATGATGGGCA TTGTGGCACC GGCTTGGGCA GTGAAATGAA TGCGGCCCTC 960 ATGCATCGGA GACACACAGA CCCAGTGCAG CTCCAGGCGG CAGGGCGAGT GCGGTGGGCC 1020 CGGGCGCTGT ATGACTTTGA GGCCCTGGAG GATGACGAGC TGGGGTTCCA CAGCGGGGAG 1080 GTGGTGGAGG TCCTGGATAG CTCCAACCCA TCCTGGTGGA CCGGCCGCCT GCACAACAAG 1140 CTGGGCCTCT TCCCTGCCAA CTACGTGGCA CCCATGACCC GATAAACTCT TCAGGGGACA 1200 GAAGCTTTTT GTCTGGAGCT GCCCACAAGA AAGAGGGCAA GGAAAAAAGG CTGGACTCCA 1260 TGACTATATA TACATACATC TATCTACATC TGCCTGTGTA CACACACAAC TTTTTATACT 1320 AGTAATTTAT TGGCAATTGG GCTGGTAATT AGTTGATGCA AAAGGGAACT CAGGTGGAGA 1380 ATAATATTGA CACTTGCTTT TCTGCCCCCC TCAGGGGTGT GTGGAAGGCA GTGGGGGAGT 1440 TGGGAGGGGG GCAGGGAAAT GAAATGGAGT TTTGTCCTGG CA 1482

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【手続補正書】

【提出日】平成１０年１１月１０日（１９９８．１１．
１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２１】

【実施例】５mgＫＬＨ（Keyhole Limpets Hemocyanin）
を化学架橋剤ＭＢＳ（3-maleimidobenzoic acid N-hydr
oxy-succinimide ）で処理後にＰＤ−１０カラムにか
け、ＭＢＳ結合ＫＬＨを得た。部分ペプチド（配列番号
１のアミノ酸番号１７４−１９４）のＣ端にシステイン
を付加した合成ペプチドを作成し、これらのペプチドと
ＭＢＳ結合ＫＬＨを反応させ、ＫＬＨ結合ペプチドを得
た。このペプチドを抗原として家兔に常法により免疫を
行い、抗血清を得た。抗血清を40％飽和硫安沈殿した
後、ＰroteinＡアフィニティーカラムにより精製し、Ｉ
ｇＧ抗体を得た。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１のアミノ酸配列を有するヒト
タンパク質Ｇrf40。
【請求項２】請求項１のヒトタンパク質Ｇrf40をコー
ドするヒト遺伝子。
【請求項３】請求項２のヒト遺伝子のｃＤＮＡであっ
て、配列番号２の塩基配列を有するＧrf40ｃＤＮＡ。
【請求項４】配列番号２の塩基配列における一部配列
からなるＤＮＡ断片。
【請求項５】請求項３のＧrf40ｃＤＮＡまたは請求項
４のＤＮＡ断片を保有する組換えベクター。
【請求項６】請求項１のヒトタンパク質Ｇrf40に対す
る抗体。