JP2000063264A - 安定化されたタンパク質組成物 - Google Patents
安定化されたタンパク質組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規な安定化されたタンパク質組成物の提
供。 【解決手段】 本発明は、安定化されたタンパク質組成
物、このような安定化されたタンパク質組成物の製造方
法、このような安定化されたタンパク質組成物を哺乳類
に投与するための投与形態に関する。さらに、本発明の
安定化されたタンパク質組成物は、畜牛における乳腺炎
を含めた感染症を治療および予防するために、療法的有
効量のＧ−ＣＳＦ、例えばウシＧ−ＣＳＦを、安定化緩
衝液例えばＨＥＰＥＳ、ＴＥＳまたはＴＲＩＣＩＮＥと
組合せて含有する。
供。 【解決手段】 本発明は、安定化されたタンパク質組成
物、このような安定化されたタンパク質組成物の製造方
法、このような安定化されたタンパク質組成物を哺乳類
に投与するための投与形態に関する。さらに、本発明の
安定化されたタンパク質組成物は、畜牛における乳腺炎
を含めた感染症を治療および予防するために、療法的有
効量のＧ−ＣＳＦ、例えばウシＧ−ＣＳＦを、安定化緩
衝液例えばＨＥＰＥＳ、ＴＥＳまたはＴＲＩＣＩＮＥと
組合せて含有する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、安定化されたタン
パク質組成物に関する。本発明の安定化された組成物
は、療法的有効量のタンパク質、例えばコロニー刺激因
子、例えばウシ顆粒球コロニー刺激因子（ｂＧ−ＣＳ
Ｆ）を哺乳類、例えばヒト、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、
ヒツジ、イヌおよびネコに持続する期間中供給するのに
有用である。特に、本発明の安定化された組成物は、Ｈ
ＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥがin vivo およ
びin vitroで持続する期間のタンパク質活性を保持し得
るような安定化緩衝剤を含有する。
パク質組成物に関する。本発明の安定化された組成物
は、療法的有効量のタンパク質、例えばコロニー刺激因
子、例えばウシ顆粒球コロニー刺激因子（ｂＧ−ＣＳ
Ｆ）を哺乳類、例えばヒト、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、
ヒツジ、イヌおよびネコに持続する期間中供給するのに
有用である。特に、本発明の安定化された組成物は、Ｈ
ＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥがin vivo およ
びin vitroで持続する期間のタンパク質活性を保持し得
るような安定化緩衝剤を含有する。
【０００２】
【従来の技術】療法的有効量のタンパク質、例えばＧ−
ＣＳＦの製剤は、in vitroおよびin vivo 活性の保存寿
命を延長するよう製剤化するのが依然として難しい。こ
のようなタンパク質の製剤は、有効な治療のために、適
切な期間、それらの活性および生物学的完全性を保持し
なければならない。さらに、このようなタンパク質の製
剤は、医薬として許容される方法で製造可能で且つ動物
に投与可能でなければならない。
ＣＳＦの製剤は、in vitroおよびin vivo 活性の保存寿
命を延長するよう製剤化するのが依然として難しい。こ
のようなタンパク質の製剤は、有効な治療のために、適
切な期間、それらの活性および生物学的完全性を保持し
なければならない。さらに、このようなタンパク質の製
剤は、医薬として許容される方法で製造可能で且つ動物
に投与可能でなければならない。
【０００３】タンパク質の製剤組成物は凍結または凍結
乾燥形態で提供されており、長期間タンパク質活性を保
持する保存条件下でin vitroで保持されている。凍結乾
燥製剤は、医薬として許容される希釈剤、例えば注射用
滅菌水を用いて使用前に再構成される。タンパク質の製
剤組成物は、液体形態でも提供されている。このような
液体タンパク質製剤は、特に高温での、長期間に亘るタ
ンパク質活性の損失のために、保存で保持するのが難し
い。
乾燥形態で提供されており、長期間タンパク質活性を保
持する保存条件下でin vitroで保持されている。凍結乾
燥製剤は、医薬として許容される希釈剤、例えば注射用
滅菌水を用いて使用前に再構成される。タンパク質の製
剤組成物は、液体形態でも提供されている。このような
液体タンパク質製剤は、特に高温での、長期間に亘るタ
ンパク質活性の損失のために、保存で保持するのが難し
い。
【０００４】治療的に有効なタンパク質の製剤は、固体
（凍結乾燥）であれ液体形態であれ、動物への例えば皮
下注射による投与後の活性の突然の損失を伴わずに動物
に投与するのは難しい。注射部位でのタンパク質活性の
急速な損失のため、有効な療法のためには適用範囲の所
望期間中毎日投与する必要があるために、動物における
感染を治療するにはタンパク質は不便である。顆粒球コ
ロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、例えばウシ顆粒球コロ
ニー刺激因子（ｂＧ−ＣＳＦ）は、二次構造の損失およ
びジスルフィドインターチェンジ、ならびにその後の活
性の損失のために、４０℃以上では不安定である。この
活性の損失は、ウシの体温が約４０℃で、注射部位は生
理学的ｐＨ範囲であるために、注射部位で起こる。
（凍結乾燥）であれ液体形態であれ、動物への例えば皮
下注射による投与後の活性の突然の損失を伴わずに動物
に投与するのは難しい。注射部位でのタンパク質活性の
急速な損失のため、有効な療法のためには適用範囲の所
望期間中毎日投与する必要があるために、動物における
感染を治療するにはタンパク質は不便である。顆粒球コ
ロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、例えばウシ顆粒球コロ
ニー刺激因子（ｂＧ−ＣＳＦ）は、二次構造の損失およ
びジスルフィドインターチェンジ、ならびにその後の活
性の損失のために、４０℃以上では不安定である。この
活性の損失は、ウシの体温が約４０℃で、注射部位は生
理学的ｐＨ範囲であるために、注射部位で起こる。
【０００５】保存寿命を延ばすための種々のタンパク質
製剤が知られている。米国特許第5,104,651 号（Boone
等、１９９２年４月１４日発行）は、１０００μｍｈｏ
ｓ／ｃｍ未満の伝導率を有する、３．０〜３．７の範囲
のｐＨのＧ−ＣＳＦと酸の製剤組成物に言及する。米国
特許第4,992,271 号（Fernandes 等、１９９１年２月１
２日発行）は、ｐＨ６．８〜７．８で水性ベースの担体
媒質中に溶解された生物学的に活性な組換えインターロ
イキン２タンパク質を含有し、さらにヒト血清アルブミ
ンのようなタンパク質のための安定剤を含有する製剤組
成物に言及する。
製剤が知られている。米国特許第5,104,651 号（Boone
等、１９９２年４月１４日発行）は、１０００μｍｈｏ
ｓ／ｃｍ未満の伝導率を有する、３．０〜３．７の範囲
のｐＨのＧ−ＣＳＦと酸の製剤組成物に言及する。米国
特許第4,992,271 号（Fernandes 等、１９９１年２月１
２日発行）は、ｐＨ６．８〜７．８で水性ベースの担体
媒質中に溶解された生物学的に活性な組換えインターロ
イキン２タンパク質を含有し、さらにヒト血清アルブミ
ンのようなタンパク質のための安定剤を含有する製剤組
成物に言及する。
【０００６】米国特許第4,623,717 号（Fernandes 等、
１９８６年１１月１８日発行）は、低温殺菌前に安定化
量の糖または還元糖およびアミノ酸とタンパク質とを混
合することにより熱感受性治療的活性タンパク質が低温
滅菌される低温殺菌化治療的活性タンパク質組成物に言
及する。米国特許第4,645,830 号（Yasushi 等、１９８
７年２月２４日発行）は、溶液中にｐＨ３〜６でインタ
ーロイキン２、ヒト血清アルブミンおよび還元化合物を
含有する安定インターロイキン２組成物に言及する。
１９８６年１１月１８日発行）は、低温殺菌前に安定化
量の糖または還元糖およびアミノ酸とタンパク質とを混
合することにより熱感受性治療的活性タンパク質が低温
滅菌される低温殺菌化治療的活性タンパク質組成物に言
及する。米国特許第4,645,830 号（Yasushi 等、１９８
７年２月２４日発行）は、溶液中にｐＨ３〜６でインタ
ーロイキン２、ヒト血清アルブミンおよび還元化合物を
含有する安定インターロイキン２組成物に言及する。
【０００７】米国特許第4,647,454 号（Cymbalista、１
９８７年３月３日発行）は、ポリビニルピロリドンを用
いたヒト繊維芽細胞インターフェロンを安定化する方法
に言及する。米国特許第4,675,184 号（Hasegawa等、１
９８７年６月２３日発行）は、インターフェロン、３価
または多価糖アルコール、有機緩衝液および製剤担体ま
たは希釈剤を含有するウイルス感染を治療するための組
成物であって、約３〜６のｐＨを有する組成物に言及す
る（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中
に含まれる）。
９８７年３月３日発行）は、ポリビニルピロリドンを用
いたヒト繊維芽細胞インターフェロンを安定化する方法
に言及する。米国特許第4,675,184 号（Hasegawa等、１
９８７年６月２３日発行）は、インターフェロン、３価
または多価糖アルコール、有機緩衝液および製剤担体ま
たは希釈剤を含有するウイルス感染を治療するための組
成物であって、約３〜６のｐＨを有する組成物に言及す
る（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中
に含まれる）。
【０００８】治療的に有効な種類のタンパク質の一例
は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。顆
粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、コロニー刺激
因子として知られているいくつかの糖タンパク質増殖因
子の１つである。このようなコロニー刺激因子は、造血
前駆細胞（haemopoietic progenitor cell）の増殖を支
持し、特定の骨髄前駆細胞の増殖およびそれらの顆粒球
への分化を刺激する。さらに、Ｇ−ＣＳＦは、好中球性
顆粒球コロニー形成を刺激し、in vitroでネズミ骨髄単
球性白血病性細胞の末期分化を誘導し得る。Ｇ−ＣＳＦ
は、好中球の機能的活性を刺激して殺微生物活性増強を
引き起こすことも示されている。Ｇ−ＣＳＦは、１７４
個のアミノ酸の既知のアミノ酸配列を有する。
は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。顆
粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、コロニー刺激
因子として知られているいくつかの糖タンパク質増殖因
子の１つである。このようなコロニー刺激因子は、造血
前駆細胞（haemopoietic progenitor cell）の増殖を支
持し、特定の骨髄前駆細胞の増殖およびそれらの顆粒球
への分化を刺激する。さらに、Ｇ−ＣＳＦは、好中球性
顆粒球コロニー形成を刺激し、in vitroでネズミ骨髄単
球性白血病性細胞の末期分化を誘導し得る。Ｇ−ＣＳＦ
は、好中球の機能的活性を刺激して殺微生物活性増強を
引き起こすことも示されている。Ｇ−ＣＳＦは、１７４
個のアミノ酸の既知のアミノ酸配列を有する。
【０００９】ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの組換え形態が調
製されている。ヒトＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡのク
ローニングおよび発現は既知である（Nagata, S. et a
l.,Nature, 319, 415-418（1986））。WO-A-8604606お
よびWO-A-8604506は、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする遺伝
子を記載する。米国特許第5,606,024 号（Boone 等、１
９９７年２月２５日発行）および米国特許第5,472,857
号（１９９５年１２月５日発行）は、イヌ顆粒球コロニ
ー刺激因子（ｃＧ−ＣＳＦ）をコードするＤＮＡ配列な
らびに、イヌまたはネコのような動物に有効量のヒトお
よびイヌＧ−ＣＳＦを投与することによりこのような動
物における感染の治療または予防方法を記載する。
製されている。ヒトＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡのク
ローニングおよび発現は既知である（Nagata, S. et a
l.,Nature, 319, 415-418（1986））。WO-A-8604606お
よびWO-A-8604506は、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする遺伝
子を記載する。米国特許第5,606,024 号（Boone 等、１
９９７年２月２５日発行）および米国特許第5,472,857
号（１９９５年１２月５日発行）は、イヌ顆粒球コロニ
ー刺激因子（ｃＧ−ＣＳＦ）をコードするＤＮＡ配列な
らびに、イヌまたはネコのような動物に有効量のヒトお
よびイヌＧ−ＣＳＦを投与することによりこのような動
物における感染の治療または予防方法を記載する。
【００１０】米国特許第4,810,643 号（Souza 、１９８
９年３月７日発行）は、ヒトＧ−ＣＳＦ様ポリペプチド
を記載する。欧州特許出願第719860号（１９９６年７月
３日公開）は、天然ウシ顆粒球コロニー刺激因子（ｂＧ
−ＣＳＦ）、ｂＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列およ
び有効量のＧ−ＣＳＦを動物に投与することによる動物
における乳腺炎の治療または予防方法を記載する。WO-A
-8702060は、ヒトＧ−ＣＳＦ様ポリペプチド、それらを
コードする配列およびそれらの製造方法を記載する。米
国特許第4,833,127 号（Ono 等、１９８９年５月２３日
発行）は、新規の生物学的に活性なヒト顆粒球コロニー
刺激因子を記載する。欧州特許出願第612,846 号（１９
９４年８月３１日公開）は、ある種のＧ−ＣＳＦ類似体
およびこのような類似体を含有する組成物を記載する
（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中に
含まれる）。
９年３月７日発行）は、ヒトＧ−ＣＳＦ様ポリペプチド
を記載する。欧州特許出願第719860号（１９９６年７月
３日公開）は、天然ウシ顆粒球コロニー刺激因子（ｂＧ
−ＣＳＦ）、ｂＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列およ
び有効量のＧ−ＣＳＦを動物に投与することによる動物
における乳腺炎の治療または予防方法を記載する。WO-A
-8702060は、ヒトＧ−ＣＳＦ様ポリペプチド、それらを
コードする配列およびそれらの製造方法を記載する。米
国特許第4,833,127 号（Ono 等、１９８９年５月２３日
発行）は、新規の生物学的に活性なヒト顆粒球コロニー
刺激因子を記載する。欧州特許出願第612,846 号（１９
９４年８月３１日公開）は、ある種のＧ−ＣＳＦ類似体
およびこのような類似体を含有する組成物を記載する
（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中に
含まれる）。
【００１１】顆粒球コロニー刺激因子は、増殖またはビ
ルレンスに必要な特定の微生物標的をターゲッティング
するというよりむしろ、動物の免疫受容能を増大する抗
感染薬として有用である。非特異的免疫応答をターゲッ
ティングして微生物感染に対する抵抗力の増大をもたら
す獣医学に用いられるその他の市販の薬剤は多くない。
利用可能な制御手段は、従来の抗菌薬および限定数の生
化学的薬剤に限られている。畜牛における乳汁回収期に
関連した経済的損失は、従来の抗菌薬の用途を限定す
る。近年のワクチンは限定数の種を標的にし、これらの
薬剤の領域効能は広範に変化する。最も成功したワクチ
ン（大腸菌Ｊ５）は、内毒素汚染に関連した安全性問題
のために、それらの世界的使用が制限されている。
ルレンスに必要な特定の微生物標的をターゲッティング
するというよりむしろ、動物の免疫受容能を増大する抗
感染薬として有用である。非特異的免疫応答をターゲッ
ティングして微生物感染に対する抵抗力の増大をもたら
す獣医学に用いられるその他の市販の薬剤は多くない。
利用可能な制御手段は、従来の抗菌薬および限定数の生
化学的薬剤に限られている。畜牛における乳汁回収期に
関連した経済的損失は、従来の抗菌薬の用途を限定す
る。近年のワクチンは限定数の種を標的にし、これらの
薬剤の領域効能は広範に変化する。最も成功したワクチ
ン（大腸菌Ｊ５）は、内毒素汚染に関連した安全性問題
のために、それらの世界的使用が制限されている。
【００１２】乳腺炎（mastitis）は、全世界の酪農生産
者に影響を及ぼす大疾病問題である。乳腺炎に関連した
米国内での経済的損失は、年間１０億ドルを超える。こ
れらの損失は、死亡率、乳汁廃棄、乳汁産生における急
性および慢性疾患、早期採集の増大、ならびに薬物およ
び獣医師労働経費に関連がある。分娩周囲期の酪農雌ウ
シは、乳腺の細菌感染に対するそれらの感受性を増大す
る免疫応答（好中球機能）の損傷を示す。この感受性増
大の衝撃は、新規の臨床的乳房内感染の約４０％が仔ウ
シ出産後、最初の２週間以内に起きるということにより
例示される。乳腺炎は、広範な種々の細菌病原体、例え
ばグラム陽性菌およびグラム陰性菌に関連する。
者に影響を及ぼす大疾病問題である。乳腺炎に関連した
米国内での経済的損失は、年間１０億ドルを超える。こ
れらの損失は、死亡率、乳汁廃棄、乳汁産生における急
性および慢性疾患、早期採集の増大、ならびに薬物およ
び獣医師労働経費に関連がある。分娩周囲期の酪農雌ウ
シは、乳腺の細菌感染に対するそれらの感受性を増大す
る免疫応答（好中球機能）の損傷を示す。この感受性増
大の衝撃は、新規の臨床的乳房内感染の約４０％が仔ウ
シ出産後、最初の２週間以内に起きるということにより
例示される。乳腺炎は、広範な種々の細菌病原体、例え
ばグラム陽性菌およびグラム陰性菌に関連する。
【００１３】乳腺炎を引き起こす既知の病原性微生物の
いくつかは、大腸菌（Escherichiacoli）、スタフィロ
コッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus)、スト
レプトコッカス・アガラクチェ（Streptococcus agalac
tiae) 、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcu
s uberis)、ストレプトコッカス・ディスガラクチァ
（Streptococcus dysgalactiae)、アエロバクター・ア
エルギノーサ（Aerobacter aerogenes)、クレブシエラ
・ニューモニア（Klebsiella pneumoniae)およびシュー
ドモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa)
である。これらの病原体は、乳頭管を通って乳腺に入
り、乳汁産生組織の炎症を生じて、瘢痕組織を形成させ
て、これが乳汁産生能力の恒久的損失を引き起こし得
る。乳腺炎の種々の形態を以下に挙げる：乳腺感染、慢
性乳腺炎、臨床的乳腺炎および無症状性乳腺炎。
いくつかは、大腸菌（Escherichiacoli）、スタフィロ
コッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus)、スト
レプトコッカス・アガラクチェ（Streptococcus agalac
tiae) 、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcu
s uberis)、ストレプトコッカス・ディスガラクチァ
（Streptococcus dysgalactiae)、アエロバクター・ア
エルギノーサ（Aerobacter aerogenes)、クレブシエラ
・ニューモニア（Klebsiella pneumoniae)およびシュー
ドモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa)
である。これらの病原体は、乳頭管を通って乳腺に入
り、乳汁産生組織の炎症を生じて、瘢痕組織を形成させ
て、これが乳汁産生能力の恒久的損失を引き起こし得
る。乳腺炎の種々の形態を以下に挙げる：乳腺感染、慢
性乳腺炎、臨床的乳腺炎および無症状性乳腺炎。
【００１４】近年の抗菌療法およびワクチンは、授乳中
の雌ウシにおけるそれらの効用を制限する多数の欠点を
有する。乳腺炎を制御するための抗生物質療法は血管が
あることが見出されている。正常免疫受容能を回復させ
て、乳腺炎の発生数および重症度を低減させるのに有用
な生物療法薬が必要とされる。
の雌ウシにおけるそれらの効用を制限する多数の欠点を
有する。乳腺炎を制御するための抗生物質療法は血管が
あることが見出されている。正常免疫受容能を回復させ
て、乳腺炎の発生数および重症度を低減させるのに有用
な生物療法薬が必要とされる。
【００１５】輸送熱とも呼ばれるウシ呼吸器疾患は、畜
牛に影響を及ぼすもう一つの一般的疾患である。ウシ呼
吸器疾患は、飼育用地へのまたは牧場への輸送後に畜牛
を襲う疾患で、畜牛に影響を及ぼす種々のストレス、例
えば離乳、去勢、角切り、絶食、過密、感染性作因への
曝露、食餌変化および温度変化が、いくつかの既知の病
原体のいずれかによる感染と組合さって引き起こされ
る。パスツレラ・ヘモリチカ（Pasteurella haemolyti
ca）は、畜牛の呼吸器系に損傷を引き起こすこのような
一般的病原体の１つである。種々の生殖系疾患を含めた
いくつかのさらに別の感染性疾患も、ヒト、ブタ、ウ
シ、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギおよびヒツジに影響を及ぼ
すことが知られている。畜牛で発生するこのような疾患
の一例が子宮炎である。
牛に影響を及ぼすもう一つの一般的疾患である。ウシ呼
吸器疾患は、飼育用地へのまたは牧場への輸送後に畜牛
を襲う疾患で、畜牛に影響を及ぼす種々のストレス、例
えば離乳、去勢、角切り、絶食、過密、感染性作因への
曝露、食餌変化および温度変化が、いくつかの既知の病
原体のいずれかによる感染と組合さって引き起こされ
る。パスツレラ・ヘモリチカ（Pasteurella haemolyti
ca）は、畜牛の呼吸器系に損傷を引き起こすこのような
一般的病原体の１つである。種々の生殖系疾患を含めた
いくつかのさらに別の感染性疾患も、ヒト、ブタ、ウ
シ、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギおよびヒツジに影響を及ぼ
すことが知られている。畜牛で発生するこのような疾患
の一例が子宮炎である。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】in vivo での持続する
期間中ずっと治療的に有効である安定したタンパク質組
成物が必要である。さらに、in vitro保存寿命および保
存の延長を提供するタンパク質の製剤が必要とされる。
期間中ずっと治療的に有効である安定したタンパク質組
成物が必要である。さらに、in vitro保存寿命および保
存の延長を提供するタンパク質の製剤が必要とされる。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明は、タンパク質お
よび安定化緩衝剤を含んで成る安定化されたタンパク質
組成物であって、持続する期間中、治療レベルのこのよ
うなタンパク質を保持し得る組成物に関する。本発明の
特定の態様としては、生理学的ｐＨにある安定化された
タンパク質組成物が挙げられる。本発明の他の態様とし
ては、安定化されたタンパク質組成物が生理的温度にあ
る安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。本発明
のその他の特定の態様としては、安定化緩衝剤がＨＥＰ
ＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群から選択
される安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
よび安定化緩衝剤を含んで成る安定化されたタンパク質
組成物であって、持続する期間中、治療レベルのこのよ
うなタンパク質を保持し得る組成物に関する。本発明の
特定の態様としては、生理学的ｐＨにある安定化された
タンパク質組成物が挙げられる。本発明の他の態様とし
ては、安定化されたタンパク質組成物が生理的温度にあ
る安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。本発明
のその他の特定の態様としては、安定化緩衝剤がＨＥＰ
ＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群から選択
される安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
【００１８】本発明のさらに別の特定の態様としては、
持続する期間が少なくとも約３日間である安定化された
タンパク質組成物が挙げられる。本発明のさらに別の特
定の態様としては、タンパク質がコロニー刺激因子、ソ
マトトロピン、インターロイキン、インターフェロン、
サイトカイン、抗体および抗原から成る群から選択され
る安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。本発明
のさらに特定の態様としては、タンパク質がヒトＧ−Ｃ
ＳＦ、ウシＧ−ＣＳＦおよびイヌＧ−ＣＳＦから成る群
から選択される安定化されたタンパク質組成物が挙げら
れる。本発明のさらに特定の態様としては、タンパク質
がＧ−ＣＳＦであり、Ｇ−ＣＳＦが０．０１〜５ｍｇ／
ｍｌの範囲の濃度で存在する安定化されたタンパク質組
成物が挙げられる。
持続する期間が少なくとも約３日間である安定化された
タンパク質組成物が挙げられる。本発明のさらに別の特
定の態様としては、タンパク質がコロニー刺激因子、ソ
マトトロピン、インターロイキン、インターフェロン、
サイトカイン、抗体および抗原から成る群から選択され
る安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。本発明
のさらに特定の態様としては、タンパク質がヒトＧ−Ｃ
ＳＦ、ウシＧ−ＣＳＦおよびイヌＧ−ＣＳＦから成る群
から選択される安定化されたタンパク質組成物が挙げら
れる。本発明のさらに特定の態様としては、タンパク質
がＧ−ＣＳＦであり、Ｇ−ＣＳＦが０．０１〜５ｍｇ／
ｍｌの範囲の濃度で存在する安定化されたタンパク質組
成物が挙げられる。
【００１９】本発明のその他の特定の態様としては、タ
ンパク質がＧ−ＣＳＦであり、安定化緩衝剤がＨＥＰＥ
Ｓ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群から選択さ
れる安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。本発
明のその他のさらに特定の態様としては、タンパク質が
Ｇ−ＣＳＦであり、そして安定化緩衝剤が約０．０５Ｍ
〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する安定化されたタンパク
質組成物が挙げられる。本発明のさらに別の特定の態様
としては、タンパク質がＧ−ＣＳＦであり、そして組成
物が生理学的ｐＨにある安定化されたタンパク質組成物
が挙げられる。
ンパク質がＧ−ＣＳＦであり、安定化緩衝剤がＨＥＰＥ
Ｓ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群から選択さ
れる安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。本発
明のその他のさらに特定の態様としては、タンパク質が
Ｇ−ＣＳＦであり、そして安定化緩衝剤が約０．０５Ｍ
〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する安定化されたタンパク
質組成物が挙げられる。本発明のさらに別の特定の態様
としては、タンパク質がＧ−ＣＳＦであり、そして組成
物が生理学的ｐＨにある安定化されたタンパク質組成物
が挙げられる。
【００２０】本発明のさらに別の特定の態様としては、
タンパク質がＧ−ＣＳＦであり、そして組成物が生理学
的温度にある安定化されたタンパク質組成物が挙げられ
る。本発明のさらに特定の態様としては、タンパク質が
ウシＧ−ＣＳＦである安定化されたタンパク質組成物が
挙げられる。本発明のその他の特定の態様としては、タ
ンパク質がウシＧ−ＣＳＦであり、そしてｂＧ−ＣＳＦ
が０．００１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する安
定化されたタンパク質組成物が挙げられる。本発明のそ
の他の特定の態様としては、タンパク質がウシＧ−ＣＳ
Ｆであり、安定化緩衝剤がＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴ
ＲＩＣＩＮＥから成る群から選択される安定化されたタ
ンパク質組成物が挙げられる。
タンパク質がＧ−ＣＳＦであり、そして組成物が生理学
的温度にある安定化されたタンパク質組成物が挙げられ
る。本発明のさらに特定の態様としては、タンパク質が
ウシＧ−ＣＳＦである安定化されたタンパク質組成物が
挙げられる。本発明のその他の特定の態様としては、タ
ンパク質がウシＧ−ＣＳＦであり、そしてｂＧ−ＣＳＦ
が０．００１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する安
定化されたタンパク質組成物が挙げられる。本発明のそ
の他の特定の態様としては、タンパク質がウシＧ−ＣＳ
Ｆであり、安定化緩衝剤がＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴ
ＲＩＣＩＮＥから成る群から選択される安定化されたタ
ンパク質組成物が挙げられる。
【００２１】本発明のさらに他の特定の態様としては、
タンパク質がウシＧ−ＣＳＦであり、そして安定化緩衝
剤が約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する安定
化されたタンパク質組成物が挙げられる。本発明のさら
に別の特定の態様としては、タンパク質がウシＧ−ＣＳ
Ｆであり、そして組成物が生理学的ｐＨである安定化さ
れたタンパク質組成物が挙げられる。本発明のさらに別
の特定の態様としては、タンパク質がウシＧ−ＣＳＦで
あり、そして組成物が生理学的温度である安定化された
タンパク質組成物が挙げられる。
タンパク質がウシＧ−ＣＳＦであり、そして安定化緩衝
剤が約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する安定
化されたタンパク質組成物が挙げられる。本発明のさら
に別の特定の態様としては、タンパク質がウシＧ−ＣＳ
Ｆであり、そして組成物が生理学的ｐＨである安定化さ
れたタンパク質組成物が挙げられる。本発明のさらに別
の特定の態様としては、タンパク質がウシＧ−ＣＳＦで
あり、そして組成物が生理学的温度である安定化された
タンパク質組成物が挙げられる。
【００２２】好ましくは、本発明の安定化されたタンパ
ク質組成物は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中にウシＧ−ＣＳＦを
含んで成る組成物である。さらに好ましくは、ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液は、約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在
する。このようなウシＧ−ＣＳＦ製剤は、好ましくは生
理学的ｐＨ、例えばｐＨ７．５である。さらに、このよ
うな好ましいウシＧ−ＣＳＦ製剤は、少なくとも３日〜
７日間、またはそれ以上の間の持続する期間中、治療レ
ベルのウシＧ−ＣＳＦを保持し得る。
ク質組成物は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中にウシＧ−ＣＳＦを
含んで成る組成物である。さらに好ましくは、ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液は、約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在
する。このようなウシＧ−ＣＳＦ製剤は、好ましくは生
理学的ｐＨ、例えばｐＨ７．５である。さらに、このよ
うな好ましいウシＧ−ＣＳＦ製剤は、少なくとも３日〜
７日間、またはそれ以上の間の持続する期間中、治療レ
ベルのウシＧ−ＣＳＦを保持し得る。
【００２３】さらに、本発明の安定化されたタンパク質
組成物はＨＥＰＥＳ緩衝液中にウシＧ−ＣＳＦを含んで
成る組成物であって、保存寿命および保存の延長を提供
し得る。好ましくは、ＨＥＰＥＳ緩衝液は、約０．０５
Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する。さらに好ましく
は、このような組成物は、約４．０〜約７．５好ましく
は４．０のｐＨで、約４０℃未満、好ましくは約４℃の
温度に保持される。保存寿命および保存の延長は、約３
週間〜約１８ヶ月の範囲、好ましくは約６週間〜約１年
の範囲である。
組成物はＨＥＰＥＳ緩衝液中にウシＧ−ＣＳＦを含んで
成る組成物であって、保存寿命および保存の延長を提供
し得る。好ましくは、ＨＥＰＥＳ緩衝液は、約０．０５
Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する。さらに好ましく
は、このような組成物は、約４．０〜約７．５好ましく
は４．０のｐＨで、約４０℃未満、好ましくは約４℃の
温度に保持される。保存寿命および保存の延長は、約３
週間〜約１８ヶ月の範囲、好ましくは約６週間〜約１年
の範囲である。
【００２４】本発明はさらに、タンパク質および医薬と
して許容される安定化緩衝剤を含んで成る哺乳類への非
経口投与のための安定化されたタンパク質組成物の医薬
として許容される投与形態であって、組成物が持続する
期間中治療レベルのこのようなタンパク質を維持し得
る、そしてタンパク質が持続する期間中哺乳類に治療利
益を提供するのに十分な量で存在する投与形態に関す
る。本発明の特定の態様としては、投与形態が粘度改質
剤および界面活性剤から成る群から選択される成分をさ
らに含んで成る医薬として許容される投与形態が挙げら
れる。
して許容される安定化緩衝剤を含んで成る哺乳類への非
経口投与のための安定化されたタンパク質組成物の医薬
として許容される投与形態であって、組成物が持続する
期間中治療レベルのこのようなタンパク質を維持し得
る、そしてタンパク質が持続する期間中哺乳類に治療利
益を提供するのに十分な量で存在する投与形態に関す
る。本発明の特定の態様としては、投与形態が粘度改質
剤および界面活性剤から成る群から選択される成分をさ
らに含んで成る医薬として許容される投与形態が挙げら
れる。
【００２５】本発明はさらに、タンパク質と安定化緩衝
剤を一緒にする工程を含んで成る哺乳類への非経口投与
のための医薬として許容される投与形態の安定化された
タンパク質組成物の製造方法であって、安定化されたタ
ンパク質組成物が持続する期間中、治療レベルのこのよ
うなタンパク質を保持することができ、そしてタンパク
質が少なくとも約３日間哺乳類に対する防護を提供する
のに十分な量で存在する方法に関する。本発明はさら
に、療法的有効量の安定化されたタンパク質組成物を哺
乳類に投与することを含んで成る哺乳類における感染の
治療または予防方法であって、安定化されたタンパク質
組成物がタンパク質および安定化緩衝剤を含んで成り、
組成物が持続する期間中このようなタンパク質の治療レ
ベルを保持し得ることを特徴とする方法に関する。
剤を一緒にする工程を含んで成る哺乳類への非経口投与
のための医薬として許容される投与形態の安定化された
タンパク質組成物の製造方法であって、安定化されたタ
ンパク質組成物が持続する期間中、治療レベルのこのよ
うなタンパク質を保持することができ、そしてタンパク
質が少なくとも約３日間哺乳類に対する防護を提供する
のに十分な量で存在する方法に関する。本発明はさら
に、療法的有効量の安定化されたタンパク質組成物を哺
乳類に投与することを含んで成る哺乳類における感染の
治療または予防方法であって、安定化されたタンパク質
組成物がタンパク質および安定化緩衝剤を含んで成り、
組成物が持続する期間中このようなタンパク質の治療レ
ベルを保持し得ることを特徴とする方法に関する。
【００２６】本発明の特定の態様としては、タンパク質
がＧ−ＣＳＦである哺乳類における感染のこのような治
療または予防方法が挙げられる。本発明はさらに、療法
的有効量の安定化Ｇ−ＣＳＦ組成物を哺乳類に投与する
ことを含んで成る畜牛における乳腺炎、子宮炎またはウ
シ呼吸器疾患の治療または予防方法であって、安定化Ｇ
−ＣＳＦ組成物がＧ−ＣＳＦおよび安定化緩衝剤を含ん
で成り、組成物が持続する期間中、このようなタンパク
質の治療レベルを保持し得ることを特徴とする方法に関
する。
がＧ−ＣＳＦである哺乳類における感染のこのような治
療または予防方法が挙げられる。本発明はさらに、療法
的有効量の安定化Ｇ−ＣＳＦ組成物を哺乳類に投与する
ことを含んで成る畜牛における乳腺炎、子宮炎またはウ
シ呼吸器疾患の治療または予防方法であって、安定化Ｇ
−ＣＳＦ組成物がＧ−ＣＳＦおよび安定化緩衝剤を含ん
で成り、組成物が持続する期間中、このようなタンパク
質の治療レベルを保持し得ることを特徴とする方法に関
する。
【００２７】本発明はさらに、安定化されたタンパク質
組成物を哺乳類に投与することを含んで成る、持続する
期間中に哺乳類においてタンパク質を治療レベルに保持
する方法であって、安定化されたタンパク質組成物がタ
ンパク質および安定化緩衝剤を含んで成り、組成物が持
続する期間中、このようなタンパク質の治療レベルを保
持し得ることを特徴とする方法に関する。本発明の特定
の態様としては、持続する期間中の哺乳類における治療
レベルのタンパク質の保持方法であって、安定化緩衝剤
がＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群
から選択される方法が挙げられる。
組成物を哺乳類に投与することを含んで成る、持続する
期間中に哺乳類においてタンパク質を治療レベルに保持
する方法であって、安定化されたタンパク質組成物がタ
ンパク質および安定化緩衝剤を含んで成り、組成物が持
続する期間中、このようなタンパク質の治療レベルを保
持し得ることを特徴とする方法に関する。本発明の特定
の態様としては、持続する期間中の哺乳類における治療
レベルのタンパク質の保持方法であって、安定化緩衝剤
がＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群
から選択される方法が挙げられる。
【００２８】本発明のその他の特定の態様としては、持
続する期間中の哺乳類における治療レベルのタンパク質
のこのような保持方法であって、持続する期間が少なく
とも約３日間である方法が挙げられる。本発明のその他
の特定の態様としては、持続する期間中の哺乳類におけ
る治療レベルのタンパク質のこのような保持方法であっ
て、タンパク質がコロニー刺激因子、ソマトトロピン、
サイトカイン、抗体および抗原から成る群から選択され
る方法が挙げられる。サイトカインの特定の例として
は、インターロイキン、例えばインターロイキン１〜１
８、並びにインターフェロン、例えばインターフェロン
α、βおよびガンマが挙げられる。
続する期間中の哺乳類における治療レベルのタンパク質
のこのような保持方法であって、持続する期間が少なく
とも約３日間である方法が挙げられる。本発明のその他
の特定の態様としては、持続する期間中の哺乳類におけ
る治療レベルのタンパク質のこのような保持方法であっ
て、タンパク質がコロニー刺激因子、ソマトトロピン、
サイトカイン、抗体および抗原から成る群から選択され
る方法が挙げられる。サイトカインの特定の例として
は、インターロイキン、例えばインターロイキン１〜１
８、並びにインターフェロン、例えばインターフェロン
α、βおよびガンマが挙げられる。
【００２９】本発明のさらに特定の態様としては、持続
する期間中の哺乳類における治療レベルのタンパク質の
このような保持方法であって、タンパク質がヒトＧ−Ｃ
ＳＦ、ウシＧ−ＣＳＦおよびイヌＧ−ＣＳＦから成る群
から選択される方法が挙げられる。本発明のさらに他の
特定の態様としては、持続する期間中に哺乳類において
治療レベルのＧ−ＣＳＦを保持する方法であって、Ｇ−
ＣＳＦが０．０１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在す
ることを特徴とする方法が挙げられる。
する期間中の哺乳類における治療レベルのタンパク質の
このような保持方法であって、タンパク質がヒトＧ−Ｃ
ＳＦ、ウシＧ−ＣＳＦおよびイヌＧ−ＣＳＦから成る群
から選択される方法が挙げられる。本発明のさらに他の
特定の態様としては、持続する期間中に哺乳類において
治療レベルのＧ−ＣＳＦを保持する方法であって、Ｇ−
ＣＳＦが０．０１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在す
ることを特徴とする方法が挙げられる。
【００３０】本発明のさらに他の特定の態様としては、
持続する期間中に哺乳類において治療レベルのＧ−ＣＳ
Ｆを保持する方法であって、安定化緩衝剤がＨＥＰＥ
Ｓ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群から選択さ
れることを特徴とする方法が挙げられる。本発明のさら
に他の特定の態様としては、持続する期間中に哺乳類に
おいて治療レベルのＧ−ＣＳＦを保持する方法であっ
て、安定化緩衝剤が約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度
で存在することを特徴とする方法が挙げられる。本発明
のさらに他の特定の態様としては、持続する期間中に哺
乳類において治療レベルのＧ−ＣＳＦを保持する方法で
あって、Ｇ−ＣＳＦがウシＧ−ＣＳＦであることを特徴
とする方法が挙げられる。
持続する期間中に哺乳類において治療レベルのＧ−ＣＳ
Ｆを保持する方法であって、安定化緩衝剤がＨＥＰＥ
Ｓ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群から選択さ
れることを特徴とする方法が挙げられる。本発明のさら
に他の特定の態様としては、持続する期間中に哺乳類に
おいて治療レベルのＧ−ＣＳＦを保持する方法であっ
て、安定化緩衝剤が約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度
で存在することを特徴とする方法が挙げられる。本発明
のさらに他の特定の態様としては、持続する期間中に哺
乳類において治療レベルのＧ−ＣＳＦを保持する方法で
あって、Ｇ−ＣＳＦがウシＧ−ＣＳＦであることを特徴
とする方法が挙げられる。
【００３１】本発明のさらに他の特定の態様としては、
持続する期間中に哺乳類において治療レベルのｂＧ−Ｃ
ＳＦを保持する方法であって、ｂＧ−ＣＳＦが０．０１
〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在することを特徴とす
る方法が挙げられる。本発明のさらに他の特定の態様と
しては、持続する期間中に哺乳類において治療レベルの
ｂＧ−ＣＳＦを保持する方法であって、安定化緩衝剤が
ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群か
ら選択されることを特徴とする方法が挙げられる。本発
明のさらに他の特定の態様としては、持続する期間中に
哺乳類において治療レベルのｂＧ−ＣＳＦを保持する方
法であって、安定化緩衝剤が約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範
囲の濃度で存在することを特徴とする方法が挙げられ
る。
持続する期間中に哺乳類において治療レベルのｂＧ−Ｃ
ＳＦを保持する方法であって、ｂＧ−ＣＳＦが０．０１
〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在することを特徴とす
る方法が挙げられる。本発明のさらに他の特定の態様と
しては、持続する期間中に哺乳類において治療レベルの
ｂＧ−ＣＳＦを保持する方法であって、安定化緩衝剤が
ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群か
ら選択されることを特徴とする方法が挙げられる。本発
明のさらに他の特定の態様としては、持続する期間中に
哺乳類において治療レベルのｂＧ−ＣＳＦを保持する方
法であって、安定化緩衝剤が約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範
囲の濃度で存在することを特徴とする方法が挙げられ
る。
【００３２】本発明はさらに、療法的有効量のタンパク
質を有する一次容器、および医薬として許容される安定
化緩衝剤を有する二次容器を含んで成る、安定化された
タンパク質組成物を哺乳類に投与するためのキットであ
って、一次容器の療法的有効量のタンパク質が、二次容
器の医薬として許容される安定化緩衝剤と組合わされ、
持続する期間中の哺乳類におけるこのようなタンパク質
の治療レベルを保持し得るキットに関する。本発明の特
定の態様としては、タンパク質が少なくとも３日間、哺
乳類に対する防護を提供するのに十分な量で存在するキ
ットが挙げられる。
質を有する一次容器、および医薬として許容される安定
化緩衝剤を有する二次容器を含んで成る、安定化された
タンパク質組成物を哺乳類に投与するためのキットであ
って、一次容器の療法的有効量のタンパク質が、二次容
器の医薬として許容される安定化緩衝剤と組合わされ、
持続する期間中の哺乳類におけるこのようなタンパク質
の治療レベルを保持し得るキットに関する。本発明の特
定の態様としては、タンパク質が少なくとも３日間、哺
乳類に対する防護を提供するのに十分な量で存在するキ
ットが挙げられる。
【００３３】本発明の好ましい組成物は、ウシＧ−ＣＳ
ＦおよびＨＥＰＥＳ緩衝液を含んで成り、in vivo で少
なくとも３日間、哺乳類において治療レベルのウシＧ−
ＣＳＦを保持し得る安定化されたタンパク質組成物であ
って、約７．５のｐＨを有し、ほぼ生理学的温度または
４０℃の温度にある組成物である。このような組成物
は、哺乳類が雌ウシである場合に特に有用である。特
に、ＨＥＰＥＳ緩衝液は約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の
濃度で存在する。ＨＥＰＥＳ緩衝液が約１Ｍの濃度で存
在する場合が特に好ましい。好ましくはウシＧ−ＣＳＦ
は約０．０１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する。
最も好ましくは、ｂＧ−ＣＳＦの濃度は約０．１ｍｇ／
ｍｌである。
ＦおよびＨＥＰＥＳ緩衝液を含んで成り、in vivo で少
なくとも３日間、哺乳類において治療レベルのウシＧ−
ＣＳＦを保持し得る安定化されたタンパク質組成物であ
って、約７．５のｐＨを有し、ほぼ生理学的温度または
４０℃の温度にある組成物である。このような組成物
は、哺乳類が雌ウシである場合に特に有用である。特
に、ＨＥＰＥＳ緩衝液は約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の
濃度で存在する。ＨＥＰＥＳ緩衝液が約１Ｍの濃度で存
在する場合が特に好ましい。好ましくはウシＧ−ＣＳＦ
は約０．０１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する。
最も好ましくは、ｂＧ−ＣＳＦの濃度は約０．１ｍｇ／
ｍｌである。
【００３４】好ましくは、本発明はさらに、ウシＧ−Ｃ
ＳＦおよびＨＥＰＥＳ緩衝液を含んで成る安定化された
タンパク質組成物であって、約３週間〜約１８ヶ月の範
囲の長期保存寿命を提供し得る組成物に関する。ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液が約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在
する場合は特に好ましい。組成物が約７．５のｐＨであ
り、そして組成物の温度が約４０℃未満である場合も好
ましく、最も好ましくは約４℃である。長期保存寿命が
約６ヶ月〜約１年である場合も特に好ましい。あるい
は、長期保存寿命を可能にするこのような安定化された
組成物は、約４０℃の組成物温度で保持され得る。
ＳＦおよびＨＥＰＥＳ緩衝液を含んで成る安定化された
タンパク質組成物であって、約３週間〜約１８ヶ月の範
囲の長期保存寿命を提供し得る組成物に関する。ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液が約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在
する場合は特に好ましい。組成物が約７．５のｐＨであ
り、そして組成物の温度が約４０℃未満である場合も好
ましく、最も好ましくは約４℃である。長期保存寿命が
約６ヶ月〜約１年である場合も特に好ましい。あるい
は、長期保存寿命を可能にするこのような安定化された
組成物は、約４０℃の組成物温度で保持され得る。
【００３５】
【発明の実施の形態】本発明は、安定化されたタンパク
質組成物がin vivo およびin vitroの両方で持続する期
間のタンパク質活性を保持し得るように、タンパク質、
特に哺乳類、例えばヒト、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、
ウマおよびブタにおける感染の治療に有用なタンパク質
が、安定化緩衝剤、例えばＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴ
ＲＩＣＩＮＥのタンパク質への付加により安定化され得
る、という意外な発見を基礎にした安定化されたタンパ
ク質組成物に関する。in vivo 活性に関しては、本発明
の安定化されたタンパク質組成物は、持続する期間中、
哺乳類における治療的有効レベルのこのようなタンパク
質を保持し得る。
質組成物がin vivo およびin vitroの両方で持続する期
間のタンパク質活性を保持し得るように、タンパク質、
特に哺乳類、例えばヒト、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、
ウマおよびブタにおける感染の治療に有用なタンパク質
が、安定化緩衝剤、例えばＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴ
ＲＩＣＩＮＥのタンパク質への付加により安定化され得
る、という意外な発見を基礎にした安定化されたタンパ
ク質組成物に関する。in vivo 活性に関しては、本発明
の安定化されたタンパク質組成物は、持続する期間中、
哺乳類における治療的有効レベルのこのようなタンパク
質を保持し得る。
【００３６】特に、本発明は、長期間の治療薬活性を提
供する安定化緩衝剤、例えばＨＥＰＥＳまたはＴＥＳ中
のｂＧ−ＣＳＦの持続放出性（持続活性）製剤である。
ｂＧ−ＣＳＦは、約４０℃の温度で変性し、そして中性
ｐＨで不安定である、ということが知られている。これ
は、生理学的ｐＨが中性に近く、雌ウシの体温が約４０
℃であるために、問題である。
供する安定化緩衝剤、例えばＨＥＰＥＳまたはＴＥＳ中
のｂＧ−ＣＳＦの持続放出性（持続活性）製剤である。
ｂＧ−ＣＳＦは、約４０℃の温度で変性し、そして中性
ｐＨで不安定である、ということが知られている。これ
は、生理学的ｐＨが中性に近く、雌ウシの体温が約４０
℃であるために、問題である。
【００３７】本発明の安定化された組成物のタンパク質
は、天然タンパク質、単離または精製されたタンパク
質、あるいは組換え的に産生されたタンパク質であり得
る。化学的に修飾されたタンパク質もすべて、本発明の
範囲内に含まれる。タンパク質の化学的修飾としては、
例えばメチオニン酸化、システインＳ−アルキル化およ
びβ−メルカプトエタノールを用いたジスルフィド付
加、リジンアミノ基のアルキル化等が挙げられる。本発
明の安定化されたタンパク質組成物中に用いるのに好ま
しいタンパク質はＧ−ＣＳＦであり、最も好ましいのは
タンパク質ｂＧ−ＣＳＦである。
は、天然タンパク質、単離または精製されたタンパク
質、あるいは組換え的に産生されたタンパク質であり得
る。化学的に修飾されたタンパク質もすべて、本発明の
範囲内に含まれる。タンパク質の化学的修飾としては、
例えばメチオニン酸化、システインＳ−アルキル化およ
びβ−メルカプトエタノールを用いたジスルフィド付
加、リジンアミノ基のアルキル化等が挙げられる。本発
明の安定化されたタンパク質組成物中に用いるのに好ま
しいタンパク質はＧ−ＣＳＦであり、最も好ましいのは
タンパク質ｂＧ−ＣＳＦである。
【００３８】「Ｇ−ＣＳＦ」とは、顆粒球コロニー刺激
因子、例えばその天然形態の顆粒球コロニー刺激因子、
ならびにその変異体（variant)および突然変異体（muta
nt)、例えば１つ又はそれ以上のアミノ酸欠失、置換お
よび／または付加を有する組換え変異体を意味する。こ
のような変異体および突然変異体は、哺乳類における治
療的利益を提供するためのすべてのまたは十分な生物学
的活性を保有する。その天然形態のＧ−ＣＳＦは、１７
４個のアミノ酸を有するタンパク質を包含する糖タンパ
ク質であり、ある形態は３つの付加的アミノ酸を有す
る。両形態とも、５個のシステイン残基を有し、そのう
ちの４個は２つのジスルフィド結合を形成し、１個は遊
離形態である。
因子、例えばその天然形態の顆粒球コロニー刺激因子、
ならびにその変異体（variant)および突然変異体（muta
nt)、例えば１つ又はそれ以上のアミノ酸欠失、置換お
よび／または付加を有する組換え変異体を意味する。こ
のような変異体および突然変異体は、哺乳類における治
療的利益を提供するためのすべてのまたは十分な生物学
的活性を保有する。その天然形態のＧ−ＣＳＦは、１７
４個のアミノ酸を有するタンパク質を包含する糖タンパ
ク質であり、ある形態は３つの付加的アミノ酸を有す
る。両形態とも、５個のシステイン残基を有し、そのう
ちの４個は２つのジスルフィド結合を形成し、１個は遊
離形態である。
【００３９】本発明の安定化されたタンパク質組成物中
に用いるのに適したタンパク質のその他の例としては、
例えばアクチビン、接着分子、例えばＬ−セレクチン、
ＣＤ−１８およびＩＣＡＭ−１、ケモカイン、走化性因
子、エリスロポエチン、増殖因子、インヒビン、インス
リン、インターフェロン、例えばα、βおよびγ、イン
ターロイキン、例えばインターロイキン１〜１８、レプ
チン、マクロファージ炎症性タンパク質、マクロファー
ジ遊走阻止因子、マクロファージ刺激タンパク質、ニュ
ートロフィン、好中球阻止因子、オンコスタチン、ソマ
トスタチン、ソマトトロピン（全種、例えばブタ、ウシ
またはヒト）、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、トロンボポ
エチン、ならびに前記のタンパク質すべてに対する細胞
関連および可溶性受容体、そして哺乳類に投与した場合
に有益なまたは治療的結果を提供し得るその他のいずれ
かのおよびあらゆるタンパク質が挙げられる。
に用いるのに適したタンパク質のその他の例としては、
例えばアクチビン、接着分子、例えばＬ−セレクチン、
ＣＤ−１８およびＩＣＡＭ−１、ケモカイン、走化性因
子、エリスロポエチン、増殖因子、インヒビン、インス
リン、インターフェロン、例えばα、βおよびγ、イン
ターロイキン、例えばインターロイキン１〜１８、レプ
チン、マクロファージ炎症性タンパク質、マクロファー
ジ遊走阻止因子、マクロファージ刺激タンパク質、ニュ
ートロフィン、好中球阻止因子、オンコスタチン、ソマ
トスタチン、ソマトトロピン（全種、例えばブタ、ウシ
またはヒト）、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、トロンボポ
エチン、ならびに前記のタンパク質すべてに対する細胞
関連および可溶性受容体、そして哺乳類に投与した場合
に有益なまたは治療的結果を提供し得るその他のいずれ
かのおよびあらゆるタンパク質が挙げられる。
【００４０】本発明の安定化されたタンパク質組成物中
に用い得る特定のタンパク質の例を、表１〜表６に示
す。本発明の安定化されたタンパク質組成物中に用い得
るその他のタンパク質としては、R&D Systems Catalogu
e, 614 McKinley Place NE, Minneapolis MN 55413, US
A （この記載内容は、参照により本明細書中に含まれ
る）に記載されているものが挙げられる。
に用い得る特定のタンパク質の例を、表１〜表６に示
す。本発明の安定化されたタンパク質組成物中に用い得
るその他のタンパク質としては、R&D Systems Catalogu
e, 614 McKinley Place NE, Minneapolis MN 55413, US
A （この記載内容は、参照により本明細書中に含まれ
る）に記載されているものが挙げられる。
【００４１】
【表１】
【００４２】
【表２】
【００４３】
【表３】
【００４４】
【表４】
【００４５】
【表５】
【００４６】
【表６】
【００４７】好ましいタンパク質は、哺乳類、例えばヒ
ト、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマおよびネコ
における感染の治療または予防に有用なものである。こ
のような感染は、細菌感染または原生動物感染であり、
あるいはウイルスにより引き起こされ得る。本明細書中
で用いる場合は、別記しない限り、「感染」という用語
は、哺乳類において生じる細菌、原生動物、真菌および
ウイルス感染、ならびに本発明の安定化されたタンパク
質組成物を投与することにより治療または予防され得る
このような感染に関連した疾病を含む。
ト、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマおよびネコ
における感染の治療または予防に有用なものである。こ
のような感染は、細菌感染または原生動物感染であり、
あるいはウイルスにより引き起こされ得る。本明細書中
で用いる場合は、別記しない限り、「感染」という用語
は、哺乳類において生じる細菌、原生動物、真菌および
ウイルス感染、ならびに本発明の安定化されたタンパク
質組成物を投与することにより治療または予防され得る
このような感染に関連した疾病を含む。
【００４８】本発明の安定化されたタンパク質組成物を
用いて治療され得る感染性疾患としては、スタフィロコ
ッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus)、エシェ
リシア・コリ（Escherichia coli) 、ストレプトコッカ
ス・ウベリス（Streptococcus uberis)、ストレプトコ
ッカス・ディスガラクチア（Streptococcus dysgalact
iae)、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococ
cus agalactiae）、クレブシエラ・スペーシス（Klebsi
ella sp.) 、コリネバクテリウム・スペシス（Corynebu
cterium sp.)に関連するがこれらに限定されない畜牛の
感染性疾患、例えばウシ乳腺炎；ウシの伝染性鼻気管炎
ウイルス（ＩＢＲ）、パラインフルエンザウイルス（Ｐ
Ｉ３）、ウシのウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤ）、パ
スツレラ・ヘモリチカ（Pasteurella haemolytica)、パ
スツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）およ
びヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）に関
連するがこれらに限定されないウシ呼吸器疾患；生殖系
疾患、例えば子宮炎；ならびに大腸菌およびアイメリア
属に関連するが、これらに限定されないウシの下痢が挙
げられるが、これらに限定されない。
用いて治療され得る感染性疾患としては、スタフィロコ
ッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus)、エシェ
リシア・コリ（Escherichia coli) 、ストレプトコッカ
ス・ウベリス（Streptococcus uberis)、ストレプトコ
ッカス・ディスガラクチア（Streptococcus dysgalact
iae)、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococ
cus agalactiae）、クレブシエラ・スペーシス（Klebsi
ella sp.) 、コリネバクテリウム・スペシス（Corynebu
cterium sp.)に関連するがこれらに限定されない畜牛の
感染性疾患、例えばウシ乳腺炎；ウシの伝染性鼻気管炎
ウイルス（ＩＢＲ）、パラインフルエンザウイルス（Ｐ
Ｉ３）、ウシのウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤ）、パ
スツレラ・ヘモリチカ（Pasteurella haemolytica)、パ
スツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）およ
びヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）に関
連するがこれらに限定されないウシ呼吸器疾患；生殖系
疾患、例えば子宮炎；ならびに大腸菌およびアイメリア
属に関連するが、これらに限定されないウシの下痢が挙
げられるが、これらに限定されない。
【００４９】本発明の安定化されたタンパク質組成物を
用いて治療され得る感染性疾患のその他の例としては、
イヌの感染性疾患、例えば膿皮症、ならびにケンネル咳
とも呼ばれるイヌの呼吸器疾患が挙げられるが、これら
に限定されない。本発明の安定化されたタンパク質組成
物は、感染症の治療または予防以外の治療的利益を提供
するために用い得る。感染症の治療または予防以外の治
療的利益または作用の一例は、イヌおよびネコに組換え
ヒトＧ−ＣＳＦを投与して、化学療法誘導性骨髄抑制を
改善し、癌治療プロトコールをより攻撃的にさせること
である。
用いて治療され得る感染性疾患のその他の例としては、
イヌの感染性疾患、例えば膿皮症、ならびにケンネル咳
とも呼ばれるイヌの呼吸器疾患が挙げられるが、これら
に限定されない。本発明の安定化されたタンパク質組成
物は、感染症の治療または予防以外の治療的利益を提供
するために用い得る。感染症の治療または予防以外の治
療的利益または作用の一例は、イヌおよびネコに組換え
ヒトＧ−ＣＳＦを投与して、化学療法誘導性骨髄抑制を
改善し、癌治療プロトコールをより攻撃的にさせること
である。
【００５０】本明細書中で用いる場合、「安定化する」
という用語は、別記しない限り、長時間、治療レベルの
タンパク質を保持することを示す。タンパク質のこのよ
うな保持治療レベルは、本発明の安定化されたタンパク
質組成物を哺乳類に投与後に、またはin vitroでは使用
前または保存中に生じる。本発明のタンパク質組成物の
安定度は、例えば本明細書に記載した方法を用いて、初
期濃度に対する％対時間により確定され得る。
という用語は、別記しない限り、長時間、治療レベルの
タンパク質を保持することを示す。タンパク質のこのよ
うな保持治療レベルは、本発明の安定化されたタンパク
質組成物を哺乳類に投与後に、またはin vitroでは使用
前または保存中に生じる。本発明のタンパク質組成物の
安定度は、例えば本明細書に記載した方法を用いて、初
期濃度に対する％対時間により確定され得る。
【００５１】哺乳類への投与後に、本発明の安定化され
た組成物は、タンパク質が持続する期間中、その治療的
または有益な作用を提供し得るように、保持治療レベル
のタンパク質を提供する。本明細書中で用いる場合、別
記しない限りは、「持続する期間」という用語は、本発
明の安定化されたタンパク質組成物の哺乳類への投与
後、あるいはin vitroでは使用前、または保存中に、治
療レベルのタンパク質が保持される期間を示す。
た組成物は、タンパク質が持続する期間中、その治療的
または有益な作用を提供し得るように、保持治療レベル
のタンパク質を提供する。本明細書中で用いる場合、別
記しない限りは、「持続する期間」という用語は、本発
明の安定化されたタンパク質組成物の哺乳類への投与
後、あるいはin vitroでは使用前、または保存中に、治
療レベルのタンパク質が保持される期間を示す。
【００５２】タンパク質治療レベルの持続する期間は、
例えば、水またはＰＢＳ中のタンパク質の対照溶液を用
いて比較した場合、安定化緩衝剤の存在を伴わない哺乳
類への同一タンパク質の投与により成され得るよりも長
い期間、哺乳類における有益なまたは治療的作用を提供
する。あるいは、in vitro保存条件下では、タンパク質
治療レベルの持続する期間は、例えば、水またはＰＢＳ
中のタンパク質の対照溶液を用いて比較した場合、安定
化緩衝剤の存在を伴わない条件下での同一タンパク質の
保存により成され得るよりも長い期間タンパク質の安定
度増大を提供する。好ましくは、持続する期間は少なく
とも３日である。最も好ましくは、持続する期間は約７
日またはそれ以上である。
例えば、水またはＰＢＳ中のタンパク質の対照溶液を用
いて比較した場合、安定化緩衝剤の存在を伴わない哺乳
類への同一タンパク質の投与により成され得るよりも長
い期間、哺乳類における有益なまたは治療的作用を提供
する。あるいは、in vitro保存条件下では、タンパク質
治療レベルの持続する期間は、例えば、水またはＰＢＳ
中のタンパク質の対照溶液を用いて比較した場合、安定
化緩衝剤の存在を伴わない条件下での同一タンパク質の
保存により成され得るよりも長い期間タンパク質の安定
度増大を提供する。好ましくは、持続する期間は少なく
とも３日である。最も好ましくは、持続する期間は約７
日またはそれ以上である。
【００５３】本明細書中で用いる場合、別記しない限
り、「治療レベル」という用語は、種々の投与レジメン
で治療効果を提供するタンパク質の量を指す。このよう
な量はあ、当業者には容易に確定される。タンパク質の
量は、感染の種類および重症度、投与経路等によってい
る。「安定化緩衝剤」とは、本発明の安定化された組成
物のタンパク質と組合わせた場合に、安定化されたタン
パク質組成物を提供し、この組成物が持続する期間中、
治療レベルのこのようなタンパク質を保持し得るいくつ
かの緩衝液のいずれかを意味する。
り、「治療レベル」という用語は、種々の投与レジメン
で治療効果を提供するタンパク質の量を指す。このよう
な量はあ、当業者には容易に確定される。タンパク質の
量は、感染の種類および重症度、投与経路等によってい
る。「安定化緩衝剤」とは、本発明の安定化された組成
物のタンパク質と組合わせた場合に、安定化されたタン
パク質組成物を提供し、この組成物が持続する期間中、
治療レベルのこのようなタンパク質を保持し得るいくつ
かの緩衝液のいずれかを意味する。
【００５４】治療レベルの保持は、例えば、当業者に既
知の方法により確定される場合、タンパク質活性を測定
することにより確定され得る。好ましくは、安定化緩衝
剤は、生理学的ｐＨで作用する。安定化緩衝剤として
は、有機緩衝液、例えば一般的に「良好な緩衝液」と呼
ばれ、６〜８．５の範囲で作用する両イオン性緩衝液、
が挙げられるが、これらに限定されない。このような安
定化緩衝剤の例としては、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）、
ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２
アミノエタンスルホン酸）およびＴＲＩＣＩＮＥ（Ｎ−
トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、カコジ
ル酸、ビス（２−ヒドロキシエチル）−イミノ−トリス
（ヒドロキシメチル）メタン（ＢＩＳＴＲＩＳ）、ピペ
ラジンＮ，Ｎ‘ビス−（２ エタンスルホン酸）（ＰＩ
ＰＥＳ）、イミダゾールおよびトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）が挙げられる。本発明の
安定化されたタンパク質組成物中に用い得る緩衝液の例
を、表７に示す。
知の方法により確定される場合、タンパク質活性を測定
することにより確定され得る。好ましくは、安定化緩衝
剤は、生理学的ｐＨで作用する。安定化緩衝剤として
は、有機緩衝液、例えば一般的に「良好な緩衝液」と呼
ばれ、６〜８．５の範囲で作用する両イオン性緩衝液、
が挙げられるが、これらに限定されない。このような安
定化緩衝剤の例としては、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）、
ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２
アミノエタンスルホン酸）およびＴＲＩＣＩＮＥ（Ｎ−
トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、カコジ
ル酸、ビス（２−ヒドロキシエチル）−イミノ−トリス
（ヒドロキシメチル）メタン（ＢＩＳＴＲＩＳ）、ピペ
ラジンＮ，Ｎ‘ビス−（２ エタンスルホン酸）（ＰＩ
ＰＥＳ）、イミダゾールおよびトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）が挙げられる。本発明の
安定化されたタンパク質組成物中に用い得る緩衝液の例
を、表７に示す。
【００５５】
【表７】
【００５６】本発明の安定化されたタンパク質組成物の
ｐＨは、約４．０〜約８の範囲である。本明細書中で用
いる場合、「生理学的ｐＨ」とは、別記しない限り、哺
乳類、例えばヒト、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、
イヌおよびネコで認められるｐＨの範囲を指す。哺乳類
の生理学的ｐＨは、一般に約６．５〜約８．０の範囲内
である。本発明の安定化されたタンパク質組成物の温度
は、約２０℃〜約５０℃の範囲である。
ｐＨは、約４．０〜約８の範囲である。本明細書中で用
いる場合、「生理学的ｐＨ」とは、別記しない限り、哺
乳類、例えばヒト、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、
イヌおよびネコで認められるｐＨの範囲を指す。哺乳類
の生理学的ｐＨは、一般に約６．５〜約８．０の範囲内
である。本発明の安定化されたタンパク質組成物の温度
は、約２０℃〜約５０℃の範囲である。
【００５７】本明細書中で用いる場合、「生理学的温
度」とは、別記しない限り、哺乳類、例えばヒト、ウ
シ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコで認め
られる体温の範囲を指す。哺乳類の生理学的温度は、一
般に約３７℃〜約４０℃の範囲内である。哺乳類の生理
学的温度のいくつかの例を以下に示す：ヒト ３７℃；
ウシ ３９℃；ネコ ３８℃；イヌ ３９℃；ヤギ ３
９℃；ウマ ３７℃；そしてブタ ３７℃。
度」とは、別記しない限り、哺乳類、例えばヒト、ウ
シ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコで認め
られる体温の範囲を指す。哺乳類の生理学的温度は、一
般に約３７℃〜約４０℃の範囲内である。哺乳類の生理
学的温度のいくつかの例を以下に示す：ヒト ３７℃；
ウシ ３９℃；ネコ ３８℃；イヌ ３９℃；ヤギ ３
９℃；ウマ ３７℃；そしてブタ ３７℃。
【００５８】好ましくは、本発明の安定化されたタンパ
ク質組成物は、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液および
ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液から選択される安定化緩衝剤中
に、タンパク質としてＧ−ＣＳＦを、さらに好ましくは
ウシＧ−ＣＳＦを含有する。その結果生じる安定化され
たタンパク質組成物は、ウシの生理学的ｐＨで、そして
４０℃のウシの生理学的温度で、少なくとも３日間の持
続する期間中、治療的有効レベルにｂＧ−ＣＳＦの活性
を保持し得る。
ク質組成物は、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液および
ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液から選択される安定化緩衝剤中
に、タンパク質としてＧ−ＣＳＦを、さらに好ましくは
ウシＧ−ＣＳＦを含有する。その結果生じる安定化され
たタンパク質組成物は、ウシの生理学的ｐＨで、そして
４０℃のウシの生理学的温度で、少なくとも３日間の持
続する期間中、治療的有効レベルにｂＧ−ＣＳＦの活性
を保持し得る。
【００５９】安定化されたタンパク質組成物は、既知の
そして一般に利用可能な組合せ技法を用いて、タンパク
質および安定化緩衝剤を一緒にすることにより、調製し
得る。安定化されたタンパク質組成物の特定の製造方法
には、当業者に既知のタンパク質精製方法にしたがって
調製された精製形態のタンパク質の使用が含まれる。
そして一般に利用可能な組合せ技法を用いて、タンパク
質および安定化緩衝剤を一緒にすることにより、調製し
得る。安定化されたタンパク質組成物の特定の製造方法
には、当業者に既知のタンパク質精製方法にしたがって
調製された精製形態のタンパク質の使用が含まれる。
【００６０】治療的値の特定のタンパク質に関しては、
種々の濃度の、例えば０．０５Ｍ〜２Ｍの緩衝液濃度の
いくつかの緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＴＲＩ
ＣＩＮＥまたはその他の緩衝液の各々の中に、特定のタ
ンパク質を溶解し得る（最大溶解度まで）。さらに、溶
液のｐＨは、典型的には約ｐＨ４．０〜約８．０に変わ
り得る。特定の緩衝液中のタンパク質の最大溶解度は、
当業者に既知の従来の手段により決定され得る。
種々の濃度の、例えば０．０５Ｍ〜２Ｍの緩衝液濃度の
いくつかの緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＴＲＩ
ＣＩＮＥまたはその他の緩衝液の各々の中に、特定のタ
ンパク質を溶解し得る（最大溶解度まで）。さらに、溶
液のｐＨは、典型的には約ｐＨ４．０〜約８．０に変わ
り得る。特定の緩衝液中のタンパク質の最大溶解度は、
当業者に既知の従来の手段により決定され得る。
【００６１】次に、タンパク質溶液が投与されるよう意
図された哺乳類の生理学的温度で溶液を保存し得る。溶
液中に存在するタンパク質の量は、時間の関数として決
定し得る。溶液中のタンパク質の治療的レベルは、時間
の関数としてのタンパク質の回収率％をモニタリングす
ることにより決定され得る。残留するタンパク質の量ま
たはタンパク質の回収率％を、治療的利益に必要なタン
パク質の既知の限界値（閾値）レベルと比較する。
図された哺乳類の生理学的温度で溶液を保存し得る。溶
液中に存在するタンパク質の量は、時間の関数として決
定し得る。溶液中のタンパク質の治療的レベルは、時間
の関数としてのタンパク質の回収率％をモニタリングす
ることにより決定され得る。残留するタンパク質の量ま
たはタンパク質の回収率％を、治療的利益に必要なタン
パク質の既知の限界値（閾値）レベルと比較する。
【００６２】次に、溶液中に残存するタンパク質の量が
治療的利益に必要なタンパク質の既知の限界値（閾値）
レベルと等しいかまたはそれより大きい日数として、持
続する期間を決定し得る。安定化緩衝剤として有効な緩
衝液は、特定のタンパク質と組合せた場合に、持続する
期間中、即ち安定化緩衝剤の非存在下で哺乳類に同一タ
ンパク質を投与することにより可能であるよりなぎ期
間、タンパク質の治療的レベルの保持を提供するもので
ある。
治療的利益に必要なタンパク質の既知の限界値（閾値）
レベルと等しいかまたはそれより大きい日数として、持
続する期間を決定し得る。安定化緩衝剤として有効な緩
衝液は、特定のタンパク質と組合せた場合に、持続する
期間中、即ち安定化緩衝剤の非存在下で哺乳類に同一タ
ンパク質を投与することにより可能であるよりなぎ期
間、タンパク質の治療的レベルの保持を提供するもので
ある。
【００６３】タンパク質の安定度は、時間の関数として
タンパク質の活性を測定することにより決定され得る。
タンパク質のアンフォールディング（unfolding)温度
（Ｔｍ）は、タンパク質に関する溶液安定度およびin v
ivo 安定度のマーカーとして用い得る。特定のタンパク
質のアンフォールディング温度は、タンパク質がその二
次構造を、典型的にはその活性を失い、そして当業者に
既知の方法、例えば示差走査熱量計を用いて決定され得
る温度を指す。
タンパク質の活性を測定することにより決定され得る。
タンパク質のアンフォールディング（unfolding)温度
（Ｔｍ）は、タンパク質に関する溶液安定度およびin v
ivo 安定度のマーカーとして用い得る。特定のタンパク
質のアンフォールディング温度は、タンパク質がその二
次構造を、典型的にはその活性を失い、そして当業者に
既知の方法、例えば示差走査熱量計を用いて決定され得
る温度を指す。
【００６４】本発明の安定化されたタンパク質組成物中
に存在するタンパク質の量は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約
５ｍｇ／ｍｌの範囲である。Ｇ−ＣＳＦに関しては、好
ましい範囲は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌで
ある。本発明の安定化されたタンパク質組成物の一例
は、ｂＧ−ＣＳＦおよびＨＥＰＥＳ緩衝液を含有する組
成物であるが、この場合、ｂＧ−ＣＳＦは約０．１〜約
５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在し、そしてＨＥＰＥＳ
緩衝液は約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する。
さらに好ましくは、ｂＧ−ＣＳＦ濃度は、約０．１ｍｇ
／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
に存在するタンパク質の量は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約
５ｍｇ／ｍｌの範囲である。Ｇ−ＣＳＦに関しては、好
ましい範囲は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌで
ある。本発明の安定化されたタンパク質組成物の一例
は、ｂＧ−ＣＳＦおよびＨＥＰＥＳ緩衝液を含有する組
成物であるが、この場合、ｂＧ−ＣＳＦは約０．１〜約
５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在し、そしてＨＥＰＥＳ
緩衝液は約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する。
さらに好ましくは、ｂＧ−ＣＳＦ濃度は、約０．１ｍｇ
／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
【００６５】本発明の安定化されたタンパク質組成物の
別の例は、ｂＧ−ＣＳＦおよびＴＥＳ緩衝液を含有する
組成物であるが、この場合、ｂＧ−ＣＳＦは約０．１〜
約５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在し、そしてＴＥＳ緩
衝液は約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する。さ
らに好ましくは、ｂＧ−ＣＳＦ濃度は、約０．１ｍｇ／
ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌの範囲内である。本発明の安定化
されたタンパク質組成物のさらに別の例は、ｂＧ−ＣＳ
ＦおよびＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液を含有する組成物である
が、この場合、ｂＧ−ＣＳＦは約０．１〜約５ｍｇ／ｍ
ｌの範囲の濃度で存在し、そしてＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液
は約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する。さらに
好ましくは、ｂＧ−ＣＳＦ濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ
〜約３ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
別の例は、ｂＧ−ＣＳＦおよびＴＥＳ緩衝液を含有する
組成物であるが、この場合、ｂＧ−ＣＳＦは約０．１〜
約５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在し、そしてＴＥＳ緩
衝液は約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する。さ
らに好ましくは、ｂＧ−ＣＳＦ濃度は、約０．１ｍｇ／
ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌの範囲内である。本発明の安定化
されたタンパク質組成物のさらに別の例は、ｂＧ−ＣＳ
ＦおよびＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液を含有する組成物である
が、この場合、ｂＧ−ＣＳＦは約０．１〜約５ｍｇ／ｍ
ｌの範囲の濃度で存在し、そしてＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液
は約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する。さらに
好ましくは、ｂＧ−ＣＳＦ濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ
〜約３ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
【００６６】本発明の安定化されたタンパク質組成物
は、当業者に既知の従来の手段を用いて、凍結形態また
は凍結乾燥形態で調製し得る。凍結乾燥形態のタンパク
質は、安定感漿液を用いて再構成し得る。あるいは、溶
液は、すぐに用いるために、液体形態で保存し得る。好
ましくは、本発明の安定化されたタンパク質組成物は、
長期保存中にその活性を保持する液体形態である。本発
明の安定化されたタンパク質組成物は、経口的に、非経
口的（皮下、血管内、腹腔内および筋肉内）に、例えば
吸入により鼻腔に、口腔内にまたは皮内に、あるいは当
業者に既知の形態を用いた還流法により、投与し得る。
非経口投与が好ましい。
は、当業者に既知の従来の手段を用いて、凍結形態また
は凍結乾燥形態で調製し得る。凍結乾燥形態のタンパク
質は、安定感漿液を用いて再構成し得る。あるいは、溶
液は、すぐに用いるために、液体形態で保存し得る。好
ましくは、本発明の安定化されたタンパク質組成物は、
長期保存中にその活性を保持する液体形態である。本発
明の安定化されたタンパク質組成物は、経口的に、非経
口的（皮下、血管内、腹腔内および筋肉内）に、例えば
吸入により鼻腔に、口腔内にまたは皮内に、あるいは当
業者に既知の形態を用いた還流法により、投与し得る。
非経口投与が好ましい。
【００６７】投与経路にかかわらず、本発明の安定化さ
れたタンパク質組成物は、当業者に既知の、または明ら
かな従来の方法により、医薬として許容される投薬形態
に処方し得る。本発明の安定化されたタンパク質組成物
の医薬として許容される投薬形態は、好ましくは皮下投
与に適している。皮下投与のための医薬として許容され
る投薬形態は、典型的には約２０ｍｌ以下の用量を有し
（例えばウマおよびウシに投与するために）、滅菌性
（哺乳類に適している）であり、さらに、哺乳類に十分
耐容される、即ち注射部位に感知可能な腫脹、疼痛また
は壊死を誘発しない。
れたタンパク質組成物は、当業者に既知の、または明ら
かな従来の方法により、医薬として許容される投薬形態
に処方し得る。本発明の安定化されたタンパク質組成物
の医薬として許容される投薬形態は、好ましくは皮下投
与に適している。皮下投与のための医薬として許容され
る投薬形態は、典型的には約２０ｍｌ以下の用量を有し
（例えばウマおよびウシに投与するために）、滅菌性
（哺乳類に適している）であり、さらに、哺乳類に十分
耐容される、即ち注射部位に感知可能な腫脹、疼痛また
は壊死を誘発しない。
【００６８】一般に、本発明の医薬として許容される投
薬形態は、その他の医薬として許容される成分、例えば
界面活性剤または洗剤、粘度改質剤、糖またはタンパク
質を含有し、付加成分は、有効、安全な製剤投与に適し
た量で存在する。例えば、本発明の安定化されたタンパ
ク質組成物の医薬として許容される投薬形態は担体、安
定剤、希釈剤および／または防腐剤を用いて、一般に認
められている慣習にしたがって、処方し得る。希釈剤と
しては、水、食塩水、デキストロース、マンニトール、
ソルビトールおよびラクトースが特に挙げられる。安定
剤としては、アルブミンが挙げられる。適切なその他の
ビヒクルおよび添加剤は、当業者には既知であるか、あ
るいは明らかになる。
薬形態は、その他の医薬として許容される成分、例えば
界面活性剤または洗剤、粘度改質剤、糖またはタンパク
質を含有し、付加成分は、有効、安全な製剤投与に適し
た量で存在する。例えば、本発明の安定化されたタンパ
ク質組成物の医薬として許容される投薬形態は担体、安
定剤、希釈剤および／または防腐剤を用いて、一般に認
められている慣習にしたがって、処方し得る。希釈剤と
しては、水、食塩水、デキストロース、マンニトール、
ソルビトールおよびラクトースが特に挙げられる。安定
剤としては、アルブミンが挙げられる。適切なその他の
ビヒクルおよび添加剤は、当業者には既知であるか、あ
るいは明らかになる。
【００６９】本発明の安定化されたタンパク質組成物
は、療法的有効量のタンパク質を有する一次容器、およ
び医薬として許容される安定化緩衝剤を有する二次容器
から成るキット中に提供され得る。タンパク質は固体、
例えば凍結または凍結乾燥形態、あるいは液体形態であ
る。次に、二次容器の医薬として許容される安定化緩衝
剤と併合した場合に、一次容器の療法的有効量のタンパ
ク質が持続する期間中、哺乳類においてこのようなタン
パク質の治療レベルを保持し得るように、安定化緩衝剤
をタンパク質と併合し、哺乳類に投与する。
は、療法的有効量のタンパク質を有する一次容器、およ
び医薬として許容される安定化緩衝剤を有する二次容器
から成るキット中に提供され得る。タンパク質は固体、
例えば凍結または凍結乾燥形態、あるいは液体形態であ
る。次に、二次容器の医薬として許容される安定化緩衝
剤と併合した場合に、一次容器の療法的有効量のタンパ
ク質が持続する期間中、哺乳類においてこのようなタン
パク質の治療レベルを保持し得るように、安定化緩衝剤
をタンパク質と併合し、哺乳類に投与する。
【００７０】本発明の特定の実施態様には、少なくとも
３日間、哺乳類に防護を提供するのに十分な量でタンパ
ク質が存在するキットが含まれる。本発明の医薬として
許容される投薬形態は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約５０μ
ｇ／ｋｇ、好ましくは約１μｇ／ｋｇ〜約２５μｇ／ｋ
ｇ、最も好ましくは約３μｇ／ｋｇ〜約２５μｇ／ｋｇ
の範囲である。最も好ましい投薬形態は、ｂＧ−ＣＳＦ
の使用に関しては約２４μｇ／ｋｇである。用量は、少
なくとも約３日間有効である。以下に示した実施例は本
発明の特定の実施態様の説明であって、本発明はそれら
に限定されない。
３日間、哺乳類に防護を提供するのに十分な量でタンパ
ク質が存在するキットが含まれる。本発明の医薬として
許容される投薬形態は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約５０μ
ｇ／ｋｇ、好ましくは約１μｇ／ｋｇ〜約２５μｇ／ｋ
ｇ、最も好ましくは約３μｇ／ｋｇ〜約２５μｇ／ｋｇ
の範囲である。最も好ましい投薬形態は、ｂＧ−ＣＳＦ
の使用に関しては約２４μｇ／ｋｇである。用量は、少
なくとも約３日間有効である。以下に示した実施例は本
発明の特定の実施態様の説明であって、本発明はそれら
に限定されない。
【００７１】
【実施例】実施例１．ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩ
ＣＩＮＥ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの持続安定度 ０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍの緩衝液濃度を、３つの各緩
衝液、即ちＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−ト
リス（ヒドロキシメチル）メチル−２ アミノエタンス
ルホン酸）およびＴＲＩＣＩＮＥ（Ｎ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチルグリシン）に関して調製した。
ＣＩＮＥ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの持続安定度 ０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍの緩衝液濃度を、３つの各緩
衝液、即ちＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−ト
リス（ヒドロキシメチル）メチル−２ アミノエタンス
ルホン酸）およびＴＲＩＣＩＮＥ（Ｎ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチルグリシン）に関して調製した。
【００７２】緩衝液は、Fluka Biochemica USAから入
手した。各緩衝液のｐＨを、水酸化ナトリウム（J.T. B
aker, USA ）を用いて７．５に調整した。０．２μＧＶ
フィルター（Millipore USA ）を用いて、緩衝液を滅菌
濾過した。調製した緩衝液濃度を以下に示す：ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液：０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ；ＴＥＳ緩衝液：
０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ；ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液：
０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ。
手した。各緩衝液のｐＨを、水酸化ナトリウム（J.T. B
aker, USA ）を用いて７．５に調整した。０．２μＧＶ
フィルター（Millipore USA ）を用いて、緩衝液を滅菌
濾過した。調製した緩衝液濃度を以下に示す：ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液：０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ；ＴＥＳ緩衝液：
０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ；ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液：
０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ。
【００７３】前記の緩衝液濃度で、各緩衝液、ＴＥＳ、
ＴＲＩＣＩＮＥおよびＨＥＰＥＳ中で、４．６９ｍｇの
大量ｂＧ−ＣＳＦ（５３．３％の効力を基礎にして）を
２５ｍｌ容量フラスコに付加し、次にこれを適切な緩衝
液濃度を有する容量にして、０．１ｍｇ／ｍｌのｂＧ−
ＣＳＦを含有する溶液を調製した。表１に示した各緩衝
液濃度で、各緩衝液、ＴＥＳ、ＴＲＩＣＩＮＥおよびＨ
ＥＰＥＳ中で、９３．８ｍｇの大量ｂＧ−ＣＳＦ（５
３．３％の効力を基礎にして）を２５ｍｌ容量フラスコ
に付加し、次にこれを適切な緩衝液濃度を有する容量に
して、０．１ｍｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦを含有する溶液
を調製した。
ＴＲＩＣＩＮＥおよびＨＥＰＥＳ中で、４．６９ｍｇの
大量ｂＧ−ＣＳＦ（５３．３％の効力を基礎にして）を
２５ｍｌ容量フラスコに付加し、次にこれを適切な緩衝
液濃度を有する容量にして、０．１ｍｇ／ｍｌのｂＧ−
ＣＳＦを含有する溶液を調製した。表１に示した各緩衝
液濃度で、各緩衝液、ＴＥＳ、ＴＲＩＣＩＮＥおよびＨ
ＥＰＥＳ中で、９３．８ｍｇの大量ｂＧ−ＣＳＦ（５
３．３％の効力を基礎にして）を２５ｍｌ容量フラスコ
に付加し、次にこれを適切な緩衝液濃度を有する容量に
して、０．１ｍｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦを含有する溶液
を調製した。
【００７４】次にｂＧ−ＣＳＦを０．２２ミクロン低タ
ンパク質結合フィルター（Millipore G.V.）を通して濾
過した。１ｍｌの容量の各製剤を１ｍｌバイアルに入れ
た後、４０℃のオーブンに９日間入れた。調製されたｂ
Ｇ−ＣＳＦ緩衝液安定化溶液は、（１）ＨＥＰＥＳ緩衝
液 ０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ中；（２）ＴＥＳ緩衝液
０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ中；（３）ＴＲＩＣＩＮＥ
緩衝液 ０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ中に０．１ｍｇ／ｍ
ｌのｂＧ−ＣＳＦであった。試料は３日毎に各バイアル
から取り出して、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬ
Ｃ）により分析した。結果を図１〜６、ならびに表８お
よび９に示す。
ンパク質結合フィルター（Millipore G.V.）を通して濾
過した。１ｍｌの容量の各製剤を１ｍｌバイアルに入れ
た後、４０℃のオーブンに９日間入れた。調製されたｂ
Ｇ−ＣＳＦ緩衝液安定化溶液は、（１）ＨＥＰＥＳ緩衝
液 ０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ中；（２）ＴＥＳ緩衝液
０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ中；（３）ＴＲＩＣＩＮＥ
緩衝液 ０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ中に０．１ｍｇ／ｍ
ｌのｂＧ−ＣＳＦであった。試料は３日毎に各バイアル
から取り出して、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬ
Ｃ）により分析した。結果を図１〜６、ならびに表８お
よび９に示す。
【００７５】
【表８】
表８は、前記のように調製した０．１ｍｇ／ｍｌ ｂＧ
−ＣＳＦ溶液の回収率％（残存）を時間の関数として示
す。溶液は４０℃で保存した。
−ＣＳＦ溶液の回収率％（残存）を時間の関数として示
す。溶液は４０℃で保存した。
【００７６】
【表９】
表９は、前記のように調製した２．０ｍｇ／ｍｌ ｂＧ
−ＣＳＦ溶液の回収率％（残存）を時間の関数として示
す。溶液は４０℃で保存した。
−ＣＳＦ溶液の回収率％（残存）を時間の関数として示
す。溶液は４０℃で保存した。
【００７７】図１〜３は、それぞれ０．１Ｍ、１Ｍおよ
び２Ｍの種々の濃度のＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩ
ＣＩＮＥ緩衝液中の、４０℃の保存条件下で、ｐＨ７．
５での０．１ｍｇ／ｍｌ ｂＧ−ＣＳＦ溶液の安定度を
示す。図１〜３に示すように、緩衝液濃度が１Ｍおよび
それ以上に増大すると、ｂＧ−ＣＳＦ活性の安定度また
は保持は改善した。０．１ｍｇ／ｍｌ ｂＧ−ＣＳＦで
は、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中のｂＧ−ＣＳＦの回収率は９０
％であった（図１）。
び２Ｍの種々の濃度のＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩ
ＣＩＮＥ緩衝液中の、４０℃の保存条件下で、ｐＨ７．
５での０．１ｍｇ／ｍｌ ｂＧ−ＣＳＦ溶液の安定度を
示す。図１〜３に示すように、緩衝液濃度が１Ｍおよび
それ以上に増大すると、ｂＧ−ＣＳＦ活性の安定度また
は保持は改善した。０．１ｍｇ／ｍｌ ｂＧ−ＣＳＦで
は、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中のｂＧ−ＣＳＦの回収率は９０
％であった（図１）。
【００７８】図４〜６は、それぞれ０．１Ｍ、１Ｍおよ
び２Ｍの種々の濃度のＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩ
ＣＩＮＥ緩衝液中の、４０℃の保存条件下で、ｐＨ７．
５での２．０ｍｇ／ｍｌ ｂＧ−ＣＳＦ溶液の安定度を
示す。この場合も、図４〜６に示すように、緩衝液濃度
が１Ｍおよびそれ以上に増大すると、ｂＧ−ＣＳＦ活性
の安定度または保持は改善した。表８および９，ならび
に図１〜６に示したデータは、緩衝液ＨＥＰＥＳ、ＴＥ
ＳおよびＴＲＩＣＩＮＥの存在が、３〜９日間の持続す
る期間中のｂＧ−ＣＳＦの活性を有意に保持することを
示す。
び２Ｍの種々の濃度のＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩ
ＣＩＮＥ緩衝液中の、４０℃の保存条件下で、ｐＨ７．
５での２．０ｍｇ／ｍｌ ｂＧ−ＣＳＦ溶液の安定度を
示す。この場合も、図４〜６に示すように、緩衝液濃度
が１Ｍおよびそれ以上に増大すると、ｂＧ−ＣＳＦ活性
の安定度または保持は改善した。表８および９，ならび
に図１〜６に示したデータは、緩衝液ＨＥＰＥＳ、ＴＥ
ＳおよびＴＲＩＣＩＮＥの存在が、３〜９日間の持続す
る期間中のｂＧ−ＣＳＦの活性を有意に保持することを
示す。
【００７９】実施例２．水、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ
ＴＥＳおよび１Ｍ ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中に処方した
ｂＧ−ＣＳＦのin vivo 性能 水、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＴＥＳおよび１Ｍ ＴＲ
ＩＣＩＮＥ緩衝液中に配合したｂＧ−ＣＳＦのin vivo
検定を、仔ウシで実施した。２４μｇ／ｋｇ用量を仔ウ
シに投与し、ＰＭＮ（好中球）数をモニタリングした。
図７は、水、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＴＥＳおよび１
Ｍ ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中に処方したｂＧ−ＣＳＦで
処置したウシに関する総末梢血ＰＭＮ数（０時間値の制
御％として表される）を示す。３つの緩衝液はすべて、
１回注射から約１００時間の適用範囲を示した。これ
は、３つの緩衝液すべてが、注射部位でのin vivo での
タンパク質活性の持続する期間を提供することを実証す
る。
ＴＥＳおよび１Ｍ ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中に処方した
ｂＧ−ＣＳＦのin vivo 性能 水、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＴＥＳおよび１Ｍ ＴＲ
ＩＣＩＮＥ緩衝液中に配合したｂＧ−ＣＳＦのin vivo
検定を、仔ウシで実施した。２４μｇ／ｋｇ用量を仔ウ
シに投与し、ＰＭＮ（好中球）数をモニタリングした。
図７は、水、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＴＥＳおよび１
Ｍ ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中に処方したｂＧ−ＣＳＦで
処置したウシに関する総末梢血ＰＭＮ数（０時間値の制
御％として表される）を示す。３つの緩衝液はすべて、
１回注射から約１００時間の適用範囲を示した。これ
は、３つの緩衝液すべてが、注射部位でのin vivo での
タンパク質活性の持続する期間を提供することを実証す
る。
【００８０】実施例３．ｂＧ−ＣＳＦのin vitro安定度
に及ぼすＨＥＰＥＳ緩衝液の作用 約７．０〜約８．５のｐＨ範囲で、０．１ｍｇ／ｍｌの
濃度で、下記のように種々の緩衝液系で、ｂＧ−ＣＳＦ
を配合した。全試料を、充填前に０．２ミクロンフィル
ター（Millipore G.V.）で濾過した。試料を４０℃で安
定度に関して設置し、下記のように、逆相ＨＰＬＣ（Ｒ
Ｐ ＨＰＬＣ）、ＳＥＣ ＨＰＬＣおよびバイオアッセ
イにより７〜１０日間、モニタリングした。ｂＧ−ＣＳ
Ｆのアンフォールディング温度は、ＶＰ−ＤＳＣ顕微熱
量計システム（USA ）により測定した。
に及ぼすＨＥＰＥＳ緩衝液の作用 約７．０〜約８．５のｐＨ範囲で、０．１ｍｇ／ｍｌの
濃度で、下記のように種々の緩衝液系で、ｂＧ−ＣＳＦ
を配合した。全試料を、充填前に０．２ミクロンフィル
ター（Millipore G.V.）で濾過した。試料を４０℃で安
定度に関して設置し、下記のように、逆相ＨＰＬＣ（Ｒ
Ｐ ＨＰＬＣ）、ＳＥＣ ＨＰＬＣおよびバイオアッセ
イにより７〜１０日間、モニタリングした。ｂＧ−ＣＳ
Ｆのアンフォールディング温度は、ＶＰ−ＤＳＣ顕微熱
量計システム（USA ）により測定した。
【００８１】図８は、 Neupogen （登録商標)(市販のヒ
トＧ−ＣＳＦ（米国））（対照として使用）、ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．４）、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）、Hank
s 緩衝液（市販、米国）および重炭酸緩衝液を含めた種
々の緩衝液系中でのｂＧ−ＣＳＦの安定度の比較を提示
する。結果は、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中に配合されたｂＧ−
ＣＳＦが試験した全製剤の内で最も安定であり、 Neupo
gen （登録商標）緩衝液（ｐＨ４．０）に対しても同様
の安定度を示した。ｂＧ−ＣＳＦは従来、中性または生
理学的ｐＨ条件で、約４０℃またはそれ以上の温度で不
安定であることが分かっていたので、図８に示したよう
なＨＥＰＥＳ緩衝液中でのｂＧ−ＣＳＦの安定度は、意
外で且つ予期せぬことであった。ＰＢＳ（ｐＨ７．
０）、Hanks緩衝液および重炭酸緩衝液中で処方したｂ
Ｇ−ＣＳＦは、安定でなかった。これは、表１０に記載
したように確証された。
トＧ−ＣＳＦ（米国））（対照として使用）、ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．４）、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）、Hank
s 緩衝液（市販、米国）および重炭酸緩衝液を含めた種
々の緩衝液系中でのｂＧ−ＣＳＦの安定度の比較を提示
する。結果は、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中に配合されたｂＧ−
ＣＳＦが試験した全製剤の内で最も安定であり、 Neupo
gen （登録商標）緩衝液（ｐＨ４．０）に対しても同様
の安定度を示した。ｂＧ−ＣＳＦは従来、中性または生
理学的ｐＨ条件で、約４０℃またはそれ以上の温度で不
安定であることが分かっていたので、図８に示したよう
なＨＥＰＥＳ緩衝液中でのｂＧ−ＣＳＦの安定度は、意
外で且つ予期せぬことであった。ＰＢＳ（ｐＨ７．
０）、Hanks緩衝液および重炭酸緩衝液中で処方したｂ
Ｇ−ＣＳＦは、安定でなかった。これは、表１０に記載
したように確証された。
【００８２】
【表１０】
【００８３】４０℃で７日間の保存中、 Neupogen （登
録商標）およびＨＥＰＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦはい
かなる活性も失わなかった。図示したように、それぞれ
初期値と比較して、ＰＢＣ中のｂＧ−ＣＳＦは活性が１
０分の１になり、Hanks および重炭酸緩衝液中のｂＧ−
ＣＳＦは１００〜１０００分の１であった。図９は、４
０℃での１０００ｍＭ、５００ｍＭ、１００ｍＭ、５０
ｍＭおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳ
Ｆの安定度に及ぼすＨＥＰＥＳ緩衝液濃度の作用を示
す。図９に示すように、ＨＥＰＥＳの濃度を低減する
と、ｂＧ−ＣＳＦの安定度の有意な損失が認められた。
録商標）およびＨＥＰＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦはい
かなる活性も失わなかった。図示したように、それぞれ
初期値と比較して、ＰＢＣ中のｂＧ−ＣＳＦは活性が１
０分の１になり、Hanks および重炭酸緩衝液中のｂＧ−
ＣＳＦは１００〜１０００分の１であった。図９は、４
０℃での１０００ｍＭ、５００ｍＭ、１００ｍＭ、５０
ｍＭおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳ
Ｆの安定度に及ぼすＨＥＰＥＳ緩衝液濃度の作用を示
す。図９に示すように、ＨＥＰＥＳの濃度を低減する
と、ｂＧ−ＣＳＦの安定度の有意な損失が認められた。
【００８４】図１０は、２つの異なるｂＧ−ＣＳＦ溶液
のサーモグラムである。最大温度４７℃を示す上方のサ
ーモグラムは、ｐＨ７．５でＰＢＳ中に配合したｂＧ−
ＣＳＦに関するものであり、最大温度５９℃を示す下方
のサーモグラムは、ｐＨ７．５で１Ｍ ＨＥＰＥＳ中で
配合したｂＧ−ＣＳＦに関する。ＨＥＰＥＳ緩衝液の非
存在下では、ｐＨ７．５でのｂＧ−ＣＳＦのアンフォー
ルディング温度は約４０℃（開始温度）であったが、一
方１Ｍ ＨＥＰＥＳ中のｂＧ−ＣＳＦはアンフォールデ
ィング温度の１０°Ｃの上昇を生じる。アンフォールデ
ィング温度の増大は、安定化を示す。
のサーモグラムである。最大温度４７℃を示す上方のサ
ーモグラムは、ｐＨ７．５でＰＢＳ中に配合したｂＧ−
ＣＳＦに関するものであり、最大温度５９℃を示す下方
のサーモグラムは、ｐＨ７．５で１Ｍ ＨＥＰＥＳ中で
配合したｂＧ−ＣＳＦに関する。ＨＥＰＥＳ緩衝液の非
存在下では、ｐＨ７．５でのｂＧ−ＣＳＦのアンフォー
ルディング温度は約４０℃（開始温度）であったが、一
方１Ｍ ＨＥＰＥＳ中のｂＧ−ＣＳＦはアンフォールデ
ィング温度の１０°Ｃの上昇を生じる。アンフォールデ
ィング温度の増大は、安定化を示す。
【００８５】実施例４．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中に配
合したｂＧ−ＣＳＦのin vivo 性能 １Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中に配合したｂＧ−ＣＳＦのin
vivo 検定を、仔ウシで実施した。１２μｇ／ｋｇ用量
を仔ウシに投与し、白血球（ＷＢＣ）およびＰＭＮ（好
中球）数をモニタリングした。結果を図１１に示す。％
ＰＭＮ（好中球）対時間のプロットである図１１は、３
つの製剤：水中ｂＧ−ＣＳＦ（対照）、１Ｍ ＨＥＰＥ
Ｓ中ｂＧ−ＣＳＦ、および１Ｍ ＨＥＰＥＳ＋１０％ポ
ラキサマー中ｂＧ−ＣＳＦの比較である。図１１に示す
ように、ＰＭＮ数は３日間または７２時間、限界値（閾
値)(防護関連レベル）を超えている。製剤当たり６匹の
ウシを試験した。
合したｂＧ−ＣＳＦのin vivo 性能 １Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中に配合したｂＧ−ＣＳＦのin
vivo 検定を、仔ウシで実施した。１２μｇ／ｋｇ用量
を仔ウシに投与し、白血球（ＷＢＣ）およびＰＭＮ（好
中球）数をモニタリングした。結果を図１１に示す。％
ＰＭＮ（好中球）対時間のプロットである図１１は、３
つの製剤：水中ｂＧ−ＣＳＦ（対照）、１Ｍ ＨＥＰＥ
Ｓ中ｂＧ−ＣＳＦ、および１Ｍ ＨＥＰＥＳ＋１０％ポ
ラキサマー中ｂＧ−ＣＳＦの比較である。図１１に示す
ように、ＰＭＮ数は３日間または７２時間、限界値（閾
値)(防護関連レベル）を超えている。製剤当たり６匹の
ウシを試験した。
【００８６】１Ｍ ＨＥＰＥＳ＋１０％ポラキサマー
（polaxamer)中ｂＧ−ＣＳＦを用いて、２４μｇ／ｋｇ
用量を仔ウシに投与した二次試験では、１回注射が約２
００時間の防護を、あるいは約８日間のカバレージ（co
verage) を提供した。この結果は、ＨＥＰＥＳ緩衝液が
ｂＧ−ＣＳＦのin vivo 安定度を改善し、次に活性の持
続する期間を、したがってこのタンパク質の供給を提供
することを実証する。
（polaxamer)中ｂＧ−ＣＳＦを用いて、２４μｇ／ｋｇ
用量を仔ウシに投与した二次試験では、１回注射が約２
００時間の防護を、あるいは約８日間のカバレージ（co
verage) を提供した。この結果は、ＨＥＰＥＳ緩衝液が
ｂＧ−ＣＳＦのin vivo 安定度を改善し、次に活性の持
続する期間を、したがってこのタンパク質の供給を提供
することを実証する。
【００８７】実施例５．１Ｍ ＨＥＰＥＳ中のｂＧ−Ｃ
ＳＦの溶解度 １Ｍ ＨＥＰＥＳ中のｐＨ７．５でのｂＧ−ＣＳＦの溶
解度を決定した。ｂＧ−ＣＳＦ 約８０ｍｇを３０ｍｌ
の１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させ
た。タンパク質溶液を０．２ミクロンGV Millipore フ
ィルターを通して濾過し、次に５０ｍｌの限外濾過セル
に移した。セルは、１０，０００分子量（ＭＷ）カット
オフを示す低タンパク質結合膜を備えていた。限外濾過
セルを用いて、タンパク質溶液を濃縮した。種々の時点
で、試料をセルから取り出して、３１０ｎｍでのＵＶ−
Ｖｉｓ分析（光散乱を測定）により分析し、ＲＰ ＨＰ
ＬＣにより濃縮した。
ＳＦの溶解度 １Ｍ ＨＥＰＥＳ中のｐＨ７．５でのｂＧ−ＣＳＦの溶
解度を決定した。ｂＧ−ＣＳＦ 約８０ｍｇを３０ｍｌ
の１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させ
た。タンパク質溶液を０．２ミクロンGV Millipore フ
ィルターを通して濾過し、次に５０ｍｌの限外濾過セル
に移した。セルは、１０，０００分子量（ＭＷ）カット
オフを示す低タンパク質結合膜を備えていた。限外濾過
セルを用いて、タンパク質溶液を濃縮した。種々の時点
で、試料をセルから取り出して、３１０ｎｍでのＵＶ−
Ｖｉｓ分析（光散乱を測定）により分析し、ＲＰ ＨＰ
ＬＣにより濃縮した。
【００８８】３１０ｎｍでの吸光度を、濃度に対してプ
ロットした。３１０ｎｍでの吸光度は濃度に伴って直線
状に増大し、飽和時には、３１０ｎｍで曲線が突然折れ
て、吸光度は３１０ｎｍで劇的に増大する。これが起き
た濃度が最大溶解度である。この方法は当業者には既知
であり、典型的にはタンパク質溶解度の確定に用いられ
る。図１２に示すように、ｐＨ７．５での１Ｍ ＨＥＰ
ＥＳ中のｂＧ−ＣＳＦの最大溶解度は、約５ｍｇ／ｍｌ
である。タンパク質の最大溶解度は、曲線が折れ曲がっ
た時点の濃度で示される。約５ｍｇ／ｍｌの濃度では、
３１０ｎｍの吸光度の突然の増大が認められ、これはタ
ンパク質の最大溶解度に対応する。
ロットした。３１０ｎｍでの吸光度は濃度に伴って直線
状に増大し、飽和時には、３１０ｎｍで曲線が突然折れ
て、吸光度は３１０ｎｍで劇的に増大する。これが起き
た濃度が最大溶解度である。この方法は当業者には既知
であり、典型的にはタンパク質溶解度の確定に用いられ
る。図１２に示すように、ｐＨ７．５での１Ｍ ＨＥＰ
ＥＳ中のｂＧ−ＣＳＦの最大溶解度は、約５ｍｇ／ｍｌ
である。タンパク質の最大溶解度は、曲線が折れ曲がっ
た時点の濃度で示される。約５ｍｇ／ｍｌの濃度では、
３１０ｎｍの吸光度の突然の増大が認められ、これはタ
ンパク質の最大溶解度に対応する。
【００８９】実施例６．ｂＧ−ＣＳＦのアンフォールデ
ィング温度に及ぼすＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣ
ＩＮＥ緩衝液の作用 １Ｍ ＨＥＰＥＳ、２Ｍ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＴＥＳ、
２Ｍ ＴＥＳおよび１Ｍ ＴＲＩＣＩＮＥ中に０．５ｍ
ｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦを含有する溶液、ならびに１Ｍ
ＨＥＰＥＳ、２Ｍ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＴＥＳ、２Ｍ
ＴＥＳおよび１Ｍ ＴＲＩＣＩＮＥ中に２ｍｇ／ｍｌ
のｂＧ−ＣＳＦを含有する溶液を調製した。これらの溶
液は、実施例１に記載したのと同様の方法で調製した。
ＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水，ｐＨ
７．４）を用いて、対照溶液を調製した。ｂＧ−ＣＳＦ
溶液のｐＨはｐＨ７．５であった。ｂＧ−ＣＳＦのアン
フォールディング温度は、２０〜９０℃の範囲の温度
で、６０度／時間の走査速度を用いて、示差走査熱量計
（Microcal Inc., USA）により決定した。結果を表１１
に示す。
ィング温度に及ぼすＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣ
ＩＮＥ緩衝液の作用 １Ｍ ＨＥＰＥＳ、２Ｍ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＴＥＳ、
２Ｍ ＴＥＳおよび１Ｍ ＴＲＩＣＩＮＥ中に０．５ｍ
ｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦを含有する溶液、ならびに１Ｍ
ＨＥＰＥＳ、２Ｍ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＴＥＳ、２Ｍ
ＴＥＳおよび１Ｍ ＴＲＩＣＩＮＥ中に２ｍｇ／ｍｌ
のｂＧ−ＣＳＦを含有する溶液を調製した。これらの溶
液は、実施例１に記載したのと同様の方法で調製した。
ＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水，ｐＨ
７．４）を用いて、対照溶液を調製した。ｂＧ−ＣＳＦ
溶液のｐＨはｐＨ７．５であった。ｂＧ−ＣＳＦのアン
フォールディング温度は、２０〜９０℃の範囲の温度
で、６０度／時間の走査速度を用いて、示差走査熱量計
（Microcal Inc., USA）により決定した。結果を表１１
に示す。
【００９０】
【表１１】
【００９１】アンフォールディング温度は、タンパク質
に関する溶液安定度およびin vivo安定度のマーカーと
して用いた。表１１の結果は、１Ｍおよびそれより高い
濃度でＨＥＰＥＳ、ＴＥＳまたはＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液
中に配合したｂＧ−ＣＳＦのアンフォールディング温度
（Ｔｍ）がＰＢＳ対照と比較して有意に高かったことを
示す。３つの緩衝液は、約２〜１１℃だけＴｍを上げ
た。緩衝液濃度は、Ｔｍの上昇の程度に実質的に影響を
及ぼした。ｂＧ−ＣＳＦのＴｍは、緩衝液濃度が増大す
ると上昇した。ＨＥＰＥＳ濃度を１Ｍから２Ｍに上げる
と約３℃上昇し、ＴＥＳ濃度を１Ｍから２Ｍに上げると
約５℃上昇した。ｂＧ−ＣＳＦ濃度を増大すると、ｂＧ
−ＣＳＦのＴｍは低下した。
に関する溶液安定度およびin vivo安定度のマーカーと
して用いた。表１１の結果は、１Ｍおよびそれより高い
濃度でＨＥＰＥＳ、ＴＥＳまたはＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液
中に配合したｂＧ−ＣＳＦのアンフォールディング温度
（Ｔｍ）がＰＢＳ対照と比較して有意に高かったことを
示す。３つの緩衝液は、約２〜１１℃だけＴｍを上げ
た。緩衝液濃度は、Ｔｍの上昇の程度に実質的に影響を
及ぼした。ｂＧ−ＣＳＦのＴｍは、緩衝液濃度が増大す
ると上昇した。ＨＥＰＥＳ濃度を１Ｍから２Ｍに上げる
と約３℃上昇し、ＴＥＳ濃度を１Ｍから２Ｍに上げると
約５℃上昇した。ｂＧ−ＣＳＦ濃度を増大すると、ｂＧ
−ＣＳＦのＴｍは低下した。
【００９２】ＨＥＰＥＳおよびＴＥＳ緩衝液中ｂＧ−Ｃ
ＳＦ濃度を０．５ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌに増大す
ると、約２℃の低下が認められた。ＴＥＳ緩衝液は、２
Ｍの緩衝液濃度および０．５ｍｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦ
濃度で、ｂＧ−ＣＳＦのＴｍを１１℃以上上昇せしめ
た。表１１の結果は、３つの緩衝液（ＨＥＰＥＳ、ＴＥ
ＳおよびＴＲＩＣＩＮＥ）すべてが、ＰＢＳと比較し
て、ｂＧ−ＣＳＦのＴｍを有意に上昇せしめることを示
す。２Ｍ ＴＥＳ中に配合したｂＧ−ＣＳＦは、他の緩
衝液に比して、最高溶液安定度を示した。
ＳＦ濃度を０．５ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌに増大す
ると、約２℃の低下が認められた。ＴＥＳ緩衝液は、２
Ｍの緩衝液濃度および０．５ｍｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦ
濃度で、ｂＧ−ＣＳＦのＴｍを１１℃以上上昇せしめ
た。表１１の結果は、３つの緩衝液（ＨＥＰＥＳ、ＴＥ
ＳおよびＴＲＩＣＩＮＥ）すべてが、ＰＢＳと比較し
て、ｂＧ−ＣＳＦのＴｍを有意に上昇せしめることを示
す。２Ｍ ＴＥＳ中に配合したｂＧ−ＣＳＦは、他の緩
衝液に比して、最高溶液安定度を示した。
【００９３】実施例７．ＰＢＳおよびＨＥＰＥＳ中での
ヒトおよびウシＧ−ＣＳＦ製剤の安定度の比較 ０．１５ｍｇ／ｍｌのｈＧ−ＣＳＦおよびｂＧ−ＣＳＦ
の製剤を、リン酸緩衝液（ダルベッコのＰＢＳ，ｐＨ
７．４）および１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（１ＭＨＥＰＥ
Ｓ，ｐＨ７．５）中で調製した。製剤を１ｍｌバイアル
に入れ（充填容量 ４００μｌ）、４０℃で１０日間保
存した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰ
ＬＣ）および肉眼的検査により３日毎に試料を検定し
た。図１３は、１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中のヒトＧ−Ｃ
ＳＦの安定度が、ＰＢＳと比較して、有意に改善された
ことを示す。ヒトＧ−ＣＳＦは、ＰＢＳ中にｐＨ７．４
で配合した場合、４０℃で１０日間に及ぶ分解を示した
が、一方１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中に配合した場合には
６５％の回収率が観察された。
ヒトおよびウシＧ−ＣＳＦ製剤の安定度の比較 ０．１５ｍｇ／ｍｌのｈＧ−ＣＳＦおよびｂＧ−ＣＳＦ
の製剤を、リン酸緩衝液（ダルベッコのＰＢＳ，ｐＨ
７．４）および１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（１ＭＨＥＰＥ
Ｓ，ｐＨ７．５）中で調製した。製剤を１ｍｌバイアル
に入れ（充填容量 ４００μｌ）、４０℃で１０日間保
存した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰ
ＬＣ）および肉眼的検査により３日毎に試料を検定し
た。図１３は、１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中のヒトＧ−Ｃ
ＳＦの安定度が、ＰＢＳと比較して、有意に改善された
ことを示す。ヒトＧ−ＣＳＦは、ＰＢＳ中にｐＨ７．４
で配合した場合、４０℃で１０日間に及ぶ分解を示した
が、一方１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中に配合した場合には
６５％の回収率が観察された。
【００９４】図１３および１４は、ウシＧ−ＣＳＦが、
ＨＥＰＥＳおよびＰＢＳ製剤において、ヒトＧ−ＣＳＦ
よりやや良好な安定度を示すことを明示している。１Ｍ
ＨＥＰＥＳ製剤中のウシＧ−ＣＳＦの約８０％の回収
率が４０℃で１０日後に観察されたが、一方、ヒトＧ−
ＣＳＦの約６５％の回収率が観察された。両方のタンパ
ク質、即ちウシおよびヒトＧ−ＣＳＦは、１Ｍ ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液中ではＰＢＳ中よりも実質的により安定して
いる。
ＨＥＰＥＳおよびＰＢＳ製剤において、ヒトＧ−ＣＳＦ
よりやや良好な安定度を示すことを明示している。１Ｍ
ＨＥＰＥＳ製剤中のウシＧ−ＣＳＦの約８０％の回収
率が４０℃で１０日後に観察されたが、一方、ヒトＧ−
ＣＳＦの約６５％の回収率が観察された。両方のタンパ
ク質、即ちウシおよびヒトＧ−ＣＳＦは、１Ｍ ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液中ではＰＢＳ中よりも実質的により安定して
いる。
【００９５】実施例８．１Ｍ ＨＥＰＥＳ製剤中のヒト
およびウシＧ−ＣＳＦの安定度 ０．１ｍｇ／ｍｌのｈＧ−ＣＳＦおよびｂＧ−ＣＳＦの
製剤を、１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ ＨＥＰＥＳ，
ｐＨ７．５）中で調製した。製剤を１ｍｌバイアルに入
れ（充填容量 ４００μｌ）、４０℃で１０日間保存し
た。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬ
Ｃ）および肉眼的検査により３日毎に試料を検定した。
図１５は、１Ｍ ＨＥＰＥＳ製剤中のウシＧ−ＣＳＦお
よびヒトＧ−ＣＳＦの安定度を示す。ウシＧ−ＣＳＦの
約９０％の回収率、およびヒトＧ−ＣＳＦの約７０％の
回収率が、４０℃で１０日後に認められた。
およびウシＧ−ＣＳＦの安定度 ０．１ｍｇ／ｍｌのｈＧ−ＣＳＦおよびｂＧ−ＣＳＦの
製剤を、１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ ＨＥＰＥＳ，
ｐＨ７．５）中で調製した。製剤を１ｍｌバイアルに入
れ（充填容量 ４００μｌ）、４０℃で１０日間保存し
た。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬ
Ｃ）および肉眼的検査により３日毎に試料を検定した。
図１５は、１Ｍ ＨＥＰＥＳ製剤中のウシＧ−ＣＳＦお
よびヒトＧ−ＣＳＦの安定度を示す。ウシＧ−ＣＳＦの
約９０％の回収率、およびヒトＧ−ＣＳＦの約７０％の
回収率が、４０℃で１０日後に認められた。
【００９６】実施例９．ｂＧ−ＣＳＦ安定度に及ぼす製
剤ｐＨの作用 ０．１ｍｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦ溶液の製剤を、ｐＨ
４．０および７．５で、１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび１Ｍ
ＴＥＳ緩衝液中に配合した。製剤を１ｍＬバイアル（充
填容量４００μｌ）に入れ、４０℃にて１０日間貯蔵し
た。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬ
Ｃ）により３日毎に試料を検定した。図１６および１８
に示したように、４０℃で１０日後のｂＧ−ＣＳＦの回
収率は、ｐＨ４．０では約１００％であったが、これに
比して、図１７および１９に示したように、ｂＧ−ＣＳ
ＦをｐＨ７．５で配合した場合には、約８０〜８５％の
回収率が観察された。
剤ｐＨの作用 ０．１ｍｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦ溶液の製剤を、ｐＨ
４．０および７．５で、１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび１Ｍ
ＴＥＳ緩衝液中に配合した。製剤を１ｍＬバイアル（充
填容量４００μｌ）に入れ、４０℃にて１０日間貯蔵し
た。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬ
Ｃ）により３日毎に試料を検定した。図１６および１８
に示したように、４０℃で１０日後のｂＧ−ＣＳＦの回
収率は、ｐＨ４．０では約１００％であったが、これに
比して、図１７および１９に示したように、ｂＧ−ＣＳ
ＦをｐＨ７．５で配合した場合には、約８０〜８５％の
回収率が観察された。
【００９７】実施例１０．１．０Ｍ ＨＥＰＥＳおよび
ＴＥＳ製剤中のｂＧ−ＣＳＦの長期熱安定性試験の６ヶ
月サンプリング この試験に含まれた製剤を以下に示す。１．０Ｍ ＨＥ
ＰＥＳの市販製剤はGibco BRL （ロット番号１０１６４
３６）から入手し、一方１．０Ｍ ＴＥＳは、Fluka Sc
ientificから入手した粉末（ロット番号ＲＡ１２６０
２）から調製した。緩衝液ｐＨ値を７．５に調整した。
ｂＧ−ＣＳＦは、Bioprocess（ロット番号ＢＰ１８５−
１１）から５３．３％の純度で提供された。
ＴＥＳ製剤中のｂＧ−ＣＳＦの長期熱安定性試験の６ヶ
月サンプリング この試験に含まれた製剤を以下に示す。１．０Ｍ ＨＥ
ＰＥＳの市販製剤はGibco BRL （ロット番号１０１６４
３６）から入手し、一方１．０Ｍ ＴＥＳは、Fluka Sc
ientificから入手した粉末（ロット番号ＲＡ１２６０
２）から調製した。緩衝液ｐＨ値を７．５に調整した。
ｂＧ−ＣＳＦは、Bioprocess（ロット番号ＢＰ１８５−
１１）から５３．３％の純度で提供された。
【００９８】１．０Ｍ ＨＥＰＥＳおよび１．０Ｍ Ｔ
ＥＳ中の０．１ｍｇ／ｍｌおよび２．０ｍｇ／ｍｌのｂ
Ｇ−ＣＳＦの製剤を調製した。試料保存には、１．０ｍ
ｌの充填容量を用いて１３ｍｍ １８８８Gray T/Fスト
ッパー（ロット番号Ｒ０５６１９−７４８７）を有する
３．５ｍｌフリント１型バイアル（ロット番号Ｒ０４１
０５−７３２２）を用いた。試料保存およびプルポイン
トの要約を表１２に示す。各製剤の５つのバイアルを、
各検定時点のために保存した。
ＥＳ中の０．１ｍｇ／ｍｌおよび２．０ｍｇ／ｍｌのｂ
Ｇ−ＣＳＦの製剤を調製した。試料保存には、１．０ｍ
ｌの充填容量を用いて１３ｍｍ １８８８Gray T/Fスト
ッパー（ロット番号Ｒ０５６１９−７４８７）を有する
３．５ｍｌフリント１型バイアル（ロット番号Ｒ０４１
０５−７３２２）を用いた。試料保存およびプルポイン
トの要約を表１２に示す。各製剤の５つのバイアルを、
各検定時点のために保存した。
【００９９】
【表１２】
２．０ｍｇ／ｍｌ ｂＧ−ＣＳＦ製剤を、ＨＰＬＣ分析
前に、１０倍に希釈した。
前に、１０倍に希釈した。
【０１００】各製剤の３つの試料を各保存小室（５、３
０、４０℃）から採取し、ｂＧ−ＣＳＦ効力に関して、
ＲＰおよびＳＥ ＨＰＬＣにより検定した。各試料を３
回検定した。濃度は、予め決定された標準曲線を用いて
算出した。開始時ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％を各分析
のために決定し、各製剤に関して、各時点で、平均を算
出した。平均％開始時ｂＧ−ＣＳＦ濃度対時間を、各保
存温度に関してプロットし、ｂＧ−ＣＳＦ効力の低減を
グラフに描いた。図２０および２１は、５℃で保存した
試料に関して、それぞれ、ＲＰおよびＳＥ ＨＰＬＣに
より得られた結果である。３０℃で保存した試料に関し
て得られた結果を図２２および２３に示し、一方４０℃
で保存した試料に関して得られた結果は図２４および２
５に示されている。１．０Ｍ ＴＥＳ中の０．１ｍｇ／
ｍｌタンパク質製剤を除いて、５℃および３０℃で保存
した試料に、ｂＧ−ＣＳＦ分解はほとんど認められなか
った。
０、４０℃）から採取し、ｂＧ−ＣＳＦ効力に関して、
ＲＰおよびＳＥ ＨＰＬＣにより検定した。各試料を３
回検定した。濃度は、予め決定された標準曲線を用いて
算出した。開始時ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％を各分析
のために決定し、各製剤に関して、各時点で、平均を算
出した。平均％開始時ｂＧ−ＣＳＦ濃度対時間を、各保
存温度に関してプロットし、ｂＧ−ＣＳＦ効力の低減を
グラフに描いた。図２０および２１は、５℃で保存した
試料に関して、それぞれ、ＲＰおよびＳＥ ＨＰＬＣに
より得られた結果である。３０℃で保存した試料に関し
て得られた結果を図２２および２３に示し、一方４０℃
で保存した試料に関して得られた結果は図２４および２
５に示されている。１．０Ｍ ＴＥＳ中の０．１ｍｇ／
ｍｌタンパク質製剤を除いて、５℃および３０℃で保存
した試料に、ｂＧ−ＣＳＦ分解はほとんど認められなか
った。
【０１０１】実施例１１．生物療法タンパク質に及ぼす
ＨＥＰＥＳ緩衝液の安定化能力 以下で考察する注目のタンパク質のＴｍ値を、MicroCa
l, ＶＰ−ＤＳＣ型顕微熱量測定を用いて、リン酸緩衝
液およびＨＥＰＥＳ緩衝液の両方で確定した。Aldrich
からのＮａ2 ＨＰＯ4 （ロット番号０８０１９ＰＱ）を
用いて２５ｍＭリン酸緩衝溶液を調製し、ｐＨを７．５
に調整した。１．０Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．
５、ロット番号１０１６４３６）は、Gibco BRL から入
手した。緩衝液交換は、攪拌限外濾過セル ８０１０型
（Amicon, Inc.）を、タンパク質のサイズによって、YM
10またはYM30 Diaflo（登録商標）限外濾過膜（Amico
n,Inc.）と組合せて、成し遂げた。
ＨＥＰＥＳ緩衝液の安定化能力 以下で考察する注目のタンパク質のＴｍ値を、MicroCa
l, ＶＰ−ＤＳＣ型顕微熱量測定を用いて、リン酸緩衝
液およびＨＥＰＥＳ緩衝液の両方で確定した。Aldrich
からのＮａ2 ＨＰＯ4 （ロット番号０８０１９ＰＱ）を
用いて２５ｍＭリン酸緩衝溶液を調製し、ｐＨを７．５
に調整した。１．０Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．
５、ロット番号１０１６４３６）は、Gibco BRL から入
手した。緩衝液交換は、攪拌限外濾過セル ８０１０型
（Amicon, Inc.）を、タンパク質のサイズによって、YM
10またはYM30 Diaflo（登録商標）限外濾過膜（Amico
n,Inc.）と組合せて、成し遂げた。
【０１０２】Bioprocessから入手した凍結乾燥ｐＳＴ
（ロット番号４１５０９−２１７−２） ２．０ｍｇ
を、２．０ｍｌのMilli-Q 水中で再構成した。５回交換
後、再構成タンパク質 １．０ｍｌを、ＹＭ１０膜を用
いて２５ｍＭ リン酸緩衝液中に移した。残りの１．０
ｍｌを次に１．０Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中で交換した。
試料を１．０ｍｇ／ｍｌ タンパク質濃度に調製した
後、顕微熱量測定により分析した。ｐＳＴの顕微熱量計
分析は、リン酸およびＨＥＰＥＳ緩衝液中の両方で２回
実施した。
（ロット番号４１５０９−２１７−２） ２．０ｍｇ
を、２．０ｍｌのMilli-Q 水中で再構成した。５回交換
後、再構成タンパク質 １．０ｍｌを、ＹＭ１０膜を用
いて２５ｍＭ リン酸緩衝液中に移した。残りの１．０
ｍｌを次に１．０Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中で交換した。
試料を１．０ｍｇ／ｍｌ タンパク質濃度に調製した
後、顕微熱量測定により分析した。ｐＳＴの顕微熱量計
分析は、リン酸およびＨＥＰＥＳ緩衝液中の両方で２回
実施した。
【０１０３】約２．０ｍｌのＮＩＦ（ロット番号４４０
６３１−２２−７）を、２．９７の濃度でBioprocessか
ら入手した。 Bioprocess から受理した試料を２つのア
リコートに分けた。１．０ｍｌのタンパク質を２５ｍＭ
リン酸緩衝液中で交換し、残りのＮＩＦを１．０Ｍ
ＨＥＰＥＳ緩衝液中で交換した。各々の場合に、ＹＭ３
０膜を用いて５回の交換を実施した。適切な緩衝液中で
溶液を１．０ｍｇ／ｍｌ濃度に調製し、Ｔｍ値を微小熱
量測定（microcalorimetory)で決定した。試験した生物
療法タンパク質を表１３に列挙するが、それらのそれぞ
れのＴｍ値は、リン酸およびＨＥＰＥＳ緩衝液に関して
確定した値である。
６３１−２２−７）を、２．９７の濃度でBioprocessか
ら入手した。 Bioprocess から受理した試料を２つのア
リコートに分けた。１．０ｍｌのタンパク質を２５ｍＭ
リン酸緩衝液中で交換し、残りのＮＩＦを１．０Ｍ
ＨＥＰＥＳ緩衝液中で交換した。各々の場合に、ＹＭ３
０膜を用いて５回の交換を実施した。適切な緩衝液中で
溶液を１．０ｍｇ／ｍｌ濃度に調製し、Ｔｍ値を微小熱
量測定（microcalorimetory)で決定した。試験した生物
療法タンパク質を表１３に列挙するが、それらのそれぞ
れのＴｍ値は、リン酸およびＨＥＰＥＳ緩衝液に関して
確定した値である。
【０１０４】
【表１３】
表８は、ＨＥＰＥＳ緩衝液がＮＩＦおよびｐＳＴの両方
の安定度の増大を提供することを示す。
の安定度の増大を提供することを示す。
【０１０５】実施例１２．ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いた組
換えウシ顆粒球コロニー刺激因子（ｒｂＧ−ＣＳＦ）の
持続性in vivo 活性 ウシ顆粒球コロニー刺激因子（ｂＧ−ＣＳＦ）はBiopro
cess Research andDevelopment-Pfizer（Groton, CT）
から、マンニトールはE.M. Industries （Hawthorne,,
NY）から、１ｘダルベッコのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）は
GibcoBRL（Grand Island, NY）から、クエン酸ナトリウ
ムおよび酢酸ナトリウムはAldrich （Milwaukee, WI ）
から、Tween-80、塩化ナトリウムおよび塩酸はJ.T. Ba
ker （Phillipsburg, USA ）から入手した。
換えウシ顆粒球コロニー刺激因子（ｒｂＧ−ＣＳＦ）の
持続性in vivo 活性 ウシ顆粒球コロニー刺激因子（ｂＧ−ＣＳＦ）はBiopro
cess Research andDevelopment-Pfizer（Groton, CT）
から、マンニトールはE.M. Industries （Hawthorne,,
NY）から、１ｘダルベッコのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）は
GibcoBRL（Grand Island, NY）から、クエン酸ナトリウ
ムおよび酢酸ナトリウムはAldrich （Milwaukee, WI ）
から、Tween-80、塩化ナトリウムおよび塩酸はJ.T. Ba
ker （Phillipsburg, USA ）から入手した。
【０１０６】ＲＰ−ＨＰＬＣ サイズ排除クロマトグラ
フィー（ＳＥＣ） ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣにより、溶液安定度をモニ
タリングした。ＲＰ−ＨＰＬＣは、０．１％ＴＦＡ Ｈ
２０（溶媒Ａ）および０．１％ＴＦＡ ＣＡＮ（溶媒
Ｂ）の移動相を用いて、Vydac, Protein C4 カラムを用
いて実施した。流量：１ｍｌ／分；ＵＶ検出：２２０ｎ
ｍ；温度：２５℃。サイズ排除クロマトグラフィーを、
TosoHaas, TSK-GEL SW XL，７．８ｍｍ ＩＤｘ３０ｃ
ｍカラムを用いて実施した。移動相：０．０５Ｍクエン
酸緩衝液（ｐＨ５．７５）中の０．３Ｍ ＮａＣｌ；流
量：１ｍｌ／分；ＵＶ検出：２８０ｎｍ；温度：２５
℃。
フィー（ＳＥＣ） ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣにより、溶液安定度をモニ
タリングした。ＲＰ−ＨＰＬＣは、０．１％ＴＦＡ Ｈ
２０（溶媒Ａ）および０．１％ＴＦＡ ＣＡＮ（溶媒
Ｂ）の移動相を用いて、Vydac, Protein C4 カラムを用
いて実施した。流量：１ｍｌ／分；ＵＶ検出：２２０ｎ
ｍ；温度：２５℃。サイズ排除クロマトグラフィーを、
TosoHaas, TSK-GEL SW XL，７．８ｍｍ ＩＤｘ３０ｃ
ｍカラムを用いて実施した。移動相：０．０５Ｍクエン
酸緩衝液（ｐＨ５．７５）中の０．３Ｍ ＮａＣｌ；流
量：１ｍｌ／分；ＵＶ検出：２８０ｎｍ；温度：２５
℃。
【０１０７】微小熱量測定
VP DES システム（MicroCal, Inc.）を用いて、変性温
度（ＴＤ）を測定した。約１ｍｌの溶液をセルに載せ、
参照プラセボ製剤に対して約１０°Ｃ／分の速度で動か
した。円二色性 温度走査測定アクセサリーを装備した円二色性分光計
（CD* ORD Model J-710/720-Japan Spectroscopic C
o., LTD ）を用いて、ｂＧ−ＣＳＦの二次構造をモニタ
リングした。
度（ＴＤ）を測定した。約１ｍｌの溶液をセルに載せ、
参照プラセボ製剤に対して約１０°Ｃ／分の速度で動か
した。円二色性 温度走査測定アクセサリーを装備した円二色性分光計
（CD* ORD Model J-710/720-Japan Spectroscopic C
o., LTD ）を用いて、ｂＧ−ＣＳＦの二次構造をモニタ
リングした。
【０１０８】バイオアッセイ
ｂＧ−ＣＳＦ製剤のin vitro活性を、ネズミ骨髄細胞増
殖検定（ＢＭＣ検定）を用いて決定した。骨髄細胞を、
大腿骨を取り出して、３ｃｃ／２３Ｇ注射器およびHank
s 平衡化食塩溶液（Gibco BRL ）を用いて骨から骨髄を
静かにフラッシュさせることにより、雌ＣＦ１マウス
（Charles River ）の大腿骨から無菌的に収穫した。細
胞懸濁液をナイロンスクリーンに通して濾過し、破砕屑
を除去し、次に室温で１１００ｒｐｍで１０分間、遠心
分離した。上清を捨て、１０％ウシ胎仔血清（ Gibco B
RL）、１％ペニシリンストレプトマイシン（１０，００
０単位／ｍｌ）、１％Ｌ−グルタミン（Gibco BRL ）を
補充したＲＰＭ１培地（Gibco BRL ） １５ｍｌ中にペ
レットを再懸濁した。
殖検定（ＢＭＣ検定）を用いて決定した。骨髄細胞を、
大腿骨を取り出して、３ｃｃ／２３Ｇ注射器およびHank
s 平衡化食塩溶液（Gibco BRL ）を用いて骨から骨髄を
静かにフラッシュさせることにより、雌ＣＦ１マウス
（Charles River ）の大腿骨から無菌的に収穫した。細
胞懸濁液をナイロンスクリーンに通して濾過し、破砕屑
を除去し、次に室温で１１００ｒｐｍで１０分間、遠心
分離した。上清を捨て、１０％ウシ胎仔血清（ Gibco B
RL）、１％ペニシリンストレプトマイシン（１０，００
０単位／ｍｌ）、１％Ｌ−グルタミン（Gibco BRL ）を
補充したＲＰＭ１培地（Gibco BRL ） １５ｍｌ中にペ
レットを再懸濁した。
【０１０９】Coulter Channelyzer 256 を用いて骨髄細
胞を定量し、細胞濃度を調整して収量を６．６７ｘ１０
5 細胞／ｍｌとした。約１０5 個の細胞を９６ウエルプ
レートの各ウエルに付加した。次にウシ顆粒球コロニー
刺激因子製剤を種々の濃度で各ウエルに（３通りに）付
加した。３７℃、（５％ＣＯ2 ）３日間で３日インキュ
ベーション後、3 Ｈ−チミジン（New England Nuclear,
Boston, Mass ）を２μＣｉ／ｍｌの最終濃度で各ウエ
ルに付加した。放射線標識を３７℃（５％ＣＯ 2 ）で少
なくとも１８時間継続した。
胞を定量し、細胞濃度を調整して収量を６．６７ｘ１０
5 細胞／ｍｌとした。約１０5 個の細胞を９６ウエルプ
レートの各ウエルに付加した。次にウシ顆粒球コロニー
刺激因子製剤を種々の濃度で各ウエルに（３通りに）付
加した。３７℃、（５％ＣＯ2 ）３日間で３日インキュ
ベーション後、3 Ｈ−チミジン（New England Nuclear,
Boston, Mass ）を２μＣｉ／ｍｌの最終濃度で各ウエ
ルに付加した。放射線標識を３７℃（５％ＣＯ 2 ）で少
なくとも１８時間継続した。
【０１１０】プレートを−２０℃に凍結し、解氷して、
Brandel 細胞収穫器（Biomedical Research and Develo
pment Laboratories, Gaithersburg, Maryland）を用い
てガラス９６ウエルファイバーマット上に細胞を収穫し
た。Wallac 1205 Betaplate液体シンチレーションカウ
ンター（Wallac, Gaithersburg, Maryland）を用いて、
活性を測定した。ｂＧ−ＣＳＦの活性は、培地制御数／
分（フォールド・オーバー・バックグラウンド）により
試料数／分を分けることにより、測定した。３またはそ
れ以上のフォールド・オーバー・バックグラウンドの活
性は、陽性と考えられた。
Brandel 細胞収穫器（Biomedical Research and Develo
pment Laboratories, Gaithersburg, Maryland）を用い
てガラス９６ウエルファイバーマット上に細胞を収穫し
た。Wallac 1205 Betaplate液体シンチレーションカウ
ンター（Wallac, Gaithersburg, Maryland）を用いて、
活性を測定した。ｂＧ−ＣＳＦの活性は、培地制御数／
分（フォールド・オーバー・バックグラウンド）により
試料数／分を分けることにより、測定した。３またはそ
れ以上のフォールド・オーバー・バックグラウンドの活
性は、陽性と考えられた。
【０１１１】ｂＧ−ＣＳＦのin vivo 活性
体重約１００〜１５０ｋｇの範囲の若い交雑肉用ウシ
で、ｂＧ−ＣＳＦ製剤のin vivo 活性を試験した。ウシ
は、Animal Health Research Center at Terre Haut, I
ndianaから購入し、輸送して、試験に割り当てる前に、
最低２日間、施設に順化させた。ほとんどのウシを１つ
の試験に用いた後、少なくとも１週間休息させ、次に二
次試験に割り当てた。ウシは２個より多くの試験には用
いなかった。
で、ｂＧ−ＣＳＦ製剤のin vivo 活性を試験した。ウシ
は、Animal Health Research Center at Terre Haut, I
ndianaから購入し、輸送して、試験に割り当てる前に、
最低２日間、施設に順化させた。ほとんどのウシを１つ
の試験に用いた後、少なくとも１週間休息させ、次に二
次試験に割り当てた。ウシは２個より多くの試験には用
いなかった。
【０１１２】試験に割り当てる前に、直腸温度、体重、
全般的健康状態並びに総白血球（ＷＢＣ）数および鑑別
白血球数を査定することにより、試験開始の３日前にウ
シを予備スクリーニングした。一般に、直腸温度が≧１
０４度で、総ＷＢＣ数が＜４０００／ｍｍ3 または＞１
２，０００／ｍｍ3 〜であるウシは試験から排除した。
０日目に、処置前にウシを採血し、計量した。２４μｇ
／ｋｇ ｂＧ−ＣＳＦ製剤の用量は、体重に基づいて各
ウシに関して処置時点で計算し、頸部の前肩胛骨領域に
皮下注射により投与した。処置後の予定時間に、頸部か
ら静脈穿刺によりＷＢＣ／鑑別数に関して、ＥＤＴＡ抗
凝固剤中に血液試料を収集した。
全般的健康状態並びに総白血球（ＷＢＣ）数および鑑別
白血球数を査定することにより、試験開始の３日前にウ
シを予備スクリーニングした。一般に、直腸温度が≧１
０４度で、総ＷＢＣ数が＜４０００／ｍｍ3 または＞１
２，０００／ｍｍ3 〜であるウシは試験から排除した。
０日目に、処置前にウシを採血し、計量した。２４μｇ
／ｋｇ ｂＧ−ＣＳＦ製剤の用量は、体重に基づいて各
ウシに関して処置時点で計算し、頸部の前肩胛骨領域に
皮下注射により投与した。処置後の予定時間に、頸部か
ら静脈穿刺によりＷＢＣ／鑑別数に関して、ＥＤＴＡ抗
凝固剤中に血液試料を収集した。
【０１１３】総ＷＢＣ計数は、等張希釈液中の白血球の
１：２５０希釈液を用いて、Nova Celltrak I 血球計数
器で実施した。鑑別ＷＢＣ計数は、Diff-Quik 染色セッ
ト（Dade）で染色した乾燥血液塗抹を用いて実施した。
１００ＷＢＣのすべてを計数し、１００ｘ油浸レンズお
よび１２．５ｘ接眼レンズ（総倍率＝１２５０ｘ）を有
するZeiss 光学顕微鏡で鑑別した。
１：２５０希釈液を用いて、Nova Celltrak I 血球計数
器で実施した。鑑別ＷＢＣ計数は、Diff-Quik 染色セッ
ト（Dade）で染色した乾燥血液塗抹を用いて実施した。
１００ＷＢＣのすべてを計数し、１００ｘ油浸レンズお
よび１２．５ｘ接眼レンズ（総倍率＝１２５０ｘ）を有
するZeiss 光学顕微鏡で鑑別した。
【０１１４】ｂＧ−ＣＳＦの溶液安定度に及ぼすｐＨお
よび温度の影響 表１４は、ｂＧ−ＣＳＦの安定度に及ぼす温度の影響を
示す。ｂＧ−ＣＳＦの溶液安定度に及ぼす温度の作用
は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、バイオアッセ
イおよび肉眼観察により追跡調査した（製剤：０．１ｍ
ｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦ、５％マンニトール、１０ｍＭ
酢酸緩衝液、０．００４％Tween-80，ｐＨ４．０）。
表１４から分かるように、４０℃より高い温度ではｂＧ
−ＣＳＦの安定性に不連続性が認められる。
よび温度の影響 表１４は、ｂＧ−ＣＳＦの安定度に及ぼす温度の影響を
示す。ｂＧ−ＣＳＦの溶液安定度に及ぼす温度の作用
は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、バイオアッセ
イおよび肉眼観察により追跡調査した（製剤：０．１ｍ
ｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦ、５％マンニトール、１０ｍＭ
酢酸緩衝液、０．００４％Tween-80，ｐＨ４．０）。
表１４から分かるように、４０℃より高い温度ではｂＧ
−ＣＳＦの安定性に不連続性が認められる。
【０１１５】ＲＰ ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣの
両方により、４０℃以上で親タンパク質ピークの損失が
認められる。高温での親ピークの消失の後には、溶液中
の粒子の増大が生じる。これは、肉眼で、そして３１０
ｎｍでの光散乱のモニタリングにより観察された。４０
℃で３週間保存したウシＧ−ＣＳＦ溶液は、活性が５℃
および３０℃の場合の１０〜１００分の１であった。５
０℃にて３週間後、５℃および３０℃で保存した溶液よ
りｂＧ−ＣＳＦは１００〜１０００分の１であった。
両方により、４０℃以上で親タンパク質ピークの損失が
認められる。高温での親ピークの消失の後には、溶液中
の粒子の増大が生じる。これは、肉眼で、そして３１０
ｎｍでの光散乱のモニタリングにより観察された。４０
℃で３週間保存したウシＧ−ＣＳＦ溶液は、活性が５℃
および３０℃の場合の１０〜１００分の１であった。５
０℃にて３週間後、５℃および３０℃で保存した溶液よ
りｂＧ−ＣＳＦは１００〜１０００分の１であった。
【０１１６】
【表１４】
【０１１７】円二色性（ＣＤ）を用いて、ｂＧ−ＣＳＦ
に及ぼす温度の作用を追跡した。ｂＧ−ＣＳＦのＣＤス
ペクトルを図２６に示す。スペクトルは、ｂＧ−ＣＳＦ
の二次構造がｂＧ−ＣＳＦと構造的に非常に似ているヒ
トＧ−ＣＳＦと同様にほとんどａ螺旋であることを示唆
する。変性温度（ＴＤ）を決定するために、種々の温度
でＣＤスペクトルを調べた。図２７は、温度の一関数と
しての２２２ｎｍの波長（ａ−螺旋に特徴的な波長）で
のモル楕円率のプロットである。４０℃と５０℃の間
で、モル楕円率は増大しているが、これはｂＧ−ＣＳＦ
の二次構造の損失および変性を示す。
に及ぼす温度の作用を追跡した。ｂＧ−ＣＳＦのＣＤス
ペクトルを図２６に示す。スペクトルは、ｂＧ−ＣＳＦ
の二次構造がｂＧ−ＣＳＦと構造的に非常に似ているヒ
トＧ−ＣＳＦと同様にほとんどａ螺旋であることを示唆
する。変性温度（ＴＤ）を決定するために、種々の温度
でＣＤスペクトルを調べた。図２７は、温度の一関数と
しての２２２ｎｍの波長（ａ−螺旋に特徴的な波長）で
のモル楕円率のプロットである。４０℃と５０℃の間
で、モル楕円率は増大しているが、これはｂＧ−ＣＳＦ
の二次構造の損失および変性を示す。
【０１１８】ｂＧ−ＣＳＦの溶液安定度に及ぼすｐＨの
影響も査定した。安定度に及ぼすｐＨの影響だけを表記
し、温度による変性の作用は表記しないために、溶液を
３０℃（ｂＧ−ＣＳＦのＴＤは４０〜５０℃の間）で保
存した。表１５は、３０℃で２週間に及ぶｐＨの関数と
してのｂＧ−ＣＳＦの安定度を要約する。タンパク質活
性損失は、ｐＨが上昇すると増大する。データは、低ｐ
Ｈでは、ｂＧ−ＣＳＦ中のシステインがプロトン化さ
れ、それゆえ製剤が一増安定になることを示唆する。高
ｐＨでは、この遊離システインはジスルフィド交換反応
に関与し、不安定性の原因になると考えられる。
影響も査定した。安定度に及ぼすｐＨの影響だけを表記
し、温度による変性の作用は表記しないために、溶液を
３０℃（ｂＧ−ＣＳＦのＴＤは４０〜５０℃の間）で保
存した。表１５は、３０℃で２週間に及ぶｐＨの関数と
してのｂＧ−ＣＳＦの安定度を要約する。タンパク質活
性損失は、ｐＨが上昇すると増大する。データは、低ｐ
Ｈでは、ｂＧ−ＣＳＦ中のシステインがプロトン化さ
れ、それゆえ製剤が一増安定になることを示唆する。高
ｐＨでは、この遊離システインはジスルフィド交換反応
に関与し、不安定性の原因になると考えられる。
【０１１９】
【表１５】
【０１２０】ｂＧ−ＣＳＦ溶液安定度に及ぼすＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液の影響 ｐＨ７．５の１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中に配合したｂＧ
−ＣＳＦは、４０℃で数日間保存した場合でも、高い溶
液安定度を示す、ということを本発明者らは観察した。
ｂＧ−ＣＳＦは中性ｐＨで不安定で、４０℃以上の温度
では変性することが、従来知られていたために、これは
予期せぬことであった。図２８は、４０℃の保存温度で
ｐＨ７．５でのｂＧ−ＣＳＦの溶液安定度に及ぼすＨＥ
ＰＥＳ緩衝液の影響を示す。ｂＧ−ＣＳＦの安定度は、
ＨＥＰＥＳ緩衝液の濃度が低下すると、有意に低下し
た。
Ｓ緩衝液の影響 ｐＨ７．５の１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中に配合したｂＧ
−ＣＳＦは、４０℃で数日間保存した場合でも、高い溶
液安定度を示す、ということを本発明者らは観察した。
ｂＧ−ＣＳＦは中性ｐＨで不安定で、４０℃以上の温度
では変性することが、従来知られていたために、これは
予期せぬことであった。図２８は、４０℃の保存温度で
ｐＨ７．５でのｂＧ−ＣＳＦの溶液安定度に及ぼすＨＥ
ＰＥＳ緩衝液の影響を示す。ｂＧ−ＣＳＦの安定度は、
ＨＥＰＥＳ緩衝液の濃度が低下すると、有意に低下し
た。
【０１２１】ｂＧ−ＣＳＦの変性温度（ＴＤ）に及ぼす
１Ｍ ＨＥＰＥＳの作用を、微小熱量測定により測定し
た。図１０は、ｂＧ−ＣＳＦのＴＤで２つの製剤（１Ｍ
ＨＥＰＥＳを用いた場合と用いない場合）を比較した
サーモグラムである。ＨＥＰＥＳ緩衝液の非存在下で
は、吸熱遷移の開始は約４０℃であるが、一方１Ｍ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液中に配合したｂＧ−ＣＳＦは約５０℃の
ＴＤ開始を有する。変性温度の増大は、通常は安定化を
示す。
１Ｍ ＨＥＰＥＳの作用を、微小熱量測定により測定し
た。図１０は、ｂＧ−ＣＳＦのＴＤで２つの製剤（１Ｍ
ＨＥＰＥＳを用いた場合と用いない場合）を比較した
サーモグラムである。ＨＥＰＥＳ緩衝液の非存在下で
は、吸熱遷移の開始は約４０℃であるが、一方１Ｍ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液中に配合したｂＧ−ＣＳＦは約５０℃の
ＴＤ開始を有する。変性温度の増大は、通常は安定化を
示す。
【０１２２】ｂＧ−ＣＳＦのin vivo 活性
雌ウシにおけるこの製剤のin vivo 活性を、本発明者ら
は評価した。図２９は、ＷＢＣ数対時間のプロットで、
１Ｍ ＨＥＰＥＳ中に処方したｂＧ−ＣＳＦを「対照」
製剤と比較したものである。「対照」とは、５％マンニ
トール、１０ｍＭ 酢酸緩衝液、Tween-80，ｐＨ４．０
を含有する製剤を指す。
は評価した。図２９は、ＷＢＣ数対時間のプロットで、
１Ｍ ＨＥＰＥＳ中に処方したｂＧ−ＣＳＦを「対照」
製剤と比較したものである。「対照」とは、５％マンニ
トール、１０ｍＭ 酢酸緩衝液、Tween-80，ｐＨ４．０
を含有する製剤を指す。
【０１２３】図２９で分かるように、ＷＢＣ数は、約２
４〜３０時間だけの間、２００％のベースラインレベル
（感染に対する防護に関連したレベル）の限界値（閾
値）を上回っている。しかしながら、ｂＧ−ＣＳＦを１
Ｍ ＨＥＰＥＳ中で配合した場合は、ＰＭＮ数は、最低
３日間または７２時間、限界値（閾値）を超えたままで
ある（いくつかの場合には、ＶＶＴＣはほぼ１週間、限
界値（閾値）を超えたままである）。
４〜３０時間だけの間、２００％のベースラインレベル
（感染に対する防護に関連したレベル）の限界値（閾
値）を上回っている。しかしながら、ｂＧ−ＣＳＦを１
Ｍ ＨＥＰＥＳ中で配合した場合は、ＰＭＮ数は、最低
３日間または７２時間、限界値（閾値）を超えたままで
ある（いくつかの場合には、ＶＶＴＣはほぼ１週間、限
界値（閾値）を超えたままである）。
【０１２４】この試験の結果は、ＨＥＰＥＳ緩衝液がin
vitroでの安定剤として役立つだけでなく、ｂＧ−ＣＳ
Ｆのin vivo 性能を多少改善することを示唆する。ｂＧ
−ＣＳＦ性能に及ぼすＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて観察さ
れた予期せぬ結果は、同様の緩衝液、例えばＭＯＰＳ、
ＨＥＰＰＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥの研究を促し
た。これらの緩衝液も、ＨＥＰＥＳ緩衝液と同様にｂＧ
−ＣＳＦのin vitro安定度の改良を示した。ｂＧ−ＣＳ
ＦをＴＥＳ緩衝液およびＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中で処方
したin vivo 試験を実施した結果、両製剤はＨＥＰＥＳ
製剤と同様に、雌ウシにおけるｂＧ−ＣＳＦのin vivo
活性の延長を引き起こした。
vitroでの安定剤として役立つだけでなく、ｂＧ−ＣＳ
Ｆのin vivo 性能を多少改善することを示唆する。ｂＧ
−ＣＳＦ性能に及ぼすＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて観察さ
れた予期せぬ結果は、同様の緩衝液、例えばＭＯＰＳ、
ＨＥＰＰＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥの研究を促し
た。これらの緩衝液も、ＨＥＰＥＳ緩衝液と同様にｂＧ
−ＣＳＦのin vitro安定度の改良を示した。ｂＧ−ＣＳ
ＦをＴＥＳ緩衝液およびＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中で処方
したin vivo 試験を実施した結果、両製剤はＨＥＰＥＳ
製剤と同様に、雌ウシにおけるｂＧ−ＣＳＦのin vivo
活性の延長を引き起こした。
【０１２５】１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中でｂＧ−ＣＳＦ
を処方すると、in vivo でのｂＧ−ＣＳＦの持続性活性
がもたらされる。この持続性活性は、注射部位でのｂＧ
−ＣＳＦの安定度改良の結果であると思われる。中性ｐ
Ｈおよび４０℃の温度でのｐＧ−ＣＳＦの溶液安定度
は、ｂＧ−ＣＳＦを１Ｍ ＨＥＰＥＳ中で処方した場合
には、有意に改良された。その他の有機緩衝液、例えば
ＭＯＰＳ、ＨＥＰＰＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥ
も、ｂＧ−ＣＳＦの安定度の改良をもたらした。
を処方すると、in vivo でのｂＧ−ＣＳＦの持続性活性
がもたらされる。この持続性活性は、注射部位でのｂＧ
−ＣＳＦの安定度改良の結果であると思われる。中性ｐ
Ｈおよび４０℃の温度でのｐＧ−ＣＳＦの溶液安定度
は、ｂＧ−ＣＳＦを１Ｍ ＨＥＰＥＳ中で処方した場合
には、有意に改良された。その他の有機緩衝液、例えば
ＭＯＰＳ、ＨＥＰＰＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥ
も、ｂＧ−ＣＳＦの安定度の改良をもたらした。
【図１】図１は、０．１Ｍ、１Ｍおよび２ＭのＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関数と
しての、０．１ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液 １ｍｌの安定
度（回収％）を示す。
Ｓ緩衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関数と
しての、０．１ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液 １ｍｌの安定
度（回収％）を示す。
【図２】図２は、０．１Ｍ、１Ｍおよび２ＭのＴＥＳ緩
衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関数として
の、０．１ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液 １ｍｌの安定度
（回収％）を示す。
衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関数として
の、０．１ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液 １ｍｌの安定度
（回収％）を示す。
【図３】図３は、０．１Ｍ、１Ｍおよび２ＭのＴＲＩＣ
ＩＮＥ緩衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関
数としての、０．１ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液 １ｍｌの
安定度（回収％）を示す。
ＩＮＥ緩衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関
数としての、０．１ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液 １ｍｌの
安定度（回収％）を示す。
【図４】図４は、０．１Ｍ、１Ｍおよび２ＭのＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関数と
しての、２ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液 １ｍｌの安定度
（回収％）を示す。
Ｓ緩衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関数と
しての、２ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液 １ｍｌの安定度
（回収％）を示す。
【図５】図５は、０．１Ｍ、１Ｍおよび２ＭのＴＥＳ緩
衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関数として
の、２ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液 １ｍｌの安定度（回収
％）を示す。
衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関数として
の、２ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液 １ｍｌの安定度（回収
％）を示す。
【図６】図６は、０．１Ｍ、１Ｍおよび２ＭのＴＲＩＣ
ＩＮＥ緩衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関
数としての、２ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液 １ｍｌの安定
度（回収％）を示す。
ＩＮＥ緩衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関
数としての、２ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液 １ｍｌの安定
度（回収％）を示す。
【図７】図７は、水、１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１Ｍ
ＴＥＳ緩衝液および１Ｍ ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中で製
剤化したｂＧ−ＣＳＦで処置された畜牛に関する総末梢
血ＰＭＮ（０時間での対照値に対する％として表す）を
示す。
ＴＥＳ緩衝液および１Ｍ ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中で製
剤化したｂＧ−ＣＳＦで処置された畜牛に関する総末梢
血ＰＭＮ（０時間での対照値に対する％として表す）を
示す。
【図８】図８は、Neupogen（登録商標）緩衝液（対照、
ｐＨ４．０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、ＰＢ
Ｓ（ｐＨ７．０）、Hanks 緩衝液（ｐＨ８．５）および
重炭酸緩衝液（ｐＨ８．２）中での、時間の関数として
のｂＧ−ＣＳＦの安定度（ｍｇ／ｍｌ 濃度）を示す。
ｐＨ４．０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、ＰＢ
Ｓ（ｐＨ７．０）、Hanks 緩衝液（ｐＨ８．５）および
重炭酸緩衝液（ｐＨ８．２）中での、時間の関数として
のｂＧ−ＣＳＦの安定度（ｍｇ／ｍｌ 濃度）を示す。
【図９】図９は、４０℃での１０００ｍＭ、５００ｍ
Ｍ、１００ｍＭ、５０ｍＭおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳ
緩衝液中での、時間の関数としてのｂＧ−ＣＳＦの安定
度（ｍｇ／ｍｌ 濃度）を示す。
Ｍ、１００ｍＭ、５０ｍＭおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳ
緩衝液中での、時間の関数としてのｂＧ−ＣＳＦの安定
度（ｍｇ／ｍｌ 濃度）を示す。
【図１０】図１０は、２つのｂＧ−ＣＳＦ溶液に関する
２つのサーモグラム（ｋｃａｌ／ｍｏｌ／ｄｅｇ）対温
度（℃）を示す。最高温度４７℃を示す上方のサーモグ
ラムは、ｐＨ７．５でＰＢＳ中に製剤化したｂＧ−ＣＳ
Ｆに関するものであり、最高温度５９℃を示す下方のサ
ーモグラムは、ｐＨ７．５で１Ｍ ＨＥＰＥＳ中で製剤
化したｂＧ−ＣＳＦに関する。
２つのサーモグラム（ｋｃａｌ／ｍｏｌ／ｄｅｇ）対温
度（℃）を示す。最高温度４７℃を示す上方のサーモグ
ラムは、ｐＨ７．５でＰＢＳ中に製剤化したｂＧ−ＣＳ
Ｆに関するものであり、最高温度５９℃を示す下方のサ
ーモグラムは、ｐＨ７．５で１Ｍ ＨＥＰＥＳ中で製剤
化したｂＧ−ＣＳＦに関する。
【図１１】図１１は、３つの製剤：水中ｂＧ−ＣＳＦ
（対照）、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中ｂＧ−ＣＳＦ、および１
Ｍ ＨＥＰＥＳ＋１０％ポラキサマー中ｂＧ−ＣＳＦに
関する、時間の関数としての畜牛における％ＰＭＮ（好
中球）のプロットを示す。
（対照）、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中ｂＧ−ＣＳＦ、および１
Ｍ ＨＥＰＥＳ＋１０％ポラキサマー中ｂＧ−ＣＳＦに
関する、時間の関数としての畜牛における％ＰＭＮ（好
中球）のプロットを示す。
【図１２】図１２は、３１０ｎｍでの吸光度対ｂＧ−Ｃ
ＳＦ濃度（ｍｇ／ｍｌ）により測定した場合の、ｐＨ
７．５の１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの溶
解度を示す。
ＳＦ濃度（ｍｇ／ｍｌ）により測定した場合の、ｐＨ
７．５の１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの溶
解度を示す。
【図１３】図１３は、４０℃での１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝
液中およびＰＢＳ中のウシＧ−ＣＳＦの安定度（初期濃
度に対する％）を示す。
液中およびＰＢＳ中のウシＧ−ＣＳＦの安定度（初期濃
度に対する％）を示す。
【図１４】図１４は、４０℃での１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝
液中およびＰＢＳ中のヒトＧ−ＣＳＦの安定度（初期濃
度に対する％）を示す。
液中およびＰＢＳ中のヒトＧ−ＣＳＦの安定度（初期濃
度に対する％）を示す。
【図１５】図１５は、ｐＨ７．５の１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩
衝液中のヒトＧ−ＣＳＦおよびウシＧ−ＣＳＦの安定度
（初期濃度に対する％）を比較する。
衝液中のヒトＧ−ＣＳＦおよびウシＧ−ＣＳＦの安定度
（初期濃度に対する％）を比較する。
【図１６】図１６は、４０℃でのｐＨ４．０の１Ｍ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの初期濃度に対する％
対時間（日）を示す。
ＥＰＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの初期濃度に対する％
対時間（日）を示す。
【図１７】図１７は、４０℃でのｐＨ７．５の１Ｍ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの初期濃度に対する％
対時間（日）を示す。
ＥＰＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの初期濃度に対する％
対時間（日）を示す。
【図１８】図１８は、４０℃でのｐＨ４．０の１Ｍ Ｔ
ＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの初期濃度に対する％対時
間（日）を示す。
ＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの初期濃度に対する％対時
間（日）を示す。
【図１９】図１９は、４０℃でのｐＨ７．５の１Ｍ Ｔ
ＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの初期濃度に対する％対時
間（日）を示す。
ＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの初期濃度に対する％対時
間（日）を示す。
【図２０】図２０は、５℃で保存した試料に関する、Ｒ
Ｐ ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％対
時間（週）の結果を示す。
Ｐ ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％対
時間（週）の結果を示す。
【図２１】図２１は、５℃で保存した試料に関する、Ｓ
Ｅ ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％対
時間（週）の結果を示す。
Ｅ ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％対
時間（週）の結果を示す。
【図２２】図２２は、３０℃で保存した試料に関する、
ＲＰ ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％
対時間（週）の結果を示す。
ＲＰ ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％
対時間（週）の結果を示す。
【図２３】図２３は、３０℃で保存した試料に関する、
ＳＥ ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％
対時間（週）の結果を示す。
ＳＥ ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％
対時間（週）の結果を示す。
【図２４】図２４は、４０℃で保存した試料に関する、
ＲＰ ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％
の結果を示す。
ＲＰ ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％
の結果を示す。
【図２５】図２５は、４０℃で保存した試料に関する、
ＳＥ ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％
対時間（週）の結果を示す。
ＳＥ ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％
対時間（週）の結果を示す。
【図２６】図２６は、ｂＧ−ＣＳＦのＣＤ（円二色性）
スペクトルである。
スペクトルである。
【図２７】図２７は、温度の関数としての、２２２ｎｍ
の波長でのモル楕円率のプロットである。
の波長でのモル楕円率のプロットである。
【図２８】図２８は、４０℃でｐＨ７．５での種々の濃
度のＨＥＰＥＳ中でのｂＧ−ＣＳＦの初期濃度に対する
％対時間（日）を示す。
度のＨＥＰＥＳ中でのｂＧ−ＣＳＦの初期濃度に対する
％対時間（日）を示す。
【図２９】図２９は、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中に製剤化した
ｂＧ−ＣＳＦ対対照製剤に関する、ＷＢＣ対注射後の時
間（時間）のプロットである。
ｂＧ−ＣＳＦ対対照製剤に関する、ＷＢＣ対注射後の時
間（時間）のプロットである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 47/22 Ａ６１Ｋ 37/02
(72)発明者 バーバラ ジーン カミッカー
アメリカ合衆国，コネチカット 06340,
グロトン，イースタン ポイント ロー
ド，ファイザー セントラル リサーチ
(72)発明者 カスラ カスライアン
アメリカ合衆国，コネチカット 06340,
グロトン，イースタン ポイント ロー
ド，ファイザー セントラル リサーチ
Claims (29)
- 【請求項１】 タンパク質および安定化緩衝剤を含んで
成る安定化されたタンパク質組成物であって、持続する
期間中、治療レベルのこのようなタンパク質を保持し得
る組成物。 - 【請求項２】 タンパク質がコロニー刺激因子、ソマト
トロピン、サイトカイン、抗体および抗原から成る群か
ら選択される請求項１に記載の組成物。 - 【請求項３】 タンパク質がコロニー刺激因子である請
求項２に記載の組成物。 - 【請求項４】 タンパク質がヒトＧ−ＣＳＦ、ウシＧ−
ＣＳＦおよびイヌＧ−ＣＳＦから成る群から選択される
請求項３に記載の組成物。 - 【請求項５】 タンパク質がウシＧ−ＣＳＦである請求
項４に記載の組成物。 - 【請求項６】 生理学的ｐＨにある請求項１または５に
記載の組成物。 - 【請求項７】 約４．０〜約７．５のｐＨにある請求項
１または５に記載の組成物。 - 【請求項８】 生理学的温度にある請求項１または５に
記載の組成物。 - 【請求項９】 安定化緩衝剤がＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよ
びＴＲＩＣＩＮＥから成る群から選択される請求項１ま
たは５に記載の組成物。 - 【請求項１０】 持続する期間が少なくとも約３日間で
ある請求項１または５に記載の組成物。 - 【請求項１１】 持続する期間がin vivo で少なくとも
約３日間である請求項１または５に記載の組成物。 - 【請求項１２】 Ｇ−ＣＳＦが０．０１〜５ｍｇ／ｍｌ
の範囲の濃度で存在する請求項４または５に記載の組成
物。 - 【請求項１３】 安定化緩衝剤が約０．０５Ｍ〜約２Ｍ
の範囲の濃度で存在する請求項１、４または５に記載の
組成物。 - 【請求項１４】 安定化緩衝剤がＨＥＰＥＳであり、約
１Ｍの濃度で存在する請求項５に記載の組成物。 - 【請求項１５】 タンパク質および医薬として許容され
る安定化緩衝剤を含んで成る哺乳類への非経口投与のた
めの安定化されたタンパク質組成物の医薬として許容さ
れる投与形態であって、組成物が持続する期間中治療レ
ベルのこのようなタンパク質を維持することができそし
てタンパク質が予定期間中哺乳類に療法的利益を提供す
るのに十分な量で存在する投与形態。 - 【請求項１６】 投与形態が粘度改質剤および界面活性
剤から成る群から選択される成分をさらに含んで成る請
求項１５に記載の医薬として許容される投与形態。 - 【請求項１７】 タンパク質が約０．０１〜５ｍｇ／ｍ
ｌの範囲の濃度で存在するウシＧ−ＣＳＦであり、安定
化緩衝剤がＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥか
ら成る群から選択され、哺乳類が雌ウシであり、予定期
間が少なくとも約３日間であり、そして組成物が約７．
５のｐＨにある請求項１５に記載の医薬として許容され
る投与形態。 - 【請求項１８】 緩衝液がＨＥＰＥＳであり、約０．０
５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する請求項１７に記載
の医薬として許容される投与形態。 - 【請求項１９】 ウシＧ−ＣＳＦが約０．１μｇ／ｋｇ
〜約５０μｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される請求項１
８に記載の医薬として許容される投与形態。 - 【請求項２０】 タンパク質と安定化緩衝剤を一緒にす
る工程を含んで成る哺乳類への非経口投与のための医薬
として許容される投与形態の安定化されたタンパク質組
成物の製造方法であって、安定化されたタンパク質組成
物が持続する期間中、治療レベルのこのようなタンパク
質を保持することができ、そしてタンパク質が少なくと
も約３日間哺乳類に対する防護を提供するのに十分な量
で存在することを特徴とする製造方法。 - 【請求項２１】 療法的有効量の安定化されたタンパク
質組成物を哺乳類に投与する工程を含んで成る哺乳類に
おける感染の治療または予防方法であって、安定化され
たタンパク質組成物がタンパク質および安定化緩衝剤を
含んで成り、組成物が少なくとも約３日間の持続する期
間中このようなタンパク質の治療レベルを保持し得るこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項２２】 療法的有効量の安定化Ｇ−ＣＳＦ組成
物を雌ウシに投与することを含んで成る畜牛における乳
腺炎、子宮炎またはウシ呼吸器疾患の治療または予防方
法であって、安定化されたＧ−ＣＳＦ組成物がＧ−ＣＳ
Ｆおよび安定化緩衝剤を含んで成り、組成物が少なくと
も３日間の持続する期間中、このようなタンパク質の治
療レベルを保持し得ることを特徴とする方法。 - 【請求項２３】 安定化されたタンパク質組成物を哺乳
類に投与することを含んで成る、持続する期間中の哺乳
類におけるタンパク質を療法レベルに保持する方法であ
って、安定化されたタンパク質組成物がタンパク質およ
び安定化緩衝剤を含んで成り、組成物が少なくとも約３
日間の持続する期間中、このようなタンパク質の治療レ
ベルを保持し得ることを特徴とする方法。 - 【請求項２４】 タンパク質が約０．０１〜５ｍｇ／ｍ
ｌの範囲の濃度で存在するウシＧ−ＣＳＦであり、安定
化緩衝剤がＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥか
ら成る群から選択され、そして組成物が約７．５のｐＨ
である請求項２０、２１、２２または２３に記載の方
法。 - 【請求項２５】 療法的有効量のタンパク質を有する一
次容器、および医薬として許容される安定化緩衝剤を有
する二次容器を含んで成る安定化されたタンパク質組成
物を哺乳類に投与するためのキットであって、一次容器
の療法的有効量のタンパク質が、二次容器の医薬として
許容される安定化緩衝剤と組合わされており、少なくと
も３日間の持続する期間中、哺乳類におけるこのような
タンパク質の治療レベルを保持し得るキット。 - 【請求項２６】 前記タンパク質が約０．０１〜５ｍｇ
／ｍｌの範囲の濃度で存在するウシＧ−ＣＳＦであり、
安定化緩衝剤がＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮ
Ｅから成る群から選択され、そして組成物が約７．５の
ｐＨにある請求項２５に記載のキット。 - 【請求項２７】 ウシＧ−ＣＳＦおよびＨＥＰＥＳ緩衝
液を含んで成る安定化されたタンパク質組成物であっ
て、約３週間〜約１８ヶ月の範囲の長期保存寿命を提供
し得る組成物。 - 【請求項２８】 ＨＥＰＥＳ緩衝液が約０．０５Ｍ〜約
２Ｍの範囲の濃度にある組成物であって、約７．５のｐ
Ｈ及び約４０℃未満の温度を有する、請求項２７に記載
の組成物。 - 【請求項２９】 温度が約４℃である請求項２８に記載
の組成物。
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