JP2000023680A - 昆虫アセチルコリン受容体サブユニットをコ―ドする核酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 昆虫アセチルコリン受容体サブユニットをコ
ードする核酸の提供。 【解決手段】 特定な３種類の塩基配列に示される昆虫
アセチルコリン受容体サブユニットをコードする核酸、
その発現手段および対応するポリペプチド及び植物保護
のための新規な有効化合物の発見方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は特に昆虫アセチルコ
リン受容体サブユニットをコードする核酸に関する。

【０００２】

【従来の技術】ニコチン性アセチルコリン受容体は動物
界で神経伝達において重要なリガンド調節性イオンチャ
ネルである。受容体へのアセチルコリンまたは他のアゴ
ニストの結合によりチャネルは一時的に開口し、そして
陽イオンが通過する。受容体は孔の周りに集まった５個
のサブユニットからなると考えられる。これらのサブユ
ニットの各々は細胞外Ｎ末端部分、それに続く３個の膜
貫通領域、細胞内部分、４番目の膜貫通領域及び短い細
胞外Ｃ末端部分からなるタンパク質である（Ｃｈａｎｇ
ｅｕｘ等、１９９２）。

【０００３】アセチルコリン受容体は脊椎動物において
特によく調べられている。これに関連して、３つの群を
それらの解剖学的位置及びそれらの機能特性（チャネル
の導電性（ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅ
ｓ）、脱感作、並びにアゴニスト及びアンタゴニスト並
びにα−ブンガロトキシンのような毒素に対する感受
性）に基づいて分類することができる。その分類は受容
体の分子組成と相関する。筋肉に見いだされるサブユニ
ット組成α₂βγδを有するヘテロオリゴマー受容体
（Ｎｏｄａ等、１９８２、Ｃｌａｕｄｉｏ等、１９８
３、Ｄｅｖｉｌｌｅｒｓ−Ｔｈｉｅｒｙ等、１９８３、
Ｎｏｄａ等、１９８３ａ、ｂ）、α２−α６及びβ２−
β４群からのサブユニットを含有し、神経系に見いださ
れるヘテロオリゴマー受容体（Ｗａｄａ等、１９８８、
Ｓｃｈｏｅｐｆｅｒ等、１９９０、Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ
等、１９９１、Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ等、１９９７）並び
にα７−α９群からのサブユニットを含有し、同様に神
経系に見いだされるホモオリゴマー受容体（Ｌｉｎｄｓ
ｔｒｏｍ等、１９９７、Ｅｌｇｏｙｈｅｎ等、１９９
７）がある。また、この分類は異なるサブユニットの遺
伝子配列の相関性の試験によっても裏付けられる。典型
的に、異なる種からの機能的に相同なサブユニットの配
列は異なる群からであるが同じ種からのサブユニットの
配列より相互に類似している。従って、例えば、ラット
筋肉αサブユニットはシビレエイ トルペド・カリフォ
ルニカ（Ｔｏｒｐｅｄｏ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の
ものと７８％のアミノ酸同一性及び８４％のアミノ酸類
似性を示すが、ラットα２サブユニット（ヘテロオリゴ
マー、神経型）と４８％の同一性及び５９％の類似性、
そしてラットα７サブユニット（ホモオリゴマー、神経
型）と３６％の同一性及び４５％の類似性を示すだけで
ある。さらに、全ての既知のアセチルコリン受容体サブ
ユニットの遺伝子配列は相互にだけでなくいくつかの他
のリガンド調節性イオンチャネル（例えば、５ＨＴ₃型
のセロトニン受容体、ＧＡＢＡ調節性塩素イオンチャネ
ル及びグリシン調節性塩素イオンチャネル）のものにも
ある程度類似している。従って、全てのこれらの受容体
は１つの共通の前駆体に由来し、そしてそれらは１つの
超遺伝子ファミリーに分類されると考えられる（Ｏｒｔ
ｅｌｌｓ等、１９９５）。

【０００４】昆虫では、アセチルコリンは中枢神経系の
最も重要な興奮性神経伝達物質である。従って、昆虫の
中枢神経系神経節の調製物においてアセチルコリン受容
体を電気生理学的に検出することができる。受容体はシ
ナプス後及びシナプス前神経終末並びに介在ニューロ
ン、運動ニューロン及び調節（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ）
ニューロンの細胞体の両方で検出される（Ｂｒｅｅｒ
等、１９８７、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ等、１９９７）。
受容体のあるものはα−ブンガロトキシンにより阻害さ
れ、一方、あるものは反応しない（Ｓｃｈｌｏβ等、１
９８８）。さらに、アセチルコリン受容体は重要な天然
（例えば、ニコチン）及び合成の殺虫剤（例えば、クロ
ロニコチニル）の攻撃の分子地点である。

【０００５】多数の昆虫のニコチン性アセチルコリン受
容体の遺伝子配列がすでに知られている。例えば、ドロ
ソフィラ・メラノガスタでは５個の異なるサブユニット
の配列が記述されており（Ｂｏｓｓｙ等、１９８８、Ｈ
ｅｒｍａｎｎｓ−Ｂｏｒｇｍｅｙｅｒ等、１９８６、Ｓ
ａｗｒｕｋ等、１９９０ａ、１９９０ｂ、Ｓｃｈｕｌｚ
等、未公開、ＥＭＢＬ受託番号Ｙ１５５９３）、一方、
ロクスタ・ミグラトリア（Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａ
ｔｏｒｉａ）では同様に５個が記述されており（Ｓｔｅ
ｔｚｅｒ等、未公開、ＥＭＢＬ受託番号ＡＪ０００３９
０−ＡＪ０００３９３）、シストセルカ・グレガリア
（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ ｇｒｅｇａｒｉａ）では
１個が記述されており（Ｍａｒｓｈａｌｌ等、１９９
０）、ミズス・ペルシカエ（Ｍｙｚｕｓ Ｐｅｒｓｉｃ
ａｅ）では２個が記述されており（Ｓｇａｒｄ等、未公
開、ＥＭＢＬ受託番号Ｘ８１８８７及びＸ８１８８
８）、そしてマンズカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ ｓ
ｅｘｔａ）では１個が記述されている（Ｅａｓｔｈａｍ
等、１９９７）。さらに、ドロソフィラ・メラノガスタ
からの多数の部分遺伝子配列がいわゆる発現配列タグ
（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）と
して特性化されている（ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎ
ｋ）受託番号ＡＡ５４０６８７、ＡＡ６９８１５５、Ａ
Ａ６９７７１０、ＡＡ６９７３２６）。個々の配列が他
の昆虫からのものに非常に似ているということから、こ
れらのサブユニットが機能的相同物であることが示唆さ
れる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】例えば、新規な殺虫剤
を探索する目的のために、新規な昆虫アセチルコリン受
容体サブユニットを利用できるようにすることは非常に
実用的に重要であり、機能的相同物間の場合より既知の
サブユニットと大きく異なるサブユニットが特に目的の
ものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は特に新
規な昆虫アセチルコリン受容体サブユニットをコードす
る核酸を利用できるようにするという目的に基づく。

【０００８】この目的は（ａ）配列番号１、配列番号３
または配列番号５の配列、（ｂ）（ａ）に定義された配
列の少なくとも１４塩基対の長さの部分配列、（ｃ）６
０℃で２ ｘ ＳＳＣ中、好ましくは６０℃で０．５ｘ
ＳＳＣ中、特に好ましくは６０℃で０．２ ｘ ＳＳＣ中
で（ａ）に定義された配列にハイブリダイズする配列
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９）、（ｄ）配列番号１
の場合の位置１２９５ないし位置２１９５の間、または
配列番号３の場合の位置４３２ないし位置１３１８の
間、または配列番号５の場合の位置１５４ないし位置１
１２３の間で、（ａ）に定義された配列と少なくとも７
０％の同一性を示す配列、（ｅ）（ａ）に定義された配
列に相補的な配列、及び（ｆ）遺伝暗号の縮重のため
に、（ａ）ないし（ｄ）に定義された配列と同じアミノ
酸配列をコードする配列から選択される配列を含んでな
る核酸を提供することにより達成される。

【０００９】好ましくは標準設定でＧＣＧプログラムパ
ッケージ、バージョン９．１からのＧＡＰプログラムを
用いて核酸配列の同一性の程度を決定する（Ｄｅｖｅｒ
ｅｕｘ等、１９８４）。

【００１０】本発明は昆虫が特にホモオリゴマーアセチ
ルコリン受容体のサブユニットをコードする遺伝子を保
有するという驚くべき発見に基づく。

【００１１】本発明はさらに新規な核酸の少なくとも１
つを含有するベクターに関する。分子生物学研究所にお
いて用いられる全てのプラスミド、ファスミド、コスミ
ド、ＹＡＣまたは人工染色体をベクターとして用いるこ
とができる。新規な核酸を発現させる目的のためにこれ
らのベクターを通常の調節配列に連結することができ
る。そのような調節配列の選択は発現のために原核もし
くは真核細胞、または無細胞系のいずれを用いるかによ
る。ＳＶ４０、アデノウイルスまたはサイトメガロウイ
ルス初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ
系、ラムダファージの主要なオペレーター及びプロモー
ター領域、ｆｄ外被タンパク質の制御領域、３−ホスホ
グリセリン酸キナーゼプロモーター、酸性ホスファター
ゼプロモーター並びに酵母α−接合因子プロモーターは
特に好ましい発現制御配列の例である。

【００１２】発現させるために、本発明の核酸を適当な
宿主細胞中に導入することができる。原核細胞、好まし
くはエシェリキア・コリ、及び真核細胞、好ましくは哺
乳類または昆虫細胞は宿主細胞としての使用のために適
当である。適当な単細胞宿主細胞の他の例は：シュード
モナス、バシラス、ストレプトミセス、酵母、ＨＥＫ−
２９３、シュナイダーＳ２、ＣＨＯ、ＣＯＳ１及びＣＯ
Ｓ７細胞、細胞培養の植物細胞並びに両生類細胞、特に
卵母細胞である。

【００１３】本発明は本発明の核酸によりコードされる
ポリペプチド及びそれらから合成されるアセチルコリン
受容体、好ましくはホモオリゴマーアセチルコリン受容
体にも関する。

【００１４】本発明の核酸によりコードされるポリペプ
チドを製造するために、本発明の核酸の少なくとも１つ
を含有する宿主細胞を適当な条件下で培養することがで
きる。その後、常法で細胞または培養培地から所望する
ポリペプチドを単離することができる。

【００１５】本発明はさらに上記のポリペプチドまたは
受容体に特異的に結合する抗体に関する。これらの抗体
を常法で調製する。例えば、抗体を生産するために有効
な本発明のアセチルコリン受容体ポリペプチドまたはそ
のフラグメントの量を実質的に免疫適格の宿主に注入
し、続いてこれらの抗体を単離することによりそのよう
な抗体を製造することができる。さらに、モノクローナ
ル抗体を生産する不死化された細胞系をそれ自体既知の
方法で得ることができる。必要な場合、抗体を検出試薬
で標識することができる。そのような検出試薬の好まし
い例は酵素、放射性標識された元素、蛍光化学薬品また
はビオチンである。完全な抗体の代わりに、所望する特
異的結合特性を保有するフラグメントを用いることもで
きる。

【００１６】本発明の核酸を特にトランスジェニック無
脊椎動物を作製するために用いることができる。これら
の後者を野生型のものと異なる本発明の受容体またはそ
れらの変異体の発現に基づく試験系に用いることができ
る。さらに、これは本発明の受容体またはそれらの変異
体の発現の変化が他の遺伝子または遺伝子制御配列（プ
ロモーター）を改変した結果として起こる全てのトラン
スジェニック無脊椎動物を含む。

【００１７】例えば、ドロソフィラ・メラノガスタにお
いてＰ因子による遺伝子導入（Ｈａｙ等、１９９７）を
用いるかまたはセノラブディティス・エレガンスにおい
てトランスポゾンによる遺伝子導入（例えば、Ｔｃ１を
用いて、Ｐｌａｓｔｅｒｋ、１９９６）を用いるかによ
りトランスジェニック無脊椎動物を作製する。

【００１８】従って、本発明は本発明の核酸配列の少な
くとも１つを含有するトランスジェニック無脊椎動物、
好ましくは種ドロソフィラ・メラノガスタまたはセノラ
ブディティス・エレガンスのトランスジェニック無脊椎
動物、及びそれらのトランスジェニック子孫にも関す
る。好ましくは、トランスジェニック無脊椎動物は野生
型のものと異なる形態の本発明の受容体を含有する。

【００１９】本発明の核酸を常法で調製することができ
る。例えば、核酸分子を完全に化学的に合成することが
できる。さらに、本発明の配列の短いセグメントのみを
化学的に合成することができ、そしてこれらのオリゴヌ
クレオチドを放射性または蛍光色素で標識することがで
きる。昆虫のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングするために標識オリゴヌクレオチ
ドを用いることができる。問題のＤＮＡを単離するため
に標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするクロー
ン（「陽性クローン」）を選択する。単離されたＤＮＡ
を特性化した後、本発明の核酸が容易に得られる。

【００２０】また、化学的に合成されたオリゴヌクレオ
チドを用いてＰＣＲ法により本発明の核酸を調製するこ
ともできる。

【００２１】コーディング領域に隣接して生来存在する
調節領域を単離及び特性化するために本発明の核酸を用
いることができる。従って、本発明はこれらの調節領域
にも関する。

【００２２】モジュレーターとして、特にアゴニストま
たはアンタゴニストとして本発明のアセチルコリン受容
体の導電性を変える化合物のような、植物保護のための
新規な有効化合物を同定するために本発明の核酸を用い
ることができる。このために、本発明の少なくとも１つ
の核酸を包含する組み換えＤＮＡ分子を適当な宿主細胞
中に導入する。本発明の受容体の発現を可能にする条件
下で、化合物または多数の化合物を含んでなるサンプル
の存在下で宿主細胞を培養する。以下の実施例２に記述
したように、受容体特性の変化を検出することができ
る。この方法を用いて、殺虫剤物質を見いだすことが可
能である。

【００２３】本発明の核酸は本発明の受容体に結合する
化合物を見いだすことも可能にする。これらの化合物を
同様に植物に対する殺虫剤として用いることができる。
例えば、本発明の核酸配列を含有し、そして対応する受
容体もしくはポリペプチドを発現する宿主細胞または遺
伝子産物自体を宿主細胞、受容体または個々のポリペプ
チドと少なくとも１つの化合物の相互作用を可能にする
条件下で化合物または化合物の混合物と接触させる。

【００２４】また、受容体の発現を変える物質を見いだ
すためにも、本発明の核酸を含有する宿主細胞またはト
ランスジェニック無脊椎動物を用いることができる。

【００２５】上記の本発明の核酸、ベクター及び調節領
域をさらに昆虫において機能的に類似したアセチルコリ
ン受容体の合成に関与するポリペプチドをコードする遺
伝子を見いだすために用いることができる。本発明で
は、機能的に類似した受容体はアミノ酸配列は本公開に
記述されるポリペプチドと異なるが本質的に同じ機能を
保有するポリペプチドを包含する受容体であると理解さ
れる。配列表及び図面の説明 ：配列番号１は位置１で始まり、
位置２８８６で終わる、単離されたＤａ７ ｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列を示す。配列番号１及び配列番号２は
Ｄａ７ ｃＤＮＡ配列から推定されるタンパク質のアミ
ノ酸配列も示す。

【００２６】配列番号３は位置１で始まり、位置３７０
０で終わる、単離されたＨｖａ７−１ ｃＤＮＡのヌク
レオチド配列を示す。配列番号３及び配列番号４はＨｖ
ａ７−１ ｃＤＮＡ配列から推定されるタンパク質のア
ミノ酸配列も示す。

【００２７】配列番号５は位置１で始まり、位置３１０
９で終わる、単離されたＨｖａ７−２ ｃＤＮＡのヌク
レオチド配列を示す。配列番号５及び配列番号６はＨｖ
ａ７−２ ｃＤＮＡ配列から推定されるタンパク質のア
ミノ酸配列も示す。

【００２８】図１はニコチンの添加後に実施例２に記述
したように組み換えで改変されている細胞中で起こる細
胞内カルシウムの増加を示す。細胞にＦｕｒａ−２−ア
セトキシメチルエステル（１％ウシ血清アルブミン及び
５ｍＭ塩化カルシウムを含有する無血清最小必須培地中
５−１０μＭ）を添加し、Ｎ−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（５
ｍＭ ＨＥＰＥＳ）緩衝Ｔｙｒｏｄｅ溶液で洗浄し、３
４０ｎｍ及び３８０ｎｍの波長の光で蛍光顕微鏡（Ｎｉ
ｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ）下で交互に照射した。測定点
は２つの波長でのビデオ画像対に対応する（画像当たり
の露出時間、１００ｍｓ）。２つの測定点の間の時間間
隔は３秒である。８画像を取った後（測定点４．０）、
ニコチンを５００μＭの最終濃度まで添加し、測定シリ
ーズを続けた。３８０ｎｍの波長の光を照射した場合の
細胞の蛍光強度を対応する３４０ｎｍでの強度で割り、
それにより比率を得る。

【００２９】

【実施例】実施例１ 記述されるポリヌクレオチド配列の単離 組み換えＤＮＡ技術の標準法を用いてポリヌクレオチド
を操作した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、等、１９８９）。ＧＣ
Ｇプログラムパッケージバージョン９．１（ＧＣＧ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎ
ｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）
を用いてヌクレオチド及びタンパク質配列の生物情報科
学処理を実施した。 部分ポリヌクレオチド配列 ホモオリゴマーアセチルコリン受容体を形成する能力が
知られている遺伝子からのタンパク質配列のコドンを逆
翻訳することにより縮重オリゴヌクレオチドを推定する
領域を同定するために配列比較（「Ｃｌｕｓｔａｌ
ｗ」）を用いた。全部で、５つのそのようなオリゴヌク
レオチド対をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のために
選択した。１つの組み合わせのみ（以下参照）がヘリオ
チス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ）ｃＤＮＡ及びドロソフィラ
ｃＤＮＡの両方から生成物を生じた。

【００３０】トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬（Ｇｉｂ
ｃｏ ＢＲＬ、製造業者の使用説明書に従って）を用い
て全ヘリオチス・ビレッセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ
ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）胚（孵化直前）からＲＮＡを単離
した。同じ方法をドロソフィラ胚（２５℃で２４時間）
に採用した。これらのＲＮＡの１０μｇを第一ｃＤＮＡ
鎖合成に用いた（第一ｃＤＮＡ鎖合成のためのスーパー
スクリプト前増幅システム（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ
Ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｔｅｍ ｆ
ｏｒ ｆｉｒｓｔ ｃＤＮＡ ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ）、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、製造業者の使用説
明書に従って、反応温度４５℃）。

【００３１】続いて、オリゴヌクレオチドα７−１ｓ：
（５’−ＧＡＹＧＴＩＧＡＹＧＡＲＡＡＲＡＡＹＣＡ−
３’）及びα７−２ａ：（５’−ＣＹＹＴＣＲＴＣＩＧ
ＣＲＣＴＲＴＴＲＴＡ−３’）を用いたポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）に上記の第一鎖ｃＤＮＡの１／１００
を各場合で用いた（組み換えＴａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）。ＰＣＲパラメーターは以下
の通りであった：Ｈｖａ７−１及びＨｖａ７−２：９４
℃、２分；３５回（９４℃、４５秒；５０℃、３０秒；
７２℃、６０秒）並びにＤａ７：９６℃、２分；３５回
（９６℃、４５秒；５０℃、３０秒；７２℃、６０
秒）。各場合で、これはドロソフィラｃＤＮＡの場合及
びヘリオチスｃＤＮＡの場合の両方でアガロースゲル
（１％）において約０．２ｋｂの検出できるバンドをも
たらした。ＤＮＡフラグメントをＳｒｆＳｃｒｉｐｔ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてサブクローン化し、
そしてそれらの配列を決定した後、２つの異なるＤＮＡ
フラグメントがヘリオチスｃＤＮＡから増幅されている
ことが分かり；これらは２２８−１１＝Ｈｖａ７−１
（部分的、１６５ｂｐを含有する）及び２２８−８＝Ｈ
ｖａ７−２（部分的、１７１ｂｐを含有する）であっ
た。ドロソフィラｃＤＮＡからは１つのＤＮＡフラグメ
ントのみが単離され；これは２４８−５＝Ｄａ７（部分
的、１５０ｂｐを含有する）であった。 ヘリオチス・ビレッセンス組織からのポリＡ含有ＲＮＡ
の単離及びｃＤＮＡライブラリーの構築 トリゾール試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、製造業者の使用
説明書に従って）を用いて全ヘリオチス・ビレッセンス
胚（孵化直前）からｃＤＮＡライブラリーＩのためのＲ
ＮＡを単離した。トリゾール試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲ
Ｌ、製造業者の使用説明書に従って）を用いて５００匹
のヘリオチス・ビレッセンス幼虫（段階４−５）からの
全頭神経節からｃＤＮＡライブラリーIIのためのＲＮＡ
を単離した。次に、Ｄｙｎａビーズ２８０（Ｄｙｎａ
ｌ）で精製することによりこれらのＲＮＡからポリＡ含
有ＲＮＡを単離した。続いて、これらのポリＡ含有ＲＮ
Ａの５μｇをλ−ＺＡＰＥ発現ベクターを用いたｃＤＮ
ＡライブラリーＩ及びIIの構築に用いた（ｃＤＮＡ合成
キット、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット及びＺＡＰ−ｃＤ
ＮＡ Ｇｉｇａｐａｃｋ III Ｇｏｌｄクローニンキッ
ト、全てＳｔｒａｔａｇｅｎｅから）。製造業者の使用
説明書と異なり、４５℃の合成温度でｃＤＮＡを合成す
るためにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｇｉｂｃ
ｏ ＢＲＬ）を用いた。さらに、放射性標識されたデオ
キシヌクレオシド三リン酸を添加しなかった。さらに、
合成されたｃＤＮＡをキット中に含まれるゲル濾過媒質
を通してではなく代わりにＳｉｚｅ Ｓｅｐ ４００
Ｓｐｕｎカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通して分画し
た。 完全なポリヌクレオチド配列 Ｈｖａ７−１クローンを単離する場合の一次スクリーニ
ングラウンドは別として、全てのスクリーニングをＤＩ
Ｇ系を用いて実施した（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎ
ｈｅｉｍからの全ての試薬及び消耗品、「Ｔｈｅ ＤＩ
Ｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ
Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」中の使
用説明書に従って、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ）。用いるＤＮＡプローブをジゴキシゲニンで標
識されたｄＵＴＰを用いてＰＣＲにより調製した。ハイ
ブリダイゼーションをＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で４２℃で一
晩実施した。標識されたＤＮＡをＸ線フィルム（Ｈｙｐ
ｅｒｆｉｌｍ ＭＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて化学
発光（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ）によりナイロン膜上に検出した。単離さ
れた遺伝子ライブラリープラスミドの最初の部分シーク
エンシングをＴ３及びＴ７プライマーを用いて同定目的
のために実施した（ＡＢＩプリズム色素ターミネーター
サイクルシークエンシングキット（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ
Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ）、ＡＢＩ、ＡＢＩ Ｐｒｉｓ
ｍ ３１０遺伝子分析器（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙ
ｚｅｒ）を用いる）。サイクルシークエンシングを用い
たプライマー歩行により、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ
により実施された委託シークエンシングとして、Ｈｖａ
７−１、Ｈｖａ７−２及びＤａ７の完全なポリヌクレオ
チド配列を決定した。 ａ．Ｄａ７クローンの単離 λファージ中のドロソフィラ・メラノガスタｃＤＮＡラ
イブラリーからの１０ ⁶個のファージ（Ｃａｎｔｏｎ−
Ｓ胚、２−１４時間、Ｕｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクター
中、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＤＩＧで標識された２４
８−５をプローブとして用いてスクリーニングした（製
造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の使用説明書に従っ
て）。フィルターを洗浄する場合の最高のストリンジェ
ンシーは０．２ｘ ＳＳＣ；０．１％ ＳＤＳ；４２℃；
２ ｘ １５分であった。１個のクローン（クローン４３
２−１）が単離され、そのインサートは２９４０ｂｐの
大きさであった（Ｄａ７、配列番号１）。この配列の最
も大きいオープンリーディングフレームは示される配列
の位置３７２で始まり、位置１８２２で終わる。これか
ら推定される７７０アミノ酸のポリペプチド（配列番号
２）は８７．０１ｋＤの計算分子量を有する。 ａ．Ｈｖａ７−１クローンの単離 ヘリオチス・ビレッセンス胚ｃＤＮＡライブラリー（ラ
イブラリーＩ）からの１０⁶個のファージがスクリーニ
ングに含まれた。３回のスクリーニングの１回目をα−
³²Ｐで標識された２２８−１１ ＤＮＡをプローブとし
て用いて実施した。Ｑｕｉｃｋ−ｈｙｂ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）中６８℃で１時間プローブをフィルターにハ
イブリダイズさせた。次に、フィルターを２ ｘ ＳＳ
Ｃ；０．１％ ＳＤＳ中室温で２回各１５分間、そして
０．１ ｘ ＳＳＣ；０．１％ ＳＤＳ中４２℃で２回各
３０分間洗浄した。ハイブリダイズしたプローブをＸＲ
Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）を用いて且つ増幅スクリ
ーン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて−８０℃で一晩オー
トラジオグラフィーにより検出した。さらに２回のスク
リーニングをＤＩＧ系（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）を用いて実施した。

【００３２】このスクリーニングで単離されたクローン
２４１−５は３６３０ｂｐのインサートを含有した。こ
のインサート（Ｈｖａ７−１、配列番号３）は示される
核酸配列の位置３３５で始まり、位置１８２１で終わる
最も長いオープンリーディングフレームを保有する。こ
れから推定される４９６アミノ酸のポリペプチド（配列
番号４）は５６．３６ｋＤの計算分子量を有する。 ａ．Ｈｖａ７−２クローンの単離 ヘリオチス・ビレッセンス神経節ｃＤＮＡライブラリー
（ライブラリーII）からの１０⁶個のファージがスクリ
ーニングに含まれた。Ｄｉｇで標識された２２８−８
ＤＮＡをプローブとして用いた。フィルターを洗浄する
場合の最高のストリンジェンシーは０．１ ｘ ＳＳＣ；
０．１％ ＳＤＳ；４２℃；２ ｘ １５分であった。

【００３３】このスクリーニングで単離されたクローン
２４１−５は３６３０ｂｐのインサートを含有した。こ
のインサート（Ｈｖａ７−２、配列番号５）は示される
核酸配列の位置９５で始まり、位置１５９８で終わる最
も長いオープンリーディングフレームを保有する。これ
から推定される５０１アミノ酸のポリペプチド（配列番
号６）は５６．７１ｋＤの計算分子量を有する。

【００３４】実施例２ 発現構築物の作製 ａ．Ｄａ７ 配列番号１の位置３７２から位置２６８１までの配列領
域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。
このために配列ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡ
ＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡＣＴＧ及びＣＧＡＧＡＣＡＡＴ
ＡＡＴＡＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＣＧＡＧを有するデオキ
シオリゴヌクレオチドを用いた。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
からのＰｆｕポリメラーゼを製造業者の使用説明書に従
ってＤＮＡポリメラーゼとして用いた。増幅後に、生成
されたセグメントを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ Ｒ
Ｉ及びＸｈｏ Ｉで消化し、そして同様にＥｃｏ ＲＩ及
びＸｈｏ Ｉで消化されたベクター、すなわち、ｐｃＤ
ＮＡ３．１／Ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクロ
ーン化した。 ｂ．Ｈｖａ７−１ 配列番号３の位置３３５から位置１８２２までの配列領
域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。
このために配列ＧＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧ
ＧＡＧＧＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＣＧＣＴＣＧＣＡＣ及び
ＧＣＣＴＣＧＡＧＣＧＡＣＡＣＣＡＴＧＡＴＧＴＧＴＧ
ＧＣＧＣを有するデオキシオリゴヌクレオチドを用い
た。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＰｆｕポリメラーゼを
製造業者の使用説明書に従ってＤＮＡポリメラーゼとし
て用いた。増幅後に、生成されたセグメントを制限エン
ドヌクレアーゼＨｉｎｄIII及びＸｈｏ Ｉで消化し、そ
して同様にＨｉｎｄIII及びＸｈｏ Ｉで消化されたベク
ター、すなわち、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化した。 ｃ．Ｈｖａ７−２ 配列番号５の位置９５から位置１５９７までの配列領域
をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。こ
のために配列ＧＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＴＡＴＧＧＣＣＣ
ＣＴＡＴＧＴＴＧ及びＴＴＧＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＴＧ
ＣＧＧＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＧを有するデオキシオリゴ
ヌクレオチドを用いた。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＰ
ｆｕポリメラーゼを製造業者の使用説明書に従ってＤＮ
Ａポリメラーゼとして用いた。増幅後に、生成されたセ
グメントを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIII及びＸ
ｈｏ Ｉで消化し、そして同様にＨｉｎｄIII及びＸｈｏ
Ｉで消化されたベクター、すなわち、ｐｃＤＮＡ３．
１／Ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化し
た。 ｄ．Ｈｖａ７−１／５ＨＴ₃及びＨｖａ７−２／５ＨＴ₃
キメラ 重複伸長の方法（Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎ等、１９９７）を
用いて、配列番号３の位置３３５から位置１０３６まで
の領域（Ｈｖａ７−１／５ＨＴ₃キメラ）及び配列番号
５の位置９５から位置７６３までの領域（Ｈｖａ７−２
／５ＨＴ₃キメラ）を各々ムス・ムスキュラス（Ｍｕｓ
ｍｕｓｃｕｌｕｓ）５−ＨＴ₃受容体ｃＤＮＡ（ＥＭ
ＢＬデータベース中の配列：Ｍ７７４４２５）の位置７
７８から位置１５２１までの領域に融合させた。次に、
ＴＡクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製造業者の
使用説明書に従って）によりそれら２つのフラグメント
をｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏベクター中にクローン化し
た。ベクター中のそれら２つのフラグメントの正しい方
向を含有する構築物をＴ７プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）を用いてシークエンシングにより同定した。 細胞培養及び遺伝子導入 Ｌ型Ｃａチャネル（Ｚｏｎｇ等、１９９５、Ｓｔｅｔｚ
ｅｒ等、１９９６）のα−サブユニットを発現するＨＥ
Ｋ２９３細胞を５％ ＣＯ₂及び２０℃から３７℃までで
ダルベッコの修正イーグル培地及び１０％ウシ胎仔血清
中で培養した。ＦｕＧＥＮＥ ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、
Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の使用説明書に従って遺伝
子導入に用いた。遺伝子導入後２４時間から４８時間ま
でで細胞をマイクロタイタープレート中に様々な密度で
接種した。ダルベッコの修正イーグル培地及び１０％ウ
シ胎仔血清及び１５０−５００μｇ／ｍｌのゼオシン
（Ｚｅｏｃｉｎ）／ｍｌ中で３から４週までの期間にわ
たって生育することにより、組み換えで改変された細胞
を選択した。個々の耐性クローンを以下に記述するよう
に分析した。 Ｆｕｒａ−２測定 細胞内カルシウム濃度の変化をＦｕｒａ−２を用いて測
定した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に２ｍＭ
のＦｕｒａ−２−アセトキシメチルエステル（Ｓｉｇｍ
ａ）を含有するストック溶液を１％ウシ血清アルブミン
及び５ｍＭ塩化カルシウムを含有する無血清最小必須培
地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で５−１０μＭの最終濃度
に希釈した。マイクロタイタープレート中でこの溶液中
で細胞を４５から６０分間までインキュベートした。次
に、細胞をＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−
Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（５ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ）緩衝Ｔｙｒｏｄｅ溶液（１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５
ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、
５ｍＭ ＮａＨＣＯ₃、１０ｍＭグルコースを含有するＨ
ＥＰＥＳ緩衝塩溶液）中で２回を洗浄した。１００μｌ
のＴｙｒｏｄｅバッファーをマイクロタイタープレート
のウェルに添加し、３４０ｎｍ及び３８０ｎｍの波長の
光で蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ）下で細
胞を交互に照射した。一連のビデオ画像（画像当たりの
露出時間１００ｍｓ）を３秒の中断で取り、デジタル化
された画像として画像分析コンピューター（Ｌｅｉｃ
ａ、Ｑｕａｎｔｉｍｅｔ ５７０）中に保存した。８画
像を取った後（図１の測定点４．０）、ニコチンを５０
０μＭの最終濃度まで添加し、測定シリーズを続けた。
３８０ｎｍの波長の光を照射した場合の細胞の蛍光強度
を対応する３４０ｎｍでの強度で割り、このようにして
カルシウム濃度の相対的増加を表す比率を得た（Ｇｒｙ
ｎｋｉｅｗｉｃｚ等、１９８５）。

【００３５】

【表１】

【００３６】

【表２】

【００３７】

【表３】

【００３８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Bayer Aktiengesellschaft <120> Nucleic acids which encode insect acetylcholine receptor subunits <130>9904058 <150> DE-198 19 829.9 <151> 1998-05-04 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2886 <212> DNA <213> Drosophila melanogaster <220> <221> CDS <222> (372)..(2681) <400> 1 ggcacgagaa aaagttgtgg tataaacttt tattgtagga aaacgcataa aaataataga 60 aaaacgctct tcgggttgta aagaaaataa gaagacaaaa gaaagacatg aaaacgttgc 120 aaacaataaa gcatatactt gccatattga tataaaggga aatcgtgaaa aggcggtgaa 180 aatttcgtaa gattagttgg tattaagggc agcccatgca cacagctaaa aagggaacta 240 aaaaaacccc gcacagaaca atgaaagctg cagcagctgg ataaggccga caaaaccgaa 300 aattatatta ttgtaatcta gtagagagca gacaacatat ccgctggcaa caaccaacac 360 cgaaagagac t atg aaa aat gca caa ctg aaa ctg act gaa gtt gac gat 410 Met Lys Asn Ala Gln Leu Lys Leu Thr Glu Val Asp Asp 1 5 10 gat gag ctg tgg ctg gca gta aga tta gcg cac tgc agc agc aac ttt 458 Asp Glu Leu Trp Leu Ala Val Arg Leu Ala His Cys Ser Ser Asn Phe 15 20 25 agc agc agt agc agc aca aga acc acc agc agc aac cag agg cac aac 506 Ser Ser Ser Ser Ser Thr Arg Thr Thr Ser Ser Asn Gln Arg His Asn 30 35 40 45 cag caa ctc aca aca ctg caa cca agg agc tta agt aca aaa cac cac 554 Gln Gln Leu Thr Thr Leu Gln Pro Arg Ser Leu Ser Thr Lys His His 50 55 60 agc aac att gca agc gag cag cac aat agc cag caa cag gag cca gca 602 Ser Asn Ile Ala Ser Glu Gln His Asn Ser Gln Gln Gln Glu Pro Ala 65 70 75 tcg aag gac gag gat gta gcc aac cac ggt aga agc aat gac cag cag 650 Ser Lys Asp Glu Asp Val Ala Asn His Gly Arg Ser Asn Asp Gln Gln 80 85 90 acg cat ctg caa cag cta gac agc agc aac atg ttg tcg cca aag aca 698 Thr His Leu Gln Gln Leu Asp Ser Ser Asn Met Leu Ser Pro Lys Thr 95 100 105 gcc gca gca gca act gct gcc ggc gat gaa gca aca acc caa caa cca 746 Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asp Glu Ala Thr Thr Gln Gln Pro 110 115 120 125 aca aac ata aga ctg tgt gca cgc aag cga caa cga ttg cgt cgc cga 794 Thr Asn Ile Arg Leu Cys Ala Arg Lys Arg Gln Arg Leu Arg Arg Arg 130 135 140 cga aaa aga aaa cca gca acc cca aac gaa aca gat atc aag aaa caa 842 Arg Lys Arg Lys Pro Ala Thr Pro Asn Glu Thr Asp Ile Lys Lys Gln 145 150 155 cag caa ctt agc atg cct ccc ttc aaa acg cgc aaa tcc acg gac acc 890 Gln Gln Leu Ser Met Pro Pro Phe Lys Thr Arg Lys Ser Thr Asp Thr 160 165 170 tac agc aca cca gca gca aca acc agc tgt ccg aca gcc acc tac atg 938 Tyr Ser Thr Pro Ala Ala Thr Thr Ser Cys Pro Thr Ala Thr Tyr Met 175 180 185 caa tgt cga gcc agc gac aat gag ttc agt att ccg ata tcg aga cat 986 Gln Cys Arg Ala Ser Asp Asn Glu Phe Ser Ile Pro Ile Ser Arg His 190 195 200 205 gat aga gta tcc acg gcc aca ttc gcc tgg gtg ttg cat gtg ctg cag 1034 Asp Arg Val Ser Thr Ala Thr Phe Ala Trp Val Leu His Val Leu Gln 210 215 220 gtg ctg ctc gtg tcg ctg caa cag tgg caa ctt cac gtg caa cag cga 1082 Val Leu Leu Val Ser Leu Gln Gln Trp Gln Leu His Val Gln Gln Arg 225 230 235 tcg gtg cta ctg ttc aga agg atc gca gcg agc acc atc gcc ttc att 1130 Ser Val Leu Leu Phe Arg Arg Ile Ala Ala Ser Thr Ile Ala Phe Ile 240 245 250 tcc tat tta ggc agc ttt gca gcg caa ctg aaa aat agc agc agc agc 1178 Ser Tyr Leu Gly Ser Phe Ala Ala Gln Leu Lys Asn Ser Ser Ser Ser 255 260 265 agt agc agc agc aac agc agc aac aac agc agc acg caa ata tta aac 1226 Ser Ser Ser Ser Asn Ser Ser Asn Asn Ser Ser Thr Gln Ile Leu Asn 270 275 280 285 gga ctt aat aaa cac tca tgg ata ttt tta ttg ata tat ttg aat tta 1274 Gly Leu Asn Lys His Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ile Tyr Leu Asn Leu 290 295 300 tct gct aaa gtt tgc cta gca gga tat cat gaa aag aga ctg tta cac 1322 Ser Ala Lys Val Cys Leu Ala Gly Tyr His Glu Lys Arg Leu Leu His 305 310 315 gat ctt ttg gat cct tat aat aca cta gaa cgt ccc gtt ctc aat gaa 1370 Asp Leu Leu Asp Pro Tyr Asn Thr Leu Glu Arg Pro Val Leu Asn Glu 320 325 330 tcg gac ccg tta caa tta agc ttt ggt tta act tta atg caa att atc 1418 Ser Asp Pro Leu Gln Leu Ser Phe Gly Leu Thr Leu Met Gln Ile Ile 335 340 345 gat gtg gac gag aaa aat caa ttg cta gtc act aat gtg tgg tta aaa 1466 Asp Val Asp Glu Lys Asn Gln Leu Leu Val Thr Asn Val Trp Leu Lys 350 355 360 365 ctg gag tgg aac gac atg aat ctc cgc tgg aac acc tcc gac tat ggc 1514 Leu Glu Trp Asn Asp Met Asn Leu Arg Trp Asn Thr Ser Asp Tyr Gly 370 375 380 gga gtt aag gat ctg cga ata ccg ccg cat cgc atc tgg aag ccg gac 1562 Gly Val Lys Asp Leu Arg Ile Pro Pro His Arg Ile Trp Lys Pro Asp 385 390 395 gtg ctg atg tac aac agt gcg gat gag gga ttt gac ggc acc tac cag 1610 Val Leu Met Tyr Asn Ser Ala Asp Glu Gly Phe Asp Gly Thr Tyr Gln 400 405 410 acg aac gtg gtg gtg cgg aac aac ggc tcg tgt cta tac gtt ccg ccg 1658 Thr Asn Val Val Val Arg Asn Asn Gly Ser Cys Leu Tyr Val Pro Pro 415 420 425 ggg atc ttc aag tcg acg tgc aag atc gac atc acg tgg ttc ccc ttc 1706 Gly Ile Phe Lys Ser Thr Cys Lys Ile Asp Ile Thr Trp Phe Pro Phe 430 435 440 445 gat gac cag cgg tgc gag atg aag ttc ggc agt tgg acc tac gac gga 1754 Asp Asp Gln Arg Cys Glu Met Lys Phe Gly Ser Trp Thr Tyr Asp Gly 450 455 460 ttc cag ctg gat tta caa tta caa gat gaa act ggc ggt gat atc agc 1802 Phe Gln Leu Asp Leu Gln Leu Gln Asp Glu Thr Gly Gly Asp Ile Ser 465 470 475 agt tac gtg ctc aac ggc gag tgg gaa cta ctg ggt gtg ccc ggc aaa 1850 Ser Tyr Val Leu Asn Gly Glu Trp Glu Leu Leu Gly Val Pro Gly Lys 480 485 490 cgt aac gag atc tat tac aac tgc tgc ccg gaa ccc tat ata gac atc 1898 Arg Asn Glu Ile Tyr Tyr Asn Cys Cys Pro Glu Pro Tyr Ile Asp Ile 495 500 505 acc ttc gcc atc atc atc cgc cga cga aca ctg tac tat ttc ttc aac 1946 Thr Phe Ala Ile Ile Ile Arg Arg Arg Thr Leu Tyr Tyr Phe Phe Asn 510 515 520 525 ctg atc ata cct tgt gta ctg att gcc tcc atg gcc ttg ctc gga ttc 1994 Leu Ile Ile Pro Cys Val Leu Ile Ala Ser Met Ala Leu Leu Gly Phe 530 535 540 acc ctg ccg cca gat tcg ggt gaa aaa tta tcg ctg ggt gtt acc atc 2042 Thr Leu Pro Pro Asp Ser Gly Glu Lys Leu Ser Leu Gly Val Thr Ile 545 550 555 ttg ctc tcg ctg acc gtg ttt ctg aat atg gtt gcc gag aca atg ccg 2090 Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Leu Asn Met Val Ala Glu Thr Met Pro 560 565 570 gct act tcc gat gcg gtg cca ttg tgg ata cgc atc gtg ttt ttg tgc 2138 Ala Thr Ser Asp Ala Val Pro Leu Trp Ile Arg Ile Val Phe Leu Cys 575 580 585 tgg ctg cca tgg ata ttg cga atg agt cgc cca gga cga ccg ctg atc 2186 Trp Leu Pro Trp Ile Leu Arg Met Ser Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile 590 595 600 605 cta gag ttc ccg acc acg ccc tgt tcg gac aca tcc tcc gag cgg aag 2234 Leu Glu Phe Pro Thr Thr Pro Cys Ser Asp Thr Ser Ser Glu Arg Lys 610 615 620 cac cag ata ctc tcc gac gtt gag ctg aaa gag cgc tcg tcg aaa tcg 2282 His Gln Ile Leu Ser Asp Val Glu Leu Lys Glu Arg Ser Ser Lys Ser 625 630 635 ctg ctg gcc aac gta cta gac atc gat gat gac ttc cgg cac aat tgt 2330 Leu Leu Ala Asn Val Leu Asp Ile Asp Asp Asp Phe Arg His Asn Cys 640 645 650 cgc ccc atg acg ccc ggc gga aca ctg cca cac aac ccg gct ttc tat 2378 Arg Pro Met Thr Pro Gly Gly Thr Leu Pro His Asn Pro Ala Phe Tyr 655 660 665 cgc acg gtt tat gga caa ggc gac gat ggc agc att ggg cca att ggc 2426 Arg Thr Val Tyr Gly Gln Gly Asp Asp Gly Ser Ile Gly Pro Ile Gly 670 675 680 685 agc acc cga atg ccg gat gcg gtc acc cat cat acg tgc atc aaa tca 2474 Ser Thr Arg Met Pro Asp Ala Val Thr His His Thr Cys Ile Lys Ser 690 695 700 tca act gaa tat gaa tta ggt tta atc tta aag gaa att cgc ttt ata 2522 Ser Thr Glu Tyr Glu Leu Gly Leu Ile Leu Lys Glu Ile Arg Phe Ile 705 710 715 act gat cag cta cgt aaa gat gac gag tgc aat gac att gcc aat gat 2570 Thr Asp Gln Leu Arg Lys Asp Asp Glu Cys Asn Asp Ile Ala Asn Asp 720 725 730 tgg aaa ttt gca gct atg gtc gtt gac aga ctg tgc ctt atc ata ttc 2618 Trp Lys Phe Ala Ala Met Val Val Asp Arg Leu Cys Leu Ile Ile Phe 735 740 745 aca atg ttc gca ata tta gcc aca ata gct gta cta cta tcg gca cca 2666 Thr Met Phe Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala Val Leu Leu Ser Ala Pro 750 755 760 765 cat att att gtc tcg tagccatatg ggcgaggtgg ttattgttat tggttttatt 2721 His Ile Ile Val Ser 770 ataaaatcaa tttgttaatt attaaattaa taacgaaact ctttaagtaa attaaaacta 2781 aaaagacact aaaaaagcac aaaaaaatag gaaaatacat gataaaaccc atgaactaaa 2841 taatacatcc aagaaaaacc aaaacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2886 <210> 3 <211> 3701 <212> DNA <213> Heliothis virescens <220> <221> CDS <222> (335)..(1822) <400> 3 ggcacgagcc gctgccccac ggtcggccgc actccgctga acaacaatgc tcaaaaacac 60 gccgtgactc cacacacatc ccctcggcgc agtaggcgat gtttgaggat cggacggcac 120 gcgtggccgt cggcgagcgg tcgtgaacaa gttgcataca tatgaaaacc gtaaaaagat 180 tgaattttaa gccgatcgtg ttcgatagat cctaatagag aagcgggagt gcggcgtttg 240 gtaggcgggg gtcgagtcgc gcggtcgggg gaaatggcgc ggcgcggggc ggcggcggcg 300 gcggcgcgcg gcgcggcggc gtcgcggcgc tgac atg ggc ggg cgg gcg cgc cgc 355 Met Gly Gly Arg Ala Arg Arg 1 5 tcg cac ttg gcg gcg ccc gcg ggc ctg ctg ctg ctg ctg tgc ctg ctc 403 Ser His Leu Ala Ala Pro Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Cys Leu Leu 10 15 20 tgg ccg agg ggg gca cgc tgc ggg tac cac gag aag cgg cta ctg cac 451 Trp Pro Arg Gly Ala Arg Cys Gly Tyr His Glu Lys Arg Leu Leu His 25 30 35 cac cta ttg gac cac tac aac gta ctg gag agg ccc gtc gtc aac gag 499 His Leu Leu Asp His Tyr Asn Val Leu Glu Arg Pro Val Val Asn Glu 40 45 50 55 agc gac ccg ctg cag ctc tcc ttc ggc ctc acg ctc atg cag atc atc 547 Ser Asp Pro Leu Gln Leu Ser Phe Gly Leu Thr Leu Met Gln Ile Ile 60 65 70 gac gtg gac gag aag aac cag ctt tta ata aca aac atc tgg cta aaa 595 Asp Val Asp Glu Lys Asn Gln Leu Leu Ile Thr Asn Ile Trp Leu Lys 75 80 85 cta gag tgg aat gat atg aac ttg agg tgg aac act tca gat ttc ggc 643 Leu Glu Trp Asn Asp Met Asn Leu Arg Trp Asn Thr Ser Asp Phe Gly 90 95 100 ggg gtc aaa gat tta aga gtg cca ccc cac aga cta tgg aaa cca gac 691 Gly Val Lys Asp Leu Arg Val Pro Pro His Arg Leu Trp Lys Pro Asp 105 110 115 gtc ctt atg tac aac agc gcg gac gaa ggg ttc gac agc acg tat cca 739 Val Leu Met Tyr Asn Ser Ala Asp Glu Gly Phe Asp Ser Thr Tyr Pro 120 125 130 135 acg aac gtg gtg gtg cgg aac aac ggc tcg tgt ctg tac gtg ccg ccc 787 Thr Asn Val Val Val Arg Asn Asn Gly Ser Cys Leu Tyr Val Pro Pro 140 145 150 ggc atc ttc aag agc acc tgc aag atc gac atc acc tgg ttc ccc ttc 835 Gly Ile Phe Lys Ser Thr Cys Lys Ile Asp Ile Thr Trp Phe Pro Phe 155 160 165 gac gac caa cga tgc gag atg aag ttt ggc agc tgg act tat gat ggt 883 Asp Asp Gln Arg Cys Glu Met Lys Phe Gly Ser Trp Thr Tyr Asp Gly 170 175 180 tat cag ttg gat cta caa cta cag gat gaa ggg ggc gga gat ata agc 931 Tyr Gln Leu Asp Leu Gln Leu Gln Asp Glu Gly Gly Gly Asp Ile Ser 185 190 195 agt ttt gtc acg aat ggc gaa tgg gag tta ata gga gtc ccc ggc aag 979 Ser Phe Val Thr Asn Gly Glu Trp Glu Leu Ile Gly Val Pro Gly Lys 200 205 210 215 cgc aac gag atc tac tac aac tgt tgt ccg gag cca tac atc gac atc 1027 Arg Asn Glu Ile Tyr Tyr Asn Cys Cys Pro Glu Pro Tyr Ile Asp Ile 220 225 230 acg ttt gcg gtg gtg atc cgg agg aaa acg ctc tac tac ttc ttc aat 1075 Thr Phe Ala Val Val Ile Arg Arg Lys Thr Leu Tyr Tyr Phe Phe Asn 235 240 245 ctg atc gtg ccc tgc gtg ctc atc gcc tcc atg gct cta ttg ggg ttc 1123 Leu Ile Val Pro Cys Val Leu Ile Ala Ser Met Ala Leu Leu Gly Phe 250 255 260 acc ttg cct cca gac tcc gga gaa aag ttg tct tta ggt gtg acg ata 1171 Thr Leu Pro Pro Asp Ser Gly Glu Lys Leu Ser Leu Gly Val Thr Ile 265 270 275 tta ctg tcg ttg acg gtg ttc ctc aac atg gtg gcg gag acg atg cca 1219 Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Leu Asn Met Val Ala Glu Thr Met Pro 280 285 290 295 gcg acg tcg gac gcc gtg ccc ttg ctc ggc acc tac ttc aac tgc atc 1267 Ala Thr Ser Asp Ala Val Pro Leu Leu Gly Thr Tyr Phe Asn Cys Ile 300 305 310 atg ttc atg gtg gct tcc tcc gtc gtc tcc acc ata ctg atc ctc aac 1315 Met Phe Met Val Ala Ser Ser Val Val Ser Thr Ile Leu Ile Leu Asn 315 320 325 tac cac cac cgg cac gca gac act cac gaa atg agt gat tgg att cgt 1363 Tyr His His Arg His Ala Asp Thr His Glu Met Ser Asp Trp Ile Arg 330 335 340 tgc gtg ttc ctt tat tgg ctg ccg tgg gtg ctg cgc atg tca cgg ccc 1411 Cys Val Phe Leu Tyr Trp Leu Pro Trp Val Leu Arg Met Ser Arg Pro 345 350 355 ggc tcg gcg acg acg ccg ccg ccg gcg cgc gta cct ccg ccg ccg gac 1459 Gly Ser Ala Thr Thr Pro Pro Pro Ala Arg Val Pro Pro Pro Pro Asp 360 365 370 375 ctg gag ctg cgc gag cgc tcc tcc aag tcg ctc cta gcg aac gtg ctc 1507 Leu Glu Leu Arg Glu Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Ala Asn Val Leu 380 385 390 gac atc gat gac gac ttc cgc cac ccg caa gcg cag cag ccg caa tgc 1555 Asp Ile Asp Asp Asp Phe Arg His Pro Gln Ala Gln Gln Pro Gln Cys 395 400 405 tgc cga tac tac agg ggg ggt gag gag aat ggc gcg ggg ttg gcg gcg 1603 Cys Arg Tyr Tyr Arg Gly Gly Glu Glu Asn Gly Ala Gly Leu Ala Ala 410 415 420 cac agt tgc ttc ggt gtc gac tac gag ctc tcc ctc att ctg aag gag 1651 His Ser Cys Phe Gly Val Asp Tyr Glu Leu Ser Leu Ile Leu Lys Glu 425 430 435 att aga gtc atc aca gat cag atg cgc aag gac gac gaa gat gcg gac 1699 Ile Arg Val Ile Thr Asp Gln Met Arg Lys Asp Asp Glu Asp Ala Asp 440 445 450 455 att tcg cgc gac tgg aag ttc gcc gcc atg gtc gtg gac aga ctg tgc 1747 Ile Ser Arg Asp Trp Lys Phe Ala Ala Met Val Val Asp Arg Leu Cys 460 465 470 ctt att atc ttt acc ctg ttc aca atc atc gcc acg cta gcc gtg ctg 1795 Leu Ile Ile Phe Thr Leu Phe Thr Ile Ile Ala Thr Leu Ala Val Leu 475 480 485 ctg tcc gcg cca cac atc atg gtg tcg tagcgacccg cccgcttgcg 1842 Leu Ser Ala Pro His Ile Met Val Ser 490 495 gatacgcatg cgaaaagttc tgtgataccg cgaatatttg ttaagttgtg atgagcgaag 1902 tggcgcggac ggtgacgccg cggcgtcgga gttgccgccg cctgcctcgc cgcccgcgcc 1962 cccctgtaga cataagttac cgctgactgc caaccctgta cgttcaacaa ataactgccc 2022 atccgactaa cgtcttttat ccccttgaaa aattcagcga ttgtgtaccc ctttcttcca 2082 agaatacaat gacaaatggt cgtcacgctc agtggaatca atcccgtact cttcgcccga 2142 tatttccctt agggtatgtc acgagtttga atgagcggtt ccgtatcaga cgttccgtcc 2202 ccggaacggt cgtcccctgc gataaagtgg cagtacgtgc tatacaggca cttaaggccg 2262 ccacgccacg gcgccgcggt gcgctcgggc cgcgaacccg cgaccctcac cgctgcaagt 2322 ggccacccac tagacaagac tgcggcagaa aatatttgca caaaaacgtc ttccttctta 2382 ccgatgaacg acctgattcg catttaaaat taaactttgt tagaacttct tcgattcttg 2442 aaatctattg tacagtttag agtttgggcg gtgaaacaat ggccctttgt ttccttcttg 2502 ttcgattcca tgaatcgtgg ttataatccc tagttttatt ttcggatata tttgtgtcag 2562 tagctagtat agaactttac aaacaatgtt gattcaattg gtacaggttg tgatatgcct 2622 cgttgtgaac gggtccgata ttgttataaa tggtaaaata cccatggcta tagcttaata 2682 aatcgttcgt taaaagttgt agttaaacaa atattatttt aataaagtca tatctgggtc 2742 ttccggaacg acttttacaa ataattaaat tacatattaa tatcacgttt gtacttcttt 2802 ccatacagtt acagtaattc gtatgctgaa aataatatta gcttgtaaaa ttttcttctt 2862 cgaaaattta ttcaaacaga tgcgaccatc gtttcaaaca tttacatgta atatagaact 2922 cattttataa gatatacaac attttataag tacaagaagt tgtaacatga accggttttt 2982 cgttacatag agggtataac acaaaggtgc ctacatattg acagatgcga agcacgatca 3042 gttgataagc acaggtacac tatatcctga catccgacag tcctgccgct cgtctgccac 3102 actcggaaac attcgacagt tcagtttact gctccgccat catcgattgt taagtttgtt 3162 gttctaactc atcgcattca tttcattcaa aaacattgta aacctctcaa ggggaaaacg 3222 tgttgtaaac agtgagagtg cgcgggtaca accgacacgc gaatgtaccc tcgcaaggct 3282 cctgtaatgt tttcctcttc cgaggtgttg ctgagagtaa tcttagacgg tccgatggaa 3342 gttgcggacc ggatatgatt acaagtcaat gtttttaagt catccgttta tttattgtta 3402 tatcttctta ccattcgcta gaggttgtgt gacgacccgg acggtgggcg ccgcaacccg 3462 cacacgcggg gttccatctt tgtattagat ggaagttgtg cggcatctct ccgtcggcaa 3522 tgggacaacc cgttgtcccc aacatttgtt caattgttag ggttaactct gaattgcact 3582 ttgtttatta aatataaacg aatgaaacaa aaaaaaaaaa aaaaaactcg agagtacttc 3642 tagagcggcc gcgggcccat cgattttcca cccgggtggg gtaccargta agtgtaccc 3701 <210> 5 <211> 3109 <212> DNA <213> Heliothis virescens <220> <221> CDS <222> (95)..(1597) <400> 5 ggcacgagcc ggccgcacgt tgtcccaggc cgcatgagcg cgccggcgtg ctagcgcagc 60 gtgcgcgggt gtggtatgcc cgcgcgtcgc cgct atg gcc cct atg ttg gcg gcc 115 Met Ala Pro Met Leu Ala Ala 1 5 ttg gcg ctg ctg gct ttg ctg ccc gta tcg gag caa ggt cct cac gag 163 Leu Ala Leu Leu Ala Leu Leu Pro Val Ser Glu Gln Gly Pro His Glu 10 15 20 aag aga ctc ctg aac gcg ttg ctg gcg aac tac aac acc ctg gag cga 211 Lys Arg Leu Leu Asn Ala Leu Leu Ala Asn Tyr Asn Thr Leu Glu Arg 25 30 35 ccg gtg gcc aac gag agc gaa ccg cta gag gtc agg ttc ggc ttg acc 259 Pro Val Ala Asn Glu Ser Glu Pro Leu Glu Val Arg Phe Gly Leu Thr 40 45 50 55 ttg cag caa atc att gac gtg gac gag aag aat caa cta ctt ata acc 307 Leu Gln Gln Ile Ile Asp Val Asp Glu Lys Asn Gln Leu Leu Ile Thr 60 65 70 aat ata tgg ctg tcg ttg gag tgg aat gac tac aac ctg agg tgg aac 355 Asn Ile Trp Leu Ser Leu Glu Trp Asn Asp Tyr Asn Leu Arg Trp Asn 75 80 85 gac agc gag tat ggc ggg gtc aag gac ctc agg atc acg ccc aac aag 403 Asp Ser Glu Tyr Gly Gly Val Lys Asp Leu Arg Ile Thr Pro Asn Lys 90 95 100 ttg tgg aag ccg gac gtc ctt atg tat aat agt gct gac gag ggt ttt 451 Leu Trp Lys Pro Asp Val Leu Met Tyr Asn Ser Ala Asp Glu Gly Phe 105 110 115 gac ggg acc tac cag acc aac gtg gtg gtc aga agc ggc ggc agt tgc 499 Asp Gly Thr Tyr Gln Thr Asn Val Val Val Arg Ser Gly Gly Ser Cys 120 125 130 135 ctg tac gtg cca cct ggc ata ttc aag agc aca tgc aag atg gac atc 547 Leu Tyr Val Pro Pro Gly Ile Phe Lys Ser Thr Cys Lys Met Asp Ile 140 145 150 gcg tgg ttt ccc ttc gac gac caa cac tgt gat atg aag ttc ggt agc 595 Ala Trp Phe Pro Phe Asp Asp Gln His Cys Asp Met Lys Phe Gly Ser 155 160 165 tgg aca tat gac ggc aat cag ttg gat ctg gtg cta aaa gat gag gca 643 Trp Thr Tyr Asp Gly Asn Gln Leu Asp Leu Val Leu Lys Asp Glu Ala 170 175 180 ggc ggc gat cta tcg gac ttc ata aca aat ggg gag tgg tat cta ata 691 Gly Gly Asp Leu Ser Asp Phe Ile Thr Asn Gly Glu Trp Tyr Leu Ile 185 190 195 gga atg cca ggc aaa aag aac aca ata aca tac gcg tgc tgc ccc gag 739 Gly Met Pro Gly Lys Lys Asn Thr Ile Thr Tyr Ala Cys Cys Pro Glu 200 205 210 215 ccc tac gtg gac gtc acc ttc acc atc atg ata aga aga cga acc ttg 787 Pro Tyr Val Asp Val Thr Phe Thr Ile Met Ile Arg Arg Arg Thr Leu 220 225 230 tac tac ttc ttc aac ctg atc gtc ccg tgc gtg ctg atc tca tcg atg 835 Tyr Tyr Phe Phe Asn Leu Ile Val Pro Cys Val Leu Ile Ser Ser Met 235 240 245 gca ctc ctc ggc ttc aca ctg cca cca gac tcc gga gag aaa ctc aca 883 Ala Leu Leu Gly Phe Thr Leu Pro Pro Asp Ser Gly Glu Lys Leu Thr 250 255 260 ctt gga gtc act att ctt cta tcg ctg acg gtg ttc ctc aac ctg gta 931 Leu Gly Val Thr Ile Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Leu Asn Leu Val 265 270 275 gcc gag acc ctg cca cag gtc tcc gac gct atc ccc ctg tta ggg acg 979 Ala Glu Thr Leu Pro Gln Val Ser Asp Ala Ile Pro Leu Leu Gly Thr 280 285 290 295 tac ttc aat tgc atc atg ttc atg gta gcg tcg tct gtg gta ctg act 1027 Tyr Phe Asn Cys Ile Met Phe Met Val Ala Ser Ser Val Val Leu Thr 300 305 310 gtg gtg gta ctc aat tac cac cat cga aca gct gat ata cat gaa atg 1075 Val Val Val Leu Asn Tyr His His Arg Thr Ala Asp Ile His Glu Met 315 320 325 cca cag tgg ata aaa tca gta ttc cta caa tgg ttg cca tgg ata ctg 1123 Pro Gln Trp Ile Lys Ser Val Phe Leu Gln Trp Leu Pro Trp Ile Leu 330 335 340 cga atg tcg agg cca ggg aag aag atc acc agg aag act ata atg atg 1171 Arg Met Ser Arg Pro Gly Lys Lys Ile Thr Arg Lys Thr Ile Met Met 345 350 355 aac acg agg atg agg gag ctg gaa ctg aag gag agg tcg tcg aag tcc 1219 Asn Thr Arg Met Arg Glu Leu Glu Leu Lys Glu Arg Ser Ser Lys Ser 360 365 370 375 ttg ctg gcg aat gtt cta gat att gat gat gac ttc aga cac ggc cct 1267 Leu Leu Ala Asn Val Leu Asp Ile Asp Asp Asp Phe Arg His Gly Pro 380 385 390 ccg cct cct aac agt act gcc tcg acc ggg aat ttg gga cct ggg tgc 1315 Pro Pro Pro Asn Ser Thr Ala Ser Thr Gly Asn Leu Gly Pro Gly Cys 395 400 405 tca ata ttc cgc acg gat ttc cgt cgg tcg ttc gtc cgt ccg tcc acg 1363 Ser Ile Phe Arg Thr Asp Phe Arg Arg Ser Phe Val Arg Pro Ser Thr 410 415 420 atg gaa gac gtg ggc ggc ggg ctg ggt agc cac cat cgc gag ctg cac 1411 Met Glu Asp Val Gly Gly Gly Leu Gly Ser His His Arg Glu Leu His 425 430 435 ctc ata ctg aga gag ctg cag ttc atc acg gcc agg atg aag aag gct 1459 Leu Ile Leu Arg Glu Leu Gln Phe Ile Thr Ala Arg Met Lys Lys Ala 440 445 450 455 gat gag gaa gcc gag ctg atc agc gac tgg aag ttt gct gcg atg gtt 1507 Asp Glu Glu Ala Glu Leu Ile Ser Asp Trp Lys Phe Ala Ala Met Val 460 465 470 gtt gat agg ttt tgc ctg ttc gtg ttc aca ctt ttc aca atc atc gcg 1555 Val Asp Arg Phe Cys Leu Phe Val Phe Thr Leu Phe Thr Ile Ile Ala 475 480 485 aca gta gct gtc ctg tta tcg gca ccg cat atc atc gtg caa 1597 Thr Val Ala Val Leu Leu Ser Ala Pro His Ile Ile Val Gln 490 495 500 tgaaccaacc actgagccgg caactccggc gcatgaatga gagaaataat tattagatcg 1657 ccgatttgta attataattg ataatgtaat taaattaaat acgtggttga aacgcacacg 1717 tctccataac aaagtcttaa gacattaaat tatgataaat ttacatattg tagttaagtc 1777 gagtgttgat ggaaatttta gccggcgcaa ggagtttcgt gaaggtctgt atatattttt 1837 tcttattgtt gtatattgta tcgttgttca tgttttcttt caggaagtga gctttgtact 1897 gtttgtttct tcgatggcag gtgcacttca gttcaggctg aaatttccat taacatttat 1957 ttaaacaaat gtgatgttga ctaggatgtt atacagataa atgttgacgt gtataatttg 2017 ttaaaataaa caatattaat tactattact aaacgatatt ataaacgaag tactaacgag 2077 ggttacttta atgggaagaa cgctaagctg gcacagagtt gcattaattt gaaaaaagaa 2137 attacggaaa aaagtttatt gaaaattgaa ctttttggaa ggaaagtaac gtttgatcaa 2197 aaaagtttgt aaaacgaaag ttcggttctg cgccaatact ggaattaaaa ttctcgtaaa 2257 tattagggaa aagaaggtcc tttaaaacaa aagatttgaa ccggcatcct ttttacaagt 2317 aatgagggat cacagatgat gacaaaaaac cttagggtat ataagtaatg tacataatgg 2377 atcaaatatc ggtagagtca agaatagtta acgatttaag attattccat tcgatattaa 2437 aattcgatta gcgattgtcg ctgcgtctac tttgatacat atcgatttga atcgatattg 2497 tataaattta gatagatcgg acattagtaa tgagtatgga cgttttaatt tttaaaaaag 2557 aatgtactac gaagattaaa tccaggaatt gttaaacagt tatggaattg ataagaaatc 2617 aacaattaat acggaaccaa aggtagacta ggtgtagcat caggagattg aattaaaaca 2677 taaattagga ccgacttaaa tggaacttgc gagtgtattg ataacttttt aatttaaaaa 2737 ctcattgtcg attaaatgga gaataacttt tgatctctcg tatcgataaa tgctcactta 2797 actatcgata gcgtaatatt ataactgtta gtatatcgat atgggagtaa gtcactagca 2857 tcagaaatag tcattaatta ggaatcggtt tgtgttaatg ttatgcttag cgaaaatatt 2917 acaatgctgt tgatatcact aaccatcacg taaccatatt gataaaatgt aaatacagaa 2977 tattgcggtg tgtatttgta tataaatttt agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aactcgagag 3037 tacttctaga gcggccgcgg gcccatcgat tttccacccg ggtggggtac caggtaagtg 3097 tacccaattc gc 3109

【図面の簡単な説明】

【図１】ニコチンの添加後に実施例２に記述したように
組み換えで改変されている細胞中で起こる細胞内カルシ
ウムの増加を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ナドヤ・エラース ドイツ50670ケルン・シユタインフエルダ ーガツセ９ (72)発明者 トマス・シユルテ ドイツ51061ケルン・アンデアルテン６

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号１、配列番号３または配
   列番号５の配列、 （ｂ）（ａ）に定義された配列の少なくとも１４塩基対
   の長さの部分配列、 （ｃ）６０℃で２ ｘ ＳＳＣ中、好ましくは６０℃で
   ０．５ｘ ＳＳＣ中、特に好ましくは６０℃で０．２ ｘ
   ＳＳＣ中で（ａ）に定義された配列とハイブリダイズ
   する配列、 （ｄ）配列番号１の位置１２９５ないし位置２１９５の
   間、または配列番号３の位置４３２ないし位置１３１８
   の間、 または配列番号５の位置１５４ないし位置１１２３の間
   で、（ａ）に定義された配列と少なくとも７０％の同一
   性を示す配列、 （ｅ）（ａ）に定義された配列に相補的な配列、及び （ｆ）遺伝暗号の縮重のために、（ａ）ないし（ｄ）に
   定義された配列と同じアミノ酸配列をコードする配列か
   ら選択される配列を含んでなる核酸。
2. 【請求項２】 請求項１の少なくとも１つの核酸を含ん
   でなるベクター。
3. 【請求項３】 原核または真核細胞における核酸の発現
   を保証する調節配列に核酸が機能的に連結されることを
   特徴とする、請求項２のベクター。
4. 【請求項４】 請求項１の核酸または請求項２もしくは
   ３のベクターを含有する宿主細胞。
5. 【請求項５】 原核または真核細胞であることを特徴と
   する、請求項４の宿主細胞。
6. 【請求項６】 原核細胞がエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃ
   ｏｌｉ）であることを特徴とする、請求項５の宿主細
   胞。
7. 【請求項７】 真核細胞が哺乳類細胞または昆虫細胞で
   あることを特徴とする、請求項５の宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項１の核酸によりコードされるポリ
   ペプチド。
9. 【請求項９】 請求項８の少なくとも１つのポリペプチ
   ドを含んでなるアセチルコリン受容体。
10. 【請求項１０】 （ａ）請求項１の核酸の発現を保証す
    る条件下で請求項４ないし７のいずれかの宿主細胞を培
    養し、そして（ｂ）細胞または培養培地からポリペプチ
    ドを単離することを含んでなる、請求項８のポリペプチ
    ドの製造方法。
11. 【請求項１１】 請求項８のポリペプチドまたは請求項
    ９の受容体と特異的に反応する抗体。
12. 【請求項１２】 請求項１の核酸を含有するトランスジ
    ェニック無脊椎動物。
13. 【請求項１３】 ドロソフィラ・メラノガスタ（Ｄｒｏ
    ｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）またはセ
    ノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄ
    ｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）であることを特徴とする、
    請求項１２のトランスジェニック無脊椎動物。
14. 【請求項１４】 請求項１の核酸または請求項２もしく
    は３のベクターを導入することを含んでなる、請求項１
    ２または１３のトランスジェニック無脊椎動物の製造方
    法。
15. 【請求項１５】 請求項１２または１３の無脊椎動物の
    トランスジェニック子孫。
16. 【請求項１６】 以下の工程： （ａ）それ自体既知の方法で完全に化学合成を実施する
    か、または（ｂ）オリゴヌクレオチドを化学的に合成
    し、オリゴヌクレオチドを標識し、オリゴヌクレオチド
    を昆虫ｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡにハイブリダイズ
    させ、陽性クローンを選択し、そして陽性クローンから
    ハイブリダイズするＤＮＡを単離するか、または（ｃ）
    オリゴヌクレオチドを化学的に合成し、そしてＰＣＲに
    より標的ＤＮＡを増幅することを含んでなる、請求項１
    の核酸の製造方法。
17. 【請求項１７】 昆虫細胞において請求項１の核酸の転
    写を自然に制御し、そして特異的発現を保証する調節領
    域。
18. 【請求項１８】 以下の工程： （ａ）請求項４ないし７のいずれかの宿主細胞を与え、 （ｂ）化合物または多数の化合物を含んでなるサンプル
    の存在下で宿主細胞を培養し、そして （ｃ）改変された受容体特性を検出することを含んでな
    る、植物保護のための新規な有効化合物、特に請求項９
    の受容体の導電性を変える化合物の発見方法。
19. 【請求項１９】 以下の工程： （ａ）請求項４ないし７のいずれかの宿主細胞、請求項
    ８のポリペプチドまたは請求項９の受容体を宿主細胞、
    ポリペプチドまたは受容体と化合物の相互作用を可能に
    する条件下で化合物または化合物の混合物と接触させ、
    そして（ｂ）受容体に特異的に結合する化合物を決定す
    ることを包含する、請求項９の受容体に結合する化合物
    の発見方法。
20. 【請求項２０】 以下の工程： （ａ）請求項４ないし７のいずれかの宿主細胞または請
    求項１１もしくは１２のトランスジェニック無脊椎動物
    を化合物または化合物の混合物と接触させ、 （ｂ）受容体濃度を測定し、そして （ｃ）受容体の発現に特異的に影響を及ぼす化合物を決
    定することを含んでなる、請求項９の受容体の発現を変
    える化合物の発見方法。
21. 【請求項２１】 植物保護のための新規な有効化合物を
    発見するためまたは昆虫において機能的に類似したアセ
    チルコリン受容体を合成することに関与するポリペプチ
    ドをコードする遺伝子を発見するための請求項１の少な
    くとも１つの核酸、請求項２もしくは３のあるベクタ
    ー、請求項１６のある調節領域または請求項１１のある
    抗体の使用。