JP2001224383A - 新規な昆虫アセチルコリン受容体βサブユニットをコードする核酸 - Google Patents
新規な昆虫アセチルコリン受容体βサブユニットをコードする核酸Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 昆虫のアセチルコリン受容体をコードする核
酸の提供。 【解決手段】 昆虫アセチルコリン受容体βサブユニッ
トをコードしている核酸、およびそのようなアセチルコ
リン受容体βサブユニットの生物学的機能を発揮するポ
リペプチド、ならびに特に作物保護のための活性化合物
を発見するためのそれらの使用。
酸の提供。 【解決手段】 昆虫アセチルコリン受容体βサブユニッ
トをコードしている核酸、およびそのようなアセチルコ
リン受容体βサブユニットの生物学的機能を発揮するポ
リペプチド、ならびに特に作物保護のための活性化合物
を発見するためのそれらの使用。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、昆虫アセチルコリ
ン受容体βサブユニットをコードする核酸、およびその
ようなアセチルコリン受容体βサブユニットの生物学的
機能を有するポリペプチド、ならびに特に作物保護のた
めの活性化合物を発見するためのそれらの使用に関す
る。
ン受容体βサブユニットをコードする核酸、およびその
ようなアセチルコリン受容体βサブユニットの生物学的
機能を有するポリペプチド、ならびに特に作物保護のた
めの活性化合物を発見するためのそれらの使用に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ニコチン性アセチルコリン受容体は、動
物界での神経伝達において役割を演じるリガンド調節性
イオンチャンネルである。アセチルコリンもしくは他の
作動剤の受容体への結合は、チャンネルの一時的開口を
引き起こし、そしてカチオンを通過させる。受容体は、
細孔の周囲に配置された５個のサブユニットからなると
推測されている。これらのサブユニットの各々は、細胞
外Ｎ末端部分と、それに続く３種の膜貫通領域、細胞内
部分、および第４の膜貫通領域とＣ末端部分からなるタ
ンパク質である。あるサブユニットは、それらの細胞外
部分上に、リガンド、例えばアセチルコリンに対する結
合部位を担持している。２つの近接するシステインがこ
の結合部位の成分であり、それ故、すべてのリガンド結
合サブユニットについての接合（ｊｏｉｎｔ）構造の特
徴であって、このサブユニットはα−サブユニットとも
呼ばれる。受容体の局在性および機能に応じて、この構
造上の特徴をもたないサブユニットは、β、γ、δもし
くはεサブユニットと呼ばれる（Ｃｈａｎｂｅｕｘ ｅ
ｔ ａｌ．１９９２）。
物界での神経伝達において役割を演じるリガンド調節性
イオンチャンネルである。アセチルコリンもしくは他の
作動剤の受容体への結合は、チャンネルの一時的開口を
引き起こし、そしてカチオンを通過させる。受容体は、
細孔の周囲に配置された５個のサブユニットからなると
推測されている。これらのサブユニットの各々は、細胞
外Ｎ末端部分と、それに続く３種の膜貫通領域、細胞内
部分、および第４の膜貫通領域とＣ末端部分からなるタ
ンパク質である。あるサブユニットは、それらの細胞外
部分上に、リガンド、例えばアセチルコリンに対する結
合部位を担持している。２つの近接するシステインがこ
の結合部位の成分であり、それ故、すべてのリガンド結
合サブユニットについての接合（ｊｏｉｎｔ）構造の特
徴であって、このサブユニットはα−サブユニットとも
呼ばれる。受容体の局在性および機能に応じて、この構
造上の特徴をもたないサブユニットは、β、γ、δもし
くはεサブユニットと呼ばれる（Ｃｈａｎｂｅｕｘ ｅ
ｔ ａｌ．１９９２）。
【０００３】アセチルコリン受容体は、特に脊椎動物に
おいて多くの研究課題であった。それらの解剖学的局在
性およびそれらの機能性（作動剤および拮抗剤ならびに
トキシン、例えばα−ブンガロトキシンに対するチャン
ネル、脱感作、感受性の伝達性）によって、３つのグル
ープが区別できる。分類は、受容体の分子組成と相関す
る。筋肉中に見いだされるサブユニット組成α2βγδ
をもつヘテロオリゴマー受容体（Ｎｏｄａ ｅｔ ａ
ｌ．１９８２，Ｃｌａｕｄｉｏ ｅｔ ａｌ．１９８
３，Ｄｅｖｉｌｌｅｒｓ−Ｔｈｉｅｒｙ ｅｔ ａｌ．
１９８３，Ｎｏｄａｅｔ ａｌ．１９８３ａ，ｂ）、グ
ループα２−α６およびβ２−β４からのサブユニット
を含有し、そして神経系に見いだされるヘテロオリゴマ
ー受容体（Ｓｃｈｏｅｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９
０，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９７）、な
らびにグループα７−α９からのサブユニットを含有
し、そして神経系にまた見いだされるホモオリゴマー受
容体（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔａｌ．１９９７，Ｅｌ
ｇｏｙｈｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９７）が存在する。こ
の分類は、また、種々のサブユニットの遺伝子配列の関
係を考慮に入れる場合に支持される。典型的には、異な
る種の機能的に一致するサブユニットの配列は、同じ種
であっても異なるグループからのサブユニットの配列よ
りも高い類似性を示す。さらにまた、すべての既知アセ
チルコリン受容体サブユニットの遺伝子配列は、互いに
いくらかは全く類似していないで、若干の他の、リガン
ド調節性イオンチャンネルのそれと類似している（例え
ば、５ＨＴ3タイプのセロトニン受容体、ＧＡＢＡ調節
性クロライド（ｃｈｌｏｒｉｄｅ）チャンネル、グリシ
ン調節性塩素チャンネル）。したがって、すべてのこれ
らの受容体は、１つの接合前駆体から生じ、そしてそれ
らは１つのスーパー遺伝子ファミリーに分類されると推
測することができる（Ｏｒｔｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．１
９９５）。
おいて多くの研究課題であった。それらの解剖学的局在
性およびそれらの機能性（作動剤および拮抗剤ならびに
トキシン、例えばα−ブンガロトキシンに対するチャン
ネル、脱感作、感受性の伝達性）によって、３つのグル
ープが区別できる。分類は、受容体の分子組成と相関す
る。筋肉中に見いだされるサブユニット組成α2βγδ
をもつヘテロオリゴマー受容体（Ｎｏｄａ ｅｔ ａ
ｌ．１９８２，Ｃｌａｕｄｉｏ ｅｔ ａｌ．１９８
３，Ｄｅｖｉｌｌｅｒｓ−Ｔｈｉｅｒｙ ｅｔ ａｌ．
１９８３，Ｎｏｄａｅｔ ａｌ．１９８３ａ，ｂ）、グ
ループα２−α６およびβ２−β４からのサブユニット
を含有し、そして神経系に見いだされるヘテロオリゴマ
ー受容体（Ｓｃｈｏｅｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９
０，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９７）、な
らびにグループα７−α９からのサブユニットを含有
し、そして神経系にまた見いだされるホモオリゴマー受
容体（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔａｌ．１９９７，Ｅｌ
ｇｏｙｈｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９７）が存在する。こ
の分類は、また、種々のサブユニットの遺伝子配列の関
係を考慮に入れる場合に支持される。典型的には、異な
る種の機能的に一致するサブユニットの配列は、同じ種
であっても異なるグループからのサブユニットの配列よ
りも高い類似性を示す。さらにまた、すべての既知アセ
チルコリン受容体サブユニットの遺伝子配列は、互いに
いくらかは全く類似していないで、若干の他の、リガン
ド調節性イオンチャンネルのそれと類似している（例え
ば、５ＨＴ3タイプのセロトニン受容体、ＧＡＢＡ調節
性クロライド（ｃｈｌｏｒｉｄｅ）チャンネル、グリシ
ン調節性塩素チャンネル）。したがって、すべてのこれ
らの受容体は、１つの接合前駆体から生じ、そしてそれ
らは１つのスーパー遺伝子ファミリーに分類されると推
測することができる（Ｏｒｔｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．１
９９５）。
【０００４】昆虫では、アセチルコリンは、中枢神経系
のもっとも重要な興奮性神経伝達物質である。したがっ
て、アセチルコリン受容体は、昆虫の中枢神経節の調製
物において電気生理学的に検出することができる。これ
は、両シナプス後およびシナプス前（ｐｒｅｓｙｎａｐ
ｔｉｃ）神経終末部において、そして介在ニューロン、
運動性ニューロンおよび調節ニューロンの細胞質体にお
いて、成功裏に検出することができる（Ｂｒｅｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．１９８７，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｅｔ ａ
ｌ．１９９７）。受容体は、α−ブンガロトキシンによ
って阻害されるものおよび非感受性であるものを含む
（Ｓｃｈｌｏｓｓ ｅｔ ａｌ．１９８８）。さらに、
アセチルコリン受容体は、重要な天然（例えばニコチ
ン）および合成殺虫剤（例えばクロロニコチニル類）の
分子標的である。
のもっとも重要な興奮性神経伝達物質である。したがっ
て、アセチルコリン受容体は、昆虫の中枢神経節の調製
物において電気生理学的に検出することができる。これ
は、両シナプス後およびシナプス前（ｐｒｅｓｙｎａｐ
ｔｉｃ）神経終末部において、そして介在ニューロン、
運動性ニューロンおよび調節ニューロンの細胞質体にお
いて、成功裏に検出することができる（Ｂｒｅｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．１９８７，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｅｔ ａ
ｌ．１９９７）。受容体は、α−ブンガロトキシンによ
って阻害されるものおよび非感受性であるものを含む
（Ｓｃｈｌｏｓｓ ｅｔ ａｌ．１９８８）。さらに、
アセチルコリン受容体は、重要な天然（例えばニコチ
ン）および合成殺虫剤（例えばクロロニコチニル類）の
分子標的である。
【０００５】多くの昆虫のニコチン性アセチルコリン受
容体の遺伝子配列が既に知られている。かくして、５種
の異なるサブユニットの配列が、キイロショウジョウバ
エ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅ
ｒ）について記述されている（Ｂｏｓｓｙ ｅｔ ａ
ｌ．１９８８，Ｈｅｒｍａｎｎｓ−Ｂｏｒｇｍｅｙｅｒ
ｅｔ ａｌ．１９８６，Ｓａｗｒｕｋ ｅｔ ａｌ．１
９９０ａ，１９９０ｂ，Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．１
９９８）；また、５種の配列がローカスタ・ミグラトリ
ア（Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）について
（Ｈｅｒｍｓｅｎｅｔ ａｌ．１９９８）、１種がシス
トセリカ・グレガリア（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｉｃａ
ｇｒｅｇａｒｉａ）について（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ
ａｌ．１９９０）、６種がミズス・ペルシカエ（Ｍｙ
ｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）について（Ｓｇａｒｄ ｅ
ｔ ａｌ．１９９８，Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９
９）、２種がマンズカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ ｓ
ｅｘｔａ）について（Ｅａｓｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．１
９９７，Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＪ００７３９７）、そして
６種がヘリオチス・ビレッセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ
ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）について（ドイツ特許第１９８
１９ ８２９号、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ１４３８４
６，ＡＦ１４３８４７，ＡＪ０００３９９，ＡＦ０９６
８７８，ＡＦ０９６８７９）記述されている。さらに、
一連のキイロショウジョウバエの部分遺伝子配列が、発
現される配列タグ（ＡＡ５４０６８７，ＡＡ６９８１５
５，ＡＡ６９７７１０，ＡＡ６９７３２６）として特徴
付けられた。これらの配列は、リガンド結合部位の２つ
の近接するシステインが存在するか、しないかに応じ
て、αおよびβサブユニットに分類できる。しかしなが
ら、全４種の異なるβ−サブユニットが脊椎動物におい
て（Ｓｃｈｏｅｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９０，Ｈｅ
ｉｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９７）、少なくとも
５種がシーハブヂチス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａ
ｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）において（Ｂａｒｇｍ
ａｎｎ ａｎｄ Ｋａｐｌａｎ １９９８）知られてい
るけれども、各場合、キイロショウジョウバエの例外は
あるが、１種のβ−サブユニットのみが、各研究された
昆虫の種において同定された（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．１９９９，Ｈｅｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９
８，Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＪ００７３９７）。この共通の
サブユニットは、キイロショウジョウバエの場合におい
てＡＤＲと呼ばれるサブユニットの同族体である（Ｓｃ
ｈｌｏｓｓ ｅｔ ａｌ．１９８８）。他のドロソフィ
ラβサブユニットの配列、ＳＢＤ（Ｓａｗｒｕｋ ｅｔ
ａｌ．１９９０ｂ）は、他のβサブユニットよりもαサ
ブユニットとの一層大きい類似性を示すが、近接するシ
ステインをもたない。
容体の遺伝子配列が既に知られている。かくして、５種
の異なるサブユニットの配列が、キイロショウジョウバ
エ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅ
ｒ）について記述されている（Ｂｏｓｓｙ ｅｔ ａ
ｌ．１９８８，Ｈｅｒｍａｎｎｓ−Ｂｏｒｇｍｅｙｅｒ
ｅｔ ａｌ．１９８６，Ｓａｗｒｕｋ ｅｔ ａｌ．１
９９０ａ，１９９０ｂ，Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．１
９９８）；また、５種の配列がローカスタ・ミグラトリ
ア（Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）について
（Ｈｅｒｍｓｅｎｅｔ ａｌ．１９９８）、１種がシス
トセリカ・グレガリア（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｉｃａ
ｇｒｅｇａｒｉａ）について（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ
ａｌ．１９９０）、６種がミズス・ペルシカエ（Ｍｙ
ｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）について（Ｓｇａｒｄ ｅ
ｔ ａｌ．１９９８，Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９
９）、２種がマンズカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ ｓ
ｅｘｔａ）について（Ｅａｓｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．１
９９７，Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＪ００７３９７）、そして
６種がヘリオチス・ビレッセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ
ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）について（ドイツ特許第１９８
１９ ８２９号、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ１４３８４
６，ＡＦ１４３８４７，ＡＪ０００３９９，ＡＦ０９６
８７８，ＡＦ０９６８７９）記述されている。さらに、
一連のキイロショウジョウバエの部分遺伝子配列が、発
現される配列タグ（ＡＡ５４０６８７，ＡＡ６９８１５
５，ＡＡ６９７７１０，ＡＡ６９７３２６）として特徴
付けられた。これらの配列は、リガンド結合部位の２つ
の近接するシステインが存在するか、しないかに応じ
て、αおよびβサブユニットに分類できる。しかしなが
ら、全４種の異なるβ−サブユニットが脊椎動物におい
て（Ｓｃｈｏｅｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９０，Ｈｅ
ｉｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９７）、少なくとも
５種がシーハブヂチス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａ
ｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）において（Ｂａｒｇｍ
ａｎｎ ａｎｄ Ｋａｐｌａｎ １９９８）知られてい
るけれども、各場合、キイロショウジョウバエの例外は
あるが、１種のβ−サブユニットのみが、各研究された
昆虫の種において同定された（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．１９９９，Ｈｅｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９
８，Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＪ００７３９７）。この共通の
サブユニットは、キイロショウジョウバエの場合におい
てＡＤＲと呼ばれるサブユニットの同族体である（Ｓｃ
ｈｌｏｓｓ ｅｔ ａｌ．１９８８）。他のドロソフィ
ラβサブユニットの配列、ＳＢＤ（Ｓａｗｒｕｋ ｅｔ
ａｌ．１９９０ｂ）は、他のβサブユニットよりもαサ
ブユニットとの一層大きい類似性を示すが、近接するシ
ステインをもたない。
【０００６】昆虫のニコチン性受容体の組み換え発現
は、類縁の脊椎動物またはＣ．エレガンス受容体のそれ
よりも困難であることが分かった。かくして、昆虫のサ
ブユニットのみからなるニコチン性受容体を、それらの
機能性、例えば感受性が天然の受容体のそれとの類似性
を示すような方式で発現させることは、一般に可能では
なかった（Ａｍａｒ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｈｅｒｍ
ｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｓｇａｒｄ ｅｔ ａ
ｌ．１９９８）。しかしながら、種々の昆虫の種由来の
少なくとも若干のαサブユニットは、昆虫βサブユニッ
トよりもむしろニワトリβ２サブユニットが、アフリカ
ツメガエルの卵母細胞において同時発現される場合に、
機能的受容体にとって寄与する（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅ
ｔ ａｌ．１９９０，Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．１９
９８，Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．１９９８）。この
ことと同様に本質的に１種のβサブユニットのみが知ら
れているという事実は、まだ未知であるさらなるβサブ
ユニットが存在するという予測を可能にする。
は、類縁の脊椎動物またはＣ．エレガンス受容体のそれ
よりも困難であることが分かった。かくして、昆虫のサ
ブユニットのみからなるニコチン性受容体を、それらの
機能性、例えば感受性が天然の受容体のそれとの類似性
を示すような方式で発現させることは、一般に可能では
なかった（Ａｍａｒ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｈｅｒｍ
ｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｓｇａｒｄ ｅｔ ａ
ｌ．１９９８）。しかしながら、種々の昆虫の種由来の
少なくとも若干のαサブユニットは、昆虫βサブユニッ
トよりもむしろニワトリβ２サブユニットが、アフリカ
ツメガエルの卵母細胞において同時発現される場合に、
機能的受容体にとって寄与する（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅ
ｔ ａｌ．１９９０，Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．１９
９８，Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．１９９８）。この
ことと同様に本質的に１種のβサブユニットのみが知ら
れているという事実は、まだ未知であるさらなるβサブ
ユニットが存在するという予測を可能にする。
【０００７】真核動物細胞系またはゼノプス・ラエビス
（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞における昆
虫ニコチン性受容体の機能的発現は、例えば新しい殺虫
剤の検索において、大きな実用的重要性をもっている。
（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞における昆
虫ニコチン性受容体の機能的発現は、例えば新しい殺虫
剤の検索において、大きな実用的重要性をもっている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、特に、新規な昆虫アセチルコリン受容体βサブユニ
ットをコードする核酸を提供するという目的に基づいて
いる。これらの新規な核酸は、もっばら昆虫サブユニッ
トからなるニコチン性アセチルコリン受容体の組み換え
発現を可能にすることを意図している。
は、特に、新規な昆虫アセチルコリン受容体βサブユニ
ットをコードする核酸を提供するという目的に基づいて
いる。これらの新規な核酸は、もっばら昆虫サブユニッ
トからなるニコチン性アセチルコリン受容体の組み換え
発現を可能にすることを意図している。
【０００９】本目的は、（ａ）配列番号：１の配列、
（ｂ）長さ少なくとも１４塩基対である（ａ）の下で定
義された配列のサブ配列、（ｃ）（ａ）の下で定義され
た配列とハイブリダイズする配列、（ｄ）（ａ）の下で
定義された配列の位置４３と位置１３６８間の配列に少
なくとも７０％同一性をもつ配列、（ｅ）（ａ）の下で
定義された配列に相補的である配列、および（ｆ）遺伝
コードの退化により、（ａ）〜（ｄ）の下で定義された
配列がコードするような同じアミノ酸配列をコードする
配列、からなる群から選ばれる配列を含んでなる核酸を
提供することによって達成される。
（ｂ）長さ少なくとも１４塩基対である（ａ）の下で定
義された配列のサブ配列、（ｃ）（ａ）の下で定義され
た配列とハイブリダイズする配列、（ｄ）（ａ）の下で
定義された配列の位置４３と位置１３６８間の配列に少
なくとも７０％同一性をもつ配列、（ｅ）（ａ）の下で
定義された配列に相補的である配列、および（ｆ）遺伝
コードの退化により、（ａ）〜（ｄ）の下で定義された
配列がコードするような同じアミノ酸配列をコードする
配列、からなる群から選ばれる配列を含んでなる核酸を
提供することによって達成される。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明による核酸は、特
に、一本鎖もしくは二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）
もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）である。好適な態様は、イ
ントロンを含有してもよいゲノムＤＮＡのフラグメン
ト、およびｃＤＮＡである。
に、一本鎖もしくは二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）
もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）である。好適な態様は、イ
ントロンを含有してもよいゲノムＤＮＡのフラグメン
ト、およびｃＤＮＡである。
【００１１】本発明による核酸の好適な態様は、配列番
号：１の核酸配列をもつｃＤＮＡである。
号：１の核酸配列をもつｃＤＮＡである。
【００１２】核酸配列の同一性の程度は、好ましくは、
標準設定を用いて、パッケージＧＣＧ、バージョン１
０．０からのプログラムＧＡＰによって決定される（Ｄ
ｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．１９８４）。
標準設定を用いて、パッケージＧＣＧ、バージョン１
０．０からのプログラムＧＡＰによって決定される（Ｄ
ｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．１９８４）。
【００１３】本明細書において使用されるような用語
「ハイブリダイズする」は、一本鎖核酸分子が相補的鎖
と塩基対形成を行う過程を記す。本明細書に開示される
配列情報から出発して、これは、例えば、アセチルコリ
ン受容体βサブユニットの生物学的機能をもつポリペプ
チドをコードするキイロショウジョウバエ以外の昆虫か
ら、ＤＮＡフラグメントを単離することを可能にする。
「ハイブリダイズする」は、一本鎖核酸分子が相補的鎖
と塩基対形成を行う過程を記す。本明細書に開示される
配列情報から出発して、これは、例えば、アセチルコリ
ン受容体βサブユニットの生物学的機能をもつポリペプ
チドをコードするキイロショウジョウバエ以外の昆虫か
ら、ＤＮＡフラグメントを単離することを可能にする。
【００１４】好適なハイブリダイゼーション条件は下記
のとおりである： ハイブリダイゼーション溶液：６Ｘ ＳＳＣ／０％ホル
ムアミド、好適なハイブリダイゼーション溶液：６Ｘ
ＳＳＣ／２５％ホルムアミド、ハイブリダイゼーション
温度：３４℃、好適なハイブリダイゼーション温度：４
２℃、洗浄段階１：２Ｘ ＳＳＣ ４０℃において、洗
浄段階２：２Ｘ ＳＳＣ ４５℃において、好適な洗浄
段階２：０．６ＸＳＳＣ ５５℃において、特に好適な
洗浄段階２：０．３Ｘ ＳＳＣ ６５℃において。
のとおりである： ハイブリダイゼーション溶液：６Ｘ ＳＳＣ／０％ホル
ムアミド、好適なハイブリダイゼーション溶液：６Ｘ
ＳＳＣ／２５％ホルムアミド、ハイブリダイゼーション
温度：３４℃、好適なハイブリダイゼーション温度：４
２℃、洗浄段階１：２Ｘ ＳＳＣ ４０℃において、洗
浄段階２：２Ｘ ＳＳＣ ４５℃において、好適な洗浄
段階２：０．６ＸＳＳＣ ５５℃において、特に好適な
洗浄段階２：０．３Ｘ ＳＳＣ ６５℃において。
【００１５】本発明は、好ましくは長さ少なくとも１０
０、特に好ましくは少なくとも５００の連続するヌクレ
オチドにわたる、そして著しく特に好ましくは全長にわ
たる、配列番号：１の配列の位置４３と位置１３６８間
の配列に、少なくとも７０％同一性、好ましくは少なく
とも８０％同一性、特に好ましくは少なくとも９０％同
一性、著しく特に好ましくは少なくとも９５％同一性を
もつ核酸を含む。
０、特に好ましくは少なくとも５００の連続するヌクレ
オチドにわたる、そして著しく特に好ましくは全長にわ
たる、配列番号：１の配列の位置４３と位置１３６８間
の配列に、少なくとも７０％同一性、好ましくは少なく
とも８０％同一性、特に好ましくは少なくとも９０％同
一性、著しく特に好ましくは少なくとも９５％同一性を
もつ核酸を含む。
【００１６】さらにまた、本発明の主題は、本発明によ
る核酸の少なくとも１つを含有するベクターである。使
用できるベクターは、分子生物学実験室で使用されるす
べてのプラスミド、ファスミド、コスミド、ＹＡＣもし
くは人工染色体である。本発明により核酸を発現するた
めに、後者は慣用の調節配列に連結することができる。
そのような調節配列の選択は、原核もしくは真核細胞
か、またはセル・フリー系か、いずれが発現のために使
用されるかに依存する。発現調節配列として特に好適な
ものは、例えば、ＳＶ４０、アデノウイルスもしくはサ
イトメガロウイルス初期もしくは後期プロモーター、ｌ
ａｃ系、ｔｒｐ系、λファージの主オペレーターおよび
プロモーター領域、ｆｄコートタンパク質調節領域、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、酸性ホス
ファターゼのプロモーターおよび酵母α−交配因子のプ
ロモーター、バキュロウイルス即時型初期プロモータ
ー、およびキイロショウジョウバエのメタロチオネイン
（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーターであ
る。
る核酸の少なくとも１つを含有するベクターである。使
用できるベクターは、分子生物学実験室で使用されるす
べてのプラスミド、ファスミド、コスミド、ＹＡＣもし
くは人工染色体である。本発明により核酸を発現するた
めに、後者は慣用の調節配列に連結することができる。
そのような調節配列の選択は、原核もしくは真核細胞
か、またはセル・フリー系か、いずれが発現のために使
用されるかに依存する。発現調節配列として特に好適な
ものは、例えば、ＳＶ４０、アデノウイルスもしくはサ
イトメガロウイルス初期もしくは後期プロモーター、ｌ
ａｃ系、ｔｒｐ系、λファージの主オペレーターおよび
プロモーター領域、ｆｄコートタンパク質調節領域、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、酸性ホス
ファターゼのプロモーターおよび酵母α−交配因子のプ
ロモーター、バキュロウイルス即時型初期プロモータ
ー、およびキイロショウジョウバエのメタロチオネイン
（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーターであ
る。
【００１７】本発明により核酸を発現するために、後者
は適当な宿主細胞中に導入することができる。適当な宿
主細胞は、原核細胞、好ましくはＥ．コリのみならず、
また真核細胞、好ましくは哺乳類もしくは昆虫細胞であ
る。適当な単細胞宿主細胞の他の例は：シュードモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）、酵母類、ＨＥＫ−２９３，ＳｃｈｎｅｉｄｅｒＳ
２、ＳＦ９、ＣＨＯ、ＣＯＳ１およびＣＯＳ７細胞、細
胞培養における植物細胞、および両生類細胞、特に卵母
細胞である。
は適当な宿主細胞中に導入することができる。適当な宿
主細胞は、原核細胞、好ましくはＥ．コリのみならず、
また真核細胞、好ましくは哺乳類もしくは昆虫細胞であ
る。適当な単細胞宿主細胞の他の例は：シュードモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）、酵母類、ＨＥＫ−２９３，ＳｃｈｎｅｉｄｅｒＳ
２、ＳＦ９、ＣＨＯ、ＣＯＳ１およびＣＯＳ７細胞、細
胞培養における植物細胞、および両生類細胞、特に卵母
細胞である。
【００１８】また、本発明の主題は、本発明による核酸
によってコードされているポリペプチドである。
によってコードされているポリペプチドである。
【００１９】また、本発明の主題は、アミノ酸配列を含
み、そして長さ少なくとも２０、好ましくは少なくとも
２５、特に好ましくは少なくとも３０の連続するアミノ
酸にわたる、そして著しく特に好ましくは全長にわた
る、配列番号：２の配列に、少なくとも４０％同一性、
好ましくは少なくとも６０％同一性、特に好ましくは少
なくとも８０％同一性をもつポリペプチドである。
み、そして長さ少なくとも２０、好ましくは少なくとも
２５、特に好ましくは少なくとも３０の連続するアミノ
酸にわたる、そして著しく特に好ましくは全長にわた
る、配列番号：２の配列に、少なくとも４０％同一性、
好ましくは少なくとも６０％同一性、特に好ましくは少
なくとも８０％同一性をもつポリペプチドである。
【００２０】アミノ酸配列の同一性の程度は、好ましく
は、標準設定を用いて、パッケージＧＣＧ、バージョン
１０．０からのプログラムＧＡＰによって決定される
（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．１９８４）。
は、標準設定を用いて、パッケージＧＣＧ、バージョン
１０．０からのプログラムＧＡＰによって決定される
（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．１９８４）。
【００２１】さらにまた、本発明の主題は、本発明によ
るポリペプチドを含むアセチルコリン受容体である。
るポリペプチドを含むアセチルコリン受容体である。
【００２２】本明細書において使用されるような用語
「ポリペプチド」は、通常、ペプチド、オリゴペプチド
もしくはオリゴマーと呼ばれる短いアミノ酸鎖のみなら
ず、また通常、タンパク質と呼ばれる長いアミノ酸鎖に
関する。それは、自然の処理、例えば翻訳後プロセッシ
ングか、または化学的な先行技術法か、いずれかによっ
て修飾できるアミノ酸鎖を含む。そのような修飾は、ポ
リペプチド中、例えばペプチド骨格、アミノ酸側鎖、ア
ミノおよび／またはカルボキシル末端において、種々の
部位において、そして反復して起きる。例えば、それら
は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミ
ド化、フラビン、ヘム部分、ヌクレオチドもしくはヌク
レオチド誘導体、脂質もしくは脂質誘導体またはホスフ
ァチジルイノシトールへの共有結合、環化、ジスルフィ
ド架橋形成、脱メチル化、シスチン形成、ホルミル化、
γ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、
ヨード化、メチル化、ミリスチル化、酸化、タンパク質
分解的プロセッシング、ホスホリル化、セレニル化およ
びアミノ酸のｔＲＮＡ媒介付加を含む。
「ポリペプチド」は、通常、ペプチド、オリゴペプチド
もしくはオリゴマーと呼ばれる短いアミノ酸鎖のみなら
ず、また通常、タンパク質と呼ばれる長いアミノ酸鎖に
関する。それは、自然の処理、例えば翻訳後プロセッシ
ングか、または化学的な先行技術法か、いずれかによっ
て修飾できるアミノ酸鎖を含む。そのような修飾は、ポ
リペプチド中、例えばペプチド骨格、アミノ酸側鎖、ア
ミノおよび／またはカルボキシル末端において、種々の
部位において、そして反復して起きる。例えば、それら
は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミ
ド化、フラビン、ヘム部分、ヌクレオチドもしくはヌク
レオチド誘導体、脂質もしくは脂質誘導体またはホスフ
ァチジルイノシトールへの共有結合、環化、ジスルフィ
ド架橋形成、脱メチル化、シスチン形成、ホルミル化、
γ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、
ヨード化、メチル化、ミリスチル化、酸化、タンパク質
分解的プロセッシング、ホスホリル化、セレニル化およ
びアミノ酸のｔＲＮＡ媒介付加を含む。
【００２３】本発明によるポリペプチドは、「成熟」タ
ンパク質の形態で、またはより大きいタンパク質の一部
として、例えば融合タンパク質として存在してもよい。
さらにまた、それらは、分泌もしくはリーダー配列、プ
ロ配列、容易な精製を可能にする配列、例えば多数のヒ
スチジン残基、または付加的安定化アミノ酸を表しても
よい。
ンパク質の形態で、またはより大きいタンパク質の一部
として、例えば融合タンパク質として存在してもよい。
さらにまた、それらは、分泌もしくはリーダー配列、プ
ロ配列、容易な精製を可能にする配列、例えば多数のヒ
スチジン残基、または付加的安定化アミノ酸を表しても
よい。
【００２４】本発明によるポリペプチドは、必ずしも完
全なアセチルコリン受容体β−サブユニットを構成する
必要はなく、また、完全なサブユニットの生物学的機能
を少なくともなお発揮できるくらい長い、それらの単な
るフラグメントであってもよい。
全なアセチルコリン受容体β−サブユニットを構成する
必要はなく、また、完全なサブユニットの生物学的機能
を少なくともなお発揮できるくらい長い、それらの単な
るフラグメントであってもよい。
【００２５】本発明にするポリペプチドは、必ずしもキ
イロショウジョウバエのアセチルコリン受容体βサブユ
ニットから得られる必要はない。他の昆虫類のアセチル
コリン受容体βサブユニットに対応するポリペプチド、
あるいはこれらのサブユニットの生物学的機能をなお発
揮できるこれらのフラグメントは、また、本発明にした
がうと考えられる。
イロショウジョウバエのアセチルコリン受容体βサブユ
ニットから得られる必要はない。他の昆虫類のアセチル
コリン受容体βサブユニットに対応するポリペプチド、
あるいはこれらのサブユニットの生物学的機能をなお発
揮できるこれらのフラグメントは、また、本発明にした
がうと考えられる。
【００２６】天然に存在するアセチルコリン受容体βサ
ブユニットの対応する領域と比較して、本発明によるポ
リペプチドは、完全なサブユニットの生物学的機能を少
なくともなお発揮できるくらい長い、欠失もしくはアミ
ノ酸置換を表してもよい。同類置換が好適である。その
ような同類置換は、１個のアミノ酸が、次の群の中から
のその他のアミノ酸によって置換されている変異を含
む： １． 小さい脂肪族残基、非極性残基もしくはほとんど
極性をもたない残基：ａｌａ，ｓｅｒ，ｔｈｒ，ｐｒｏ
およびｇｌｙ； ２． 極性のネガティブ電荷の残基およびそれらのアミ
ド：ａｓｐ，ａｓｎ，ｇｌｕおよびｇｌｎ； ３． 極性のポジティブ電荷の残基：ｈｉｓ，ａｒｇお
よびｌｙｓ； ４． 大きい脂肪族非極性残基：ｍｅｔ，ｌｅｕ，ｉｌ
ｅ，ｖａｌおよびｃｙｓ；ならびに ５． 芳香族残基：ｐｈｅ，ｔｙｒおよびｔｒｐ。
ブユニットの対応する領域と比較して、本発明によるポ
リペプチドは、完全なサブユニットの生物学的機能を少
なくともなお発揮できるくらい長い、欠失もしくはアミ
ノ酸置換を表してもよい。同類置換が好適である。その
ような同類置換は、１個のアミノ酸が、次の群の中から
のその他のアミノ酸によって置換されている変異を含
む： １． 小さい脂肪族残基、非極性残基もしくはほとんど
極性をもたない残基：ａｌａ，ｓｅｒ，ｔｈｒ，ｐｒｏ
およびｇｌｙ； ２． 極性のネガティブ電荷の残基およびそれらのアミ
ド：ａｓｐ，ａｓｎ，ｇｌｕおよびｇｌｎ； ３． 極性のポジティブ電荷の残基：ｈｉｓ，ａｒｇお
よびｌｙｓ； ４． 大きい脂肪族非極性残基：ｍｅｔ，ｌｅｕ，ｉｌ
ｅ，ｖａｌおよびｃｙｓ；ならびに ５． 芳香族残基：ｐｈｅ，ｔｙｒおよびｔｒｐ。
【００２７】好適な同類置換は、次のリストから見るこ
とができる：
とができる：
【００２８】
【表１】
【００２９】本明細書において使用されるところの用語
「アセチルコリン受容体βサブユニットの生物学的機
能」は、機能的アセチルコリン受容体を生成する役割、
すなわち受容体の他のサブユニットと相互作用すること
ができる能力を意味する。
「アセチルコリン受容体βサブユニットの生物学的機
能」は、機能的アセチルコリン受容体を生成する役割、
すなわち受容体の他のサブユニットと相互作用すること
ができる能力を意味する。
【００３０】本発明によるポリペプチドの好適な態様
は、配列番号：２のアミノ酸配列をもつキイロショウジ
ョウバエのアセチルコリン受容体βサブユニットであ
る。 さらにまた、本発明の主題は、本発明によるポリ
ペプチドの製造方法である。本発明による核酸によって
コードされているポリペプチドを製造するために、本発
明による核酸を含有する宿主細胞は、適当な条件下で培
養することができる。その後、所望のポリペプチドが、
細胞もしくは培養基から慣用の方法において単離でき
る。
は、配列番号：２のアミノ酸配列をもつキイロショウジ
ョウバエのアセチルコリン受容体βサブユニットであ
る。 さらにまた、本発明の主題は、本発明によるポリ
ペプチドの製造方法である。本発明による核酸によって
コードされているポリペプチドを製造するために、本発
明による核酸を含有する宿主細胞は、適当な条件下で培
養することができる。その後、所望のポリペプチドが、
細胞もしくは培養基から慣用の方法において単離でき
る。
【００３１】本発明による核酸を用いて宿主細胞によっ
て合成される本発明によるポリペプチドを単離する急速
な方法は、融合タンパク質の発現とともに出発し、融合
成分について、単純な方式でアフィニティー精製するこ
とができる。例えば、融合成分はグルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼであってもよい。次いで、融合タンパク
質が、グルタチオンアフィニティーカラムにおいて精製
することができる。融合成分は、例えば融合成分と精製
されるべき本発明によるポリペプチド間のリンカーにお
ける、部分タンパク質分解開裂によって除去できる。リ
ンカーは、それが、トリプシン開裂の部位を決定するア
ルギニンおよびリジン残基のような標的アミノ酸を含む
ように、設計することができる。そのようなリンカーを
生成するためには、オリゴヌクレオチドを用いる標準ク
ローニング法が用いられる。
て合成される本発明によるポリペプチドを単離する急速
な方法は、融合タンパク質の発現とともに出発し、融合
成分について、単純な方式でアフィニティー精製するこ
とができる。例えば、融合成分はグルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼであってもよい。次いで、融合タンパク
質が、グルタチオンアフィニティーカラムにおいて精製
することができる。融合成分は、例えば融合成分と精製
されるべき本発明によるポリペプチド間のリンカーにお
ける、部分タンパク質分解開裂によって除去できる。リ
ンカーは、それが、トリプシン開裂の部位を決定するア
ルギニンおよびリジン残基のような標的アミノ酸を含む
ように、設計することができる。そのようなリンカーを
生成するためには、オリゴヌクレオチドを用いる標準ク
ローニング法が用いられる。
【００３２】可能である他の精製方法は、調製用電気泳
動、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ（例えばゲル濾過、逆相もしく
は弱疎水性カラムを用いる）、ゲル濾過、分別沈殿、イ
オン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロ
マトグラフィーに基づく。
動、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ（例えばゲル濾過、逆相もしく
は弱疎水性カラムを用いる）、ゲル濾過、分別沈殿、イ
オン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロ
マトグラフィーに基づく。
【００３３】本発明によるポリペプチドの精製は、本発
明による核酸を発現する宿主細胞から出発する膜の単離
を含んでもよい。そのような細胞は、好ましくは、膜フ
ラクション中のポリペプチド量が、アセチルコリン受容
体を天然に発現する細胞に匹敵する膜における量よりも
少なくとも１０倍高いような、十分に高いコピー数にお
いて本発明によるポリペプチドを発現する；特に好まし
くは、その量は、少なくとも１００倍高く、著しく特に
好ましくは、少なくとも１０００倍高い。
明による核酸を発現する宿主細胞から出発する膜の単離
を含んでもよい。そのような細胞は、好ましくは、膜フ
ラクション中のポリペプチド量が、アセチルコリン受容
体を天然に発現する細胞に匹敵する膜における量よりも
少なくとも１０倍高いような、十分に高いコピー数にお
いて本発明によるポリペプチドを発現する；特に好まし
くは、その量は、少なくとも１００倍高く、著しく特に
好ましくは、少なくとも１０００倍高い。
【００３４】本明細書において使用されるような用語
「単離もしくは精製」は、本発明によるポリペプチド
が、細胞もしくは組織の他のタンパク質もしくは他の高
分子から分離されることを意味する。本発明によるポリ
ペプチドを含有している組成物のタンパク質含量は、宿
主細胞調製物におけるよりも、好ましくは少なくとも１
０倍高く、特に好ましくは少なくとも１００倍高い。
「単離もしくは精製」は、本発明によるポリペプチド
が、細胞もしくは組織の他のタンパク質もしくは他の高
分子から分離されることを意味する。本発明によるポリ
ペプチドを含有している組成物のタンパク質含量は、宿
主細胞調製物におけるよりも、好ましくは少なくとも１
０倍高く、特に好ましくは少なくとも１００倍高い。
【００３５】また、本発明によるポリペプチドは、ポリ
ペプチドに結合する抗体を用いて、融合成分なしにアフ
ィニティー精製されてもよい。
ペプチドに結合する抗体を用いて、融合成分なしにアフ
ィニティー精製されてもよい。
【００３６】本発明のさらなる主題は、前記ポリペプチ
ドもしくは受容体に特異的に結合する抗体である。その
ような抗体は慣用の方式で製造される。例えば、そのよ
うな抗体は、抗体生産のために効果的である本発明によ
るアセチルコリン受容体ポリペプチドもしくはそのフラ
グメントのそのような量を、実質的に免疫担当宿主に注
射することによって生産され、続いてこの抗体を得るこ
とができる。さらにまた、モノクローナル抗体を生産す
る不死化細胞系が、それ自体既知の方式で得られてもよ
い。適当ならば、抗体は検出試薬で標識されてもよい。
そのような検出試薬の好適な例は、酵素、放射能標識元
素、蛍光薬品もしくはビオチンである。完全な抗体の代
わりに、また、所望の特異的結合特性をもつフラグメン
トが使用されてもよい。
ドもしくは受容体に特異的に結合する抗体である。その
ような抗体は慣用の方式で製造される。例えば、そのよ
うな抗体は、抗体生産のために効果的である本発明によ
るアセチルコリン受容体ポリペプチドもしくはそのフラ
グメントのそのような量を、実質的に免疫担当宿主に注
射することによって生産され、続いてこの抗体を得るこ
とができる。さらにまた、モノクローナル抗体を生産す
る不死化細胞系が、それ自体既知の方式で得られてもよ
い。適当ならば、抗体は検出試薬で標識されてもよい。
そのような検出試薬の好適な例は、酵素、放射能標識元
素、蛍光薬品もしくはビオチンである。完全な抗体の代
わりに、また、所望の特異的結合特性をもつフラグメン
トが使用されてもよい。
【００３７】本発明による核酸は、特にトランスジェニ
ック無脊椎動物の生成のために使用することができる。
これらは、本発明による受容体または野生型からそれた
その変異体の発現に基づく試験システムにおいて用いる
ことができる。また、これは、本発明による受容体もし
くはその変異体の発現が、他の遺伝子もしくは遺伝子調
節配列（プロモーター）のために変化しているすべての
トランスジェニック無脊椎動物を含む。
ック無脊椎動物の生成のために使用することができる。
これらは、本発明による受容体または野生型からそれた
その変異体の発現に基づく試験システムにおいて用いる
ことができる。また、これは、本発明による受容体もし
くはその変異体の発現が、他の遺伝子もしくは遺伝子調
節配列（プロモーター）のために変化しているすべての
トランスジェニック無脊椎動物を含む。
【００３８】トランスジェニック無脊椎動物は、例え
ば、Ｐ−因子媒介遺伝子転移によってキイロショウジョ
ウバエにおいて（Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．１９９７）、ま
たはトランスポゾン媒介遺伝子転移によってシーノルハ
ブジチス・エレガンスにおいて（例えばＴｃ１による、
Ｐｌａｓｔｅｒｋ １９９６）生成される。
ば、Ｐ−因子媒介遺伝子転移によってキイロショウジョ
ウバエにおいて（Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．１９９７）、ま
たはトランスポゾン媒介遺伝子転移によってシーノルハ
ブジチス・エレガンスにおいて（例えばＴｃ１による、
Ｐｌａｓｔｅｒｋ １９９６）生成される。
【００３９】したがって、また、本発明の主題は、本発
明による核酸の少なくとも１種を含有しているトランス
ジェニック無脊椎動物、好ましくは、種キイロショウジ
ョウバエもしくはシーノルハブジチス・エレガンスのト
ランスジェニック無脊椎動物、およびそれらのトランス
ジェニック子孫である。好ましくは、トランスジェニッ
ク無脊椎動物は、野生型からそれた形態における本発明
による受容体を含有する。
明による核酸の少なくとも１種を含有しているトランス
ジェニック無脊椎動物、好ましくは、種キイロショウジ
ョウバエもしくはシーノルハブジチス・エレガンスのト
ランスジェニック無脊椎動物、およびそれらのトランス
ジェニック子孫である。好ましくは、トランスジェニッ
ク無脊椎動物は、野生型からそれた形態における本発明
による受容体を含有する。
【００４０】本発明による核酸は慣用の方式で生成する
ことができる。例えば、すべての核酸分子は、化学的に
合成できるし、または外に、本発明による配列の短いセ
クションのみが化学的に合成されてもよく、そしてその
ようなオリゴヌクレオチドは、放射能標識されても、蛍
光染料で標識されてもよい。標識されたオリゴヌクレオ
チドは、昆虫のｍＲＮＡから出発して生成されたｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングするために使用でき
る。標識されたオリゴヌクレオチドがハイブリダイズす
るクローンは、問題のＤＮＡを単離するために選択され
る。単離されたＤＮＡの特徴付けの後、本発明による核
酸は単純な方式で得られる。
ことができる。例えば、すべての核酸分子は、化学的に
合成できるし、または外に、本発明による配列の短いセ
クションのみが化学的に合成されてもよく、そしてその
ようなオリゴヌクレオチドは、放射能標識されても、蛍
光染料で標識されてもよい。標識されたオリゴヌクレオ
チドは、昆虫のｍＲＮＡから出発して生成されたｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングするために使用でき
る。標識されたオリゴヌクレオチドがハイブリダイズす
るクローンは、問題のＤＮＡを単離するために選択され
る。単離されたＤＮＡの特徴付けの後、本発明による核
酸は単純な方式で得られる。
【００４１】あるいはまた、本発明による核酸は、化学
的に合成されたオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法の
手段によって生成することができる。
的に合成されたオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法の
手段によって生成することができる。
【００４２】本明細書において使用されるような用語
「オリゴヌクレオチド」は、１０〜５０ヌクレオチド、
好ましくは１５〜３０ヌクレオチドからなるＤＮＡ分子
を指す。それらは化学的に合成され、そしてプローブと
して使用できる。
「オリゴヌクレオチド」は、１０〜５０ヌクレオチド、
好ましくは１５〜３０ヌクレオチドからなるＤＮＡ分子
を指す。それらは化学的に合成され、そしてプローブと
して使用できる。
【００４３】本発明による核酸は、コーディング領域に
近接して天然に存在する調節領域を単離し、そして特徴
付けるために使用することができる。かくして、そのよ
うな調節領域は、また本発明の主題である。
近接して天然に存在する調節領域を単離し、そして特徴
付けるために使用することができる。かくして、そのよ
うな調節領域は、また本発明の主題である。
【００４４】本発明による核酸は、新規な、作物保護の
ための活性化合物、あるいはヒトおよび／または動物の
治療のための製薬学的活性な化合物を同定するのを可能
にし、そのような化合物は、モジュレーター、特に作動
剤もしくは拮抗剤として本発明によるアセチルコリン受
容体の伝達性を変化させる。この目的のために、本発明
による核酸を含む組み換えＤＮＡ分子は、適当な宿主細
胞中に導入される。宿主細胞は、本発明による受容体の
発現を可能にする条件下で、化合物もしくは種々の化合
物を含むサンプルの存在下で増殖される。受容体の性質
における変化は、実施例２において下記のように検出で
きる。これは殺虫性物質を発見させる。
ための活性化合物、あるいはヒトおよび／または動物の
治療のための製薬学的活性な化合物を同定するのを可能
にし、そのような化合物は、モジュレーター、特に作動
剤もしくは拮抗剤として本発明によるアセチルコリン受
容体の伝達性を変化させる。この目的のために、本発明
による核酸を含む組み換えＤＮＡ分子は、適当な宿主細
胞中に導入される。宿主細胞は、本発明による受容体の
発現を可能にする条件下で、化合物もしくは種々の化合
物を含むサンプルの存在下で増殖される。受容体の性質
における変化は、実施例２において下記のように検出で
きる。これは殺虫性物質を発見させる。
【００４５】また、本発明による核酸は、本発明による
受容体に結合する化合物を見い出すことを可能にする。
これらもまた、殺虫剤として使用することができる。例
えば、本発明による核酸を含み、そして問題の受容体も
しくはポリペプチドか、または遺伝子生産物自体を発現
する宿主細胞は、宿主細胞、受容体もしくは個々のポリ
ペプチドと、少なくとも１種の化合物の相互作用を可能
にする条件下で、化合物もしくは化合物の混合物と接触
される。
受容体に結合する化合物を見い出すことを可能にする。
これらもまた、殺虫剤として使用することができる。例
えば、本発明による核酸を含み、そして問題の受容体も
しくはポリペプチドか、または遺伝子生産物自体を発現
する宿主細胞は、宿主細胞、受容体もしくは個々のポリ
ペプチドと、少なくとも１種の化合物の相互作用を可能
にする条件下で、化合物もしくは化合物の混合物と接触
される。
【００４６】本発明による核酸を含有している宿主細胞
またはトランスジェニック無脊椎動物を用いて、受容体
発現を変える物質を発見することが、また可能である。
またはトランスジェニック無脊椎動物を用いて、受容体
発現を変える物質を発見することが、また可能である。
【００４７】前記の本発明による核酸、ベクターおよび
調節領域は、また、昆虫において、機能的に類似のアセ
チルコリン受容体の合成に関与しているポリペプチドを
コードする遺伝子を発見するために使用できる。機能的
に類似の受容体は、本発明によれば、本明細書に記述さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるけれども、
本質的に同じ機能をもつポリペプチドを含む受容体を意
味すると理解されるべきである。
調節領域は、また、昆虫において、機能的に類似のアセ
チルコリン受容体の合成に関与しているポリペプチドを
コードする遺伝子を発見するために使用できる。機能的
に類似の受容体は、本発明によれば、本明細書に記述さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるけれども、
本質的に同じ機能をもつポリペプチドを含む受容体を意
味すると理解されるべきである。
【００４８】配列リストおよび図面に関する情報 配列番号：１は、位置１で始まり、そして位置１５３９
で終わる単離されたＤｂ３−ｃＤＮＡのヌクレオチド配
列を示す。さらにまた、配列番号：１および配列番号：
２は、Ｄｂ３−ｃＤＮＡ配列から得られるタンパク質の
アミノ酸配列を示す。
で終わる単離されたＤｂ３−ｃＤＮＡのヌクレオチド配
列を示す。さらにまた、配列番号：１および配列番号：
２は、Ｄｂ３−ｃＤＮＡ配列から得られるタンパク質の
アミノ酸配列を示す。
【００４９】配列番号：３および配列番号：４は、実施
例１に記されるオリゴデオキシヌクレオチドを示す。
例１に記されるオリゴデオキシヌクレオチドを示す。
【００５０】図１は、時間に対してプロットされた、全
細胞放電によってアフリカツメガエル卵母細胞において
測定されたアセチルコリンに誘導される電流を示す。電
流はナノアンペアーで、時間は秒で示される。卵母細胞
は、ショウジョウバエα１，α２およびβ３サブユニッ
トをコードするｃＤＮＡ発現プラスミドを注射された。
アセチルコリン適用の時刻は横バーで確認される。
細胞放電によってアフリカツメガエル卵母細胞において
測定されたアセチルコリンに誘導される電流を示す。電
流はナノアンペアーで、時間は秒で示される。卵母細胞
は、ショウジョウバエα１，α２およびβ３サブユニッ
トをコードするｃＤＮＡ発現プラスミドを注射された。
アセチルコリン適用の時刻は横バーで確認される。
【００５１】
【実施例】例１ 前記ポリヌクレオチド配列の単離 一般にポリヌクレオチドは組み換えＤＮＡ技術の標準方
法によって操作された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８９）。ヌクレオチドおよびタンパク質配列
は、パッケージＧＣＧ、バージョン１０．０（ＧＣＧ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉ
ｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳ
Ａ）を用いて、ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓの用語で
処理された。
法によって操作された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８９）。ヌクレオチドおよびタンパク質配列
は、パッケージＧＣＧ、バージョン１０．０（ＧＣＧ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉ
ｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳ
Ａ）を用いて、ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓの用語で
処理された。
【００５２】ＰＣＲの手段による部分ポリヌクレオチド
配列の単離 キイロショウジョウバエＡＲＤサブユニットのタンパク
質配列対ゲノムキイロショウジョウバエのデータベース
を用いるデータベース検索に基づいて、アミノ酸レベル
においてＡＲＤに対して２８％同一性をもつ核酸領域が
同定された。オリゴデオキシヌクレオチドプライマー
（ｄｇ１センス：５’−ＴＧＧＣＡＲＣＣＩＴＣＩＣＡ
ＲＴＡＹＧＡ−３’，ｄｇ２アンチ：５’−ＣＡＴＲＡ
ＴＹＴＴＹＴＣＩＣＣＩＣＣＣＡＴ−３’）は、この部
分配列に基づいて誘導された。ＲＮＡは、キイロショウ
ジョウバエの胚からＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ Ｂ
ＲＬ）の方法によって、製造者の指示にしたがって単離
された。このＲＮＡ１０μｇをｃＤＮＡ第１鎖合成に使
用した（ｃＤＮＡ第１鎖合成のためのＳｕｐｅｒｓｃｒ
ｉｐｔ ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔ
ｅｍ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、製造者の指示による、反応
温度４５℃）。次いで、各場合上記第１鎖ｃＤＮＡの１
／１００を、オリゴヌクレオチドｄｇ１センスおよびｄ
ｇ２アンチを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
おいて使用した（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、組み換え
体，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）。ＰＣＲパラメーターは、次
のとおりであった：９４℃，１分；３５回（９４℃，３
０ｓ；５５℃，３０ｓ；７２℃，４５ｓ）。これによっ
て、アガロースゲル（１％）において識別できない約
０．６ｋｂバンドを得た。このバンドをｐＣＲ ＴＯＰ
Ｏキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてサブクーン
化した。
配列の単離 キイロショウジョウバエＡＲＤサブユニットのタンパク
質配列対ゲノムキイロショウジョウバエのデータベース
を用いるデータベース検索に基づいて、アミノ酸レベル
においてＡＲＤに対して２８％同一性をもつ核酸領域が
同定された。オリゴデオキシヌクレオチドプライマー
（ｄｇ１センス：５’−ＴＧＧＣＡＲＣＣＩＴＣＩＣＡ
ＲＴＡＹＧＡ−３’，ｄｇ２アンチ：５’−ＣＡＴＲＡ
ＴＹＴＴＹＴＣＩＣＣＩＣＣＣＡＴ−３’）は、この部
分配列に基づいて誘導された。ＲＮＡは、キイロショウ
ジョウバエの胚からＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ Ｂ
ＲＬ）の方法によって、製造者の指示にしたがって単離
された。このＲＮＡ１０μｇをｃＤＮＡ第１鎖合成に使
用した（ｃＤＮＡ第１鎖合成のためのＳｕｐｅｒｓｃｒ
ｉｐｔ ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔ
ｅｍ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、製造者の指示による、反応
温度４５℃）。次いで、各場合上記第１鎖ｃＤＮＡの１
／１００を、オリゴヌクレオチドｄｇ１センスおよびｄ
ｇ２アンチを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
おいて使用した（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、組み換え
体，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）。ＰＣＲパラメーターは、次
のとおりであった：９４℃，１分；３５回（９４℃，３
０ｓ；５５℃，３０ｓ；７２℃，４５ｓ）。これによっ
て、アガロースゲル（１％）において識別できない約
０．６ｋｂバンドを得た。このバンドをｐＣＲ ＴＯＰ
Ｏキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてサブクーン
化した。
【００５３】キイロショウジョウバエ組織からのポリ−
Ａ含有ＲＮＡの単離、およびｃＤＮＡライブラリーの構
築 ｃＤＮＡライブラリーのためのＲＮＡは、キイロショウ
ジョウバエの胚および幼虫から、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂ
ｃｏ ＢＲＬ）を用いて製造者の指示にしたがって単離
された。ポリ−Ａ含有ＲＮＡは、ここで、Ｄｙｎａ Ｂ
ｅａｄｓ２８０（Ｄｙｎａｌ）上での精製によってこの
ＲＮＡから単離された。これらのポリ−Ａ含有ＲＮＡ５
μｇを、続いて、λ−ＺＡＰ−ＣＭＶベクターを用いる
ｃＤＮＡライブラリーの構築において使用した（ｃＤＮ
Ａ合成キット、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キットおよびＺＡ
Ｐ−ｃＤＮＡ Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩゴールドクロ
ーニングキット、すべてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ製）。
Ａ含有ＲＮＡの単離、およびｃＤＮＡライブラリーの構
築 ｃＤＮＡライブラリーのためのＲＮＡは、キイロショウ
ジョウバエの胚および幼虫から、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂ
ｃｏ ＢＲＬ）を用いて製造者の指示にしたがって単離
された。ポリ−Ａ含有ＲＮＡは、ここで、Ｄｙｎａ Ｂ
ｅａｄｓ２８０（Ｄｙｎａｌ）上での精製によってこの
ＲＮＡから単離された。これらのポリ−Ａ含有ＲＮＡ５
μｇを、続いて、λ−ＺＡＰ−ＣＭＶベクターを用いる
ｃＤＮＡライブラリーの構築において使用した（ｃＤＮ
Ａ合成キット、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キットおよびＺＡ
Ｐ−ｃＤＮＡ Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩゴールドクロ
ーニングキット、すべてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ製）。
【００５４】ｃＤＮＡから完全ポリヌクレオチド配列の
単離 １０6プラーク形成単位によるスクリーニングを、ＤＩ
Ｇシステムによって実施した（全試薬および消耗品はＢ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ製、”Ｔｈｅ
ＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ ｆ
ｏｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍにおける指示
にしたがう）。使用されるＤＮＡプローブは、ジゴキシ
ゲニン標識ｄＵＴＰを用いてＰＣＲによって調製され
た。ハイブリダイゼーションは、ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈ
ｙｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）にお
いて４２℃で一夜遂行された。ナイロンメンブラン上の
標識ＤＮＡは、Ｘ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ Ｍ
Ｐ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて化学発光（ＣＤＰ−Ｓ
ｔｅｒ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に
よって検出された。単一にされ、そしてハイブリダイゼ
ーションにおいてポジティブであったプラークを、イン
・ビボ切除によってプラスミド（ｐＣＭＶ）に移した
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キッ
ト）。同定のために、単離されたプラスミドを、Ｔ３お
よびＴ７プライマーを用いる初期の配列決定にかける
（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ，ＡＢＩ，
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌ
ｙｚｅｒ）。ＤＢ３の完全ポリヌクレオチド配列は、Ａ
ＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙ
ｚｅｒを用いて、Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＡ
ＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃ
ｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ，ＡＢＩの方
法によるプライマーウォーキングによって決定された。
単離 １０6プラーク形成単位によるスクリーニングを、ＤＩ
Ｇシステムによって実施した（全試薬および消耗品はＢ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ製、”Ｔｈｅ
ＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ ｆ
ｏｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍにおける指示
にしたがう）。使用されるＤＮＡプローブは、ジゴキシ
ゲニン標識ｄＵＴＰを用いてＰＣＲによって調製され
た。ハイブリダイゼーションは、ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈ
ｙｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）にお
いて４２℃で一夜遂行された。ナイロンメンブラン上の
標識ＤＮＡは、Ｘ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ Ｍ
Ｐ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて化学発光（ＣＤＰ−Ｓ
ｔｅｒ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に
よって検出された。単一にされ、そしてハイブリダイゼ
ーションにおいてポジティブであったプラークを、イン
・ビボ切除によってプラスミド（ｐＣＭＶ）に移した
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キッ
ト）。同定のために、単離されたプラスミドを、Ｔ３お
よびＴ７プライマーを用いる初期の配列決定にかける
（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ，ＡＢＩ，
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌ
ｙｚｅｒ）。ＤＢ３の完全ポリヌクレオチド配列は、Ａ
ＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙ
ｚｅｒを用いて、Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＡ
ＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃ
ｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ，ＡＢＩの方
法によるプライマーウォーキングによって決定された。
【００５５】例２ 新規なショウジョウバエβ３サブユニットを含有する組
み換え昆虫アセチルコリン受容体のアフリカツメガエル
卵母細胞における発現 卵母細胞は、ショウジョウバエα１，α２およびβ３サ
ブユニットをコードするｃＤＮＡ発現プラスミドを同時
に注射された。αサブユニットはｐｃＤＮＡ３中に、β
サブユニットはｐＣＭＶ中に、上記のようにクローン化
された。３〜５日間インキュベーション後、卵母細胞膜
を通す電流を、全細胞放電を用いて先のように測定され
た（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９６）。この最後
まで、細胞膜における電位差を、−８０ｍＶにおいて一
定に維持し、そして細胞をアセチルコリン（１０μＭ）
で刺激した。刺激直後に、イオンチャンネルの活性化を
象徴する強い内部電流を測定した（図１）。これは、新
規なショウジョウバエβ３サブユニットが、２つの同時
注射されたαサブユニットの１つ、または両サブユニッ
トをもつ機能的受容体を形成することを示唆している。
み換え昆虫アセチルコリン受容体のアフリカツメガエル
卵母細胞における発現 卵母細胞は、ショウジョウバエα１，α２およびβ３サ
ブユニットをコードするｃＤＮＡ発現プラスミドを同時
に注射された。αサブユニットはｐｃＤＮＡ３中に、β
サブユニットはｐＣＭＶ中に、上記のようにクローン化
された。３〜５日間インキュベーション後、卵母細胞膜
を通す電流を、全細胞放電を用いて先のように測定され
た（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９６）。この最後
まで、細胞膜における電位差を、−８０ｍＶにおいて一
定に維持し、そして細胞をアセチルコリン（１０μＭ）
で刺激した。刺激直後に、イオンチャンネルの活性化を
象徴する強い内部電流を測定した（図１）。これは、新
規なショウジョウバエβ３サブユニットが、２つの同時
注射されたαサブユニットの１つ、または両サブユニッ
トをもつ機能的受容体を形成することを示唆している。
【００５６】
【表２】
【００５７】
【表３】
【００５８】
【表４】
【００５９】
【表５】
【００６０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Bayer Aktiengesellschaft <120> Nucleic acids encoding new insect acetylcholine receptor β subunits <130> 200011004 <150> DE 199 59 582.8 <151> 1999-12-10 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1539 <212> DNA <213> Drosophila melanogaster <220> <221> CDS <222> (43)..(1365) <400> 1 attcggcacg agggtacatc cgaaacaaag gcgcgctgaa ca atg acg acg act 54 Met Thr Thr Thr 1 ccc aag ata aag gca cca gtt tcc ggt cct gga ctg cca cta ctg ctg 102 Pro Lys Ile Lys Ala Pro Val Ser Gly Pro Gly Leu Pro Leu Leu Leu 5 10 15 20 caa atg cta atg ggg atg ctt ctt atg ggg ctg act tcc gtg cca ggc 150 Gln Met Leu Met Gly Met Leu Leu Met Gly Leu Thr Ser Val Pro Gly 25 30 35 gcc act gcc acc gcg gac ccc aag aac gcc aat gtc aag gcc ctg gat 198 Ala Thr Ala Thr Ala Asp Pro Lys Asn Ala Asn Val Lys Ala Leu Asp 40 45 50 cgc ctc cac gcc ggc ctg ttc acg aac tac gac agc gat gtg cag ccg 246 Arg Leu His Ala Gly Leu Phe Thr Asn Tyr Asp Ser Asp Val Gln Pro 55 60 65 gtg ttc caa gga acc ccc acg aac gtg tcc ctg gaa atg gtg gtc acc 294 Val Phe Gln Gly Thr Pro Thr Asn Val Ser Leu Glu Met Val Val Thr 70 75 80 tac ata gac atc gac gag ttg aac ggc aag ctg acc acc cac tgc tgg 342 Tyr Ile Asp Ile Asp Glu Leu Asn Gly Lys Leu Thr Thr His Cys Trp 85 90 95 100 ctg aat ctc cga tgg aga gac gag gag cgc gtg tgg caa ccg tca caa 390 Leu Asn Leu Arg Trp Arg Asp Glu Glu Arg Val Trp Gln Pro Ser Gln 105 110 115 tat gac aac atc acg cag atc act ttg aag tcc agc gag gtc tgg acc 438 Tyr Asp Asn Ile Thr Gln Ile Thr Leu Lys Ser Ser Glu Val Trp Thr 120 125 130 ccc caa atc aca ctc ttc aac ggc gac gaa ggt ggc ctg atg gcc gaa 486 Pro Gln Ile Thr Leu Phe Asn Gly Asp Glu Gly Gly Leu Met Ala Glu 135 140 145 acc cag gtg acc ctc agc cac gat ggc cac ttc cgg tgg atg cct cca 534 Thr Gln Val Thr Leu Ser His Asp Gly His Phe Arg Trp Met Pro Pro 150 155 160 gcc gtg tac acg gcc tac tgc gaa ctc aac atg ctc aac tgg ccc cac 582 Ala Val Tyr Thr Ala Tyr Cys Glu Leu Asn Met Leu Asn Trp Pro His 165 170 175 180 gac aag cag agc tgc aag ttg aag atc ggc tcc tgg ggc ctg aag gtc 630 Asp Lys Gln Ser Cys Lys Leu Lys Ile Gly Ser Trp Gly Leu Lys Val 185 190 195 gtc ctg ccg gag aac ggc acg gcg aga gga gag tcc ctt gac cac gac 678 Val Leu Pro Glu Asn Gly Thr Ala Arg Gly Glu Ser Leu Asp His Asp 200 205 210 gac ctg gtt cag tca ccg gag tgg gaa atc gtg gac tcg cga gcc cac 726 Asp Leu Val Gln Ser Pro Glu Trp Glu Ile Val Asp Ser Arg Ala His 215 220 225 ttt gtc agt cag gac tac tac ggc tac atg gag tac act ctg acg gct 774 Phe Val Ser Gln Asp Tyr Tyr Gly Tyr Met Glu Tyr Thr Leu Thr Ala 230 235 240 cag cgg cgc tcc tcc atg tac acg gcc gtc atc tac aca ccc gcg tcc 822 Gln Arg Arg Ser Ser Met Tyr Thr Ala Val Ile Tyr Thr Pro Ala Ser 245 250 255 260 tgc atc gtc atc ctg gcc ctc tca gcc ttc tgg ctg cct ccc cac atg 870 Cys Ile Val Ile Leu Ala Leu Ser Ala Phe Trp Leu Pro Pro His Met 265 270 275 ggc ggc gag aag atc atg atc aac ggc ctg ctc atc atc gtg atc gcc 918 Gly Gly Glu Lys Ile Met Ile Asn Gly Leu Leu Ile Ile Val Ile Ala 280 285 290 gcc ttc ctc atg tac ttc gcc cag ctc ctg cca gtg ctg tcc aac aat 966 Ala Phe Leu Met Tyr Phe Ala Gln Leu Leu Pro Val Leu Ser Asn Asn 295 300 305 act cca ctt gtg gta atc ttc tac agc acc agc ctg ctg tat ctg agc 1014 Thr Pro Leu Val Val Ile Phe Tyr Ser Thr Ser Leu Leu Tyr Leu Ser 310 315 320 gtc tcc acc atc gtc gag gtt cta gtt ctg tac ctg gcc aca ggc aag 1062 Val Ser Thr Ile Val Glu Val Leu Val Leu Tyr Leu Ala Thr Gly Lys 325 330 335 340 cac aag agg cgc ctg ccg gag gcg ctg aga aag ctg ctg cac ggg cac 1110 His Lys Arg Arg Leu Pro Glu Ala Leu Arg Lys Leu Leu His Gly His 345 350 355 ctg ggc acg tgg ctg ctg ctc tcg gtg ttc agc acc act ggc gag tcg 1158 Leu Gly Thr Trp Leu Leu Leu Ser Val Phe Ser Thr Thr Gly Glu Ser 360 365 370 cag gcg gag aag acc aaa gag atg gac gag cac ccg tac gag gag gcg 1206 Gln Ala Glu Lys Thr Lys Glu Met Asp Glu His Pro Tyr Glu Glu Ala 375 380 385 gac gag cag gag tcc agt ccg ctg ggc atc aac cac acc gag gtg ccg 1254 Asp Glu Gln Glu Ser Ser Pro Leu Gly Ile Asn His Thr Glu Val Pro 390 395 400 ggc gcc aag gcc aac cag ttc gac tgg gcg ctg ctg gcc acc gcc gtg 1302 Gly Ala Lys Ala Asn Gln Phe Asp Trp Ala Leu Leu Ala Thr Ala Val 405 410 415 420 gac cgc att tcc ttc gtt tcc ttc agc ctg gcc ttc ctc att ctg gcc 1350 Asp Arg Ile Ser Phe Val Ser Phe Ser Leu Ala Phe Leu Ile Leu Ala 425 430 435 atc agg tgc tcc gtg tagggatgct cgagactcaa ggccacatcc caagccagtg 1405 Ile Arg Cys Ser Val 440 cgcactctga actagttttg catttgcgat ttcatgtatt taatgtgtgt gcgaacttat 1465 aattatttaa tgatgagacc tcgtatggaa taaaggacct ctgccgaatg tctgcttaca 1525 aaaaaaaaaa aaaa 1539 <210> 2 <211> 441 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 2 Met Thr Thr Thr Pro Lys Ile Lys Ala Pro Val Ser Gly Pro Gly Leu 1 5 10 15 Pro Leu Leu Leu Gln Met Leu Met Gly Met Leu Leu Met Gly Leu Thr 20 25 30 Ser Val Pro Gly Ala Thr Ala Thr Ala Asp Pro Lys Asn Ala Asn Val 35 40 45 Lys Ala Leu Asp Arg Leu His Ala Gly Leu Phe Thr Asn Tyr Asp Ser 50 55 60 Asp Val Gln Pro Val Phe Gln Gly Thr Pro Thr Asn Val Ser Leu Glu 65 70 75 80 Met Val Val Thr Tyr Ile Asp Ile Asp Glu Leu Asn Gly Lys Leu Thr 85 90 95 Thr His Cys Trp Leu Asn Leu Arg Trp Arg Asp Glu Glu Arg Val Trp 100 105 110 Gln Pro Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Thr Gln Ile Thr Leu Lys Ser Ser 115 120 125 Glu Val Trp Thr Pro Gln Ile Thr Leu Phe Asn Gly Asp Glu Gly Gly 130 135 140 Leu Met Ala Glu Thr Gln Val Thr Leu Ser His Asp Gly His Phe Arg 145 150 155 160 Trp Met Pro Pro Ala Val Tyr Thr Ala Tyr Cys Glu Leu Asn Met Leu 165 170 175 Asn Trp Pro His Asp Lys Gln Ser Cys Lys Leu Lys Ile Gly Ser Trp 180 185 190 Gly Leu Lys Val Val Leu Pro Glu Asn Gly Thr Ala Arg Gly Glu Ser 195 200 205 Leu Asp His Asp Asp Leu Val Gln Ser Pro Glu Trp Glu Ile Val Asp 210 215 220 Ser Arg Ala His Phe Val Ser Gln Asp Tyr Tyr Gly Tyr Met Glu Tyr 225 230 235 240 Thr Leu Thr Ala Gln Arg Arg Ser Ser Met Tyr Thr Ala Val Ile Tyr 245 250 255 Thr Pro Ala Ser Cys Ile Val Ile Leu Ala Leu Ser Ala Phe Trp Leu 260 265 270 Pro Pro His Met Gly Gly Glu Lys Ile Met Ile Asn Gly Leu Leu Ile 275 280 285 Ile Val Ile Ala Ala Phe Leu Met Tyr Phe Ala Gln Leu Leu Pro Val 290 295 300 Leu Ser Asn Asn Thr Pro Leu Val Val Ile Phe Tyr Ser Thr Ser Leu 305 310 315 320 Leu Tyr Leu Ser Val Ser Thr Ile Val Glu Val Leu Val Leu Tyr Leu 325 330 335 Ala Thr Gly Lys His Lys Arg Arg Leu Pro Glu Ala Leu Arg Lys Leu 340 345 350 Leu His Gly His Leu Gly Thr Trp Leu Leu Leu Ser Val Phe Ser Thr 355 360 365 Thr Gly Glu Ser Gln Ala Glu Lys Thr Lys Glu Met Asp Glu His Pro 370 375 380 Tyr Glu Glu Ala Asp Glu Gln Glu Ser Ser Pro Leu Gly Ile Asn His 385 390 395 400 Thr Glu Val Pro Gly Ala Lys Ala Asn Gln Phe Asp Trp Ala Leu Leu 405 410 415 Ala Thr Ala Val Asp Arg Ile Ser Phe Val Ser Phe Ser Leu Ala Phe 420 425 430 Leu Ile Leu Ala Ile Arg Cys Ser Val 435 440 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 tggcarccnt cncartayga 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 catratytty tcnccnccca t 21
【図１】全細胞放電によってアフリカツメガエル卵母細
胞において測定された時間に対してプロットされたアセ
チルコリンにより誘導される電流のグラフである。
胞において測定された時間に対してプロットされたアセ
チルコリンにより誘導される電流のグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/566 (Ｃ１２Ｎ 1/21 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 クリストフ・メトフエツセル ドイツ42327ブツペルタール・キルヒホフ シユトラーセ94 (72)発明者 トマス・シユルテ ドイツ51061ケルン・アンデアルートヘン ６
Claims (22)
- 【請求項１】 （ａ）配列番号：１の配列、（ｂ）長さ
少なくとも１４塩基対である（ａ）の下で定義された配
列のサブ配列、（ｃ）（ａ）の下で定義された配列とハ
イブリダイズする配列、（ｄ）（ａ）の下で定義された
配列の位置４３と位置１３６８間の配列に少なくとも７
０％同一性をもつ配列、（ｅ）（ａ）の下で定義された
配列に相補的である配列、および（ｆ）遺伝コードの縮
重により、（ａ）〜（ｄ）の下で定義された配列がコー
ドするような同じアミノ酸配列をコードする配列、から
なる群から選ばれる配列を含んでなる核酸。 - 【請求項２】 請求項１記載の少なくとも１つの核酸を
含んでなるベクター。 - 【請求項３】 核酸分子が、原核もしくは真核細胞にお
いて核酸の発現を確実にする調節配列に操作可能に結合
されることを特徴とする、請求項２記載のベクター。 - 【請求項４】 請求項１記載の核酸、または請求項２ま
たは３記載のベクターを含む宿主細胞。 - 【請求項５】 宿主細胞が原核もしくは真核細胞である
ことを特徴とする、請求項４記載の宿主細胞。 - 【請求項６】 原核細胞が大腸菌(E. coli)であること
を特徴とする、請求項５記載の宿主細胞。 - 【請求項７】 真核細胞が哺乳類もしくは昆虫細胞であ
ることを特徴とする、請求項５記載の宿主細胞。 - 【請求項８】 請求項１記載の核酸によってコードされ
ているポリペプチド。 - 【請求項９】 アセチルコリン受容体βサブユニットの
生物学的機能を発揮し、そして配列番号：２の配列に少
なくとも４０％同一性をもつアミノ酸配列を含むポリペ
プチド。 - 【請求項１０】 請求項８または９記載の少なくとも１
種のポリペプチドを含んでなるアセチルコリン受容体。 - 【請求項１１】 （ａ）請求項１記載の核酸の発現を確
実にする条件下で、請求項４〜７の１つに記載の宿主細
胞を培養し、そして（ｂ）細胞もしくは培養基からポリ
ペプチドを得ること、を含む、請求項８または９記載の
ポリペプチドの製造方法。 - 【請求項１２】 請求項８または９記載のポリペプチ
ド、または請求項１０記載の受容体と特異的に反応する
抗体。 - 【請求項１３】 請求項１記載の核酸を含有するトラン
スジェニック無脊椎動物。 - 【請求項１４】 トランスジェニック無脊椎動物が、キ
イロショウジョウバエもしくはケノルハブヂチス・エレ
ガンスであることを特徴とする、請求項１３記載のトラ
ンスジェニック無脊椎動物。 - 【請求項１５】 請求項１記載の核酸、または請求項２
または３記載のベクターが導入される、請求項１３また
は１４記載のトランスジェニック無脊椎動物の作成方
法。 - 【請求項１６】 請求項１３または１４記載の無脊椎動
物のトランスジェニック子孫。 - 【請求項１７】 （ａ）それ自体既知の方式における全
化学合成工程、または（ｂ）オリゴヌクレオチドを化学
合成し、オリゴヌクレオチドを標識し、オリゴヌクレオ
チドを昆虫ｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡとハイブリダ
イズさせ、ポジティブクローンを選択し、そしてポジテ
ィブクローンからハイブリダイズするＤＮＡを単離する
工程、または（ｃ）オリゴヌクレオチドの化学合成およ
びＰＣＲの手段による標的ＤＮＡの増幅工程、を含む、
請求項１記載の核酸の作成方法。 - 【請求項１８】 昆虫細胞において、請求項１記載の核
酸の転写を天然に調節し、そして特異的発現を確実にす
る調節領域。 - 【請求項１９】 （ａ）請求項４〜７のいずれかに記載
の宿主細胞を提供する工程、（ｂ）化合物もしくは化合
物の混合物の存在下で宿主細胞を培養する工程、および
（ｃ）変化された伝達性を検出する工程、を含む、新規
な、作物保護のための活性化合物あるいはヒトまたは動
物の治療のための製薬学的に活性な化合物、特に、請求
項１０記載の受容体の伝達性を変化する化合物の発見方
法。 - 【請求項２０】 （ａ）請求項４〜７のいずれかに記載
の宿主細胞、請求項８または９記載のポリペプチド、あ
るいは請求項１０記載の受容体を、宿主細胞、ポリペプ
チドもしくは受容体と少なくとも１種の化合物の相互作
用を可能にする条件下で、ある化合物もしくは化合物の
混合物と接触させる工程、および（ｂ）受容体に特異的
に結合する化合物を決定する工程、を含む、請求項１０
記載の受容体に結合する化合物の発見方法。 - 【請求項２１】 （ａ）請求項４〜７のいずれかに記載
の宿主細胞、または請求項１３または１４記載のトラン
スジェニック無脊椎動物を、化合物もしくは化合物の混
合物と接触させる工程、（ｂ）受容体濃度を決定する工
程、および（ｃ）受容体発現に特異的に影響を与える化
合物を決定する工程、を含む、請求項１０記載の受容体
の発現を変化する化合物の発見方法。 - 【請求項２２】 新規な、作物保護のための活性化合物
あるいはヒトまたは動物の治療のための製薬学的に活性
な化合物を発見するための、請求項１記載の核酸、請求
項２または３記載のベクター、請求項４〜７のいずれか
に記載の宿主細胞、請求項８または９記載のポリペプチ
ド、請求項１０記載のアセチルコリン受容体、請求項１
２記載の抗体、請求項１３または１４記載のトランスジ
ェニック無脊椎動物、あるいは請求項１８記載の調節領
域の使用。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| DE19959582.8 | 1999-12-10 | ||
| DE19959582A DE19959582A1 (de) | 1999-12-10 | 1999-12-10 | Nukleinsäuren, die für neue Acetylcholinrezeptor-beta-Untereinheiten von Insekten kodieren |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001224383A true JP2001224383A (ja) | 2001-08-21 |
Family
ID=7932141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000366880A Pending JP2001224383A (ja) | 1999-12-10 | 2000-12-01 | 新規な昆虫アセチルコリン受容体βサブユニットをコードする核酸 |
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| JP (1) | JP2001224383A (ja) |
| DE (1) | DE19959582A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
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|---|---|---|---|---|
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- 2000-12-08 US US09/732,680 patent/US20020046412A1/en not_active Abandoned
Also Published As
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