FR2795075A1 - CLONAGE, EXPRESSION ET CARACTERISATION D'UN ADNc CODANT POUR UN RECEPTEUR GAMMA-HYDROXYBUTYRATE (GHB) DE CERVEAU DE RAT - Google Patents

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Abstract

L'invention concerne un nouveau polypeptide récepteur gamma-hydroxy-butyrate (GHB), caractérisé par ses activités fonctionnelles, le clonage de l'ADNc codant pour ce récepteur, des vecteurs et cellules transformées, des méthodes de sélection de composés utilisables à titre de médicament pour la prévention et/ ou le traitement de pathologies associées directement ou indirectement à l'activité de ce récepteur ou de son ligand naturel, le GHB.

Description

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CLONAGE, EXPRESSION ET CARACTERISATION D'UN ADNc CODANT POUR UN RECEPTEUR GAMMA-HYDROXYBUTYRATE (GHB) DE CERVEAU DE RAT.
L'invention concerne un nouveau polypeptide récepteur gamma-hydroxybutyrate (GHB), caractérisé par ses activités fonctionnelles, le clonage de l'ADNc codant pour ce récepteur, des vecteurs et cellules transformées, des méthodes de sélection de composés utilisables à titre de médicament pour la prévention et/ou le traitement de pathologies associées directement ou indirectement à l'activité de ce récepteur ou de son ligand naturel, le GHB.
Le gamma-hydroxybutyrate (GHB) est une substance endogène du système nerveux central des mammifères (Roth et Giarman, 1970) possédant une distribution régionale hétérogène (Snead et Morley, 1981). Il est synthétisé surtout par la transamination de l'acide gamma amino butyrique (GABA) cérébral en semialdéhyde succinique (SSA) suivie par la réduction de ce dernier en GHB par la semialdéhyde succinate réductase (SSR) (Andriamampandry et al., 1998). Le GHB est surtout concentré dans les terminaisons nerveuses, au niveau des synaptosomes (Snead, 1987) où il est stocké (Maitre, 1997).
La dépolarisation neuronale induite par les ions potassium ou par la présence de la vératridine libère le GHB dans l'espace extracellulaire à partir duquel il est transporté par un phénomène actif avec un Km de 46 M. L'interaction du GHB avec des sites récepteurs spécifiques, uniquement exprimés par des neurones ou des clones d'origine neuronale en culture, déclenche le plus souvent des hyperpolarisations membranaires avec une diminution de l'entrée des ions calcium (Harris et al., 1989).
Les récepteurs GHB prédominent dans le cortex et l'hippocampe, mais aussi dans les régions dopaminergiques du cerveau (tubercules olfactifs, striatum, aire tegmentale ventrale, substantia nigra, cortex frontal). Les régions caudales du cerveau, par contre, comme le cervelet et le tronc cérébral en sont dépourvus, de même que les tissus périphériques comme le c#ur, les reins, le foie (Hechler et al., 1992 ; Snead et Liu, 1984). Cette distribution, jointe à une ontogenèse et une pharmacologie spécifique, en font des récepteurs distincts des récepteurs GABA-B malgré l'existence d'analogies fonctionnelles avec les récepteurs GHB (Benavides et al., 1982 ; Snead,
1994).
Sur le plan structural, ces récepteurs sont de la famille des protéines à 7 domaines transmembranaires, liés à des protéines G du type Gi ou Go (Ratomponirina et al., 1995).
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Parmi les rôles fonctionnels des récepteurs GHB, la régulation de l'activité dopaminergique nigro-striée et méso-cortico-limbique est la mieux connue (Roth et al., 1980). Le tonus GHBergique endogène induit une hyperpolarisation des terminaisons dopaminergiques et une hypodopaminergie extracellulaire. Néanmoins, si on l'administre à des doses pharmacologiques, le GHB induit une accumulation tissulaire de dopamine qui précède une augmentation importante de la libération du neurotransmetteur dans les aires dopaminergiques. Le GHB interfère également avec l'activité opioide cérébrale, puisqu'un certain nombre de ses effets neuropharmacologiques et neurophysiologiques sont bloqués par la naloxone. Ces modifications de l'activité opioide engendrée par le GHB peuvent être la conséquence, au moins dans le striatum, des perturbations de l'activité dopaminergique. On sait en effet que la dopamine régule l'expression des peptides proenképhaline et prodynorphine dans certains neurones striataux. Récemment, des résultats ont montré que le GHB inhibait la libération de GABA dans certaines régions cérébrales, en particulier le thalamus et le cortex frontal. Cette régulation s'effectue vraisemblablement via des récepteurs GHB présynaptiques existants dans ces régions. L'administration de fortes doses de GHB conduit chez l'animal, après un temps de latence de quelques dizaines de minutes, à une désensibilisation des récepteurs GHB. De ce fait, les influences potentialisatrices de la libération de GABA l'emportent, de façon globale, sur les influences inhibitrices représentées pour une grande part par le système GHB et ses récepteurs spécifiques. Il en résulte une augmentation de la libération de GABA qui peut-être une des raisons de la modulation de l'activité dopaminergique. Ces augmentations de GABA et de dopamine induites par l'administration de fortes doses de GHB peuvent être responsables, pour une large part, des effets neuropharmacologiques du GHB. Sur le plan comportemental et fonctionnel, l'administration per os du GHB à doses pharmacologiques (plusieurs centaines de milligrammes) induit une sédation. A des doses plus fortes le GHB induit un sommeil réparateur avec un réveil agrémenté d'une humeur tonique le plus souvent. C'est pourquoi le GHB possède depuis longtemps des indications en anesthésie humaine (Bessman et Skolnik, 1964 ; Laborit, 1973 ; Mamelak et al. 1986).
Le GHB est aussi utilisé pour la régularisation du sommeil chez le narcoleptique (Laborit, 1973 ; et Skolnik, 1964 ; Mamelak et al. 1986). Il est important de signaler qu'aucun problème d'assuétude ou d'addiction n'a été rapporté chez ces malades traités chroniquement avec du GHB (Gallimberti et al., 1993 ; Biggio et al., 1992).
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Plusieurs autres études plaident depuis quelques années en faveur de l'utilisation du GHB comme substance de substitution dans le cas de sevrage à plusieurs drogues dont l'héroïne, la cocaïne et l'éthanol (Fadda et al., 1989 ; Gallimberti et al. ; Biggio et al., 1992). L'administration de GHB réduit la consommation de l'alcool et permet un sevrage plus facile (Fadda et al., 1988). Chez le rat, le GHB réduit l'auto-administration de cocaïne modulant les effets renforçants liés à la prise aiguë de la drogue. Chez les patients ayant interrompu brutalement leur traitement substitutif à la méthadone, la prise de GHB élimine la plupart des symptômes physiques du sevrage et est bien tolérée (Gallimberti et al., 1992).
Ces résultats sont d'un grand intérêt compte tenu de l'innocuité du GHB, de sa bonne tolérance et de l'absence de problèmes d'assuétude. Si le GHB peut dans certaines conditions, installer une dépendance, celle-ci est fluctuante et difficile à mettre en évidence parce que sans commune mesure avec les phénomènes de dépendance rencontrés avec l'alcool, l'héroïne ou la cocaïne.
L'implication du GHB dans ces problèmes physiopathologiques souligne par conséquent l'intérêt que présente la connaissance des récepteurs GHB, de leur structure, de leur fonctionnalité et de leur pharmacologie.
En outre, le clonage de ces récepteurs et leur hyperexpression en culture de cellules eucaryotes peuvent faciliter le triage et la sélection de molécules originales, présentant une bonne affinité pour le récepteur. Ces molécules peuvent être triées à partir d'une chimiothèque et cataloguées quant à leur pouvoir agoniste, agoniste inverse, ou antagoniste du récepteur. Ces molécules peuvent avoir plusieurs applications potentielles en thérapeutique ou comme agents pharmacologiques.
Ainsi, il reste aujoud'hui un grand besoin d 'identifier les récepteurs GHB.
Ceci est justement l'objet de la présente invention.
L'invention concerne un récepteur GHB (GHB-R) purifié, comprenant au moins une protéine d'un poids moléculaire d'environ 56 kDa chez le rat, caractérisé en ce qu'il est capable de fixer le GHB, le trans-4-hydroxycrotonate ou le p-chloro-phényltranshydroxycrotonate.
De préférence, le récepteur GHB selon l'invention ne fixe pas le GABA, le glutamate et le baclofen.
L'invention concerne des polypeptides, caractérisés en ce qu'ils sont un constituant d'un récepteur GHB selon l'invention.
Il doit être compris que l'invention ne concerne pas les polypeptides sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement. En effet,
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l'invention concerne les peptides obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenus par recombinaison génétique, ou encore par synthèse chimique et pouvant alors comporter des amino-acides non naturels, comme cela sera décrit ciaprès. La production d'un polypeptide recombinant, qui peut être réalisée en utilisant l'une des séquences nucléotidiques selon l'invention ou un fragment d'une de ces séquences, est particulièrement avantageuse car elle permet d'obtenir un niveau de pureté accrue du polypeptide désiré.
L'invention concerne donc un polypeptide purifié, isolé ou recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'au moins 5, de préférence d'au moins 10 à 15, acides aminés consécutifs de la séquence d'acides aminés choisie parmi le groupe comprenant la séquence SEQ ID No.1 et les séquences de polypeptides homologues ou variants du polypeptide de séquence SEQ ID No. 1.
On entendra désigner dans la présente invention le récepteur de séquence d'acides aminés SEQ ID No. 1 selon l'invention également par la dénomination récepteur GHB ou récepteur GHB-R selon l'invention.
On entendra également désigner dans la présente invention par récepteur GHB ou récepteur GHB-R selon l'invention, tout polypeptide purifié, isolé ou recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'au moins 5, de préférence d'au moins 10 à 15, acides aminés consécutifs de la séquence d'acides aminés choisie parmi le groupe comprenant la séquence SEQ ID No.1 et les séquences de polypeptides homologues ou variants du polypeptide de séquence SEQ ID No. 1.
Dans la présente description, on utilisera le terme polypeptide pour désigner également une protéine ou un peptide.
De préférence, la séquence d'au moins 5, de préférence 10 à 15 acides aminés selon l'invention est un fragment biologiquement actif dudit récepteur GHB selon l'invention.
L'invention a également pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend un site de fixation du gamma-hydroxybutyrate (GHB).
L'invention comprend en outre un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend une région constituant un domaine transmembranaire total ou partiel d'un polypeptide selon l'invention, notamment d'un polypeptide de séquence SEQ ID
No. 1 ou une région constituant un domaine hydrophile d'un polypeptide selon l'invention, notamment d'un polypeptide de séquence SEQ ID No. 1.
La séquence d'acides aminés codée par l'ADNc de rat décrite dans la présente demande est représentée schématiquement Figure 3 (séquence SEQ ID No. 1).
L'analyse de cette séquence met en évidence la présence de 7 régions
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transmembranaires (séquences d'acides aminés représentés en caractères gras) caractéristique des récepteurs couplés à la protéine G.
Par polypeptide homologue, on entendra désigner les polypeptides présentant, par rapport au polypeptide de séquence SEQ ID No. 1, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une mutation, notamment ponctuelle, et comprenant au moins 5, de préférence 10 à 15 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No. 1. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80 %, de préférence 90 % ou 95 %, d'identité après alignement avec la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID No.1.
Par polypeptide variant (ou variant protéique), on entendra désigner un polypeptide ayant au moins une des activités du récepteur GHB selon l'invention, notamment sa capacité à fixer de manière spécifique le GHB, notamment des récepteurs GHB apparentés ou de la même famille que le récepteur GHB de séquence SEQ ID No. 1 selon l'invention et comprenant au moins 5, de préférence au moins 10 à 15, acides aminés consécutifs de la séquence d'acides aminés SEQ ID No. 1. Par polypeptide variant, on entendra désigner également tout polypeptide résultant d'épissage alternatif de la séquence nucléique génomique codant pour le récepteur GHB de séquence SEQ ID No. 1 selon l'invention.
On entendra également par polypeptide variant d'un polypeptide de séquence SEQ ID No. 1, un polypeptide naturel, pouvant exister en particulier chez l'être humain, synthétique ou recombinant, et dont la séquence d'acides aminés présente par rapport à la séquence SEQ ID No. 1 au moins une mutation et au plus 10 % de mutation correspondant notamment à une ou plusieurs troncations, délétions, substitutions et/ou additions de résidu d'acide aminé, et comportant une séquence d'au moins 5, de préférence d'au moins 10 à 15, acides aminés consécutifs de la séquence d'acides aminés SEQ ID No.1. Dans le cas présent, les polypeptides variants présentant au moins une mutation seront notamment en partie liés aux pathologies associées à une expression et/ou une activité anormale du récepteur GHB selon l'invention.
Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide codé par une séquence nucléique comportant au minimum 15 nucléotides ou bases, de préférence 20 bases et 30 bases. Ces fragments pourront notamment comporter une mutation ponctuelle, par comparaison à la séquence de polypeptide normal, ou correspondre à des séquences d'acides aminés spécifiques de polypeptides variants, artificiels ou existants chez l'homme, tels que ceux liés à un polymorphisme lié en particulier aux pathologies qui seront citées ci-après.
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Par fragment biologiquement actif, on entendra désigner en particulier un fragment de séquence d'acides aminés de polypeptide : - présentant au moins une des activités du récepteur GHB de séquence SEQ ID No.1 selon l'invention, notamment sa capacité à fixer de manière spécifique un ligand connu du récepteur GHB, tel que le GHB, et/ou - capable d'être reconnu par un anticorps spécifique du récepteur GHB de séquence
SEQ ID No.1 selon l'invention, et/ou - capable d'être reconnu par un composé pouvant, par exemple, en neutralisant la fixation d'un ligand spécifique dudit récepteur GHB de séquence SEQ ID No.1, moduler l'activité du récepteur GHB de séquence SEQ ID No.1, et/ou - plus généralement, constituant un domaine ou motif biologiquement actif du récepteur GHB de séquence SEQ ID No.1 selon l'invention, notamment les fragments comprenant un site de fixation du GHB ou les fragments comprenant un domaine transmembranaire au moins partiel tel que représenté sur la figure 3, ou un domaine hydrophile.
La présente invention a également pour objet des acides nucléiques purifiés ou isolés, caractérisés en ce qu'ils codent pour un polypeptide selon l'invention.
L'invention concerne un acide nucléique purifié, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 12, de préférence au moins 15 ou 20, nucléotides consécutifs de la séquence choisie parmi le groupe comprenant la séquence SEQ ID No.2 ou un de ses fragments, les séquences nucléiques homologues ou variantes de l'acide nucléique de séquence SEQ ID No. 2, leur séquence complémentaire et la séquence de leur ARN correspondant.
L'invention concerne également des séquences nucléiques d'hybridation purifiées comprenant au moins 12 nucléotides, de préférence d'au moins 15 ou 20 nucléotides, caractérisées en ce qu'elles peuvent s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléique selon l'invention, de préférence dans des conditions d'hybridation telles qu'elles assurent au moins 80 % d'homologie, de préférence 90 ou 95 %.
L'invention comprend aussi des méthodes pour le criblage de banques d'ADNc ou d'ADN génomique, pour le clonage d'ADNc ou d'ADN génomique isolé codant pour le récepteur GHB de séquence SEQ ID No.1 selon l'invention, un de ses polypeptides homologues ou variants, ou codant pour leur promoteur et/ou régulateur d'expression, caractérisées en ce qu'elles mettent en #uvre une séquence nucléique selon l'invention.
Parmi ces méthodes, on peut citer notamment :
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- le criblage de banques d'ADNc et le clonage des ADNc isolés (Sambrook et al.,
1989 ; Suggs et al., 1981 ;Woo et al., 1979), à l'aide des séquences nucléiques ~ selon l'invention ; - le criblage de banques génomiques, par exemple de BACs (Chumakov et al., 1992 ;
Chumakov et al., 1995) et éventuellement une analyse génétique en FISH (Cherif et al., 1990) à l'aide de séquences selon l'invention, permettant l'isolement et la localisation chromosomique, puis le séquençage complet des gènes codant pour le récepteur GHB.
L'invention comprend aussi une méthode d'identication des séquences d'acide nucléique promotrices et/ou régulatrices de l'expression dudit récepteur GHB de séquence SEQ ID No. 1, notamment capable de fixer le GHB, d'un de ses polypeptides homologues ou variants, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un acide nucléique selon l'invention, notamment une étape d'hybridation avec un acide nucléique contenu dans une banque d'ADN génomique.
L'invention comprend ainsi une méthode d'identication des séquences d'acide nucléique d'ADNc d'un récepteur GHB, notamment capable de fixer le GHB, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un acide nucléique selon l'invention, notamment une étape d'hybridation avec un acide nucléique contenu dans une banque d'ADNc.
L'invention comprend en particulier des méthodes de criblage et/ou de clonage caractérisées en ce qu'elles comprennent une étape d'hybridation d'un acide nucléique selon l'invention avec un acide nucléique contenu dans une banque génomique ou d'ADNc, notamment pour l'identification des séquences d'acide nucléique promotrices et/ou régulatrices de l'expression ou pour l'identification de la séquence d'acide nucléique de l'ADNc d'un gène codant pour un variant protéique du récepteur GHB de séquence SEQ ID No. 1, capable de fixer ou non le GHB et dont ledit ADNc, ou l'un de ses fragments, présente une homologie de séquence suffisante avec la séquence SEQ ID No. 2, ou l'un de ses fragments, pour s'hybrider avec un acide nucléique selon l'invention.
Les acides nucléiques caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par une des méthodes précédentes selon l'invention, ou les acides nucléiques capables de s'hybrider dans des conditions de forte stringence (homologie d'au moins
80 % entre une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre) avec lesdits acides nucléiques, font partie de l'invention, notamment les acides nucléiques variants ou homologues, ou les séquences nucléiques de variants alléliques de la séquence génomique du récepteur GHB de séquence SEQ ID No.1.
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Les polypeptides codés par les acides nucléiques selon l'invention font également partie de l'invention.
-- --- - - Par acide nudéique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, on entend un fragment d'ADN et/ou d'ARN naturel isolé, ou de synthèse, comportant ou non des nucléotides non naturels, désignant un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment, un segment ou une région d'un acide nucléique.
La présente invention concerne, bien entendu, aussi bien les séquences ADN qu'ARN ainsi que les séquences qui s'hybrident avec elles, de même que les ADNs double brin correspondants.
Il doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques génomiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à- dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie (ADNc), leur environnement ayant été au moins partiellement modifié.
Ainsi, il peut s'agir aussi bien d'ADNc que d'ADN génomique partiellement modifié ou porté par des séquences au moins partiellement différentes des séquences les portant naturellement.
Par séquences nucléiques ou acide nucléique variant, on entend désigner les séquences nucléiques codant pour les polypeptides selon l'invention, compte tenu de la dégénérescence du code génétique, leur séquence d'ADN complémentaire et leur séquence d'ARN correspondant, ainsi que les séquences nucléiques codant pour les polypeptides variants.
Par séquences nucléiques homologues, on entend désigner les séquences nucléiques codant pour les polypeptides homologues et/ou les séquences nucléiques présentant un taux d'identité après alignement d'au moins 80 %, de préférence 90 %. Il s'agit de préférence de séquences susceptibles de s'hybrider spécifiquement ou dans conditions de forte stringence avec une des séquences de l'invention. De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 80 %, de préférence 90 % ou 95 % d'homologie entre l'une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre.
La longueur de ces séquences nucléiques d'hybridation peut varier de 12, 15,
20 ou 30 à 200 nucléotides, particulièrement de 20 à 50 nucléotides, plus particulièrement de 20 à 30 nucléotides.
On entendra par allèle ou variant allélique les séquences mutées naturelles correspondant à des polymorphismes présents chez l'être humain et, notamment, à
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des polymorphismes pouvant conduire à la survenue et/ou au développement de pathologie. Ces polymorphismes pourront aussi conduire à la survenue et/ou au développement des pathologies qui seront citées ci-après,
On entend par acides nucléiques mutés, inclus dans la présente description dans la dénomination acides nucléiques variants, les séquences nucléiques comportant au moins une mutation ponctuelle par comparaison à la séquence normale.
Si les séquences selon l'invention sont en général les séquences normales, ce sont également les séquences mutées dans la mesure où elles comportent au moins une mutation ponctuelle et de préférence au plus 10 % de mutations par rapport à la séquence normale.
De préférence, la présente invention concerne des séquences nucléiques mutées dans lesquelles les mutations ponctuelles sont non muettes, c'est-à-dire qu'elles conduisent à une modification de l'acide aminé codé par rapport à la séquence normale. De façon encore préférée, ces mutations portent sur des acides aminés qui structurent le récepteur GHB selon l'invention, ou les domaines et fragments correspondants de celui-ci. Ces mutations peuvent encore porter sur des acides aminés portés par les régions correspondant aux sites récepteurs, ou encore aux sites de phosphorylation. Ces mutations peuvent également porter sur les séquences impliquées dans la circulation ou le transport, notamment des ions, ou l'ancrage membranaire du récepteur GHB selon l'invention.
Selon l'invention, les fragments de séquences nucléiques peuvent notamment coder pour des domaines du récepteur GHB selon l'invention, possédant une fonction ou une activité biologique telle que définie précédemment, comporter des domaines ou des régions situés en amont ou en aval de la séquence codante et contenant des éléments régulateurs de l'expression du gène codant pour le récepteur GHB selon l'invention, ou bien possédant une séquence permettant leur utilisation comme sonde ou comme amorce dans des procédés de détection, d'identification ou d'amplification de séquence nucléique. Ces fragments présentent de préférence une taille minimale de 12, de 15 bases, et on préférera des fragments de 20 bases, et de préférence de 30 bases.
Les séquences d'acide nucléique utilisables comme oligonucléotides sens ou anti-sens, caractérisées en ce que leurs séquences sont choisies parmi les séquences selon l'invention, font partie de l'invention.
Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants, il faut ainsi citer en particulier les oligonucléotides anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit
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correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression.
Les séquences portant des mutations pouvant intervenir dans les séquences promotrices et/ou régulatrices du gène du récepteur GHB selon l'invention, lesquelles peuvent avoir des effets sur l'expression des protéines correspondantes, notamment sur leur niveau d'expression, font également partie des séquences précédentes selon l'invention.
Les séquences nucléiques utilisables comme amorce ou sonde, caractérisées en ce que leur séquence nucléique est une séquence de l'invention, font également partie de l'invention.
La présente invention concerne l'ensemble des amorces qui peuvent être déduites des séquences nucléotidiques de l'invention et qui peuvent permettre de mettre en évidence lesdites séquences nucléotidiques de l'invention, en particulier les séquences mutées, en utilisant notamment une méthode d'amplification telle que la méthode PCR, ou une méthode apparentée.
La présente invention concerne l'ensemble des sondes qui peuvent être déduites des séquences nucléotidiques de l'invention, notamment des séquences capables d'hybrider avec elles, et qui peuvent permettre de mettre en évidence lesdites séquences nucléotidiques de l'invention, en particulier de discriminer les séquences normales des séquences mutées.
L'invention concerne également l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention comme sonde ou amorce, pour la détection et/ou l'amplification de séquence d'acide nucléique.
L'ensemble des sondes et amorces selon l'invention pourront être marquées par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
L'invention comprend également les vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique selon l'invention, éventuellement associée avec une séquence codant pour la protéine G.
Les vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils comportent les éléments permettant l'expression et/ou la sécrétion desdites séquences dans une cellule hôte, font également partie de l'invention.
Les vecteurs caractérisés en ce qu'ils comportent une séquence de promoteur et/ou de régulateur selon l'invention, ou une séquence d'adressage cellulaire selon l'invention, ou l'un de leurs fragments, font également partie de l'invention.
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Lesdits vecteurs comporteront de préférence un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Jls doivent pouvoir être maintenus de façon stable dans la cellule et peuvent éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite.
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilisera de préférence en fonction de la cellule hôte, des systèmes de type plasmidique ou viral, les virus vecteurs pouvant notamment être des adénovirus (Perricaudet et al., 1992), des rétrovirus, des poxvirus ou des virus herpétiques (Epstein et al., 1992). L'homme du métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes.
Lorsque l'on souhaitera l'intégration de la séquence dans les chromosomes de la cellule hôte, on pourra utiliser par exemple des systèmes de type plasmidique ou viral ; de tels virus seront, par exemple, les rétrovirus (Temin, 1986), ou les AAV (Carter, 1993).
De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique.
L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, transformées par les vecteurs selon l'invention ainsi que les animaux transgéniques, excepté l'Homme, comprenant une desdites cellules transformées selon l'invention.
Parmi les cellules utilisables à ces fins, on peut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins et Lee, 1993), mais également les cellules de levure (Buckholz, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO), mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en #uvre des baculovirus par exemple (Luckow, 1993). Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par les cellules CHO.
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Parmi les mammifères selon l'invention, on préférera des animaux tels que les souris, les rats ou les lapins, exprimant un polypeptide selon l'invention, le phénotype correspondant au récepteur GHB selon l'invention, notamment d'origine humaine.
Parmi les mammifères selon l'invention, on préférera également des animaux tels que les souris, les rats ou les lapins, caractérisé en ce que le gène codant pour un récepteur GHB selon l'invention, n'est pas fonctionnel ou est invalidé.
Parmi les modèles animaux plus particulièrement intéressants ici, on trouve notamment : - les animaux transgéniques présentant un déficit du récepteur GHB selon l'invention.
Ils sont obtenus par recombinaison homologue sur cellules souches embryonnaires, transfert de ces cellules souches à des embryons, sélection des chimères affectées au niveau des lignées reproductrices, et croissance desdites chimères ; - les souris transgéniques surexprimant l'un ou plusieurs des gènes du récepteur
GHB selon l'invention, d'origine murins et/ou humains. Les souris sont obtenues par transfection de copies multiples des gènes dudit récepteur GHB sous contrôle d'un promoteur puissant de nature ubiquitaire, ou sélectif d'un type de tissu, de préférence neuronal ; - les animaux (de préférence souris) transgéniques rendus déficients pour l'un ou plusieurs des gènes dudit récepteur GHB selon l'invention, par inactivation à l'aide du système LOXP/CRE recombinase (Rohlmann et al., 1996) ou de tout autre système d'inactivation de l'expression d'un gène à un âge précis de l'animal ; - les animaux (de préférence rats, lapins, souris) surexprimant l'un ou plusieurs des gènes dudit récepteur GHB selon l'invention, après transcription virale ou thérapie génique.
Les cellules et mammifères selon l'invention sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide selon l'invention, comme décrit ci-dessous, et peuvent également servir à titre de modèle d'analyse et pour le criblage de banque d'ADN (génomique ou d'ADNc).
Les cellules ou mammifères transformés tels que décrits précédemment peuvent être ainsi utilisés à titre de modèles afin d'étudier les interactions entre les polypeptides selon l'invention, et les composés chimiques ou protéiques, impliqués directement ou indirectement dans les activités de récepteur GHB selon l'invention, ceci afin d'étudier les différents mécanismes et interactions mis en jeu selon le type d'activité, ou selon qu'il s'agit d'un récepteur GHB selon l'invention.
Surtout, ils peuvent être utilisés pour la sélection de produits interagissant avec le récepteur GHB selon l'invention, à titre de cofacteur, ou d'inhibiteur, notamment
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compétitif, ou encore ayant une activité agoniste ou antagoniste de l'activité dudit récepteur GHB selon l'invention. De préférence, on utilisera lesdites cellules transformées à titre de modèle permettant, notamment, la sélection de produits permettant de lutter contre les pathologies mentionnées ci-dessous.
L'invention concerne également l'utilisation de cellule, de mammifère ou de polypeptide selon l'invention, pour l'étude de l'expression et de l'activité du récepteur GHB selon l'invention, et des interactions directes ou indirectes entre ledit récepteur et des composés chimiques ou biochimiques pouvant être impliqués dans l'activité dudit récepteur.
L'invention concerne également l'utilisation de cellule, de mammifère ou de polypeptide selon l'invention pour le criblage de composé chimique ou biochimique pouvant interagir directement ou indirectement avec le récepteur GHB selon l'invention, et/ou capable de moduler l'expression ou l'activité dudit récepteur.
L'invention concerne également la synthèse de polypeptides synthétiques ou recombinants de l'invention, notamment par synthèse chimique ou par l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention.
Les polypeptides selon la présente invention peuvent être obtenus par synthèse chimique et ce en utilisant l'une quelconque des nombreuses synthèses peptidiques connues, par exemple les techniques mettant en oeuvre des phases solides ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique.
La technique de synthèse en phase solide est bien connue de l'homme du métier. Voir notamment Stewart et al. (1984) et Bodansky (1984).
Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondants sont également compris dans l'invention.
La méthode de production d'un polypeptide de l'invention sous forme recombinante est elle-même comprise dans la présente invention, et se caractérise en ce que l'on cultive les cellules transformées, notamment les cellules ou mammifères de la présente invention, dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant codé par une séquence d'acide nucléique selon l'invention, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
Les polypeptides recombinants, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par ladite méthode de production, font également partie de l'invention.
Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci-dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle.
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Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences d'acide nucléique définies ci-dessus, selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.
Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur et d'une cellule hôte selon l'invention.
Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Les procédés de purification de polypeptide recombinant utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono ou polyclonaux spécifiques, etc..
Les anticorps mono ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide ou un récepteur selon l'invention, font partie de l'invention.
Des anticorps polyclonaux spécifiques peuvent être obtenus à partir d'un sérum d'un animal immunisé contre, par exemple : - le récepteur GHB selon l'invention, purifié à partir de membranes de cellules présentant ledit récepteur GHB, par des méthodes bien connues de l'homme de l'art comme la chromatographie d'affinité en utilisant par exemple le GHB ou un de ses analogues structuraux, comme ligand spécifique, ou - un polypeptide selon l'invention, notamment produit par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, selon les modes opératoires usuels, à partir d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention.
On notera notamment l'intérêt d'anticorps reconnaissant de façon spécifique certains polypeptides, variants, ou fragments, notamment biologiquement actifs, selon l'invention.
Les anticorps monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein, 1975.
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Les anticorps selon l'invention sont, par exemple, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')z. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
L'invention concerne également des méthodes pour la détection et/ou la purification d'un polypeptide selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en #uvre un anticorps selon l'invention.
L'invention comprend en outre des polypeptides purifiés, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par une méthode selon l'invention.
Par ailleurs, outre leur utilisation pour la purification des polypeptides, les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent également être utilisés pour la détection de ces polypeptides dans un échantillon biologique.
Ils constituent ainsi un moyen d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique de l'expression de récepteur GHB selon l'invention, sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoconjugués enzymatiques.
Ils permettent notamment de mettre en évidence une expression anormale de ces polypeptides dans les tissus ou prélèvements biologiques, ce qui les rend utiles pour la détection d'expression anormale du récepteur GHB selon l'invention, ou pour le suivi de l'évolution de méthode de prévention ou de traitement.
Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en #uvre dans toute situation où l'expression d'un récepteur GHB selon l'invention, normal ou muté, doit être observée.
Font également partie de l'invention, les méthodes de détermination d'une variabilité allélique, d'une mutation, d'une délétion, d'une perte d'hétérozygotie ou d'une anomalie génétique d'un gène codant pour le récepteur GHB selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre une séquence d'acide nucléique ou un anticorps selon l'invention.
Ces méthodes visent par exemple les méthodes de diagnostic de pathologies ou de prédisposition à des pathologies associées à une expression anormale d'un récepteur GHB selon l'invention, leurs homologues ou variants, ou leurs fragments, en déterminant à partir d'un prélèvement biologique du patient la présence de mutations dans au moins une des séquences décrites précédemment. Les séquences d'acides nucléiques analysées pourront aussi bien être de l'ADN génomique, de l'ADNc, ou de l'ARNm.
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Des acides nucléiques ou anticorps basés sur la présente invention pourront également être utilisés pour permettre un diagnostic positif chez un malade ou un diagnostic pré-symptomatique chez un sujet à risque, notamment avec antécédent familial.
En outre, la mise en évidence d'une mutation spécifique peut permettre un diagnostic évolutif, notamment quant à l'intensité de la pathologie.
Les méthodes permettant de mettre en évidence une mutation dans un gène par rapport au gène sauvage sont, bien entendu, très nombreuses. On peut essentiellement les diviser en deux grandes catégories. Le premier type de méthode est celui dans lequel la présence d'une mutation est détectée par comparaison de la séquence mutée avec la séquence correspondante sauvage, et le second type est celui dans lequel la présence de la mutation est détectée de façon indirecte, par exemple par évidence de mésappariements dus à la présence de la mutation.
Ces méthodes peuvent mettre en oeuvre les sondes et amorces de la présente invention décrites. Il s'agit généralement de séquences nucléiques d'hybridation purifiées comprenant au moins 12 nucléotides, de préférence 15 ou 20 nucléotides, caractérisées en ce qu'elles peuvent s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléique selon l'invention.
De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques sont telles que celles définies dans les exemples, ou telles qu'elles assurent au moins 95 % d'homologie. La longueur de ces séquences nucléiques d'hybridation peut varier de 12, 15, 20 ou 30 à 200 nucléotides, particulièrement de 20 à 50 nucléotides, plus particulièrement de 20 à 30 nucléotides.
Parmi les méthodes de détermination d'une variabilité allélique, d'une mutation, d'une délétion, d'une perte d'hétérozygotie ou d'une anomalie génétique, on préfère les méthodes comprenant au moins une étape d'amplification dite par PCR (réaction en chaîne par la polymérase) ou par PCR-like de la séquence cible selon l'invention susceptible de présenter une anomalie à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Les produits amplifiés pourront être traités à l'aide d'enzyme de restriction approprié avant de procéder à la détection ou au dosage du produit ciblé.
Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en #uvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues, en général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une
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transcription réverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, par exemple les méthodes dites NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification (Compton, 1991), TAS Transcription based Amplification System (Guatelli et al., 1990), LCR Ligase Chain Reaction (Landegren et al., 1988), et SDA Strand Displacement Amplification (Walker et al., 1992), bien connues de l'homme du métier.
L'invention concerne en outre une méthode de diagnostic de pathologies associées à une expression anormale d'un récepteur GHB selon l'invention, caractérisée en ce que l'on met en contact un ou des anticorps selon l'invention avec le matériel biologique à tester, dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre ledit polypeptide et le ou lesdits anticorps, et en ce que l'on détecte les complexes immunologiques éventuellement formés.
Les mutations d'un des gènes du récepteur GHB selon l'invention, peuvent être responsables de différentes modifications de son produit, modifications utilisables pour une approche diagnostique. En effet, les modifications d'antigénicité liées à ces mutations peuvent permettre la mise au point d'anticorps spécifiques. La discrimination de produit de gène muté peut être réalisée par ces méthodes. Toutes ces modifications peuvent être utilisées dans une approche diagnostique grâce à plusieurs méthodes bien connues basées sur l'utilisation d'anticorps mono ou polyclonaux reconnaissant le polypeptide normal ou des variants mutés, comme par exemple par RIA ou par ELISA.
Ces méthodes de diagnostic visent également les méthodes de diagnostic par imagerie in vivo ou ex vivo en utilisant les anticorps monoclonaux ou polyclonaux selon l'invention, particulièrement ceux marqués et correspondant à tout ou partie des polypeptides mutés (imagerie à l'aide d'anticorps couplés à une molécule détectable en imagerie de type PET-scan, par exemple).
Sont également comprises dans l'invention, les méthodes de sélection de composés chimiques ou biochimiques capables d'interagir directement ou indirectement avec le récepteur GHB selon l'invention ou avec les acides nucléiques selon l'invention, et/ou permettant de moduler l'expression ou l'activité dudit récepteur
GHB.
Le criblage peut être utilisé pour tester des composés capables de modifier le niveau et/ou la spécificité d'expression du récepteur GHB selon l'invention soit en se liant compétitivement aux sites de liaison des facteurs de transcription situés dans le promoteur du récepteur GHB selon l'invention soit en se liant directement aux facteurs de transcription.
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Le niveau d'expression dudit récepteur GHB et sa localisation peuvent être analysés par hybridation en solution avec de grandes sondes comme indiqué dans le brevet PCT WO 97/05277. Brièvement, un ADNc ou l'ADN génomique dudit récepteur GHB ou encore un fragment de ceux-ci est inséré à un site de clonage situé immédiatement en aval d'un promoteur de RNA polymérase de bactériophage (T3, T7 ou SP6) pour produire un ARN antisens. De préférence, l'insert comprend au moins 100 nucléotides consécutifs de la séquence génomique du récepteur GHB ou d'un des ADNc de la présente invention. Le plasmide est linéarisé et transcrit en présence de ribonucléotides comprenant des ribonucléotides modifiés tels que Biotine-UTP et Digoxygénine-UTP. Un excès de cet ARN marqué est hybridé en solution avec les ARNm isolés de cellules ou de tissus d'intérêt. Les hybridations sont réalisées sous des conditions stringentes (40-50 C pendant 16 h dans une solution 80 % formamide, 0,4 M NaCl, pH 7-8). La sonde non-hybridée est éliminée par digestion avec des ribonucléases spécifiques des ARN simple-brin (Rnases CL3, T1, PhyM, U2 ou A). La présence de nucléotides modifiés biotine-UTP permet la capture des hybrides sur des plaques de microtitration portant de la streptavidine. La présence de la modification DIG permet la détection et la quantification des hybrides par ELISA en utilisant des anticorps anti-DIG couplés à la phosphatase alkaline
Une analyse quantitative de l'expression du gène dudit récepteur GHB selon l'invention peut aussi être réalisée en utilisant des matrices à ADN, pouvant inclure les séquences d'un ADNc de la présente invention présentant une longueur suffisante pour permettre une détection spécifique de l'expression des ARNm capables de s'y hybrider. De préférence, les fragments comprennent au moins 15, au moins 25, au moins 50, au moins 100 ou au moins 500 nucléotides consécutifs des séquences nucléiques dont ils sont issus comme décrit dans Schena et al. (1995 et 1996).
Une analyse quantitative de l'expression du récepteur GHB selon l'invention peut également être réalisée avec des ADNc du récepteur GHB selon l'invention sur des matrices à ADN selon la description de Pietu et al. (1996). Les ADNc du GHB selon l'invention ou leurs fragments sont amplifiés par PCR et fixés sur des membranes. Les ARNm provenant de différents tissus ou cellules sont marqués avec des nucléotides radioactifs. Après hybridation et lavage dans des conditions contrôlées, les ARNm hybridés sont détectés avec un Phosphor Imager ou par autoradiographie. Les expériences sont effectuées en double et une analyse quantitative des ARNm différentiellement exprimés peut être effectuée.
Les techniques mentionnées ci-dessus permettent l'analyse des niveaux d'expression du récepteur GHB selon l'invention , dans une même cellule ou un même
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tissu selon des conditions différentes, par exemple d'induction ou de non induction, mais aussi l'analyse de la spécificité tissulaire de cette expression, dans des conditions qui peuvent également varier.
Un autre aspect de la présente invention concerne des méthodes d'identification de molécules capables de se lier audit récepteur GHB selon l'invention. De telles molécules peuvent être utilisées pour moduler l'activité dudit récepteur GHB. Par exemple, de telles molécules peuvent être utilisées pour stimuler ou réduire la circulation des ions à travers la membrane cellulaire ou pour inhiber l'activation de l'activité du récepteur GHB selon l'invention.
Ainsi, l'invention comprend une méthode de sélection de composés chimiques ou biochimiques capables d'interagir avec le récepteur GHB selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'un polypeptide selon l'invention, d'une cellule selon l'invention, ou d'un mammifère selon l'invention, avec un composé candidat et, la détection d'une modification de l'activité dudit récepteur GHB.
L'invention a également pour objet une méthode de sélection de composés chimiques ou biochimiques capables d'interagir avec ledit récepteur GHB selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'un polypeptide selon l'invention, d'une cellule selon l'invention, ou d'un mammifère selon l'invention, avec un composé candidat et, la détection de la formation d'un complexe entre le composé candidat et ledit polypeptide.
L'invention a également pour objet une méthode de sélection de composés chimiques ou biochimiques capables d'interagir avec un récepteur GHB selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'un polypeptide selon l'invention, d'une cellule selon l'invention, ou d'un mammifère selon l'invention, avec un composé candidat en présence d'un ligand connu du récepteur GHB, et la détermination de la capacité dudit candidat d'entrer en compétition avec la capacité dudit ligand à se lier audit récepteur GHB selon l'invention.
De préféférence, ledit polypeptide ou ladite cellule est fixé sur un support solide.
De préférence également, ledit ligand connu du récepteur GHB est le GHB, le trans-4-hydroxycrotonate ou le p-chloro-phényl-transhydroxycrotonate.
L'invention concerne notamment une méthode de sélection de composés chimiques ou biochimiques capables d'interagir avec une séquence d'acide nucléique comprise dans un gène codant pour un récepteur GHB selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'une cellule hôte exprimant ledit récepteur
GHB avec un composé candidat susceptible de modifier l'expression ou la régulation
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de l'expression de ladite séquence nucléique, et, la détection directe ou indirecte d'une modification de l'expression ou de l'activité dudit récepteur GHB.
@ -- -Il existe de nombreuses méthodes pour identifier des ligands du récepteur GHB comprenant un polypeptide selon l'invention.
Par exemple, mais sans s'y limiter, on peut citer une méhode d'identification de molécules capables d'interagir avec ledit récepteur GHB utilisant un système de double hybride bactérien ou levure tel que le Matchmaker Two Hybrid System 2, selon les instructions du manuel accompagnant le Matchmaker Two Hybrid System 2 (Catalogue
N K1604-1, Clontech).
Pour étudier l'interaction dudit récepteur GHB, avec des petites molécules telles que celles générées par chimie combinatoire, il est possible d'utiliser une microdialyse couplée à une HPLC comme décrit dans Wang et al. (1997), ou une électrophorèse capillaire d'affinité comme décrit dans Busch et al. (1997).
Dans d'autres méthodes, les peptides ou petites molécules susceptibles d'interagir avec ledit récepteur GHB comprenant un polypeptide selon l'invention, peuvent être liés à des marqueurs détectables tels que des marqueurs radioactifs, fluorescents ou enzymatiques. Ces molécules marquées sont mises en contact avec ledit récepteur GHB comprenant un polypeptide selon l'invention immobilisé, dans des conditions permettant une interaction spécifique. Après élimination des molécules non- fixées spécifiquement, les molécules liées sont détectées par des moyens appropriés
La technologie du BIACORE peut également être utilisée pour effectuer le criblage de composés capables d'interagir avec ledit récepteur GHB. Cette technologie, décrite dans Szabo et al. (1995) et dans Edwards et Leartherbarrow (1997), permet de détecter des interactions entre molécules en temps réel sans utilisation de marquage. Elle est basée sur le phénomène de SPR (surface plasmon resonance). Un des principaux avantages de cette méthode est qu'elle permet la détermination des constantes d'association entre le récepteur et les molécules interagissant. Ainsi, il est possible de sélectionner spécifiquement les molécules interagissant avec de fortes ou de faibles constantes d'association.
Les protéines ou autres molécules interagissant avec ledit récepteur GHB selon l'invention, peuvent être identifiées en utilisant des colonnes d'affinité qui contiennent ledit récepteur GHB. Ledit récepteur GHB peut être attaché à la colonne en utilisant des techniques conventionnelles incluant le couplage chimique à une matrice de colonne appropriée telle que l'agarose, Affi Gel, ou d'autres matrices connues de l'homme de l'art. Dans un autre aspect de l'invention, la colonne d'affinité peut contenir des protéines chimériques dans lesquelles ledit récepteur GHB, consécutif serait
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fusionné par exemple avec la gluthation S-transférase. Les molécules à tester décrites ci-dessus sont ensuite déposées sur la colonne. Les molécules interagissant avec ledit récepteur GHB sont retenues par la colonne et peuvent être isolées par élution.
L'invention concerne également une méthode de criblage et/ou de sélection de composés interagissant avec les séquences promotrices et/ou régulatrices dudit récepteur GHB comprenant un polypeptide selon l'invention.
Les acides nucléiques codant pour des protéines interagissant avec les séquences promotrices et/ou régulatrices du gène dudit récepteur GHB selon l'invention, peuvent être criblés et/ou sélectionnés en utilisant un système de simple hybride tel que celui décrit dans le manuel accompagnant le kit Matchmaker OneHybrid System de Clontech (Catalog N K1603-).
La sélection de composés capables de modifier l'expression dudit récepteur GHB selon l'invention comprenant un polypeptide selon l'invention en se fixant à ses séquences régulatrices et/ou promotrices peut aussi être réalisée à l'aide de gènes reporter tels que la phosphatase alkaline, la p galactosidase, ou la GFP (green fluorescent protein). L'effet de composés candidats sur l'expression issue des séquences régulatrices et/ou promotrices du récepteur GHB peut ainsi être évalué.
Sous un autre aspect, l'invention comprend l'utilisation d'acide nucléique ou de polypeptide selon l'invention, d'une cellule selon l'invention, ou d'un mammifère selon l'invention, pour l'étude de l'expression ou de l'activité du récepteur GHB selon l'invention, et/ou des interactions, directes ou indirectes, entre ledit récepteur GHB selon l'invention, et des composés chimiques ou biochimiques pouvant être impliqués dans l'activité dudit récepteur.
Les composés chimiques ou biochimiques, caractérisés en ce qu'ils sont capables d'interagir, directement ou indirectement, avec le récepteur GHB selon l'invention, font partie de l'invention.
Les composés chimiques ou biochimiques caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés par lesdites méthodes définies ci-dessus font également partie de l'invention.
L'invention comprend les composés capables d'interagir directement ou indirectement avec un récepteur GHB selon l'invention, ainsi que les composés susceptibles d'interagir avec une ou plusieurs séquences nucléiques selon l'invention.
Elle comprend également les composés chimiques ou biochimiques permettant de moduler l'expression ou l'activité dudit récepteur GHB selon l'invention.
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On entend désigner par composés permettant de moduler l'expression ou l'activité du récepteur GHB selon l'invention, les composés qui permettent notamment de réduire, de stabiliser ou d'augmenter le nombre, la spécificité dudit récepteur GHB, ou de favoriser ou d'inhiber l'activité globale ou l'activité d'un des domaines dudit récepteur ou encore de rétablir l'expression normale dudit récepteur dans le cas, par exemple, où une anomalie génétique est constatée. Ces composés pourront par exemple interagir en tant que ligands spécifiques dudit récepteur ou d'un de ses domaines à titre de cofacteur, ou d'inhibiteur, notamment compétitif, ou encore ayant une activité agoniste ou antagoniste de l'activité dudit récepteur GHB selon l'invention. Ces composés pourront également interagir en neutralisant les ligands spécifiques naturels dudit récepteur et en inhibant ainsi l'activité du récepteur induite par ces ligands.
Les composés, caractérisés en ce qu'ils ont été sélectionnés par une des méthodes selon la présente invention, font également partie de l'invention.
L'invention comprend les composés selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont des agonistes, des agonistes inverses ou des antagonistes de l'activité du récepteur GHB selon l'invention.
L'invention comprend en outre des composés selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont capables de se fixer sur un récepteur GHB selon selon l'invention.
L'invention comprend en outre des composés selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont capables de modifier la circulation ou le transport des ions à travers la membrane cellulaire.
L'invention comprend en outre des composés selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont capables de moduler la régulation présynaptique des activités GABAergiques et/ou dopaminergiques cérébrales.
En particulier, parmi ces composés selon l'invention, on préfère les composés caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi : - un anticorps selon l'invention, - un polypeptide selon l'invention, - un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il correspond à la fraction soluble du récepteur GHB selon l'invention, - un acide nucléique selon l'invention, sens ou antisens, et - un vecteur selon l'invention.
Sous un autre aspect, l'invention comprend des composés selon l'invention, à titre de médicament pour la prévention et/ou le traitement de pathologies liées à une anomalie de l'expression et/ou de l'activité du récepteur GHB selon l'invention, pour la
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prévention et/ou le traitement de pathologies liées à une anomalie de l'activité cérébrale GABAergique, notamment pour la prévention et/ou le traitement de l'épilepsie, de l'anxiété, pour la régulation du sommeil ou de l'humeur, pour le sevrage de drogues telles que la cocaïne, l'héroïne ou l'alcool.
L'invention comprend enfin des composés selon l'invention, à titre de médicament pour la prévention et/ou le traitement de pathologies liées à une anomalie de l'activité cérébrale dopaminergique, notamment pour la prévention et/ou le traitement de maladies neurodégénératives où la dopamine est spécifiquement impliquée telles que la maladie de Parkinson, de psychoses où la dopamine est impliquée telle que la schizophrénie, pour le sevrage de drogues telles que la cocaïne, l'héroïne ou l'alcool, pour la régulation de l'humeur ou pour la régulation de la sécrétion d'hormones qui sont sous contrôle dopaminergique telles que l'hormone de croissance, ou la prolactine.
Les composés de l'invention en tant que principes actifs de médicament, seront préférentiellement sous forme soluble, associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale.
Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc..
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après.
LEGENDE DES FIGURES
FIGURE 1 : Séquence de l'ADNc du récepteur GHB (SEQ ID No. 2).
FIGURE 2 : Alignement de la séquence partielle de l'ADNc du récepteur GHB (SEQ ID
No. 2), notée C, avec les séquences partielles des ADNc des récepteurs GABA-B,
GABA-B1a (notée Gaba 1a ) et GABA-B1b (notée Gaba 1b ).
La séquence notée consensus fait apparaître en majuscule les nucléotides communs aux trois séquences alignées.
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FIGURE 3 : Séquence d'acides aminés codée par l'ADNc du récepteur GHB (SEQ ID No. 1). Les 7 séquences d'acides aminés correspondant à des domaines transmembranaires du récepteur GHB sont notées en caractères gras.
FIGURE 4 : Schéma représentant les étapes successives d'amplification mises en oeuvre pour obtenir le fragment d'ADNc utilisé comme sonde pour le criblage d'une banque d'ADNc d'hippocampe de cerveau de rat.
FIGURE 5 : Localisation des oligonucléotides 1 et 4 sur la séquence nucléique SEQ ID N 2 du récepteur GHB-R.
FIGURE 6 : Fixation du GHB sur une cellule CHO recombinante exprimant le polypeptide GHB-R de séquence SEQ ID No. 1, représentée en nombre de coups par minute en fonction de la concentration de GHB (en mole) obtenue par des expériences de Scatchard.
FIGURE 7 : inhibition compétitive de la fixation du GHB sur une cellule recombinante exprimant le polypeptide GHB-R de séquence SEQ ID No. 1 pour différentes concentrations de GABA, Baclofène et Glutamate (2 ; 200 et 600 M) (respectivement 2ème, 3ème et 4ème série d'histogramme). Les deux histogrammes de la première série représentent la fixation non spécifique (N. S.) et totale exprimée en coups par minute (cpm) pour le GHB.
EXEMPLES Exemple 1 : Purification et séquençage partiel du récepteur GHB
La protéine récepteur du GHB (GHB-R) a été isolée par chromatographie d'affinité sur support insoluble greffé avec un analogue structural du GHB (Sel de sodium de l'acide 5-[4-(aminoprop-1-ynyl)phényl]-4-hydrohypentanoïque) à partir d'un homogénat de cerveau de rat.
La solubilisation des récepteurs GHB à partir d'un homogénat de cerveau de rat est réalisée en présence d'une forte concentration de NaCI et de Triton X-100. La fraction soluble obtenue possède une activité de liaison pour le GHB. Cette partie soluble est ensuite passée sur une colonne d'agarose sur laquelle a été fixé l'analogue cité ci-dessus. L'élution est réalisée par 10 mM de GHB suivie par une chromatographie d'exclusion. GHB-R a ensuite été purifiée par électrophorèse préparative sur gel de polyacrylamide/SDS (Cash et al., 1996), puis soumise à une hydrolyse partielle par la trypsine. Les peptides obtenus ont été purifiés par HPLC (Vydac C18 5m column, 250 mm x 1. 6 mm on an Applied Biosystem microbore apparatus) et séquences automatiquement sur Applied Biosystem sequencer model
477A. Les séquences peptidiques obtenues sont les suivantes :
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1. GLGPGRLHA.
2. LENEIQTYR.
~ 3. YENEVALR.
4. LRENTFLLKF.
5. SEISELNR.
EXEMPLE 2 : d'une sonde pour le criblage d'une banque d'ADNc d'hippocampe de cerveau de rat
Les procédures d'isolement de la sonde, de criblage et de clonage sont détaillées ci-dessous.
A partir des séquences peptidiques ci-dessus (cf. Exemple 1), les oligonucléotides dégénérés correspondants :
Oligonucléotide 1 : GGNYTNGGNCCNGGNHGNYTNCAYGCN
Oligonucléotide 2 : CTBGARAAYGARATYCARACHTAYGG
Oligonucléotide 3 TAYGARAAYGARGTSGCHCTBAGRC
Oligonucléotide 4 : YTNMGNGARAAYACNTTYYTNYTNAARTTY
Oligonucléotide 5 : ATYGAGATC WSYGAGCTGAAY MGG ainsi que leurs reverse-complémentaires ont été synthétisés.
En combinant les amorces par paire aléatoire (10 combinaisons possibles), une première série de PCR est débutée par une phase de dénaturation à 94 C pendant 3 minutes, suivie par 30 cycles de dénaturation à 93 C pendant 45 secondes, d'hybridation à 50 C pendant 1 minute et d'élongation à 72 C pendant 3 minutes. La réaction est terminée par une étape à 72 C pendant 6 minutes. Les PCR sont effectuées dans un milieu réactionnel composé de 10 l de tampon 10x (Tris-HCI 100 mM, pH 8.3, KCI 500 mM, MgCI2 15 mM), de 10 l de dNTP (5 mM), de 2 l du couple d'amorces adéquat (1 g/ l), de 0,5 l Taq polymérase (2,5 Ul/tube), 1 g de préparation d'ADN plasmidiques représentative de la banque d'ADNc d'hippocampe de rat et d'une quantité suffisante d'eau stérile pour un volume total de 100 l. Les fragments d'ADNc obtenus sont réamplifiés par PCR par la technique d'extension d'amorces selon le schéma représenté à la figure 4.
Cette technique permet un séquençage direct en utilisant T3 et T7 comme amorce. Un fragment amplifié d'ADNc, de 344 pb montre une homologie (30 à 40 %) avec des séquences de récepteurs appartenant à la famille des protéines à 7 domaines transmembrananires. Ce fragment d'ADNc est marqué avec de l'a [32P]- dCTP puis utilisé comme sonde pour cribler la banque d'ADNc d'hippocampe de cerveau de rat.
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EXEMPLE 3 : Criblage d'une banque d'ADNc d'hippocampe de cerveau de rat, clonage et séquençage de l'ADNc du récepteur GHB-R.
La sonde isolée à l'exemple 2 est utilisée pour le criblage d'une banque d'ADNc d'hippocampe de cerveau de rat dans laquelle le clone du récepteur GHB-R est fortement représenté, région cérébrale qui exprime particulièrement fortement les récepteurs GHB-R, à la fois chez le rat mais également dans le cerveau humain.
I. Criblage de la banque.
Le criblage par sonde oligonucléotidique fait donc appel à la technique d'hybridation. Etant donné la taille de la sonde (344 pb) et surtout sa spécificité présumée, il est possible de travailler à une stringence élevée (température d'hybridation de 60 C) pour éliminer le maximum de faux positifs. Pratiquement, environ 106 clones sont ensemencés dans des boîtes de pétri à raison de 40 000 clones par boîte. Après le transfert et la fixation des ADNc sur des membranes de nylon, on procède à l'hybridation avec la sonde radioactive. Après révélation par autoradiographie des clones positifs, ceux-ci sont ré-ensemencés successivement à des densités décroissantes jusqu'à obtention de clones uniques et homogènes. Les clones obtenus à homogénéité ont été analysés de deux manières :
1. Par le séquençage et interrogation des bases de données.
2. Par la transfection de cellules eucaryotes telles que les cellules CHO et l'étude de la fonctionnalité de la protéine exprimée par les cellules, de sa pharmacologie, en réalisant des expériences de liaison avec divers ligands potentiels.
II. Etalement de la banque pour le premier criblage.
11.1. Réalisation d'un starter bactérien.
1 colonie de bactéries E.coli (souche XL1 blue, MRF') récoltées d'une boîte LBagar (20 g/l LB ;1,5 % agar ; 12,5 mg/l de tétracycline) est ensemencée dans 10 ml de milieu LB contenant du maltose à 20 % et 10 l de tétracycline et incubée à 37 C sous agitation jusqu'à l'obtention d'une D. O. à 600 nm égale à 1.
106 clones (275 NI) sont prélevés de la banque et mélangés avec 15 ml de bactéries XL1 blue, MRF'. Après 15 min d'incubation à température ambiante, ils sont répartis dans 25 tubes Falcon (réf. 2059) à raison de 40.000 clones/tube. Dans chaque tube sont versés 8 ml d'une préparation d'agarose (21 g/l NZY ;0,6 % agarose) maintenue en surfusion à 55 C et le tout est versé dans une boîte de pétri de 15 cm de diamètre. Les boîtes sont laissées à température ambiante pendant 15 min puis incubées, retournées, à 37 C pendant une nuit.
III. Transfert et fixation des ADNc sur les membranes de nylon.
111.1. Prise d'empreintes.
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Après une nuit d'incubation, les boîtes sont placées dans une chambre froide pour refroidir l'agarose pour que celle-ci n'adhère pas à la membrane lors de la prise d'empreintes avec des membranes (PALL biodyne) de 132 mm de diamètre préalablement marquées. Cette opération de transfert d'ADNc dure 5 minutes.
111.2. Dénaturation.
Les membranes sont ensuite décollées délicatement et mises dans une solution dénaturante contenant du NaOH 0,1 N et du NaCl 1,5 M pendant 10 minutes.
111.3. Neutralisation.
Les membranes sont ensuite transférées dans une solution contenant du Tris 0,1 M et de l'EDTA 2 mM à pH 7,0 pendant 5 minutes.
111.4. Lavage.
Enfin, les membranes sont lavées dans une solution tampon composée de SSC 2x, d'EDTA 2 mM EDTA à pH 7,0 et de tampon phosphate 25 mM à pH 7,0. L'ADN transféré est fixé par cuisson à 80 C pendant au moins 2 heures.
IV. Préhybridation et hybridation.
IV.1. Préhybridation.
Une fois sèches, les membranes sont immergées dans 150 ml d'une solution tampon contenant du SSC 5x, du PAF 5x, du tampon phosphate 35 mM à pH 7,0, du SDS 0,1 % et de l'ADN de sperme de saumon préalablement dénaturé (5 minutes à 100 C puis refroidissement dans la glace pendant 10 minutes). Elles sont ensuite incubées à 60 C pendant au moins 3 heures.
IV.2. Marquage de la sonde.
Dans un tube eppendorf on ajoute successivement 1 l de l'ADN amplifié par PCR (100 ng/ l), 1 l d'un mélange d'héxanucleotides (100 ng/ l) et 13 l d'eau. Cette préparation est dénaturée pendant 3 minutes à 100 C puis refroidie immédiatement dans la glace pendant 2 minutes. Le milieu réactionnel est ensuite complété avec 10 l de tampon 3x (Tris-HCI 2 M, pH 8,0 ; MgCI2 1 M ; HEPES 1 M, pH 6,5 ; p- mercaptoéthanol 14,1 M ; dATP, dGTP, dTTP à 5 mM chacun ; BSA 10 mg/ml), 1 l de klenow (5 UI/ l) et 5 l d'[alpha]-dCTP[32-P] (3000 Ci/mmol) puis on incube à 37 C pendant 2 heures. Après l'incubation, la réaction est arrêtée par l'addition de 170 l de STOP MIX (EDTA 0,2 M ; 2 M, pH 8,0 ; 10 % ; de sperme de saumon,
10 mg/ml). Le mélange est ensuite déposé sur une colonne de séphadex G-50 qui est introduite dans un tube falcon au fond duquel est préalablement placé un tube eppendorf (sans capuchon). Le tout est centrifugé à 3000 tours pendant 10 minutes.
IV.3. Hybridation.
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C'est pendant cette étape que la sonde radioactive dénaturée est rajoutée dans le tampon de préhybridation. L'hybridation est conduite à 60 C pendant la nuit.
- - Les membranes sont lavées dans une solution de SSC 2x et de SDS 0,1 % à température ambiante pendant 15 minutes. Elles sont ensuite séchées à température ambiante puis mises en contact avec un film (KODAK, X-OMAT) et placées dans des cassettes d'autoradiographie. Après 48 heures d'exposition à -80 C, les films sont développés dans une développeuse automatique (M-35-MX-OMAT) afin de révéler les clones positifs.
V. Prélèvement des clones positifs.
Chaque clone positif est prélevé par aspiration des plages de lyse à l'aide d'une pipette Pasteur et mis dans 500 l d'une solution de Tris-HCI 10 mM à pH 7,5 contenant 2 g/l de MgS04, 7H20 (# dil). Cette préparation est laissée à 4 C pendant une nuit pour permettre aux phages de diffuser de l'agar.
VI. Le deuxième criblage.
Toutes les étapes précédemment décrites pour le premier criblage se retrouvent ici. Quelques modifications sont cependant introduites au niveau de certaines d'entre elles.
L'étalement ne concerne plus la banque mais les suspensions de phages contenant les clones prélevés précédemment. Des dilutions à 10-1 et à 10-2 sont réalisées à partir de la suspension pure. 10 l sont prélevés à partir de chacun de ces échantillons et mélangés avec 200 l d'un starter de bactéries XL1blue, MRF' puis incubés à température ambiante pendant 15 minutes. L'étalement proprement dit est réalisé avec 4 ml d'une préparation d'agarose dans une boîte de pétri de 82 mm de diamètre. Il s'en suit que les prises d'empreintes se feront également à l'aide de membranes de 82 mm de diamètre. La suite des évènements est identique à ce qui a été décrit pour le premier criblage.
Un troisième criblage, parfois un quatrième, est nécessaire pour obtenir des clones homogènes. En d'autres termes, toutes les plages de lyse doivent être positives après hybridation avec la sonde radioactive.
Il s'agit pour la suite d'exciser le plasmide des bras du phage, de le recirculariser et de le purifier pour permettre son analyse. Dans le système que nous avons utilisé pour construire la banque (ZapExpress) ces opérations sont réalisées automatiquement grâce à l'assistance d'un phage helper (ExAssist phage helper).
VII. Excision automatique du plasmide recombinant.
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V11.1. Réalisation de Starters.
Deux souches d'E.Co//, la XLlblue, MRF' et la XLOLR sont chacune cultivées dans 10 ml de milieu NZY contenant 0,2 % de maltose pendant une nuit. Dans des tubes falcon de 14 ml on met en présence de 200 l du starter de bactéries XL1 blue, MRF', 250 l d'une suspension de phages (clone positif) issus du dernier criblage et 1 l d'ExAssist helper phage, pendant 15 minutes à 37 C. On ajoute ensuite 3 ml de NZY puis on incube à 37 C pendant 3 heures. Une fois l'incubation terminée, les tubes sont chauffés dans un bain marie à 70 C pendant 20 minutes. Après 15 minutes de centrifugation à 1 000 g, le surnageant est prélevé. Une partie aliquote de 10 l et de 100 l est additionnée à 200 l de bactéries XLOLR qu'on incube à 37 C pendant 15 minutes. Après addition de 300 l de NZY, l'incubation est poursuivie à 37 C pendant 45 minutes.
200 l du mélange sont ensemencés dans des boîtes de pétri dont les fonds sont recouverts du milieu LB-agar contenant 50 mg/l de kanamycine et incubés pendant une nuit à 37 C. Une colonie isolée est prélevée et remise en culture dans 3 ml de LB à 37 C pendant une nuit dans le but de préparer de l'ADN plasmidique.
VIII. Mini préparation d'ADN plasmidique (Minlprep).
1,5 ml de la culture bactérienne sont mis dans un tube puis centrifugés à 3 OOOg pendant 5 minutes. Le culot est resuspendu dans 150 l de solution GTE (glucose 9 g/l ; tris 25 mM, pH 8,0 ; 10 mM, pH 8,0) et 300 l de solution S2 (NaOH 0. 2 N ; SDS 1 %). Après une incubation de 5 minutes dans la glace, 225 l de solution S3 (acétate de K 2,8 M, pH = 5,2) sont ajoutés et le mélange est de nouveau laissé dans la glace pendant 5 minutes puis centrifugé à 20.000g pendant 5 minutes.
L'ADN plasmidique est ensuite extrait par la technique du phénol/chloroforme. 300 l de phénol et 300 l de chloroforme sont rajoutés à 600 l de surnageant contenant l'ADN plasmidique récolté après centrifugation puis vigoureusement agité. Une centrifugation de 3 minutes à 5 000 g sépare la phase aqueuse de la phase organique.
Cette opération est répétée jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de protéines visibles à l'interphase. La nouvelle phase aqueuse ainsi obtenue après centrifugation est lavée avec 600 l de chloroforme pour éliminer tout le phénol présent dans la phase aqueuse. L'ADN plasmidique contenu dans cette dernière est de nouveau récolté et soumis à une précipitation avec 1,5 ml d'éthanol absolu à -20 C pendant une nuit.
L'ADN plasmidique est ensuite culoté par centrifugation à 20. 000 g à 4 C pendant
20 minutes. Le culot est rincé avec 500 l d'éthanol à 75 % puis centrifugé de nouveau à 20. 000 g à 4 C pendant 20 minutes. Une fois le surnageant éliminé, le culot est séché à température ambiante puis resuspendu dans 20 l d'eau stérile. Le dosage de
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l'ADN plasmidique est réalisé par spectrophotométrie à 260 nm et 280 nm. 3 l de la suspension sont ajoutés à 600 l de H2O stérile et la densité optique est mesurée contre de l'eau. Une préparation d'ADN correcte doit avoir un rapport DO260/DO280 compris entre 1,8 et 2,0.
VIII.1. Analyse de la taille des fragments d'ADN insérés dans les plasmides.
Cette analyse consiste à digérer l'ADN des plasmides recombinants par les enzymes de restriction appropriées et de séparer le plasmide de l'ADN inséré par électrophorèse d'agarose. Dans un tube eppendorf, on additionne successivement 3 NI de tampon universel (Tris base 330 mM, acétate de potassium 660 mM, acétate de magnésium 100 mM, pH 7,8), 3 l de Rnase (dépourvue d'une contamination à la DNase), 2,5 l de EcoRI (5 UI/ g d'ADN), 5 l de Xhol (5 UI/ g d'ADN), un volume de la suspension de plasmides correspondant à 10 g d'ADN et de l'eau stérile pour un volume final de 30 l. Après une incubation de 2 heures à 37 C, un gel d'agarose à 1 % (1 g d'agarose, 100 ml de TAE 1x, 3 l de bromure d'éthidium [10 g/ml]) est réalisé en présence d'une gamme-étalon de tailles déterminées de fragments d'ADN.
VIII.2. Préparation des ADN plasmidiques en vue du séquençage.
20 l de l'échantillon obtenu après une minipréparation d'ADN plasmidique sont complétés à 200 l avec du T10E1 contenant 10 g/ml d'ARNase. Après une incubation à 37 C pendant 30 minutes, 200 l du mélange PEG 13 % et NaCI 1,6 M sont ajoutés pour précipiter l'ADN plasmidique dans la glace pendant 1 heure. Une centrifugation à 20 000g est ensuite réalisée pendant 25 minutes pour récupérer le culot d'ADN. Celuici est lavé avec 500 l d'éthanol à 75 % puis recentrifugé pendant 25 minutes à 20 000 g. Après séchage, le culot est resuspendu dans 20 l d'eau stérile et l'ADN est dosé par spectrophotométrie à 260 nm et 280 nm.
Précisions concernant la localisation de la séquence nucléique de la sonde obtenue par rapport à la séquence nucléique de GHB-R (SEQ ID No. 2)
Les séquences des oligonucléotides 1 et 4 se retrouvent dans la séquence de GHB-R (tenir compte de la dégénérescence du code génétique), de part et d'autre du fragment de 344 pb de la sonde (analyse par BESTFIT, GCG) (cf. figure 5).
La sonde de 344 bp utilisée pour le criblage de la banque d'ADNc d'hippocampe de cerveau de rat correspond au fragment nt 57 - nt 400 de la séquence
SEQ ID No. 2 du récepteur GHB-R.
Le séquençage de l'ADNc du récepteur GHB-R a été réalisé sur séquenceur automatique applied Biosystem, modèle 373.
La séquence nucléique obtenue (SEQ ID No. 2) est représentée à la figure 1.
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La séquence d'acides aminés putative obtenue à partir du cadre ouvert de lecture (SEQ ID No. 2) est représentée à la figure 2, cette séquence comprenant 7 domaines transmembranaires (représentés en caractères gras sur la figure 3).
Après séquençage et interrogation des bases de données (Wisconsin séquence analysis package, Genetic computer), il apparaît que la séquence du fragment d'ADNc du récepteur GHBR1 de séquence SEQ ID No. 2 présente de faibles homologies avec les séquences d'autres ADNc codant pour des protéines couplées à la protéine G comme les récepteurs GABA-B ou le récepteur métabotropique glutamate de type # (cf. figure 2 et tableau 1).
Tableau 1
Exemple de recherche d'homologies de séquences entre GHBR1 et les récepteurs GABA-B1a, GABA-B1b et métobotropique Glutamate de type I.
Figure img00310001
<tb>
<tb>
Type <SEP> de <SEP> récepteur <SEP> % <SEP> homologie
<tb> GABA-B1a <SEP> 40
<tb> GABA-B1b <SEP> 40 <SEP>
<tb> mGIuRI <SEP> 35 <SEP>
<tb>
Un codon d'initiation potentiel (ATG) est localisé à la position +22 suivi d'une phase de lecture ouverte de 1535 pb. Un codon STOP (TAA) potentiel se trouve à la position +1558 à son extrémité 3'.
Par multialignement de séquences (multialin, Expasy tools) avec des séquences d'ADNc codant pour des récepteurs connus et décrits comme couplés à une protéine G nous constatons que GHB-R présente certaines homologies avec ces séquences.
A titre d'exemple, la figure 2 montre les homologies avec les séquences des récepteurs GABA-B (GABA-B1a et GABA-B1b). Les nucléotides apparaissant en lettres majuscules dans la séquence consensus sont communs aux trois séquences nucléotidiques.
L'existence de cette phase de lecture ouverte permet de simuler la traduction de ce fragment d'ADNc en protéine. La recherche de régions conservées au niveau de la séquence peptidique de GHB-R révèle l'existence de 7 domaines transmembranaires (caractères gras dans la figure 3).
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EXEMPLE 4 : Expression du récepteur GHB-R par des cellules CHO
La technique de transfection utilisée est celle du phosphate de calcium.
1. Le jour de la transfection, les cellules (CHO) doivent être à confluence.
2.3 h avant la transfection, le milieu de culture est changé.
3. Préparer la solution d'ADN et le tampon HBS 2x selon le tableau 2 cidessous. Ces quantités sont pour un tube :
Tableau 2
Figure img00320001
<tb>
<tb> dna <SEP> 1 <SEP> G/ l <SEP> 15 <SEP> NI <SEP>
<tb> 2 <SEP> M <SEP> CaCl2 <SEP> 60 <SEP> l
<tb> T1E0. <SEP> 05 <SEP> 395 <SEP> l
<tb> 2x <SEP> HBS <SEP> 480 <SEP> l
<tb>
4. Sous la hotte, ajouter la solution d'ADN, goutte à goutte, dans le tampon HBS 2x. Terminer cette opération en faisant des bulles d'air dans le tube pour bien mélanger jusqu'à ce que la préparation soit trouble par la formation de précipité ADNphosphate de calcium.
5. La préparation est laissée à température ambiante pendant 30 minutes.
6. Ajouter 950 L de cette préparation dans chaque boîte de culture et incuber à 37 C.
7. La transfection se fait pendant 16 h.
* 8. Les cellules sont rincées avec 10 ml de PBS.
9.2,5 ml d'une solution de glycerol sont ajoutés par boîte.
10. Après 2 minutes d'incubation à température ambiante, les cellules sont lavées avec 10 ml de PBS.
11. Du milieu frais est rajouté et les cellules sont incubées à 37 C pendant 48 à 72 h.
12. Les celllules sont réensemencées à plus faible densité en présence de G418 (Geneticine) afin de sélectionner les transfectants stables.
EXEMPLE 5 : spécifique du récepteurGHB-R exprimée à la surface de cellules CHO pour les ligands connus du récepteur GHB
Des expériences de Scatchard réalisées sur des cellules CHO transfectées exprimant le récepteur GHB-R obtenues à l'exemple 4 ont permis de confirmer la grande spécificité du récepteur GHB-R selon l'invention pour des ligands connus du
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récepteur GHB. En particulier, la figure 4 représentant la fixation du composé GHB en fonction de sa concentration sur les cellules CHO transfectées met en évidence la grande spécificité de ce composé pour le récepteur GHB-R exprimé (Kd = 425 nM, Bmax = 4,8 pmol/mg protéine).
Des expériences similaires réalisées avec d'autres ligands connus du récepteur GHB mettent également en évidence l'affinité de ce récepteur exprimé à la suface des cellules CHO pour le trans-4-hydroxycrotonate et le p-chloro-phényl-transhydroxycrotonate (résultats non représentés).
D'autres expériences similaires montrent en revanche que ledit récepteur GHBR ainsi exprimé ne reconnaît pas le baclofène, le GABA et le glutamate (cf. figure 7).
Les histogrammes représentés à la figure 7 montrent que les composés GABA, Baclofène et Glutamate ne déplacent pas la fixation du GHB sur le récepteur CHB-R exprimé à la surface des cellules CHO transformées.
EXEMPLE 6 : et identification de sites ou domaines spécifiques du récepteur GHB de séquence SEQ IDNo. 1
1) Sites de phosphorylation
Les sites de phosphorylation (séquences consensus) sont localisés comme suit selon PROSITE.
# Site de phosphorylation de protéine kinase cAMP- et cGMP-dépendantes :
233-236 (peptide RKTS).
# Site de phosphorylation de protéine kinase C :
48-50 (peptide TLR) ;
231-233 (peptide TLR) ;
280-282 (peptide SFK) ;
293-295 (peptide TSR) ;
300-302 (peptide TGK) ;
340-342 (peptide SPR) ;
428-430 (peptide SFK).
# Site de phosphorylation de caséine kinase Il
247-250 (peptide TELE) ;
294-297 (peptide SRQE) ;
503-506 (peptide TWQD).
2) Sites de glycosylation, indices d'hydrophilicité, probabilité de présence en surface, indices de fléxibilité, structures secondaires et indices d'antigénicité.
<Desc/Clms Page number 34>
Le tableau 3 ci-après précise selon la position (Pos) de l'acide aminé sur la séquence SEQ ID No. 1 : - la nature de l'acide aminé (AA) ; - la présence (g) ou l'absence (-) d'un site de glycosylation (GlycoS) ; - l'hydrophilicité (Kyte-Doolittle) moyenne selon une fenêtre de 7 (HyPhil) ; - la probabilité de présence en surface selon Emini (SurfPr) ; - l'indice de flexibilité selon Karplus-Schulz (FlexPr) ; - la présence (H, h, B, b, T ou t) ou l'absence (-) d'une structure secondaire selon Chou-Fasman (CF-Pred) ou selon Garnier-Osguthorpe-Robson (GORPred) ; et - l'index d' antigénicité selon Jameson-Wolf (AI-Ind).
Tableau 3
Figure img00340001
<tb>
<tb> Pos <SEP> AA <SEP> GlycoS <SEP> HyPhil <SEP> SurfPr <SEP> FlexPr <SEP> CF-Pred <SEP> GORPred <SEP> AI-Ind..
<tb>
17 <SEP> A <SEP> 1. <SEP> 100 <SEP> 0. <SEP> 953 <SEP> 0. <SEP> 912 <SEP> H <SEP> B <SEP> 0.600
<tb> 18 <SEP> A <SEP> 0.700 <SEP> 0. <SEP> 934 <SEP> 0. <SEP> 947 <SEP> H <SEP> B <SEP> 0.600
<tb> 19 <SEP> R <SEP> 0. <SEP> 414 <SEP> 0. <SEP> 732 <SEP> 0. <SEP> 981 <SEP> H <SEP> T <SEP> 0.700
<tb> 20 <SEP> R <SEP> 0. <SEP> 343 <SEP> 0. <SEP> 718 <SEP> 1. <SEP> 008 <SEP> H <SEP> T <SEP> 0.850
<tb> 21 <SEP> G <SEP> 1. <SEP> 243 <SEP> 1. <SEP> 391 <SEP> 1. <SEP> 019 <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 22 <SEP> L <SEP> 1. <SEP> 100 <SEP> 0. <SEP> 615 <SEP> 1. <SEP> 013 <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 23 <SEP> G <SEP> 0. <SEP> 686 <SEP> 0. <SEP> 486 <SEP> 1. <SEP> 004 <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 33 <SEP> A <SEP> 1. <SEP> 114 <SEP> 0. <SEP> 879 <SEP> 1. <SEP> 013 <SEP> h <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 34 <SEP> G <SEP> 1. <SEP> 000 <SEP> 0. <SEP> 601 <SEP> 1. <SEP> 037 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.350
<tb> 35 <SEP> G <SEP> 0. <SEP> 586 <SEP> 0. <SEP> 921 <SEP> 1. <SEP> 067 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.350
<tb> 36 <SEP> R <SEP> 0. <SEP> 486 <SEP> 0. <SEP> 488 <SEP> 1. <SEP> 078 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.050
<tb> 37 <SEP> S <SEP> 0. <SEP> 971 <SEP> 0. <SEP> 763 <SEP> 1. <SEP> 076 <SEP> t <SEP> 0.950
<tb> 38 <SEP> P <SEP> 0. <SEP> 657 <SEP> 0. <SEP> 779 <SEP> 1. <SEP> 053 <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 39 <SEP> C <SEP> 0. <SEP> 714 <SEP> 0. <SEP> 533 <SEP> 1. <SEP> 017 <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 43 <SEP> # <SEP> 0.171 <SEP> 0.628 <SEP> 1. <SEP> 021 <SEP> 0. <SEP> 450
<tb> 44 <SEP> S <SEP> 0.586 <SEP> 1. <SEP> 218 <SEP> 1. <SEP> 051 <SEP> t <SEP> 1.100
<tb> 45 <SEP> N <SEP> 0. <SEP> 943 <SEP> 1. <SEP> 312 <SEP> 1. <SEP> 073 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.500
<tb> 46 <SEP> S <SEP> 0. <SEP> 286 <SEP> 1. <SEP> 543 <SEP> 1. <SEP> 082 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.200
<tb> 47 <SEP> R <SEP> 1. <SEP> 571 <SEP> 2. <SEP> 256 <SEP> 1. <SEP> 058 <SEP> H <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 48 <SEP> T <SEP> 0.914 <SEP> 1.157 <SEP> 1. <SEP> 027 <SEP> H <SEP> B <SEP> 0.900
<tb>
<Desc/Clms Page number 35>
Figure img00350001
<tb>
<tb> 72 <SEP> C <SEP> 0. <SEP> 971 <SEP> 0. <SEP> 717 <SEP> 0. <SEP> 987 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.400
<tb> 73 <SEP> S <SEP> 0. <SEP> 957 <SEP> 0. <SEP> 555 <SEP> 0. <SEP> 986 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.200
<tb> 81 <SEP> G <SEP> 1. <SEP> 143 <SEP> 0. <SEP> 988 <SEP> 1. <SEP> 043 <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 82 <SEP> V <SEP> 0.771 <SEP> 1.009 <SEP> 1. <SEP> 024 <SEP> h <SEP> B <SEP> 0.900
<tb> 90 <SEP> S <SEP> 0.657 <SEP> 1.163 <SEP> 1. <SEP> 119 <SEP> t <SEP> 1.100
<tb> 91 <SEP> Q. <SEP> 1.557 <SEP> 1.302 <SEP> 1. <SEP> 133 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.700
<tb> 92 <SEP> G <SEP> 0.686 <SEP> 0.633 <SEP> 1. <SEP> 122 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.550
<tb> 93 <SEP> G <SEP> 1.086 <SEP> 0. <SEP> 817 <SEP> 1. <SEP> 101 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.350
<tb> 94 <SEP> Q <SEP> 1.029 <SEP> 0.467 <SEP> 1. <SEP> 074 <SEP> 0.750
<tb> 95 <SEP> # <SEP> 0.586 <SEP> 0. <SEP> 467 <SEP> 1. <SEP> 058 <SEP> 0. <SEP> 750
<tb> 158 <SEP> W <SEP> . <SEP> 1. <SEP> 286 <SEP> 1. <SEP> 846 <SEP> 0. <SEP> 986 <SEP> B <SEP> 0.750
<tb> 159 <SEP> # <SEP> 2. <SEP> 186 <SEP> 1. <SEP> 598 <SEP> 0. <SEP> 985 <SEP> B <SEP> 0.750
<tb> 160 <SEP> R <SEP> 1. <SEP> 086 <SEP> 0. <SEP> 789 <SEP> 0. <SEP> 990 <SEP> B <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 161 <SEP> D <SEP> 1. <SEP> 086 <SEP> 1. <SEP> 207 <SEP> 0. <SEP> 992 <SEP> B <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 162 <SEP> Q <SEP> 0. <SEP> 414 <SEP> 1. <SEP> 420 <SEP> 0.993 <SEP> B <SEP> T <SEP> 0.850
<tb> 163 <SEP> L <SEP> 0. <SEP> 657 <SEP> 0. <SEP> 628 <SEP> 0. <SEP> 979 <SEP> B <SEP> 0.600
<tb> 171 <SEP> V <SEP> 1. <SEP> 386 <SEP> 1. <SEP> 393 <SEP> 1. <SEP> 011 <SEP> 0.900
<tb> 172 <SEP> K <SEP> 1. <SEP> 529 <SEP> 1. <SEP> 696 <SEP> 1. <SEP> 002 <SEP> h <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 173 <SEP> A <SEP> 1. <SEP> 529 <SEP> 1. <SEP> 762 <SEP> 0. <SEP> 988 <SEP> h <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 174 <SEP> Y <SEP> 1. <SEP> 529 <SEP> 3. <SEP> 964 <SEP> 0. <SEP> 993 <SEP> h <SEP> B <SEP> 0.750
<tb> 175 <SEP> R <SEP> 1. <SEP> 486 <SEP> 1. <SEP> 389 <SEP> 1. <SEP> 008 <SEP> h <SEP> B <SEP> 0.900
<tb> 176 <SEP> D <SEP> 1.429 <SEP> 2. <SEP> 297 <SEP> 1.014 <SEP> h <SEP> B <SEP> 0.900
<tb> 177 <SEP> D <SEP> 1. <SEP> 143 <SEP> 1. <SEP> 209 <SEP> 1. <SEP> 017 <SEP> h <SEP> B <SEP> 0.900
<tb> 178 <SEP> # <SEP> 1. <SEP> 457 <SEP> 1. <SEP> 069 <SEP> 1. <SEP> 008 <SEP> h <SEP> B <SEP> 0.900
<tb> 179 <SEP> D <SEP> 1. <SEP> 314 <SEP> 1. <SEP> 029 <SEP> 0. <SEP> 994 <SEP> h <SEP> B <SEP> 0 <SEP> 750 <SEP>
<tb> 188 <SEP> Q <SEP> 1. <SEP> 157 <SEP> 0. <SEP> 991 <SEP> 0. <SEP> 974 <SEP> H <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 189 <SEP> E <SEP> 0. <SEP> 771 <SEP> 1. <SEP> 534 <SEP> 0. <SEP> 974 <SEP> H <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 190 <SEP> Y <SEP> 0. <SEP> 814 <SEP> 0.814 <SEP> 0. <SEP> 957 <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 191 <SEP> W <SEP> . <SEP> 0. <SEP> 714 <SEP> 0. <SEP> 252 <SEP> 0. <SEP> 935 <SEP> T <SEP> 1.000
<tb>
<Desc/Clms Page number 36>
Figure img00360001
<tb>
<tb> 197 <SEP> R <SEP> 0.871 <SEP> 1.105 <SEP> 1. <SEP> 038 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.500
<tb> 198 <SEP> G <SEP> 1.729 <SEP> 1.864 <SEP> 1. <SEP> 072 <SEP> t <SEP> 1.100
<tb> 199 <SEP> P <SEP> @ <SEP> 1.800 <SEP> 1.940 <SEP> 1.075 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.700
<tb> 200 <SEP> N <SEP> 2.557 <SEP> 1. <SEP> 593 <SEP> 1. <SEP> 062 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.700
<tb> 201 <SEP> D <SEP> 1. <SEP> 371 <SEP> 1. <SEP> 327 <SEP> 1. <SEP> 035 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.700
<tb> 202 <SEP> W <SEP> . <SEP> 1.814 <SEP> 1. <SEP> 381 <SEP> 0.994 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.350
<tb> 203 <SEP> N <SEP> 0. <SEP> 943 <SEP> 0. <SEP> 602 <SEP> 0. <SEP> 972 <SEP> 0.600
<tb> 204 <SEP> L <SEP> 1. <SEP> 086 <SEP> 0. <SEP> 706 <SEP> 0. <SEP> 964 <SEP> b <SEP> 0.600
<tb> 205 <SEP> N <SEP> 0. <SEP> 686 <SEP> 0. <SEP> 969 <SEP> 0. <SEP> 971 <SEP> b <SEP> 0.600
<tb> 206 <SEP> # <SEP> 0. <SEP> 671 <SEP> 0. <SEP> 807 <SEP> 1. <SEP> 004 <SEP> b <SEP> 0.750
<tb> 215 <SEP> N <SEP> g <SEP> 1. <SEP> 157 <SEP> 2. <SEP> 894 <SEP> 1. <SEP> 099 <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 216 <SEP> P <SEP> 2. <SEP> 200 <SEP> 3. <SEP> 472 <SEP> 1. <SEP> 102 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.700
<tb> 217 <SEP> S <SEP> 2. <SEP> 743 <SEP> 5. <SEP> 075 <SEP> 1. <SEP> 098 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.700
<tb> 218 <SEP> R <SEP> 2. <SEP> 271 <SEP> 1. <SEP> 692 <SEP> 1. <SEP> 074 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.500
<tb> 219 <SEP> E <SEP> 1. <SEP> 829 <SEP> 1. <SEP> 083 <SEP> 1. <SEP> 051 <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 220 <SEP> R <SEP> 1. <SEP> 000 <SEP> 0. <SEP> 600 <SEP> 1. <SEP> 022 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.350
<tb> 221 <SEP> C <SEP> 1. <SEP> 114 <SEP> 0. <SEP> 473 <SEP> 0. <SEP> 988 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.200
<tb> 231 <SEP> T <SEP> 0. <SEP> 929 <SEP> 1. <SEP> 554 <SEP> 1. <SEP> 000 <SEP> B <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 232 <SEP> L <SEP> 0. <SEP> 900 <SEP> 3.021 <SEP> 1.022 <SEP> B <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 233 <SEP> R <SEP> 1.614 <SEP> 2.067 <SEP> 1. <SEP> 046 <SEP> B <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 234 <SEP> K <SEP> 1.471 <SEP> 2. <SEP> 480 <SEP> 1. <SEP> 064 <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 235 <SEP> T <SEP> 1. <SEP> 557 <SEP> 4. <SEP> 712 <SEP> 1. <SEP> 070 <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 236 <SEP> S <SEP> 2. <SEP> 329 <SEP> 3. <SEP> 720 <SEP> 1. <SEP> 065 <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 237 <SEP> Q <SEP> 1. <SEP> 329 <SEP> 0. <SEP> 997 <SEP> 1. <SEP> 035 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.350
<tb> 238 <SEP> Y <SEP> 0. <SEP> 829 <SEP> 0. <SEP> 684 <SEP> 0. <SEP> 999 <SEP> t <SEP> 0.800
<tb> 239 <SEP> P <SEP> 0. <SEP> 914 <SEP> 0. <SEP> 800 <SEP> 0. <SEP> 970 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.400
<tb> 240 <SEP> C <SEP> 0. <SEP> 900 <SEP> 0. <SEP> 666 <SEP> 0. <SEP> 958 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.400
<tb> 244 <SEP> S <SEP> 0. <SEP> 800 <SEP> 1. <SEP> 754 <SEP> 1. <SEP> 028 <SEP> h <SEP> 0.900
<tb> 245 <SEP> A <SEP> 1. <SEP> 243 <SEP> 1.939 <SEP> 1.040 <SEP> h <SEP> H <SEP> 0.900
<tb> 246 <SEP> Q <SEP> 0. <SEP> 514 <SEP> 1. <SEP> 108 <SEP> 1. <SEP> 040 <SEP> h <SEP> H <SEP> 0.900
<tb> 247 <SEP> T <SEP> 0. <SEP> 914 <SEP> 1. <SEP> 432 <SEP> 1. <SEP> 030 <SEP> h <SEP> H <SEP> 0.900
<tb> 248 <SEP> E <SEP> 1. <SEP> 257 <SEP> 1. <SEP> 928 <SEP> 1. <SEP> 013 <SEP> h <SEP> H <SEP> 0.900
<tb> 249 <SEP> L <SEP> 2. <SEP> 071 <SEP> 2. <SEP> 227 <SEP> 0. <SEP> 998 <SEP> h <SEP> H <SEP> 0.750
<tb>
<Desc/Clms Page number 37>
Figure img00370001
<tb>
<tb> 250 <SEP> E <SEP> 0. <SEP> 929 <SEP> 1. <SEP> 082 <SEP> 0. <SEP> 983 <SEP> h <SEP> H <SEP> 0.750
<tb> 251 <SEP> H <SEP> 1.286 <SEP> 0. <SEP> 850 <SEP> 0. <SEP> 972 <SEP> h <SEP> H <SEP> 0.600
<tb> 252 <SEP> K <SEP> 0.243 <SEP> 0.850 <SEP> 0. <SEP> 962 <SEP> h <SEP> H <SEP> 0.300
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<tb> 254 <SEP> H <SEP> 1. <SEP> 243 <SEP> 0.850 <SEP> 0.940 <SEP> b <SEP> H <SEP> 0.600
<tb> 255 <SEP> L <SEP> 0. <SEP> 900 <SEP> 0. <SEP> 569 <SEP> 0. <SEP> 948 <SEP> b <SEP> 0.600
<tb> 256 <SEP> H <SEP> 0.471 <SEP> 0. <SEP> 854 <SEP> 0.959 <SEP> b <SEP> 0.300
<tb> 257 <SEP> Q <SEP> 1. <SEP> 243 <SEP> 0. <SEP> 660 <SEP> 0. <SEP> 975 <SEP> b <SEP> 0.600
<tb> 258 <SEP> S <SEP> 1.014 <SEP> 1.238 <SEP> 0. <SEP> 976 <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 259 <SEP> W <SEP> . <SEP> 1. <SEP> 157 <SEP> 0. <SEP> 788 <SEP> 0. <SEP> 960 <SEP> h <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 260 <SEP> W <SEP> . <SEP> 1. <SEP> 200 <SEP> 0. <SEP> 788 <SEP> 0. <SEP> 952 <SEP> h <SEP> 0.600
<tb> 261 <SEP> P <SEP> 1.257 <SEP> 1.175 <SEP> 0. <SEP> 957 <SEP> h <SEP> 0.750
<tb> 262 <SEP> F <SEP> 1. <SEP> 271 <SEP> 1. <SEP> 175 <SEP> 0. <SEP> 966 <SEP> h <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 263 <SEP> E. <SEP> 0. <SEP> 600 <SEP> 0. <SEP> 922 <SEP> 0. <SEP> 985 <SEP> h <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 264 <SEP> K <SEP> 1. <SEP> 029 <SEP> 1. <SEP> 192 <SEP> 0. <SEP> 999 <SEP> h <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 265 <SEP> W <SEP> . <SEP> 1. <SEP> 357 <SEP> 2. <SEP> 753 <SEP> 1. <SEP> 004 <SEP> h <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 266 <SEP> L <SEP> 1. <SEP> 986 <SEP> 2. <SEP> 458 <SEP> 1. <SEP> 018 <SEP> h <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 267 <SEP> K <SEP> 1. <SEP> 986 <SEP> 2. <SEP> 053 <SEP> 1. <SEP> 034 <SEP> h <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 268 <SEP> K <SEP> 1.486 <SEP> 1. <SEP> 932 <SEP> 1. <SEP> 046 <SEP> h <SEP> 0.900
<tb> 269 <SEP> P <SEP> 1.486 <SEP> 2. <SEP> 463 <SEP> 1. <SEP> 046 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.700
<tb> 270 <SEP> D <SEP> 2. <SEP> 257 <SEP> 1. <SEP> 905 <SEP> 1. <SEP> 039 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.700
<tb> 271 <SEP> G <SEP> 1. <SEP> 757 <SEP> 0. <SEP> 943 <SEP> 1. <SEP> 029 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.550
<tb> 289 <SEP> N <SEP> 1. <SEP> 514 <SEP> 2. <SEP> 290 <SEP> 1. <SEP> 067 <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 290 <SEP> P <SEP> 1. <SEP> 871 <SEP> 3. <SEP> 339 <SEP> 1. <SEP> 078 <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 291 <SEP> R <SEP> 1. <SEP> 929 <SEP> 2. <SEP> 894 <SEP> 1. <SEP> 089 <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 292 <SEP> S <SEP> 2. <SEP> 343 <SEP> 3. <SEP> 524 <SEP> 1. <SEP> 101 <SEP> t <SEP> 1.100
<tb> 293 <SEP> T <SEP> 2. <SEP> 343 <SEP> 3. <SEP> 947 <SEP> 1. <SEP> 105 <SEP> t <SEP> 1.100
<tb> 294 <SEP> S <SEP> 2. <SEP> 614 <SEP> 3. <SEP> 490 <SEP> 1. <SEP> 113 <SEP> t <SEP> 1.100
<tb> 295 <SEP> R <SEP> 2. <SEP> 614 <SEP> 5. <SEP> 101 <SEP> 1. <SEP> 106 <SEP> t <SEP> 1 <SEP> 100 <SEP>
<tb> 296 <SEP> Q <SEP> 2. <SEP> 729 <SEP> 5. <SEP> 466 <SEP> 1. <SEP> 100 <SEP> 0.900
<tb> 297 <SEP> E <SEP> 2. <SEP> 729 <SEP> 5.886 <SEP> 1.088 <SEP> 0. <SEP> 900
<tb> 298 <SEP> R <SEP> 2. <SEP> 671 <SEP> 2. <SEP> 974 <SEP> 1. <SEP> 078 <SEP> 0.900
<tb> 299 <SEP> P <SEP> 2. <SEP> 586 <SEP> 3. <SEP> 434 <SEP> 1. <SEP> 080 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.700
<tb> 300 <SEP> T <SEP> 1. <SEP> 543 <SEP> 1.635 <SEP> 1.074 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.700
<tb> 301 <SEP> G <SEP> 1. <SEP> 271 <SEP> 1. <SEP> 291 <SEP> 1. <SEP> 075 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.700
<tb>
<Desc/Clms Page number 38>
Figure img00380001
<tb>
<tb> 323 <SEP> A <SEP> 1.057 <SEP> 1.342 <SEP> 1. <SEP> 001 <SEP> h <SEP> 0.900
<tb> 324 <SEP> L <SEP> 1.057 <SEP> 0.899 <SEP> 0. <SEP> 985 <SEP> h <SEP> 0.600
<tb> 325 <SEP> P <SEP> 1.000 <SEP> 0.933 <SEP> 0. <SEP> 979 <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 326 <SEP> H <SEP> 0,629 <SEP> 0.971 <SEP> 0.982 <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 327 <SEP> S <SEP> 1.386 <SEP> 2. <SEP> 038 <SEP> 0.995 <SEP> 0. <SEP> 750
<tb> 328 <SEP> Q <SEP> 1. <SEP> 986 <SEP> 1. <SEP> 305 <SEP> 1. <SEP> 002 <SEP> B <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 329 <SEP> W <SEP> 1.214 <SEP> 0.791 <SEP> 0. <SEP> 999 <SEP> B <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 330 <SEP> Q <SEP> 0.886 <SEP> 0.620 <SEP> 0. <SEP> 997 <SEP> B <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 331 <SEP> G <SEP> 1.271 <SEP> 0.598 <SEP> 0. <SEP> 986 <SEP> B <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 343 <SEP> L <SEP> 1.043 <SEP> 0.723 <SEP> 0.973 <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 344 <SEP> C <SEP> 0.986 <SEP> 0.463 <SEP> 0. <SEP> 957 <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 345 <SEP> E <SEP> 0.857 <SEP> 0.341 <SEP> 0. <SEP> 964 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.200
<tb> 346 <SEP> H <SEP> 0. <SEP> 714 <SEP> 0. <SEP> 716 <SEP> 0. <SEP> 993 <SEP> t <SEP> 0.800
<tb> 347 <SEP> G <SEP> 1. <SEP> 757 <SEP> 2.314 <SEP> 1.028 <SEP> t <SEP> 1.100
<tb> 348 <SEP> T <SEP> 1. <SEP> 857 <SEP> 1. <SEP> 350 <SEP> 1. <SEP> 058 <SEP> t <SEP> 1.100
<tb> 349 <SEP> Q <SEP> 1. <SEP> 457 <SEP> 1. <SEP> 432 <SEP> 1. <SEP> 074 <SEP> H <SEP> H <SEP> 0.900
<tb> 350 <SEP> E <SEP> 1. <SEP> 500 <SEP> 2. <SEP> 505 <SEP> 1. <SEP> 068 <SEP> H <SEP> H <SEP> 0.900
<tb> 351 <SEP> A <SEP> 1. <SEP> 186 <SEP> 1. <SEP> 754 <SEP> 1. <SEP> 059 <SEP> H <SEP> H <SEP> 0.900
<tb> 352 <SEP> T <SEP> 1. <SEP> 143 <SEP> 1. <SEP> 002 <SEP> 1. <SEP> 042 <SEP> H <SEP> H <SEP> 0.900
<tb> 425 <SEP> P <SEP> 1.343 <SEP> 0.788 <SEP> 0. <SEP> 944 <SEP> B <SEP> 0.600
<tb> 426 <SEP> F <SEP> 0. <SEP> 300 <SEP> 0. <SEP> 649 <SEP> 0. <SEP> 961 <SEP> B <SEP> T <SEP> 0.700
<tb> 427 <SEP> Q <SEP> 0. <SEP> 729 <SEP> 1. <SEP> 234 <SEP> 0. <SEP> 986 <SEP> B <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 428 <SEP> S <SEP> 0. <SEP> 657 <SEP> 0. <SEP> 790 <SEP> 1. <SEP> 010 <SEP> B <SEP> 0.750
<tb> 429 <SEP> F <SEP> 0. <SEP> 929 <SEP> 1. <SEP> 523 <SEP> 1. <SEP> 026 <SEP> B <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 430 <SEP> K <SEP> 1.386 <SEP> 0.870 <SEP> 1. <SEP> 049 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1 <SEP> 350 <SEP>
<tb> 431 <SEP> G <SEP> 0. <SEP> 629 <SEP> 0. <SEP> 656 <SEP> 1. <SEP> 059 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.350
<tb> 432 <SEP> D <SEP> 1. <SEP> 157 <SEP> 1. <SEP> 484 <SEP> 1. <SEP> 056 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.500
<tb> 433 <SEP> G <SEP> 2. <SEP> 200 <SEP> 1. <SEP> 453 <SEP> 1. <SEP> 053 <SEP> t <SEP> 1.100
<tb> 434 <SEP> A <SEP> 1. <SEP> 043 <SEP> 1. <SEP> 090 <SEP> 1.039 <SEP> 0 <SEP> 900 <SEP>
<tb> 435 <SEP> R <SEP> 1.043 <SEP> 0.646 <SEP> 1. <SEP> 020 <SEP> B <SEP> 0.750
<tb> 436 <SEP> R <SEP> 1. <SEP> 000 <SEP> 0. <SEP> 888 <SEP> 1. <SEP> 004 <SEP> B <SEP> 0 <SEP> 750 <SEP>
<tb> 464 <SEP> H <SEP> 1. <SEP> 057 <SEP> 0. <SEP> 516 <SEP> 0. <SEP> 938 <SEP> h <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 465 <SEP> # <SEP> 0. <SEP> 914 <SEP> 0. <SEP> 558 <SEP> 0. <SEP> 918 <SEP> h <SEP> 0.600
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Figure img00390001
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<tb> 466 <SEP> H <SEP> 0. <SEP> 143 <SEP> 0.558 <SEP> 0.914 <SEP> h <SEP> 0.300
<tb> 467 <SEP> H <SEP> 1. <SEP> 186 <SEP> 0.710 <SEP> 0.931 <SEP> h <SEP> 0.600
<tb> 468 <SEP> D <SEP> 0. <SEP> 957 <SEP> 1. <SEP> 565 <SEP> 0. <SEP> 956 <SEP> h <SEP> 0.750
<tb> 469 <SEP> L <SEP> 1.343 <SEP> 1.162 <SEP> 0. <SEP> 980 <SEP> h <SEP> 0.750
<tb> 470 <SEP> E <SEP> 1. <SEP> 014 <SEP> 0. <SEP> 898 <SEP> 0. <SEP> 995 <SEP> h <SEP> 0.60
<tb> 471 <SEP> P <SEP> 0.671 <SEP> 0.721 <SEP> 1. <SEP> 002 <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 472 <SEP> A <SEP> 0.286 <SEP> 1. <SEP> 171 <SEP> 1. <SEP> 006 <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 473 <SEP> W <SEP> . <SEP> 1. <SEP> 057 <SEP> 1. <SEP> 046 <SEP> 1. <SEP> 017 <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 474 <SEP> S <SEP> 0. <SEP> 686 <SEP> 0.711 <SEP> 1.033 <SEP> t <SEP> 0.950
<tb> 475 <SEP> S <SEP> 0. <SEP> 686 <SEP> 1.088 <SEP> 1.049 <SEP> t <SEP> 1.100
<tb> 476 <SEP> P <SEP> 1. <SEP> 443 <SEP> 1. <SEP> 792 <SEP> 1. <SEP> 052 <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 477 <SEP> W <SEP> . <SEP> 0.957 <SEP> 0.717 <SEP> 1. <SEP> 033 <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 478 <SEP> P <SEP> 1.300 <SEP> 0.728 <SEP> 1. <SEP> 015 <SEP> t <SEP> 0.950
<tb> 479 <SEP> Q <SEP> 1.300 <SEP> 0.631 <SEP> 0.985 <SEP> t <SEP> T <SEP> 1.200
<tb> 480 <SEP> C <SEP> 0.529 <SEP> 0.495 <SEP> 0.960 <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 481 <SEP> H <SEP> 0.900 <SEP> 0.554 <SEP> 0.951 <SEP> T <SEP> 1.000
<tb> 501 <SEP> T <SEP> 1. <SEP> 114 <SEP> 1.103 <SEP> 0.993 <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 502 <SEP> H <SEP> 1.386 <SEP> 2.317 <SEP> 0. <SEP> 987 <SEP> 0.750
<tb> 503 <SEP> T <SEP> 2. <SEP> 429 <SEP> 1. <SEP> 976 <SEP> 0. <SEP> 980 <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 504 <SEP> W <SEP> . <SEP> 1. <SEP> 843 <SEP> 1. <SEP> 355 <SEP> 0.982 <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 505 <SEP> Q <SEP> 1. <SEP> 929 <SEP> 1.560 <SEP> 0.993 <SEP> T <SEP> 1.150
<tb> 506 <SEP> D <SEP> 1. <SEP> 971 <SEP> 1. <SEP> 872 <SEP> 1. <SEP> 005 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.700
<tb> 507 <SEP> G <SEP> 2. <SEP> 514 <SEP> 3. <SEP> 487 <SEP> 1. <SEP> 014 <SEP> T <SEP> T <SEP> 1.700
<tb> 508 <SEP> Y <SEP> 1. <SEP> 843 <SEP> 1. <SEP> 661 <SEP> 1. <SEP> 012 <SEP> t <SEP> 1.100
<tb> 509 <SEP> E <SEP> 1. <SEP> 843 <SEP> 1. <SEP> 599 <SEP> 1. <SEP> 000 <SEP> 0.900
<tb> 510 <SEP> R <SEP> 1. <SEP> 567 <SEP> 2.065 <SEP> 1.000 <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 511 <SEP> L <SEP> 1.800 <SEP> 1. <SEP> 685 <SEP> 1. <SEP> 000 <SEP> T <SEP> 1.300
<tb> 512 <SEP> N <SEP> 1. <SEP> 925 <SEP> 1. <SEP> 244 <SEP> 1. <SEP> 000 <SEP> T <SEP> 1.300
<tb>
H : pr sence tr s probable d'une h lice a ; h : pr sence putative d'une h lice a ; B : pr sence tr s probable d'un feuillet p ; b : pr sence putative d'un feuillet p ; T : pr sence tr s probable d'une boucle ; t : pr sence putative d'une boucle.
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Les r sultats pr sent s ci-dessus, d montrent que la s quence d'ADNc isol e et identifi e selon la pr sente invention code tr s certainement pour le r cepteur du GHB (GHB-R). En effet, l'analyse de la s quence nucl otidique isol e de GHB-R (SEQ ID No. 2) r v le une homologie avec celles de r cepteurs 7 domaines membranaires et coupl s une prot ine G, crit re structural essentiel de ce type de r cepteur. D'autre part, l'ADNc code pour une prot ine de poids mol culaire 56 kDa, ce qui correspond au poids mol culaire mesur pour la prot ine purifi e de d part qui apr s s quen age partiel a permis de dessiner les amorces sp cifiques. L'ADNc finalement isol , transfect dans des cellules CHO, a induit l'expression d'une population de sites de liaison de haute affinit pour le GHB (Kd = 425 nM, Bmax = 4,8 pmol/mg prot ine).
Ce site de liaison fixe le GHB, le trans-4-hydroxycrotonate, le p-chloro-ph nyltranshydroxycrotonate qui sont des ligands pour le r cepteur GHB. Par contre, le r cepteur ne reconna t pas le baclof ne, le GABA et le glutamate. Il est donc bien distinct d'un r cepteur GABA-B ou GABA-A ou glutamate.
L'isolement et l'identification de la s quence de de l'ADNc du r cepteur GHB-R selon l'invention ainsi que la caract risation de son activit fonctionnelle comme r cepteur sp cifique de ligangs connus de ce r cepteur, tel que le compos GHB, permet : - le criblage d'une banque g nomique pour l' tude de la r gulation de l'expression du g ne codant pour le r cepteur GHB-R selon l'invention et pour l'identification de ses s quences promotrices et/ou r gulatrices de son expression ; - la recherche d'une famille de r cepteurs par criblage plus faibles stringences avec des acides nucl iques selon l'invention et l'isolement d'ADNc parents qui induiraient une fixation du GHB apr s transfection de cellules ; - l' tude de la r gulation de l'expression du r cepteur (down-r gulation) GHB-R selon l'invention et de la modulation de son affinit pour ses agonistes (d sensibilisation par phosphorylation r versible) apr s hyperstimulation selon des modalit s proches de celles rencontr es en clinique humaine. Ces tudes pourront tre r alis es en culture de cellules selon l'invention, un anticorps sp cifique selon l'invention dirig contre le r cepteur permettant de l'immunopr cipiter sp cifiquement.
Ces tudes pourront se faire sur des cellules transfect es surexprimant le r cepteur
GHB-R selon l'invention avec co-transfection ventuelle de prot ines G ; - l' tude de la distribution et de l'hypo ou hyperexpression du r cepteur GHB-R selon l'invention apr s marquage avec un ou des anticorps sp cifiques selon l'invention. Ces anticorps selon l'invention pourront tre obtenus en particulier partir de polypeptides synth tiques ou recombinants, sp cifiques notamment d'une partie
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hydrophile de la séquence du récepteur GHB-R selon l'invention, éventuellement couplés ou associés à une protéine porteuse, telle qu'une anatoxine (TT), une protéine membranaire d'enterobactérie (OmpA), ou en présence d'un adjuvant de l'immunité tel que l'adjuvant de Freund ou l'ISCOM, puis administré à un animal ; - l'étude de la distribution des ARN messagers spécifiques du récepteur au moyen d'acide nucléique selon l'invention pour l'étude de la régulation de son expression chez l'animal par exemple par administration chronique de GHB ou de ligand structurellement apparenté ; - l'étude des voies GHBergiques cérébrales par exemple par double marquage en microscopie confocale, à la fois du récepteurGHB-R selon l'invention pour le GHB et son enzyme de synthèse (SSR) ; - le criblage de chimiothèque pour la sélection de ligands de haute affinité pour le récepteur GHB-R selon l'invention, à l'aide de polypeptides ou de cellules transfectés selon la présente invention. Ces ligands seront ensuite sélectionnés pour leur pouvoir agoniste, agoniste inverse, antagoniste. Pour cette sélection, il sera possible d'utiliser par exemple des cellules en cultures exprimant un récepteur actif (cellules NCB-20 ou des cellules transfectées selon l'invention). Les mouvements d'ions qui sont modifiés par la stimulation du récepteur GHB selon l'invention pourront également être étudiés, par exemple à l'aide du calcium 45 ou du rubidium 86).
Le récepteur GHB-R selon l'invention est responsable de la régulation présynaptique des activités GABAergique et dopaminergique cérébrale. Ces effets seront explorés à l'aide de ligands agonistes ou antagonistes spécifiques. L'implication de ces ligands et du récepteur GHB-R selon l'invention dans le pilotage des activités dopaminergiques et GABAergiques a des applications dans plusieurs affections neuropsychiatriques : - la régulation de l'activité cérébrale GABAergique via des ligands du récepteur GHB-R selon l'invention peut être utilisée pour des profits thérapeutiques dans les manifestations anxieuses, la régulation du sommeil, le sevrage à certaines drogues (cocaïne, héroïne, alcool), l'épilepsie, la régulation de l'humeur ; - la régulation de l'activité cérébrale dopaminergique via des ligands du récepteur GHB-R selon l'invention peut être utilisée pour des profits thérapeutiques dans le sevrage à certaines drogues (cocaïne, héroïne, alcool), dans la régulation de l'humeur, pour l'amélioration de la symptomatologie de certaines psychoses ou la dopamine joue un rôle (schizophrénie), dans certaines maladies neurodégénératives ou la dopamine est spécifiquement impliquée (maladie de Parkinson), dans la
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régulation de la sécrétion de certaines hormones qui sont sous contrôle dopaminergique (hormone de croissance, prolactine).
~~ Dans certaines des affections citées (épilepsie, troubles du sommeil et syndrome narcolepsique, troubles de l'humeur et dépression, troubles anxieux), une anomalie de l'expression et/ou de l'activité du récepteur GHB-R selon l'invention chez ces malades est probable et peut être explorée.
Enfin, l"invalidation du gène du récepteur cloné GHB-R selon l'invention chez par exemple la souris est un modèle de choix pour explorer les fonctionnalités de ce récepteur. La souche de souris obtenue représentera un modèle en particulier pour l'étude physiopathologique, comportementale et des mécanismes moléculaires des affections précédemment citées telles que notamment certaines formes d'épilepsies, troubles anxieux, certains troubles du sommeil et de la vigilance, altérations du rythme circadien ou anomalies de la régulation thymique.
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<Desc/Clms Page number 46>
LISTAGE DE SEQUENCES <110> ADEREGEM <120> CLONAGE, EXPRESSION ET CARACTERISATION D'UN ADNc CODANT
POUR UN RECEPTEUR GAMMA-HYDROXYBUTYRATE (GHB) DE
CERVEAU DE RAT <130> D18184 <160> 2 <170> PatentIn Vers. 2.0 <210> 1 <211> 512 <212> PRT <213> Rat <400> 1
Met Arg Ala Ala Ala Ala Gly Leu Gly Pro Gly Arg Leu His Ala Trp
1 10 15
Ala Ala Arg Arg Gly Leu Gly Arg Phe Pro Ala Arg Val Pro Arg Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Arg Ser Pro Cys Pro Ala Ser Ile Ser Asn Ser Arg Thr
35 40 45
Leu Arg Leu Ala Ala Ala Gly Asn Thr Phe Cys Leu Ala Ser Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Gly Cys Trp Glu Pro Cys Ser Trp Pro Ser Ala Ser Gly Pro
65 70 75 80
Gly Val Arg Arg Ala Phe Phe Pro Thr Ser Gln Gly Gly Gln Ile Gln
85 90 95
Gly Gly Leu Asp Pro Val Trp Leu Phe Val Val Ile Gly Gly Ile Met
100 105 110
Ser Val Leu Gly Phe Ala Gly Cys Ile Gly Ala Leu Arg Glu Asn Thr
115 120 125
Phe Leu Leu Lys Phe Phe Ser Val Phe Leu Gly Leu Ile Phe Phe Leu
130 135 140
Glu Leu Ala Ala Gly Ile Leu Ala Phe Val Phe Lys Asp Trp Ile Arg
145 150 155 160
Asp Gln Leu Asn Leu Phe Ile Asn Asn Asn Val Lys Ala Tyr Arg Asp
165 170 175
Asp Ile Asp Leu Gln Asn Leu Ile Asp Phe Ala Gln Glu Tyr Trp Ser
180 185 190
Cys Cys Gly Ala Arg Gly Pro Asn Asp Trp Asn Leu Asn Ile Arg Thr
195 200 205
<Desc/Clms Page number 47>
Ser Thr Ala Leu Thr Ser Asn Pro Ser Arg Glu Arg Cys Gly Val Pro
210 215 220 Phe Phe Cys Trp Val Arg Thr Leu Arg Lys Thr Ser Gln Tyr Pro Cys 225 230 235 240 Gly Tyr Thr Ser Ala Gln Thr Glu Leu Glu His Lys Ile His Leu His
245 250 255 Gln Ser Trp Trp Pro Phe Glu Lys Trp Leu Lys Lys Pro Asp Gly Trp
260 265 270 Pro Gly Leu Gly Ala Ile Ala Ser Phe Lys Met Gly Ile Ala Gly Pro
275 280 285 Asn Pro Arg Ser Thr Ser Arg Gln Glu Arg Pro Thr Gly Lys Leu Pro
290 295 300 Gly Val Met Ala Thr Cys Leu Ala His Arg Ala Val Val Gly Ala Ser 305 310 315 320 Lys Asp Ala Leu Pro His Ser Gln Trp Gln Gly Leu Trp Asp Val Cys
325 330 335 Tyr Asp Leu Ser Pro Arg Leu Cys Glu His Gly Thr Gln Glu Ala Thr
340 345 350 Glu Ala Gly Leu Gly Leu Asn Trp Gly Cys Thr Gly Ala Gly Leu Gly
355 360 365 Leu Phe Thr Thr Glu Leu Cys Val Trp Gly Val His Met Cys Val Cys
370 375 380 Val Cys Val Cys Val Cys Val Arg Val Cys Leu Cys Leu Cys Val Arg 385 390 395 400 Val Arg Gly Met His Val Cys Ala Leu Val Ser Thr Pro Gly Val Ser
405 410 415 Thr Pro Leu Leu Val Arg Trp Trp Pro Phe Gln Ser Phe Lys Gly Asp
420 425 430 Gly Ala Arg Arg Val Gly His Val Pro Ala Ser Pro Ser Leu Leu Trp
435 440 445 Asp Val Ser Leu Cys Gly Leu Gly Ala Cys Cys Leu Arg Pro Leu His
450 455 460 Ile His His Asp Leu Glu Pro Ala Trp Ser Ser Pro Trp Pro Gln Cys 465 470 475 480 His Ser Leu Glu Met Gly Pro Arg Ile Leu Ser Val Ser Leu Ser Arg
485 490 495
Leu Pro Leu Arg Thr His Thr Trp Gln Asp Gly Tyr Glu Arg Leu Asn
500 505 510 <210> 2 <211> 1567
<Desc/Clms Page number 48>
<212> ADN <213> Rat <220> <221> CDS <222> (22)..(1557) <400> 2 ggcacgaggt gtggctctgg c atg aga gcc gca gcc gcc ggg cta ggc ccg 51
Met Arg Ala Ala Ala Ala Gly Leu Gly Pro 1 5 10 ggg cgg ctc cac gcc tgg gca gcc cgc aga ggg ctg ggc cgg ttc ccg 99 Gly Arg Leu His Ala Trp Ala Ala Arg Arg Gly Leu Gly Arg Phe Pro
15 20 25 gct cgg gtt ccc agg gcg gca ggt ggc cgc tca cca tgc ccg gca agc 147 Ala Arg Val Pro Arg Ala Ala Gly Gly Arg Ser Pro Cys Pro Ala Ser
30 35 40 atc agc aat tcc agg ace ctg agg ttg gct gct gcg gga aat act ttc 195 Ile Ser Asn Ser Arg Thr Leu Arg Leu Ala Ala Ala Gly Asn Thr Phe
45 50 55 tgt ttg gct tca aca ttg tct tct ggg tgc tgg gag ccc tgt tcc tgg 243 Cys Leu Ala Ser Thr Leu Ser Ser Gly Cys Trp Glu Pro Cys Ser Trp
60 65 70 cca tcg gcc tct ggg cet ggg gtg aga agg gcg ttc ttt cca aca tct 291 Pro Ser Ala Ser Gly Pro Gly Val Arg Arg Ala Phe Phe Pro Thr Ser
75 80 85 90 cag ggc gga cag atc caa ggc ggt ctt gac ccc gtg tgg ctg ttt gtg 339 Gln Gly Gly Gln Ile Gln Gly Gly Leu Asp Pro Val Trp Leu Phe Val
95 100 105 gtg att ggg gga atc atg tca gtg ctg ggc ttt gcc ggc tgc att ggg 387 Val Ile Gly Gly Ile Met Ser Val Leu Gly Phe Ala Gly Cys Ile Gly
110 115 120 gcc ctc cgg gaa aac acc ttc ctg ctc aaa ttt ttc tct gtg ttc ctc 435 Ala Leu Arg Glu Asn Thr Phe Leu Leu Lys Phe Phe Ser Val Phe Leu
125 130 135 ggc ctc atc ttc ttc ctg gag ctg gcg gcc ggg atc ctg gcc ttc gtg 483 Gly Leu Ile Phe Phe Leu Glu Leu Ala Ala Gly Ile Leu Ala Phe Val
140 145 150 ttc aag gat tgg atc cga gac caa ctt aac ctc ttc atc aac aac aat 531
Phe Lys Asp Trp Ile Arg Asp Gln Leu Asn Leu Phe Ile Asn Asn Asn
155 160 165 170 gtc aaa gcc tac cgg gac gat att gac ctt cag aac ctt atc gac ttt 579 Val Lys Ala Tyr Arg Asp Asp Ile Asp Leu Gln Asn Leu Ile Asp Phe
175 180 185 gct cag gaa tac tgg tct tgc tgt gga gcc cga ggg ccc aat gac tgg 627
Ala Gln Glu Tyr Trp Ser Cys Cys Gly Ala Arg Gly Pro Asn Asp Trp
190 195 200
<Desc/Clms Page number 49>
aac ctc aac atc cgg act tca act gca ctg act tca aac cca agc cgc 675 Asn Leu Asn Ile Arg Thr Ser Thr Ala Leu Thr Ser Asn Pro Ser Arg
205 210 215 gag cgc tgt ggg gtg ccc ttc ttc tgc tgg gta agg acc ctg cgg aag 723 Glu Arg Cys Gly Val Pro Phe Phc Cys Trp Val Arg Thr Leu Arg Lys
220 225 230 acg tct caa tac cca tgt ggc tat aca tcc gct caa act gag ctg gag 771 Thr Ser Gln Tyr Pro Cys Gly Tyr Thr Ser Ala Gln Thr Glu Leu Glu 235 240 245 250 cac aag att cat cta cac caa agc tgg tgg cca ttt gag aag tgg ctc 819 His Lys Ile His Leu His Gln Ser Trp Trp Pro Phe Glu Lys Trp Leu
255 260 265 aag aaa cet gat ggg tgg ccg ggt ctt ggc gcc att gcc tcc ttc aaa 867 Lys Lys Pro Asp Gly Trp Pro Gly Leu Gly Ala Ile Ala Ser Phe Lys
270 275 280 atg ggc atc gct ggc ccc aac cet cgt agt aca tcg agg cag gaa agg 915 Met Gly Ile Ala Gly Pro Asn Pro Arg Ser Thr Ser Arg Gln Glu Arg
285 290 295 cca act ggt aag ctg ccg ggg gta atg gcc aca tgc ctg gcc cac agg 963 Pro Thr Gly Lys Leu Pro Gly Val Met Ala Thr Cys Leu Ala His Arg
300 305 310 gct gta gtt ggg gcc tcc aag gac gct ctg cet cac tca caa tgg caa 1011 Ala Val Val Gly Ala Ser Lys Asp Ala Leu Pro His Ser Gln Trp Gln 315 320 325 330 ggc ctg tgg gac gtc tgt tat gac ctg agc ccg agg ctc tgt gag cat 1059 Gly Leu Trp Asp Val Cys Tyr Asp Leu Ser Pro Arg Leu Cys Glu His
335 340 345 ggt act cag gaa gcc act gag gct gga ctg ggg ctg aac tgg ggc tgt 1107 Gly Thr Gln Glu Ala Thr Glu Ala Gly Leu Gly Leu Asn Trp Gly Cys
350 355 360 act ggg gct gga ctg ggg ctg ttt acc aca gaa ctg tgt gtg tgg ggt 1155 Thr Gly Ala Gly Leu Gly Leu Phe Thr Thr Glu Leu Cys Val Trp Gly
365 370 375 gta cac atg tgt gtg tgt gtg tgt gtg tgt gtg tgt gtg cgt gtg tgc 1203 Val His Met Cys Val Cys Val Cys Val Cys Val Cys Val Arg Val Cys
380 385 390 ctg tgc ctg tgt gtg cgt gtg cgt ggc atg cac gtg tgc gca ctc gtg 1251
Leu Cys Leu Cys Val Arg Val Arg Gly Met His Val Cys Ala Leu Val
395 400 405 410 agt aca cet gga gtc tcc acc ccg ctg ctg gtg agg tgg tgg ccc ttc 1299
Ser Thr Pro Gly Val Ser Thr Pro Leu Leu Val Arg Trp Trp Pro Phe
415 420 425 cag agc ttt aag gga gat gga gcc agg agg gta ggg cat gta cet gcg 1347
Gln Ser Phe Lys Gly Asp Gly Ala Arg Arg Val Gly His Val Pro Ala
430 435 440
<Desc/Clms Page number 50>
tcc cet agt cta ctg tgg gat gta tcc ctg tgt ggc tta gga gcc tgc 1395
Ser Pro Ser Leu Leu Trp Asp Val Ser Leu Cys Gly Leu Gly Ala Cys
445 450 455 tgt ctc aga cca ctc cat att cac cat gac ctt gaa cet gcc tgg age 1443
Cys Leu Arg Pro Leu His Ile His His Asp Leu Glu Pro Ala Trp Ser
460 465 470 tca cet tgg cet cag tgt cac agc ctc gaa atg ggt cca aga atc ctc 1491
Ser Pro Trp Pro Gln Cys His Ser Leu Glu Met Gly Pro Arg Ile Leu
475 480 485 490 tet gtc tet ctc tet cgc ttg cet ctc agg acc cac aca tgg cag gat 1539
Ser Val Ser Leu Ser Arg Leu Pro Leu Arg Thr His Thr Trp Gln Asp
495 500 505 ggc tac gag cga ctc aat taaccctttg 1567
Gly Tyr Glu Arg Leu Asn
510

Claims (47)

  1. REVENDICATIONS 1. Polypeptide purifié, isolé ou recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'au moins 5, de préférence d'au moins 10 à 15, acides aminés consécutifs de la séquence choisie parmi le groupe comprenant la séquence SEQ ID No.1 ou un de ses fragments, et les séquences de polypeptides homologues ou variants du polypeptide de séquence SEQ ID No. 1.
  2. 2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un site de fixation du gamma-hydroxybutyrate (GHB).
  3. 3. Polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend une région constituant un domaine transmembranaire du polypeptide de séquence
    SEQ ID No. 1.
  4. 4. Acide nucléique purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3.
  5. 5. Acide nucléique purifié, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 12, de préférence au moins 15 ou 20, nucléotides consécutifs de la séquence choisie parmi le groupe comprenant la séquence SEQ ID No.2 ou un de ses fragments, les séquences nucléiques homologues ou variantes de l'acide nucléique de séquence SEQ ID No. 2, leur séquence complémentaire et la séquence de leur ARN correspondant.
  6. 6. Acide nucléique purifié comprenant au moins 12 nucléotides, caractérisé en ce qu'il peut s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 4 ou 5, dans des conditions d'hybridation telles qu'elles assurent au moins 80 % d'homologie, de préférence 90 ou 95 %.
  7. 7. Méthode pour le criblage de banques d'ADNc ou d'ADN génomique, pour le clonage d'ADNc ou génomique isolé codant pour le récepteur GHB, ou codant pour son promoteur et/ou régulateur d'expression, caractérisée en ce qu'elle met en #uvre une séquence nucléique selon l'une des revendications 4 à 6.
  8. 8. Méthode selon la revendication 7, pour l'identification des séquences d'acide nucléique promotrices et/ou régulatrices de l'expression du récepteur GHB.
  9. 9. Méthode selon la revendication 7, pour l'identification de la séquence d'acide nucléique de l'ADNc du récepteur GHB.
  10. 10. Acide nucléique identifié par une méthode selon l'une des revendications 7 à 9.
  11. 11. Polypeptide codé par un acide nucléique selon la revendication 10.
  12. 12. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6 et 10.
    <Desc/Clms Page number 52>
  13. 13. Cellule hôte transformée par un vecteur selon la revendication 12.
  14. 14. Mammifère, excepté l'Homme, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule selon la revendication 13.
  15. 15. Mammifère, excepté l'Homme, caractérisé en ce que le gène codant pour un récepteur GHB comprenant un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, et 11 n'est pas fonctionnel ou est invalidé,
  16. 16. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6, et
    10 comme sonde ou amorce, pour la détection et/ou l'amplification de séquences d'acide nucléique.
  17. 17. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6,et
    10, pour le criblage de banque génomique.
  18. 18. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6, et
    10, pour la production d'un polypeptide recombinant ou synthétique.
  19. 19. Méthode de production d'un polypeptide recombinant, caractérisée en ce que l'on cultive une cellule transformée selon la revendication 13 dans des conditions permettant l'expression dudit polypeptide recombinant et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
  20. 20. Polypeptide, caractérisé en ce qu'il est obtenu par une méthode selon la revendication
    19.
  21. 21. Anticorps mono ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, 11et 20.
  22. 22. Méthode pour la détection et/ou la purification d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3,11 et 20, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un anticorps selon la revendication 21.
  23. 23. Polypeptide purifié, caractérisé en ce qu'il est obtenu par une méthode selon la revendication 22.
  24. 24. Méthode de détermination d'une variabilité allélique, d'une mutation, d'une délétion, d'une perte d'hétérozygotie ou d'une anomalie génétique d'un gène codant pour le récepteur GHB, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6, et 10 ou un anticorps selon la revendication 21.
  25. 25. Méthode de diagnostic de pathologies ou de prédisposition à des pathologies associées à une expression anormale d'un polypeptide selon l'une des revendications
    1 à 3, et 11, caractérisée en ce que l'on détermine à partir d'un prélèvement
    <Desc/Clms Page number 53>
    biologique du patient la présence de mutations dans une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6, et 10.
  26. 26. Méthode de diagnostic de pathologies associées à une expression anormale d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, et 11, caractérisée en ce que l'on met en contact un ou des anticorps selon la revendication 21 avec le matériel biologique à tester, dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre ledit polypeptide et le ou lesdits anticorps, et en ce que l'on détecte les complexes immunologiques éventuellement formés.
  27. 27. Méthode de sélection de composés chimiques ou biochimiques capables d'interagir avec récepteur GHB, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, 11,20 et 23, d'une cellule selon la revendication 13, ou d'un mammifère selon la revendication 14, avec un composé candidat et, la détection d'une modification de l'activité dudit récepteur GHB.
  28. 28. Méthode de sélection de composés chimiques ou biochimiques capables d'interagir avec récepteur GHB, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, 11, 20 et 23, d'une cellule selon la revendication 13, ou d'un mammifère selon la revendication 14, avec un composé candidat et, la détection de la formation d'un complexe entre le composé candidat et ledit polypeptide.
  29. 29. Méthode de sélection de composés chimiques ou biochimiques capables d'interagir avec récepteur GHB, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3,11, 20 et 23, d'une cellule selon la revendication 13, ou d'un mammifère selon la revendication 14, avec un composé candidat en présence d'un ligand connu du récepteur GHB, et la détermination de la capacité dudit candidat d'entrer en compétition avec la capacité dudit ligand à se lier audit récepteur GHB.
  30. 30. Méthode selon la revendication 28 ou 29, caractérisée en ce que ledit polypeptide ou ladite cellule est fixé sur un support solide.
  31. 31. Méthode selon la revendication 29 ou 30, caractérisée en ce que ledit ligand connu du récepteur GHB est le GHB, le trans-4-hydroxycrotonate ou le p-chloro-phényl- transhydroxycrotonate.
  32. 32. Méthode de sélection de composés chimiques ou biochimiques capables d'interagir avec une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6, et 10, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'une cellule hôte selon la
    <Desc/Clms Page number 54>
    revendication 13 avec un composé candidat susceptible de modifier l'expression ou la régulation de l'expression de ladite séquence nucléique, et, la détection directe ou -indirecte d'une modification de l'expression ou de l'activité du récepteur GHB.
  33. 33. Utilisation de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, 11, 20 et 23, d'une cellule selon la revendication 13, ou d'un mammifère selon la revendication 14 ou 15, pour l'étude de l'expression ou de l'activité du récepteur GHB, et/ou des interactions, directes ou indirectes, entre ledit récepteur GHB et des composés chimiques ou biochimiques pouvant être impliqués dans l'activité dudit récepteur.
  34. 34. Composé capable d'interagir directement ou indirectement avec le récepteur GHB, caractérisé en ce qu'il est sélectionné par une méthode selon l'une des revendications
    24 à 32.
  35. 35. Composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est capable d'interagir, directement ou indirectement, avec un récepteur GHB ou avec une ou plusieurs séquences nucléiques selon l'une des revendications 4 à 6, et 10.
  36. 36. Composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il permet de moduler l'expression ou l'activité d'un récepteur GHB.
  37. 37. Composé selon l'une des revendications 34 à 36, caractérisé en ce qu'il est un agoniste, un agoniste inverse ou un antagoniste de l'activité du récepteur GHB.
  38. 38. Composé selon l'une des revendications 34 à 37, caractérisé en ce qu'il est capable de se fixer sur un récepteur GHB.
  39. 39. Composé selon l'une des revendications 34 à 38, caractérisé en ce qu'il est capable de modifier la circulation des ions à travers la membrane d'une cellule, notamment neuronale.
  40. 40. Composé selon l'une des revendications 34 à 39, caractérisé en ce qu'il est capable de moduler la régulation présynaptique des activités GABAergiques et/ou dopaminergiques cérébrales.
  41. 41. Composé selon l'une des revendications 34 à 40, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : - un anticorps selon la revendication 21, - un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, 11, 20 et 23, - un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, 11, 20 et 23, caractérisé en ce qu'il correspond à la fraction soluble du récepteur GHB, - un vecteur selon la revendication 12, - un acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6, et 10, sens ou antisens.
  42. 42. Composé selon l'une des revendication 34 à 41, à titre de médicament.
    <Desc/Clms Page number 55>
  43. 43. Composé selon la revendication 42, pour la prévention et/ou le traitement de pathologies liées à une anomalie de l'expression et/ou de l'activité du récepteur GHB.
  44. 44. Composé selon la revendication 42 ou 43, pour la prévention et/ou le traitement de pathologies liées à une anomalie de l'activité cérébrale GABAergique.
  45. 45. Composé selon l'une des revendications 42 à 44, pour la prévention et/ou le traitement de l'épilepsie, de l'anxiété, pour la régulation du sommeil ou de l'humeur, pour le sevrage de drogues telles que la cocaïne, l'héroïne ou l'alcool.
  46. 46. Composé selon la revendication 42, pour la prévention et/ou le traitement de pathologies liées à une anomalie de l'activité cérébrale dopaminergique.
  47. 47. Composé selon la revendication 46, pour la prévention et/ou le traitement de maladies neurodégénératives où la dopamine est spécifiquement impliquée telles que la maladie de Parkinson, de psychoses où la dopamine est impliquée telles que la schizophrénie, pour le sevrage de drogues telles que la cocaïne, l'héroïne ou l'alcool, pour la régulation de l'humeur ou pour la régulation de la sécrétion d'hormones qui sont sous contrôle dopaminergique telles que l'hormone de croissance, ou la prolactine.
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