JP3977427B2 - ニューロペプチドy−y5受容体 - Google Patents
ニューロペプチドy−y5受容体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3977427B2 JP3977427B2 JP51768597A JP51768597A JP3977427B2 JP 3977427 B2 JP3977427 B2 JP 3977427B2 JP 51768597 A JP51768597 A JP 51768597A JP 51768597 A JP51768597 A JP 51768597A JP 3977427 B2 JP3977427 B2 JP 3977427B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- npy
- receptor
- dna molecule
- cell
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Neurology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
発展した豊かな国においては、肥満の蔓延は驚くほどである。肥満は社会的に不利であるばかりでなく、いまや罹病率および死亡率に大きく寄与している。腹部における脂肪沈積は、11型糖尿病および心臓血管性疾患の危険と関連して特に問題である。しかし最近まで、食欲、エネルギー消費および肥満をコントロールする分子的作用機序は驚くほど誤って理解されてきた。
肥満は、インスリン非依存性糖尿病(NIDDM)、高血圧症、脂血症、および冠状動脈性心臓疾患と関連していることは周知であり、またそれほど明白でないが変形性関節症等の疾患および種々の悪性疾患と関連を有する。肥満はまた、運動性の低下および生活の質の低下を通じて重要な問題を引き起こす。単一遺伝子の突然変異によって決定される齧歯動物の肥満の7つの形が同定されている。すなわち、マウスにおけるイエロー[Ay]、脂肪の多い(adipose)[Ad]、糖尿病[db]、太った[fat]、丸々と太った(tubby)[tub]および肥満[ob]、ならびにラットにおける脂肪質[fa]である。これらの突然変異によって引き起こされる肥満表現型は、発症年齢、重篤度およびインスリン依存性の程度において異なる。肥満したヒトにおいても類似の表現型が見られる。最近、これらの突然変異のいくつかについて分子的基礎が解明された。これらのうち、[ob]遺伝子産物である「レプチン(leptin)」は、最大の関心を呼び起こした。しかし、エネルギーバランスおよび身体の脂肪分布の調節には他の多くの因子もまた関与している。4つの因子が重要な役割を有している可能性が高いと思われる。その因子とは、ニューロペプチドY(NPY)、副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRF)/ACTH/グルココルチコイド、インスリンおよびガラニン(galanin)である。特にNYPおよびその受容体は食欲の調節、およびそれに関連して肥満に重要な役割を果たす。
ニューロペプチドY(NPY)は、膵臓ポリペプチド(PP)およびペプチドYY(PYY)と共に1つのファミリー(膵臓ポリペプチドファミリーと呼ばれる)を形成する。これらのポリペプチドは全て36個のアミノ酸から成り、そして共通の三次構造を有する。ニューロペプチドY(NPY)受容体は、Gタンパク質共役受容体スーパーファミリーのメンバーであり、哺乳動物の神経系に最も豊富に存在するペプチドの1つによって活性化され、そして精神運動活性、中枢内分泌物分泌、不安、生殖への作用、心臓血管系への血管作用性作用、および最も重要なものとして食欲への強力な作用を含めて、多様な範囲の重要な生理学的パラメーターに影響を及ぼす。多数のニューロペプチドおよび古典的神経伝達物質(ノルアドレナリンおよびセロトニンを含む)は、食物摂取挙動を変調する。しかし、NPYは肥満を引き起こすことができるという点で食物摂取に対する実験的効果において多くの神経伝達物質からきわ立っている。室傍核(paraventricular nucleus)(PVN)にNPYを注射すると、用量依存的にラットの食物および飲物摂取挙動を増大させることが示された。NPYの1回の注射が数時間にわたって食物摂取を数倍増大させることが可能であり、そしてラットが通常は殆ど食物をとらない明期においても、またすでに飽食するまで食べたラットにおいても、効果的である。したがって、NPYペプチドは食物を剥奪された動物においても飽食した動物においても公知の最も強力な食欲促進物質の1つである。PVNに繰り返しNPYを注射すると、大量でかつ持続的な食物摂取応答をもたらし、最終的にラットは体脂肪含有量の真の増加を伴う肥満となる。食欲/肥満調節の媒介物としてのNPYの重要性は、obese遺伝子産物であるレプチンがNPYの合成および放出を阻害するというごく最近の報告によってさらに強められる。
室傍核へのNPYの注射は、血漿ACTHレベルの迅速でかつ強い上昇を引き起こす。そして、NPYに誘導されるACTH分泌は副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRF)によって媒介されるという明白な証拠が存在する。しかし、脳内におけるNPYの作用機構およびCRFとの相互作用は、他のホルモン(例えばインスリン)との相互関係と同様、殆ど分かっていない。しかし、食欲を増進させ、グルココルチコイドレベルを上昇させる作用物質は、主要な肥満を発生させる上で重要であろう。
したがって、NPYの特異的アゴニストおよびアンタゴニストは、広範な臨床障害の療法にとって実質的に有益であると思われる。NPYはコンパクトな三次構造を有し、また異なるサブタイプの受容体との相互作用には分子の異なる部分が必要とされるので、アゴニストおよびアンタゴニスト両者の理論的開発は特異的な受容体構造の利用可能性および知識に決定的に依存する。
NPYは少なくとも5つの受容体、すなわちY1、Y2、Y3、Y4およびY1様(または「非定型Y1」)受容体と特異的に結合することが現在知られている。NPY受容体はアデニル酸シクラーゼ二次メッセンジャー系とカップリングすることが示されているが、ホスファチジルイノシトール代謝回転、カチオンおよびアラキドン酸もまたNPYの二次メッセンジャーとして機能しうるという証拠があるので、さらなるNPY受容体サブタイプが存在する可能性が残っている。
NPYアゴニストおよびアンタゴニストは、例えば可能性のある抗高血圧剤、心臓血管薬、神経成長因子、抗精神病薬、抗肥満剤および抗糖尿病剤として商業的価値を有し得るので、組換えDNA技術によってNPY受容体を生産できることは好都合であろう。この目的のため、Y1、Y2、Y3およびY4をコードするDNA分子が以前に単離された。
本発明者らはこの度、ヒト、マウスおよびラットY1様(以後NPY−Y5と称する)受容体をコードする新規なDNA分子を単離した。ヒトおよびラットNPY−Y5をコードする類似のDNA分子が国際(PCT)特許明細書WO 96/16542に記載されているが、これらはヒトNPY−Y5の場合であればN末端に付加的な10アミノ酸を、ラットNPY−Y5の場合であればN末端に付加的な11アミノ酸を有する受容体をコードしている。数個のcDNAクローンの分析ならびにイントロンおよびエキソン配列に特異的なプライマーを用いたRT−PCRを行なった結果、本発明者らはヒト、マウスおよびラットのNPY−Y5受容体はこれらの付加的10/11アミノ酸を含まないことを確認した。したがって、WO 96/16542に記載のDNA分子は、本発明DNA分子よりも低い発現率を示すであろう。さらに、WO 96/16542に記載のDNA分子によってコードされる受容体は、より低い、そして恐らく変更された活性を示すであろう。
したがって、本発明はその第1の局面において、約445アミノ酸を有するNPY−Y5受容体または機能的に等価なその断片をコードする単離されたDNA分子を提供する。
好ましくは、この単離されたDNA分子はヒト、マウスまたはラットのNPY−Y5受容体をコードする。
最も好ましくは、この単離されたDNA分子は下記に示すヌクレオチド配列と実質的に一致した、または少なくとも>80%(より好ましくは>95%)相同のヌクレオチド配列を有する:
(i)図1のヌクレオチド6291から7625、
(ii)図2のヌクレオチド63から1397、
(iii)図3のヌクレオチド115から1449、または
(iv)図4のヌクレオチド73から1470。
この単離されたDNA分子をプラスミドまたは発現ベクターに組み込み、次にこれを適切な細菌、酵母および哺乳動物宿主細胞に導入することができる。このような宿主細胞を用いて、その単離されたDNA分子によってコードされるNPY−Y5受容体を発現させることができる。
したがって、第2の局面において、本発明は第1の局面のDNA分子によって形質転換された哺乳動物、酵母または細菌宿主細胞を提供する。
第3の局面において、本発明はそのDNA分子の発現を可能とする条件下で第2の局面の宿主細胞を培養する工程、及び必要に応じてNPY−Y5受容体を回収する工程を包含する、NPY−Y5受容体の生産方法を提供する。
好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞または細菌細胞である。細胞が哺乳動物細胞である場合は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児腎臓293細胞または昆虫Sf9細胞であることが好ましい。
好ましい実施態様においては、NPY−Y5受容体は宿主細胞の表面に発現される。
本発明のDNA分子はNPY受容体を表す。この受容体は身体の多数の領域において発現され、そしてNPYは多くの系に影響を及ぼすので、その受容体は臨床的にも商業的にも興味がもたれ得る。
本発明の核酸分子を用いることにより、ニューロペプチドY−Y5受容体タンパク質を実質的に純粋な形で得ることが可能である。
したがって第4の局面として、本発明はNPY−Y5受容体を実質的に純粋な形で提供する。
好ましくは、精製されたNPY−Y5は図5に示すアミノ酸配列のいずれか1つに実質的に一致するアミノ酸配列を有する。
第5の局面において、本発明はNPY−Y5受容体に特異的に結合することができる抗体を提供する。
第6の局面において、本発明は本発明の第1の局面のDNA分子によって形質転換された非ヒト動物を提供する。
第7の局面において本発明は、NPY−Y5受容体の活性化を可能とする条件下でNPY−Y5受容体、または第1の局面のDNA分子によって形質転換されこれを発現する細胞を試験作用物質と接触させる工程、及びNPY−Y5受容体活性の増大または減少を検出する工程を包含する、NPY−Y5受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト作用物質を検出する方法を提供する。
さらなる局面において本発明は、第1の局面のDNA分子内の独特な配列に特異的にハイブリダイズすることができる、10個以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む核酸プローブを提供する。
さらなる局面において本発明は、NPY−Y5受容体をコードするmRNA分子に特異的にハイブリダイズして該mRNA分子の翻訳を阻止することができるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸分子を提供する。このようなアンチセンス核酸分子は、自らがそこにハイブリダイズするmRNAを触媒的に不活性化するリボザイム領域を含むことができる。
図1および2に示すヌクレオチド配列に関連して本明細書に使用する「実質的に一致する」という表現は、遺伝暗号の縮重によってコードされるタンパク質には変化をもたらさない、ヌクレオチド配列における重要でない変異を包含することを意図している。さらに、この表現は特定の系において発現を促進させるために必要とされうるが、コードされるタンパク質の生物活性の低下をもたらさない、その配列における他の重要でない変異を包含することを意図している。
アミノ酸配列との関連において本明細書に使用する「実質的に一致する」という表現は、NPY−Y5受容体の生物活性の低下をもたらさない、アミノ酸配列における重要でない変異を包含することを意図している。これらの変異はアミノ酸の保存的置換を含みうる。想定される置換は:
G、A、V、I、L、M;D、E;N、Q;S、T;K、R、H;
F、Y、W、H;およびP、Nα-アルカルアミノ酸(alkalamino acid)
である。
下記の非限定的実施例およびさらに添付の図に言及しながら本発明を以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
図1は、ヒトNPY−Y5受容体をコードするゲノムDNA分子のヌクレオチド配列を示し、予測されるアミノ酸配列をも含む。
図2は、ヒトNPY−Y5受容体をコードするcDNAのヌクレオチド配列を示し、予測されるアミノ酸配列をも含む。
図3は、ラットNPY−Y5受容体をコードするcDNAのヌクレオチド配列を示し、予測されるアミノ酸配列をも含む。
図4は、マウスNPY−Y5受容体をコードするゲノムDNA分子のヌクレオチド配列を示し、予測されるアミノ酸配列をも含む。
図5は、ヒト、マウスおよびラットNPY−Y5受容体タンパク質の予測されるアミノ酸配列間の同一性の程度を示す。
図6a〜fは、NPY−Y5を発現するCHO細胞を用いて実施した結合アッセイの結果を示すグラフである。アッセイしたY5リガンドは、NPY、Leu 31 Pro 34 NPY、PP、PYY、NPY 2-36およびPYY 13-36であった。
図7は、NPY−Y5を発現するCHO細胞において、リガンドNPY、Leu 31 Pro 34 NPY、PP、PYYおよびNPY 2-36を用いて実施したcAMPアッセイの結果を示すグラフである。
実施例
実験手順
cDNAおよびゲノムライブラリーのスクリーニング
ヒトNPY−Y1遺伝子のエキソン1Cに隣接する632 bpの32P標識化EcoRI/Pst1断片を用いて、ヒトゲノムP1 DNAライブラリー(Genome-Systems)、ヒト胎児脳cDNAライブラリー(P. Seeburg, University of Heidelberg)およびラット視床下部cDNAライブラリー(Stratagene)をスクリーニングした。6xSSC、5xデンハート溶液、0.1% SDSおよび100mg/mlの変性し、剪断したサケ精子DNAを含有する溶液中で、上記プローブとのハイブリダイゼーションを60℃で16時間実施した。2xSSC/0.1% SDSを用いて60℃でフィルターを15分間2回洗浄し、次に0.1xSSC/0.1% SDSを用いて60℃でフィルターを15分間洗浄し、増感板を用いて70℃で16時間X線フィルム(Kodak,X-Omat)に暴露した。陽性クローン由来のP1 DNAを製造者のプロトコールにしたがって単離した。次いで、このDNAをEcoRI、HindIII、BamHIおよびPstIで消化し、ヒトY1およびY5遺伝子のすべてをカバーするクローンを生じるように、Bluescript SKベクター(Stratagene)にサブクローン化した。
ヌクレオチド配列の決定
スーパーコイルプラスミドDNAをアルカリ変性し、T7ポリメラーゼ(Promega)を用いてジデオキシチェーンターミネーション法(Sambrookら,1992)により配列決定した。オリゴヌクレオチドプライマーは、最初はベクターの両側の領域に相補的なものを用い、次いで配列分析を完成させるために得られた配列に基づいたものを用いた。
制限酵素地図の決定
制限酵素EcoRI、BamHI、HindIIIを単独および可能なあらゆる組合せで用いてP1 DNAを消化し、0.8%アガロースゲルを用いて電気泳動にかけ、アルカリ変性し(0.4M NaOH)、0.4M NaOHを用いてHybond N+メンブレーンに毛管転写し、数個の特定のオリゴヌクレオチド、cDNAおよび上記のサブクローン化によって得たゲノムDNA断片とハイブリダイズさせた。
In situハイブリダイゼーション分析
DIG RNAラベリングキット(SP6/T7)(Boehringer Mannheim)を用いてヒトNPY−Y5受容体に対するセンスおよびアンチセンスリボプローブを合成した。ヒトNPY−Y5受容体のコード領域に対応するcDNAを線状化し、T7(アンチセンスリボプローブ用)またはSP6(センスリボプローブ用)RNAポリメラーゼのいずれかを製造者の指示にしたがって用いて、ジゴキシゲニン標識化dUTPを用いて転写した。
神経性疾患をもたない若い成人男性から死後脳組織を得た。特定の脳領域を解剖し、ホルマリンに36時間浸漬することにより固定し、パラフィンに包埋した。6mmの連続した切片をスライド上に集め、クロムミョウバンを塗り、使用時まで4℃で保存した。Histoclear(National Diagnostics)中で切片を5分間脱ワックスし、100%、70%および50%アルコール中で各2分間再水和化し、次にリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を用いて5分間洗浄した。
5mg/mlプロテイナーゼK(Boehringer Mannheim)を用いて、50mM Tris,pH7.5,5mM EDTA中で切片を室温で10分間前処理した。次に、切片を0.1Mグリシン(PBSに溶解)を用いて2分間2回洗浄し、PBSで1回洗浄し、次にハイブリダイゼーション緩衝液[2xSSPE、50%ホルムアミド、5%デキストラン硫酸、1xデンハート試薬、100mg/ml tRNA型X-SA(Sigma)]中で室温で1時間インキュベートした。75μlのハイブリダイゼーション緩衝液に溶解したセンスおよびアンチセンスDNAに対するジゴキシゲニン標識化リボプローブ(500ng)を上記切片に加え、42℃で18時間、湿環境下で、Hybaid Omnislide PCR Thermal Cycler(Integrated Sciences)を用いてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、切片を室温で洗浄し、2xクエン酸ナトリウム生理食塩水(SSC)緩衝液(0.15M NaCl/0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)を用いて10分間室温で洗浄し、次に0.2xSSCを用いて30分間洗浄した。その後、10mM Tris,pH7.5,15mM NaClに溶解した20mg/ml RNase(Sigma)を用いて切片を室温で15分間処理した。RNase処理後、2xSSCを用いて室温で5分間スライドを洗浄し、次に0.2xSSCを用いて37℃で30分間洗浄した。
組織を緩衝液A(100mM Tris-HCl,pH7.5,150mM NaCl)で10分間洗浄し、2%ブロッキング溶液(Boehringer Mannheim)、0.3% Triton X-100と共に緩衝液A中で30分間インキュベートすることにより、免疫学的検出のために処理した。次に、アルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗血清(Boehringer Mannheim、緩衝液Aおよび0.5%ブロッキング試薬を用いて1/500に希釈)と共に切片を2時間インキュベートし、緩衝液Aを用いて各5分間2回洗浄し、その後100mM Tris-HCl,pH9.5,100mM NaCl,50mM MgCl2で2分間洗浄した。基質としてニトロブルーテトラゾリウムおよびブロモクロロインドイルホスフェートを用いて、標識化プローブを18時間暗中で可視化した。10mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTAを用いて切片を10分間洗浄し、次に蒸留水を用いて3回素早く洗浄し、Aquamount[Gurr]を用いてマウントし、Nomarsky光学素子を備えたZeiss Axiophot顕微鏡でブルーのフィルターを用いて検査した。
NPY Y5の発現
ラットY5受容体タンパク質を以下のように発現させた。すなわち、ラットNPY Y5 cDNAの全コード領域および全3’非翻訳領域の殆どを含む1.9kb断片をpPRC/CMVベクター(Invitrogen)にサブクローン化することにより、哺乳動物用発現構築物rpHz17を作製した。この構築物は、CMVプロモーターの制御下にあり、そして選択のためネオマイシン遺伝子を含む。改変したリン酸カルシウムトランスフェクション法を用いて、この発現構築物rpHz17を哺乳動物細胞系CHO-K1およびHEKにトランスフェクトした。
NPY−Y5結合アッセイ
NPY−Y5受容体のコード領域をpRC/CMV発現ベクター中にサブクローン化し、改変したリン酸カルシウムトランスフェクション法を用いてチャイニーズハムスター卵巣(CHO)K1細胞系にトランスフェクトした。CHO細胞を5%CO2のもとで、2mMグルタミンおよび10%ウシ胎児血清を含む、ダルベッコ改変イーグル培地(EMEM)/ハム(Ham)F-12培地(1:1)中で維持した。ネオマイシンを用いて安定にトランスフェクトされた細胞を選択し、NPY/PYYアナログに結合する能力を試験した。トランスフェクトされた細胞(1x106個)を0.5mlのアッセイ緩衝液[50mM Tris-HCl,pH7.4,2mM CaCl2,5mM KCl,120mM NaCl,1mM MgCl2,0.1%ウシ血清アルブミン]中で、0.05nM125I標識化NPYおよび徐々に濃度を上げたヒトNPYおよび関連ペプチドの存在下で、インキュベートした。細胞は15℃で3時間インキュベートし、次に0.5mlのウマ血清上に重層してから4分間微小遠心機にかけペレット化した。γカウンターを用いて1分間放射能を測定した。NPY−Y5受容体を発現するCHO細胞を用いた結合アッセイの結果を、特異的に結合した放射標識NPYの最大値に対する百分率として表1に示す。これらの結果は、3組の点をもつ3つの独立した結合曲線に由来するプールされたデータである。
cAMPアッセイ
NPY−Y5受容体を発現するCHO細胞を増殖させ、150cm3のフラスコ中で、2mM L−グルタミンおよび10%(v/v)ウシ胎児血清を含む、ダルベッコ改変イーグル培地:ハムF-12培地(1:1 v/v)で、37℃で10%CO2雰囲気下で、湿潤空気中で維持した。細胞がコンフルエンスに達したならば、24ウエルクラスターディッシュを用いて実験をおこなった。
フォルスコリン(forskolin)刺激[ 3 H]-cAMP蓄積の阻害
ウエルあたり1mlの、[3H]-アデニン(74kBq/ウエル)を含有するHEPES緩衝化ハンク溶液(HBH;20mM,pH7.4)中で細胞単一層を37℃で2時間インキュベートした。アゴニストの添加に先立って、ウエルあたり1mlの、ホスホジエステラーゼ阻害剤Ro 20-1724を含有するHBH中で細胞を30分間インキュベートした。フォルスコリン(10μM)の添加後、アゴニスト(10μlのHBHに溶解)をアッセイ系に添加し、インキュベーションを10分間継続した。これらの操作の間、インキュベーション培地の温度は37℃に維持した。各ウエルに50μlの濃塩酸を加えてインキュベーションを終止させ、細胞を溶解させた。各ウエル由来の上清緩衝液中の[3H]-cAMPを連続イオン排除Dowex-アルミナクロマトグラフィーによって単離した。乳化剤シンチレーター(15ml)の添加後、液体シンチレーション計測によって放射能を測定した。結果を表2に示す。
結果
NPY−Y5受容体遺伝子の同定
ヒトNPY−Y1受容体遺伝子の5’上流領域のクローン化および特徴付けは、Y1遺伝子の数個の別個な5’エキソンの存在を確認(Ballら、1995)すると共に、エキソン1Cにおいて方向が逆向きの部分的オープンリーディングフレームを含む、Gタンパク質共役受容体と広範な相同性を有する領域を明らかにした。第3細胞内ループおよび膜貫通ドメインVIおよびVIIの部分を含むこの200アミノ酸配列をGenbankデータベースと比較した結果、37%同一性を有する最も密接に関連する受容体としてヒトNPY−Y1受容体が同定された。Y1遺伝子のエキソン1Cおよびエキソン1Bの間の全7kbの領域をサブクローン化し、配列決定することにより、Y5と称する新規なNPY受容体サブタイプをコードする遺伝子の存在が確認された(図1)。632bpヒトゲノムY5断片を用いて高ストリンジェンシー条件下でヒト胎児脳およびラット視床下部cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、両方の種について全長cDNAクローンが同定した。これらの配列は、長さが445アミノ酸のY5受容体をコードしていた(図2および3)。ヒトゲノム配列(図1)は2個のイニシエーターATGコドン候補を示しているが、数個のcDNAクローンの解析ならびにイントロンおよびエキソン配列に特異的なプライマーを用いたRT−PCRにより、これらATGコドンの一方(他のATGの30ヌクレオチド上流に位置する)がイントロン内に位置することが立証された。この訂正を行なった後のヒトおよびラットNPY−Y5受容体間の全般的同一性は89%である。図5はヒトおよびラットNPY−Y5受容体の予想されるアミノ酸配列の間の同一性の程度を示す。
ヒトY5遺伝子の5’非翻訳領域をコードするエキソンは、2.7kbのイントロンによってエキソン2から隔てられ、NPY−Y1遺伝子のエキソン1Bの約2.8kb上流に位置している。反対方向を向いた、これら2つの5’エキソンの顕著な近接性は、共通のプロモーター領域を介する両遺伝子の転写の同時調節の可能性を示唆している。
しかし、ヒトY5遺伝子の興味深い特徴は、NPY−Y5遺伝子のコード領域内にNPY−Y1遺伝子のエキソン1Cを担持していることである。長さ100bpのエキソン1Cは、その反対側の鎖において、受容体タンパク質の3番目の細胞内ループの殆どを含むY5配列の一部をコードする。この細胞質ループはGタンパク質共役受容体の間で大きさが非常に異なり、異なるGタンパク質複合体への結合の特異性の決定に関与していると考えられる。他の公知のNPY受容体サブタイプの全てと対照的に、Y5受容体におけるこの領域は通常大きく、約150アミノ酸からなる。NPY−Y1遺伝子の対応する領域においては、5番目の膜貫通ドメインのすぐ後で、フレーム内停止コドンを含む小さい97bpのイントロンがコード領域を中断しており(図1)、この非コード領域が複製後2つの付加的機能を獲得したことを示唆している。1つは、Y5タンパク質配列の一部をコードすることであり、もう1つはY1遺伝子の選択的にスプライシングされた5’エキソンとして組織特異的転写において調節機能を果たすことである。エキソン1Cの転写活性化はY5発現に確実に影響を及ぼし、mRNAの産生を阻害する可能性が非常に高い。しかし、このような作用機構は、これら2つの受容体遺伝子間の調節相互作用の1側面しか表していないのかもしれない。Y1遺伝子のエキソン1BおよびY5遺伝子のエキソン1の顕著な近接性は、一方または他方の遺伝子の特異的転写活性化のためのさらに別な制御機構を示唆している。
Y5受容体の薬理学的特徴付け
ラットY5受容体サブタイプを安定に発現するCHO細胞系のNPY結合分析は、Y1様の薬理学を有し、かつフィーディング(feeding)特異的リガンドNPY[2-36]に強く応答するNPY受容体を表す、リガンド特異性および効力の順位(NPY=NPY>PYY[Leu31,Pro34]=NPY[2-36]=PP>>PYY[13-36])を示す(図6a〜f)。これらの異なるNPYアナログに対する選択性と同一のプロフィールを、アデニル酸シクラーゼの活性阻害を測定する実験から得られた結果に見ることができる。
In situハイブリダイゼーション分析
ヒト視床下部の視床下部領域におけるY5受容体mRNAの分布を総合的に試験した。Y5に対するセンスプローブを用いたハイブリダイゼーションは特異的標識化を全く示さなかったが、アンチセンスプローブは室傍核の大きいニューロンに見いだされるY5受容体mRNAの極めて高い発現を示した。背内側核、視索上核および乳頭体、ならびに正中線視床核においても高レベルが見いだされる。核内では、分布は必ずしも均一ではなかった。例えば、背内側核では、標識されたニューロンに混ざって明らかに標識されていない大きいピラミッド型ニューロンが見いだされ、機能的特殊化を示唆している。Y1受容体に関する予備試験の結果は、ヒトNPY−Y1受容体がY5受容体と類似の分布を有することを示唆しているが、これら2つの遺伝子の同時調節的(co-regulatory)転写活性化という説を支持する同定可能な幾つかの相違点が存在する。
NPY−Y5の発現
発現されたY5受容体タンパク質は、ユニークな分布および異なるNPY/PYY/PPアナログに対する相対的親和性を有するように思われる。他のNPY受容体に比べてY5受容体は機能的にユニークであること、そして、例えば食欲/肥満障害、高血圧症、運動障害、記憶喪失、睡眠障害、偏頭痛、並びに胃腸(GI)および心臓血管性障害のような多くの障害に対する薬物の開発において非常に重要でありうることもまた予想される。
当業者には、実施例に示す本発明に、広く記述された本発明の精神または範囲から逸脱することなく多数の変更および/または改変が可能であることが理解されるであろう。それゆえ、本発明の実施態様はいずれの側面においても例示的なものであり、限定的なものではない。
参照文献
1.Ball, H.J., Shine, J.およびHerzog, H.(1995)、多重プロモーターはヒトNPY−Y1受容体遺伝子の組織特異的発現を調節する、J. Biol. Chem. 270, 27272-27276。
2.Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T.(1992), Molecule cloning(A Laboratory Manual),第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。
配列表
Claims (14)
- 445アミノ酸からなるNPY−Y5受容体をコードする、単離されたDNA分子であって、前記NPY−Y5受容体は、配列番号4もしくは配列番号6に示すアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を含む前記アミノ酸配列の変異体からなる、前記分子。
- 前記NPY−Y5受容体が、配列番号4または配列番号6に示すアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の単離されたDNA分子。
- 配列番号4に示すアミノ酸配列からなるNPY−Y5受容体をコードする、請求項1に記載の単離されたDNA分子。
- NPY−Y5受容体をコードする単離されたDNA分子であって、配列番号1のヌクレオチド6291から7625に示す配列に一致するヌクレオチド配列からなる、前記DNA分子。
- NPY−Y5受容体をコードする単離されたDNA分子であって、配列番号3のヌクレオチド63から1397に示す配列に一致するヌクレオチド配列からなる、前記DNA分子。
- NPY−Y5受容体をコードする単離されたDNA分子であって、配列番号5のヌクレオチド115から1449に示す配列に一致するヌクレオチド配列からなる、前記DNA分子。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のDNA分子を含むプラスミドまたは発現ベクター。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のDNA分子によって形質転換された宿主細胞。
- 前記細胞が哺乳動物細胞、細菌細胞または昆虫Sf9細胞である、請求項8に記載の宿主細胞。
- 前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児腎臓(HEK)293細胞または昆虫Sf9細胞である、請求項9に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が細胞表面にNPY−Y5受容体を発現する、請求項8から10のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 445アミノ酸から構成され、配列番号4もしくは配列番号6に示すアミノ酸配列または保存的アミノ酸置換を含む前記アミノ酸配列の変異体からなる、純粋な形態のNPY−Y5受容体。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のDNA分子で形質転換された非ヒト動物。
- NPY−Y5受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト作用物質を検出する方法であって、請求項12に記載のNPY−Y5受容体または請求項1から6のいずれか一項に記載のDNA分子によって形質転換され、そして該分子を発現する細胞を、NPY−Y5受容体の活性化を可能とする条件下で被験作用物質に接触させる工程、及びNPY−Y5受容体活性の増大または減少を検出する工程を包含する、前記方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AU6467 | 1995-11-09 | ||
AUPN6467A AUPN646795A0 (en) | 1995-11-09 | 1995-11-09 | Neuropeptide Y-Y5 receptor |
PCT/AU1996/000706 WO1997017440A1 (en) | 1995-11-09 | 1996-11-08 | Neuropeptide y-y5 receptor |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2000500648A JP2000500648A (ja) | 2000-01-25 |
JP3977427B2 true JP3977427B2 (ja) | 2007-09-19 |
Family
ID=3790792
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP51768597A Expired - Fee Related JP3977427B2 (ja) | 1995-11-09 | 1996-11-08 | ニューロペプチドy−y5受容体 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6528303B1 (ja) |
EP (1) | EP0862627B1 (ja) |
JP (1) | JP3977427B2 (ja) |
KR (1) | KR19990064263A (ja) |
AT (1) | ATE273389T1 (ja) |
AU (2) | AUPN646795A0 (ja) |
CA (1) | CA2235631A1 (ja) |
DE (1) | DE69633131T2 (ja) |
DK (1) | DK0862627T3 (ja) |
WO (1) | WO1997017440A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5516653A (en) * | 1993-12-28 | 1996-05-14 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding a human neuropeptide Y/peptide YY/pancreatic polypeptide receptor (Y4) and uses thereof |
US5545549A (en) | 1994-02-03 | 1996-08-13 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding a human neuropeptide Y/peptide YY (Y2) receptor and uses thereof |
US5989920A (en) * | 1994-12-02 | 1999-11-23 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | Methods of modifying feeding behavior compounds useful in such methods and DNA encoding a hypothalmic atypical neuropeptide Y/peptide YY receptor Y5 |
US5602024A (en) | 1994-12-02 | 1997-02-11 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding a hypothalamic atypical neuropeptide Y/peptide YY receptor (Y5) and uses thereof |
US5965392A (en) * | 1996-04-08 | 1999-10-12 | Bayer Corporation | Neuropeptide Y receptor Y5 and nucleic acid sequences |
US5919901A (en) * | 1996-04-08 | 1999-07-06 | Bayer Corporation | Neuropeptide Y receptor Y5 and nucleic acid sequences |
AU3295297A (en) * | 1996-06-04 | 1998-01-05 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | Methods of modifying feeding behavior, compounds useful in such methods, and dna encoding a hypothalamic atypical neuropeptide y/peptide yy receptor (y5) |
AU729590B2 (en) * | 1996-10-23 | 2001-02-08 | Sanofi-Aventis | Cosmetic composition containing a neuropeptide Y receptor antagonist |
US6713265B1 (en) | 1997-06-04 | 2004-03-30 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | Methods of modifying feeding behavior, compounds useful in such methods, and DNA encoding a hypothalamic atypical neuropeptide Y/peptide YY receptor (Y5) |
US5985616A (en) * | 1998-01-07 | 1999-11-16 | Schering Corporation | Chimeric mammalian NPY Y5 receptors |
US20040006004A1 (en) * | 2002-06-27 | 2004-01-08 | Markku Koulu | Method for prevention and treatment of diseases or disorders related to excessive formation of vascular tissue or blood vessels |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ZA896376B (en) | 1988-08-26 | 1990-05-30 | Merrell Dow Pharma | Neuropeptide y agonists |
JP3419454B2 (ja) * | 1991-11-06 | 2003-06-23 | ガーヴァン インスティチュート オブ メディカル リサーチ | ヒト神経ペプチドy−y1レセプター |
US5602024A (en) | 1994-12-02 | 1997-02-11 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding a hypothalamic atypical neuropeptide Y/peptide YY receptor (Y5) and uses thereof |
US5621079A (en) | 1995-02-03 | 1997-04-15 | Merck & Co., Inc. | Neuropeptide Y receptor |
AU7692896A (en) | 1995-12-01 | 1997-06-27 | Novartis Ag | Quinazolin-2,4-diazirines as NPY receptor antagonist |
US5965392A (en) | 1996-04-08 | 1999-10-12 | Bayer Corporation | Neuropeptide Y receptor Y5 and nucleic acid sequences |
AU3295297A (en) | 1996-06-04 | 1998-01-05 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | Methods of modifying feeding behavior, compounds useful in such methods, and dna encoding a hypothalamic atypical neuropeptide y/peptide yy receptor (y5) |
-
1995
- 1995-11-09 AU AUPN6467A patent/AUPN646795A0/en not_active Abandoned
-
1996
- 1996-11-08 DE DE69633131T patent/DE69633131T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-08 EP EP96937126A patent/EP0862627B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-08 DK DK96937126T patent/DK0862627T3/da active
- 1996-11-08 WO PCT/AU1996/000706 patent/WO1997017440A1/en active IP Right Grant
- 1996-11-08 US US09/065,027 patent/US6528303B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-08 KR KR1019980702753A patent/KR19990064263A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-11-08 AU AU74859/96A patent/AU7485996A/en not_active Abandoned
- 1996-11-08 AT AT96937126T patent/ATE273389T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-11-08 CA CA002235631A patent/CA2235631A1/en not_active Abandoned
- 1996-11-08 JP JP51768597A patent/JP3977427B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0862627B1 (en) | 2004-08-11 |
AU7485996A (en) | 1997-05-29 |
JP2000500648A (ja) | 2000-01-25 |
DE69633131T2 (de) | 2005-08-11 |
KR19990064263A (ko) | 1999-07-26 |
DE69633131D1 (de) | 2004-09-16 |
CA2235631A1 (en) | 1997-05-15 |
WO1997017440A1 (en) | 1997-05-15 |
US6528303B1 (en) | 2003-03-04 |
ATE273389T1 (de) | 2004-08-15 |
DK0862627T3 (da) | 2004-11-29 |
AUPN646795A0 (en) | 1995-11-30 |
EP0862627A1 (en) | 1998-09-09 |
EP0862627A4 (en) | 2000-01-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4216326B2 (ja) | ヒト神経ペプチドy/ペプチドyy/膵臓ポリペプチド受容体(y4)をコードしたdna、及び該dnaの使用 | |
JP3977427B2 (ja) | ニューロペプチドy−y5受容体 | |
US20030082672A1 (en) | Dna encoding galanin galr2 receptors and uses thereof | |
AU2223899A (en) | G protein-related kinase mutants in essential hypertension | |
JP2003508026A (ja) | ヒトg−タンパク質共役型受容体 | |
JP2003501029A (ja) | Snorf33受容体をコ−ドするdna | |
JP4476491B2 (ja) | 新規膜貫通蛋白質をコードする遺伝子 | |
US6927041B2 (en) | Human neuropeptide Y-like G protein-coupled receptor | |
JP2002330769A (ja) | ヒトバニロイド受容体様タンパク質 | |
US6586581B1 (en) | Prolactin regulatory element binding protein and uses thereof | |
EP2298803A2 (en) | Human G-protein coupled receptor and ligands thereof | |
WO2000029423A1 (en) | G protein-coupled receptor resembling the leukotriene b4 receptor | |
AU772193B2 (en) | Neuropeptide Y-Y5 receptor | |
JPH11127872A (ja) | 新規核内レセプター蛋白質、遺伝子及びその用途 | |
US6998255B1 (en) | Human G-protein coupled receptor | |
US6797472B1 (en) | Variation in drug response related to polymorphisms in β2-adrenergic receptor | |
AU776319B2 (en) | Variation in drug response related to polymorphisms in beta2- adrenergic receptor | |
JP2004533847A (ja) | Gpr50の対立遺伝子変異体 | |
JP2002501723A (ja) | オーファンレセプター | |
US20030165844A1 (en) | Haplotypes of the TNFRSF1A gene | |
WO1998056908A1 (fr) | Proteines isoformes du recepteur de la vitamine d | |
FR2795075A1 (fr) | CLONAGE, EXPRESSION ET CARACTERISATION D'UN ADNc CODANT POUR UN RECEPTEUR GAMMA-HYDROXYBUTYRATE (GHB) DE CERVEAU DE RAT | |
US20020132238A1 (en) | Progesterone receptor complex p23-like protein | |
JP2005503793A (ja) | 少なくとも視床下部、肝臓又は膵臓で発現する肥満に関する遺伝子 | |
WO1997047172A1 (fr) | Proteine isoforme du recepteur de la vitamine d |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060919 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20061213 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070209 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070319 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070529 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070621 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100629 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110629 Year of fee payment: 4 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |