JPH10508473A

JPH10508473A - カリウムチャンネルの新規ファミリーをコードする遺伝子

Info

Publication number: JPH10508473A
Application number: JP8514863A
Authority: JP
Inventors: マーク・ヘンリーポーシユ，; ローラ・アリシアプライス，
Original assignee: アメリカン・サイアナミド・カンパニー
Priority date: 1994-10-31
Filing date: 1995-10-25
Publication date: 1998-08-25
Also published as: WO1996013520A1; AU4146996A; US5559026A; EP0789712A1

Abstract

(57)【要約】この発明は全体的にカリウムチャンネル遺伝子ファミリーに関する。より具体的には、本発明はドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogaster)およびケノルハブディティスエレガンス(Caenorhabditis elegans)からのカリウムチャンネル遺伝子のクローニングおよび特徴づけに関する。本発明の他の局面は細胞増殖に対する影響を決定する物質のアッセイ方法を包含する。ここに記述されるようなヌクレオチド配列によりコードされるカリウムチャンネルに本質的に相同なカリウムチャンネルを阻害することによる線虫の害および害虫の制御方法もまた提示される。

Description

【発明の詳細な説明】カリウムチャンネルの新規ファミリーをコードする遺伝子発明の分野この発明は、概括的には、カリウムチャンネル遺伝子ファミリーに関する。より具体的には、本発明はドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogast er)およびケノルハブディティスエレガンス(Caenorhabditis elegans)からのカリウムチャンネル遺伝子のクローニングおよび特徴づけに関する。発明の背景合成有機殺虫剤は、主として、コリン作動系（有機リン化合物およびメチルカルバメート）、電位依存性ナトリウムチャンネル（ピレスロイドおよびＤＤＴ）、ならびにＧＡＢＡ依存性塩素チャンネル（シクロジエンおよび他のポリクロロシクロアルカン）に作用する神経毒である。カリウムチャンネルは、ニューロンおよび筋線維の興奮性および再分極の特性のレベルを決定する不可欠な膜タンパク質の大きなかつ多様なグループを含む［ハイル(B．Hille)、イオニックチャンネルズオブエクサイタブルメンブレンズ(Ionic Channel of Excitable Membranes)、シナウアー(Sinauer)、サンダーランド(Sunderland)、メリーランド州(MA)(1984)］。カリウムチャンネルによりコードされる多数の不可欠な機能は、それらを新規の殺虫剤ならびに動物およびヒトの治療上の優れた標的とする。ショウジョウバエドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogaster )でのカリウムチャンネルの多様性は、相同なタンパク質をコードする広汎な遺伝子ファミリーに起因する。カリウムチャンネルをコードする６個の遺伝子がドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogaster)からクローニングされており、これらは昆虫の神経組織で観察されるカリウムの流れの多様性の大きな部分の原因である［ウェイ(A．Wei)、コヴァルビアス(M．Covarrubias)、バトラー(A．Butler) 、ベイカー(K．Baker)、パク(M．Pak)、サルコフ(L．Salkoff)、サイエンス(Sci ence)248、599-603(1990)、アトキンソン(N.S．Atkinson)、ロバートソン(G.A． Robertson)、ガネツキー(B．Ganetzky)、サイエンス(Science)253、551-555(199 1)、ヴァルムケ(J．Warmke)、ドライスデール(R．Drysdale)、ガネツキー(B．Ga netzky)、サイエンス(Science)252、1560-1564(1991)、ブルッゲマン(A．Brugge mann)、パルド(L.A．Pardo)、シュトゥーマー(W．Stuhmer)、ポングズ(O．Pongs )、ネイチャー(Nature)365、445-448(1993)］。ＳｈａｋｅｒおよびＳｈａｌは迅速な流れの活性化および不活性化の特性をもつ電位依存性カリウムチャンネルをコードする。ＳｈａｂおよびＳｈａｗは遅延性の不活性化（Ｓｈａｂ）および非不活性化（Ｓｈａｗ）の特性をもつ遅延性整流性(rectifier)チャンネルをコードする。Ｓｌｏはカルシウム活性化性カリウムチャンネルをコードし、また、ｅａｇは環状ＡＭＰにより調整されるカリウムおよびカルシウムの双方が透過できる電位依存性チャンネルをコードする。カリウムチャンネルの挙動に影響を与える化合物による心活動電位の調整は重篤な心疾患の有用な治療となりうる。これに関しては、昆虫よりクローニングされたカリウムチャンネルのそれぞれが、哺乳類種で、とりわけラット心組織からクローニングされた遅延性整流性カリウムチャンネルの相同物ＲＡＫを包含する、対応する異形(versions)を有する［パウルミクル(M．Paulmichl)、ネイスミス (P．Nasmith)、ヘルミス(R． Hellmiss)、リード(K．Reed)、ボイル(W.A．Boyle)、ネルボンヌ(J.M．Nerbonne )、ペラルタ(E.G．Peralta)、クラパム(D.E．Clapham)、プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンスＵＳＡ(Proc．Natl．Acad ．Sci USA)88、7892-7895(1991)］。かように、ＲＡＫチャンネルは、心不全の制御の新規薬物の重要な標的としての意味を持つ。心細胞での遅延性整流性カリウム電流は、脱分極する内部へのカルシウムの流れに逆らうことにより心活動電位のプラトーの期間を調節する。遅延性整流性カリウム電流は、特徴的に、休止からの脱分極に際し活性化され、Ｓ字状もしくは遅延性の開始を呈し、そして非直線性もしくは整流性の電流−電圧の関係を有する。遅延性カリウムコンダクタンスのいくつかのタイプは、測定された単一チャンネルのコンダクタンスに基づいて心細胞で同定されている。心拍数および収縮性は遅延性整流性カリウムコンダクタンスの二次的メッセンジャーの修飾により調節され、また、プラトーの形の種差はチャンネル発現のタイプおよびレベルにより影響されうる。予測される膜貫通トポロジーに基づけば、カリウムチャンネルは２個の別個のクラスにさらに分類されうる。すなわち、６個の膜貫通ドメイン（Ｓ１−Ｓ６）およびただ１個の孔形成ドメイン（Ｈ５）より成る電位依存性、カルシウム活性化性、かつ環状ヌクレオチド依存性カリウムチャンネル、ならびに、膜を２回貫通しかつただ１個の孔形成領域もまた含有する内部整流性カリウムチャンネルである［クボ(Y．Kubo)、リューヴェニー(E．Reuveny)、スレジンガー(P.A．Slesi nger)、ヤン(Y.N．Jan)、ヤン(L.Y．Jan)ネイチャー(Nature)364、802-806(1993 )；クボ(Y．Kubo)、ボールドウィン(T.J．Baldwin)、ヤン(Y.N．Jan)、ヤン(L.Y．Jan)ネイチャー(Nature)362、127-133(1993)］。ここで、われわれは、ドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogaster)の新規のカリウムチャンネルのクローニングおよび酵母での機能的発現を報告する。さらに、われわれは、カリウムチャンネルの既知のクラスで独特な位相的立体配置を表すカリウムチャンネルの新規ファミリーの第二のメンバーを構成するケノルハブディティスエレガンス(Caenorhabditis elegans)の相同物を明らかにする。酵母サッカロミセスセレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)が、カリウム移送メカニズムを研究する目的のモデル真核生物体として利用される。酵母サッカロミセスセレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)の遺伝子的構成を容易に操作し得るため、研究者はカリウム移送を包含する多くの複雑な生物学的経路の詳細な理解を発展させてきた。酵母では、高親和性のカリウム取り込みがＴＲＫ１遺伝子産物により実行される［ゲイバー(R.F．Gaber)、スタイルズ(C.A．Styl es)、フィンク(G.R．Fink)Mol．Cell．Biol．8、2848-2859(1988)］。ｔｒｋ１機能を欠く変異酵母株はカリウムの高濃度を欠く培地中での増殖が不可能である。カリウム移送メカニズムは、生物体では酵母およびヒトと同じくらい互いに異なって存在するため、変異細胞での異種性カリウムチャンネルの発現がｔｒｋ１の機能に取って換わり、そして低カリウム濃度を含有する培地での増殖を援助しうると予測し得るであろう。これに関しては、植物のカリウムチャンネルが酵母で機能すること、および、新規の除草剤の重要な標的としての意味をもつことが示された［アンダーソン(J.A．Anderson)、ヒュープリカー(S.S．Huprikar)、コーチャン(L.V．Kochian)、ルーカス(W.J．Lucas)、ゲイバー(R.F．Gaber)、プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンスＵＳＡ (Proc．Natl．Acad．Sci USA)89、3736-3740(1992)；センテナ(H．Sentenac)、ボノー(N．Bonnaud)、ミネ(M．Minet)、ラクルー(W.J．Lacroute)、サルモン(J. -M．Salmon)、ゲイナー(F．Gaynard)、グリニョン(C．Grignon)、サイエンス(Sc ience)256、663-665(1992)；シャハトマン(D.P．Schachtman)とシュレーダー(J. I．Schroeder)、ネイチャー(Nature)370、655-658］。かように、われわれは、異種性の種からのカリウムチャンネルのクローニングおよび発現にこの酵母発現系を採用し、それを新規殺虫剤の発見ならびに動物およびヒトの治療学に有用にしている。こうした化合物の発見は高い特異性および処理量のスクリーニングアッセイを必然的に要求するであろう。例えば、カリウムチャンネルに向けられる新規の殺虫剤は、昆虫のチャンネルに対する高い選択性および非昆虫種に対する低い活性を要求する。異種性のカリウムチャンネルの機能的発現を適応させるよう遺伝子的に修飾された酵母株を利用するスクリーニングアッセイは、この分野で大きな利点を提供する。発明の要約本発明の最初の局面は、カリウムチャンネル遺伝子およびそれによりコードされるタンパク質の新規のサブクラスの発見である。この新規のサブクラスに属するカリウムチャンネルは膜貫通ヘリックスの形成が可能な４個の疎水性ドメインを含む。その最初の孔形成ドメインは第一と第二の膜貫通ヘリックスの間に挿入され、また、二番目の孔形成ドメインは第三と第四の膜貫通ヘリックスの間に挿入され、さらに、その各孔形成ドメインはカリウム選択的ペプチドモチーフを含有する。好まれる態様においては、当該ペプチドモチーフはＹ／Ｆ−Ｇジペプチドモチーフから成るグループから選択される。ある好まれる態様においては、この新規のサブクラスに属する無脊椎動物（すなわち昆虫および線虫）のカリウムチャンネル遺伝子の単離および特徴づけが提示される。より好まれる態様においては、本発明は、このカリウムチャンネル遺伝子ファミリーに独特な保存されたアミノ酸配列要素をコードする、ドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogaster)およびケノルハブディティスエレガンス(Caenorhabditis elegans)からの相補的ＤＮＡ断片の単離を提供する。酵母の発現技術が、ドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogaster )およびＣ．エレガンス(Caenorhabditis elegans)から。ＤＮＡをクローニングするのに採用され、また、ハイブリッド形成のアプローチが、ケノルハブディティスエレガンス(Caenorhabditis elegans)から付加的ｃＤＮＡを単離するのに利用される。本発明の第二の局面は細胞増殖に対する影響を決定する物質のアッセイ方法である。上述の種類の酵母細胞が異種性タンパク質の発現を引き起こすような適切な増殖培地で培養され、寒天増殖培地に固定され、そして当該寒天プレートの表面に適用される化学的化合物に曝される。固定された細胞の増殖に対する影響は、異種性カリウムチャンネルに対し影響を有する化合物の周囲で見出される。本発明の第三の局面は、ここに提示されるようなヌクレオチド配列によりコードされるカリウムチャンネルに本質的に相同なそれらを阻害することによる線虫の害および害虫の制御方法である。図面の簡単な説明第１図。ｐＤｍＯＲＦ１をもつＣＹ１６２細胞の増殖。ＣＹ１６２細胞は、低カリウム濃度を含有する培地でのＣＹ１６２の増殖を援助するプラスミドの一次ライブラリースクリーニングの生存体から単離したプラスミドで形質転換した。各プラスミドをもつ株の６個の別個の形質転換体を指摘される培地上ところどころで培養する。ｐＤｍＯＲＦ１をもつＣＹ１６２細胞は各プレートの上左角に見出され、一方、ｐＫＡＴ１含有細胞は下右角に見出される。第２図。ＤｍＯＲＦ１のＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列［配列番号１および２］。この2.4kbのｃＤＮＡのヌクレオチド配列はＧＡＬ１プロモーターに隣接するただ１個の長い読み取り枠を示した。予測されるポリペプチド中の推定の膜貫通ドメイン（Ｍ１−Ｍ４）および孔形成Ｈ５ドメインに対応する区分に下線がつけられる。１個のアミノ末端のアスパラギンに連結されるグリコシル化部位がＧで指摘される。第３図。ケノルハブディティスエレガンス(Caenorh abditis elegans)ゲノムのＦ２２ｂ７．７区分のＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列［配列番号３］。予測されるポリペプチド中の推定の膜貫通ドメイン（Ｍ１−Ｍ４）および孔形成Ｈ５ドメインに対応する区分に下線がつけられる。第４図。ＤｍＯＲＦ１配列およびＦ２２ｂ７.７配列の整列(Alignment)。ＤｍＯＲＦ１のタンパク質コード領域［配列番号３７］およびＦ２２ｂ７．７のタンパク質コード領域［配列番号３８］（この図ではＣｅＯＲＦ−１と称される）が、ジーンワーク(Genework)ＤＮＡ配列分析ソフトウェアのタンパク質配列整列アルゴリズムを使用して比較される。同一アミノ酸が囲まれる。第５Ａ図。ＤｍＯＲＦ１およびＦ２２ｂ７．７の孔形成ドメインの比較。クローニングされたドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogaster)の６種のカリウムチャンネルおよび３種の内部整流性チャンネルのアミノ酸配列［配列番号７から２１］が、孔形成Ｈ５領域内でＤｍＯＲＦ１およびＦ２２ｂ７．７と比較される。アミノ酸同一性は垂直線により指摘され、また、保存された置換は点により指摘される。許容されると思われるアミノ酸置換が指摘される。第５Ｂ図。ＤｍＯＲＦ１およびＦ２２ｂ７．７のポリペプチド配列のハイドロパシープロット分析。ジーンワークス(Geneworks)ＤＮＡ分析ソフトウェアのカイト−ドゥーリトル(Kyte-Doolittle)のハイドロパシーアルゴリズムが、ＤｍＯＲＦ１およびＦ２２ｂ７．７のトポロジーを予測するのに使用される。予測される膜貫通ドメイン（Ｍ１−Ｍ４）および孔形成ドメインの位置が指摘される。第６図。ＤｍＯＲＦ１の予測される膜貫通トポロジー。第７図。プラスミドをもつＣＹ１６２（ｔｒｋ１Δ）株の異種性カリウムチャンネル依存性の増殖。ｐＹＥＳ２、ｐＫＡＴ１、ｐＤｍＯＲＦ１およびｐＲＡＴＲＡＫをもつＣＹ１６２を、０mM、0.2mMもしくは100mMの添加した塩化カリウムを含有するアルギニン−リン酸−寒天培地上、30℃で４日間培養する。第８図。異種性カリウムチャンネルを含有する酵母細胞の増殖阻害。指摘されるプラスミドをもつＣＹ１６２細胞（105）を、0.2mM塩化カリウムを含有するアルギニン−リン酸−寒天培地で培養する。滅菌したフィルターディスクをこの寒天の表面に置き、そしてカリウムチャンネル遮断化合物の１M溶液20mlに浸した。左上角から時計回りに塩化バリウム、塩化セシウム、ＴＥＡそして塩化ルビジウムである。塩化カリウムは中央のディスクに適用される。第９図。ＣＯＲＫのＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列［配列番号３６］。この1.4kbのｃＤＮＡのヌクレオチド配列はＧＡＬ１プロモーターに隣接するただ１個の長い読み取り枠を示した。予測されるポリペプチド中の孔形成Ｈ５ドメインに対応する区分に下線が付けられる。アスパラギンに連結されたグリコシル化部位がＧにより指摘される。発明の詳細な説明ヌクレオチド塩基はここで以下のように略記される：Ａｄｅ；Ａ−アデニンＧ−グアニンＵｒａ；Ｕ−ウラシルＣ−シトシンＴ−チミンアミノ酸配列はここで以下のように３文字もしくは１文字のいずれかで略記される：Ａｌａ；Ａ−アラニンＬｅｕ；Ｌ−ロイシンＡｒｇ；Ｒ−アルギニンＬｙｓ；Ｋ−リシンＡｓｎ；Ｎ−アスパラギンＭｅｔ；Ｍ−メチオニンＡｓｐ；Ｄ−アスパラギン酸Ｐｈｅ；Ｆ−フェニルアラニンＣｙｓ；Ｃ−システインＰｒｏ；Ｐ−プロリンＧｌｎ；Ｑ−グルタミンＳｅｒ；Ｓ−セリンＧｌｕ；Ｅ−グルタミン酸Ｔｈｒ；Ｔ−スレオニンＧｌｙ；Ｇ−グリシンＴｙｐ；Ｗ−トリプトファンＨｉｓ；Ｈ−ヒスチジンＴｙｒ；Ｙ−チロシンＩｌｅ；Ｉ−イソロイシンＶａｌ；Ｖ−バリンここで使用されるような「哺乳類」という用語はいずれかの哺乳動物種（例えばヒト、マウス、ラットおよびサル）を指す。ここで使用されるような「異種性」という用語は、カリウムチャンネルもしくはその一部の発現で使用されるかまたはここで記述される生物体（例えば、哺乳類、鳥類、両生類、昆虫、植物）よりほかの生物体から源を発する、酵母で天然には見出されないＤＮＡ配列、タンパク質、および他の材料、もしくはその組み合わせを指す。「上流」および「下流」という用語は、転写および翻訳の方向を指すのにここで使用され、ある配列が別の配列に先立ち転写もしくは翻訳されることを後者の「上流」と称する。本発明のカリウムチャンネルは、電位依存性チャンネル、カルシウム活性化性チャンネル、環状ヌクレオチド依存性チャンネル、内部整流性チャンネルなどを包含する既知のカリウムチャンネルに共有の特性、およびとりわけ電気生理学的特性に関する特性を所有する。ある好まれるチャンネルは、カリウム濃度、とりわけ電位依存性チャンネルの特徴により影響される内側へおよび外側への流れを表す。「チャンネル」という用語およびそれをコードするヌクレオチド配列は、チャンネルの前述のクラスのサブタイプ、ならびにそれらの変異体、誘導体および相同物を包含することを意図される。カリウムチャンネルもしくはその一部をコードするヌクレオチド配列は組み換え的に発現され、また、様々な理由で利用されうる。理由の最も注目に値するものは、カリウムイオンチャンネルの活性を調整する物質のスクリーニングである。こうした物質、とりわけ本発明のカリウムチャンネル活性の阻害剤は、殺虫剤、駆虫剤、心不全の制御に適する薬物などとして利用されうる。異種性ＤＮＡ配列は一般的に発現ベクターにより宿主中で発現される。発現ベクターは複製可能なＤＮＡ構築物であり、そこでは異種性ＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列は意図される宿主中での当該異種性ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの発現に影響を与えることが可能な適する制御配列に操作可能に連結される。一般に、制御配列は、転写プロモーター、転写を制御する任意のオペレーター配列、適するｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および（場合によっては）転写および翻訳の停止を制御する配列を包含する。本発明を実行するのに有用なベクターは、プラスミド、ウイルス（バクテリオファージを包含する）、および組み込み可能なＤＮＡ断片（すなわち遺伝子組み換えにより宿主ゲノム中に組み込み可能なＤＮＡ断片）を包含する。当該ベクターは、プラスミドの場合のように宿主ゲノムに独立に複製しかつ機能しうるか、もしくは組み込み可能なＤＮＡ断片の場合のように当該ゲノムそれ自身に組み込まれうる。適するベクターは、レプリコン、および、意図される発現宿主と両立できる種由来の制御配列を含有するであろう。例えば、宿主細胞内で操作可能なプロモーターは、その細胞のＲＮＡポリメラーゼに結合するそれであり、また、宿主細胞内で操作可能なリボソーム結合部位は、その細胞の内在性リボソームに結合するそれである。ＤＮＡ領域は、それらが相互に機能的に関連する場合には操作可能に関連付けられる。例えば、プロモーターはそれが当該配列の転写を制御する場合にコード配列に操作可能に連結され、リボソーム結合部位はそれが翻訳を可能にするように配置される場合にコード配列に操作可能に連結される。一般に、操作可能に関連付けられるとは、隣接する、および、リーダー配列の場合には、隣接しかつ読み取り状態(reading phase)にあることを意味する。本発明の形質転換された宿主細胞は、組み換えＤＮＡ技術を使用して構築されるベクターで形質転換もしくはトランスフェクションされており、かつ、当該異種性ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質もしくはタンパク質サブユニットを発現する細胞である。好まれる態様においては、この形質転換された宿主細胞は酵母である。酵母培養系の多様性、および酵母細胞の形質転換に適する発現ベクターは既知である。例えば、米国特許第4,745,057号、同第4,797,359号、同第 4,615,974号、同第4,880,734号、同第4,711,844号および同第4,865,989号を参照。サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は酵母のなかで最も普遍的に使用されるが、とはいえ多数の他の酵母種も普遍的に入手し得る。例えば、米国特許第4,806,472号（クルベロミセスラクティス(Kluveromyces lacti s)およびそれによる発現ベクター）；同第4,855,231号（ピキアパストリス(Pi chia pastoris)およびそれによる発現ベクター）を参照。異種性カリウムチャンネルは、低カリウム濃度含有培地で増殖が不可能な酵母株の生存を許容しうる［ＣＹ１６２；例えば、アンダーソン(J.A．Anderson)、ヒュープリカー(S.S．Hup rikar)、コーチャン((L.V．Kochian)、ルーカス(W.J．Lucas)、ゲイバー(R.F．G aber)、プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンスＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci USA)89、3736-3740(1992)を参照］。酵母ベクターは、当該プラスミドに酵母細胞内で高コピー数で複製する能力を与える内在性２ミクロン（２μ）酵母プラスミドからの複製開始点もしくは自律性複製配列（ＡＲＳ）、当該プラスミドが酵母細胞内で低コピー数でのみ複製する能力を制限するセントロメア（ＣＥＮ）配列、プロモーター、異種性ＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ、ポリアデニル酸化配列および転写終止配列、ならびに選択可能なマーカー遺伝子を含有しうる。例示的プラスミドはＹＲｐ７である［スティンチコム(Stinchcomb)ら、(1979) ネイチャー(Nature)282、39；キングズマン(Kingsman)ら、(1979)ジーン(Gene)7 、141；チェンパー(Tschemper)ら、(1980)ジーン(Gene)10、157］。このプラスミドはＴＲＰ１遺伝子を含有し、この遺伝子はトリプトファン非存在下で増殖能力を欠く酵母変異株例えばＡＴＣＣ番号44076についての選択的マーカーを提供する。酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在は、その後、トリプトファン非存在下での増殖による形質転換の検出に有効な環境を提供する。酵母ベクターでの適する促進配列は、メタロチオネインのプロモーター（ＹＥｐ５２）、３−フォスフォグリセリン酸キナーゼのプロモーター［ｐＰＧＫＨ、ヒッツェマン(Hitzeman)ら、(1980)ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(J．Biol．Chem.)255、2073］、もしくは、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、フォスフォフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−フォスフォグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フォスフォグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのような他の解糖酵素のプロモーター［ｐＹＳＫ１５３、ヘス(Hess)ら、(1968)J．Adv ．Enzyme Reg．7、149；およびホランド(Holland)ら、(1978)バイオケミストリー(Biochemistry)17、4900］を包含する。酵母の発現での使用に適するベクターおよびプロモーターはヒッツェマン(Hitzema n)ら、EPO Publn．No．73,657にさらに記述される。増殖条件により制御される転写の付加的な利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２（ｐＡＤ４Ｍ）、イソチトクロームＣ、酸リン酸化物、窒素代謝に関連する分解酵素、ならびに前述のメタロチオネインおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース（ｐＹＥＳ２）の利用を司る酵素、のプロモーター領域である。最後に、適する発現プラスミドの構築においては、これらの遺伝子に関連する終止配列もまた、当該ｍＲＮＡのポリアデニル酸化および終止を提供するように発現ベクター内の異種性コード配列の３’に結合されうる。本発明のひとつの態様において酵母の発現系が記述される。ここで酵母細胞は異種性のカリウムチャネルをもつ。好まれる態様においては、これらのチャンネルはＤｍＯＲＦ−１、ＣＯＲＫもしくはＲＡＫである。上で言及されるように、本発明の形質転換された宿主細胞は異種性ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質もしくはタンパク質サブユニットを発現する。発現される場合は、当該カリウムチャンネルは宿主細胞膜に配置される（すなわち、リガンドの立体選択的結合およびカリウムイオンの通過の双方にとって適正な方向にその中に物理的に置かれる）。本発明のある好まれるスクリーニングの態様においては形質転換された酵母細胞が提示され、これは適する発現ベクター中にクローニングされたラット心遅延性整流性カリウムチャンネルＲＡＫをコードする異種性ＤＮＡ配列を含有する。ＲＡＫは、低カリウム濃度含有培地でのサッカロミセスセレビシエ(Saccharom yces cerevisiae)株ＣＹ１６２のカリウム依存性の表現型を補足することが可能である。本発明のカリウムチャンネルのサブクラスは、当該カリウムチャンネルが膜貫通ヘリックスを形成することが可能な４個の疎水性ドメインを有することを特徴とする。これらのチャンネルは、それらが２個の孔形成ドメインを含み、そのうち１個は前述の第一のヘリックスと前述の第二のヘリックスの間に挿入され、また、他方は前述の第三のヘリックスと前述の第四のヘリックスの間に挿入されることをさらに特徴とする。当該孔形成ドメインはさらに、当該チャンネルに、ナトリウム、カルシウムなどのような他のイオンを除外してカリウムイオンを通過させる能力を与えるようはたらくカリウム選択的モチーフを含有する。ある好まれる態様においては、このモチーフはペプチドＹ／Ｇを含有し、また、とりわけジペプチドもしくはトリペプチドのモチーフのいずれかで、またしばしばＹ／Ｆ −Ｇ結合をもつ。最も好まれる態様においては、当該モチーフはＧ−Ｖ−Ｇ、Ｇ −Ｌ−Ｇ、Ｇ−Ｙ−Ｇ、Ｇ−Ｆ−ＧおよびＧ−Ｉ−Ｇから成るグループより選択される。本発明のある態様においては、当該カリウムチャンネルは、それが細胞内および細胞外へのカリウムイオンの流れの調整体として機能できるような様式で細胞膜内に配置される。この活性を最良に調節するためには、少なくともただ１個の孔形成ドメインが細胞膜の外側部分に隣接して配置されうる。他の態様においては、本発明のカリウムチャンネルはさらにアミノ末端のグリコシル化部位を含み、そしてとりわけその部位はアスパラギンに連結される。ここに提示されるようなサブクラスに属するカリウムチャンネルは脊椎動物および無脊椎動物の双方の幅広い多様な動物種に由来しうる。酵母発現技術およびここに述べられるような他の技術を使用し、本発明の発明人らは、低カリウム濃度含有培地上でサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisia e)株ＣＹ１６２（ｔｒｋ１Δ）のカリウム依存性の表現型の補足により、ＤｍＯＲＦ１［配列番号１］と命名される無脊椎動物起源からのただ１個の2463塩基対のｃＤＮＡ断片を単離している［アンダーソン(J.A．Anderson)、ヒュープリカー(S.S．Huprikar)、コーチャン((L.V．Kochian)、ルーカス(W.J．Lucas)、ゲイバー(R.F．Gaber)、プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンスＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci USA)89、3736-3740(1992)］。ＤｍＯＲＦ１は、他のカリウムチャンネルの孔形成領域との本質的なアミノ酸同一性を表す618アミノ酸のタンパク質［配列番号２］をコードするただ１個の長い読み取り枠を含有する。ＤｍＯＲＦ１は、膜貫通ヘリックス（Ｍ１−Ｍ４）の形成が可能な４個の疎水性ドメイン、ならびに、膜貫通ヘリックスＭ１とＭ２、およびＭ３とＭ４の間に見出される２個の推定の孔形成Ｈ５ドメインを包含する、それを他のクラスのカリウムチャンネルと区別する構造的特徴を含有する。各孔形成Ｈ５ドメインはカリウム選択性に必要とされるＹ／Ｆ−Ｇジペプチドモチーフを含有する［ヘギンボタム(L．Heginbotham)、アブラムソン(T．Abramson )、マッキノン(R．MacKinnon)、サイエンス(Science)258、1152-1155、(1992)］。この業績を、ｐＣＯＲＫと命名される434アミノ酸のタンパク質をコードするのに十分なただ１個の読み取り枠を有するＣ．エレガンス(C．elegans)由来の構築物をクローニングするのに発展させた。ＤｍＯＲＦ１に類似のＤＮＡおよびタンパク質についてのジェンバンク(GENBA NK)データベース検索は、ケノルハブディティスエレガンス(Caenorhabditis e legans)ゲノム配列決定プロジェクトで報告された［ウィルソン(R．Wilson)、アインズコフ(R．Ainscough)、アンダーソン(K．Anderson)ら、ネイチャー(Nature )368、32-38(1994)］推定のタンパク質をコードするＤＮＡ配列Ｆ２２ｂ７．７を包含するいくつかのクローニングされたカリウムチャンネル配列を示した。当該ＤＮＡ配列は、既知のカリウムチャンネル配列への本質的相同性をもつ366アミノ酸のタンパク質（予測される分子量38.5kDa）をコードするのに十分なただ１個の長い読み取り枠を含有した。ハイブリッド形成のアプローチを使用し、ＣｅＯＲＦ１と命名されるｃＤＮＡ配列［配列番号３８］が、Ｆ２２Ｂ７．７のＤＮＡ配列を使用してデザインされるオリゴヌクレオチドをプローブとしてケノルハブディティスエレガンス(Cae norhabditis elegans)ｃＤＮＡライブラリーを探ることにより単離された［デイヴィス(T.N．Davis)とトーナー(J．Thorner）メソッヅインエンツィモロジー(Meth．Enzymol.)139、246-262(1987)］。ＣｅＯＲＦ１は他のカリウムチャンネルの孔形成領域との本質的なアミノ酸同一性を表すタンパク質をコードするただ１個の長い読み取り枠を含有する。ＣｅＯＲＦ１およびｐＣＯＲＫはそれぞれＤｍＯＲＦ１に類似の構造的特徴を含有し、２個の推定の孔形成Ｈ５ドメインを包含する。各孔形成Ｈ５ドメインはカリウム選択性に必要とされるＹ／Ｆ−Ｇジペプチドモチーフを含有する［ヘギンボタム(L．Heginbotham)、アブラムソン(T．Abramson)、マッキンン(R．MacKi nnon)、サイエンス(Science)258、 1152-1155、(1992)］。これらの特徴は、ＤｍＯＲＦ１、ＣＯＲＫ、およびＣｅＯＲＦ１を含むカリウムチャンネルの新規サブファミリーの呼称の根拠を形成する。本発明の他の局面は、細胞膜の内へ、それを介して、あるいはの外へのイオンの流れを可能にするカリウムチャンネルの能力に影響することによる、また、とりわけこれらのイオンがカリウムイオンである場合の、そうしたチャンネルの活性の調整方法に関する。生物学的であろうと化学的であろうとある物質が、配列番号２、配列番号４、配列番号３６もしくはＲＡＫのアミノ酸配列を含むひとつもしくはそれ以上のカリウムチャンネルをそれらの構造の不可欠な部分として有する細胞膜に、イオンの流れをそのように制御するカリウムチャンネルの能力に影響を与えるのに十分な量かつ時間、適用されうる。カリウムチャンネル遮断薬である物質はそうしたイオンの流れを調節するチャンネルの能力を阻害するであろう。そうした能力を高める物質はカリウムチャンネルの「活性化剤」と考えられうる。ＲＡＫの活性を調整する物質は、心活動電位の上方へもしくは下方への調整によりそうするとみられる。こうした物質の応用はそれぞれ当該物質を細胞膜に分布しかつ当該物質が膜と相互作用できるのに十分な時間そうした分布を保持するのに適する処方で、インビトロ、エクスビトロ、もしくはインビボの応用の形態をとりうる。適切な処方、物質濃度、応用時間および他の関連するパラメータは、とりわけ、イオンチャンネルの電流の流れを測定する既知のアッセイを利用することにより確立されうる。当業者が、とりわけカリウムチャンネル遮断薬の場合に、これらのパラメータを至適化するのに利用しうる別の適する終点は「細胞死」である。こうしたアッセイはインビトロで実行され、また、インビボ条件に外挿され、もしくはいくつかの場合には、例えば標的害虫（生物体全体）を含む試験サンプルに当該物質を直接適用し、そして昆虫の死亡の許容し得るパーセントが達成される適切なパラメータに注目する(noting)ことによるように、直接インビボで容易に確立されうる。ある好まれる態様においては、害虫を選択的に阻害する方法が、そうした昆虫の細胞中に含有されかつ配列番号２のアミノ酸配列を含むカリウムチャンネル、もしくはそれと本質的に相同なカリウムチャンネルの活性を選択的に阻害することが可能な物質をそうした害虫に適用することにより提示される。最も好まれる態様においては、当該阻害剤は、標的とされる害虫よりほかの種に存在しうる他の非相同的カリウムチャンネルの阻害なしに前述のカリウムチャンネルの活性を阻害するであろう。こうした他の種はまた、庭園、作物もしくはその中で害虫を制御することが所望される他の場所でのような当該阻害剤の適用場所にも存在しうることも構想される。他の好まれる態様においては、線虫の害を選択的に阻害する方法が、そうした害虫の細胞に含有されかつ配列番号４もしくは配列番号３６のアミノ酸配列を含むカリウムチャンネル、あるいはそれと本質的に相同なカリウムチャンネルの活性を選択的に阻害することが可能な物質をそうした害虫に適用することによる害虫の制御について論考されるとほぼ同様の様式で提示される。以下の実施例は本発明の多様な局面をさらに例証するために提供される。それらは本発明を制限するものとして解釈されるべきでない。実施例１組み換え発現ライブラリーのスクリーニング。サッカロミセスセレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)株ＣＹ１６２はアンダーソン(Anderson，J.A.)ら、(1992)プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンスＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)89、37 36-3740に記述される。細菌株の増殖およびプラスミド操作は標準的方法により実行する（マニアティス(Maniatis T.)、モレキュラークローニング(Molecula r Cloning)。コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Sp ring Harbor Laboratory Press)、1982）。酵母増殖の培地条件、酵母からのプラスミドＤＮＡの単離、およびＤＮＡが媒介する酵母株の形質転換は記述される通りである（ローズ(Rose M.D.)、メソッヅインイーストジェネティックス(Methods in yeast genetics)、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、1990）。ｐＹＥＳ２中に構築されかつ第３齢の雄性ドロソフィラメラノガスター(Drosophila melano gaster)ｍＲＮＡから作成したｃＤＮＡを含有する多機能発現ライブラリーを記述されるように使用する［エレッジ(S.J．Elledge)、マリガン(J.T．Mulligan) 、レイマー(S.W．Ramer)、スポッツウッド(M．Spottswood)、デイヴィス(R.W．D avis)プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンスＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci USA)88、1731-1735(1991)］。ｐＹＥＳ２中に構築されかつケノルハブディティスエレガンス(Caenorhabditis elegans)の全生命段階から得たｍＲＮＡから作成したｃＤＮＡを含有する多機能発現ライブラリーはインヴィトロジェンコーポレーション(Invitrogen Corporation)による注文製である。異種性カリウムチャンネルをコードする発現プラスミドの単離。ＣＹ１６２細胞を各ライブラリーからのプラスミドＤＮＡで形質転換し、0.1M塩化カリウム含有ＳＣＤ−ｕｒａ（ウラシルを除く全必須栄養補充物を含有する合成完全ブドウ糖（２％）培地）寒天培地上で各ライブラリーから３×10⁶個の形質転換体を得る。形質転換体はＳＣＧ−ｕｒａ（ウラシルを除く全必須栄養補充物を含有する合成完全ガラクトース（２％）培地）寒天培地上に複製培養する。この選択的寒天培地上で増殖するコロニーをＳＣＧ−ｕｒａ寒天培地に移して個別のコロニーのクローンを得、そして一方でカリウム依存性の表現型の抑制を再アッセイする。プラスミドＤＮＡを生存するコロニーから単離し、そしてＣＹ１６２を形質転換するのに使用する。カリウム非依存性の表現型を与える１種のプラスミドｐＤｍＯＲＦ１を含有する６個の別個の形質転換株を、ｐＫＡＴ１をもつＣＹ１６２株とともにＳＣＤ−ｕｒａおよびＳＣＧ−ｕｒａ培地上で培養する。ｐＫＡＴ１は選択培地上でのＣＹ１６２の増殖を援助する植物の内部整流性カリウムチャンネルをコードする（第１図）。プラスミドをもつ株はブドウ糖含有培地およびガラクトース含有培地の双方でカリウム非依存性の増殖を表す。ブドウ糖含有培地での増殖は、増殖を援助するのに十分なカリウムチャンネル発現につながる転写の基礎レベルによるものであるとみられる。実施例２ＤｍＯＲＦ１のＤＮＡ配列分析。カリウム依存性の表現型の抑制を与えるプラスミドを高温サイクルシークェンシング（アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)により実行される自動ＤＮＡ配列分析にかける。ジーンワークス(G eneworks)ＤＮＡ配列分析ソフトウェア（インテリジェネティクス(Intelligenetics)）を使用して未処理のＤＮＡ配列情報を整列しそして読み取り枠を同定する。ｐＤｍＯＲＦ１中の2.4kbの挿入物のＤＮＡ配列が第２図に表される［配列番号１］。当該ｃＤＮＡの５’非翻訳配列はタンパク質コード領域に見出されそうにない長いポリＡおよびポリＴの広がり(t ract)を含有する。５’末端に近接する最初のＡＴＧはドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogaster)のコンセンサス翻訳開始部位に存在し［ケイヴナー(D.R．Cavener)ヌクレイックアシッヅリサーチ(Nucleic Acids Res.) 、15、1353-1361(1987)］、翻訳開始部位としてのこの部位の呼称に矛盾しない。618アミノ酸のタンパク質（予測される分子量68kDa）をコードするのに十分なただ１個の長い読み取り枠がｐＤｍＯＲＦ１中にコードされる。コンセンサスポリアデニル酸化部位ＡＡＴＣＡＡは３’非翻訳配列中の位置2093−2098に存在する。ＤｍＯＲＦ１は、膜貫通ヘリックス（Ｍ１−Ｍ４）の形成が可能な４個の疎水性ドメイン、ならびに、膜貫通ヘリックスＭ１とＭ２、およびＭ３とＭ４の間に見出される２個の孔形成Ｈ５ドメインを包含する、それを他のクラスのカリウムチャンネルと区別する構造的特徴を含有する。各孔形成Ｈ５ドメインはカリウム選択性に必要とされるＹ／Ｆ−Ｇジペプチドモチーフを含有する［ヘギンボタム(L．Heginbotham)、アブラムソン(T．Abramson)、マッキノン(R．MacKinnon) 、サイエンス(Science)258、1152-1155、(1992)］。実施例３ＤｍＯＲＦ１に相同なケノルハブディティスエレガンス(Caenorhabditis eleg ans)配列の同定。ジェンバンク(GENBANK)データベースのＤｍＯＲＦ１に類似のタンパク質配列の検索は、いくつかの既知のカリウムチャンネル配列とのかなりの合致(match)を示す。最も近似した合致は、ケノルハブディティスエレガンス(Caenorhabditis elegans)ゲノム配列決定プロジェクトで報告された［ウィルソン(R．Wilson)、アインズコフ(R．Ain scough)、アンダーソン(K．Anderson)ら、ネイチャー(Nature)368、32-38(1994) ］、推定のタンパク質コードＤＮＡ配列Ｆ２２ｂ７．７とである。当該ＤＮＡ配列およびジェンバンク(GENBANK)エクソン同定アルゴリズムにより認識される推定のエクソンから組立てられた予測されるアミノ酸配列が第３図［配列番号３および４］に表される。当該ＤＮＡ配列は、既知のカリウムチャンネル配列との本質的相同性をもつ336アミノ酸のタンパク質（予測される分子量38.5kDa）をコードするのに十分なただ１個の長い読み取り枠を含有する。Ｆ２２ｂ７．７配列は、ｐＤｍＯＲＦ１中で同定される膜貫通ヘリックス（Ｍ１−Ｍ４）の形成が可能な４個の疎水性ドメインのうち３個、ならびに、膜貫通ヘリックスの予測されるＭ１とＭ２、およびＭ３とＭ４の間に見出される２個の孔形成Ｈ５ドメインを包含する、それを他のクラスのカリウムチャンネルと区別する構造的特徴を含有する。各孔形成Ｈ５ドメインはカリウム選択性に必要とされるＹ／Ｆ−Ｇジペプチドモチーフを含有する［ヘギンボタム(L．Heginbotham)、アブラムソン(T．Abra mson)、マッキノン(R．MacKinnon)、サイエンス(Science)258、1152-1155、(199 2)］。Ｆ２２ｂ７．７配列中のＤｍＯＲＦ１のＭ１に相同なアミノ末端膜貫通ドメインの欠損は、アミノ末端をコードするエクソン（ひとつもしくは複数）を同定する検索アルゴリズムの欠陥によるとみられる。あるいは、アミノ末端コード配列が、ケノルハブディティスエレガンス(Caenorhabditis elegans)では頻繁に起こるトランススプライシングにより付加されうる。実施例４ＣｅＯＲＦ１のクローニングおよびＤＮＡ配列分析。Ｆ２２ｂ７．７の２個の孔形成ドメインをコードするＤＮＡ配列に対応するオリゴヌクレオチドを、アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)ＤＮＡ合成装置を使用して合成する。Ｆ２２ｂ７．７−Ｈ２−１：５’ＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＧＣＣＧＴＡＡＣＣＧＴＣＧＴＣＡＣＴＡＣＣＡＴＣＧＧＡＴＡＣＧＧＴＡＡＴＣＣＡ［配列番号５］。Ｆ２２ｂ７．７−Ｈ２− ２：５’ＴＣＡＴＴＣＴＡＣＴＧＧＴＣＣＴＴＣＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＡＣＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＧＧＣＧＡＣＴＴＧ［配列番号６］。当該オリゴヌクレチドは、それらの５’末端で、５’末端ラベリングキットを使用し、製造元の説明書（ニューイングランドヌクレアー(New England Nuclear)）に従い³²Ｐで標識した。標識したオリゴヌクレオチドを合わせ、そして、λＺＡＰ−ケノルハブディティスエレガンス(Caenorhabditis elegans)ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック(Clontech)より得る）からの６×10⁵個のプラークを、公表された方法［デイヴィス(T.N．Davis)とトーナー(J．Thorner)メソッヅインエンツィモロジー(Meth．Enzymol.)139、246-262(1987)］によりスクリーニングするのに使用する。ハイブリッド形成は42℃で16時間である。陽性クローンは、ハイブリッド形成スクリーニング過程を２回繰り返すことによりプラーク精製する。製造元の説明書に従ってファージＤＮＡから取り出したプラスミドＤＮＡを高温サイクルシークェンシング（アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)）により実行される自動ＤＮＡ配列分析にかける。ジーンワークス(Geneworks)ＤＮＡ配列分析ソフトウェア（インテリジェネティクス(Intelligenetics)）を使用して未処理のＤＮＡ配列データを整列しそして読み取り枠を同定する。実施例５ＤｍＯＲＦ１およびＦ２２ｂ７．７によりコードされる推定のタンパク質の比較。ＤｍＯＲＦ１およびＦ２２ｂ７．７の予測されるアミノ酸配列を整列しそして第４図に表す［配列番号３７および３８］。限られた全体的アミノ酸相同性のみが、孔形成Ｈ２−１およびＨ２−２ドメインに存在する最大の相同性領域をもつこれらの２種のタンパク質により表される。第５Ａ図は、ＤｍＯＲＦ１およびＦ２２ｂ７．７の孔形成ドメインと、既知のドロソフィラメラノガスター(Droso phila melanogaster)カリウムチャンネル配列および内部整流体カリウムチャンネル配列のそれら［配列番号７から２１］との比較を示す。50％より大きなアミノ酸同一性が全カリウムチャンネル配列でみとめられる。第５Ｂ図はＤｍＯＲＦ１およびＦ２２ｂ７．７のハイドロパシープロット分析を示す。それらの長さを通して顕著な位相的類似性を示す２種のタンパク質は、４個の膜貫通疎水性ドメイン（Ｍ１−Ｍ４）および２個の孔形成Ｈ２ドメインから成ると予測される。これらのデータは第６図に示された予測されるトポロジーを示唆する。双方のタンパク質とも、膜を４回通り抜け、アミノ末端およびカルボキシル末端が細胞内に存すると予測される。このトポロジーは、１個のアミノ末端アスパラギンに連結されるグリコシル化部位およびＨ２ドメインを、機能的カリウムチャンネル形成に対する絶対的要求である孔形成ドメインによる外側からの膜の浸透を可能にする細胞の外側に配置する。実施例６酵母でのラット心房遅延性整流性カリウムチャンネルの機能的発現。植物の内部整流性カリウムチャンネルをコードするプラスミドｐＫＡＴ１、ラット心房遅延性整流性カリウムチャンネルをコードするプラスミドｐＲＡＴＲＡＫ、プラスミドｐＤｍＯＲＦ１、およびコントロールのプラスミドｐＹＥＳを含有するＣＹ１６２の形質転換体を、様々な塩化カリウム濃度を含有するｕｒａ培地を欠くアルギニン−リン酸−ブドウ糖寒天培地［ロドリゲス−ナヴァロ(A．Rodriguez-Nava rro)とラモス(J．Ramos)、ジャーナルオブバクテリオロジー(J．Bacteriol. )159、940-945、(1984)］上で培養する（第７図）。ｐＫＡＴ１、ｐＲＡＴＲＡＫ、およびｐＤｍＯＲＦ１を含有する株は全てカリウムの低濃度を含有する培地上でのＣＹ１６２の増殖を援助するが、一方、ｐＹＥＳ２含有ＣＹ１６２細胞は、高カリウム濃度を含有する培地上でのみ増殖し、いくつかの異なるタイプの異種性カリウムチャンネルが高親和性のカリウムの取り込みを提供するよう機能することを指摘する。ｐＲＡＴＲＡＫは、ＲＡＴＲＡＫのタンパク質コード配列を、ＰＣＲを使用して５’のHind IIIおよび３’のXba I切断部位を添加するように修飾することにより構築される。加えて、４個のＡ残基が、良好な酵母の翻訳開始部位を提供するよう、イニシエーターＡＴＧのすぐ５’に隣接する配列に加えられる。修飾された配列を酵母発現ベクターｐＹＥＳ２（インヴィトロジェン(Invitrogen)）の Hind IIIおよびXba I切断部位にクローニングし、ｐＲＡＴＲＡＫを形成する。実施例７異種性カリウムチャンネルの機能的発現のバイオアッセイ増殖に関して異種性カリウムチャンネル依存性の酵母株は非特異的カリウムチャンネル遮断化合物に感受性であるはずである。いくつかの化合物のカリウムチャンネル遮断特性を試験するため、便宜的寒天プレートバイオアッセイを採用する。ｐＫＡＴ１、ｐＲＡＫＴＡＫ、ｐＤｍＯＲＦ１およびｐＹＥＳ２を含有する株を、ｕｒａを欠きかつ塩化カリウムの様々な量を含有するアルギニン−リン酸 −ブドウ糖寒天培地で培養する。アルギニン−リン酸−ブドウ糖培地は標準的合成酵母培養培地に存在するカリウムイオンおよびアンモニウムイオンからの妨害を避けるために使用する。滅菌したフィルターディスクを寒天表面に置き、そしてカリウムチャンネルを遮断するイオン、塩化セシウム、塩化バリウムおよびＴＥＡで浸す。異種性カリウムチャンネル含有株の増殖は、チャンネル依存性の様式でカリウムチャンネルを遮断するイオンにより阻害される。ＤｍＯＲＦ１依存性の増殖は塩化バリウムにより妨害されるが、しかし塩化セシウムもしくはＴＥＡにより阻害されない。ＫＡＴ依存性の増殖は塩化バリウム、塩化セシウムおよびＴＥＡにより妨害される。ＲＡＴＲＡＫ依存性の増殖は、ｐＫＡＴ１よりも相当より大きな程度、塩化バリウム、塩化セシウムおよびＴＥＡにより妨害され、ｐＲＡＴＲＡＫ含有細胞のより遅い増殖速度を部分的に反映する。これらの観察は、これらのチャンネルが当該変異酵母細胞の増殖を援助することを確かにし、また、カリウムチャンネル機能を妨害する化合物のスクリーニングのための酵母のバイオアッセイの効力を立証する。コントロールのｐＹＥＳ２含有株は、適用された塩化カリウムおよび塩化カリウムの同種物塩化ルビジウムの周囲でのみ増殖する。実施例８カリウムチャンネル活性を変化させる化合物の同定異種性カリウムチャンネルの発現により低カリウム濃度含有培地での増殖が可能とされた酵母株を、チャンネル機能を妨害する化学的化合物について多様な構造のそれらのライブラリーをスクリーニングするのに使用する。ｐＫＡＴ１、ｐＲＡＴＲＡＫ、ｐＤｍＯＲＦ１、ｐＣｅＯＲＦ１、およびｐＹＥＳ２−ＴＲＫ１を含有するＣＹ１６２細胞（10⁴/ml）を、500cm2のプレート中のｕｒａを欠きかつ0.2mM塩化カリウムを含有するアルギニン−リン酸−ブドウ糖寒天培地200ml中で培養する。ｐＹＥＳ２−ＴＲＫ１をもつＣＹ１６２細胞を、当該酵母株に対し非特異的影響を有しかつ従って異種性カリウムチャンネルに対し特異的に活性ではない化合物を同定するためのコントロールとしてアッセイに包含する。多様な構造の化学的化合物のサンプル（ＤＭＳＯ中の10mg/ml溶液２μｌ）を、24×24 の配列中の硬化させた寒天培地の表面に適用する。当該プレートを30℃で２日間インキュベーションする。この間に、適用した化合物が寒天培地中に放射状に拡散する。異種性カリウムチャンネル遺伝子をもつ株に対する適用した化合物の影響をｐＹＥＳ２−ＴＲＫ１をもつ株と比較する。ｐＹＥＳ２−ＴＲＫ１をもつ株の周囲にみとめられる帯よりも異種性カリウムチャンネルをもつ細胞を含有するプレート上でより大きな適用点の周囲の増殖阻害の帯の原因となる化合物は、選択的カリウムチャンネル遮断薬と考えられる。ｐＹＥＳ２−ＴＲＫ１をもつ株の周囲にみとめられる帯よりも異種性カリウムチャンネルをもつ細胞を含有するプレート上でより大きな適用点の周囲の増殖増強の帯を誘発する化合物は、選択的なカリウムチャネル開放物質と考えられる。実施例９２電極電圧固定法によりアッセイされるＸ．レヴィス(X．laevis)卵母細胞でのＤｍＯＲＦ１誘発性の電流ｐＤｍＯＲＦ挿入物のＤＮＡ配列分析は、１個の長いＯＲＦによりコードされるタンパク質が既知のカリウムチャンネルと共通の性質を所有することを強く示唆する。この仮説を試験するため、ＤｍＯＲＦによりコードされる推定のカリウムチャンネルの電気生理学的性質を、Ｘ．レヴィス(X．laevis)卵母細胞での発現により検査した。電流を２電極全細胞電圧固定法により測定した。ＤｍＯＲＦ１の読み取り枠をコードするＤＮＡ配列を以下のオリゴヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した：ＭＰＯ２３：ＡＴＡＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＴＣＧＣＣＧＡＡＴＣＧＡＴＧＧＡＴ［配列番号２２］ＭＰＯ２４：ＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＡＴＧＴ［配列番号２３］全長のＰＣＲ産物をｐＳＰ６４ポリＡ（プロメガ(Promega)）の対応する部位中にクローニングしｐＭＰ１４７を形成した。鋳型ＤＮＡは、Eco RIおよび製造元の説明書に従ってメッセージマシーン(Message Machine)（アンビオン(Ambion )）インビトロ転写キットを使用して転写されたＲＮＡで直鎖状にした。当該ＲＮＡのサンプルをＭＯＰＳ−酢酸−ホルムアルデヒドアガロースゲル中で分離し、そしてＲＮＡ含量を臭化エチジウム染色により推定した。残りはドライアイス上に保存した。Ｘ．レヴィス(X．laevis)卵母細胞を単離し、そして、５−20ng の転写物を含有する滅菌ＴＥ50nlを公表された処置に従って注入した。３日後、全卵母細胞の電流を２電極電圧固定法を使用して記録した。電極は３M塩化カリウムを含有しかつ0.3−1.0MΩの抵抗を有した。記録は低（10mM）もしくは高（9 0mM）塩化カリウムのいずれかの存在下に室温で一定の灌流を行い実行した。Ｘ．レヴィス(X．laevis)卵母細胞で発現されるＤｍＯＲＦ１遺伝子産物の２電極電圧固定法は、電位依存性およびカリウム依存性のカリウムチャンネルの特性を立証する。低カリウム濃度では、ＤｍＯＲＦ１は脱分極電位で外側への電流を表した。高カリウム濃度では、ＤｍＯＲＦ１は内側へおよび外側への双方の電流を表す。ＤｍＯＲＦ１チャンネルはカリウムに対する高度の選択を表し、また、カリウム＞ルビジウム＞アンモニウム＞セシウム＞ナトリウム＞リチウムの順番の陽イオン選択性を示す。カリウム電流は塩化バリウムにより大きく減衰された。実施例１０ノーザンブロッティング分析により決定されるＤ．メラノガスター(D．melanoga ster)でのＤｍＯＲＦ１発現の発達上の調節Ｄ．メラノガスター(D．melanogaster)発現ライブラリーからのｐＤｍＯＲＦ１の単離は、当該挿入物がその種からのｍＲＮＡ起源の内部に含有されることを強く示唆する。ＤｍＯＲＦ１発現の発達上の調節の詳細な理解は新規の殺虫剤の標的としてのＤｍＯＲＦ１の使用戦略の決定を促進するはずである。ＤｍＯＲＦ１発現を特徴づけるため、Ｄ．メラノガスター(D．melanogaster)の生活環の様々な段階からのポリＡＲＮＡのノーザンブロッティング分析を実施した。胚、幼虫および成虫形態からのＤ．メラノガスター(D．melanogaster)ポリＡ⁺ ＲＮＡ（インヴィトロジェン(Invitrogen)、５μg）を、標準的処置に従ってＭＯＰＳ−酢酸−ホルムアルデヒドアガロースゲル中で分離した。このゲルを臭化エチジウムで染色しそして写真撮影して分子量マーカーとして使用される18Ｓおよび28ＳリボソームＲＮＡの位置に印をつけた。ＲＮＡを毛管作用により10×ＳＳＰＥでニトロセルロースに移した。当該ブロットを風乾し、 80℃で１時間ベーキング(baked)し、そして４×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、２×デンハルト(Denhardt's)液、0.1％一本鎖ＤＮＡ中、68℃で２時間プレハイブリダイゼーションした。ＤｍＯＲＦ１の2.4kbのXho I断片をｐＤｍＯＲＦ１から単離し、そしてレディ −トゥ−ゴー(Ready-to-Go)キット（ファルマシア(Pharmacia)）を使用し、製造元の説明書に従ってα−³²ＰｄＣＴＰで標識した。このプローブを100℃で５分間加熱することにより変性し、その後氷水浴中で冷却した(quenching)。当該プローブをプレハイブリダイゼーション溶液に添加し、そしてハイブリダイゼーションを68℃で24時間継続した。当該ブロットを２×ＳＳＰＥ、0.1％ＳＤＳで室温で簡単に、その後、0.5×ＳＳＰＥ、0.1％ＳＤＳで65℃で２時間洗浄した。当該ブロットを風乾し、そして増感スクリーンを使用して反射Ｘ線フィルム（ＮＥＮ）を−70℃で48時間感光させた。ノーザンブロッティング分析は、ＤｍＯＲＦ１プローブがＤ．メラノガスター (D．melanogaster)の胚、幼虫および成虫形態から単離したおよそ2.8kbのｍＲＮＡ種とハイブリッド形成することを指摘する。ＤｍＯＲＦ１のｍＲＮＡの長さは予測されるＯＲＦの長さによく対応する。かように、ＤｍＯＲＦはＤ．メラノガスター(D．melanogaster)の生活環の全発達段階で発現される。実施例１１インビトロでのＤｍＯＲＦ１遺伝子産物の発現ｐＤｍＯＲＦ１挿入物のＤＮＡ配列分析は、既知のカリウムチャンネルに共通の保存されたアミノ酸配列ドメインをもつただ１個の長いＯＲＦを示す。当該ＤＮＡ配列は長さ618アミノ酸のタンパク質をコードするのに十分なＯＲＦを予測する。ＤｍＯＲＦ１ポリペプチドは、その区分が血漿膜にまたがることを示唆する長さが少なくとも20疎水性アミノ酸の４区分を含有する。加えて、ＤｍＯＲＦ１タンパク質配列はアミノ酸58−60に、Ｎに連結される推定のグリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ）を含有する。ＤｍＯＲＦの予測される大きさのタンパク質がｐＤｍＯＲＦ１中の挿入物から発現されることを確認するため、また、ＤｍＯＲＦ１がグリコシル化されるという主張を試験するため、ｐＤｍＯＲＦ１を、連結したインビトロ転写／翻訳をさせる鋳型として使用した。プラスミドｐＭＰ１４７を鋳型として使用し、ＴｎＴ結合転写−翻訳キット（プロメガ(Promeega)）を使用し、製造元の説明書に従って³⁵Ｓで標識したＤｍＯＲＦ遺伝子産物をインビトロで産生した。発生期のＤｍＯＲＦ１ポリペプチドのグリコシル化は、転写−翻訳反応へのイヌ膵ミクロソーム（プロメガ(Promeega) ）の添加により達成された。グリコシル化されたＤｍＯＲＦタンパク質のサンプルをエンドグリコシダーゼＨで処理して添加された炭化水素部分を除去した。アリコートをＴＣＡで沈殿させてそしてＧＦ／Ｃフィルター上に収集し、エタノールで洗浄し、乾燥しそして計測した。同等のｃｐｍをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。当該ゲルを可溶性蛍光アンプリファイ(Amplify)（アマーシャム(Amersham)）に浸漬し、そしてワットマン(Whatman)３ＭＭ濾紙上へ乾燥した。乾燥したゲルで反射Ｘ線フィルムを室温で感光させた。ＤｍＯＲＦ１遺伝子産物のインビトロでの翻訳は68kDaのポリペプチドを産生した。これは当該ＯＲＦの予測される分子量と矛盾しない。イヌ膵ミクロソームの存在下でのＤｍＯＲＦ１の翻訳は、低減された電気泳動の移動性をもつタンパク質の合成に帰着した。これは発生期のポリペプチドのグリコシル化と矛盾しない。グリコシル化されたＤｍＯＲＦのエンドグリコシダーゼＨでの処理は、炭化水素部分の除去に際して予期されるようなその相対的移動性を増大させた。かように、当該ＤｍＯＲＦ１挿入物は、予期される分子量をもつ糖タンパク質の発現を支配することが可能である。エンドグリコシダーゼＨ処理は、Ｎに連結されるグリコシル化により添加された糖に矛盾しない炭化水素残基を除去する。実施例１２酵母で発現されたＤｍＯＲＦ１の高親和性のカリウムイオン取り込みおよび選択性。ＤｍＯＲＦの発現はＣＹ１６２細胞がカリウムの低濃度を含有する培地で増殖することを可能にする。これは、ＤｍＯＲＦ１が高親和性のカリウム取り込み能力を提供することを意味する。ＤｍＯＲＦ１含有ＣＹ１６２細胞のカリウム取り込み特性を特徴づけるため、⁸⁶Ｒｂの取り込みの研究を実行した。このカリウム同種物の取り込みの検討は、ＤｍＯＲＦ１によるカリウム取り込みの重要な局面を示した。異種性カリウムチャンネル発現プラスミドを含有する酵母株、ＣＹ１６２−ＤｍＯＲＦ１、ＣＹ１６２−ｐＫＡＴおよびコントロール株ＣＹ１６２−ｐＹＥＳ２（クロンテック(Clontech)）を、0.1M塩化カリウム含有ＳＣＧａｌ−ｕｒａ中で一夜培養した。細胞を採集し、滅菌２回蒸留水で洗浄し、そしてＣａ−ＭＥＳ緩衝液中で６時間カリウムイオンを枯渇させた。細胞を再度洗浄し、そしてＣａ−ＭＥＳ緩衝液中に⁸⁶ＲｂＣｌを含有する培養チューブに分配（細胞10⁸個／チューブ）した。当該チューブを室温でインキュベーションし、サンプルを様々な時間間隔で濾過しそして計測した。細胞内への⁸⁶Ｒｂの取り込みが表された。２回の繰り返し分析について、⁸⁶Ｒｂは一定に保ち、そしてバリウムイオンを変動させてＫi値を決定した。ＤｍＯＲＦ１によりコードされる高親和性のカリウム取り込み能力はカリウム同種物⁸⁶Ｒｂの高親和性の取り込みも同様に可能にする。バリウムは、２回の繰り返し分析で立証されるように、μMのＫiで⁸⁶Ｒｂの取り込みを阻害した。高親和性の86Ｒｂ取り込みはコントロールのＣＹ１６２−ｐＹＥＳ２細胞でみとめられず、また、ＣＹ１６２−ｐＫＡＴ細胞内への⁸⁶Ｒｂ取り込みはその公表された特性と矛盾しない。実施例１３酵母でのドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogaster)カリウムチャンネルの発現。ショウジョウバエドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogaster )での電位依存性カリウムチャンネルの多様性は、６個の遺伝子、Ｓｈａｋｅｒ、Ｓｈａｂ、Ｓｈａｌ、Ｓｈａｗ、ＥａｇおよびＳｌｏにより大部分がコードされる。酵母でのこれらのカリウムチャンネルの発現は新規の殺虫化合物のスクリーニングアッセイへのそれらの導入を可能にし、また、それらのイオンチャンネルの性質ならびに活性化および阻害性の特性をもつ化合物への感受性の特徴づけを容易する。ドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogaster)カリウムチャンネルをコードするＤＮＡ配列を、５’にHind IIIもしくはKpn I切断部位、および３’にXba I、Sph IもしくはXho I切断部位を添加する合成オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲにより増幅した：ＰＣＲ反応の鋳型として使用されたプラスミドは：ｐＢＳｃ−ＤｓｈａｋｅｒＨ３７、ｐＢＳｃ−ｄＳｈａｂ１１、ｐＢＳｃ−ｄＳｈａｌ２＋（Ａ）₃₆、ｐＢＳｃＭＸＴ−ｄＳｈａｗ［ウェイ(A．Wei)、コヴァルビアス(M．Covarrubias)、バトラー(A．Butler)、ベイカー(K．Baker)、パク(M．Pak)、サルコフ(L．Salkoff )、サイエンス(Science)248、599-603(1990)、サルコフ(L．Salkoff)により提供される］、ｐＢＳｃＭＸＴ−ｓｌｏ，ｖ４［アトキンソン(N.S．Atkinson)、ロバートソン(G． A．Robertson)、ガネツキー(B．Ganetzky)、サイエンス(Science)253、551-555( 1991)、サルコフ(L．Salkoff)により提供される］、およびｐＢＩＭＣＨ２０Ｅａｇ［ＣＨ２０］［ヴァルムケ(J．Warmke)、ドライスデール(R．Drysdale)、ガネツキー(B．Ganetzky)、サイエンス(Science)252、1560-1564(1991)、ブルッゲマン(A．Bruggemann)、パルド(L.A．Pardo)、シュトゥーマー(W．Stuhmer)、ポングズ(O．Pongs)、ネイチャー(Nature)365、445-448(1993)、ガネツキー(B． Ganetzky)により提供される］。増幅された断片を適切な制限エンドヌクレアーゼで切断し、ジーンクリーン(G eneclene)（バイオ(Bio)１０１）を使用して精製し、そしてｐＹＥＳ２（インヴィトロジェン(Invitrogen)）中の対応する切断部位に連結した。ＣＹ１６２細胞は、組み立てたドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogaster)カリウムチャンネル発現プラスミドで塩化リチウム法により形質転換し、そして0.1M 塩化カリウム含有ＳＣＤ−ｕｒａ寒天培地上で培養した。選択された形質転換体は、１−５mMの塩化カリウムを含有するアルギニン−リン酸−ガラクトース（２％）／ショ糖（0.2％）−ｕｒａ寒天培地上での増殖を試験した。ｐＫＡＴ１もしくはｐＤｍＯＲＦ１を含有するＣＹ１６２細胞をポジティブコントロールとして培養し、また、ｐＹＥＳ２含有ＣＹ１６２細胞をネガティブコントロールを供給するために増殖した。ドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogaster)カリウムチャンネル発現プラスミドをもつＣＹ１６２細胞は、増殖が機能的カリウムチャンネルの発現に依存する条件下で生存する。１−３mMの間のカリウムイオン濃度では、ネガティブコントロールのｐＹＥＳ２含有ＣＹ１６２細胞は不十分に増殖する。ドロソフィラメラノガスター(Drosophila me lanogaster)カリウムチャンネルＳｈａｌ、ＳｈａｗおよびＥａｇの発現はＣＹ１６２の増殖を本質的に改善する。これらの結果は高親和性のカリウム取り込み能力を提供するドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogaster)カリウムチャンネルと矛盾しない。この能力は、ＣＹ１６２（ｔｒｋ１ｔｒｋ２）細胞が欠いているＴＲＫ１によりコードされる本来の高親和性のカリウム移送能力に取って換わるのに見たところ十分である。実施例１４カリウムチャンネルとの相同性をもつ新規のＣ．エレガンス(C．elegans)配列のクローニング。この技術の適用性を新規の駆虫活性をもつ化合物を発見するのに発展させるため、ＣＹ１６２細胞を、Ｃ．エレガンス(C．elegans)ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ（インヴィトロジェン(Invitrogen)）を使用して構築したｐＹＥＳ２に基づく酵母発現ライブラリーで形質転換した。実施例１に記述される選択計画を生き残った酵母細胞から単離したプラスミドＤＮＡを、高温サイクルシークェンシング（アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)により実行される自動ＤＮＡ配列分析にかけた。ジーンワークス(Geneworks)ＤＮＡ配列分析ソフトウェア（インテリジェネティクス(Intelligenetics)）を使用して未処理のＤＮＡ配列情報を整列しそして読み取り枠を同定する。ｐＣＯＲＫ中の1.4kbの挿入物のＤＮＡ配列が第９図に表される。当該ｃＤＮＡの５’非翻訳配列はこの構築物中に存在する。434アミノ酸のタンパク質（予測される分子量48kDa）をコードするのに十分なただ１個の長い読み取り枠がｐＣＯＲＫ中に予測される［配列番号３８］。コンセンサスポリアデニル酸化部位ＡＡＴＡＡＡは３’非翻訳配列中の位置1359−1364に存在し、また、その後に15個の連続するＡ残基の広がりがある。ＣＯＲＫのＯＲＦはカリウムチャンネル中に見出される孔形成Ｈ５ドメインに似た構造的特徴を含有する。２個の推定の孔形成Ｈ５ドメイン（残基76−39および150−162）がカリウム選択性に必要とされるＧ−Ｙ／Ｆ−Ｇトリペプチドモチーフを含有する［ヘギンボタム(L． Heginbotham)、アブラムソン(T．Abramson)、マッキノン(R．MacKinnon)、サイエンス(Science)258、1152-1155、(1992)］。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:865） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ｉ）第一の孔形成ドメインが第一および第二の膜貫通ヘリックスの間に挿入され、かつ（ii）第二の孔形成ドメインが第三および第四の膜貫通ヘリックスの間に挿入される、膜貫通ヘリックスを形成することが可能な４個の疎水性ドメインを含むカリウムチャンネル。２．各孔形成ドメインがカリウム選択的ペプチドモチーフを含む、請求の範囲１のカリウムチャンネル。３．当該ペプチドモチーフがＹ／Ｆ−ＧジペプチドモチーフおよびＧ−Ｙ／Ｆ− Ｇトリペプチドモチーフから成るグループから選択される、請求の範囲２のカリウムチャンネル。４．少なくとも１個の孔形成ドメインが細胞膜の外側部分に近接して配置される、請求の範囲３のカリウムチャンネル。５．さらにアミノ末端のグルコシル化部位を含む、請求の範囲４のカリウムチャンネル。６．前述のグリコシル化部位がアスパラギンに連結される、請求の範囲５のカリウムチャンネル。７．無脊椎動物のクラスに属することを特徴とする、請求の範囲６のカリウムチャンネル。８．昆虫由来であることを特徴とする、請求の範囲７のカリウムチャンネル。９．線中由来であることを特徴とする、請求の範囲７のカリウムチャンネル。１０．ＤｍＯＲＦ−１をコードすることが可能な単離されたヌクレオチド配列。１１．配列番号１に表されるヌクレオチド配列を含む、請求の範囲１０の単離されたヌクレオチド配列。１２．ＣＯＲＫをコードすることが可能である単離されたヌクレオチド配列。１３．配列番号３６に表されるタンパク質をコードする、請求の範囲１２の単離されたヌクレオチド配列。１４．請求の範囲１０のヌクレオチド配列を含む酵母細胞の細胞膜で異種性カリウムチャンネルを発現することが可能な発現ベクター。１５．請求の範囲１１のヌクレオチド配列を含む酵母細胞の細胞膜で異種性カリウムチャンネルを発現することが可能な発現ベクター。１６．請求の範囲１２のヌクレオチド配列を含む酵母細胞の細胞膜で異種性カリウムチャンネルを発現することが可能な発現ベクター。１７．当該カリウムチャンネルが請求の範囲１３のアミノ酸配列を含む、酵母細胞の細胞膜で異種性カリウムチャンネルを発現することが可能な発現ベクター。１８．請求の範囲１０、１１、１２もしくは１３のヌクレオチド配列を含む、形質転換された酵母細胞。１９．請求の範囲１４、１５、１６もしくは１７の発現ベクターを含む、形質転換された酵母細胞。２０．細胞増殖に対する影響を決定する物質のアッセイ方法であって、ａ．ウラシルを欠く液体培地で酵母細胞の培養系を調製する；当該液体培地はカリウム依存性変異株の増殖を援助するのに十分な塩化カリウム濃度から成る；ｂ．当該酵母細胞をウラシルを含まない寒天培地で培養する；当該寒天培地は請求の範囲１の異種性カリウムチャンネルを含有するカリウム依存性変異株の増殖を選択的に援助するのに十分な塩化カリウムから成る：ｃ．当該寒天プレートに物質を適用する、ｄ．当該寒天プレートをインキュベートして増殖させる、そして、ｅ．増殖のレベルが、異種性カリウムチャンネルの活性がコントロールと比較して調整されるかどうかを指摘する、当該物質周辺の増殖帯を明らかにする、の段階を含む方法。２１．さらにＲＡＫをコードするヌクレオチド配列、または請求の範囲１０、１１、１２もしくは１３のヌクレオチド配列を含む、請求の範囲２０の酵母細胞。２２．前述の細胞増殖に対する影響がカリウムチャンネルの活性化により調整される、請求の範囲２０の方法。２３．前述の細胞増殖に対する影響がカリウムチャンネルの阻害により調整される、請求の範囲２０の方法。２４．請求の範囲１０のヌクレオチド配列によりコードされるカリウムチャンネルに本質的に相同なカリウムチャンネルを阻害することが可能な物質を害虫に適用することによる、そうした害虫の選択的な阻害方法。２５．請求の範囲１２のヌクレオチド配列によりコードされるカリウムチャンネルに本質的に相同なカリウムチャンネルを阻害することが可能な物質を線虫の害虫に適用することによる、そうした害虫の選択的な阻害方法。２６．カリウムイオンがカリウムチャンネルを通過する能力を阻害するのに十分な量および時間、細胞膜をある物質と接触させることによる、前述の細胞膜中に配置され、かつ、配列番号２、配列番号４、および配列番号３６から成るグループから選択されるアミノ酸配列を含む前述のチャンネルの活性の調整方法。