ITTO20060790A1 - Uso di derivati dell'acido para-cumarico o dell'acido para-idrossicinnamico in composizioni cosmetiche o dermatologiche - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell’invenzione industriale dal titolo:

“Uso di derivati dell’acido para-cumarico o dell’acido para-idrossicinnamico in composizioni cosmetiche o dermatologiche”,

di: ENGELHARD LYON, nazionalità francese, 32, rue Saint Jean-de-Dieu, 69007 Lyon (Francia), e UNIVERSITE JOSEPH FOURIER-GRENOBLE 1, nazionalità francese, BATIMENT ADMINISTRATIF, 621 Avenue Centrale BP 53, DOMAINE UNIVERSITAIRE DE SAINT-MARTIN D’HYERES-GIERES, 38041 GRENOBLE CEDEX 09 (Francia).

Inventori designati: Sabrina OKOMBI ; Delphine RI-VAL; Ahcène BOUMENDJEL; Anne-Marie MARIOTTE; Eric J.L. PERRIER.

Depositata il: 7 Novembre 2006

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DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce particolarmente all’utilizzazione di almeno un derivato dell’acido p-cumarico, come agente cosmetico o per la preparazione di una composizione farmaceutica, specialmente dermatologica, con attività depigmentante o con effetto inibitore della melanogenesi, e/oppure con attività anti-radicalica e/oppure anti-infiammatoria.

L’invenzione si riferisce pure a composizioni

F C/em cosmetiche o a composizioni farmaceutiche, in particolare dermatologiche, così ottenute, con attività depigmentante o con effetto inibitore della melanogenesi e/oppure con attività anti-radicalica e/oppure anti-infiammatoria.

L’invenzione si riferisce inoltre ad un procedimento di trattamento cosmetico o un procedimento di trattamento terapeutico di depigmentazione che utilizza derivati di acido p-cumarico come agenti attivi per la depigmentazione.

L’invenzione si riferisce inoltre ad un procedimento di trattamento cosmetico o un procedimento di trattamento terapeutico per ottenere un effetto anti-radicalico e/oppure anti-infiammatorio utilizzando derivati dell’acido p-cumarico precedentemente citati.

STATO DELLA TECNICA

Per lottare contro l’irradiazione solare, la pelle possiede cellule differenziate particolarmente adattate a questo scopo: i melanociti. Durante un procedimento complesso, la melanogenesi, questi producono un pigmento scuro, la melanina, che ha l’effetto di proteggere le strutture cutanee e prolungare i tempi necessari per contrarre un eritema solare. Tuttavia, non tutte le melanine sono protettrici ed esiste in particolare una forma di melanina, denominata feomelanina, che è estremamente fototossica. Come tutte le melanine è in grado di reagire con certe forme di radicali liberi, e provoca la formazione di radicali liberi ancora più tossici, in grado di provocare danni irreversibili sul materiale genetico dei cheratinociti. D’altra parte, certi disturbi legati ad una disfunzione dell’unità di melanizzazione possono provocare una iperpigmentazione talvolta particolarmente antiestetica.

Così, l’utilizzazione di inibitori della sintesi di melanina è particolarmente interessante in cosmetologia, non solamente in impieghi in cui si ricerca, per esempio, una autentica depigmentazione come nel caso dello schiarimento della pelle fortemente pigmentata o l’inibizione dell’iperpigmentazione in certi aspetti antiestetici, ma anche per impieghi che tendono a schiarire il colore, dare luminosità alla pelle e freschezza ai tessuti superficiali. Questa inibizione della sintesi della melanina può essere pure particolarmente interessante nel quadro del trattamento terapeutico per una autentica patologia.

Gli acidi para-cumarico o para-idrossicinnamico sono stati descritti come inibitori della produzione di melanina in vari lavori. Tuttavia, queste sostanze non permettono di ottenere effetti inibitori significativi della sintesi della melanina. Questa attività troppo debole non permette di ottenere effetti sufficientemente potenti e queste sostanze sono quindi assai poco utilizzate in impieghi cosmetici o farmaceutici per via topica, che permettono di lottare efficacemente contro le pigmentazioni indesiderate.

Lo stato della tecnica menziona in particolare l’utilizzazione della vitamina C (o suoi derivati) o dell’acido cogico (o suoi derivati) come inibitori della tirosinasi, tuttavia queste molecole sono sia citotossiche alla concentrazione utilizzata, sia poco efficaci. In particolare è nota l’utilizzazione dell’acido ferulico o dell’acido caffeico come agente depigmentante in composizioni cosmetiche. Tuttavia queste composizioni non danno una soddisfazione completa dal punto di vista dell’efficacia dell’azione depigmentante.

OGGETTI DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si pone quindi come oggetto essenziale la soluzione del problema tecnico consistente nel fornire un agente depigmentante più attivo di quelli abitualmente utilizzati, come per esempio l’acido caffeico o l’acido ferulico.

Oggetto della presente invenzione è pure quello di fornire composizioni che utilizzano questi agenti depigmentanti, metodi di cura cosmetica e/ oppure trattamento farmaceutico che utilizzano questi agenti depigmentanti, nonché l’utilizzazione di questi agenti depigmentanti per esercitare una attività anti-radicalica e/oppure anti-infiammatoria.

Oggetto della presente invenzione è pure quello di fornire composizioni i cui composti attivi sono estratti da vegetali.

Oggetto della presente invenzione è pure quello di fornire composizioni utilizzabili per via topica.

Oggetto della presente invenzione è pure quello di fornire agenti depigmentanti che permettano di lottare contro l’iperpigmentazione della pelle, in particolare per ragioni estetiche, principalmente quando la pelle presenta almeno una zona localizzata iperpigmentata.

Oggetto della presente invenzione è pure quello di risolvere i problemi tecnici summenzionati in modo sicuro, affidabile e particolarmente evitando gli effetti secondari indesiderabili, specialmente nell’uomo, per esempio diminuendo la tossicità degli agenti attivi utilizzati.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

Gli inventori hanno risolto questo problema sintetizzando nuovi derivati chimici dell’acido para-cumarico, ed in particolare dell’acido caffeico o dell’acido ferulico, oppure, in certi casi, derivati ibridi di queste due molecole. L’effetto inibitore della sintesi della melanina delle molecole così descritte è estremamente forte, il profilo tossicologico di queste molecole è perfetto per impieghi cosmetici e dermofarmaceutici, e l’incorporazione di queste sostanze in formulazioni cosmetiche o farmaceutiche è possibile senza incontrare alcun problema grave. Queste sostanze sono quindi adatte nel quadro di applicazioni cosmetiche e farmaceutiche.

D’altronde, confrontando l’effetto depigmentante delle sostanze così ottenute, che sono specialmente derivati dell’acido para-cumarico innestati su derivati di tirammina, dopammina o tirosolo, con l’effetto dei composti derivati dall’acido para-cumarico come acido caffeico o acido ferulico, in miscela con la tirammina, la dopammina o il tirosolo, gli inventori hanno constatato in modo del tutto sorprendente che l’attività dei composti della presente invenzione è nettamente superiore a quella delle miscele suddette.

L’invenzione si riferisce quindi all’utilizzazione di una quantità efficace di un almeno un composto derivato dall’acido para-cumarico di formula generale (I) seguente:

in cui:

Z rappresenta un ossigeno o un gruppo –NH-;

X e Y sono identici e rappresentano ciascuno un gruppo CH (cis oppure trans) oppure CH2;

n è un numero, preferibilmente un numero intero, variabile da 1 a 12;

Ra e Rb sono identici o diversi, di preferenza identici e rappresentano un atomo di idrogeno, un gruppo acile lineare o ramificato, di preferenza C1-

12, un alchile lineare o ramificato, saturo o meno, di preferenza C1-12; un gruppo solfonile (SO3H) salificato o meno, oppure un gruppo fosfonato (PO3H2) salificato o meno; ORa e/oppure ORb possono essere in presenza di una base sottoforma dissociata, per esempio sottoforma O- Na+;

R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7e R8rappresentano, indipendentemente gli uni dagli altri: un atomo di idrogeno; un gruppo ossidrile; un atomo di alogeno; un funzione acida salificata o meno; una funzione aldeide; una funzione ammide; una funzione ammina (primaria, secondaria o terziaria) sottoforma basica o salificata; un gruppo ciano; un gruppo tiolo; un gruppo nitro; uno zucchero (O-eteroside); un gruppo alchilato lineare o ramificato, di preferenza C1-12; una catena alchilica lineare o ramificata, di preferenza C1-12; una catena alchenilica lineare o ramificata, di preferenza C1-12; una catena tioalchilica lineare o ramificata, di preferenza C1-12; una catena alcossilica lineare o ramificata, di preferenza C1-12; una catena alchenilossilica, di preferenza C1-12; un gruppo solfato salificato o meno; un gruppo solfonile salificato o meno; un gruppo fosfonato salificato o meno; un gruppo fosfato salificato o meno; un gruppo silanolo; in cui le catene di atomi di carbonio, preferibilmente C1-12, possono essere sostituite;

come principio attivo in una composizione cosmetica o farmaceutica, vantaggiosamente applicata per via topica.

Vantaggiosamente, i composti utilizzati sono i composti trans, sebbene l’invenzione copra ugualmente i composti cis oppure una miscela cis/trans, che comprende di preferenza più composti trans.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

In quanto segue, i gruppi identificati in modo generale (Ra, Rb, R1, R2, ecc.) si riferisco a qualsiasi formula comprendente detti gruppi ed in particolare alla formula generale (I). Così, ogni combinazione che possa essere realizzata partendo dai modi di realizzazione vantaggiosi, è coperta dalla presente invenzione.

Vantaggiosamente, la presente invenzione si riferisce all’utilizzazione di una quantità efficace di almeno un composto derivato da acido paracumarico di formula generale (I) come precedentemente, definito, come agente depigmentante oppure come principio attivo con attività anti-radicalica oppure anti-infiammatoria in una composizione cosmetica.

Vantaggiosamente, Ra e Rb rappresentano, ciascuno indipendentemente, un atomo di idrogeno, un gruppo acile lineare o ramificato C1-12, un gruppo solfonile (SO3H) salificato o meno; un gruppo fosfonato (PO3H2) salificato o meno e di preferenza un atomo di idrogeno.

Vantaggiosamente, derivati preferiti sono rappresentati dalla formula chimica (II) in cui i gruppi da R1a R8, X, Y, Z e n rappresentano gli elementi citati nella formula generale I:

Vantaggiosamente, i derivati preferiti sono rappresentati dalla formula chimica III in cui i gruppi R2, R3, R6e R7, X, Y, Z e n rappresentano gli elementi citati nella formula generale I:

Di preferenza, l’invenzione copre i derivati dell’acido para-cumarico, denominati derivati di acido ferulico, che rispondono alla formula generale I in cui:

Ra, Rb, R1, R4, R5e R8rappresentano preferibilmente un idrogeno,

R3rappresenta preferibilmente un gruppo metossile e R2è un idrogeno,

X e Y rappresentano ciascuno un gruppo CH e n è uguale a due.

Questi derivati possono essere rappresentati dalle formule seguenti (IVa e IVb) in cui R6e R7, rappresentano gli elementi citati nella formula generale I:

Nelle formule precedenti, IVa e IVb, R6e R7sono preferibilmente idrogeno, il che corrisponde ai due derivati rappresentati dalle formule IVa1 e IVb1 seguenti:

Preferibilmente, i composti egualmente interessati nella presente invenzione sono derivati dell’acido para-cumarico denominati derivati di acido caffeico, corrispondenti alla formula generale I, in cui:

Ra e Rb, R1, R2, R4, R5e R8rappresentano preferibil mente un idrogeno,

R3rappresenta preferibilmente un ossidrile e R2è un idrogeno,

X e Y rappresentano ciascuno un gruppo CH e n è uguale a due.

Questi derivati sono rappresentati dalle formule seguenti (Va e Vb) in cui R6e R7, rappresentano gli elementi citati nella formula generale I:

Nelle formule Va e Vb, R6e R7sono preferibilmente idrogeno, il che corrisponde ai due derivati rappresentati dalle formule Va1 e Vb1 seguenti:

L’invenzione si riferisce pure a derivati di acido para-cumarico che corrispondono alla formula generale I, in cui:

i sostituenti Ra, Rb, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7e R8rappresentano un idrogeno e n è preferibilmente uguale a due.

Vantaggiosamente, R1, R2, R4, R5e R8rappresentano un idrogeno.

Vantaggiosamente, i sostituenti R2e R3vengono scelti tra un gruppo ossidrile, eventualmente sottoforma salificata, o metossile ed un atomo di idrogeno.

Vantaggiosamente, i sostituenti R6e R7vengono scelti tra un gruppo ossidrile, eventualmente sottoforma salificata, o metossile ed un atomo di idrogeno.

Preferibilmente n è uguale a due.

Vantaggiosamente, i sostituenti R6e R7vengono scelti tra un gruppo ossidrile, eventualmente sottoforma salificata, ed un atomo di idrogeno.

Secondo una prima forma di realizzazione, i derivati dell’acido para-cumarico sono derivati di acido ferulico, in cui:

Ra, Rb, R1, R2e R4, rappresentano preferibilmente un atomo di idrogeno.

R3rappresenta preferibilmente un gruppo metossile; X e Y rappresentano ciascuno un gruppo CH e n è uguale a due;

questi derivati potendo essere rappresentati dalle formule seguenti (IIa e IIb):

in cui:

R5, R6, R7e R8hanno gli stessi significati precedentemente indicati.

Vantaggiosamente, nelle formule IIa e IIb, R5, R6, R7e R8rappresentano ciascuno un atomo di idrogeno.

Secondo un secondo modo di realizzazione, nelle formule IIa e IIb, R5, R6, R8rappresentano ciascuno un atomo di idrogeno e R7rappresenta un gruppo ossidrile, il che corrisponde a due derivati rappresentati dalle formule seguenti:

Vantaggiosamente, i derivati dell’acido paracumarico sono derivati dell’acido caffeico, in cui: Ra, Rb, R1, R2e R4, rappresentano preferibilmente un atomo di idrogeno;

R3 rappresenta preferibilmente un gruppo ossidrile; X e Y rappresentano ciascuno un gruppo CH e n è uguale a due;

questi derivati possono essere rappresentati dalle seguenti formule (IIIa e IIIb):

in cui:

R5, R6, R7e R8hanno gli stessi significati precedentemente indicati.

Vantaggiosamente, nelle formule IIIa e IIIb, R5, R6, R7e R8rappresentano ciascuno un atomo di idrogeno.

Vantaggiosamente, nelle formule IIIa e IIIb, R5, R6, R8rappresentano ciascuno un atomo di idrogeno e R7rappresenta un gruppo ossidrile, il che corrisponde ai due derivati rappresentati dalle formule seguenti IIIa1 e IIIb2:

Vantaggiosamente, i sostituenti Ra, Rb, R1, R2, R4, R5, R6, R7e R8rappresentano ciascuno un atomo di idrogeno,

R3rappresenta un gruppo ossidrile,

n è uguale a due,

questi derivati possono essere rappresentati dalle seguenti formule (VIa e VIb) in cui X e Y sono gruppi CH oppure CH2:

Secondo un modo di realizzazione vantaggioso, il composto viene estratto da un vegetale, detto estratto comprendendo di preferenza un composto scelto tra:

In particolare in cosmetica è vantaggioso utilizzare composti naturali, specialmente derivati da vegetali, così da garantire per gli utilizzatori la provenienza sana dei composti attivi utilizzati. L’esperto del campo conosce pure i differenti vantaggi di utilizzare i composti naturali estratti da vegetali.

È vantaggioso ottenere un estratto di vegetali utilizzati come materia prima partendo da un solvente di preferenza polare, e preferibilmente acqua, una miscela acqua/alcol o poliolo, come una miscela acqua/glicole oppure acqua/etanolo, oppure un poliolo, oppure un alcol come l’etanolo. È anche possibile acetato di etile o acetone oppure una qualsiasi miscela dei solventi precedentemente citati. L’estratto viene di preferenza filtrato e quindi essiccato. È pure possibile eseguire l’estrazione con un riscaldamento moderato come ad esempio a 45°C. L’estrazione viene eseguita di preferenza sotto agitazione. I procedimenti di estrazione sono ben noti dagli esperti. La parte dei vegetali utilizzata può variare a seconda dell’estratto da ottenere.

L’invenzione si riferisce in particolare all’utilizzazione dei composti summenzionati per esercitare una attività depigmentante oppure un effetto inibitore della melanogenesi, in particolare per applicazione topica su almeno una zona del tessuto cutaneo di un soggetto.

L’invenzione si riferisce in particolare all’utilizzazione dei composti summenzionati per diminuire la pigmentazione di detta zona del tessuto cutaneo.

L’invenzione si riferisce pure ad un procedimento di cura cosmetica, comprendente l’applicazione topica di una composizione come quella precedentemente definita.

Vantaggiosamente, la cura cosmetica permette di diminuire la pigmentazione della pelle a livello della zona di applicazione.

L’invenzione si riferisce inoltre alla formulazione di composizioni cosmetiche comprendenti i composti summenzionati.

L’invenzione si riferisce pure all’utilizzazione di una quantità utile di almeno un composto come quelli definiti precedentemente per la preparazione di una composizione farmaceutica destinata ad esercitare una attività depigmentante oppure un effetto inibitore della melanogenesi, in particolare per applicazione topica su almeno una zona del tessuto cutaneo di un soggetto che presenta una iperpigmentazione.

L’invenzione si riferisce pure all’utilizzazione di una quantità efficace di almeno un composto come quello precedentemente definito per la preparazione di una composizione cosmetica o farmaceutica destinata ad esercitare una attività antiradicalica e/oppure anti-infiammatoria. In effetti, per la loro attività anti-radicalica, i composti dell’invenzione possono ridurre la molecola di L-Dopa così da rallentare la sua ossidazione a composto cromoforo. Per la loro forte attività antiradicalica, i composti dell’invenzione sono composti anti-infiammatori: in effetti, i radicali liberi generati a seguito di uno stress da UV oppure altro, inducono la cascata dell’infiammazione. È per questo che i composti che hanno proprietà antiradicaliche inibiscono la cascata dall’infiammazione.

L’invenzione si riferisce in particolare ai composti preferiti seguenti, che vengono esemplificati in modo specifico.

Tuttavia altri scopi, caratteristiche e vantaggi dell’invenzione appariranno evidenti all’esperto dalla lettura della descrizione esplicativa che fa riferimento agli esempi che vengono forniti solamente a titolo di illustrazione e che non intendono in alcun modo limitare la portata dell’invenzione.

Gli esempi costituiscono parte integrante della presente invenzione ed ogni caratteristica che si presenta come nuova rispetto ad uno stato della tecnica anteriore qualsiasi, partendo dalla descrizione presa nel suo insieme, compresi gli esempi, costituisce parte integrante dell’invenzione nella sua funzione e nella sua generalità.

Così, ciascun esempio ha una portata generale. Negli esempi tutte le percentuali sono indicate in peso, salvo indicazione contraria, e la temperatura è espressa in gradi Celsius, salvo indicazione contraria, e la pressione corrisponde alla pressione atmosferica, salvo indicazione contraria.

ESEMPI

I-Derivati di acido ferulico (4-idrossi-3-metossicinnamico)

Esempio 1: N trans-feruloildopammina (SO-I-146):

Una soluzione di acido ferulico (300 mg; 1,54 mmoli) e di trietilammina (1,5 eq; 2,31 mmoli) in DMF (3,5 ml) viene raffreddata a 3 oppure 4°C in bagno di ghiaccio. A questa si aggiunge una ammina, 3-idrossitirammina (dopammina) (1 eq; 1,54 mmoli) seguita da una soluzione di BOP (benzotriazol-1-ilossi)tris(dimetilammino)fosfonio esafluorofosfato; (1 eq; 1,54 mmoli) in 3,5 ml di diclorometano; il tutto viene agitato per una trentina di minuti nel bagno di ghiaccio, quindi per venti ore a temperatura ambiente. L’agitazione viene interrotta ed il diclorometano viene evaporato sottovuoto. Alla soluzione rimanente si aggiungono 30 ml di acqua e la miscela viene estratta con acetato di etile (3x75 ml). La fase organica viene successivamente lavata con 100 ml di una soluzione di HCl 1N, 100 ml di acqua e 100 ml di una soluzione 1M di bicarbonato di sodio (NaHCO3). La soluzione viene poi seccata su solfato di sodio ed evaporata a secco.

Il prodotto viene ottenuto sottoforma di precipitato bianco dopo purificazione cromatografica su colonna di gel di silice.

Esempio 2: N-trans-feruloil-3,4-dimetossidopammina:

Il protocollo ottenuto dall’esempio 1 viene applicato con l’acido ferulico e la 2-(3,4-dimetossifenil)etilammina in luogo dell’acido ferulico e dopammina; il composto ottenuto è la N-transferuloil-3,4-dimetossidopammina.

Esempio 3: N-trans-feruloiltirammina:

Il protocollo ottenuto dall’esempio 1 viene applicato con l’acido ferulico e tirammina in luogo di acido ferulico e dopammina; il composto ottenuto è la N-trans-feruloiltirammina.

Esempio 4: N-trans-feruloil-4-idrossi-3-metossifenilmetilammina:

Il protocollo ottenuto dall’esempio 1 viene applicato con l’acido ferulico e la 4-idrossi-3-metossibenzilammina in luogo di acido ferulico e dopammina; il composto ottenuto è la N-trans-feruloil-4-idrossi-3-metossifenilmetilammina.

Esempio 5: N-diidroferuloiltirammina:

Il protocollo ottenuto dall’esempio 1 viene applicato con l’acido diidroferulico e tirammina in luogo di acido ferulico e dopammina; il composto ottenuto è la N-diidroferuloiltirammina.

Esempio 6: N-diidroferuloildopammina:

Il protocollo ottenuto dall’esempio 1 viene applicato con l’acido diidroferulico e 3-idrossitirammina in luogo di acido ferulico e dopammina; il composto ottenuto è la N-diidroferuloildopammina.

Esempio 7: sintesi di un estere dell’acido ferulico: trans-ferulato di 2-(p-idrossifeniletile):

L’acido ferulico (4-idro-3-metossicinnamico, 250 mg, 1,28 mmoli) viene disciolto in 10 ml di diclorometano, quindi si aggiunge DMAP (dimetilammi nopiridana, 157 mg; 1,28 mmoli). Dopo solubilizzazione dei due prodotti, si aggiunge tirosolo (353,7 mg; 2,56 mmoli) e quindi EDCI [1-(3-dimetilamminopropil)-3-etilcarbodiimmide; 368 mg; 1,92 mmoli]. La miscela ottenuta viene agitata per 20 ore a temperatura ambiente. Il mezzo di reazione viene poi diluito con acetato di etile (32 ml) e acqua (6 ml). La fase organica viene separata dalla fase acquosa che viene nuovamente estratta con acetato di etile. Le fasi organiche vengono riunite, essiccate su solfato di magnesio, lavate con soluzione satura di NaCl ed evaporate a secco. Il prodotto viene ottenuto sottoforma di precipitato bianco dopo cromatografia su colonna di silicagel utilizzando una miscela di acetato di etile 5/cicloesano 5.

Esempio 8: trans-ferulato di 2-(3,4-diidrossifeniletile):

Il protocollo ottenuto dall’esempio 1 viene applicato con l’acido ferulico e 3-idrossitirosolo in luogo di acido ferulico e tirosolo; il composto ottenuto è il trans-ferulato di 3,4-diidrossifeniletile (formula IVb2).

II- Derivati di acido caffeico (3,4-diidrossicinnamico)

Esempio 9: N-trans-caffeiltirammina:

Una soluzione di acido caffeico (300 mg; 1,66 mmoli) e di trietilammina (1,5 eq; 2,49 mmoli) in DMF (3,5 ml) viene raffreddata a 4°C per mezzo di un bagno di ghiaccio. Si aggiunge una ammina, la tirammina (1 eq; 1,66 mmoli) seguita da una soluzione di BOP (benzotriazol-1-ilossi)tris(dimetilammino)fosfonio esafluorofosfato, (1 eq; 1,66 mmoli) in diclorometano (3,5 ml); il tutto viene agitato per una trentina di minuti in bagno di ghiaccio, quindi per venti ore a temperatura ambiente. L’agitazione viene poi interrotta ed il diclorometano viene evaporato sottovuoto. Alla soluzione rimanente si aggiungono 30 ml di acqua e la miscela viene estratta con acetato di etile (3x75 ml). La fase organica viene successivamente lavata con 100 ml di una soluzione di HCl 1N, 100 ml di acqua e 100 ml di una soluzione 1M di bicarbonato di sodio (Na-HCO3). La soluzione viene poi essiccata su solfato di sodio ed evaporata a secco.

Il prodotto viene ottenuto sottoforma di un precipitato bianco dopo purificazione cromatografi ca su colonna di gel di silice.

Esempio 10: N-trans-caffeildopammina:

Si adotta lo stesso protocollo dell’esempio 9 con l’acido caffeico e la 3-idrossitirammina (dopammina) in luogo di acido caffeico e tirammina; il composto ottenuto è la N-trans-caffeildopammina.

Esempio 11: N-trans-caffeil-4-idrossi-3-metossifenilmetilammina:

Si adotta lo stesso protocollo dell’esempio 9 con l’acido caffeico e 4-idrossi-3-metossibenzilammina in luogo di acido caffeico e tirammina; il composto ottenuto è la N-trans-caffeil-4-idrossi-3-metossifenilmetilammina.

Esempio 12: N-trans-caffeil-3,4-dimetossidopammina:

Si adotta lo stesso protocollo dell’esempio 9 con l’acido caffeico e 2-(3,4-dimetossifenil)etilammina in luogo di acido caffeico e tirammina; il composto ottenuto è la N-trans-caffeil-3,4-dimetossidopammina.

Esempio 13: diidrocaffeiltirammina:

Si adotta lo stesso protocollo dell’esempio 9 con l’acido 3-(3,4-diidrofenil)propionico e tirammina in luogo di acido caffeico e tirammina; il composto ottenuto è la diidrocaffeiltirammina.

Esempio 14: sintesi di un estere dell’acido caffeico, trans-caffeato di 2-(4-idrossifenil)etile (formula IVb1):

Si adotta lo stesso protocollo dell’esempio 7 con l’acido caffeico e tirosolo in luogo di acido ferulico e tirosolo; il composto ottenuto è il trans-caffeato di 2-(4-idrossifenil)etile (formula IVb1).

Esempio 15: trans-caffeato di 2-(3,4-diidrossifenil)etile (formula IVb2):

Si adotta lo stesso protocollo dell’esempio 14 precedente con l’acido caffeico e 3-idrossitirosolo in luogo di acido caffeico e tirosolo; il composto ottenuto è il trans-caffeato di 2-(3,4-diidrossifenil)etile (formula IVb2).

III – DERIVATI DELL’ACIDO CUMARICO (4-IDROSSI-CINNAMICO)

Esempio 16: N-diidrocumariltirammina:

Una soluzione di acido 3-(4-idrossifenil)propionico o acido p-diidrocumarico (1 g; 6,02 mmoli) e trietilammina (1,5 eq; 9,03 mmoli) in 10 ml di DMF viene raffreddata a 4°C in bagno di ghiaccio. Si aggiungono quindi una ammina, la tirammina (1 eq; 6,02 mmoli) seguita da una soluzione di BOP (benzotriazol-1-ilossi)tris(dimetilammino)fosfonio esafluorofosfato, (1 eq; 6,02 mmoli) in 10 ml di diclorometano; il tutto viene agitato per una trentina di minuti in bagno di ghiaccio, quindi per venti ore a temperatura ambiente. L’agitazione viene poi interrotta ed il diclorometano viene evaporato sottovuoto. Alla soluzione rimanente si aggiungono 100 ml di acqua e la miscela ottenuta viene estratta con acetato di etile (3x75 ml). La fase organica viene successivamente lavata con 100 ml di una soluzione di HCl 1N, 100 ml di acqua e 100 ml di una soluzione 1M di bicarbonato di sodio (Na-HCO3). La soluzione viene poi essiccata su solfato di sodio ed evaporata a secco.

Il prodotto viene ottenuto sottoforma di un precipitato bianco dopo purificazione cromatografica su colonna di gel di silice.

Esempio 17 (estere dell’acido para-cumarico): trans-cumarato di 2-(4-idrossifenil)etile:

Si adotta il protocollo dell’esempio 7 con acido p-cumarico e tirosolo in luogo di acido ferulico e tirosolo; il composto ottenuto è il transcumarato di 2-(4-idrossifenil)etile (formula VIb, X e Y sono gruppi CH)

Esempio 18: diidrocumarato di 2-(4-idrossifenil)etile:

Si adotta il protocollo dell’esempio 7 precedente con acido p-diidrocumarico (o acido floretico) e tirosolo in luogo di acido ferulico e tirosolo; il composto ottenuto è il diidrocumarato di 2-(4-idrossifenil)etile (formula VIb, X e Y sono gruppi CH2).

Esempio 19: N-3-(4-fosfatofenil)propanoil-2-(4- fosfatofenil)etilammina:

Il prodotto dell’esempio 16 (180 mg; 0,63 mmoli) ed idruro di sodio (37,8 mg; 1,57 mmoli; 2,5 eq) vengono dispersi in 4 ml di DMF anidra (2 ml) sotto argo. La miscela ottenuta viene agitata energicamente per 30 minuti a 0°C, quindi si aggiunge 1 ml di una soluzione di cloruro di dietilfosfato (273 μl, 3 eq) in 1 ml di DMF. Si prosegue l’agitazione per una intera notte. Il mezzo di reazione viene versato in 10 ml di acqua ghiacciata ed estratto con acetato di etile (2x10 ml). La fase organica viene essiccata su solfato di sodio ed evaporata a secco ottenendo un residuo limpido.

Il residuo ottenuto (300 mg) viene disciolto in 3 ml di diclorometano anidro e la soluzione ottenuta viene raffreddata a 0°C. Si aggiunge un eccesso di bromuro di trimetilsilile (1 ml) goccia a goccia sotto agitazione e si prosegue l’agitazione per 4 ore a temperatura ambiente. Il solvente viene poi evaporato sottovuoto. Il prodotto viene ottenuto sottoforma di precipitato bianco dopo purificazione cromatografica a fase inversa acqua 85/metanolo 15 e liofilizzazione delle frazioni della colonna.

Esempio 20: N-trans-3-(3-metossi-4-fosfatofenil)propenoil-2-(4-fosfatofenil)etilammina:

Si adotta il protocollo dell’esempio 19 per il prodotto ottenuto dall’esempio 1; il composto ottenuto è N-trans-3-(3-metossi-4-fosfatofenil)propenoil-2-(4-fosfatofenil)etilammina.

Esempio 21: N-trans-3-(3,4-difosfatofenil)propenoil-2-(4-fosfatofenil)etilammina:

Si adotta il protocollo dell’esempio 19 al prodotto ottenuto dall’esempio 9; il composto ottenuto è N-trans-3-(3,4-difosfatofenil)propenoil-2-(4-fosfatofenil)etilammina.

Esempio 22: N-trans-3-(3-metossi-4-solfatofenil)propenoil-2-(4-solfatofenil)etilammina:

Ad una soluzione del prodotto ottenuta dall’esempio 3 (150 mg; 0,455 mmoli) in 2 ml di DMF si aggiunge un complesso di piridina e triossido di zolfo (2,73 mmoli; 6 eq). La soluzione ottenuta viene agitata per 20 ore a temperatura ambiente quindi si aggiungono 4 ml di una soluzione acquosa di bicarbonato di sodio.

Il prodotto viene ottenuto sottoforma di precipitato bianco dopo purificazione cromatografica su colonna a fase inversa (acqua).

Esempio 23: N-trans-3-(3-metossi-4-solfatofenil)propenoil-2-(3,4-disolfatofenil)etilammina:

Si adotta il protocollo dell’esempio 22 per il prodotto ottenuto dall’esempio 1; il composto otte nuto è N-trans-3-(3-metossi-4-solfatofenil)propenoil-2-(3,4-disolfatofenil)etilammina.

Esempio 24: N-3-(4-solfatofenil)propanoil-2-(4-solfatofenil)etilammina:

Si adotta il protocollo dell’esempio 22 per il prodotto ottenuto dall’esempio 16; il composto ottenuto è N-3-(4-solfatofenil)propanoil-2-(4-solfatofenil)etilammina.

Esempio 25 dell’invenzione: l’invenzione si riferisce ad estratti vegetali, noti per contenere uno dei derivati di acido para-cumarico descritti negli esempi precedenti:

Come è stato menzionato nella descrizione, la presente invenzione viene vantaggiosamente realizzata partendo da estratti naturali, di preferenza estratti vegetali.

La tabella 1 seguente descrive i derivati naturali identificati nelle piante.

Tabella 1 Sono state quindi realizzate differenti composizioni partendo da vegetali della tabella precedente. L’invenzione copre qualsiasi estratto derivato da queste piante, in particolare gli estratti ottenuti secondo l’esempio 26 seguente.

Si preferisce così realizzare un estratto preferibilmente con un solvente polare oppure una miscela di solventi polari, eventualmente al ricadere, di preferenza della parte della pianta menzionata nella tabella 1. Dopo realizzazione dell’estratto, la soluzione viene filtrata ed eventualmente risolubilizzata in un solvente polare oppure una miscela di solventi polari.

Esempio 26 dell’invenzione: estrazioni realizzate partendo da piante note per contenere uno dei derivati dell’acido para-cumarico oggetto dell’invenzione:

Di preferenza si realizza un estratto di Hibiscus cannabinus partendo da cortecce tagliuzzate al 10% (peso/peso) in etanolo al ricadere. L’estrazione viene realizzata per un’ora quindi la soluzione viene filtrata, l’etanolo eliminato e la N-transferuloiltirammina (prodotto ottenuto dall’esempio 3) ottenuta viene solubilizzata al 5% (peso/peso) in una miscela di acqua e glicole quindi ultrafiltrata su filtro di ceramica a differenti valori di taglio, ed infine filtrata a 0,45 μm.

Di preferenza, si prepara un estratto di Hibiscus cannabinus partendo da cortecce tagliuzzate al 10% (peso/peso) in acetato di etile. L’estrazione viene realizzata per un’ora quindi la soluzione viene filtrata, l’acetato di etile eliminato e la N-trans-feruloiltirammina (prodotto ottenuto dall’esempio 3) ottenuta viene solubilizzata al 5% (peso/peso) in una miscela di acqua e glicole quindi ultrafiltrata su filtro di ceramica a differenti valori di taglio, ed infine filtrata a 0,45 μm.

Di preferenza, si prepara un estratto di Hibiscus cannabinus partendo da cortecce tagliuzzate al 10% (peso/peso) in acetone. L’estrazione viene realizzata per un’ora quindi la soluzione viene filtrata, l’acetone viene eliminato e la N-transferuloiltirammina (prodotto ottenuto dall’esempio 3) ottenuta viene solubilizzata al 5% (peso/peso) in una miscela di acqua e glicole quindi ultrafiltrata su filtro di ceramica a differenti valori di taglio, ed infine filtrata a 0,45 μm.

Di preferenza, si prepara un estratto di Hibiscus cannabinus partendo da cortecce tagliuzzate al 10% (peso/peso) in una miscela costituita dal 75% di acqua ed il 25% di glicole butilenico. La macerazione viene eseguita per una notte a 45°C, quindi la N-trans-feruloiltirammina (prodotto ottenuto dall’esempio 3) ottenuta viene ultrafiltrata su filtro di ceramica a differenti valori di taglio, ed infine filtrata a 0,45 μm.

Di preferenza, si prepara un estratto di Lycium chinense partendo da radici tagliuzzate al 10% (peso/peso) in etanolo al ricadere. L’estrazione viene realizzata per un’ora quindi la soluzione viene filtrata, l’etanolo eliminato e la N-trans-diidrocaffeiltirammina (prodotto ottenuto dall’esempio 13) ottenuta viene solubilizzata al 5% (peso/peso) in una miscela di acqua e glicole, quindi ultrafiltrata su filtro di ceramica a diffe-<renti valori di taglio, ed infine filtrata a 0,45>μm.

Di preferenza, si prepara un estratto di Lycium chinense partendo da cortecce tagliuzzate al 10% (peso/peso) in acetato di etile. L’estrazione viene realizzata per un’ora quindi la soluzione viene filtrata, l’acetato di etile eliminato e la N-trans-diidrocaffeiltirammina (prodotto ottenuto dall’esempio 13) ottenuta viene solubilizzata al 5% (peso/peso) in una miscela di acqua e glicole, quindi ultrafiltrata su filtro di ceramica a diffe-<renti valori di taglio, ed infine filtrata a 0,45>μm.

Di preferenza, si prepara un estratto di Lycium chinense partendo da cortecce tagliuzzate al 10% (peso/peso) in acetone. L’estrazione viene realizzata per un’ora quindi la soluzione viene filtrata, l’acetone eliminato e la N-trans-diidrocaffeiltirammina (prodotto ottenuto dall’esempio 13) ottenuta viene solubilizzata al 5% (peso/peso) in una miscela di acqua e glicole, quindi ultrafiltrata su filtro di ceramica a differenti valori di taglio, ed infine filtrata a 0,45 μm.

Un estratto di Lycium chinense viene realizzato partendo da cortecce tagliuzzate al 10% (peso/peso) in una miscela costituita dal 75% di acqua ed il 25% di glicole butilenico. La macerazione viene eseguita per una notte a 45°C, quindi la N-trans-diidrocaffeiltirammina (prodotto ottenuto dall’esempio 13) ottenuta viene ultrafiltrata su filtro di ceramica a differenti valori di taglio, ed infine filtrata a 0,45 μm.

Gli altri estratti menzionati nella tabella 1 sono stati pure ottenuti secondo i differenti protocolli precedentemente menzionati con riferimento ai composti degli esempi 3 e 13. Le variazioni apportate al procedimento sono direttamente accessibili all’esperto per le sue conoscenze generali.

Esempio 27 dell’invenzione: saggio in vitro dell’inibizione mediante i derivati di acido pcumarico della tirosinasi isolata:

La tirosinasi catalizza la formazione di L-dopachinone quindi del dopacromo partendo da L-Dopa. Il dopacromo è un composto colorato quantificabile spettrofotometricamente, visibile a 490 nm. L’utilizzazione di un composto attivo capace di modificare l’attività enzimatica si traduce in una variazione della densità ottica a 490 nm.

Il rapporto delle velocità di formazione del dopacromo permette di determinare in modo preciso le attivazioni oppure le inibizioni ottenute con le differenti molecole testate.

Il campione da testare viene incubato in presenza di tirosinasi di fungo (Sigma), per 5 minuti sotto agitazione. La L-DOPA (Sigma), substrato della tirosinasi, viene incubata per 10 minuti al riparo dalla luce, in presenza o meno delle molecole da testare. Il calcolo della percentuale di inibizione viene eseguito rapportando la DO del saggio alla DO del testimone negativo senza molecola. Il testimone positivo utilizzato è l’acido cogico (Sigma) allo 0,01% = 45% ± 5% di inibizione.

Nel quadro di questo saggio in vitro, i derivati di acido p-cumarico sono stati testati a concentrazioni finali di 10<-4>M e 10<-5>M. I risultati ottenuti sono riportati nella tabella 2.

Tabella 2: inibizione della tirosinasi di fungo da differenti derivati di acido para-cumarico a 490 nm, espressa in percentuale di inibizione.

SD: scostamento standard nd: non determinato Dalla tabella 2 si vede chiaramente che i derivati testati inibiscono la tirosinasi anche a concentrazioni basse.

Esempio 28 dell’invenzione: saggio in vitro dell’inibizione da parte dei derivati dell’acido pcumarico della tirosinasi umana:

La tirosinasi umana ottenuta partendo da estratti di melanociti ottenuti da donatori sani, catalizza la formazione di L-Dopachinone partendo da L-Dopa. Il L-Dopachinone può venire quantificato spettrofotometricamente con osservazione a 490 nm grazie ad un cromogeno: il 3-metil-2-benzotiazolinonidrazone (MBTH).

Questo reattivo fissa gli o-chinoni sintetizzati mediante tirosinasi formando un composto MBTH-o-chinone stabile e solubile che possiede una densità ottica molare elevata.

Quindi, l’utilizzazione di un prodotto attivo in grado di modificare l’attività enzimatica si traduce in una variazione della DO a 490 nm rispetto a quella ottenuta nel testimone negativo (attività 100%).

L’estratto di melanociti viene ottenuto dopo lisi delle membrane cellulari dei melanociti umani normali realizzata mediante choc termico. Il surnatante viene recuperato quindi incubato con MBTH (Sigma) e L-Dopa (Sigma). La DO a 490 nm misurata dopo 30 minuti viene confrontata per ciascun attivo testato a quella ottenuta dal testimone e la percentuale di inibizione viene calcolata confrontando la DO del saggio (molecola testata) alla DO del testimone negativo (senza molecola). Il testimone positivo utilizzato è l’acido cogico a 0,1% (60% ± 5% d’inibizione).

I risultati ottenuti sono riportati nella tabella 3.

Tabella 3: inibizione della tirosinasi umana mediante derivati dell’acido p-cumarico a 490 nm, risultati espressi in percentuale di inibizione.

Dalla tabella 3 precedente si vede che l’attività inibitrice dei derivati dell’acido paracumarico è presente ma modesta su questo modello particolare di tirosina umana isolata.

Esempio 29 dell’invenzione: saggio di inibizione della tirosinasi umana studiato su monostrato dopo applicazione di prodotti attivi da testare a melanociti umani normali:

I melanociti umani normali (ottenuti da plastica addominale) vengono inseminati in piastre a 24 pozzetti in quantità di 80.000 cellule per pozzetto. Essi vengono coltivati fino a confluenza e quindi si applicano i prodotti attivi per 24 ore nel mezzo di coltura. Dopo 24 ore i mezzi vengono eliminati ed i melanociti vengono staccati meccanicamente. L’estrazione viene realizzata mediante choc termico quindi i surnatanti vengono recuperati ed incubati con MBTH (Sigma) e L-Dopa (Sigma). La DO a 490 nm viene misurata dopo 30 minuti e l’inibizione della tirochinasi viene calcolata confrontando la DO a 490 nm al tasso di proteina (misurato in ciascun pozzetto di coltura) del saggio rispetto al rapporto DO 490 nm/concentrazione di proteina del testimone negativo (testimone non trattato). Una percentuale dell’attività anti-tirosinasi viene così calcolata rispetto al testimone non trattato. Il testimone negativo dell’esperimento è l’acido cogico impiegato allo 0,1% sui melanociti (per una inibizione misurata del 20% ± 5%).

Tabella 4: inibizione della tirosinasi umana dopo applicazione dei derivati dell’acido pcumarico e dei prodotti commerciali su melanociti umani normali, risultati espressi in percentuale di inibizione (nd: non determinato).

Dalla tabella precedente si vede chiaramente che i risultati ottenuti, in questo modello, indicano una reale efficacia dei derivati dell’acido para-cumarico sull’inibizione della melanogenesi umana. Le percentuali di inibizione osservate sono nettamente superiori a quelle ottenute su un modello molto lontano dal vivente, cioè la tirosinasi di fungo e mediante contatto diretto con un estratto di tirosinasi di melanociti umani normali.

I derivati dell’acido para-cumarico ossidrilati presentano quindi una attività particolarmente inattesa per l’esperto e molto significativa sull’inibizione della tirosinasi umana mentre l’efficacia è, almeno su un modello, meno specifica utilizzando una tirosinasi ottenuta dai funghi, largamente utilizzata e descritta in bibliografia.

La tirammina e la dopammina sono state testate a 10<-4>M (vedi tabella precedente) e presentano una attività molto scarsa. Le molecole ottenute dalla reazione tra acido caffeico e tirammina o dopammina (rispettivamente i composti degli esempi 9 e 10) hanno permesso di aumentare significativamente l’attività anti-tirosinasi, tanto più che l’acido caffeico da solo presenta una attività pure molto scarsa. Le molecole ottenute dalla reazione tra l’acido ferulico e la tirammina o dopammina producono lo stesso effetto (rispettivamente i composti ottenuti dagli esempi 1 e 3), il solo acido ferulico essendo pure assai poco attivo. L’analogo metilato della dopammina permette di ottenere un effetto di inibizione della sintesi delle melammine misurabile, ma minore di quello dei derivati non metilati. La molecola ottenuta dalla reazione tra l’acido caffeico e l’analogo metilato della dopammina da una parte (composto ottenuto dall’esempio 12) e quella ottenuta dall’acido ferulico e dallo stesso composto, dall’altra parte (composto ottenuto dall’esempio 2) non permettono una attività altrettanto forte.

Esempio 30 dell’invenzione: saggio di inibizione della tirosinasi umana dopo applicazione dei composti ottenuti dagli esempi 9, 10, 1 e 3, su melanociti umani normali ottenuti da differenti donatori:

I composti ottenuti dagli esempi precedentemente citati sono stati testati su melanociti ottenuti da vari donatori ma con fototipi chiari, secondo il protocollo descritto nell’esempio 29. I donatori testati sono i seguenti:

- donatore S (donatore testato nell’esempio 12): 46 anni

- donatore 1: 40 anni

- donatore 2: 47 anni

- donatore 3: 33 anni

I risultati ottenuti sono riportati nelle tabelle seguenti:

Tabelle 5: inibizione della tirosinasi mediante i composti degli esempi 9, 10, 1 e 3 su quattro differenti donatori.

I risultati ottenuti mostrano una grande efficacia dei composti sui quattro donatori differenti.

Esempio 31 dell’invenzione: saggio di inibizione della tirosinasi umana dopo applicazione dei composti ottenuti dagli esempi 3, 9 e 1 su melanociti umani normali ottenuti da differenti donatori con fototipi bruno e nero:

Il composto ottenuto dall’esempio 1 viene testato su colture di melanociti ottenuti da due do natori di fototipo bruno ed un donatore di fototipo nero. Il protocollo applicato è quello descritto nell’esempio 29.

I risultati ottenuti sui due donatori di fototipo bruno sono riportati nelle tabelle 6.

Tabelle 6: inibizione della tirosinasi ottenuta con il composto dell’esempio 3 su due donatori di fototipo bruno.

I risultati ottenuti sui fototipi bruni mostrano che l’attività anti-tirosinasi dipende dalla dose ed è forte. I risultati ottenuti con il donatore di fototipo nero (età 31 anni) sono descritti nella tabella 7 seguente.

Tabella 7: inibizione ottenuta per i composti degli esempi 3 e 9 su un donatore a pelle negroide.

L’attività inibitrice della tirosinasi ottenuta dal donatore a pelle negroide dipende dalla dose e conferma i risultati ottenuti da un lato sui donatori di fototipi chiari.

Esempio 32 dell’invenzione: studio della citotossicità dei derivati di acido para-cumarico:

La citotossicità dei prodotti attivi viene studiata su melanociti umani normali in piastre a 24 pozzetti, con un dosaggio di PNPP (p-nitrofenil fosfato), sostanza trasformata in p-nitrofenolo dalle fosfatasi acide intracellulari delle cellule vitali.

L’assorbanza del p-nitrofenolo a 405 nm è direttamente proporzionale al numero di cellule vitali.

I prodotti attivi vengono testati a due concentrazioni differenti (10<-4>M e 10<-5>M) ed aggiunti al mezzo di coltura, quindi incubati a 37°C per 24 ore. Il dosaggio di PNPP viene eseguito sul tappeto cellulare ed i risultati vengono espressi in percentuale di vitalità rispetto al testimone negativo (pozzetti non trattati).

I risultati ottenuti sono riassunti nella tabella 8 seguente:

Tabella 8: percentuali di vitalità ottenute per differenti derivati di acido p-cumarico su melanociti umani normali (le molecole sono state testate a 2 concentrazioni di 10<-4>M e 10<-5>M).

Le molecole testate sono non citotossiche quando vengono testate a concentrazioni molari di 10<-4>M e 10<-5>M, poiché le percentuali di vitalità ottenute sono superiori al 75% della vitalità (soglia tollerata). Solo due molecole presentano una soglia inferiore al 75% quando vengono testate a 10<-4>M, in particolare le molecole provenienti dagli esempi 11 e 12.

Per venire valutate queste molecole dovranno quindi essere testate su monostrato a concentrazioni inferiori a 10<-4>M (per esempio 10<-5>M).

Esempio 33 dell’invenzione: confronto dell’efficacia dei derivati di acido para-cumarico e delle molecole quasi-farmaco:

Uno studio viene realizzato con molecole note in letteratura per la loro attività depigmentante; queste molecole vengono applicate al modello descritto nell’esempio 29 così da confrontare la loro efficacia rispetto alle molecole descritte nei differenti esempi.

La vitamina C stabilizzata da un gruppo di fosfato di magnesio o vitamina C PMg come pure l’acido cogico, hanno potuto essere valutate nel nostro modello.

I risultati ottenuti sono riportati nella tabella 9.

Tabella 9: inibizione della tirosinasi ottenuta con testimoni della letteratura.

Le molecole testate si sono rivelate inefficaci nel modello descritto nell’esempio 29 rispetto ai derivati di acido para-cumarico particolarmente attivi a concentrazioni molto più basse. In effetti, alcune molecole non hanno permesso di inibire la tirosinasi umana ad una soglia comparabile a quella dei derivati dell’acido para-cumarico.

La vitamina C testata al 3% e allo 0,3% presenta tassi di inibizione importanti nella misura in cui questa molecola ha una azione citotossica sui melanociti e non una azione specifica.

Pertanto, questa molecola non può essere considerata come attiva nel nostro modello.

I derivati dell’acido para-cumarico si rivelano molecole molto efficaci sulla tirosinasi umana normale.

Esempio 34 dell’invenzione: studio dell’attività anti-radicalica dei derivati di acido para-cumarico:

L’attività anti-radicalica dei derivati ottenuti dalle sintesi precedentemente descritte è stata valutata in un modello in vitro acellulare utilizzante DPPH.

Il 1,1-difenil-2-picrilidrazile, per la sua struttura para-magnetica, può accettare un elettrone o un radicale idrogeno per diventare una molecola diamagnetica stabile.

Questo radicale libero, di colore violetto nell’etanolo, presenta una forte banda di assorbimento a 520 nm.

L’aggiunta di un composto che apporta elettroni comporta una decolorazione dell’1,1-difenil-2-picrilidrazile proporzionale al numero di elettroni captati dal radicale che può essere seguito mediante misurazione dell’assorbanza a 520 nm.

La DPPH viene incubata per 30 minuti in presenza dei derivati precedentemente descritti testati ad una concentrazione di 10<-5>M, oppure sola per il controllo. Alla fine dell’incubazione l’attività anti-radicalica dei derivati suddetti viene valutata misurando l’assorbanza della soluzione a 520 nm.

L’attività anti-radicalica di ciascun prodotto testato è stata calcolata secondo la formula in percentuale:

100-((DO520in presenza del composto da testare/DO520in assenza del composto)x 100).

Tabella 10: attività anti-radicalica dei composti dell’invenzione.

I composti suddetti presentano una attività anti-radicalica ad una concentrazione di 10<-5>M.

Per effetto della loro forte attività anti-radicalica, i composti dell’invenzione sono composti anti-infiammatori: in effetti i radicali liberi generati a seguito di uno stress UV o altro, inducono la cascata dell’infiammazione. È per questo che composti aventi proprietà anti-radicaliche inibiscono la cascata dell’infiammazione.

Con “prodotti dell’invenzione”, si intendono i composti che rispondono alla formula generale I, come pure i composti preferiti ed in particolare i composti descritti negli esempi da 1 a 26.

Esempio 35 dell’invenzione: utilizzazione dei prodotti dell’invenzione in formulazioni cosmetiche oppure farmaceutiche del tipo emulsione di olio in acqua:

Formulazione 35a :

A Acqua q.b. a 100 Glicole butilenico 2 Glicerina 3

Sodio diidrossicetilfosfato, 2 Isopropilidrossicetiletere

B Glicolstearato SE 14 Triisononanoina 5 Ottilcoccoato 6

C Butilenglicole, Metilparaben 2 Etilparaben, Propilparaben pH portato a 5,5

D Prodotti dell’invenzione 0,01 - 10% Formulazione 35b :

A Acqua q.b. a 100 Glicole butilenico 2 Glicerina 3 Poliacrilammide, Isoparaffina 2,8 Laureth-7

B Butilenglicole 2 Metilparaben, Etilparaben, Propil- 2 paraben

Fenossietanolo, Metilparaben, Pro- 0,5

pilparben, Butilparaben, Etilparaben

Butilen glicole

D Prodotti dell’invenzione 0,01 - 10% Formulazione 35c :

A Carbomero 0,50 Propilenglicole 3 Glicerolo 5

Acqua q.b. a 100 B Ottilcoccoato 5 Bisabololo 0,30 Dimeticone 0,30

C Idrossido di sodio 1,60

D Fenossietanolo, Metilparaben, Pro- 0,50 pilparaben, Butiparaben, Etilparaben

E Profumo 0,30

F Prodotti dell’invenzione 0,01 – 10% Esempio 36 dell’invenzione: utilizzazione dei prodotti dell’invenzione in una formulazione di tipo acqua in olio:

A PEG 30 - dipoliidrossistearato 3 Trigliceridi caprici 3 Cetearilottanoato 4 Dibutiladipato 3

Olio di semi di uva 1,5 Olio di Jojoba 1,5 Fenossietanolo, Metilparaben, Pro- 0,5 pilparaben, Butilparaben, Etilparaben

B Glicerina 3 Butilenglicole 3 Solfato di magnesio 0,5 EDTA 0,05 Acqua q.b. a 100 C Ciclometicone 1 Dimeticone 1

D Profumo 0,3

E Prodotti dell’invenzione 0,01 – 10% Esempio 37 dell’invenzione: utilizzazione dei prodotti dell’invenzione in una formulazione di tipo shampoo o gel per doccia:

A Resina xantorrea 0,8 Acqua q.b. a 100 B Butilenglicole, Metilparaben, E- 0,5 tilparaben, Propilparaben

Fenossietanolo, Metilparaben, Pro- 0,5 pilparaben, Butilparaben, Etilparaben

C Acido citrico 0,8

D Sodio Laureth solfato 40,0

E Prodotto dell’invenzione 0,01 – 10% Esempio 38 dell’invenzione: utilizzazione dei prodotti dell’invenzione in una formulazione del tipo per rossetto ed altri prodotti anidri:

A Cera minerale 17,0 Isostearilisostearato 31,5 Propilenglicole dipelargonato 2,6 Propilenglicole isostearato 1,7 Cera d’api PEG 8 3,0 Olio di noccioli di palma idroge- 3,4 nato, gliceridi, gliceridi di palma idrogenati

Olio di lanolina 3,4 Olio di sesamo 1,7 Cetillattato 1,7 Olio minerale, alcol lanolinico 3,0

B Olio di ricino q.b. a 100 Biossido di titanio 3,9

CI 15850 : 1 0,616 CI 45410 : 1 0,256 CI 19140 : 1 0,048 CI 77491 2,048 C Prodotti dell’invenzione 0,01 – 5% Esempio 39 dell’invenzione: utilizzazione dei prodotti dell’invenzione in una formulazione di gel acquosi (contorno occhi, snellenti, ecc):

A Acqua q.b. a 100 Carbomero 0,5

Butilenglicole 15

Fenossietanolo, Metilparaben, Pro- 0,5

pilparaben, Butilparaben, Etilparaben

B Prodotti dell’invenzione 0,01 – 10% Esempio 40 dell’invenzione: utilizzazione dei prodotti dell’invenzione in una formulazione di tipo emulsione tripla:

Emulsione primaria W1/O

A PEG 30 – dipoliidrossistearato 4

Trigliceridi caprici 7,5

Isoesadecano 15

PPG-15 steariletere 7,5

B Acqua 65,3

C Fenossietanolo, Metilparaben, Pro- 0,7

pilparaben, Butiparaben, Etilparaben

Emulsione secondaria W1/O/W2

A Emulsione primaria 60

B Polossamero 407 2

Fenossietanolo, Metilparaben, Pro- 0,3

pilparaben, 2-bromo-2nitropropan-1,3-diolo

Acqua q.b a 100 C Carbomero 15

D Trietanolammina pH 6,0-6,5 Esempio 41 dell’invenzione: preparazione di formulazioni farmaceutiche contenenti il prodotto dell’invenzione:

Formulazione 41a: preparazione di compresse A Eccipienti g per compressa Lattosio 0,359 Saccarosio 0,240 B Prodotti dell’invenzione* 0,001-0,1 *Il prodotto dell’invenzione viene ottenuto, per esempio, secondo il procedimento di estrazione descritto nell’esempio 1, con successivo essiccamento.

Formulazione 41b: preparazione di pomata

A Eccipienti

Polietilene a bassa densità 5,5 Paraffina liquida q.b. a 100 B Prodotti dell’invenzione* 0,001-0,1 *Il prodotto dell’invenzione viene ottenuto, per esempio, secondo il procedimento di estrazione descritto nell’esempio 1, con successivo essiccamento.

Formulazione 41c: preparazione di una formula iniettabile

A Eccipiente

Soluzione isotonica salina 5 ml

B Prodotti dell’invenzione* 0,001-0,1 *Il prodotto dell’invenzione viene ottenuto, per esempio, secondo il procedimento di estrazione descritto nell’esempio 1, con successivo essiccamento.

Esempio 42: valutazione dell’accettazione cosmetica di una preparazione contenente l’oggetto dell’invenzione:

I saggi tossicologici sono stati eseguiti sul composto ottenuto secondo l’esempio 1 incorporato al 10% in un gel di xantano allo 0,5% con una valutazione oculare sul coniglio, con lo studio dell’assenza di tossicità anomala per somministrazione orale unica al ratto e con lo studio del potere sensibilizzante sulla cavia.

Valutazione dell’irritazione primaria cutanea nel coniglio:

Le preparazioni precedentemente descritte vengono applicate senza diluizione alla dose di 0,5 ml sulla pelle di tre conigli secondo il metodo previsto dalla direttiva OCSE, relativa allo studio di “effetto irritante/corrosivo acuto sulla pelle”.

I prodotti sono classificati secondo i criteri definiti dal decreto dell’1/02/1982 pubblicato su JORF del 21/02/82.

I risultati di questi saggi, hanno permesso di concludere che i prodotti dell’invenzione erano classificati non irritanti per la pelle.

Valutazione dell’irritazione oculare sul coniglio:

Le preparazioni suddescritte sono state instillate in una sola volta, in ragione di 0,1 ml, nell’occhio di tre conigli secondo il metodo previsto dalla direttiva OCSE n. 405 del 24 febbraio 1987 e relativa allo studio de “l’effetto irritante/corrosivo acuto sugli occhi”.

I risultati di questo test hanno permesso di concludere che le preparazioni possono essere considerate come non irritanti per gli occhi secondo la direttiva CEE 91/326, utilizzati puri o senza diluizione.

Saggio sull’assenza di tossicità anomala per somministrazione orale unica al ratto:

Le preparazioni descritte sono state somministrate una sola volta per via orale alla dose di 2 g/kg di peso corporeo a 5 ratti maschi e a 5 ratti femmina secondo il protocollo corrispondente alla direttiva OCSE n. 401 del 24 febbraio 1987 adattata ai prodotti cosmetici.

Le DL0 e DL50 sono risultate superiori a 2.000 mg/kg. Le preparazioni testate non sono quindi classificate tra quelle pericolose per ingestione.

Valutazione del potenziale di sensibilizzazione cutanea sulla cavia:

I preparati descritti sono stati sottoposti al test di massimizzazione descritto da Magnusson e Kligmann, protocollo corrispondente alla direttiva n. 406 della OCSE.

I preparati sono classificati come non sensibilizzanti per contatto con la pelle.

Tabella 11: formule chimiche

Claims (28)

1. RIVENDICAZIONI 1. Utilizzazione di una quantità efficace di almeno un composto derivato dall’acido para-cumarico di formula generale (I) seguente: in cui: Z rappresenta un ossigeno o un gruppo –NH-; X e Y sono identici e rappresentano ciascuno un gruppo CH oppure CH2; n è un numero, preferibilmente intero, variabile da 1 a 12; Ra e Rb sono identici o diversi, di preferenza identici, e rappresentano un atomo di idrogeno, un gruppo acile lineare o ramificato, di preferenza C1- 12, un alchile lineare o ramificato, saturo o meno, di preferenza C1-12; un gruppo solfonile (SO3H) salificato o meno; oppure un gruppo fosfonato (PO3H2) salificato o meno; ORa e/oppure ORb possono essere in presenza di una base sottoforma dissociata, come per esempio sottoforma O- Na+; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7e R8rappresentano, indipendentemente gli uni dagli altri: un atomo di idrogeno; un gruppo ossidrile; un atomo di alogeno; una funzione acida salificata o meno; una funzione aldeide; una funzione ammide; una funzione ammina (primaria, secondaria o terziaria) sottoforma basica o salificata; un gruppo ciano; un gruppo tiolo; un gruppo nitro; uno zucchero (O-eteroside); un gruppo alchilato lineare o ramificato, di preferenza C1-12; una catena alchilica lineare o ramificata, di preferenza C1-12; una catena alchenilica lineare o ramificata, di preferenza C1-12; una catena tioalchilica lineare o ramificata, di preferenza C1-12; una catena alcossilica lineare o ramificata, di preferenza C1-12; una catena alchenilossilica, di preferenza C1-12; un gruppo solfato salificato o meno; un gruppo solfonile salificato o meno; un gruppo fosfonato salificato o meno; un gruppo fosfato salificato o meno; un gruppo silanolo; in cui le catene di atomi di carbonio, preferibilmente C1-12, possono essere sostituite; come principio attivo in una composizione cosmetica.
2. 2. Uso di una quantità efficace di almeno un composto derivato dall’acido para-cumarico di formula generale (I) come definito nella rivendicazione 1, come agente depigmentante in una composizione cosmetica.
3. 3. Uso, secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che Ra e Rb rappresentano ciascuno indipendentemente un atomo di idrogeno, un gruppo acile lineare o ramificato C1-12, un gruppo solfonile (SO3H) salificato o meno, un gruppo fosfonato (PO3H2) salificato o meno e di preferenza un idrogeno.
4. 4. Uso, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato del fatto che il composto derivato dall’acido para-cumarico è rappresentato dalla formula chimica II, in cui i gruppi da R1a R8, X, Y, Z e n rappresentano gli elementi citati nella formula generale I:
5. 5. Uso, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il composto derivato dall’acido para-cumarico è rappresentato dalla formula chimica III, in cui i gruppi R2, R3, R6e R7, X, Y, Z e n rappresentano gli elementi citati nella formula generale I:
6. 6. Uso, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il composto derivato dall’acido para-cumarico è rappresentato dalle seguenti formule (IVa e IVb) in cui R6e R7rappresentano gli elementi citati nella formula generale I:
7. 7. Uso, secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che nelle formule precedenti IVa e IVb, R6e R7sono preferibilmente idrogeno, il che corrisponde ai due derivati rappresentati dalle formule IVa1 e IVb1 seguenti:
8. 8. Uso, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, caratterizzato dal fatto che il composto derivato dall’acido para-cumarico è rappresentato dalle seguenti formule (Va e Vb) in cui R6e R7rappresentano gli elementi citati nella formula generale I:
9. 9. Uso, secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che nelle formule Va e Vb, R6e R7sono preferibilmente idrogeno, il che corrisponde ai due derivati rappresentati dalle formule Va1 e Vb1 seguenti:
10. 10. Uso, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che R1, R4, R5e R8rappresentano idrogeno.
11. 11. Uso, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che i sostituenti R2e R3vengono scelti tra un gruppo ossidrile, eventualmente sottoforma salificata, oppure metossile e un atomo di idrogeno.
12. 12. Uso, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che i sostituenti R6e R7vengono scelti tra un gruppo ossidrile, eventualmente sottoforma salificata, oppure metossile, e un atomo di idrogeno.
13. 13. Uso, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che n = 2.
14. 14. Uso, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che i sostituenti R6e R7vengono scelti tra un gruppo ossidrile ed un atomo di idrogeno.
15. 15. Uso, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, caratterizzato dal fatto che i derivati dall’acido para-cumarico sono derivati dell’acido ferulico, in cui: Ra, Rb, R1, R2e R4, rappresentano preferibilmente un atomo di idrogeno. R3rappresenta un gruppo metossile; X e Y rappresentano ciascuno un gruppo CH e n è u guale a due; questi derivati potendo essere rappresentati dalle formule seguenti (IIa e IIb): in cui: R5, R6, R7e R8hanno lo stesso significato precedentemente indicato.
16. 16. Uso, secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che nelle formule IIa e IIb, R5, R6, R7e R8rappresentano ciascuno un atomo di idrogeno.
17. 17. Uso, secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che nelle formule IIa e IIb, R5, R6, e R8rappresentano ciascuno un atomo di idrogeno e R7rappresenta un gruppo ossidrile, il che corrisponde ai due derivati rappresentati dalle formule seguenti:
18. 18. Uso, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, caratterizzato dal fatto che i derivati dell’acido para-cumarico sono derivati dell’acido caffeico, in cui: Ra, Rb, R1, R2e R4, rappresentano preferibilmente un atomo di idrogeno; R3rappresenta un gruppo ossidrile; X e Y rappresentano ciascuno un gruppo CH e n è uguale a due; questi derivati potendo essere rappresentati dalle formule seguenti (IIIa e IIIb): in cui: R5, R6, R7e R8hanno lo stesso significato precedentemente indicato
19. 19. Uso, secondo la rivendicazione 18, caratterizzato dal fatto che nelle formule IIIa e IIIb, R5, R6, R7e R8rappresentano ciascuno un atomo di idrogeno.
20. 20. Uso, secondo la rivendicazione 18, caratterizzato dal fatto che nelle formule IIIa e IIIb, R5, R6, e R8 rappresentano ciascuno un atomo di idrogeno e R7rappresenta un gruppo ossidrile, il che corrisponde ai due derivati rappresentati dalle formule IIIa1 e IIIb2 seguenti:
21. 21. Uso, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, caratterizzato dal fatto che i sostituenti Ra, Rb, R1, R2, R4, R5, R6, R7e R8rappresentano ciascuno un atomo di idrogeno; R3rappresenta un gruppo ossidrile; n è uguale a due; questi derivati possono essere rappresentati dalle formule seguenti (VIa e VIb) in cui X e Y sono gruppi CH e CH2:
22. 22. Uso, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 21, caratterizzato dal fatto che il composto viene estratto da un vegetale, detto estratto comprendendo di preferenza un composto scelto tra:
23. 23. Uso di una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti per esercitare una attività depigmentante oppure un effetto inibitore della melonogenesi, in particolare per applicazione topica su almeno una zona del tessuto cutaneo di un soggetto.
24. 24. Uso di una quantità efficace di almeno un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 22, come principio attivo con attività antiradicalica e/oppure anti-infiammatoria in una composizione cosmetica.
25. 25. Procedimento di cura cosmetica, caratterizzato dal fatto che comprende l’applicazione topica di una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 22.
26. 26. Procedimento di cura cosmetica, secondo la rivendicazione 25, per diminuire la pigmentazione della pelle a livello della zona di applicazione.
27. 27. Uso di una quantità efficace di almeno un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 22, per la preparazione di una composizione farmaceutica destinata a esercitare una attività depigmentante oppure un effetto inibitore della melanogenesi, in particolare per applicazione topica su almeno una zona di tessuto cutaneo di un soggetto che presenta una iperpigmentazione.
28. 28. Uso di una quantità efficace di almeno un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 22, per la preparazione di una composizione farmaceutica destinata a esercitare una attività anti-radicalica e/oppure anti-infiammatoria.