ITMI990389A1

ITMI990389A1 - Metodo ed apparecchio per il riallinemaneto dei picchi in analisi

Info

Publication number: ITMI990389A1
Application number: IT1999MI000389A
Authority: IT
Inventors: Paolo Magni; Pier Albino Colombo; Sorin Trestianu; Fausto Pigozzo
Original assignee: Thermoquest Italia Spa
Priority date: 1999-02-25
Filing date: 1999-02-25
Publication date: 2000-08-25
Also published as: ATE428921T1; EP1041382A3; IT1309602B1; DE69940722D1; US6357277B1; EP1041382B1; EP1041382A2

Description

Descrizione dell’invenzione che ha per titolo:

"Metodo ed apparecchio per il riallineamento dei picchi in analisi gascromatografiche"

La presente invenzione concerne un metodo, nonché l’apparecchio destinato all’attuazione di tale metodo, per realizzare la riproducibilità dei tempi di ritenzione dei componenti di una miscela analizzata in uno strumento di analisi gascromatografica, quando la colonna capillare utilizzata viene sostituita con un’altra colonna nominalmente uguale in un medesimo apparecchio o in apparecchi diversi ma nominalmente uguali operanti sotto le stesse condizioni.

Il problema che sta alla base della presente invenzione nasce dalla constatazione che i tempi di ritenzione di un determinato componente in una miscela da analizzare tramite gascromatografia presentano valori che variano da colonna a colonna e da apparecchio ad apparecchio, anche se le caratteristiche nominali delle colonne e degli apparecchi sono uguali. Ciò determina uno spostamento del picco relativo al componente interessato rispetto all'asse dei tempi del cromatogramma, nei confronti dello stesso picco ottenuto attraverso un’identica analisi in una diversa colonna, pur nominalmente uguale,

E’ noto che come risultato di un'analisi gascromatografica si ottiene un cromatogramma formato da una successione di picchi, ciascuno dei quali indica l'arrivo di un componente della miscela analizzata ad un rivelatore posto a valle della colonna, dopo un tempo tr, cosiddetto di ritenzione, misurato dal momento dell’introduzione del campione nella colonna e che rappresenta il tempo di attraversamento della colonna. Il tempo di ritenzione tr dipende ovviamente dalla natura del componente considerato, dalla natura e dallo spessore della pellicola di fase stazionaria nella colonna, nonché dalle modalità dell'analisi, in particolare dal programma di temperatura della colonna e dalle pressioni del gas di trasporto (carrier} in entrata e in uscita dalla colonna. Il tempo di ritenzione tr è anche influenzato, per uno stesso componente ed a parità di altre condizioni, dalle caratteristiche della colonna capillare, in particolare dalla lunghezza e dal diametro della stessa.

Risulta pertanto che le variazioni nei tempi di ritenzione dei componenti di una stessa miscela, ovvero gli spostamenti dei picchi che si rilevano in analisi uguali con colonne diverse, ma nominalmente uguali, dipendono dalle diverse caratteristiche geometriche di tali colonne.

Si è constatato infatti che colonne nominalmente uguali, cioè con lo stesso diametro e la stessa lunghezza nominale presentano in realtà differenze non trascurabili sia nella lunghezza sia nei diametro interno, che non è ovviamente uniforme e controllabile per tutta la lunghezza della colonna e varia da una colonna all’altra.

Sono appunto queste divergenze rispetto ai valori nominali a creare il citato spostamento dei picchi di identiche analisi su colonne diverse ma nominalmente uguali, in un medesimo apparecchio o in un apparecchi diversi ma nominalmente uguali. Tale spostamento comporta la necessità di cambiare, alla sostituzione della colonna o dell'apparecchio, i parametri utilizzati per il riconoscimento dei picchi (peak tables), il che si traduce nella necessità di modificare il metodo di analisi con perdite di tempo, oneri aggiuntivi e con un mancato rispetto delle norme GLP (Good Laboratory Practice).

Per eliminare ciò, è stato già proposto di utilizzare una metodologia denominata bloccaggio del tempo di ritenzione e che c -onsiste nella procedura seguente. Si sceglie una miscela standard e si effettua un'analisi di riferimento ad una determinata pressione di ingresso del carrier, identificando un composto di riferimento ed il relativo tempo di ritenzione. Dopo la sostituzione della colonna, si effettuano analisi con la stessa miscela e con pressioni di ingresso del carrier rispettivamente pari all'80%, 90%, 100%, 110% e 120% della pressione di ingresso utilizzata in precedenza, prelevando i tempi di ritenzione per il composto di riferimento. Si traccia quindi un grafico riportando i tempi di ritenzione in funzione della pressione di ingresso e connettendo i punti tracciati con segmenti di retta. Si entra quindi nel grafico con il tempo dì ritenzione originale per ricavare la nuova pressione di ingresso che deve essere mantenuta nelle analisi successive per ottenere il riallineamenfo dei picchi.

Questo metodo risulta tuttavia alquanto lungo e complesso. Inoltre, esso consente un riallineamento dei picchi solo quando questi sono prossimi a quello del composto di riferimento. Ma l’inconveniente più grave è che esso obbliga ad effettuare tutte le analisi successive con modalità di analisi a pressione costante, mentre la conduzione di analisi con modalità a portata costante del carrier è più vantaggiosa per quanto riguarda la costanza di risposta del rivelatore ed il tempo totale di analisi. Partendo dal presupposto che quando si sostituisce la colonna, o si cambia l'apparecchio, le caratteristiche geometriche della nuova colonna sono quelle che determinano lo spostamento dei picchi, ovvero le variazioni dei tempi di ritenzione, la Richiedente si è proposta lo scopo di applicare un metodo che consentisse di caratterizzare automaticamente ogni colonna utilizzata, tenendo conto degli effettivi valori di lunghezza e diametro interno della stessa, e di utilizzare tale caratterizzazione per ottenere un riallineamento automatico di tutti i picchi, senza differenze determinate dal loro posizionamento sul cromatogramma, qualsiasi sia la modalità di analisi prescelta (alimentazione del carrier a portata costante o programmata, oppure a pressione costante o programmata).

Questo ed altri scopi dell’invenzione vengono realizzati applicando il metodo come definito nella rivendicazione 1.

Le modalità applicative e le caratteristiche dell'invenzione saranno ora descritte con riferimento a forme di attuazione preferite ed ai disegni allegati, in cui:

La fig. 1 è un diagramma che mostra il significato della costante di

caratterizzazione K attraverso la correlazione fra i valori Fm e

La fig. 2 è un diagramma mostrante la correlazione fra la pressione di ingresso del carrier pin e la portata massica del carrier Fm attraverso la colonna, a temperatura costante .

La Fig. 3 è un diagramma mostrante le variazioni de! tempo di ritenzione in funzione della portata massica Fm a temperatura costante, per due colonne di lunghezza e diametro diversi rispetto al valore nominale La costante K menzionata nella rivendicazione principale deriva dalla nota equazione di Poiseuille che correla pressione e portata in condotti capillari, modificata per tener conto del fatto che la portata massica Fm del gas di trasporto (carrier) è convenzionalmente espressa come portata volumetrica in condizioni standard (pstd = latm; Tstd = 298°K):

dove d: è il diametro interno effettivo della colonna gascromatografica, pari al diametro interno di una colonna cilindrica ideale di lunghezza L e di volume interno uguale a quello della colonna reale;

L: è la lunghezza effettiva della colonna

Tstd: è la temperatura standard (Tst=298°K)

Pstd: è la pressione standard (pstd= 1 atm)

ηstd: è la viscosità del gas di trasporto in condizioni standard di pressione e temperatura

Pin: è la pressione assoluta di ingresso in colonna del gas di trasporto

Pout: è la pressione assoluta del gas di trasporto aH'uscita della colonna, solitamente pari a 1 atm ( 0 atm quando l'uscita è sotto vuoto)

Tc: è la temperatura effettiva della colonna

a: è un coefficiente sperimentale che dipende dalla natura del gas di trasporto

Nella formula precedente, ponendo

E’ allora evidente che il coefficiente K, contenente termini costanti e noti come Tstd, Pstd, nstd e a, dipende dai valori reali del diametro interno e della lunghezza della colonna e può essere assunto come parametro indicatore di tali grandezze geometriche e quindi essere correiabile al tempo di ritenzione dei componenti di una miscela nella particolare colonna considerata.

Il citato coefficiente K è ricavabile applicando l’equazione (3), mediante effettuazione di un passaggio del carrier e mediante misura, in condizioni stabilizzate del passaggio di gas di trasporto attraverso la colonna, dei valori di Tc, Fm, pin, ed eventualmente pout. Da rilevare che Pout generalmente è pari a 0 o latm e quindi può essere impostato senza necessità che venga misurato. Si ottiene:

Per maggiore precisione, è possibile ripetere le misure di cui sopra variando, a gradini, la pressione di ingresso e misurando la portata massica del carrier, sempre a temperatura Tc costante .

E’ inoltre evidente che qualora in luogo del solo carrier si facesse passare in colonna, assieme al carrier, una quantità modesta di campione, la situazione non cambierebbe ed i risultati sarebbero praticamente identici.

Il coefficiente K risulta così pari al coefficiente angolare della retta che

correla Fm, in ordinate, e in ascisse, riportata nell'allegata

figura 1.

Per tener conto delle dimensioni reali della colonna, il coefficiente K così calcolato viene immagazzinato nella memoria del sistema che controlla l’apparecchio di gascromatografia. Dopo di ciò, sarà sufficiente utilizzare tale coefficiente K per correlare almeno due dei parametri di controllo (pressione di ingresso pin e portata massica del carrier Fm e temperatura della colonna Tc) delle analisi successive condotte con la stessa colonna. Il riallineamento dei picchi è garantito dal fatto che cambiando la colonna con un’altra, nominalmente uguale alla prima, viene ripetuta la procedura di caratterizzazione, ottenendo un nuovo valore di K che tiene conto in modo automatico delle dimensioni reali della nuova colonna .

Il riallineamento dei tempi di ritenzione deriva dal fatto che il tempo di ritenzione tr è la somma di due elementi: il tempo trascorso nella fase stazionaria tstaz (quando il componente è immobile) ed il tempo trascorso nella fase mobile tm quando il componente è trasportato dal carrier:

tr = tm + tstaz

Se la natura e lo spessore della fase stazionaria sono identici in colonne nominalmente uguali (come si suppone) e il programma di temperatura è identico, la variazione del tempo di ritenzione Δtr è uguale alla variazione del tempo trascorso in fase mobile (carrier):

Δtr = Δtm

La variazione Δtm può essere espressa in funzione della variazione della portata del gas di trasporto e anche dei parametri geometrici della colonna:

Δtm = f (AFm , ΔL, Δd)

Si è constatato che la variazione della portata di gas di trasporto è predominante rispetto alle altre variazioni e dunque se la portata è mantenuta rigorosamente costante da colonna a colonna, la variazione del tempo di ritenzione è contenuta. Se invece si lavora a pressione di ingresso costante, la variazione di portata che deriva dalla variazione dei parametri della colonna induce una variazione cospicua del tempo di ritenzione.

Questo si spiega sulla base delle equazioni (2) e (3) dalle quali risulta che la variazione di portata è proporzionale alla variazione del diametro della colonna elevato alla quarta potenza e dunque una piccola variazione del diametro produce importanti variazioni di portata.

In pratica si utilizza nuovamente l'equazione (3), nella quale il coefficiente K, precedentemente determinato durante la caratterizzazione della colonna, viene impiegato al fine di controllare uno dei parametri che governano l'analisi, a seconda delle esigenze operative richieste.

Quando si desideri operare nelle condizioni con carrier a portata costante, nell’equazione (3) si introdurrà il valore di portata desiderato e si calcolerà la pressione di ingresso, in dipendenza dal valore di K precedentemente calcolato ed immagazzinato e dalla temperatura della colonna, istante per istante. Il cromatogramma così ottenuto terrà conto in modo automatico delle caratteristiche geometriche della colonna, realizzando il desiderato riallineamento dei picchi.

Lo stesso si verifica nel caso in cui l'analisi debba essere condotta seguendo una variazione programmata della portata del carrier, con la sola differenza che il calcolo della pressione non si riferirà più ad un valore dì portata costante, ma al valore di portata desiderato istante per istante.

Nel caso in cui si desideri operare con pressione costante o programmata durante l’analisi con una nuova colonna nominalmente uguale alla precedente, si calcola la pressione di ingresso necessaria per ottenere una medesima portata, a temperatura costante, nella seconda colonna. Tale pressione di ingresso varierà in corrispondenza alla variazione nel valore dei coefficienti K fra le due colonne. Impostando la pressione calcolata si ottiene anche in questo caso un riallineamento dei picchi nelle due colonne.

Nella figura 2 sono state riportate in un diagramma le variazioni di portata massica del carrier Fm, in ascisse, e di Pin^Pout<2 >rispettivamente calcolate per una colonna (n) di lunghezza nominale di 25 m e diametro interno nominale di 0,32 mm, per una colonna (a) dello stesso diametro ma di lunghezza superiore del 5% e per una colonna (b) con la stessa lunghezza ma diametro superiore del 5%, il tutto ad una temperatura Tc=50°C e pressione assoluta di uscita pari a 100 kPa. Si vede che, a parità di pressione di entrata pin, si hanno variazioni di portata Fm che arrivano a circa 0,5 std mi/min fra le due colonne a) e b) nominalmente uguali.

La figura 3 mostra invece le variazioni del tempo di ritenzione rispetto alla portata massica del carrier Fm per le stesse due colonne (a) e (b) della figura 2. Si vede che quando la portata rimane costante (2 std ml/min), la variazione del tempo di ritenzione δtr, per uno stesso componente e a temperatura costante rimane contenuta.

Mantenendo costante la pressione di ingresso nelle due colonne reali (a) e (b) ma nominalmente uguali, i flussi reali del carrier variano da circa 1,9 a 2,45 std ml/min (vedere fig. 2) e ciò comporta una variazione del tempo di ritenzione (Δtr) considerevolmente più elevata (vd. fig. 3).

Nella tabella 1 che segue sono riportati i risultati di una serie di analisi condotte su una stessa miscela, in un medesimo apparecchio gascromatografico, con colonne nominalmente uguali, ma in realtà diverse. Le analisi sono state condotte a portata costante (1,2 ml/min) con una programmazione di temperatura della colonna che prevede un aumento da 50°C a 100°C alla velocità di 50°C/min, poi un aumento da 100°C a 250°C alla velocità di 30°C/min e quindi un aumento da 250°C a 340°C alla velocità di 20°C/min.

VARIAZIONE DEI

nC8 nC8 COLONNA 1 (K = 1.03088) 2.102 2,573 COLONNA 2 ( K B 1,73151} 2.088 2554 Differenza tempi

di ritenzione min 0.018 0.019 % 0,76 0.75 Media di 10 proveconsecutive

APPARECCHIO TRACE GC 1

Portata in colonne: 1.2ml/ Pressioneiniziale colonna 1:14.4 psi Pressioneiniziale colonna 2: 13.9 psi Sono stati calcolati i coefficienti K delle due colonne per controllare la costanza della portata attraverso la pressione di ingresso e sono stati rilevati i tempi di ritenzione per diversi componenti. Si nota che le variazioni nei tempi di ritenzione vanno all'incirca da 1 a 4 secondi e percentualmente sono sempre inferiori all' 1 %.

Quanto sopra è stato ripetuto nel caso di installazione di colonne nominalmente identiche in apparecchi di analisi dello stesso tipo ma diversi fra loro, con i risultati riportati nella tabella 2 che segue.

TABELLA 2

VARIAZIONE DEI TEMPI DI RITENZIONE DA APPARE

Tempi di ritenzione {min) nC6 nC8 nC10 nC12 nC14 n nna 1 2.102 2.073 3.346 4251 G.13S 5, nne 3 2.0S2 2.556 3.337 4244 5.135 5 min 0.020 0.015 0.011 0.008 0.004 0 % 0J9S 0.60 0.32. 0.16 0.08 0

ecutive

a: 1.2 mminia ( CF)

e colonne 1: 14.4 psi

e colonna 3 : 14.3 psi

I risultati mostrano che anche in questo caso il metodo utilizzato consente di contenere la variazione dei tempi di ritenzione entro N%. Per l’attuazione del metodo dell’invenzione, l’apparecchio di analisi gascromatografica comporterà, oltre alle usuali parti componenti, dei sensori di pressione e di portata, nonché i mezzi elettronici per calcolare ed immagazzinare il coefficiente K e per utilizzare tale coefficiente K nel controllo delle analisi successive.

Preferibilmente, l'apparecchio presenta una funzione, ad esempio attivabile attraverso un pulsante, per effettuare automaticamente la caratterizzazione della colonna mediante il passaggio di carrier in condizioni controllate attraverso la colonna, con rilevazione dei valori di portata, pressione e temperatura e con conseguente calcolo ed immagazzinamento del coefficiente K.

Dalla descrizione sopra riportata si può rilevare che il coefficiente K rappresenta in definitiva un parametro che caratterizza il comportamento fluido dinamico di una colonna e che quindi ogni colonna può essere identificata e caratterizzata, assieme agli altri parametri, anche dal suo coefficiente K.

Ciò significa che è ipotizzabile assegnare a ciascuna colonna tale parametro K onde caratterizzare la colonna stessa, inserendola in un apparecchio gascromatografico adatto, per calcolare come sopra detto il suo coefficiente K. Questo coefficiente può poi essere esplicitato ed assegnato, con gli altri elementi identificativi, alla colonna considerata.

In un caso del genere, per ottenere il desiderato riallineamento dei picchi, all'atto dell'installazione della colonna per le analisi sarà sufficiente introdurre il valore di K della colonna nel sistema ed operare come citato, controllando i parametri dell’analisi attraverso il coefficiente K. .

Qualora poi, a colonna installata, si ricarafterizzasse la colonna ottenendo un nuovo coefficiente K significativamente diverso da quello originale, ciò significherebbe che la colonna ha subito delle modifiche geometriche, oppure che dopo l'installazione della sfessa nel sistema gascromafografico si verificano delle perdite di carrier o delle ostruzioni idrauliche.

Claims

Rivendicazioni 1. Metodo per realizzare la riproducibilità dei tempi di ritenzione dei componenti di una miscela analizzata in un apparecchio di gascromatografia a seguito della sostituzione della colonna capillare utilizzata con una nominalmente uguale, in un medesimo apparecchio o in un altro apparecchio dello stesso tipo nominalmente uguale, caratterizzato dalle fasi di: I) calcolare preventivamente un coefficiente K caratteristico della colonna mediante un passaggio in colonna di gas di trasporto in condizioni stabilizzate di pressione e portata e di temperatura della colonna, misurando i valori di pressione del gas di trasporto all'entrata (psn) della colonna, di portata massica del gas di trasporto (Fm) e di temperatura dèlia colonna (Tc), nonché misurando od impostando il valore di pressione del gas di trasporto all'uscita della colonna (pOUf) ed introducendo tali valori nell'equazione seguente: in cui:

a è un esponente sperimentale impostabile, dipendente dalla natura del gas di trasporto. II) immagazzinare tale coefficiente K in una memoria del sistema gascromatografico; e III) utilizzare il coefficiente K per correlare almeno due dei parametri sopra menzionati nelle analisi successive.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che i parametri correlati attraverso il coefficiente K sono costituiti dalla pressione di ingresso e dalla portata del gas di trasporto.
3. Metodo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che il coefficiente K è utilizzato per correlare la pressione di ingresso e la portata del gas di trasporto, mantenendo la portata ad un valore costante od a valori che seguono una curva predefinita, attraverso la programmazione della pressione di ingresso, al variare della temperatura della colonna.
4. Metodo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che il coefficiente K è utilizzato per correlare la pressione di ingresso e la portata del gas di trasporto in due colonne diverse ma nominalmente uguali, onde calcolare le pressioni di ingresso a portata uguale e costante ed utilizzare la pressione calcolata per la seconda colonna, in analisi condotte in condizioni di pressione costante o programmata.
5. Apparecchio di analisi gascromatografica per l'attuazione del metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, del tipo comprendente un forno a temperatura controllabile per il riscaldamento di una colonna gascromatografica capillare in esso contenuta, un iniettore per immettere una miscela da analizzare nella colonna, un rivelatore per rilevare all'uscita della colonna il passaggio dei componenti della miscela analizzata, mezzi per alimentare un gas di trasporto (carrier) alla detta colonna, mezzi per rilevare le condizioni di temperatura della colonna e di pressione di alimentazione ed eventualmente di uscita del gas di trasporto, nonché un sistema elettronico per il controllo dell'apparecchio, caratterizzato dal fatto di comprendere inoltre: un sensore della portata del gas di trasporto nella colonna; mezzi per calcolare il coefficiente K sulla base delle informazioni fornite dai rilevatori di temperatura, pressione e portata, durante un passaggio di gas di trasporto in condizioni costanti di temperatura e stabilizzate; mezzi per immagazzinare in una memoria del sistema la costante K calcolata; e mezzi per il controllo delle condizioni di analisi da parte del sistema utilizzando la costante K immagazzinata.
6. Apparecchio secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto di comprendere mezzi per effettuare automaticamente e a comando una procedura secondo la rivendicazione 1 per calcolare ed immagazzinare il coefficiente K.
7. Colonna capillare per gascromatografica, caratterizzato dal fatto di comprendere, fra i parametri caratteristici della stessa, un coefficiente (K) calcolato realizzando, in un apparecchio gascromatografico, la fase I del metodo secondo la rivendicazione 1.
8. Metodo per realizzare la riproducibilità dei tempi di ritenzione dei componenti di una miscela analizzata in un apparecchio di gascromatografia a seguito della sostituzione della colonna capillare utilizzata con una nominalmente uguale, in un medesimo apparecchio o in un altro apparecchio dello stesso tipo, caratterizzato dalle fasi di: • utilizzare una nuova colonna secondo la rivendicazione 7; • impostare nel sistema gascromatografico il valore del coefficiente (K) relativo a tale colonna; • utilizzare tale coefficiente (K) per correlare almeno due dei parametri pressione e portata del gas di trasporto, temperatura della colonna, nelle analisi successive.
9. Metodo per accertare la presenza di perdite o di ostruzioni nel circuito idraulico di una colonna secondo la rivendicazione 7, a valle del sistema di regolazione del gas di trasporto (carrier), il detto metodo comprendendo: • la caratterizzazione della colonna installata secondo il metodo della rivendicazione 1, con ottenimento di un valore sperimentale della costante K; • la comparazione fra il valore K determinato sperimentalmente e quello originariamente associato alla