ITMI981367A1

ITMI981367A1 - Agenti e loro composizioni per il trattamento dei capelli

Info

Publication number: ITMI981367A1
Application number: IT98MI001367A
Authority: IT
Inventors: Roberto Porta; Armando Cedro; Pia Alberico; Danilo Moltrasio
Original assignee: Crinos Industria Farmaco
Priority date: 1998-06-16
Filing date: 1998-06-16
Publication date: 1999-12-16
Also published as: IL130462A0; EP0965323B1; US6232302B1; ES2242329T3; IT1301720B1; EP0965323A3; EP0965323A2; TR199901334A2; TR199901334A3; PT965323E; ATE293426T1

Description

Descrizione dell'invenzione industriale a nome:

La presente invenzione riguarda prodotti da utilizzarsi come agenti tricogeni da applicare per via topica sul cuoio capelluto, per normalizzare il ciclo di crescita dei capelli, e come agenti antimicotici della microflora cutanea, quindi in grado di ridurre la forfora.

Più in particolare si riferisce ad agenti tricogeni o a loro composizioni aventi migliorata efficacia nell'aumentare la percentuale di capelli in fase di crescita, e allo stesso tempo attivi come agenti antimicrobici della pelle, privi di effetti collaterali degli antimicotici dell'arte nota e con elevata tollerabilità cutanea.

Il ciclo di crescita dei capelli é suddiviso in tre fasi successive che si ripetono periodicamente nella vita dell'individuo: la fase anagen, in cui si ha l'allungamento del fusto del capello, le fasi catagen, in cui si ha la cheratinizzazione progressiva del bulbo pilifero e non si ha crescita del fusto, e telogen, in cui non si ha alcuna modifica del bulbo pilifero o del fusto del capello.

La fase di anagen di solito ha una durata di molti mesi, o anni, ed é assai più lunga sia della fase di catagen (3 settimane) che di quella di telogen (3 mesi). In condizioni normali circa 85% dei capelli é in fase di anagen, 1% in catagen e 14% in telogen (C.E. Orfanos, R.H. Happle "Hair and hair disease" Springer-Verlag 1990). Nei soggetti con alopecia androgenetica si riduce sia la fase di anagen che della percentuale dei capelli in crescita.

Si definisce agente tricogeno secondo la presente invenzione una sostanza in grado di aumentare la percentuale di capelli in fase di crescita. Quindi un agente tricogeno può contribuire a normalizzare il ciclo di crescita, riallungando la fase di anagen. Le sostanze usate come agenti tricogeni devono rimanere a contatto con la pelle per periodi abbastanza lunghi e quindi non devono causare problemi di tollerabillità cutanea.

Sulla superficie cutanea e sul cuoio capelluto é presente una microflora tra i cui componenti principali si annoverano lieviti lipofili del genere Pityrosporum, che crescono nelle zone ricche di lipidi. Il Pityrosporum ovale é il lievito più diffuso sul cuoio capelluto.

La crescita eccessiva del Pityrosporum ovale provoca la comparsa della forfora. In alcuni soggetti con aumentata secrezione sebacea la proliferazione di questo fungo può indurre anche la dermatite seborroica, caratterizzata da seborrea, desquamazione e infiammazione.

Da quanto sopra é evidente che per preservare l'integrità morfologica e funzionale della cute e del cuoio capelluto é importante mantenere la microflora ospite a livelli fisiologici.

Per raggiungere questo obbiettivo, secondo l'arte nota, la pelle viene trattata con preparati contenenti composti ad attività antimicotica come ketoconazolo, litio succinato, zinco piritione, solfuro di selenio. Questi composti possono causare effetti indesiderati sulla cute e sul cuoio capelluto. Ad esempio il ketoconazolo induce irritazione locale, dermatiti; il litio succinato é controindicato in pazienti affetti da psoriasi perché é un potenziale agente infiammatorio, lo zinco piritione può provocare neuriti periferiche e il solfuro di selenio può indurre irritazione del cuoio capelluto, della congiuntiva e della parte interna delle pieghe cutanee. Di conseguenza i tempi di contatto con la pelle dei preparati contenenti questi composti devono essere ridotti.

Da quanto sopra é evidente che secondo l'arte nota non é pòssibile effettuare un unico trattamento per normalizzare il ciclo di crescita dei capelli e per prevenire o ridurre la forfora.

E' anche noto che composti destinati alla somministrazione percutanea devono avere un basso peso molecolare per poter venire facilmente assorbiti attraverso la pelle. E' altresì noto che per ottenere l'assorbimento topico dei polimeri naturali occorre diminuirne il peso molecolare, generalmente elevato e dell'ordine di diverse centinaia di Kilodalton, mediante un procedimento di depolimerizzazione.

La domanda di brevetto europeo EP 730.867 riguarda l'uso nel trattamento dermatologico e cosmetico della pelle e dei capelli, e nell'alopecia del cuoio capelluto, di polimeri ottenuti per depolimerizzazione da polianioni di origine vegetale. I prodotti depolimerizzati hanno un range di peso molecolare compreso tra 5.000 e 100.000, e contenuto di zolfo tra il 5 ed il 20% in peso. Non vengono portati esempi che dimostrino l'attività tricogena di questi prodotti, né si descrivono o si fa riferimento a metodi che consentano di ottenere questi composti. Non viene fatto alcun cenno al fatto che i composti riportati in detta domanda di brevetto siano agenti attivi nell'inibire la crescita del Pytirosporum. Prove eseguite dalla Richiedente hanno mostrato che tra i polimeri aventi le specifiche dei fucani depolimerizzati riportate nella domanda EP 730.867, ottenuti secondo i processi dell'arte nota (si veda l'esempio di confronto), non si ottengono prodotti capaci di inibire la crescita del Pityrosporum e quindi aventi attività antiforfora, e in più l'attività di crescita é insignificante .

Era sentita l'esigenza di utilizzare composti che fossero agenti efficaci nell'aumentare la percentuale di capelli in fase di crescita, e contemporaneamente agenti antimicrobici della pelle, in particolare attivi nella riduzione della forfora e privi degli effetti collaterali degli antimicotici dell'arte nota e dotati di elevata tollerabilità cutanea.

E' stato ora inaspettatamente e sorprendentemente trovato che é possibile soddisfare assieme dette esigenze impiegando una particolare classe di fucan solfati depolimerizzati aventi ben specifiche caratteristiche, che risultano efficaci nell'aumentare la percentuale di capelli in fase di crescita, e che sono in grado di inibire la crescita del Pytirosporum, sia sulla pelle che sul cuoio capelluto e sono inoltre privi di effetti collaterali.

Costituisce un oggetto della presente invenzione fucani solfati depolimerizzati e il loro uso come agenti tricogeni caratterizzati dai seguenti parametri (le percentuali sono in peso sul secco):

- Peso molecolare medio ponderale: 5.000 - 30.000 dalton; - Zolfo: 5 - 16%;

- Fucosio: 25 - 60%;

- Acidi uronici 2 - 25%;

In particolare i fucani cone sopra definiti sono in grado di inibire la crescita del Pytirosporum ovale.

Particolarmente preferiti sono i fucani depolimerizzati ottenibili da Fucus vesiculosus, Ascophyllum nodosum, Ecklonia kurome, Eisenia bicyclis, Laminaria digitata, Laminaria japonica, Padina pavonia, Pelvetia canaliculata, Sargassum linifolium, Undaria pinnatifida.

I metodi per la determinazione di questi parametri sono descritti nella domanda di brevetto europeo n. 97122241.9 a nome della Richiedente, qui incorporata integralmente per riferimento .

I fucani depolimerizzati da alghe brune aventi peso molecolare 14,000 - 30,000 dalton da utilizzarsi nella presente invenzione sono ottenibili con il procedimento descritto nella domanda di brevetto europeo n. 97122241.9, qui integralmente incorporata per riferimento.

I polimeri aventi peso molecolare inferiore a 14.000 dalton con le seguenti caratteristiche chimiche e chimico-fisiche:

- Peso molecolare medio ponderale: 5.000 - 14.000 dalton - Zolfo: 5 - 12,5%

- Fucosio: 25 - 43%

- Acidi uronici 9 - 25%

sono ottenibili con il seguente procedimento:

a) dispersione in acqua sotto agitazione della polvere secca e macinata dell'alga, o del materiale vegetale tal quale, in acqua, in modo da avere una concentrazione sul secco del 12,5% p/p, a una temperatura compresa tra 92 e 100°C, estraendo il materiale vegetale in queste condizioni per 16 ore;

b) filtrazione della sospensione e correzione del pH del filtrato a un valore compreso tra 2,0 e 2,5, allontanamento del precipitato formatosi per filtrazione, correzione del pH del sovranatante a un valore compreso tra 6,5 e 7,5;

c) ultrafiltrazione su membrana avente cut-off di 100.000 dalton per ridurre il volume della soluzione a 1/4 - 1/5 di quello iniziale, successiva dialisi nella stessa apparecchiatura contro 3 volumi di acqua distillata, opzionalmente seguita da una fase di concentrazione;

d) salatura della soluzione, aggiunta di due volumi di etanolo o acetone e recupero dell'estratto grezzo;

e) depolimerizzazione alla temperatura di 55°C dell'estratto grezzo in soluzione acquosa in presenza di un sale rameico inorganico in rapporto ponderale % con l'estratto compreso tra 0,12 e 0,14%, e di acqua ossigenata 8% in quantità tale che il rapporto tra il peso dell'estratto grezzo ed il volume in mi dell'acqua ossigenata 8% sia compreso tra 1/4 e 1/10, per il tempo necessario, determinato in prove di laboratorio, per ridurre il peso molecolare tra 5.000 e 14.000;

f) filtrazione, salatura della soluzione e precipitazione dei sali di rame dei fucani depolimerizzati per aggiunta di 2-3 volumi di etanolo o acetone,-g) dissoluzione del precipitato in acqua a una concentrazione compresa tra il 5 e 7% p/v e trattamento con una resina a scambio ionico nella forma Na+ per una notte sotto lenta agitazione; allontanamento della resina e correzione del pH a un valore compreso tra 6,0 e 7,0; salatura e precipitazione dei fucani depolimerizzati nella forma dei loro corrispondenti sali sodici per aggiunta di 2-3 volumi di etanolo od acetone.

Il modello sperimentale che é stato utilizzato nella presente domanda di brevetto per dimostrare che i fucani depolimerizzati dell'invenzione hanno migliorata efficacia nell'aumentare la percentuale dei capelli in fase di crescita é descritto nell'articolo di M.P. Philpott e al. "Human hair growth in vitro" J. Celi. Sci. 1990, 97463-471, modificato da G.E. Westgate "Prolonged maintenance of human hair follicles in vitro in a serum free medium" J. Celi. Sci. 1993, 129 372-379. La Richiedente ha utilizzato in questo esperimento follicoli piliferi sani, isolati da strisce di cuoio capelluto umano prelevati dalla zona occipitale di soggetti maschi durante interventi di autotrapianto. I follicoli piliferi sono stati colturati in adatto medium di coltura, contenente le sostanze in esame, come specificato negli esempi.

Questo modello riproduce i seguenti aspetti fondamentali del ciclo fisiologico normale del follicolo pilifero:

1) La velocità di crescita del fusto o stelo del capello (C.S. Harmon et alii, J. Invest. Dermatol. 1994, 103, 318-322) .

2) La medesima transizione anagen/catagen: la cheratinizzazione prossimale del fusto e la condensazione della papilla dermica al termine della fase di anagen, che sono le medesime modificazioni morfologiche che si osservano in vivo nella transizione dalla fase di anagen a quella di catagen (M. Taylor et alii, J. Invest. Dermatol. 1993, 100 237-239).

3) L'inibizione ad opera del testosterone o dell'epidermal growth factor (C. S. Harmon, vedi sopra) della crescita dei follicoli in coltura, con diminuzione della quantità di follicoli in crescita.

Nell'arte nota é stato verificato che la ciclosporina A (M. Taylor, vedi sopra), che provoca l'effetto collaterale della crescita dei peli nell'uomo, nello stesso modello usato dalla Richiedente ha prolungato il periodo di crescita del pelo di follicoli piliferi umani. Quindi il modello che é stato usato nella presente invenzione é predittivo dell'attività in vivo.

I fucani depolimerizzati con le caratteristiche chimiche e chimico-fisiche sopra descritte si sono dimostrati attivi nell'aumentare in modo statisticamente significativo (p<0,0l) la percentuale dei follicoli in crescita, rispetto ai controlli non trattati, per l'intera durata dell'esperimento (28 giorni) alla concentrazione utilizzata.

Questi composti sono quindi agenti efficaci per somministrazione topica sul cuoio capelluto, per normalizzare la durata della fase di anagen nei casi in cui é ridotta come ad es. nell'alopecia.

Sorprendentemente i composti depolimerizzati dell'invenzione si sono dimostrati agenti efficaci nell'inibire la crescita del Pytirosporum ovale a concentrazioni molto basse, inferiori a 0,1% p/v.

Quindi é possibile l'impiego dei fucani depolimerizzati dell'invenzione come agenti antimicotici.

Il prodotto di depolimerizzazione acida dell'esempio di confronto non ha invece alcuna proprietà antimicotica sul Pityrosporum ovale.

La tollerabilità delle preparazioni contenenti fucan solfati dell'invenzione é risultata molto buona.

I fucani secondo la presente invenzione, applicati topicamente in formulazioni cosmetiche preparate secondo l'arte nota, risultano efficaci anche nel mantenere i livelli fisiologici di idratazione cutanea. Di conseguenza l'applicazione topica sulla pelle di queste sostanze consente di ottenere vari vantaggi.

Gli usi previsti nella presente invenzione vengono realizzati impiegando fucan solfati veicolati in preparazioni ad uso topico a concentrazioni comprese tra 0,01 e 20%. Per composizioni nella forma di lozioni e shampoo, preferibilmente destinate al cuoio capelluto, preferibilmente si usano concentrazioni di fucan sulfato comprese tra 0,01 e 1%. Nelle formulazioni in creme e gel si usano preferibilmente concentrazioni da 1 a 20% p/v.

Le preparazioni contenenti i fucan solfati depolimerizzati della presente invenzione vengono applicate per via topica, localmente sulla pelle o sul cuoio capelluto, frizionando per facilitarne l'assorbimento o eventualmente mediante dispositivi noti nell'arte (es. patch).

Le preparazioni contenenti i fucan solfati depolimerizzati della presente invenzione vengono preparate secondo metodi ben noti all'esperto del ramo. Si veda ad esempio in Remington's Pharmaceutical Sciences 15a Ed.

I seguenti esempi vengono dati al solo scopo di illustrare l'invenzione e non costituiscono una limitazione della medesima .

ESEMPIO 1

Estrazione del orezzo di fucan solfato preparazione n. V0246.B In un reattore da 300 litri si versano 175 litri di acqua distillata. Si aggiungono 25 Kg di polvere secca di Fucus vesiculosus e si scalda con camicia di vapore a 92°C per 16 ore. Al termine si raffredda a 30°C, si aggiungono 5 Kg di Clarcel FLO/MA®, si filtra su filtro pressa utilizzando filtri Seitz K 800®, raccogliendo il filtrato e disperdendo il pannello in acqua (20 litri) tenendo sotto agitazione per 1 h a 60°C. Si filtra su filtri Seitz K 800®, si riuniscono i liquidi (220 litri) e si versano in un reattore provvisto di camieia di raffreddamento. Si aggiungono 5,5 Kg di Clarcel CBR® (polvere di diatomee calcinata e macinata). Mantenendo la temperatura all'interno del reattore tra 25 e 30°C si aggiungono sotto agitazione 1,5 litri circa di HC137%. Il pH della soluzione si abbassa a 2. L'agitazione viene proseguita per 15 minuti dopo l'aggiunta dell'acido e si filtra su filtri Seitz K 800®. I pannelli vengono dispersi in 20 litri di acido cloridrico diluito a pH 2 e si filtra di nuovo. Le fasi liquide vengono riunite. Si carica la soluzione in impianto per ultrafiltrazione Alfa Lavai® dotato di una cartuccia per ultrafiltrazione Millipore® avente cut-off = 100.000. Si concentra la soluzione in modo da ridurre il volume a 50 litri, poi si dializza a volume costante contro 3 volumi di acqua distillata. Ultimata la dialisi si riduce di nuovo il volume della soluzione a 25-30 litri. Si scarica il liquido, si sala aggiungendo NaCl fino a concentrazione 2% p/v del sale e si precipita l'estratto grezzo aggiungendo 2 volumi di acetone. Dopo decantazione si recupera il solido che viene disidratato, essiccato e macinato. L'estratto grezzo ottenuto V0246.B pesa 1665 g (resa 6,7%). I dati analitici sul secco sono i seguenti: zolfo 7,1%, fucosio 32,0%, acidi uronici 25,0%, peso molecolare 800.000.

ESEMPIO 2

Estrazione del fucan solfato grezzo preparazione VQ246.C Si ripete l'esempio precedente partendo da 25 Kg di un nuovo lotto di Fucus Vesiculosus. Il pH della precipitazione intermedia é di 2,5. Si ottengono 2100 g (resa 8,4%) di prodotto n. batch V0246.C. Determinazioni analitiche: zolfo 7,6%, fucosio 35,8%, acidi uronici 26,1%, peso molecolare 470.000. ESEMPIO 3

Estrazione del fucan solfato grezzo preparazione V0246.D Si ripete l'esempio 1 partendo da 25 Kg di un nuovo lotto di Fucus Vesiculosus. Si ottengono 2470 g (resa 9,9%) di prodotto V0246.D. Determinazioni analitiche: zolfo 6,2%, fucosio 36,3%, acidi uronici 22,1%, peso molecolare 1.007.000.

ESEMPIO 4

Depolimerizzazione del grezzo V0246.C con sali di rame ed ottenimento del fucan solfato depolimerizzato prep. n. 0195/97086-A

20 g di V0246.C vengono sciolti in 400 mi di acqua distillata (concentrazione 5% p/v). Si scalda a 55°C e si aggiungono 80 mg di acetato rameico monoidrato, correggendo il pH a 7,5 con una soluzione di NaOH 1 N. Con una pompa peristaltica, regolata al flusso di 18,5 ml/h, si aggiunge una soluzione 8% p/v di acqua ossigenata, mantenendo il pH della soluzione al valore di 6 aggiungendo gradualmente una soluzione di NaOH 30%. in base alle determinazioni di peso molecolare, dopo 6 ore la depolimerizzazione viene interrotta (volume complessivo di acqua ossigenata impiegato: 110 mi). Si raffredda a temperatura ambiente, si sala con sodio acetato fina ad avere una concentrazione 7% p/v del sale e si aggiungono tre volumi di etanolo. Si disidrata e si essicca. Si ridiseloglie il precipitato (9,1 g) in 14Ό mi di acqua deionizzata e si aggiungono 95 mi di resina a scambio ionico Amberlite IRC 718® (forma Na+). Si lascia sotto lenta agitazione per una notte. Si recupera la soluzione, si lava la resina con due volumi di acqua distillata e si filtra su buckner con pannello di Clarcel CBR® di peso uguale a quello della polvere recuperata dopo la depolimerizzazione. La soluzione limpida viene salata con sodio acetato anidro fino ad avere una concentrazione del 7% p/v. Si precipita con 3 volumi di etanolo. Dopo disidratazione ed essiccamento si ottengono 7,1 g di fucan solfato depolimerizzato prep. n. 0195/97086-A. Determinazioni analitiche: zolfo 8,6%, fucosio 30,0%, acidi uronici 16,1%, peso molecolare 5.600.

ESEMPIO 5

Depolimerizzazione del grezzo V0246.C con sali di rame ed ottenimento del fucan solfato depolimerizzato prep. n. V0268.B

300 g di V0246.C sono sciolti in 6 litri di acqua distillata. Si scalda a 55°C e si aggiungono 1,2 g di acetato rameico monoidrato, correggendo il pH a 7,5 con una soluzione di NaOH 1 N. Con una pompa peristaltica regolata al flusso di 18,3 ml/h si aggiunge una soluzione 8% p/v di acqua ossigenata, mantenendo il pH della soluzione al valore di 6,5 mediante graduale aggiunta di NaOH 30%. In base alle determinazioni di peso molecolare, dopo 1,5 ore la depolimerizzazione viene interrotta (volume complessivo di acqua ossigenata impiegato: 1,65 litri). Si procede per recuperare il prodotto depolimerizzato come descritto nell'esempio 4. Si disidrata e si essicca. Si ridiscioglie il precipitato (173 g) in 2,6 litri di acqua deionizzata e si aggiungono 1,73 litri di resina a scambio ionico Amberlite IRC 718® (forma Na+), lasciando sotto lenta agitazione per una notte. Si procede come descritto nell'esempio 4. Dopo disidratazione ed essiccamento si ottengono 139,5 g del fucan solfato depolimerizzato (resa 46%) prep. n. V0268.B. Determinazioni analitiche: zolfo 7,0 3⁄4, fucosio 28,5%, acidi uronici 15,4%, peso molecolare 10700.

ESEMPIO 6

Depolimerizzazione del orezzo V0246.B con sali di rame e ottenimento del fucan solfato depolimerizzato prep. n. V0264.B 100 g di V0246.B sono sciolti in 2 litri di acqua distillata. Si scalda a 55°C e si aggiungono 4 g di acetato rameico monoidrato, correggendo il pH a 7,5 con una soluzione di NaOH 1 N. Con una pompa peristaltica regolata al flusso di 108,3 ml/h si aggiunge una soluzione 8% p/v di acqua ossigenata, mantenendo il pH della soluzione a un valore compreso tra 6,0 e 6,5 mediante graduale aggiunta di NaOH 30%. In base alle determinazioni di peso molecolare, dopo 24 ore la depolimerizzazione viene interrotta (volume complessivo di acqua ossigenata impiegato: 2,600 litri). Si procede come descritto nell'esempio 4. Si disidrata e si essicca. Si ridiscioglie il precipitato (23,2 g) in 400 mi di acqua deionizzata e si aggiungono 260 mi di resina a scambio ionico Amberlite IRC 718® (forma Na+) lasciando sotto lenta agitazione per una notte. Si procede come descritto nell'esempio 4. Dopo disidratazione ed essiccamento si ottengono 16,4 g del fucan solfato depolimerizzato (resa 16,4%) prep. n. V0264.B. Determinazioni analitiche: zolfo 14,3 %, fucosio 44,2%, acidi uronici 3,4%, peso molecolare 17.500.

ESEMPIO 7

Depolimerizzazione del grezzo VQ246.C con sali di rame ed ottenimento del fucan solfato depolimerizzato prep. n. V0260.C 200 g di V0246.C sono sciolti in 4 litri di acqua distillata. Si scalda a 55°C e si aggiungono 8 g di acetato rameico monoidrato, correggendo il pH a 7,5 con una soluzione di NaOH 1 N. Con una pompa peristaltica, regolata al flusso di 183,3 ml/h, si aggiunge una soluzione 8% p/v di acqua ossigenata, mantenendo il pH della soluzione a un valore compreso tra 6,0 e 6,5 mediante graduale aggiunta di NaOH 30%. In base alle determinazioni di peso molecolare dopo 6 ore la depolimerizzazione viene interrotta (volume complessivo di acqua ossigenata 1,100 litri). Si aggiunge una soluzione di acetato sodico triidrato fino ad avere una concentrazione in soluzione di 11% p/v e si precipita con due volumi di etanolo. Si disidrata e si essicca. Si ridiscioglie il precipitato (79 g) in 1,2 1 di acqua deionizzata. Si centrifuga a 3000 rpm e si aggiungono 800 mi di resina a scambio ionico Amberlite IRC 718® (forma Na+) lasciando sotto lenta agitazione per una notte. Si procede come nell'esempio 4, filtrando su buckner con 15 g di pannello di Clarcel CBR®. Si corregge il pH a 6,5 e si procede come nell'esempio 4, precipitando con due volumi di etanolo. Si ottengono 60,1 g di fucan solfato depolimerizzato (resa 30,1%) prep. n. VO260.C. Determinazioni analitiche: zolfo 12,6 %, fucosio 47, acidi uronici 8,1%, peso molecolare 29.000.

ESEMPIO 8

Depolimerizzazione in ambiente acido del fucan solfato grezzo V0246.B

5 g di estratto grezzo vengono sciolti in 500 mi di acqua distillata ed aggiunti di 10 mi di HC11. In questo modo il pH della soluzione si abbassa a circa 2,2, vale a dire a un valore debolmente acido, tale da consentire che il composto venga idrolizzato in modo blando. Si scalda a 60°C per 12 ore. Si raffredda la soluzione e si neutralizza aggiungendo pochi mi di di NaOH 30% p/v. Il liquido viene dializzato in apparecchiatura di ultrafiltrazione Amicon® CH2-A a volume costante, in passaggi consecutivi, contro 5 volumi di acqua distillata ogni volta. Nel primo passaggio si usa una membrana avente cut-off di 3.000 Da, nel secondo di 10.000 Da e nel terzo 100.000 Da. Il permeato dell'ultima dialisi viene salato con NaCl fino a concentrazione 2% p/v e si aggiungono 2 volumi di acetone. Si ottengono 0,5 g della preparazione 0195/95026-D avente le seguenti caratteristiche analitiche: peso molecolare 65000, zolfo 5,2%, acidi uronici 20,1%, fucosio 21,2%. Questa preparazione é stata usata per le prove biologiche e microbiologiche di confronto degli esempi 11B e 12B.

ESEMPIO 9

Estrazione del fucan solfato grezzo preparazione VQ271.A

1 Kg di polvere secca di Ascophyllum nodosum vengono sospesi sotto agitazione in 7 litri di acqua distillata in pallone da 15 litri con refrigerante. A sospensione avvenuta (circa 15 minuti) si scalda in bagno ad olio a 100°C per 16 ore. Si raffredda a 40°C, si centrifuga a 3000 giri per 20 minuti la sospensione, utilizzando 4 provettoni da centrifuga da I litro. Il residuo gelatinoso che si accumula sul fondo dei recipienti viene sospeso in 3 litri di acqua alla temperatura di 60°C, mediante agitazione meccanica, mantenendo l'agitazione per 15 minuti circa. Si centrifuga di nuovo ed il sovranatante così ottenuto viene riunito al precedente. Ai sovranatanti riuniti (7,5 litri) si aggiungono 20 g di Clarcel CBR® (perlite calcinata e macinata). Si filtra su Seitz K 800® recuperando 6,65 litri di filtrato; si corregge il pH a 2,0 mediante aggiunta di 330 mi di HC12 N e si centrifuga di nuovo. II sovranatante viene neutralizzato (pH 6,5) con circa 70 mi di una soluzione di NaOH 30%, quindi viene concentrato mantenendo il volume costante a 1,5 litri in apparecchiatura di ultrafiltrazione Amicon® CH2-A su cui é stata installata una membrana con cut-off di 100.000 Da. Ultimata la fase di concentrazione la soluzione viene dializzata utilizzando la stessa membrana contro tre volumi di acqua distillata.

Al retenato vengono aggiunti 945 g (7% p/v) di sodio acetato anidro, si agita fino ad ottenere una soluzione omogenea e si precipita il soluto con due volumi di etanolo 95%. Si lascia decantare per una notte ed il solido viene disidratato ed essiccato. Si recuperano 75,46 g (resa 8,4%) di un solido (preparazione V0271.A) avente i seguenti dati analitici: zolfo 5,2%, fucosio 25,2%, acidi uronici 19,7%, peso molecolare 483.000.

ESEMPIO 10

Depolimerizzazione del fucansolfato V0271.A con sali di rame ed ottenimento del fucan solfato depolimerizzato prep. n- V0272.A

25 g di V0271.A vengono sciolti in 500 ml di acqua distillata (concentrazione 5% p/v). Si scalda a 55°C e si aggiungono 100 mg di acetato rameico monoidrato, correggendo il pH a 7,5 con una soluzione di NaOH 1 N. Con una pompa peristaltica, regolata al flusso di 18,5 ml/h, si aggiunge una soluzione 8% p/v di acqua ossigenata (totale 137,5 mi), mantenendo il pH della soluzione al valore di 6,50 aggiungendo gradualmente una soluzione di NaOH 30%. In base alle determinazioni di peso molecolare, dopo 24 ore la depolimerizzazione viene interrotta. Si raffredda a temperatura ambiente, si decanta il sovranatante, si sala con sodio acetato fino ad avere una concentrazione 7% p/v del sale e si aggiungono due volumi di etanolo. Si disidrata e si essicca. Si ridiscioglie il precipitato (9 g) in 130 mi di acqua deionizzata e si aggiungono 90 mi di resina a scambio ionico Amberlite IRC 718® (forma Na+). Si lascia sotto lenta agitazione per una notte. Si recupera la soluzione, si lava la resina con due volumi di acqua distillata e si filtra su buckner con pannello di Clarcel CBR® di peso uguale a quello della polvere recuperata dopo la depolimerizzazione. La soluzione limpida viene salata con sodio acetato anidro fino ad avere una concentrazione del 7% p/v. Si precipita con 2 volumi di etanolo. Dopo disidratazione ed essiccamento si ottengono 7,5 g di fucan solfato depolimerizzato V0272.A. Determinazioni analitiche: zolfo 9,2%, fucosio 32,7%, acidi uronici 17,3%, peso molecolare 8.900.

ESEMPIO 11

Es. HA Metodo per valutare l'efficacia della preparazione di fucan solfato VQ268.B dell'invenzione nell'aumentare la % di follicoli piliferi in fase di crescita

I follicoli piliferi vengono prelevati dalla zona occipitale di soggetti maschi, accuratamente ripuliti, e posti in pozzetti contenenti 1 mi di medium nutritivo William's medium E (ICN catalogue 1995). Il medium é addizionato di 10 ng/ml di idrocortisone, 10 μg/ml di insulina, 2 mmoli di glutamina e di un complesso antimicrobico comprendente streptomicina 100 μg/ml, penicillina 100 U/ml, anfotericina B 0,25 μg/ml . Le colture sono state aggiunte di una quantità di fucan solfato depolimerizzato tale da ottenere una concentrazione del composto di 80 μg/ml rispettivamente. I follicoli usati nell'esperimento sono stati ottenuti da n. 10 soggetti diversi (12 follicoli prelevati da ciascun soggetto) e suddivisi in 2 gruppi (controllo e il gruppo trattato alla concentrazione di fucan solfato sopra indicata). Ogni gruppo é stato replicato 6 volte. Le colture sono state incubate a 37°C in atmosfera umidificata contenente 5% C02, per 28 giorni. Al decimo e ventunesimo giorno il medium di coltura é stato sostituito con una aliquota fresca dello stesso medium. La lunghezza della porzione del fusto del capello esterna al follicolo é stata misurata subito dopo l'isolamento di ciascun follicolo, e poi al terzo, settimo, decimo, quattordicesimo, diciassettesimo, ventunesimo, ventiquattresimo e ventottesimo giorno di coltura. Il criterio per stabilire quanti follicoli si trovavano nella fase di crescita é stato che l'incremento della lunghezza del fusto, calcolato come la differenza (1" - 1') in cui 1" = lunghezza attuale, 1' = lunghezza determinata il giorno della precedente determinazione, doveva essere diverso da zero.

Nell'esperimento é stata usata la preparazione VO 268.B ed i relativi risultati sono riportati in Tabella I e si osserva, in particolare, che al ventunesimo giorno dall'inizio del trattamento la percentuale dei follicoli in crescita é più del doppio rispetto ai follicoli non trattati.

Es. 11B (di confronto)

Determinazione dell'attività della preparazione dell'Es. 8 ottenuta per depolimerizzazione acida

Utilizzando il metodo descritto nell'Es. 11A impiegando la preparazione ottenuta per depolimerizzazione acida dell'es. 8 alla dose di 80 μg/ml si sono ottenuti i risultati riportati in Tabella II. Dalla tabella si evince che a tutti i tempi la percentuale dei follicoli piliferi in crescita nel medium addizionato del fucan solfato a basso peso molecolare ottenuto per depolimerizzazione acida si avvicinano a quello del gruppo controllo. Quindi questo fucan solfato é poco attivo rispetto ai fucani solfati della presente invenzione. Es. 11C

Determinazione dell'attività delle preparazioni dell'invenzione degli Es. 4. 6, 7 e 10

L'esperimento dell'esempio HA é stato ripetuto con la preparazione n. 195/97086-A (Es. 4), V0264.B (Es. 6), VO260.C (Es. 7) e V0272.A (Es. 10). La tabella III riporta la percentuale di follicoli piliferi in crescita al diciassettesimo giorno di osservazione in terreni di coltura addizionati di preparazioni diverse di fucan solfato secondo la presente invenzione alla concentrazione di 80 μg/ml. Si osserva che la percentuale di follicoli piliferi in crescita é significativamente superiore rispetto alla percentuale di follicoli del gruppo controllo e i valori ottenuti sono compresi in un intervallo piuttosto piccolo e si possono considerare .tra di loro omogenei.

ESEMPIO 12

Es. 12A Determinazione dell'attività antimicrobica in vitro dei fucan solfati VQ268.B (inibizione in vitro della crescita del lievito Pvtirosporum ovale) e del prodotto ottenuto per depolimerizzazione acida secondo l'esempio 8

Il ceppo utilizzato é quello ATCC 12078 proveniente dall'Istituto Sieroterapico di Milano - Italia. Il ceppo é stato sospeso in 100 mi di soluzione fisiologica (soluzione madre , M).

1) Conta microbica totale in terreno liquido.

Sono state allestite due aliquote da 100 mi di un medium di coltura generico preparato sciogliendo in 1000 mi di acqua distillata, 5 g di NaCl e 10 g di peptone (brodo nutritivo); ad ogni aliquota sono stati aggiunti 10 mi di soluzione madre.

In una delle due sospensioni é stato aggiunto il prodotto da esaminare in polvere fino ad ottenere una concentrazione di 1 mg/ml (campione B). Dopo aver incubato a una temperatura di 36°C per 48 ore é stata determinata la conta microbica totale (CMT) per diluizioni successive e spatolamento di 1 ml sulla piastra.

2) Conta microbica totale in terreno solido.

Parallelamente alla conta precedente é stata determinata la CMT relativa alla soluzione madre utilizzando due piastre diverse, una come riferimento (campione 1) e l'altra aggiunta del campione in esame (Campione 2). I risultati ottenuti sono stati i seguenti:

1} Conta microbica totale in terreno solido:

Campione A (bianco): 1,9 x 102 unità formanti colonie (u.f.c.)/l g di soluzione madre;

Campione B (con il composto in esame): < 1 unità formanti colonie/l g di soluzione madre 2) Conta microbica totale in terreno liquido:

Campione 1 (bianco): 8,2 x IO2 unità formanti colonie/l g di soluzione madre;

Campione 2 (con il composto in esame): < 1 unità formanti colonie/l g di soluzione madre. Es. 12B di confronto

Determinazione dell'attività antibatterica in vitro del prodotto ottenuto per depolimerizzazione acida secondo l'esempio 8

Seguendo il metodo dell'es. 12A, é stata determinata l'attività antimicrobica del composto ottenuto nell'esempio 8. I risultati sono stati i seguenti:

1) Conta microbica totale in terreno solido:

Campione A (bianco): > 5 x IO7 unità formanti colonie (u.f.c.)/l g di soluzione madre;

Campione B (con il composto in esame): > 5 x IO7 unità formanti colonie/1 g di soluzione madre

2) Conta microbica totale in terreno liquido:

Campione 1 (bianco): > 5 x 107 unità formanti colonie/l g di soluzione madre;

Campione 2 (con il composto in esame) > 5 x 10 unità formanti colonie/l g di soluzione madre.

Quindi il composto non ha alcuna attività antibatterica. ESEMPIO 13

Formulazioni dei fucan solfati depolimerizzati in soluzione idroalcoolica

ESEMPIO 14

Prove di tollerabilità cutanea della preparazione V0268.B La formulazione dell'Es.· 13B é stata applicata nella parte volare dell'avambraccio di n. 20 volontari mediante patch test occlusivo per 48 ore. Dopo Rimozione del patch, le valutazioni visive della zona di applicazione sono state effettuate ai seguenti intervalli: 15 minuti, 24, 48 e 72 ore. A tutti i tempi di osservazione non si sono rilevate alterazioni cutanee di rilievo.

ESEMPIO 15

Formulazione dei fucan solfati depolimerizzati in crema

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Uso di fucan solfati depolimerizzati per aumentare la percentuale di capelli in fase di crescita, e come agenti antimicrobici in grado di inibire la crescita del Pytirosporum sulla pelle e sul cuoio capelluto, caratterizzati dai seguenti parametri (percentuali in peso sul secco): - Peso molecolare: 5.000 - 30.000 dalton; - Zolfo: 5 - 16%; - Fucosio: 25 - 60%; - Acidi uronici 2 - 25%; 2. Uso secondo la rivendicazione 1 in cui il Pytirosporum é il Pytirosporum ovale. 3. Uso secondo le rivendicazioni 1-2 di fucan solfati depolimerizzati ottenibili da Fucus vesiculosus, Ascophyllum nodosum, Ecklonia kurome, Eisenia bicyclis, Laminaria digitata, Laminaria japonica, Padina pavonia, Pelvetia canaliculata, Sargassum linifolium, Undaria pinnatifida. 4. Uso secondo le rivendicazioni 1-3 di fucan solfati depolimerizzati aventi le seguenti caratteristiche chimiche e chimico-fisiche : - Peso molecolare: 5.000 - 14.000 dalton - Zolfo: 5 - 12,5% - Fucosio: 25 - 43% - Acidi uronici 9 - 25% 5. Uso secondo le rivendicazioni 1-4, caratterizzato dal fatto di venire realizzato impiegando composizioni ad uso topico contenenti fucan solfati a concentrazioni comprese tra 0,01 e 20% p/v. 6. Uso secondo la rivendicazione 5 in cui per lozioni e shampoo si impiegano concentrazioni di fucan solfato comprese tra 0,01 e 1% p/v. 7. Uso secondo la rivendicazione 5 in cui per creme e gel si impiegano concentrazioni di fucan solfato comprese tra 0,1 e 20% p/v.. 8. Fucan solfati secondo la rivendicazione 4. 9. Procedimento per ottenere i fucan solfati della rivendicazione 8 comprendente i seguenti passaggi: a) Dispersione in acqua sotto agitazione della polvere secca e macinata dell'alga, o del materiale vegetale tal quale in modo da avere una concentrazione sul secco del 12,5% p/p, a una temperatura compresa tra 92 e 100°C, estraendo il materiale vegetale in queste condizioni per 16 ore; b) filtrazione della sospensione e correzione del pH dei filtrato a un valore compreso tra 2,0 e 2,5, allontanamento del precipitato formatosi per filtrazione, correzione del pH del sovranatante a un valore compreso tra 6,5 e 7,5; c) Ultrafiltrazione su membrana avente cut-off di 100.000 dalton per ridurre il volume della soluzione a 1/4 - 1/5 di quello iniziale, successiva dialisi nella stessa apparecchiatura contro 3 volumi di acqua distillata, opzionalmente seguita da una fase di concentrazione; d) salatura della soluzione, aggiunta di due volumi di etanolo o acetone e recupero dell'estratto grezzo; e) depolimerizzazione alla temperatura di 55°C dell'estratto grezzo in soluzione acquosa in presenza di un sale rameico inorganico in rapporto ponderale % con l'estratto compreso tra 0,12 e 0,14%, e di acqua ossigenata 8% in quantità tale che il rapporto tra il peso dell'estratto grezzo ed il volume in mi dell'acqua ossigenata sia compreso tra 1/4 e 1/10, per il tempo necessario per ridurre il peso molecolare tra 5.000 e 14.000; f) filtrazione, salatura della soluzione e precipitazione dei sali di rame dei fucani depolimerizzati per aggiunta di 2-3 volumi di etanolo o acetone,-g) Dissoluzione del precipitato in.acqua a una concentrazione compresa tra il 5 e 7% p/v e trattamento con una resina a scambio ionico nella forma Na+ per una notte sotto lenta agitazione; allontanamento della resina e correzione del pH a un valore compreso tra 6,0 e 7,0, salatura e precipitazione dei fucani depolimerizzati nella forma dei loro corrispondenti sali sodici per aggiunta di 2-3 volumi di etanolo od acetone.