ITMI942025A1 - Composizioni farmaceutiche contenenti microorganismi ingegnerizzati e loro uso per terapia - Google Patents

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Description

"COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE CONTENENTI MICROORGANISMI INGEGNERI ZZATI E LORO USO PER TERAPIA"
La presente invenzione riguarda conposizioni farmaceutiche contenenti microorganismi ingegnerizzati, in grado di produrre entità proteiche farmacologicamente attive, e il loro uso per la scraninistrazione efficace e conveniente di dette entità proteiche nei siti anatomici in cui si vuole ottenere l'effetto terapeutico.
BACKGROUND DELL'INVENZIONE
L'avvento dei farmaci da DNA ricombinante ha notevolmente trasformato nell'ultimo decennio l'aspettativa terapeutica e la qualità della vita in molte patologie a esito fatale. Negli anni a venire i farmaci ottenuti tramite tecniche di DNA ricontainante aumenteranno esponenzialmente. Ma se da un lato l'inportanza dei farmaci proteici da DNA ricombinante è innegabile, dall'altro il loro crescente impiego particolarmente in patologie croniche può presentare problemi relativi alla loro stessa natura proteica. Infatti, le proteine seguono un diverso destino rispetto ai farmaci di sintesi organica (distruzione proteolitica, immunogenicità, etc.) che ne rappresenta un forte deterrente particolarmente in patologie non immediatamente fatali. Molti problemi che attualmente acconpagnano l'impiego terapeutico di proteine sono dovuti al fatto che esse vengano generalmente scrrministrate per via sistemica. Ciò le rende maggiormente esposte all'attacco da parte dei sistemi di difesa e di omeostasi dell'organismo. Perciò il destino di molti farmaci riconbinanti, ottenuti dopo laboriose e costose procedure di purificazione, è quello di andare incentro a una veloce distruzione da parte di meccanismi proteolitici e catabolici.
Questo problema è ancora più critico quando l'effetto farmacologico delle proteine riconbinanti deve esprimersi a livello mucosale, sia delle mucose gastrointestinali, che di quelle polmonari e di quelle riproduttive. Diviene così importante poter adottare vie di somministrazione locale dellé proteine che ne permettano una maggiore efficacia limitandone la distruzione e il catabolismo. Al fine di ottenere una efficace veicolazione di entità farmacologicamente attive nei distretti di interesse, si è perciò ipotizzato di poter sfruttare certe caratteristiche biologiche specifiche dei microorganismi, per esempio la capacità di aderire a cellule epiteliali (Karlsscn K.-A. Annu. Rev. Biochem. 58: 309, 1989) o quella di formare spore resistenti a condizioni avverse (Kaiser D. & Losick R. Celi. 73: 237, 1993) o quella di replicarsi all'interno delle cellule dell'ospite e di rilasciare prodotti microbici nel citoplasma cellulare, per indurli a produrre localmente particolari proteine farmacologicamente attive. Ciò al fine di mettere a punto una ccnposizicne farmaceutica utile per la somministrazione di proteine riconbinanti, efficace e ccn limitati effetti collaterali in quanto selettivamente indirizzata a certi siti anatomici.
CAMPO DELL' INVENZIONE
La presente invenzione riguarda la preparazione di composizioni farmaceutiche contenenti microorganismi ingegneri zzati , utili per il trattamento terapeutico di diverse condizioni patologiche, ideate sfruttando caratteristiche naturali dei microorganismi sviluppate nel corso dell'evoluzione per adattarsi a sopravvivere all'interno del corpo umano. In particolare la presente invenzione riguarda lo sfruttamento della capacità dei microorganismi di vivere a livello delle mucose, che rappresentano l'interfaccia tra l 'ambiente esterno e l'interno dell'organismo, per assicurare il trasporto di proteine da DNA ricombinante in modo efficace e selettivo ai siti anatomici ove maggiormente necessiti l'effetto farmacologico delle proteine stesse.
La presente invenzione riguarda anche lo <■ >sfruttamento dei meccanismi di lisi cellulare (sporulazione, autolisi) di certi microorganismi per il rilascio di proteine nei siti anatomici voluti.
Il canpo dell ' invenzione include:
preparazicni farmaceutiche contenenti microorganismi ingegneri zzati, capaci di produrre proteine farmacologicamente attive; preparazioni farmaceutiche contenenti microorganismi ingegneri zzati, capaci di produrre proteine farmacologicamente attive all 'interno del microorganismo stesso;
preparazioni farmaceutiche contenenti microorganismi ingegnerizzati, capaci di produrre proteine farmacologicamente attive e di rilasciarle all 'esteri» del microorganismo stesso;
uso di tali preparazicni farmaceutiche a scopo terapeutico per veicolare le proteine farmacologicamente attive nei siti anatomici in cui i microorganismi giungono e producono le proteine farmacologicamente attive;
uso di microorganismi per la somministrazione localizzata delle proteine farmacologicamente attive in distretti anatomici particolari, per esenpio le mucose;
uso di microorganismi per la somministrazione sistemica delle proteine farmacologicamente attive, per esenpio tramite assorbimento delle proteine attraverso le mucose;
- uso di microorganismi diversi, con caratteristiche di attecchimento e di crescita adatte per la sonministrazicne localizzata delle proteine farmacologicamente attive;
uso di microorganismi che formino spore o che vadano incentro a lisi anche senza formazione di spore, rilasciando le proteine farmacologicamente attive nel sito anatomico voluto;
uso di spore di microorganismi che attecchiscano selettivamente in certi siti anatomici, per esempio le mucose intestinali, in grado di germinare e produrre localmente le proteine farmacologicamente attive.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL INVENZIONE
La presente invenzione ha per oggetto preparazioni farmaceutiche contenenti microorganismi ingegnerizzati in grado di produrre proteine ricombinanti farmacologicamente attive. La presente invenzione, sfruttando le capacità intrinseche di alcuni microorganismi di aderire alle mucose e di colonizzarle, permette la produzione e la somministrazione locale di proteine ricombinanti farmacologicamente attive il cui gene codificante sia stato preventivamente inserito nei microorganismi utilizzati per la preparazione farmaceutica. In questo modo è possibile effettuare trattamenti terapeutici con farmaci biotecnologici, che abbiano il vantaggio di essere mirati, efficaci e di basso costo, in quanto la produzione in situ delle entità terapeutiche da parte di batteri riconbinanti permette di ritardare i processi distruttivi catabolici e contemporaneamente di evitare costosi processi di purificazione. La presente invenzione ha analogie con l'approccio vaccino logico che impiega organismi vivi attenuati, ma si differenzia da esso nella sostanza in quanto la proteina rilasciata non è finalizzata a suscitare la risposta immunitaria dell'ospite, bensì ad agire direttamente ocre farmaco.
La presente invenzione sfrutta infatti la capacità dei microorganismi di colonizzare aree diverse dell'organismo ospite (per esempio l'essere umano) e di produrre nell'area specifica la proteina farmacologicamente attiva. Sano infatti noti microorganismi aventi tropismo selettivo per la mucosa del tratto gastro-intestinale, la mucosa boccale ed esofagea, la mucosa nasale, faringea e tracheale, la mucosa vaginale, la cute, il tratto bronco-polmonare etc.. A titolo di esempio , si può citare la possibilità di usare S. pyogenes , mutans , qordonii per colonizzare la mucosa boccale e rilasciare nel sito una molecola anti-infianmatoria, utile per la terapia di malattie infiammatorie delle gengive e dei denti.
Analogamente, si può sfruttare la capacità di altri batteri di colonizzare la mucosa intestinale (per esempio quelli che carpcngcno la . flora intestinale, incluso E. coli) per far arrivare nell'area farmaci
per il controllo di patologie locali (per esempio colite ulcerosa o
malattia di Chron), dopo somministrazione dei batteri modificati per via
orale o per via rettale. Data l'alta capacità di assorbimento della
mucosa intestinale, è prevista la possibilità che l'attecchimento di
batteri modificati nell'intestino possa portare al passaggio della
molecola farmacologicamente attiva in circolo, per terapie di tipo
sistemico .
Le composizioni farmaceutiche dell 'invenzione possono inoltre
contenere spore di batteri sporigeni (per esaipio specie appartenenti ai
generi Baciilus e Clostridium) ingegnerizzati per produrre la molecola
farmacologicamente attiva. La spora ha caratteristiche di resistenza in
ambienti estremi ed è perciò particolarmente adatta per la
somministrazione orale, essendo in grado di resistere all'acidità
gastrica e di raggiungere inalterata la mucosa intestinale. La spora di
un batterio ccn tropismo per l'ambiente intestinale può germinare e
colonizzare la mucosa intestinale, producendo nel sito la molecola
farmacologicamente attiva.
Secondo un'ulteriore forma di realizzazione, le ccnposizioni
farmaceutiche dell'invenzione possano contenere batteri sporigeni (per
esempio specie appartenenti ai generi Bacillus e Clostridium),
ingegnerizzati per produrre la molecola farmacologicamente attiva,
sommninistrati per via orale (in formulazioni che li proteggano
dall'acidità gastrica) o per via rettale, che siano indotti dall ambiente intestinale a sporulare , andando perciò incentro al fenomeno di autolisi con il rilascio nel sito delle molecole presenti nel loro citoplasma, inclusa la molecola farmacologicamente attiva. In tal modo si ottiene il rilascio nel sito voluto di una dose molto ben determinabile della proteina farmacologicamente attiva, in quanto il batterio ncn si replica. Analogamente, gli stessi batteri che sporulano nell'area intestinale possono essere ingegnerizzati (oon inattivazione o delezione di uno qualsiasi dei fattori necessari alla formazione della spora, per esempio le proteine della spora) in modo da andare incontro al fenomeno di autolisi (stimolato dalle condizioni avverse dell'ambiente intestinale) senza la formazione di spore. Tale ulteriore modifica genetica porta dunque al rilascio controllato della molecola farmacologicamente attiva nel sito, oon la morte e perciò la completa eliminazione del batterio ingegnerizzato durante il rilascio del farmaco.
La proteina farmacologicamente attiva può anche essere secreta dai batteri trasformati utilizzati nelle composizioni dell'invenzione. Per esempio, batteri cane subtilis possono essere ingegnerizzati con il gene per la proteina farmacologicamente attiva inserito in un vettore di secrezione, che permetta il rilascio della molecola senza che sia necessaria la lisi del batterio.
La molecola farmacologicamente attiva può essere espressa da-i microorganismi ingegnerizzati in maniera costitutiva (per esempio quando il gene è inserito sotto il controllo di un promotore costitutivo) oppure in maniera inducibile (per esempio quando il gene è inserito sotto il controllo di un promotore indicibile).
La presente invenzione prevede la. possibilità di inserire nei batteri inclusi nella composizione farmaceutica il gene di qualsiasi proteina farmacologicamente attiva, ad esempio citochine, o loro antagonisti, fattori di crescita, armoni, enzimi.
Secondo la presente invenzione , le composizioni farmaceutiche possono contenere batteri (vivi o liofilizzati) o spore in quantitativi medi giornalieri ccnpresi fra 10 e 10 , a seconda delle caratteristiche biologiche e di produttività del microorganismo ingegnerizzato, della via di somministrazione, delle caratteristiche farmacologiche della proteina ricombinante, della patologia. Le composizioni dell'invenzione possono essere somministrate per via orale, rettale, aerosol, vaginale, topica, impiegando veicoli ed eccipienti convenzionali .
A titolo di esenpio, subtilis è stato ingegnerizzato per esprimere IL-Ira umano. IL-Ira, l antagonista recettoriale di IL-1, è una proteina strutturalmente simile a IL-1 che è in grado di legarsi con alta affinità ai recettori di IL^I senza però essere capace<" >di attivare le cellule bersaglio (Dinarello C.A. & Thompson R.C. Imminol. Today 11: 404, 1991). A causa della sua capacità di occupare i recettori di IL-1, IL-lra è un potente antagonista degli effetti di IL-1, potenzialmente ' utilizzabile in terapia per antagonizzare le attività infianmatorie e di distruzione della matrice dovute a IL-1 in patologie croniche e acute come artrite reumatoide, osteoporosi, shock settico. Tuttavia, per raggiungere un effetto terapeutico significativo nei modelli animali sano necessari trattamenti continui con dosi molto alte di IL-lra rieabbinante. I dati delle sperimentazioni cliniche nello shock settico indicano la necessità di trattamenti sistemici pesantissimi per ottenere risultati di scarsa significatività (Fisher et al. JAMA. 271: 1836, 1994).
Secondo la presente invenzione, IL_ subtilis ingegnerizzato con IL-lra viene somninistrato "in vivo" nel topo o nel ratto in siti anatomici diversi (cavità peritoneale, intestino tenue, intestino crasso). La proteina riconfoinante umana, prodotta "in situ" dai microorganismi semninistrati , viene identificata in Western blot. L'attività biologica della proteina prodotta dai microorganismi viene verificata come capacità di proteggere dalla morte indotta da LPS in un modello murino di shock settico (shock endotossico).
Tabella 1 : Sequenza nucleotidica e aminoacidica di IL-lra. Viene riportata la sequenza nucleotidica codificante per IL-lra umano. La numerazione della sequenza aminoacidica (codice a una lettera) si riferisce alla proteina intera comprendente il peptide segnale (primi 25 aminoacidi). La proteina matura inizia ccn R26.
Tabella 2 : Identificazione di IL-lra "in vivo", con Western blot dopo sortministrazione intraperitoneale di IL_ subtilis ingegnerizzato. Soimninistrazione intraperitcneale di 3 x 10® batteri ingegnerizzati ccn IL-lra in topi C3H/HeOuJ. Lavaggio peritoneale e prelievo di siero a tempi diversi. Western blot ccn un anticorpo di coniglio anti-IL-lra riconfoinante umano. Il risultato viene valutato cerne intensità della banda a livello di IL-lra, identificata o come peso molecolare apparente (~22kD) o come cernigrazicne con il controllo positivo di IL-lra.
Tabella 3: Identificazione di IL-lra "in vivo" con Western blot dopo sonrninistrazione nel tratto intestinale di B. subtilis ingegnerizzato. Sorrministrazione di 3-6 x 10 batteri nel tenue e nel crasso di ratti Sprague Dawley. Lavaggi dei tratti intestinali a tempi diversi. Western blot con un anticarpo di coniglio anti-IL-lra ricontoinante umano. Il risultato viene valutato come descritto nella didascalia della Tabella 2.
Tabella 4: Inibizione della mortalità da shock endotossico da parte di B^ subtilis ingegnerizzato oon IL-lra. LPS di EL coli 055:B5 (Sigma) viene inoculato i.p. B^ subtilis wild type (3 x 10^), B^ subtilis ingegnerizzato con IL-lja (3 x 10^), o PBS vengono inoculati i.p. 24 ore prima di LPS. La mortalità viene calcolata cerne percentuale (su 10-20 topi C3H/HeOuJ fenmine) alla fine dell'esperimento (5-7 giorni).
ESEMPIO 1
Clonaggio del gene di IL-lra in B. subtilis per espressione intracellulare .
Per costruire un ceppo di subtilis in grado di esprimere l'antagonista recettoriale di IL-1 (IL-lra), il cDNA di IL-lra è stato clonato in un vettore appropriato che ne consenta l'espressione costitutiva. La sequenza nucleotidica codificante IL-lra e la sequenza aminoacidica della proteina seno riportate nella Tabella 1. Il cDNA di IL-lra viene usato per produrre la proteina IL-lra sfruttando tecniche standard. Il gene può essere inserito in un vettore di espressione e il vettore di espressione può essere usato per trasformare un ospite opportuno . L'ospite trasformato può essere coltivato in condizioni che favoriscano l'espressione del gene di IL- Ira e, di conseguenza, la produzione della proteina IL- Ir a.
Per l'espressione intracellulare di IL- Ir a, il cDNA codificante per IL-lra viene per esempio isolato mediante PCR da un pool di cDNA, preparato con metodiche classiche da cellule di origine mon oc i tornerei agic a. Gli oligcnucleotidi utilizzabili per l' amplificazione · selettiva del cDNA codificante IL-lra sono qui di seguito indicati:
IL-1ra fòrward: 6' GGfìA^UfiTTATGCGACCCTCTGGGAGAAAATCC 3* Boom
IL-1ra reverse: 5' GGfiTfìCAQCTACTCGTCCTCCTGGAAG 3*
PtO
L'oligonucleotide forward è stato disegnato in modo da inserire il sito di restrizione "EcoRI" irrmediat amente a monte del codone codificante l' aminoacido Metionina (indispensabile per dirigere l'inizio della traduzione del mRNA) , seguito dal codone codificante il primo aminoacido della forma matura della proteina (R26) . Analogamente, attraverso l 'oligonucleotide reverse si inserisce un sito di restrizione "PstI" immediatamente a valle del codone di stop della proteina. Il frammento amplificato viene clonato nei siti "EcoRI" e "PstI" del vettore di espressione pSM671, ottenendo il plasmide pSM441. Il plasmide pSM441 viene trasferito in cellule del ceppo SMS118 di B^_ subtilis mediante metodiche standard. Una coltura dei suddetti batteri trasformati può essere conservata a -80 °C in 15% glicerolo fino al momento dell'uso.
ESEMPIO 2
Clonaggio del gene di IL- Ira in B. subtilis per espressione extrac e 11 ul are.
Il cDNA codificante la proteina IL-lra viene per esempio isolato mediante PCR da un pool di cDNA, preparato con metodiche classiche da cellule di origine mance ito-macrofagica. Gli oligcnucleotidi utilizzabili per l'anplif inazione selettiva del cDNA codificante IL-lra saio indicati:
IL- Ira forward: r GGGAATTCTTATGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTA E∞RI ACGTTAATCTTTACGATGGCATTCAGCAACATGAGACGCGTCCGGCGACCCT CTGGGAGAAAATCC T
lL-1ra reverse: 5' GGCTGCAGCTACTCGTCCTCCTGGAAG 3·
Pstf
L'oligcnucleotide forward è stato disegnato in modo da inserire il sito di restrizione "EooRI" inmediatamente a monte della sequenza nucleotidica codificante il peptide segnale della proteina subtilisina ( indispensabile per dirigere la secrezione della proteina riccmbinante) , seguito dalla sequenza nucleotidica codificante la forma matura della proteina IL-lra. Analogamente, attraverso l'oligcnucleotide reverse si inserisce un sito di restrizione "PstI" inmediatamente a valle del codone di stop della proteina. Il frammento anplificato viene clonato nei siti "EcoRl” e "PstI" del vettore di espressione pSM671, ottenendo il plasmide pSM441sec.
Il plasmide p3l441sec viene trasferito in cellule del ceppo SMS118 di B. subtilis mediante metodiche standard. Una coltura dei suddetti batteri trasformati può essere conservata a -80 °C in 15% glicerolo fino al memento dell'uso.
ESEMPIO 3
Rivelazione di IL-lra con Western blot dopo semninistrazione intraperitcneale di B. subtilis inqeqnerizzato con IL-Ira
B. subtilis è fatto crescere in LB in presenza di antibiotico cloramfenicolo 5 mg/1) utilizzando un inoculo primario cresciuto nello stesse condizioni. La crescita viene condotta durante la notte a 37eC in continua agitazione. I batteri vengono raccolti sterilmente per centrifugazione e il pellet risospeso in modo da ottenere la giusta concentrazione di batteri.
Topi C3H/He0uJ felimina, peso corporeo circa 20 g ricevono una somministrazione i.p. di 3 x IO7 batteri/topo in mi di PBS. Cene controllo vengono usati animali non trattati.
Il lavaggio peritoneale viene effettuato con 3 mi di soluzione fisiologica sacrificando gli animali dopo 3, 6 e 24 ore (2 animali /tempo) effettuando contestualmente un prelievo del sangue per preparazione del siero. I lavaggi peritoneali vengono centrifugati 5.000 x g 30' a 4°C e il supem atante viene recuperato. Aliquote di 1 e 3 pi, di supernatante vengono sottoposte a elettroforesi su SDS-PAGE 13,5%. Successivamente si esegue il Western blot utilizzando un antisiero anti IL-lra ottenuto in coniglio diluito 1:100.000. Per la rivelazione viene usato GAR/HKP oonjugated (Bio Rad) 1:15.000 e il sistema IBI Enzygraphic Web (Kodak). Come controllo positivo, esperimenti viene aggiunto IL-lra (10 ng) diluito in un canpicne di siero negativo. I risultati sono riassunti nella Tabella 2.
ESEMPIO 4
Rilascio di una proteina ricombinante IL-Ira da B. subtilis ingegnerizzato somministrato nell'intestino di ratto.
Ratti Sprague Dawley maschi del peso di circa 200-250 g, mantenuti a digiuno per 24-48 ore, vengono anestetizzati utilizzando pentobarbital (45 mg/kg i.m.) o etere. L'addane viene aperto lungo la linea alba per permettere l'accesso al tratto gastrointestinale. Il tratto terminale del colon e/o il tratto terminale dell'ileo (0,5-1 cm a mente della valvola ileo-cecale) vengono identificati e isolati con una.legatura. Si procede successivamente alla sonninistrazicne dei batteri. Per la scrministrazione nel crasso volumi di 5-10 mi di LB 0,25 x contenenti 3-, 6 x 10 batteri (cresciuti care nell'esenpio 3) vengono aspirati con una siringa e iniettati a monte della valvola ileo-cecale in modo da rienpire il cieco e buona parte del colon. Una occlusione mediante legatura chirurgica viene effettuata immediatamente a valle del punto d' ingresso dell'ago in modo da evitare riversamenti di batteri nella cavità peritoneale. Analogamente, quantità variabili da 1 a 10 mi contenenti 3-6 x 10 batteri vengono iniettati nella porzione prossimale del tenue 0,5-1 cm a valle del piloro; anche in questo caso una occlusione mediante legatura chirurgica viene effettuata innieoliatamente a valle del punto d'ingresso dell'ago in modo da evitare riversamenti di batteri nella cavità peritoneale. L'animale viene sacrificato e l'addome viene aperto scoprendo completamente l'intestino.
Si lava il lume intestinale con 10-50 mi di soluzione fisiologica sterile a pressione costante (100 cm H^O) tramite un ago introdotto nel cieco o nel duodeno in ragione dei siti in cui seno avvenute le satministrazioni.
Aliquote dei lavaggi (1-2 mi) vengano centrifugate a 5.000 x g 30' a 4°C e IL-Ira viene ricercato nel supernatante mediante Western blotting ccn anticerpi di coniglio contro IL-lra care nell'esenpio 3, caricando su SDS-PAGE 10 μΐ, di ogni campione. Cane controllo positivo viene utilizzato IL-lra (10 ng). Il controllo basale viene effettuato su animali non trattati.
Il risultato di vari esperimenti, valutato cane nell'esenpio 3, è riassunto nella Tabella 3.
ESEMPIO 5
Protezione da shock endotoesico in seguito a senninistrazione intraperitcneale di B. subtilis ingegnerizzato con IL-lra
Topi C3H/HeOuJ (femmine peso corporeo circa 25 g) ricevono una singola somministrazione intraperitoneale di 3 x 10^ batteri/topo in 0,2 mi di PBS. I batteri sonninistrati sono: B^ subtilis wild type e B. subtilis ingegnerizzato oon IL-lra. Gli animali di controllo ricevono solo 0,2 mi di PBS. Dopo 24 ore tutti gli animali ricevono 15-20 mg/kg LPS i.p. I gruppi sperimentali saio di 10-20 animali.
La mortalità osservata al termine degli esperimenti (in media 5-7 giorni dopo la somministrazione di LPS, tempo a cui non si hanno più decessi da almeno 48 ore) è riportata nella Tabella 4.
pp a
TABELLA 1
SEQUENZA NOCLEOTIDICA E AMINOACIDA DI IL-lra
ATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCACTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCAT M E I C R G L R S H L I T. L L L F<' >L F H
1 TCAGAGACGATCTGCCGACCCTCTGGGAGAAAATCCAGCAAGATGCAAGCCTTCAGAATC 1 S E T I C R P S G R K S S K M Q A F R I
21 TGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACAACCAACTAGTTGCTGGATACTTG 1 W D V N Q K T F Y L R N N Q L V A G Y L
81 CAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATGTGGTACCCATTGAGCCTCATGCT 1 Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A
41 CTGTTCTTGGGAATCCATGG AGGGAAG ATGTGCCTGTCCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAG 1 L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E
01 ACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACCTGAGCGAGAACAGAAAGCAGGAC 01 T R L Q L E A V N I T D L S E N R K Q D
61 AAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCACCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCC 21 K R F A F I R S D S G P T T S F E S A A
21 TGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTGACCAGCCCGTCAGCCTC ACCAAT 41 C P G W F L C T A M E A D Q P V S L T N
81 ATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACTTCCAGGAGGACGAG 531 61 M P D E G V M V T K F Y F Q E D E 177
TABELLA 2
IDENTIFICAZION IN WESTERN BLOT DI IL-lra DOPO SOMMINISTRAZION IN VIVO
PRELIEVO TEMPO DEL _
PRELIEVO
lavaggio peritoneale siero
Basale
3 ore ++
6 ore
24 ore
TABELLA 3
UraiTIFICAZIGNE IN WESffiBN SLOT DI IL-lra NEL LIME INTESTINALE DOPO SCMONISTRAZICNE IN SITO DI B. subtills H*®C3⁄4HIIZZATO
TEMPI (ore)
TRATTO INTESTINALE
Basale 3 4 6 8 24
Tenue - + + - . Crasso - +++++ ++++ + + +
T3U3ELLA 4
INIBIZIONE DELLO SHOCK ENDOTOSSICO IN TOPI TRATTATI CON IL sutoHI -is ΙίΚ3⁄43ίΗ3⁄4ΙΖΖΑΊΌ CON IL-lra
MORTALITÀ' DOPO TRATTAMENTO CON: DOSE DI LPS PBS B.subtilis wt fl.suW///s-IL-1ra
15 mg/kg 40% 40% 0% 20 mg/kg 100% 100% 70%

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIOI 1. Corposi z ieri farmaceutiche contenenti cane principio attivo microorganismi ingegnerizzati con vettori di espressione contenenti i geni per proteine rioonbinanti farmacologicamente attive.
  2. 2. Conposizioni secondo la rivendicazione 1 in cui i microorganismi seno batteri.
  3. 3. Ccnposizioni secondo la rivendicazione 2 in cui i batteri sono scelti fra le speci Bacii lus, Clostridium, Escher io hia e Streptococcus .
  4. 4. Ccnposizioni secondo la rivendicazione 3, in cui i batteri sono scelti tra B. subtilis, E. coli e pyoqenes , mutans, gordonii .
  5. 5. Ccnposizioni secondo la rivendicazione 1 in cui i microorgani smi scno allo stato di spora.
  6. 6. Ccnposizioni secondo la rivendicazione 1 o secondo la rivendicazione 5 in cui i microorganismi sano batteri sporogeni che spor ulano nell ’ anbiente intestinale.
  7. 7. Ccnposizioni secondo la rivendicazione 6 in cui i batteri sporogeni sano ingegnerizzati in modo da subire autolisi senza la formazione di spore.
  8. 8. Conposizioni secondo la rivendicazione 1 in cui il vettore di espressione è un vettore di secrezione.
  9. 9. Ccnposizioni secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti in cui i microorganismi esprimono la proteina riconbinante in maniera costitutiva oppure in maniera inducibile.
  10. 10. Ccnposizioni secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti adatte alla samiinistrazione orale, aereosol, rettale, vaginale o topica.
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