ITMI20122195A1 - Metodo per il recupero di componenti intracellulari da microorganismi fermentati - Google Patents

Description

Metodo per il recupero di componenti intracellulari da microorganismi fermentati

------

La presente invenzione à ̈ relativa ad un metodo per il recupero delle componenti intracellulari di materiali di origine biologica, quali lieviti, alghe, batteri e/o muffe.

E’ noto nell’arte che sospensioni di microorganismi cellulari possono essere lisate mediante perturbazione e rottura della membrana cellulare ad esempio per variazioni di pressione osmotica. Ad esempio, il semplice abbassamento della forza ionica dell’ambiente liquido, oppure l’aggiunta di un tensioattivo con moderata agitazione della sospensione, permette di rigonfiare le cellule e portare alla loro lisi. In altri casi, invece, à ̈ necessaria una forte agitazione della sospensione, ed una forte azione termica, meccanica o sonica per disgregare le membrane cellulari, con un aumento dei costi della lisi cellulare. Ad esempio, le cellule di batteri, lieviti ed alghe sono molto più resistenti e la loro lisi per recuperare i componenti intracellulari à ̈ difficoltosa e si deve ricorrere a metodi più efficaci dell’osmosi per ottenerla.

In “Disruption of microbial cells for intracellular products†, Enzim Microb Tech., 1986, vol.

8, sono delineati i principali metodi per la disgregazione della parete cellulare, ovvero:

a) Metodi meccanici:

- mediante forze frizionali tra cellule e materiale solido, ad esempio con mulini a palle (Bead Mills) oppure con pressa-X (X-press) o pressa di Hughes (Hughes press);

- mediante forze frizionali in sospensione di cellule, ad esempio con ultrasuoni o con omogeneizzatori ad alta pressione o con la cosiddetta French-press.

b) Metodi non meccanici:

- mediante lisi enzimatica, chimica (con detergenti, solventi o antibiotici) oppure fisica (shock osmotico o pressione).

Nei processi industriali che prevedono la raccolta a fine fermentazione dei microorganismi e loro rottura o lisi cellulare per la liberazione del prodotto intracellulare, una fase oleosa e acquosa enzimatica accompagna spesso i residui della cellula.

Un approccio all’estrazione degli olii dai semi seguito dall’industria à ̈ l’utilizzo di unità di processo (gramola) dotate di un adeguato volume agitato da pale elicoidali che ruotano ad una velocità di 20-30 giri al minuto e garantiscono un tempo di permanenza adeguato (1-2 o più ore) per il processo disgregativo di liberazione dei vacuoli oleosi. Tale processo à ̈ svolto a bassa temperatura (20-30° C) in aria.

Un impianto industriale generalmente può comprendere più gramole disposte in serie (in questo caso spesso sovrapposte per limitare lo spazio d'ingombro) oppure in parallelo, caricate meccanicamente, mediante sistema idraulico, con la pasta d'olio in uscita dal frangitore. Tale processo produce una blanda lisi termica che, associata ad un lento rimescolamento della pasta, consente una liberazione della fase oleosa poi separata mediante processo di flottazione. Tale tecnologia risulta essere efficace per microorganismi di dimensioni superiori a qualche decina di micron, ma essa non risulta efficace per microorganismi resistenti come alcuni, ma non solo, della tipologia Lypomices, Rhodotorula e Criptococco. I parametri tecnici indicati per questo processo sono la temperatura e la durata dell'operazione. La temperatura à ̈ fondamentale per la resa nella successiva estrazione ed à ̈ strettamente correlata alla fase di liberazione del contenuto cellulare. Il parametro tempo à ̈ correlato al modo operativo.

Un’altra tipologia di macchina industriale in grado di compiere un tale processo per i casi di lisi cellulare che richiedono condizioni drastiche di temperatura e pressione à ̈ una macchina costituita da un cilindro fisso o rotante, dotata di pale o mescolatori interni in grado di mescolare, rompere e accompagnare le cellule da lisare. Tale macchina à ̈ in uso nell’industria alimentare per l’idrolisi termica e, a volte in ambiente acidi per acidi solforici (si vedano ad esempio le macchine dalla Anco-Eaglin Inc.)

La domanda di brevetto statunitense US 2010/0006515 A1 descrive un macchinario per la lisi cellulare termomeccanica che funziona come una pressa a coclea per pressioni maggiori a 5 bar e temperature maggiori di 120° C. Nella descrizione à ̈ indicato che questo macchinario può eseguire anche una separazione dei liquidi cellulari durante il procedimento di lisi termica per prodotti cellulari con membrane caratterizzate da una forte resistenza alla rottura termico/meccanica.

L’uso di mulini a palle in vetro o ceramica consente una agitazione e rottura vigorosa delle cellule nella pasta da lisare. Il metodo à ̈ stato usato per anni ed à ̈ considerato applicabile alla classe biologica dei lieviti e funghi, micobatteri, spore e microalghe. Più recentemente, à ̈ stato applicato a campioni di suolo e di piccoli campioni di vegetali e tessuto animale.

Entrambi i metodi, quelli basati sui mulini che sul tamburo a coclea, seppur efficaci per determinate tipologie di cellulari, sono caratterizzati da un alto costo di esercizio e di apparecchiatura. Quest’ultimo derivante dai tempi necessari per operare l’azione lisante e, a volte, a causa dell’aggressività chimica degli ambienti di crescita che si accompagnano ai microorganismi cellulari come nel caso delle alghe dove la presenza di cloro necessita l’impiego di materiali altamente resistenti come leghe a base principalmente di nichel e cromo.

Più di recente sono stati impiegati metodi basati su procedimenti di lisi sonora o magnetica che portano ad un costo finale energetico inferiore.

Ad esempio la sonicazione intensa di liquidi genera onde sonore che si propagano in mezzi liquidi con alternanza di cicli ad alta e bassa pressione. Durante il ciclo di bassa pressione, un’alta intensità di bolle da vuoto, di piccole dimensioni, sono create nel liquido. Un processo di cavitazione à ̈ quindi utilizzato per l’implosione delle bolle di liquido, che permette così di generare delle forze di taglio in grado di rompere la struttura cellulare in modo meccanico. Questo effetto à ̈ utilizzato per l'estrazione dei lipidi dalle alghe. La separazione della fase oleosa/lipidica dalla fase acquosa e dai debris cellulari per essere efficace richiede l’aggiunta di un solvente, poiché altrimenti nella fase oleosa/lipidica rimangono inglobati anche i debris cellulari.

Altri metodi prevedono la frantumazione delle cellule tramite passaggio ad alta pressione (20000– 30000 psi o 140–210 MPa) attraverso una valvola con orifizio stretto. Il fluido à ̈ così soggetto a forze di taglio elevate con conseguente rottura delle cellule. Controllando la pressione si definisce la forza di taglio per ottimizzare la rottura della cellula. Il sistema necessita alte energie e un raffreddamento per campioni che richiedono più passaggi attraverso il sistema.

L’omogeneizzazione meccanica à ̈ un metodo annoverato tra questi metodi meccanici, che opera in condizioni di alta pressione e con l’impiego di un’elevata densità di energia che si basa sull’utilizzo della pressione e microvalvole per suddividere le particelle fino a ridurle a minime dimensioni (al di sotto del micron). Le valvole omogeneizzanti sono dimensionate per ottenere il grado richiesto di micronizzazione e dispersione alla pressione più bassa possibile, a seconda delle diverse applicazioni. Sono macchine industriali continue che possono trattare anche portate voluminose con basse energie specifiche di utilizzo (ad esempio, una macchina che tratta portate liquide di 6 m<3>/h, con sovrappressioni di 1500 bar, necessita di una potenza pari a 315 kW).

Un altro approccio per la lisi termica à ̈ quello descritto in letteratura col nome di trattamento idrotermico o “Hydrothermal treatment†che viene applicato sperimentalmente per la lisi di alghe, e viene proposto per l’estrazione dei lipidi contenuti in semi oleosi. Il procedimento à ̈ corredato da dati sperimentali di liberazione dei lipidi contenuti nell’alga. L’operazione consta in un meccanismo di lisi termica su una sospensione liquido-solido in pressione (200 atm) e temperatura tra i 250 e 300° C. L’estrazione finale dei lipidi dalla massa cellulare solida lisata, à ̈ eseguita con n-Esano. L’approccio tecnologico al problema sviluppato da quest’ultima tecnologia, come pure quelle che utilizzano sistemi di omogeneizzazione in pressione, portano ad applicazioni industriali costose soprattutto per i materiali utilizzati che devono garantire la dovuta resistenza al sistema chimico-fisico costituito dalla sospensione da trattare alle condizioni del metodo di lisi (“Hydrothermal processing of high-lipid biomass to fuels†Johnson, Michael C., Ph. D. Massachusetts Institute of Technology. Dept. of Chemical Engineering Massachusetts Institute of Technology Issue Date: 2012).

La domanda di brevetto internazionale WO 99/15638 ha per oggetto un metodo per modificare la struttura di membrane lipidiche quali i doppi strati lipidici di microorganismi, eucarioti o procarioti, di liposomi, di vescicole o di cellule viventi. In particolare, detto metodo crea un’instabilità (perturbazione) della struttura lipidica, che permette la fusione delle membrane lipidiche senza lisare le cellule coinvolte.

Il metodo descritto in WO 99/15638 prevede l’uso di un nebulizzatore (spray dryer) a bassa temperatura, per atomizzare in piccole gocce un mezzo liquido, quale ad esempio una soluzione fisiologica, latte, sangue, siero, brodi di fermentazione e acqua, contenente la struttura lipidica, che vengono immesse ad alta velocità in un ambiente contenente vapore a temperatura controllata.

Nel metodo di WO 99/15638 il mezzo liquido utilizzato per sospendere le cellule o le strutture lipidiche da fondere durante la nebulizzazione, favorisce il processo di fusione delle membrane cellulari per lisi di parte di queste. Il mezzo liquido utilizzato non deve perciò favorire la rottura di queste membrane ma favorirne l’aggregazione. L’obiettivo del procedimento di WO 99/15638 non à ̈ distruggere le membrane di due o più diverse entità cellulari, ma à ̈ di mantenere inalterate le caratteristiche delle cellule originarie, consentendo così una fusione parziale delle membrane cellulari. In tale modo il metodo produce degli aggregati molecolari che combinano le caratteristiche delle cellule aggregate nel miscuglio pluricellulare.

Nella lisi di una cellula si vuole recuperare da microorganismi sottoposti a fermentazione o coltivazione il prodotto del processo, e si deve in primo luogo operare una lisi o rottura ad esempio per via termica in un volume di processo, o reattore, adatto per ottenere temperature superiori a 120° C ad almeno 5 bar di pressione, per un tempo variabile da 10 minuti a 4-5 ore sotto agitazione moderata, ovvero le condizioni necessarie per la lisi dei microorganismi. Successivamente si deve: attuare il raffreddamento del reattore; estrarre la massa cellulare dal reattore come sospensione di residui solidi, oli, acqua e altri prodotti intracellulari; ed infine si deve aggiungere un solvente organico, o inorganico, o loro miscele, per ottenere, con successive lavorazioni di solubilizzazione e separazione dei liquidi dai solidi, il contenuto cellulare prodotto del processo fermentativo o di coltivazione.

Questa metodologia à ̈ caratterizzata dal fatto che più del 90% delle necessità energetiche del processo globale di estrazione del prodotto del processo fermentativo à ̈ dovuta alla lisi termica operata sui microorganismi fermentati.

E’ quindi di grande interesse un nuovo metodo per l’ottenimento delle componenti intracellulari di materiali biologici fermentati, dove le necessità energetiche del metodo globale siano nettamente minori rispetto ai procedimenti convenzionali.

La presente invenzione ha per oggetto un metodo di lisi termica per il recupero (estrazione) di componenti intracellulari di materiali di origine biologica, quali lieviti, alghe, batteri e/o muffe coltivati, o in particolare fermentati, che consente di minimizzare i costi operativi e di apparecchiature utilizzate nel processo di lisi di questi processi bio-industriali.

Il metodo dell’invenzione comprende:

- la co-alimentazione ad un nebulizzatore di almeno due flussi, dove il primo flusso comprende una sospensione acquosa di microorganismi cellulari da lisare e il secondo flusso comprende un solvente liquido o gassoso (solvente di nebulizzazione);

- la nebulizzazione della sospensione contenente detti microorganismi e la loro lisi cellulare per via termica in ambiente caratterizzato da alta superficie di scambio e quindi caratterizzato da un basso tempo di contatto in un piccolo volume di trattamento o reattore, cosa che normalmente risulta in un costo di apparecchiatura relativamente più basso;

- la separazione dei componenti intracellulari dai residui cellulari derivanti dalla lisi.

Il liquido che accompagna le cellule nella sospensione, o solvente di nebulizzazione, à ̈ normalmente acqua e/o altro composto chimico che favorisca il processo di lacerazione delle membrane cellulari per liberare i contenuti della cellula. Il solvente utilizzato dovrà perciò favorire la rottura di queste membrane e favorire anche la separazione dei prodotti intracellulari dalla matrice solida restante. Come esempi specifici di solventi di nebulizzazione sono indicate soluzioni organiche, quali ad esempio idrocarburi, alcoli, esteri, eteri. Quando il solvente di nebulizzazione à ̈ una soluzione acquosa liquida, alla stessa possono essere aggiunti anche acidi inorganici.

La nebulizzazione della sospensione dei microorganismi avviene in una camera di espansione (o camera di nebulizzazione, o unità di lisi termica) contenente un gas inerte, vapore acqueo, anidride carbonica e/o un solvente organico in fase gassosa, ad alte temperature. La camera di nebulizzazione può già essere alla temperatura di lisi, ovvero tra 90° C e 180° C, preferibilmente tra 120° C e 160° C e ancora più preferibilmente tra 130° C e 150° C.

Il vantaggio della presente invenzione à ̈ infatti quello di poter operare a temperature più basse rispetto a quelle normalmente utilizzate nei processi di lisi noti nell’arte.

L’interazione ad alta superficie di contatto, creatasi grazie alla nebulizzazione, consente un veloce trasferimento di energia cinetica alla sospensione nebulizzata che porta la parete cellulare e/o le membrane cellulari dei microorganismi presenti nelle gocce nebulizzate a rottura meccanica per espansione. Di conseguenza, si ottiene la liberazione dei contenuti intracellulari prodotti per coltivazione o in particolare per via fermentativa, che possono così essere recuperati lungo le unità di processo seguenti all’unità di lisi termica.

Dopo la prima camera di nebulizzazione sono presenti successive unità di processo, quali ad esempio serbatoi di accumulo, cicloni o condensatori a superficie che vengono mantenuti ad una temperatura progressivamente decrescente e, lungo i quali, si osserva la separazione di una sospensione plurifasica composta dai contenuti intracellulari, solidi (debris cellulari), da un liquido acquoso ed oleoso dovuto alla condensazione di parte dei vapori dell’atmosfera della camera di nebulizzazione, quest’ultimi dovuti ai solventi che sono co-alimentati assieme alla sospensione di cellule, e dai contenuti intracellulari o lipidi.

Nella fase acquosa sono contenuti: acqua, residui del brodo di coltivazione o di fermentazione, sali, solventi e pochi lipidi solubilizzati. Nella fase lipidica o oleosa sono contenuti: solventi organici, acidi grassi, lipidi, acqua, e i loro sali. La fase solida comprende i residui solidi restanti dagli aggregati cellulari (debris cellulare) che ancora possono contenere dei lipidi non estratti, e che può opzionalmente essere sottoposta ad una, o più, operazioni aggiuntive di lisi mediante seguenti operazioni di nebulizzazione e lisi di completamento nella stessa apparecchiatura, per riciclo assieme all’alimentazione primaria, in testa alla camera di nebulizzazione, o in una unità di lisi seguente.

La sospensione plurifasica, prodotta nella camera di nebulizzazione, à ̈ quindi oggetto di separazione per via gravimetrica o per centrifugazione, al fine di separare l’acqua e i solidi dalla fase oleosa contenente i solventi ed i lipidi. La natura del solvente (di nebulizzazione iniziale) utilizzato influisce anche su questa operazione potendo creare delle fasi sotto forma di sospensioni schiumose di difficile trattamento. Quindi la scelta del solvente di nebulizzazione deve favorire anche la separabilità dei componenti della sospensione ottenuta dopo la lisi.

A valle dello stadio di separazione delle fasi solide da quelle liquide à ̈ sempre presente uno stadio di recupero del solvente di nebulizzazione in analogia con i processi chimici di estrazione con solvente.

I lipidi recuperati possono essere utilizzati come tali o inviati a trattamento finalizzato all’utilizzo ultimo degli stessi, ad esempio nell’ambito di utilizzo come biocarburanti, trattamenti di idrogenazione o di transesterificazione.

I contenuti intracellulari di interesse sono separati dal solvente/fase acquosa tramite separazione gravimetrica o centrifugazione. Alla fine del treno di separazione l’acqua può rimanere in parte in forma di vapore ed in parte in forma condensata. L’acqua à ̈ sempre presente, derivando dall’acqua presente inizialmente all’interno delle cellule.

In particolare, il metodo dell’invenzione à ̈ utile nei processi di produzione dei lipidi ottenuti come composti intracellulari in lieviti fatti crescere su substrati zuccherini. Questi organismi cellulari, quali ad esempio i lieviti Lypomices, Rhodotorula e Criptococco sono dotati di una parete cellulare particolarmente resistente anche a forti azioni di stress meccanico/termico corrispondenti a pressioni anche superiori a 1000 bar.

L’azione di nebulizzazione permette di diminuire le necessità energetiche del processo globale, in quanto lo scambio termico alla base del processo di lisi à ̈ favorito dall’elevata superficie di scambio termico che si forma con la nebulizzazione e da fenomeni di cavitazione indotti dagli alti profili termici attraverso la cellula.

L’ambiente creato dalla nebulizzazione à ̈, infatti, caratterizzato da alto trasporto dell’energia all’interfaccia cellulare, in quanto si osserva un aumento dello scambio termico tra la fase gassosa ed il liquido. Lo scambio termico tra la fase gassosa ed il liquido à ̈ dovuto al fatto che l'interfaccia tra le due fasi à ̈ tanto maggiore quanto à ̈ minore il diametro delle gocce di sospensione liquido-solido, e la velocità di trasporto dell’energia attraverso le membrane cellulari aumenta considerevolmente in funzione dell’aumento della superficie di contatto liquido/atmosfera gassosa che à ̈ inversamente proporzionale al diametro della goccia e che quindi aumenta la sua efficacia di circa tre unità di misura rispetto ai casi di evaporazione del liquido da una superficie di separazione gravitazionali. Valori tipici del coefficiente liminare di scambio termico convettivo, h, per l’acqua e per l’aria sono: aria: h = 10-100 W/m<2>K; acqua = 500-10.000 W/m<2>K.

I solventi utilizzati per la nebulizzazione e la successiva estrazione delle componenti intracellulari di lieviti, alghe, batteri e/o muffe sono solventi organici polari, come gli alcoli, gli esteri, i chetoni in particolare sono preferiti metanolo, etanolo, isopropanolo e/o acetato di etile, solventi organici apolari quali gli alcani, in particolare sono preferiti esano e/o isoottano, tagli di raffineria caratterizzati da curva di ebollizione normale tra 50° C e 180°C, preferibilmente di 100°C, miscugli di sostanze organiche varie di raffineria come etere di petrolio, nafte e/o benzine alchilate o miscele dei solventi citati.

La camera di nebulizzazione dove viene nebulizzata la sospensione contenente i microorganismi può contenere un gas inerte come, ad esempio azoto, elio, argon, anidride carbonica, oltre a vapore acqueo, o vapori saturi o surriscaldati dei solventi organici sopra indicati come solventi di nebulizzazione. Questo permette sia la lisi del microorganismo, che l’estrazione nel solvente delle componenti intracellulari di interesse.

L’estrazione dei liquidi intracellulari dalla matrice solida del microorganismo à ̈ favorita dal solvente in pressione. L’estrazione à ̈ poi migliorata da un’azione centrifuga che favorisce l’estrazione per diversa densità delle fasi solidi e liquidi della sospensione venutasi a formare.

Per ottenere la lisi termica, la temperatura nella camera di nebulizzazione à ̈ compresa nell’intervallo da 90° C a 180° C, preferibilmente compresa tra 120° C e 160° C e ancora più preferibilmente tra 130° C e 150° C.

In particolare, quest’ultimo intervallo à ̈ preferito per i lieviti, in particolare lieviti Lypomices, Rhodotorula e Criptococco.

La miscelazione del solvente di nebulizzazione con la sospensione cellulare prima della nebulizzazione potrebbe migliorare la resa complessiva del processo di lisi, in quanto potrebbe agire per via chimica sul doppio strato lipidico che compone la membrana cellulare, così come osservato nelle soluzioni tecniche dell’arte precedente. Nell’arte infatti una tempistica di contatto tra il solvente e le cellule da lisare prolungata à ̈ un importante fattore insieme alla temperatura e alla pressione per ottenere la lisi dei microorganismi.

Tuttavia, questa tempistica prolungata di contatto rappresenta un ulteriore costo energetico, mentre la presente invenzione à ̈ rivolta all’abbattimento di tali costi ed à ̈ pertanto caratterizzata da bassi tempi di permanenza a contatto del solvente con le cellule da lisare, sia quando il solvente sia posto a contatto con le cellule prima di essere immessi nel nebulizzatore, sia quando il solvente sia presente nella camera di nebulizzazione dove à ̈ stata nebulizzata la sospensione dei microorganismi non addizionata preventivamente con il solvente.

Il dimensionamento del volume di nebulizzazione per il metodo alla base della presente invenzione deriva dall’applicazione del concetto di separazione della sospensione contenente le fasi solido-liquide, derivate dall’azione di lisi cellulare, dai vapori rilasciati dopo nebulizzazione. A tale concetto si deve anche l’utilizzazione, a volte necessaria, di più camere di separazione, poste in serie rispetto al flusso del gas, che sono necessarie per favorire la separazione dei contenuti cellulari oltreché dei residui solidi della cellula lisata.

La forma della camera di nebulizzazione deve favorire la separazione dai vapori della sospensione e l’efflusso e raccolta di quest’ultima dal fondo di essa. Forme cilindriche, anche intramezzate da riduttori di velocità a griglia o lamellari, con terminale troncoconico per la raccolta delle sospensioni, sono forme preferite della camera di nebulizzazione.

Una situazione dove à ̈ associato un profilo termico crescente tra la prima e le successive camere non influenza l’azione di lisi, allorché queste temperature siano al di sotto dei valori di temperatura e pressione previsti dal metodo. In genere si può dire che temperature più alte nelle camere successive alla camera di nebulizzazione possono essere controproducenti in termini di effetti chimici sui liquidi lisati.

In genere un profilo termico, lungo la linea di processo che parte dal volume di nebulizzazione, che viene definito dallo scambio termico realizzato a parete o tramite inserti di scambio nei volumi dei separatori, influenza invece la liberazione dei solventi dalla sospensione derivante dalla lisi. Tale profilo à ̈ definito dalla portata dei gas rilasciati e dal trascinamento ammesso dei contenuti cellulari per effetto chimico-fisico d’equilibrio liquido/vapore e dall’azione della velocità dei gas.

La camera di nebulizzazione può già essere alla temperatura di lisi o a temperatura più alta per favorire alte portate di trattamento in lisi, e contiene i gas o vapori sopra menzionati a temperatura pari o più alta rispetto alla temperatura a cui si vuole effettuare la lisi ed estrazione.

La sospensione contenente i microrganismi da lisare può entrare nella camera di nebulizzazione a temperatura più bassa di quella a cui si vuole condurre la lisi. In questo caso il solvente entra con un flusso ed un livello termico tale da raggiungere, assieme alla sostanza da lisare, nel nebulizzatore le condizioni di lisi.

All’interno della camera di nebulizzazione parte dell’acqua endo/eso cellulare presente e parte, o tutto, del solvente eventualmente alimentato con la sospensione di microorganismi evaporano abbassando la temperatura a cui si trovava la camera di nebulizzazione prima dell’alimentazione della sospensione di microrganismi liberando liquidi, alto bollenti come i lipidi intracellulari, che si separano sulle pareti della camera assieme ai debris cellulari.

Un eventuale incremento della temperatura nei volumi di separazione, che seguono la camera di nebulizzazione, ha un effetto negativo verso i lipidi aumentando la quota parte di acidi grassi contenuti nella sospensione. Questo incremento può però favorire l’estrazione dalla matrice solida.

Dopo la lisi, le componenti intracellulari di interesse di natura lipidica, quali trigliceridi, acidi grassi mono e diacil gliceridi, fosfolipidi, fitoli, colesteroli, sono liberate in una sospensione di olii alto bollenti (i lipidi hanno una temperatura di ebollizione a temperatura ambiente superiore a 300° C) insieme ai residui cellulari solidi. Pertanto, la sospensione di oli alto bollenti viene separata dal solvente di nebulizzazione, nel caso questo si separi da tali oli, come ad esempio quando il solvente à ̈ acquoso o polare, e viene avviata alla separazione dei residui cellulari solidi (debris); come già prima sottolineato, detta separazione può avvenire per via gravimetrica, per densità, per centrifugazione o filtrazione ad esempio con idrociclone, decanter oppure tricanter oppure per distillazione, mediante membrane o per evaporazione del prodotto dal solvente di nebulizzazione/estrazione.

L’acqua presente nella camera di espansione, di derivazione intracellulare o derivante dalla sospensione delle cellule o derivante dal vapore ad alta temperatura eventualmente aggiunto per motivi di scambio termico assieme o separatamente alla sospensione da lisare, à ̈ preferibilmente allontanata dalla sospensione per facilitare la seguente separazione solido/liquido evitando schiume e sospensioni che interagirebbero negativamente sulla successiva separazione dei prodotti cellulari. Il solvente di nebulizzazione à ̈ opzionalmente alimentato assieme a vapore acqueo in pressione per poter controllare la temperatura di lisi nel nebulizzatore. Tale metodologia operativa à ̈ impiegata se esiste una facilità di separazione acqua/solvente in fase liquida.

In questi casi il vapore, contenete il solvente e l’acqua viene inviato ad una seconda camera e una volta separato dall’acqua, viene riciclato al nebulizzatore, dove verrà integrato con solvente fresco.

Le apparecchiature che possono essere utilizzate per la nebulizzazione sono, in linea di principio, analoghe o le stesse che possono essere impiegate per l’operazione di nebulizzazione di una sospensione liquida di un solido (spray-dryer). Uno spray dryer à ̈ un insieme di apparecchiature formato da una pompa di alimentazione di un liquido contenente una sospensione, un solido inorganico o no, una sorgente di gas o vapore quale vettore di energia termica e meccanica, un atomizzatore, un riscaldatore, uno spazio di dispersione della miscela vapore/liquido/solido in uscita dall’atomizzatore, o camera di essiccazione, oltre che da sistemi di trattamento/condensazione della miscela di vapori/gas di scarico e il recupero di eventuali polveri. Il composto solido à ̈ estratto secco alla temperatura della camera di essiccazione.

Tenendo in considerazione le necessarie condizioni per la lisi termica del microorganismo e le condizioni di estrazione del prodotto dalla sostanza cellulare in cui questo à ̈ trattenuto, una serie di condizioni di funzionamento sono specificabili per la lisi e recupero del lipide solido, liquido o solubilizzato nel solvente, se questo à ̈ utilizzato.

I materiali da impiegare per le applicazioni di lisi sono da definire in funzione delle condizioni di lavoro, ovvero in funzione di temperatura e pressione nominale di funzionamento, e in relazione alla resistenza alle condizioni di aggressività dell’ambiente a sua volta specificato dai solventi e dai contenuti nei liquidi che accompagnano le cellule.

L’applicazione della metodologia oggetto dell’attuale domanda di brevetto consente considerevoli risparmi sui costi variabili e CAPEX (Spese di capitale - Capital expenditure) degli impianti previsti per compiere le operazioni di lisi della cellula e estrazione dei composti intracellulari, perché grazie al metodo dell’invenzione si ha un notevole risparmio energetico, non essendo più necessari apparati per lisare termicamente o meccanicamente le cellule in un primo tempo e successive costose unità di estrazione del lipide.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1: nella figura 1, Ã ̈ riportata la resa di estrazione (%ps) dei lipidi sul secco, in funzione della temperatura di atomizzazione delle sospensioni di lieviti Lypomices (L), Rhodotorula (R) e Criptococco (C).

Figura 2: nella figura 2, à ̈ riportato il confronto tra termogrammi di cellule di lievito Lypomices dopo la nebulizzazione ma prima dell’estrazione con solvente dei lipidi in essi contenuti, a temperature di nebulizzazione crescenti.

Figura 3: in figura 3 Ã ̈ riportato il termogramma di cellule di lievito Lypomices essiccate in stufa a 105° C; si osserva la curva di peso residuo % (scala di sinistra) e le curve derivate (D%/DT).

Figura 4: nella figura 4 sono riportati lo spettro IR di trioleina (figura 4a) e dell’estratto SOX107 (a 150° C) (fig. 4b).

Figura 5: in figura 5 à ̈ rappresentato lo schema di impianto di una soluzione a ciclo chiuso per attuare il metodo dell’invenzione.

Figura 6: in figura 6 à ̈ riportata la tabella 4, dove sono stati indicati il bilancio materiale e energetico dell’esempio relativo ad una Rhodotorula trattata via fermentazione da zuccheri.

ESEMPI

ESEMPIO 1

Sono state utilizzate tre sospensioni di lieviti in acqua del genere Lypomices, Rhodotorula o Criptococco (biomassa) per il recupero delle componenti intracellulari secondo il metodo dell’invenzione. Nella fase di nebulizzazione non sono stati aggiunti altri solventi alla sospensione.

Nel presente esempio si vuole solo individuare la capacità di lisi del processo proposto. La lisi effettiva à ̈ poi valutata a posteriori con analisi classiche mediante unità Soxhlet di estrazione liquido solido.

Per la nebulizzazione della sospensione à ̈ stato usato un MINI Spray Dryer 190 del fornitore BUCHI, che, come essiccatore, à ̈ in grado di evaporare circa 100-500 g/h di acqua con un flusso di N2 di 700-1000 Nl/h che può essere scaldata al max a 250° C, e quindi che à ̈ in grado di produrre circa 1-100 g/h di polvere essiccata ad una granulometria nell’ordine di 0,2-10 micron.

Il tempo complessivamente impiegato dalla biomassa per percorrere la “parte calda†del circuito sino all’ugello di nebulizzatore, à ̈ stato di 10-30 secondi. Tutto il circuito del gas alimentato alla camera di nebulizzazione sino alla camera di nebulizzazione o di spruzzo si trova in leggero vuoto, indicativamente 0,97 atm.

Nella camera di nebulizzazione in cui à ̈ stata spruzzata la sospensione da trattare era presente azoto come gas inerte la cui temperatura à ̈ mantenuta all’incirca uguale a quella all’ingresso del separatore a ciclone (temperatura a cui immediatamente si porta il campione dopo l’ugello per evaporazione dell’acqua di sospensione e che à ̈ stata costantemente monitorata come indicata in Tabella 1).

Per l’estrazione dei lipidi dai solidi cellulari à ̈ stata utilizza un’unità Soxhlet. Un ditale in carta à ̈ stato lavato con il solvente di estrazione quindi à ̈ stato portato a peso costante in stufa a 105° C. Il solido da trattare (3-20 g) à ̈ stato caricato nel ditale. Nel pallone, di cui à ̈ stata determinata la tara con precisione, à ̈ stato caricato il solvente di estrazione (150-200 ml). Nei casi esempio descritti nella Tabella 1 e 2, sono stati impiegati esano, caratterizzato da una temperatura di ebollizione di 69° C e densità 0,655 g/ml, indice di polarità 2, acetato di etile, caratterizzato da una temperatura di ebollizione di 77° C e densità 0,90 g/ml, etanolo caratterizzato da temperatura di ebollizione 79°C e densità 0,789 g/ml, indice di polarità 24. Sono stati posti ebollitori nel pallone e si à ̈ riscaldato il pallone con un bagno a olio. Si à ̈ ricondensato il solvente con un condensatore ad acqua nella parte alta del Soxhlet. Sono stati condotti circa 10 cicli di estrazione, alla fine dell’ultimo ciclo si à ̈ prelevato il ditale e lo si à ̈ posto in stufa a 105° C fino a peso costante.

Per separare il solvente di estrazione dall’estratto lipidico si à ̈ sostituito il Soxhlet con un claisen e si à ̈ distillato il solvente, prima a pressione atmosferica e poi sotto vuoto a circa 0,005 atm assolute. Nel pallone rimane l’estratto lipidico.

E’ stato utilizzato un microscopio ottico per determinare la morfologia delle particelle prima e dopo l’operazione di nebulizzazione ed à ̈ stata utilizzata una termobilancia (Perkin Elmer) per caratterizzare il tenore di umidità ed il tenore di ceneri delle polveri ottenute.

Sono state effettuate analisi di spettrofotometria in trasformata di Fourier (FT-IR) per caratterizzare l’estratto lipidico. Gli estratti sono stati caratterizzati mediante analisi FT-IR (Nicolet Nexus 670) nell’intervallo 4000 - 1000 cm<−1>(a 2 cm<−1>) in trasmissione per casting dell’estratto tal quale su una pastiglia di CaF2.

Con il metodo sopra indicato, sono state condotte le nebulizzazioni riportate nella tabella 1 seguente.

La prova SD100 à ̈ stata condotta con una alimentazione diluita circa 1:3 in H2O demineralizzata rispetto alle altre. Le 3 prove si differenziano per la temperatura della camera di nebulizzazione (T out nella seguente tabella 1) ed in particolare 95°, 130° e 150° C. Si segnala che il criptococco utilizzato per il test SD104, riportato in tabella prima dell’essiccamento in spray drying à ̈ stato sottoposto a diafiltrazione con l’aggiunta di acqua demineralizzata ed ultrafiltrazione per separare / raccogliere le cellule di lievito e lasciare gli zuccheri presenti inizialmente con il lievito nell’acqua, per rimuovere il glucosio residuo della fermentazione.

Tabella 1 – condizioni di nebulizzazione.

TEST SOSPENSIONE

peso secco

(g) (%ps)

SD100 Lypomices 150 9,8

SD101 Lypomices 19 29,5

SD102 Lypomices 67 29,5

SD103 Rhodotorula 26,8 13,0

SD104 Criptococco 127,2 4,2

(continuazione Tabella 1)

TEST CONDIZIONI SPRAY stima azoto Vuoto Set point T in T out peso f. recupero (l/h) atm Pompa (°C) (°C) (g) (%ps) SD100 550 0,975 4 210 95 6,9 47% SD101 550 0,975 3 220 130 3,8 67% SD102 551 0,975 4 250 150 16,2 82% SD103 551 0,975 3 250 130 2,5 73% SD104 500 0,975 3 250 150

Legenda tabella 1:

test = codice della prova

peso(g) = quantità di sospensione di lievito nebulizzata secco(%ps) = quantità di lievito nella sospensione nebulizzata

azoto (l/h) = portata nel gas caldo alimentato alla camera di nebulizzazione

vuoto (atm) = pressione assoluta a cui si trova l’azoto dopo il ciclone in cui viene separato e raccolto il lievito essiccata

set point pompa = selettore portata della pompa di alimentazione della sospensione di lievito nella camera di nebulizzazione (3=bassa, 4 media, 5 alta)

T in (°C) = temperatura dell’azoto in ingresso alla camera di nebulizzazione, quindi prima dell’immissione della sospensione da nebulizzare.

T out (°C) = temperatura della camera di nebulizzazione dopo l’ingresso della sospensione di lieviti.

Peso f (g) = quantità di lieviti essiccati raccolti nel ciclone posto dopo la camera di nebulizzazione.

Stima recupero (%) = peso di lieviti raccolti nel ciclone rispetto alla quantità di lieviti alimentati in sospensione

I lieviti raccolti nel ciclone posto dopo la camera di nebulizzazione risultano essiccati, in quanto hanno un contenuto residuo di acqua inferiore al 5%. Tali lieviti essiccati sono stati caratterizzati mediante analisi termogravimetrica. La termogravimetria consiste in una registrazione dell’evoluzione del peso in aria tra temperatura ambiente e 930° C, con gradiente di 10°C/min. I campioni sottoposti a termogravimetria sono quelli elencati nella tabella 2 seguente.

Tabella 2

TERMOGRAVIMETRIA

SD100

SD101

SD102

SD103

SD104

Es105°C in stufa

SOX104 Residuo da SD100 estratto con solvente esano SOX105 Residuo da SD101 estratto con solvente etanolo SOX107 Residuo da SD102 estratto con solvente etanolo SOX109 Residuo da SD103 estratto con solvente acetato di etile

SOX110 Residuo da SD103 estratto con solvente etanolo SOX111 Residuo da SD104 estratto con solvente acetato di etile

SOX112 Residuo da SD104 estratto con solvente etanolo

La normale operazione di atomizzazione del presente strumento utilizzato quale spray dryer sino ad una temperatura di 95° C, produce un efficace essiccamento della sospensione di questi lieviti (l’acqua residua nei solidi à ̈ inferiore al 5%) ma non risulta efficace a condurre contemporaneamente una lisi della membrana cellulare. Solo a partire da temperatura più alta, in cui il campione permane per circa 10-20 sec a T maggiore o uguale a 120° C, si à ̈ ottenuta una resa in termini di estratto percentuale, nel seguente processo di estrazione eseguito nell’unità Soxhlet, significativa e progressivamente più elevata all’aumentare della temperatura di nebulizzazione.

In sintesi, à ̈ risultata evidente una correlazione diretta ed inequivocabile tra l’incremento di temperatura di nebulizzazione e la lisi effettiva del microorganismo. Infatti durante i test di verifica dei lipidi estratti à ̈ stato dimostrato che l’effetto lisi aumenta all’aumentare della temperatura del processo di nebulizzazione nello spruzzatore, a causa del valore di temperatura e dalla rapidità di incremento di temperatura nello spruzzatore, che causa la rottura della membrana del campione.

Nella figura 1, Ã ̈ riportata la resa di estrazione (%ps) dei lipidi, in funzione della temperatura di atomizzazione delle sospensioni di lieviti Lypomices (L), Rhodotorula (R) e Criptococco (C).

Come si può notare dalla figura 1, la resa di estrazione percentuale, a parità di solvente utilizzato, aumenta all’aumentare della temperatura di nebulizzazione dei microrganismi.

Nella figura 2, sono riportati termogrammi che dimostrano i risultati ottenuti con il metodo dell’invenzione.

In particolare, in figura 2 à ̈ riportato il confronto tra termogrammi di cellule di lievito Lypomices dopo la nebulizzazione a temperature di nebulizzazione via via crescenti, ovvero a 95° C, 130° C e 150° C, ma prima dell’estrazione con solvente dei lipidi in esse contenute.

I termogrammi di figura 2 rappresentano le curve di peso residuo % (scala di sinistra) e le curve derivate (D% / DT) ottenute riscaldando i campioni nebulizzati in atmosfera di aria con rampa di riscaldamento di 10° C/min a temperature di 95° C, 130° C e 150° C.

La temperatura a cui si osserva la principale perdita di peso nel termogramma à ̈ compresa nell’intervallo 280-380°C. Questa perdita di peso indica la rottura della membrana che à ̈ correlata, nel grafico, alla temperatura a cui à ̈ stato atomizzato il campione. In particolare, da questo confronto si può notare come una temperatura di nebulizzazione più alta delle sospensioni iniziali (come da tabella 1, il campione SD100 era stato nebulizzato a 95° C (T out= 95° C), il campione SD101 a 130° C e il campione SD102 a 150° C) risulti in una temperatura più bassa per quanto riguarda la perdita di peso (rottura della membrana) del campione analizzato.

A scopo di confronto, in figura 3 à ̈ riportato il termogramma di una sospensione di lievito Lypomices essiccato in stufa a 105 °C, da cui si evince che la perdita di peso, ovvero la misura di un’ipotetica lisi dovuta al solo effetto termico di essicazione, non avviene a queste temperature che poi sono quelle di normale impiego della tecnologia di essicazione di uno spry-dryer. Solo per temperature decisamente più alte, e per tempi di trattamento di qualche ordine di grandezza superiore rispetto alla decina di microsecondi, la lisi termica può portare a rottura delle membrane del lievito utilizzato nell’esempio di nebulizzate.

I termogrammi della Figura 2 evidenziano anche come il tenore residuo di umidità sui campioni prodotti con nebulizzazione sia stato inferiore al 5% (perdita di peso a temperatura 105°C inferiore al 5%) e come vi sia stato un modesto contenuto di ceneri, inferiore al 4% (peso residuo a temperatura di 600°C). L’inizio dei fenomeni significativi di degrado à ̈ evidenziato dalla perdita di peso che si à ̈ osservata a circa 220° C.

La perdita di peso tra 280° C e 380° C inizia a temperature inferiori all’aumentare della temperatura di atomizzazione (nebulizzazione) del campione, indice di una maggior facilità a rilasciare verso l’esterno le sostanze endocellulari. Le altre perdite di peso osservate in particolare a circa 250° C, 420° C e 500° C, che sono altre componenti cellulari, come ad esempio i carboidrati, non sono sembrate invece essere influenzate dal trattamento di nebulizzazione che ha subito il campione

Nella figura 4 à ̈ riportata la curva dello spettro IR dell’estratto SOX107 (a 150° C) (fig. 4b) (sempre con riferimento ai campioni indicati nelle tabelle 1 e 2), e per confronto diretto lo spettro IR di un trigliceride di riferimento, ovvero con la trioleina (fig. 4a). Dal confronto, si può evincere come gli spettri ottenuti con il metodo dell’invenzione siano quelli di trigliceridi, con la banda caratteristica del carbonile a 1750 cm<-1>. Si à ̈ inoltre in presenza di acidi grassi liberi (banda a 1705 cm<-1>) derivanti dall’idrolisi dei lipidi (trigliceridi).

ESEMPIO 2

Di seguito à ̈ esemplificato uno schema di impianto per l’utilizzo del metodo dell’invenzione, dove sono stati estratti i lipidi contenuti all’interno di un lievito della famiglia delle Rhodotorula.

Nel presente esempio la sostanza da lisare, in sospensione nelle acque di fermentazione, à ̈ trattata in lisi assieme a n-esano quale solvente necessario per l’estrazione dei lipidi dal solido.

In figura 5 à ̈ rappresentato lo schema di impianto di una soluzione a ciclo chiuso dove la nebulizzazione à ̈ ottenuta con uno spray-dryer industriale usuale, dove le specifiche delle operazioni sono in linea con i dati elencati nell’esempio 1 e variano a seconda del prodotto da lisare, in virtù delle condizioni di temperatura e di solvente utilizzato. A catalogo sono disponibili un'ampia gamma di camere nebulizzazione e sistemi in iniezione in linea con la tecnologia propria dello spray-drying.

Nella tabella 3 seguente à ̈ riportata una legenda dei simboli dello schema di impianto della figura 5: tabella 3:

E-100 Scambiatori di calore a fascio tubiero

E-101

q100 Energia fornita per il riscaldamento a mezzo fluido di servizio esterno

VLV- Valvola di laminazione

100

MIX- Spruzzatore o nebulizzatore

101

V-100 Camera di nebulizzazione

E-102 Scambiatore di calore con vapore a

parete del V-100

C-500- Colonna per la separazione acqua

2 solvente

X-100 Separatore olio lipidici solidi

MIX- Operazione di rabbocco del solvente

102

P-100 Pompa di trascinamento solvente

RCY-2 Riciclo

Lo schema rappresentato in figura 5 à ̈ composto da una pompa P-100 che porta un solvente per l’estrazione del prodotto intracellulare, in pressione ad un valore adeguato per l’operazione di scambio termico e di lisi nella camera di nebulizzazione. Qui devono essere ottenute una temperatura specifica per la disgregazione cellulare del microorganismo ed un tempo di permanenza della sospensione nebulizzata nell’ intervallo 5-300 sec, preferibilmente circa 10 secondi circa.

Il liquido (flusso “12†) passa attraverso uno scambiatore senza cambiare di fase, quindi entra in un mixer statico a griglie dove incontra e trascina la sospensione o torbida da lisare (flusso “1†) ad un atomizzatore (nebulizzatore).

Nel mixer il meccanismo turbolento di miscelazione radiale riduce le velocità radiali e le dimensioni degli aggregati monofase da mescolare, aumentando la superficie di contatto e incentivando lo scambio termico e chimico di concentrazione migliorando la miscelazione. La lunghezza di dispersori necessaria dipende dal tempo di contatto richiesto. Per i processi di trasferimento di massa in cui l’equilibrio à ̈ stabilito rapidamente, una lunghezza di 5 diametri à ̈ generalmente sufficiente.

Esiste un vasto stato dell’arte sui diversi tipi di nebulizzatori pneumatici per applicazioni che possono essere utilizzabili a seconda delle caratteristiche di concentrazione e/o viscosità dell’alimentazione. Ad esempio citiamo:

- Nebulizzatori a tubi concentrici

- Nebulizzatori a flusso incrociato

- DIN (Direct Injection Nebulizer)

- Nebulizzatori a disco forato

- Nebulizzatori di Babington nelle sue versioni "V-groove†e "cone-spray†.

- Nebulizzatori "Parallel Path"

Nei sistemi industriali la nebulizzazione dei prodotti avviene tramite più atomizzatori, in condizioni di temperatura e flusso d'aria controllate, che possono essere rotanti per una miglior omogeneizzazione della camera V-100.

Il liquido, o gas liquefatto per le condizioni di lavoro, immesso nel mixer, fuoriesce da un ugello e viene disperso da un diffusore sotto forma di aerosol. La sospensione viene suddivisa in gocce nebulizzate le quali vengono poi a contatto con vapore acqueo nel presente esempio per il controllo della temperatura della camera di nebulizzazione V-100 e espande. La temperatura di tale camera à ̈ mantenuta sopra la soglia di lisi da un flusso di vapore addizionale e a parete.

L'evaporazione di parte o tutto il solvente liquido e dell’acqua che accompagna il prodotto da lisare, libera le cellule in una sospensione di olii alto bollenti (come già indicato i lipidi hanno una temperatura di ebollizione normale superiore a 300° C). I vapori evacuano la camera V-100. in condizioni di temperatura e flusso controllate. La sospensione dei residui solidi e lipidi viene continuamente scaricata, per gravità e pressione, dalla camera di nebulizzazione può essere avviata alla separazione dei residui cellulari (questo à ̈ il flusso indicato con “4†nello schema in figura 5). Il flusso “2†rappresenta un flusso di vapore acqueo per il controllo della temperatura della camera di nebulizzazione.

I vapori, dopo raffreddamento sotto i 100° C, sono avviati ad un colonna di recupero del solvente, C-100, che à ̈ poi riciclato assieme ad un flusso di make-up alla pompa P-100.

Le acque separate (correnti “6†e “7†) sono avviate ad un impianto di trattamento prima di essere smaltite.

Nella tabella 4 riportata in figura 6 sono stati indicati il bilancio materiale e energetico dell’esempio relativo ad una Rhodotorula trattata via fermentazione da zuccheri.

Lo schema à ̈ stato sviluppato per una concentrazione di solidi da lisare al 30% in peso nella torbida da trattare. Le condizioni di specifica per l’operazione di lisi sono indicate in tabella 4. A tale riguardo, sono necessari 1,52 kg di Vapore a 30 bar e 21 kg di acqua di raffreddamento per kg di torbida da lisare. Gli altri scambi sono compensati internamente.

L’operazione di estrazione à ̈ poi eseguita su tricanter utilizzando esano.

Se l’alimentazione, quale risultato di una filtrazione, fosse relativa ad una torbida al 70% in peso di microorganismi, i consumi caratteristici scenderebbero ad un vero conveniente 0,37 kg di Vapore e 4,25 kg di acqua torre per kg di torbida da lisare.

Claims (14)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per recuperare componenti intracellulari da una sospensione di microorganismi che comprende: - co-alimentare ad un nebulizzatore almeno due flussi, dove il primo flusso comprende la sospensione acquosa di microorganismi cellulari da lisare e il secondo flusso comprende un solvente liquido o gassoso; - nebulizzare detta sospensione in una camera di nebulizzazione mantenuta ad una temperatura compresa nell’intervallo da 90° C a 180° C, così da ottenere la lisi delle pareti cellulari dei microorganismi con formazione di una sospensione contenente i componenti intracellulari e i residui cellulari derivanti dalla lisi, e una fase vapore comprendente il solvente organico; - separare i componenti intracellulari dai residui cellulari derivanti dalla lisi.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui il solvente à ̈ un solvente organico, preferibilmente un solvente organico polare.
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 2, in cui il solvente organico polare à ̈ preferibilmente scelto tra gli alcoli, gli esteri, i chetoni o loro miscele, e ancora più preferibilmente à ̈ metanolo, etanolo, isopropanolo e/o acetato di etile.
4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui il solvente à ̈ un solvente organico, preferibilmente un solvente organico apolare.
5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4, in cui il solvente organico apolare à ̈ scelto tra alcani, in particolare sono preferiti esano e/o isoottano, tagli di raffineria caratterizzati da curva di ebollizione normale tra 50° C e 180°C, preferibilmente di 100°C, miscugli di sostanze organiche varie di raffineria, preferibilmente etere di petrolio, nafte e/o benzine alchilate, o loro miscele.
6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la nebulizzazione della sospensione dei microorganismi coltivati avviene in una camera di nebulizzazione contenente un gas inerte, preferibilmente, vapore acqueo, anidride carbonica o il solvente di nebulizzazione in fase gassosa.
7. 7. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la temperatura della camera di nebulizzazione à ̈ compresa nell’intervallo da 120° C a 160° C, preferibilmente da 130° C a 150° C.
8. 8. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui i microorganismi sono lieviti, alghe, batteri e/o muffe.
9. 9. Metodo secondo la rivendicazione 8, in cui i microorganismi coltivati sono lieviti, preferibilmente lieviti scelti tra: Lypomices, Rhodotorula e Criptococco.
10. 10. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui le componenti intracellulari sono lipidi intracellulari prodotti dai microorganismi coltivati a seguito di fermentazione zuccherina.
11. 11. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la separazione dei componenti intracellulari dai residui cellulari derivanti dalla lisi à ̈ effettuata per via gravimetrica o per centrifugazione.
12. 12. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la sospensione contenente i componenti intracellulari e i residui cellulari derivanti dalla lisi à ̈ sottoposta ad almeno una operazione di lisi aggiuntiva mediante riciclo della stessa sospensione.
13. 13. Metodo secondo la rivendicazione 12, in cui il riciclo della sospensione contenente i componenti intracellulari e i residui cellulari derivanti dalla lisi à ̈ condotto insieme alla sospensione iniziale da lisare, a monte della camera di nebulizzazione.
14. 14. Metodo secondo la rivendicazione 12, in cui il riciclo della sospensione contenente i componenti intracellulari e i residui cellulari derivanti dalla lisi à ̈ condotto verso una unità di lisi a valle della camera di nebulizzazione.