JP6744222B2 - 藻類の破砕方法 - Google Patents

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Description

本開示は、藻類の破砕方法及びそれを用いた藻類から脂質を抽出する方法に関する。
近年、地球温暖化を始めとする環境問題に対する意識や関心が高まっている。このため、二酸化炭素の排出量を低減することや、二酸化炭素の固定化により大気中の二酸化炭素濃度を低減することについて様々な検討が行われている。例えば、化石燃料に代えてカーボンニュートラルな資源であるバイオマスをエネルギー源として利用する試みが活発になされている。
藻類は、脂質を産生することが知られている。藻類が産生した脂質を効率良く抽出することができれば、化石燃料に代わるエネルギー源となり得る。エネルギー源以外にも種々の製品の原材料となり得る。しかし、藻類から脂質を抽出する際には、細胞壁が大きな障害となる。一般的に藻類の細胞壁は、硬く且つ柔軟性を有するため、容易に破砕することができない。このため、藻類から脂質等の産生物を効率良く回収することは容易ではない。
バイオマスから脂質等の油性化合物を回収する方法として、例えば特許文献１には、ｐＨを調整したバイオマス懸濁液に非極性溶媒を接触させ、非極性溶媒と極性バイオマス溶液から細胞産物を回収する方法が記載されている。
特表２０１２−５２００７６号公報
しかし、特許文献１は、脂質収率が十分でないという問題がある。また、高い脂質収率を得るためには、ｐＨ１、処理温度１２０℃以上という条件が必要であることも示されている。従って、高温下の強酸条件に耐える非常に特殊な設備が必要となり、商業化することは極めて困難である。
藻類を効率良く破砕することができれば、藻類からの脂質収率を大きく向上できると期待される。
本開示の課題は、不等毛植物門に属する微細藻類を効率良く破砕できるようにすることである。
藻類の破砕方法の一態様は、不等毛植物門に属する微細藻類に対し、ｐＨが３．５以上、９．５以下の条件で４０℃以上、６５℃以下の温度で熱処理した後、高圧分散装置を用いて物理的処理をする。
本開示の藻類の破砕方法によれば、不等植物門に属する微細藻類を効率良く破砕することができる。
高圧分散装置の均質バルブの一例を示す断面図である。 高圧分散装置のチャンバの一例を示す斜視図である。 高圧分散装置のチャンバの一例を示す斜視図である。
＜不等毛植物門に属する微細藻類＞
本開示において、不等毛植物門に属する微細藻類とは、微細藻類のうち、不等毛植物門に属するものをいう。微細藻類とは、酸素を発生する光合成を行う生物の中からコケ植物、シダ植物、及び種子植物を除いた残りのうちの、細胞サイズが直径１μｍ〜１００μｍのものをいう。なお、細胞サイズは、光学顕微鏡を用いて観察倍率４００倍で測定した細胞の長軸径である。不等毛植物門に属する微細藻類の具体例としてはBacillariophyceae綱、及びEustigmatophyceae綱等が挙げられる。Bacillariophyceae綱の微細藻類の具体例としては、Chaetoceros属、Nitzschia属、及びSkeletonema属等が挙げられる。Eustigmatophyceae綱の微細藻類の具体例としては、Nannochloropsis（ナンノクロロプシス）属が挙げられる。このうち、脂質の生産性及び脂質の回収性の観点から、Eustigmatophyceae綱の微細藻類が好ましく、中でもNannochloropsis属がより好ましい。Nannochloropsis属の藻類としては、Nannochloropsis oculata、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis gaditanaなどが例示される。微細藻類は、沼や池等に生息するものを採取したものでも、培養したものでもよく、さらには商業的に入手したものでもよい。
＜破砕方法＞
本実施形態の藻類の破砕方法は、不等毛植物門に属する微細藻類に対して、所定の水素イオン濃度（ｐＨ）範囲で、所定温度範囲にて熱処理をした後、高圧分散装置を用いて物理的処理をする。
本実施形態の破砕方法は、採取又は培養等により得られた、分散媒中に分散した状態の藻類をそのまま破砕処理することができる。また、処理液中に含まれる微細藻類の濃度（以下、藻体濃度ともいう。）を調整するための希釈又は濃縮等の操作を行ってから処理してもよい。さらに、分散媒の置換又は添加物の添加等の処理を行ってもよい。低温若しくは常温での保存又は凍結保存等の処理をすることもできる。破砕処理をする前に、微細藻類が８０℃以上の温度にさらされていないことが好ましい。
藻体濃度は、特に限定されない。生産性の向上、藻類の破砕性、脂質の回収性の観点からは、０．５ｇ／Ｌ以上が好ましく、０．８ｇ／Ｌ以上がより好ましく、５ｇ／Ｌ以上がさらに好ましく、１０ｇ／Ｌ以上がよりさらに好ましい。また、藻類の破砕性、脂質の回収性及び処理液の流動性の観点から、２００ｇ／Ｌ以下が好ましく、１００ｇ／Ｌ以下がより好ましく、５０ｇ／Ｌ以下がさらに好ましく、３０ｇ／Ｌ以下がよりさらに好ましく、２０ｇ／Ｌ以下がよりさらに好ましい。
濃度の調整方法は特に限定されない。濃縮方法としては例えばろ過、圧搾、遠心分離、重力沈降、凝集沈降、加圧浮上又は分散媒の蒸発等の方法が挙げられる。例えば、硫酸アルミニウム等の凝集剤を添加して、藻体を凝集沈降させた後、上清の一部を廃棄して濃縮したり、凝集沈降した藻体を回収して再懸濁して濃縮したりすることができる。また、複数の方法を組み合わせて多段階の濃縮を行ってもよい。熱処理と物理的処理をそれぞれ異なる濃度で行ってもよい。希釈方法としては例えば水等の液体を添加する方法が挙げられる。なお、処理液中の微細藻類の濃度は、実施例に記載された方法により測定された値である。
処理液の分散媒は、所定のｐＨ範囲とすることができれば特に限定されないが、経済性の観点から水が好ましい。水は精製されていても、不純物を含んでいてもよい。また、海水であってもよい。処理液が、塩化ナトリウム等の塩、窒素若しくはリンを含む化合物、微量金属、無機系凝集剤、有機系凝集剤、キレート剤、及び緩衝剤等のいずれか１つ又は２つ以上からなる添加物を含んでいてもよい。水を主成分とする培養液により微細藻類を培養した場合には、微細藻類の培養液をそのまま又は希釈等をして熱処理することができる。培養液又はその希釈液を処理液とする場合には、処理液が通常の培養液に含まれる種々の成分を含んでいてかまわない。培養液を希釈する場合には、水又は所定の添加物を含む水溶液を用いることができる。また、培養液を水又は所定の添加物を含む水溶液に置換してから処理してもよい。
−熱処理−
・ｐＨ
熱処理は、微細藻類を効率良く破砕する観点から、ｐＨ３．５以上、好ましくは３．８以上、より好ましくは４．０以上、さらに好ましくは４．５以上、よりさらに好ましくは５．０以上であり、そして、微細藻類を効率良く破砕する観点から、ｐＨ９．５以下、好ましくは９．０以下、より好ましくは８．５以下、さらに好ましくは８．０以下、よりさらに好ましくは７．５以下、よりさらに好ましくは７．０以下、よりさらに好ましくは６．５以下、よりさらに好ましくは６．０以下である。
ｐＨは、JIS Z8802に従った測定方法で、処理液のｐＨを２５℃で測定することにより求めることができる。
・処理温度
熱処理の温度は、微細藻類を効率良く破砕する観点から、４０℃以上、好ましくは４２℃以上、より好ましくは４３℃以上、さらに好ましくは４５℃以上であり、そして、微細藻類を効率良く破砕する観点から、６５℃以下、好ましくは６２℃以下、より好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５７℃以下、よりさらに好ましくは５５℃以下、よりさらに好ましくは５２℃以下、よりさらに好ましくは５０℃以下である。
・処理時間
熱処理の時間は、処理液の温度を上記の熱処理の温度範囲内で維持した時間を表し、微細藻類を効率良く破砕する観点から、好ましくは０．５時間以上、より好ましくは１時間以上、さらに好ましくは３時間以上、よりさらに好ましくは５時間以上、よりさらに好ましくは８時間以上、よりさらに好ましくは１０時間以上、よりさらに好ましくは２０時間以上、よりさらに好ましくは２４時間以上、よりさらに好ましくは４８時間以上とすることができる。処理時間の上限は、生産効率の観点から、好ましくは９６時間以下、より好ましくは７２時間以下とすることができる。
熱処理は、所定の時間続けて行えばよいが、合計が所定の時間となるように複数回に別けて行うこともできる。
以上の条件の範囲でｐＨ、温度及び時間を自由に組み合わせることができるが、微細藻類を効率良く破砕する観点から、中でもｐＨを５．０以上、７．５以下で、温度を４５℃以上、６０℃以下で、時間を１０時間以上とすることが好ましい。
熱処理は、開放又は密閉された処理槽により行うことができる。処理槽内の温度は、既知の方法により制御すればよい。例えば、熱源と、所定の温度になるように熱源をオンオフする制御装置とを設けることができる。温度制御は、通常の工業的処理の精度で行えばよく、好ましくは±５℃以下、より好ましくは±３℃以下、さらに好ましくは±１℃以下に制御することができる。制御が困難である場合には、処理液の温度が所定の温度範囲内にある時間の合計が、所定の時間となればよい。熱源は処理槽の内部に設けても、外部に設けてもよい。処理槽はバッチ式であっても、フロー式であってもよい。フロー式の場合、処理液が流れる通路状の処理槽としてもよい。熱処理は常圧で行うことができるが、加圧又は減圧環境で行うこともできる。
処理温度は、例えば温度計又は温度センサ等を処理液中に挿入して測定することができる。また、非接触の温度センサを用いて処理液の液温を測定することも可能である。処理液の温度を直接測定するのではなく、処理槽の雰囲気温度又は外部温度等を測定してもよい。この場合、雰囲気温度等と処理液の温度との相関係数を予め求めておき、雰囲気温度等を処理液の温度に換算してもよい。また、温度計又は温度センサ等の出力を記録装置に接続して、連続的に又は周期的に温度を記録することにより、熱処理の時間を精度良く管理することが可能となる。
処理液のｐＨが所定の値ではない場合には、処理液に酸又はアルカリを加えることによりｐＨを調整することができる。酸は特に限定されず、有機酸、鉱酸又はこれらの混合物を用いることができる。例えば、酢酸、クエン酸、リン酸、塩酸、硝酸又は硫酸等を用いることができる。アルカリは特に限定されないが、炭酸ナトリウム、アンモニア又は水酸化ナトリウム等を用いることができる。また、分散媒を緩衝液としてもよい。緩衝液は必要とするｐＨに応じて選択すればよいが、酢酸、クエン酸、リン酸又は炭酸ナトリウム等を含む緩衝液を用いることができる。
熱処理の際に処理液にどのような添加物を加えてもよい。但し、細胞壁の分解作用を有する酵素、例えば、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ及びラミナリナーゼ等を積極的に添加する必要はない。また、塩、アルカリ、界面活性剤及び洗剤等の細胞壁を分解する作用を有する薬剤を積極的に添加する必要もない。但し、これらの酵素又は薬剤が処理液に含まれていてもかまわない。
−物理的処理−
物理的処理は、高圧分散装置により行うことができる。高圧分散装置は、基本的に、固体粒子や液滴粒子等の分散質を含む処理液を加圧した状態で狭い流路を通過させ、その後急激に減圧することで固体粒子や液滴粒子等の分散質をさらに分散又は粉砕する装置である。高圧分散装置は、工業化において大量処理が可能であるという観点からも好ましい。
処理液の加圧には高圧ポンプを用いることができる。処理液を通過させる狭い隙間を有する流路は、所定の圧力等を加えることができればどのような構造としてもよい。必要とする圧力等によって隙間の幅等の値は適宜変えればよいが、例えば、流路を直径が１μｍ〜２０００μｍの直管とすることができる。また、１μｍ〜２０００μｍの穴を有するオリフィスが直管の流路の途中に配置されている構造としてもよい。１μｍ〜２０００μｍの隙間を有するスリットが直管の流路の途中に配置されている構造とすることもできる。また、バルブの先端とバルブ受けの隙間に流路を形成させ、バルブの開度を調整することで、隙間の間隔を１μｍ〜２０００μｍとしてもよい。さらに、１μｍ〜２０００μｍの隙間の流路を対向させて配置し、処理液同士を衝突させてもよい。流路の方向を例えば直角に曲げるなど急激に変化させて、流路の壁面に処理液を衝突させてもよい。
このような処理を行う装置として種々の構成のものを用いることができるが、微細藻類を効率良く破砕する観点から、例えば均質バルブを有する均質バルブ式の高圧分散装置及びチャンバを有するチャンバ式の高圧分散装置等を用いることが好ましい。中でも、少量処理が可能である観点からチャンバ式の高圧分散装置が好ましく、工業化においては大量処理が可能である観点から均質バルブ式の高圧分散装置が好ましい。図１には均質バルブ１００の一例を示す。均質バルブ１００は、吐出孔が形成された均質バルブシート（バルブ受け）１０１と、均質バルブシート１０１の吐出口と対向する位置に配置された均質バルブ本体１０２と、均質バルブ本体１０２を囲むインパクトリング１０３とを有する。均質バルブシート１０１、均質バルブ本体１０２及びインパクトリング１０３が形成する間隙を通過する際に処理液には大きな圧力が加わり、間隙を通過した後は急激に減圧される。吐出孔から吐出された処理液中の分散質は、均質バルブ本体１０２及びインパクトリング１０３に衝突する。間隙を通過する際のせん断応力、衝突による衝撃力、及び間隙を通過した後の圧力降下によるキャビテーションにより、分散質が粉砕される。
均質バルブシート１０１、均質バルブ本体１０２及びインパクトリング１０３が形成する間隙の大きさを変化させることにより分散質に加わるせん断力を調整できる。均質バルブシート１０１と均質バルブ本体１０２とが互いに対向する面は、平滑面とすることができる。また、流路を長くし、分散質に十分に強いせん断力を与えることを目的として、流路となる壁面に凹凸を形成することもできる。また、インパクトリング１０３が設けられていない構成とすることもできる。
また、物理的処理にはチャンバ式の高圧分散装置を用いることもできる。チャンバ式の高圧分散装置は、処理液を互いに衝突させる又は壁面等と衝突させる形式ものと、衝突させない形式ものとがある。
処理液同士を衝突させる形式のチャンバ式高圧分散装置は、例えば図２に示すようなチャンバ１１０を有している。チャンバ１１０は、複数の処理液の流入管路１１１と、流入管路１１１と同数のせん断管路１１２と、単一の流出管路１１３とが順次連結され、複数のせん断管路１１２の流出管路１１３に近い方の端が１カ所で接続されており、接続箇所において処理液同士を衝突させる。流入管路１１１及び流出管路１１３よりも細いせん断管路１１２におけるせん断応力、処理液同士の衝突による衝撃力、及び流出管路１１３における圧力降下によるキャビテーションにより、分散質が粉砕される。
処理液と壁面とを衝突させる形式のチャンバ式高圧分散装置は、例えば図３に示すようなチャンバ１２０を有している。チャンバ１２０は、各々単一の、液体の流入管路１２１と、せん断管路１２２と、流出管路１２３とが順次連結されている。せん断管路１２２と流出管路１２３とのなす角度は直角となっており、せん断管路１２２の液体流を流出管路１２３の内壁に衝突させる。せん断管路１２２におけるせん断応力、処理液と壁面との衝突による衝撃力、及び流出管路１２３における圧力降下によるキャビテーションにより、分散質が粉砕される。
処理液を衝突させない形式のチャンバ式高圧分散装置は、例えば流路中に狭いせん断管路が設けられており、せん断管路におけるせん断応力と、拡がった流出管路における圧力降下によるキャビテーションにより、分散質が粉砕される。
これらの形式の高圧分散装置に限らず、他の形式の高圧分散装置を用いることもできる。
いずれの形式の高圧分散装置についても、微細藻類の物理的処理に用いる場合には、処理液に加える圧力（入口圧）は、藻類を効率良く破砕する観点から、ゲージ圧で１０ＭＰａ以上、好ましくは３０ＭＰａ以上、より好ましくは５０ＭＰａ以上、さらに好ましくは８０ＭＰａ以上であり、経済性の観点から、好ましくは２００ＭＰａ以下、より好ましくは１５０ＭＰａ以下、さらに好ましくは１２０ＭＰａ以下である。藻類を効率良く破砕する観点及び経済性の観点から、減圧後の圧力（出口圧）は大気圧（絶対圧で０．１ＭＰａ）とすることができる。流路の構造等により完全に大気圧まで減圧されなくてもよく、出口圧は絶対圧で、好ましくは０．３ＭＰａ以下、より好ましくは０．２ＭＰａ以下、さらに好ましくは０．１５ＭＰａ以下、よりさらに好ましくは０．１１ＭＰａ以下である。
均質バルブ式の高圧分散装置の具体例としては、圧力式ホモジナイザー（株式会社エスエムテー）、高圧ホモゲナイザー（株式会社イズミフードマシナリ）、及びミニラボ８．３Ｈ型（Ｒａｎｎｉｅ社）等が挙げられる。チャンバ式の高圧分散装置の例としては、マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社）、ナノヴェイタ（エス・ジーエンジニアリング株式会社、吉田機械工業株式会社）、スターバースト（スギノマシン株式会社）、アルティマイザー（スギノマシン株式会社）、ジーナスＰＹ（白水化学株式会社）、ＤｅＢＥＥ２０００（日本ビーイーイー株式会社）等が挙げられる。これらのうち、少量処理が可能である観点からナノヴェイタが好ましく、工業化においては大量処理が可能である観点から圧力式ホモジナイザーが好ましい。
熱処理の後に物理的処理を行うことにより不等毛植物門に属する微細藻類を効率良く破砕することができる。不等毛植物門に属する微細藻類である場合には、先に示したような熱処理と物理的処理との組み合わせとすることにより、物理的処理単独の場合よりも破砕効率を大きく向上させることができる。本実施形態の破砕方法においては、熱処理の温度は４０℃〜６５℃程度である。この程度の温度であれば数時間〜十時間程度の熱処理に要するエネルギーは小さく、費用も非常に低く抑えられる。このため、物理処理単独の場合と比べて、単純に破砕率が向上するだけでなく、必要とするエネルギーや費用を考慮した実質的な効率についても大きく向上する。また、熱処理が数十時間〜数日間に及んだとしても、この程度の温度範囲であれば大きなエネルギーは必要とせず、熱処理費用も低く抑えられる。また、サイクルタイムについても許容の範囲内であり、実質的な破砕率の向上効果が十分に得られる。
熱処理の後に物理的処理を複数回繰り返してもよい。熱処理の後、他の処理を行うことなく物理的処理を行うことができる。熱処理の後すぐに物理的処理を行うことができるが、熱処理の後、処理液を一旦保存してから物理的処理を行うこともできる。処理液を保存する場合には、必要とするエネルギーを低減する観点から、１５〜２５℃程度の常温であることが好ましく、また、脂質の変質を抑える観点から５〜１５℃程度の低温で保存することが好ましい。凍結保存することもできる。熱処理の後、物理的処理の前に処理液の濃縮、希釈又は分散媒の置換、処理液のｐＨ調整等の操作を行うこともできる。
＜脂質を抽出する方法＞
本実施形態の破砕方法は、脂質を回収する処理と組み合わせて、脂質を抽出する方法とすることができる。破砕率が高いほど、微細藻類の処理液からの脂質の収率が向上する。従って、効率良く破砕できる本実施形態の破砕方法により、不等毛植物門に属する微細藻類を破砕してから脂質を抽出して回収することにより、脂質の収率を大きく向上することができる。また、破砕処理における破砕率を高くすることにより、抽出に用いる溶媒の量を低減できたり、抽出に必要とするエネルギーや費用を低減できたりするという利点も得られる。
−脂質−
本開示において、脂質には、単純脂質、複合脂質及び誘導脂質が含まれる。単純脂質には、油脂又は脂肪酸エステルなどの脂肪酸と各種アルコールとのエステル等が含まれる。複合脂質には、脂肪酸、アルコール及びリン酸を含むリン脂質、並びに脂肪酸、アルコール及び糖を含む糖脂質等が含まれる。誘導脂質には、単純脂質又は複合脂質の加水分解生成物であり、水に不溶性の脂肪酸、高級アルコール、ステロール、テルペン、及び脂溶性ビタミン等が含まれる。脂質の回収性の観点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がより好ましく、油脂がさらに好ましい。
−油脂−
油脂とは、脂肪酸とグリセリンとのエステルを意味し、具体的には、モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリドのような中性脂質をいう。油脂を構成する脂肪酸は、単一でなくてよい。
−脂肪酸−
脂肪酸は、炭素数が２〜４の短鎖脂肪酸、炭素数が５〜１２の中鎖脂肪酸、及び炭素数が１２以上の長鎖脂肪酸のいずれであってもよい。また、飽和脂肪酸でも不飽和脂肪酸でもよい。飽和脂肪酸の具体例としては、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、及びイコサン酸が挙げられる。一価の不飽和脂肪酸の具体例としては、９−ヘキサデセン酸、及び９−オクタデセン酸等が挙げられる。多価の不飽和脂肪酸の具体例としては、９，１２−オクタデカジエン酸、６，９，１２−オクタデカトリエン酸、５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸、９，１２，１５−オクタデカトリエン酸、５，８，１１，１４，１７−イコサペンタエン酸、及び４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸が挙げられる。
−脂肪酸エステル−
脂肪酸エステルとは、油脂以外の、脂肪酸とアルコールとのエステルであり、長鎖脂肪酸と１価又は２価の高級アルコールとのエステルである蝋、中鎖脂肪酸と低級又は高級アルコールとのエステルである中鎖脂肪酸エステル等を含む。
−脂質を回収する処理−
脂質を回収する処理は、微細藻類の破砕物を含む処理液から脂質を分取することができれば特に限定されない。例えば、溶媒抽出、遠心分離、静置処理、カラムクロマトグラフィー等が挙げられる。これらの１種又は２種以上を組み合わせて適用することができる。中でも、脂質の回収性の観点から、溶媒抽出、遠心分離及び静置処理から選ばれる１種又は２種以上の組み合わせが好ましく、中でも溶媒抽出と遠心分離との組み合わせ、又は溶媒抽出と静置処理との組み合わせが好ましい。
溶媒抽出は、微細藻類を破砕した後の処理液に抽出用の溶媒を添加して混合すればよい。溶媒を添加した後、攪拌を行ってもよい。微細藻類から溶出した脂質は、溶媒に溶解するため、溶媒相と水相とを相分離させて、溶媒相を回収することにより、脂質を回収することができる。
溶媒抽出に用いる溶媒としては、例えば、酢酸メチル、及び酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、及びジエチルエーテル等の鎖状並びに環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、及び四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、及び石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、及びトルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類；ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、及びイソプロピルアルコール（２−プロパノール）等のアルコール類；ブチレングリコール等の多価アルコール類；メチルエチルケトン等のケトン類；超臨界二酸化炭素等が挙げられる。これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
これらの溶媒の中でも、脂質の回収性の観点から、非極性溶媒が好ましい。非極性溶媒の具体例として、ハロゲン化炭化水素類、炭化水素類、又は芳香族炭化水素類が挙げられ、中でも、炭化水素類が好ましく、ヘキサンがより好ましい。また、メタノール、エタノール、プロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、及びアセトン等の水と相溶性のある溶媒を非極性溶媒に補助的に添加して用いることもできる。また、超臨界二酸化炭素等を用いた超臨界抽出を用いることもできる。さらに、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、又は亜臨界抽出等を用いることもできる。例えば、「生物化学実験法２４ 植物脂質代謝実験法」（山田晃弘 編著、株式会社学会出版センター、ｐ３−４）に記載の方法を参考にすることができる。
溶媒抽出の温度は特に限定されないが、脂質の回収性の観点から、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上である。また、上記観点及び溶媒を加温する等の経済性の観点から、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下、さらにより好ましくは４０℃以下である。
また、溶媒抽出は１回でもよく、２回以上行ってもよい。溶媒抽出を２回以上行う場合は、同じ溶媒により行っても、異なる溶媒により行ってもよい。
遠心分離は、分離板型、円筒型、又はデカンター型等の一般的な機器を使用することができる。この場合の遠心力は、脂質の回収性の観点から、好ましくは５００Ｇ以上、より好ましくは１０００Ｇ以上とすることができる。また、経済性の観点から、好ましくは１００００Ｇ以下、より好ましくは５０００Ｇ以下、さらに好ましくは２０００Ｇ以下とすることができる。
遠心分離の処理時間は、脂質の回収性の観点から、好ましくは１分以上、より好ましくは５分以上、さらに好ましくは１０分以上とすることができる。また、経済性の観点から、好ましくは８０分以下、より好ましくは４０分以下、さらに好ましくは２０分以下とすることができる。
遠心分離の際の温度は特に限定されないが、脂質の回収性及び経済性の観点から、好ましくは１０℃以上、より好ましくは１５℃以上であり、好ましくは５０℃以下、より好ましくは４０℃以下である。
溶媒抽出と遠心分離とを組み合わせる場合には、溶媒相と水相との分離を遠心分離により迅速に行うことができる。
静置処理は、脂質と水相とが相分離するまで反応液を静止状態に置けばよい。溶媒抽出と組み合わせる場合には、溶媒相と水相とが相分離するまで静止状態とすればよい。
本開示の藻類から脂質を抽出する方法によれば、このような簡便な操作により、体内に脂質を蓄積した微細藻類から高い回収率で脂質を抽出することができる。
微細藻類から抽出された脂質は、直接又は精製処理若しくは分解処理等を行ってバイオディーゼル燃料等のバイオ燃料として用いることができる。また、機能性食品又は医薬品等の原料、化成品の原料、化粧品の原料として用いることができる。
破砕した微細藻類から脂質を抽出・回収する方法について説明したが、糖質及び蛋白質等の脂質以外の生成物を抽出・回収して利用することもできる。これらの抽出・回収について既知の方法を用いることができる。
上述した実施の形態に関し、本開示はさらに以下の藻類を破砕する方法及び藻類から脂質を抽出する方法を開示する。
＜１＞
不等毛植物門に属する微細藻類に対し、ｐＨが３．５以上、好ましくは３．８以上、より好ましくは４．０以上、さらに好ましくは４．５以上、よりさらに好ましくは５．０以上であり、９．５以下、好ましくは９．０以下、より好ましくは８．５以下、さらに好ましくは８．０以下、よりさらに好ましくは７．５以下、よりさらに好ましくは７．０以下、よりさらに好ましくは６．５以下、よりさらに好ましくは６．０以下の条件で、４０℃以上、好ましくは４２℃以上、より好ましくは４３℃以上、さらに好ましくは４５℃以上、６５℃以下、好ましくは６２℃以下、より好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５７℃以下、よりさらに好ましくは５５℃以下、よりさらに好ましくは５２℃以下、よりさらに好ましくは５０℃以下の温度で熱処理した後、高圧分散装置を用いて物理的処理をする、藻類の破砕方法。
＜２＞
前記微細藻類が、ナンノクロロプシス属である、前記＜１＞に記載の藻類の破砕方法。
＜３＞
前記熱処理は、好ましくは０．５時間以上、より好ましくは１時間以上、さらに好ましくは３時間以上、よりさらに好ましくは５時間以上、よりさらに好ましくは８時間以上、よりさらに好ましくは１０時間以上、よりさらに好ましくは２０時間以上、よりさらに好ましくは２４時間以上、よりさらに好ましくは４８時間以上である、前記＜１＞又は＜２＞に記載の藻類の破砕方法。
＜４＞
前記熱処理は、好ましくは９６時間以下、より好ましくは７２時間以下である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。
＜５＞
前記物理処理は、前記高圧分散装置を用い、ゲージ圧で好ましくは１０ＭＰａ以上、より好ましくは３０ＭＰａ以上、さらに好ましくは５０ＭＰａ以上、よりさらに好ましくは８０ＭＰａ以上、好ましくは２００ＭＰａ以下、より好ましくは１５０ＭＰａ以下、さらに好ましくは１２０ＭＰａ以下の圧力を加えた後、絶対圧で、好ましくは０．３ＭＰａ以下、より好ましくは０．２ＭＰａ以下、さらに好ましくは０．１５ＭＰａ以下、よりさらに好ましくは０．１１ＭＰａ以下、よりさらに好ましくは大気圧（０．１ＭＰａ）に減圧する、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。
＜６＞
前記熱処理は、細胞壁を分解する酵素の意図的な添加なしに行う、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。
＜７＞
前記熱処理は、ｐＨが５．０以上、７．５以下の条件で、温度が４５℃以上、６０℃以下で、時間を１０時間以上行う、前記＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。
＜８＞
高圧分散装置が、均質バルブ式の高圧分散装置又はチャンバ式の高圧分散装置である、＜１＞〜＜７＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。
＜９＞
＜１＞〜＜８＞のいずれか１つに記載された藻類の破砕方法により得られた藻類の破砕物から脂質を回収する、藻類から脂質を抽出する方法。
＜１０＞
前記脂質を回収する処理は、溶媒抽出、遠心分離、静置処理、及びカラムクロマトグラフィーから選ばれた１種又は２種以上の組み合わせであり、好ましくは溶媒抽出、遠心分離及び静置処理から選ばれる１種又は２種以上の組み合わせであり、より好ましくは溶媒抽出と遠心分離との組み合わせ、又は溶媒抽出と静置処理との組み合わせである、前記＜９＞に記載の藻類から脂質を抽出する方法。
＜１１＞
前記脂質を回収する処理における、溶媒抽出に用いる溶媒が、好ましくは非極性溶媒であり、より好ましくは炭化水素類であり、さらに好ましくはヘキサンである、前記＜１０＞に記載の藻類から脂質を抽出する方法。
＜１２＞
前記脂質を回収する処理における、溶媒抽出の温度が、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上であり、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下、さらにより好ましくは４０℃以下である、前記＜１０＞又は＜１１＞に記載の藻類から脂質を抽出する方法。
＜１３＞
前記脂質を回収する処理における、遠心分離の遠心力が、好ましくは５００Ｇ以上、より好ましくは１０００Ｇ以上であり、好ましくは１００００Ｇ以下、より好ましくは５０００Ｇ以下、さらに好ましくは２０００Ｇ以下である、前記＜１０＞〜＜１２＞のいずれか１つに記載の藻類から脂質を抽出する方法。
＜１４＞
前記脂質を回収する処理における、遠心分離の処理時間が、好ましくは１分以上、より好ましくは５分以上、さらに好ましくは１０分以上であり、好ましくは８０分以下、より好ましくは４０分以下、さらに好ましくは２０分以下である、前記＜１０＞〜＜１３＞のいずれか１つに記載の藻類から脂質を抽出する方法。
＜１５＞
前記脂質を回収する処理における、遠心分離の処理温度が、好ましくは１０℃以上、より好ましくは１５℃以上であり、好ましくは５０℃以下、より好ましくは４０℃以下である、前記＜１０＞〜＜１３＞のいずれか１つに記載の藻類から脂質を抽出する方法。
本開示について実施例を用いてさらに詳細に説明する。以下の実施例は例示であり、本発明を限定するものではない。
＜使用藻体＞
沖縄県石垣島近郊の沿岸から藻体含む海水サンプルを取得した。取得した海水サンプルをフィルタによって濃縮し、マイクロピペットにより一つの藻体株を単離した。この単離した藻体は、培養液（ダイゴＩＭＫ培地、和光純薬工業社製）によって培養を行い、さらに培養液（ｆ／２培地）を用いて藻体を増殖させた。この藻体の一部をテキサス大学（UTEX Culture Collection）に分析を依頼し、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）であることが同定された。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）「ヤンマリンＫ−１」（クロレラ工業製、処理液を構成する液体：海水、藻体濃度：５０ｇ／Ｌ）を入手し、実験に用いた。
＜細胞数の計測＞
希釈した処理液２μＬをバクテリアカウンター（サンリード硝子製）の計算室に注入した後、光学顕微鏡（Nikon製、ECLIPSE80i）を用いて観察倍率４００倍で観察し、ブロック内の細胞数をカウントした。バクテリアカウンターの計算室のうち、０．０５ｍｍ角のブロックを使用した。計算室には、０．０５ｍｍ角のブロック１６マス（縦４マス×横４マス）からなる集合体が、２５個（縦５個×横５個）並んでいる。これらの集合体のうち、顕微鏡の観察画面の右上から左下までの対角線上に存在する５個の集合体中に含まれる細胞数をカウントした。すなわち、０．０５ｍｍ角のブロックの８０マス（１６マス×５個）中の細胞数をカウントした。バクテリアカウンターの計算室の深さは０．０２０ｍｍであり、０．０５ｍｍ角のブロック１つあたりの体積は１／２００００ｍｍ3である。カウントした細胞の総数を、該当するブロックの体積（１／２００００ｍｍ3×８０マス）で除し、さらにカウントに用いた希釈液の希釈倍率をこれに乗ずることにより、希釈前のサンプル１ｍＬあたりの細胞数を求めた。なお、希釈液には、ダイゴ人工海水ＳＰ（和光純薬工業製）を用いた。
＜細胞破砕率の算出＞
前述の細胞数の測定方法により、処理液中の細胞数を測定した。破砕処理前の細胞数から破砕処理後の細胞数を引いて、破砕処理前の細胞数で除し、１００を乗じた値を細胞破砕率（％）とした。
＜藻体濃度の測定＞
微細藻類を含む処理液を遠心分離機（HITACHI社製、CR22GIII、ローター：18A）にて、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分、２５℃）し、上清を捨てた後、０．１２５Ｍクエン酸-リン酸水素二ナトリウムバッファー（ｐＨ５）に再分散させた。再分散させた液をフィルタ（日本ポール製、Supor-450、孔径０．４５μｍ）にて吸引ろ過し、等量の蒸留水で掛け洗いした。藻体を捕集したフィルタをアルミカップに移して１０５℃で２時間乾燥させた。乾燥後の重量を測定し、フィルタの風袋を差し引いて藻体濃度（ｇ／Ｌ）とした。また、処理液がフィルタで吸引ろ過しにくい場合は、適当な濃度に処理液を希釈して、乾燥後の重量を測定し、フィルタの風袋を差し引いた後、希釈率を乗じて藻体濃度（ｇ／Ｌ）とした。なお、希釈液には、０．１２５Ｍクエン酸−リン酸水素二ナトリウムバッファー（ｐＨ５）を用いることができる。
＜熱処理＞
所定濃度の微細藻類を含む処理液を、ポリエチレン製の容器に入れ、予め所定の温度に設定した真空乾燥機（ヤマト科学社製、ADP300）のチャンバ内に静置した。チャンバ内は大気圧とした。所定の時間が経過した後、サンプルを乾燥機から取り出し、室温にて冷却した。なお、比較として２５℃で処理する場合は、実験室の温度を２５℃とし、実験室内にサンプルを静置した。また、比較として４℃で処理する場合は、冷蔵庫（三洋電機株式会社製、ＭＰＲ−１４１１）内にサンプルを静置した。所定の時間が経過した後、サンプルを冷蔵庫から取り出し、室温に戻した。
＜物理的処理＞
物理的処理は、高圧分散装置により行った。高圧分散装置には、ナノヴェイタ「NM2-L200-D」（吉田機械興業社製、クロス型ノズル：NVGL-XT160）又は圧力式ホモジナイザー「LAB2000」（株式会社エスエムテー社製）を用いた。ナノヴェイタを用いた場合は、処理圧力は、入口圧がゲージ圧で１００ＭＰａ、出口圧が絶対圧で０．１Ｍｐａ（大気圧）とし、端切りのために７ショット目から取得した。パス回数は１回とした。圧力式ホモジナイザーを用いた場合は、処理圧力は、入口圧がゲージ圧で１００ＭＰａ、出口圧が絶対圧で０．１Ｍｐａ（大気圧）とした。端切りのために処理開始後の３００ｃｃの処理液は廃棄し、３００ｃｃ以降から処理サンプルとして取得した。パス回数は１回とした。
＜乾燥藻体中の脂質量の測定＞
藻体の脂質の含量は、E.G.BlighとW.J.Dyerによって１９５９年に報告された生体材料からの脂質の抽出方法（Bligh ＆ Dyer法）に従って分析した（E.G.Bligh、W.J.Dyer、Canadian journal of biochemistry and physiology、37(1959)、p.911-917）。
処理前の試料０．５ｍＬに、内部標準として１ｍｇ／ｍＬの７−ペンタデカノン（メタノール溶液）を１００μＬ添加した。次に、２ＮのＨＣｌを１０μＬ添加し、さらにクロロホルム５００μＬとメタノール０．９ｍＬを添加した。撹拌後、２５℃にて３０分間静置し、クロロホルム５００μＬと１．５％ＫＣｌを５００μＬ添加した。撹拌した後、遠心分離機、「himacCF7D2」（日立工機株式会社製）を用いて遠心分離（遠心力：１５００Ｇ、回転数：３０００ｒ／ｍｉｎ、温度：２５℃、時間：１５分間）した。次に、下層のクロロホルム相を採取し、窒素を用いて乾固した。次に、０．７ｍＬの０．５Ｎ ＫＯＨ−メタノール溶液（水酸化カリウム２．８ｇ、メタノール１００ｍＬ）を添加し、８０℃で３０分間保温してケン化を行った。さらに１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液を添加し、８０℃にて１０分間保温してメチルエステル化を行い、溶媒と飽和食塩水をそれぞれ１ｍＬ添加して撹拌した後、２５℃で３０分間放置して溶媒相を取得した。溶媒にはヘキサンを用いた。得られた溶媒相を回収し、脂肪酸エステルの同定及び定量を下記の条件のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により行った。脂肪酸エステルの同定は、後述の標準物質とのリテンションタイムと同一かどうかにより判断した。またＧＣ分析にて検出した脂肪酸エステルの量を、内部標準を基準にして算出し、その総量を乾燥藻体中の脂質量として求めた。
なお、このクロロホルム・メタノール溶媒抽出法は、単に藻体中の脂質量を測定するには有効であるが、使用する溶媒の安全性、回収性、リサイクル性の観点から、工業的な実用には適していない方法である。
−ＧＣ分析−
装置：Agilent technology 7890A
カラム：ＤＢ１−ＭＳ（J&W scientific製、20m×100μm×0.1μm）
オーブン温度：１５０℃（0.5min hold）−[40℃/min]−２２０℃（0min hold）−[20℃/min]−３２０℃（2min hold）−post run2min
キャリアガス：水素
メイクアップガス：ヘリウム
サンプル注入量：５μＬ
注入法：スプリットモード（スプリット比＝７５：１）
注入口温度：３００℃
検出器：ＦＩＤ
カラム流量：０．２８ｍＬ／ｍｉｎコンスタント
圧力（ゲージ圧）：６２．４０３ｐｓｉ
標準物質：ＳＩＧＭＡ社製の下記脂肪酸エステルを用いた。
ラウリン酸メチル（Ｃ１２）、ミリスチン酸メチル（Ｃ１４）、パルミチン酸メチル（Ｃ１６）、ステアリン酸メチル（Ｃ１８）、パルミトレイン酸メチル（Ｃ１６：１）、オレイン酸メチル（Ｃ１８：１）、リノール酸メチル（Ｃ１８：２）、リノレン酸メチル（Ｃ１８：３）、エイコサペンタエン酸メチル（Ｃ２０：５）、ドコサヘキサエン酸メチル（Ｃ２２：６）
＜脂質の回収率の測定＞
脂質は以下に示す溶媒抽出により回収した。回収した脂質は、メチルエステル化した後、前述のＧＣにて脂質量を定量した。
−ヘキサン抽出−
処理後の試料０．５ｍＬに、ヘキサン１ｍＬを添加し、２５℃にて３分間撹拌した後、遠心分離機、「himacCF7D2」（日立工機株式会社製）を用いて遠心分離（遠心力：１５００Ｇ、回転数：３０００ｒ／ｍｉｎ、温度：２５℃、時間：１５分間）した。次に、上層のヘキサン相を４００μＬ採取し、内部標準として１ｍｇ／ｍＬの７−ペンタデカノン（メタノール溶液）を４０μＬ添加した後、窒素を用いて乾固した。次に、０．７ｍＬの０．５Ｎ ＫＯＨ−メタノール溶液（水酸化カリウム２．８ｇ、メタノール１００ｍＬ）を添加し、８０℃で３０分間保温してケン化を行った。さらに１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液を添加し、８０℃にて１０分間保温してメチルエステル化を行い、溶媒と飽和食塩水をそれぞれ１ｍＬ添加して撹拌した後、２５℃で３０分間放置して溶媒相を取得した。溶媒にはヘキサンを用いた。得られた溶媒相を回収し、脂肪酸エステルの同定及び定量を前述の条件のＧＣにより行った。またＧＣ分析にて検出した脂肪酸エステルの量を、内部標準を基準にして算出し、その総量をヘキサン中の脂質量として求めた。
−脂質の回収率の算出−
以下の式（１）によりヘキサン溶媒による脂質回収率を算出した。
脂質回収率（％）＝ヘキサン中の脂質量／乾燥藻体中の脂質量×１００・・・（１）
（参考例１）
不等毛植物門に属する微細藻類としてナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）（処理液を構成する液体：人工海水（ダイゴ人工海水SP、日本製薬株式会社製、藻体濃度：１．０ｇ／Ｌ））を用いた。２５℃における処理液のｐＨは７．３であった。１ＭのＨＣｌを滴下し、処理液のｐＨを５．０に調整した。ｐＨを調整した溶液に対して熱処理を行った。処理温度は５０℃とし、処理時間は１時間とした。熱処理後に、物理的処理をナノヴェイタを用いて入口圧が１００ＭＰａの条件で行った。細胞の破砕率は３８．６％であった。
（参考例２）
熱処理時間を２時間とした以外は参考例１と同様にした。細胞の破砕率は３３．９％であった。
（実施例３）
熱処理時間を３時間とした以外は参考例１と同様にした。細胞の破砕率は４５．８％であった。
（実施例４）
熱処理時間を５時間とした以外は参考例１と同様にした。細胞の破砕率は４７．４％であった。
（実施例５）
熱処理時間を１０時間とした以外は参考例１と同様にした。細胞の破砕率は６０．５％であった。
（実施例６）
熱処理時間を２４時間とした以外は参考例１と同様にした。細胞の破砕率は８７．０％であった。また、破砕後の脂質回収率は６９％であった。
（実施例７）
物理的処理における入口圧力を５０ＭＰａとした以外は実施例６と同様にした。細胞の破砕率は７５．９％であった。また、破砕後の脂質回収率は７０％であった。
（比較例１）
ｐＨの調整をせず、熱処理も行わなかったこと以外は、参考例１と同様にした。すなわちナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）（処理液を構成する液体：人工海水（ダイゴ人工海水SP、日本製薬株式会社製、藻体濃度：１．０ｇ／Ｌ））の処理液を得た後、ｐＨ７．３のまま、サンプル取得後３０分以内に熱処理を行わずに高圧分散装置ナノヴェイタにて物理的処理を入口圧１００ＭＰａの条件で行った。細胞の破砕率は１６．９％であった。
（比較例２）
熱処理を行わなかったこと以外は、参考例１と同様にした。すなわちナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）（処理液を構成する液体：人工海水（ダイゴ人工海水SP、日本製薬株式会社製、藻体濃度：１．０ｇ／Ｌ））の処理液を、１ＭのＨＣｌを用いて２５℃にてｐＨ５．０に調整した後、３０分以内に熱処理を行わずに高圧分散装置ナノヴェイタにて物理的処理を入口圧１００ＭＰａの条件で行った。細胞の破砕率は１８．７％であった。また、破砕後の脂質回収率は６％であった。
（比較例３）
熱処理温度を２５℃とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は１６．１％であった。
（比較例４）
熱処理温度を２５℃とし、熱処理時間を２時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は１１．９％であった。
（比較例５）
熱処理温度を２５℃とし、熱処理時間を３時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は１３．２％であった。
（比較例６）
熱処理温度を２５℃とし、熱処理時間を１０時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は１８．５％であった。
（比較例７）
熱処理温度を２５℃とし、熱処理時間を２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は１６．１％であった。
（比較例８）
熱処理温度を８０℃とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は２１．８％であった。
（比較例９）
熱処理温度を８０℃とし、熱処理時間を２時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は１８．５％であった。
（比較例１０）
熱処理温度を８０℃とし、熱処理時間を３時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は２４．８％であった。
（比較例１１）
熱処理温度を８０℃とし、熱処理時間を１０時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は１８．５％であった。
（比較例１２）
熱処理温度を８０℃とし、熱処理時間を２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は２３．０％であった。
（比較例１３）
比較例２と同様にして破砕処理を行った後、５０℃で、２４時間の熱処理を行った。細胞の破砕率は１９．３％であった。
（実施例８）
熱処理温度を４０℃とし、熱処理時間を２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は４９．５％であった。また、破砕後の脂質回収率は３３％であった。
（実施例９）
熱処理温度を４５℃とし、熱処理時間を２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は９２．０％であった。また、破砕後の脂質回収率は７４％であった。
（実施例１０）
熱処理温度を５５℃とし、熱処理時間を２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は８１．２％であった。また、破砕後の脂質回収率は７３％であった。
（実施例１１）
熱処理温度を６０℃とし、熱処理時間を２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は７２．１％であった。また、破砕後の脂質回収率は５５％であった。
（比較例１４）
熱処理温度を４℃とし、熱処理時間を２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は１９．９％であった。
（比較例１５）
熱処理温度を３７℃とし、熱処理時間を２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は１９．０％であった。
（比較例１６）
熱処理温度を７０℃とし、熱処理時間を２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は２９．４％であった。
（比較例１７）
熱処理温度を８０℃とし、熱処理時間を２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は２３．０％であった。
参考例１〜２、実施例３〜７及び比較例１〜１３について、実施条件及び細胞の破砕率を表１及び表２にそれぞれ示す。実施例８〜１１及び比較例１４〜１７について、実施条件及び細胞の破砕率を表３にまとめて示す。
Figure 0006744222
Figure 0006744222
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（実施例１２）
１ＭのＨＣｌを用いて処理液のｐＨを２５℃にて４．０に調整し、熱処理時間を１０時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は４０．３％であった。
（実施例１３）
熱処理時間を２４時間とした以外は、実施例１２と同様にした。細胞の破砕率は６６．０％であった。
（実施例１４）
処理液のｐＨを２５℃にて６．８に調整し、熱処理時間を２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は５３．５％であった。
（実施例１５）
処理液のｐＨの調整をせず、２５℃におけるｐＨを７．３のままとし、熱処理時間を２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は５２．３％であった。
（実施例１６）
熱処理時間を４８時間とした以外は、実施例１５と同様にした。細胞の破砕率は６６．６％であった。
（実施例１７）
１ＭのＮａＯＨを用いて処理液のｐＨを２５℃にて９．０に調整し、熱処理時間を２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は４７．４％であった。
（比較例１８）
１ＭのＨＣｌで処理液のｐＨを２５℃にて２．０に調整し、熱処理時間を２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は２３．６％であった。
（比較例１９）
１ＭのＨＣｌで処理液のｐＨを２５℃にて３．０に調整し、熱処理時間２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は１６．０％であった。
（比較例２０）
１ＭのＮａＯＨで処理液のｐＨを２５℃にて１０．０に調整し、熱処理時間２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は２６．５％であった。
（比較例２１）
１ＭのＮａＯＨで処理液のｐＨを２５℃にて１２．０に調整し、熱処理時間２４時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は１８．６％であった。
実施例１２〜１７及び比較例１８〜２１について、実施条件及び細胞の破砕率を表４にまとめて示す。
Figure 0006744222
（実施例１８）
不等毛植物門に属する微細藻類としてナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）「冷蔵ナンノ ヤンマリンＫ−１」（クロレラ工業製、処理液を構成する液体：海水、藻体濃度：５０ｇ／Ｌ）を室温に戻して用いた。さらにこの処理液を人工海水（日本製薬株式会社製、海産微細藻類用ダイゴ人工海水SP）で希釈し、藻体濃度を１．０ｇ／Ｌとした。処理液の２５℃におけるｐＨは５．０であった。以上の処理液を用いて、熱処理時間を５時間とした以外は、参考例１と同様にした。細胞の破砕率は４７．４％であった。
（実施例１９）
熱処理時間を１０時間とした以外は、実施例１８と同様にした。細胞の破砕率は４９．４％であった。
（比較例２２）
ｐＨの調整をせず、熱処理を行わなかったこと以外は、実施例１８と同様にした。すなわちナンノクロロプシス・オキュラータ「冷蔵ナンノ ヤンマリンＫ−１」（藻体濃度：１．０ｇ／Ｌ）の処理液を、２５℃におけるｐＨを６．８としたまま、希釈後３０分以内に熱処理を行わずに高圧分散装置にて物理的処理を行った。細胞の破砕率は１９．６％であった。
（比較例２３）
熱処理温度を２５℃とし、熱処理時間を１０時間とした以外は、実施例１８と同様にした。細胞の破砕率は２２．７％であった。
実施例１８〜１９及び比較例２２〜２３について、実施条件及び細胞の破砕率を表５にまとめて示す。
Figure 0006744222
（実施例２０）
不等毛植物門に属する微細藻類としてナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）（処理液を構成する液体：人工海水（ダイゴ人工海水SP、日本製薬株式会社製、藻体濃度：１．０ｇ／Ｌ））を用いた。処理液のｐＨは７．３であった。この処理液に１ＭのＨＣｌを滴下し、処理液のｐＨを２５℃にて６．３に調整した後、硫酸アルミニウム（セントラル硝子株式会社社製、商品名「硫酸バンド」）を処理液に対し０．１％となるように添加して５分間撹拌した。その後、撹拌を停止し、室温で３時間静置した。この時藻体が凝集し、沈降した。その後、上清の一部を廃棄して藻体濃度を１５．２ｇ／Ｌとした。１ＭのＨＣｌを滴下し、処理液のｐＨを２５℃にて５．０に調整した。ｐＨを調整した溶液に対して熱処理を行った。処理温度は５０℃とし、処理時間は２４時間とした。熱処理後に、物理的処理を圧力式ホモジナイザーを用いて入口圧が１００ＭＰａの条件で行った。細胞の破砕率は７７．６％であった。
１００ 均質バルブ
１０１ 均質バルブシート
１０２ 均質バルブ本体
１０３ インパクトリング
１１０ チャンバ
１１１ 流入管路
１１２ せん断管路
１１３ 流出管路
１２０ チャンバ
１２１ 流入管路
１２２ せん断管路
１２３ 流出管路

Claims (15)

  1. 不等毛植物門に属する微細藻類に対し、ｐＨが３．５以上、９．５以下条件で４０℃以上、６５℃以下の温度で物理的処理における破砕効率を向上させる熱処理をした後、高圧分散装置を用いて物理的処理をし、
    前記熱処理は３時間以上行う、藻類の破砕方法。
  2. 前記微細藻類が、ナンノクロロプシス属である、請求項１に記載の藻類の破砕方法。
  3. 前記ナンノクロロプシス属が、Nannochloropsis oculata、Nannochloropsis salina及びNannochloropsis gaditanaからなる群から選ばれる１種以上である、請求項２に記載の藻類の破砕方法。
  4. 前記熱処理は、前記ｐＨが、５．０以上、７．５以下の条件で行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の藻類の破砕方法。
  5. 前記熱処理は１０時間以上行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の藻類の破砕方法。
  6. 前記熱処理は２０時間以上行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の藻類の破砕方法。
  7. 前記熱処理は４５℃以上、６０℃以下の温度で行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の藻類の破砕方法。
  8. 前記熱処理は４５℃以上、５５℃以下の温度で行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の藻類の破砕方法。
  9. 前記熱処理は、ｐＨが５．０以上、７．５以下の条件で、温度が４５℃以上、６０℃以下で、時間を１０時間以上行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の藻類の破砕方法。
  10. 前記熱処理は、細胞壁を分解する酵素の意図的な添加なしに行う、請求項１〜９のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。
  11. 前記高圧分散装置が、均質バルブ式の高圧分散装置又はチャンバ式の高圧分散装置である、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。
  12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載された藻類の破砕方法により得られた藻類の破砕物から脂質を回収する処理を行う、藻類から脂質を抽出する方法。
  13. 前記脂質を回収する処理は、溶媒抽出、遠心分離、静置処理、及びカラムクロマトグラフィーから選ばれた１種又は２種以上の組み合わせである、請求項１２に記載の藻類から脂質を抽出する方法。
  14. 前記脂質を回収する処理における、溶媒抽出に用いる溶媒が、非極性溶媒である、請求項１３に記載の藻類から脂質を抽出する方法。
  15. 前記脂質を回収する処理における、溶媒抽出の温度が、１０℃以上、６０℃以下である、請求項１３又は１４に記載の藻類から脂質を抽出する方法。
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