JP2017029052A - 藻類の破砕方法 - Google Patents

Abstract

【課題】不等毛植物門に属する微細藻類を効率良く破砕できるようにする。【解決手段】藻類の破砕方法は、不等毛植物門に属する微細藻類に対して、グリセリンを含む処理液中に前記微細藻類を保持するグリセリン処理をした後、高圧分散装置を用いて物理的処理をする。【選択図】なし

Description

本開示は、藻類の粉砕方法に関する。

近年、地球温暖化を始めとする環境問題に対する意識や関心が高まっている。このため、二酸化炭素の排出量を低減することや、二酸化炭素の固定化により大気中の二酸化炭素濃度を低減することについて様々な検討が行われている。例えば、化石燃料に代えてカーボンニュートラルな資源であるバイオマスをエネルギー源として利用する試みが活発になされている。

藻類は、脂質を産生することが知られている。藻類が産生した脂質を効率良く抽出することができれば、化石燃料に代わるエネルギー源となり得る。エネルギー源以外にも種々の製品の原材料となり得る。しかし、藻類から脂質を抽出するには、細胞壁が大きな障害となる。一般に藻類の細胞壁は、硬く且つ柔軟性を有するため、容易に破砕することができない。

藻類の細胞壁を破砕して脂質を抽出するために、例えば、特許文献１においては、緑藻植物門に属するイカダモの細胞壁をホモジナイザ等を用いて破砕することを試みている。
特開２０１１−６８７４１号公報

しかし、特許文献１は、イカダモについて記載されているのみであり、他の藻類に関しては何ら検討されていない。

本開示の課題は、不等毛植物門に属する微細藻類を効率良く破砕できるようにすることである。

藻類の破砕方法の一態様は、不等毛植物門に属する微細藻類に対して、グリセリンを含む処理液中に前記微細藻類を保持するグリセリン処理をした後、高圧分散装置を用いて物理的処理をする。

本開示の藻類の破砕方法によれば、不等毛植物門に属する微細藻類を効率良く破砕できる。

高圧分散装置の均質バルブの一例を示す断面図である。 高圧分散装置のチャンバの一例を示す斜視図である。 高圧分散装置のチャンバの一例を示す斜視図である。

＜不等毛植物門に属する微細藻類＞
本開示において、不等毛植物門に属する微細藻類とは、微細藻類のうち、不等毛植物門に属するものをいう。微細藻類とは、酸素を発生する光合成を行う生物の中からコケ植物、シダ植物、及び種子植物を除いた残りのうちの、細胞サイズが直径約１μｍ〜１００μｍのものをいう。なお、細胞サイズは、光学顕微鏡を用いて観察倍率４００倍で測定した細胞の長軸径である。不等毛植物門に属する微細藻類の具体例としてはBacillariophyceae綱、及びEustigmatophyceae綱等が挙げられる。Bacillariophyceae綱の微細藻類の具体例としては、Chaetoceros属、Nitzschia属、及びSkeletonema属等が挙げられる。Eustigmatophyceae綱の微細藻類の具体例としては、Nannochloropsis（ナンノクロロプシス）属が挙げられる。このうち、脂質の生産性及び脂質の回収性の観点から、Eustigmatophyceae綱の微細藻類が好ましく、中でもNannochloropsis属がより好ましい。Nannochloropsis属の藻類としてはNannochloropsis oculata、Nannochloropsis salina、及びNannochloropsis gaditanaなどが例示される。微細藻類は、沼や池等に生息するものを採取したものでも、培養したものでもよく、更には商業的に入手したものでもよい。

＜破砕方法＞
本実施形態の藻類の破砕方法は、藻類を破砕して藻類の破砕物を得る。具体的に、不等毛植物門に属する微細藻類に対して、グリセリン処理をした後、高圧分散装置を用いて物理的処理をする。

物理的処理よりも前に、不等毛植物門に属する微細藻類に対して、酵素による酵素処理をすることもできる。この場合の酵素には、例えばヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ及びラミナリナーゼから選ばれた１種以上を用いることができる。

本実施形態の破砕方法は、採取又は培養等により得られた、藻類が分散媒中に分散した分散液をそのまま処理液として行うことができる。また、処理液中に含まれる微細藻類の濃度（以下、藻体濃度ともいう。）を調整するための希釈又は濃縮等の操作を行ってから破砕することもできる。更に、分散媒の置換又は添加物の添加等の処理を行ってもよい。藻類を培養した後、常温若しくは低温において溶液状態で保存したり、凍結保存したりすることもできる。

本実施形態の破砕方法において処理液の藻体濃度は、特に限定されない。生産性を向上させる観点、藻類を効率良く破砕する観点及び脂質を効率良く回収する観点からは、０．５ｇ／Ｌ以上が好ましく、０．８ｇ／Ｌ以上がより好ましく、５ｇ／Ｌ以上が更に好ましく、３０ｇ／Ｌ以上がより更に好ましい。また、藻類を効率良く破砕する観点、脂質を効率良く回収する観点及び処理液の流動性の観点から、２００ｇ／Ｌ以下が好ましく、１５０ｇ／Ｌ以下がより好ましく、１００ｇ／Ｌ以下が更に好ましく、８０ｇ／Ｌ以下がより更に好ましく、６０ｇ／Ｌ以下がより更に好ましい。グリセリン処理と物理的処理とをそれぞれ異なる濃度で行ってもよい。濃度の調整方法は特に限定されない。濃縮方法としては例えばろ過、圧搾、遠心分離、重力沈降、凝集沈降、加圧浮上又は分散媒の蒸発等の方法が挙げられる。上記の方法を組み合わせて多段階の濃縮を行ってもよい。希釈方法としては例えば水等の液体を添加する方法が挙げられる。なお、処理液中の微細藻類の濃度は、実施例に記載された方法により測定された値である。

−グリセリン処理−
グリセリン処理は、不等毛植物門に属する微細藻類を、グリセリンを含む処理液中に保持することにより行うことができる。グリセリン処理の回数は１回とすることができるが、２回以上行うこともできる。

処理液のグリセリン濃度は、処理液に含まれる微細藻類の乾燥質量に対して、微細藻類を効率良く破砕する観点から、好ましくは０．０１質量％以上であり、より好ましくは０．１質量％以上であり、更に好ましくは０．５質量％以上であり、より更に好ましくは１質量％以上であり、より更に好ましくは３質量％以上である。また、微細藻類を効率良く破砕する観点及び経済性の観点から、好ましくは１５００質量％以下であり、より好ましくは５００質量％以下であり、更に好ましくは１００質量％以下であり、より更に好ましくは２０質量％以下である。

グリセリン処理の処理時間は、微細藻類を効率良く破砕する観点から、好ましくは０．５時間以上であり、より好ましくは８時間以上であり、更に好ましくは１２時間以上であり、より更に好ましくは２０時間以上である。また、生産性の観点から、好ましくは４８時間以下であり、より好ましくは３６時間以下であり、更に好ましくは３０時間以下である。

グリセリン処理の温度は、経済性の観点から、好ましくは１０℃以上であり、より好ましくは１５℃以上であり、更に好ましくは２０℃以上であり、また、好ましくは５０℃以下であり、より好ましくは４５℃以下であり、更に好ましくは４０℃以下である。グリセリン処理の間を通じて一定の温度とすることができるが、処理の間に温度が変化してもよい。例えば、屋外で微細藻類を培養する場合、特に温度を制御せずに外気温下においてグリセリン処理することができる。

グリセリン処理を行う際の処理液のｐＨは特に限定されず、例えば微細藻類の培養液等のｐＨを調整することなくそのまま処理することができる。但し、グリセリン処理の効果は、グリセリンと微細藻類の細胞壁との何らかの化学反応によるものであると考えられるため、化学反応を効率良く進めるという観点から、好ましくは３．０以上であり、より好ましくは３．５以上あり、更に好ましくは４．０以上であり、より更に好ましくは４．５以上であり、また、好ましくは９．０以下であり、より好ましくは８．５以下であり、更に好ましくは８．０以下であり、より更に好ましくは７．５以下である。後に示す酵素処理の際のｐＨとグリセリン処理の際のｐＨとを合わせることもできる。ｐＨは、JIS Z8802に従った測定方法により、処理液の温度を２５℃として測定することにより求めることができる。

グリセリン処理をする際の処理液の分散媒は、特に限定されないが、経済性の観点から水が好ましい。水は精製されていても、不純物を含んでいてもよい。また、海水であってもよい。処理液が、塩化ナトリウム等の塩、窒素若しくはリンを含む化合物、微量金属、無機系凝集剤、有機系凝集剤、キレート剤、及び緩衝剤等の添加物のいずれか１つ又は２つ以上を含んでいてもよい。水を主成分とする培養液により微細藻類を培養した場合には、微細藻類の培養液をそのまま又は希釈等をしてグリセリン処理することができる。培養液又はその希釈液を処理液とする場合には、処理液が通常の培養液に含まれる種々の成分を含んでいてかまわない。培養液を希釈する場合には、水又は所定の添加物を含む水溶液を用いることができる。また、培養液を水又は所定の添加物を含む水溶液に置換してからグリセリン処理してもよい。

−物理的処理−
物理的処理は、高圧分散装置により行うことができる。高圧分散装置は、基本的に、固体粒子や液滴粒子等の分散質を含む処理液を加圧した状態で狭い流路を通過させ、その後急激に減圧することで処理液中の固体粒子や液滴粒子等の分散質を更に分散又は粉砕する装置である。高圧分散装置は、工業化において大量処理が可能であるという観点からも好ましい。

処理液の加圧には高圧ポンプを用いることができる。処理液を通過させる狭い隙間を有する流路は、所定の圧力等を加えることができればどのような構造としてもよい。必要とする圧力等によって隙間の幅等の値は適宜変えればよいが、例えば、流路を直径が１μｍ〜２０００μｍ程度の直管とすることができる。また、１μｍ〜２０００μｍ程度の穴を有するオリフィスが直管の流路の途中に配置されている構造としてもよい。１μｍ〜２０００μｍ程度の隙間を有するスリットが直管の流路の途中に配置されている構造とすることもできる。また、バルブの先端とバルブ受けの隙間に流路を形成させ、バルブの開度を調整することで、隙間の間隔を１μｍ〜２０００μｍ程度としてもよい。更に、１μｍ〜２０００μｍ程度の隙間の流路を対向させて配置し、処理液同士を衝突させてもよい。流路の方向を例えば直角に曲げるなど急激に変化させて、流路の壁面に処理液を衝突させてもよい。

このような処理を行う装置として種々の構成のものを用いることができるが、微細藻類を効率良く破砕する観点から、例えば均質バルブを有する均質バルブ式の高圧分散装置及びチャンバを有するチャンバ式の高圧分散装置等を用いることが好ましい。中でも、少量処理が可能である観点からチャンバ式の高圧分散装置が好ましく、工業化においては大量処理が可能である観点から均質バルブ式の高圧分散装置が好ましい。図１には均質バルブ１００の一例を示す。均質バルブ１００は、吐出孔が形成された均質バルブシート（バルブ受け）１０１と、均質バルブシート１０１の吐出口と対向する位置に配置された均質バルブ本体１０２と、均質バルブ本体１０２を囲むインパクトリング１０３とを有する。均質バルブシート１０１、均質バルブ本体１０２及びインパクトリング１０３が形成する間隙を通過する際に処理液には大きな圧力が加わり、間隙を通過した後は急激に減圧される。吐出孔から吐出された処理液中の分散質は、均質バルブ本体１０２及びインパクトリング１０３に衝突する。間隙を通過する際のせん断応力、衝突による衝撃力、及び間隙を通過した後の圧力降下によるキャビテーションにより、分散質が粉砕される。

均質バルブシート１０１、均質バルブ本体１０２及びインパクトリング１０３が形成する間隙の大きさを変化させることにより分散質に加わる剪断力を調整できる。均質バルブシート１０１と均質バルブ本体１０２とが互いに対向する面は、平滑面とすることができる。また、流路を長くし、分散質に十分に強い剪断力を与えることを目的として、流路となる壁面に凹凸を形成することもできる。また、インパクトリング１０３が設けられていない構成とすることもできる。

また、物理的処理にはチャンバ式の高圧分散装置を用いることもできる。チャンバ式の高圧分散装置は、処理液を互いに衝突させる又は壁面等と衝突させる形式ものと、衝突させない形式ものとがある。

処理液同士を衝突させる形式のチャンバ式高圧分散装置は、例えば図２に示すようなチャンバ１１０を有している。チャンバ１１０は、複数の処理液の流入管路１１１と、流入管路１１１と同数のせん断管路１１２と、単一の流出管路１１３とが順次連結され、複数のせん断管路１１２の流出管路１１３に近い方の端が１カ所で接続されており、接続箇所において処理液同士を衝突させる。流入管路１１１及び流出管路１１３よりも細いせん断管路１１２におけるせん断応力、処理液同士の衝突による衝撃力、及び流出管路１１３における圧力降下によるキャビテーションにより、分散質が粉砕される。

処理液と壁面とを衝突させる形式のチャンバ式高圧分散装置は、例えば図３に示すようなチャンバ１２０を有している。チャンバ１２０は、各々単一の、液体の流入管路１２１と、せん断管路１２２と、流出管路１２３とが順次連結されている。せん断管路１２２と流出管路１２３とのなす角度は直角となっており、せん断管路１２２の液体流を流出管路１２３の内壁に衝突させる。せん断管路１２２におけるせん断応力、処理液と壁面との衝突による衝撃力、及び流出管路１２３における圧力降下によるキャビテーションにより、分散質が粉砕される。

処理液を衝突させない形式のチャンバ式高圧分散装置は、例えば流路中に狭いせん断管路が設けられており、せん断管路におけるせん断応力と、拡がった流出管路における圧力降下によるキャビテーションにより、分散質が粉砕される。

これらの形式の高圧分散装置に限らず、他の形式の高圧分散装置を用いることもできる。

いずれの形式の高圧分散装置についても、微細藻類の物理的処理に用いる場合には、処理液に加える圧力（入口圧）は、藻類を効率良く破砕する観点から、ゲージ圧で１０ＭＰａ以上、好ましくは３０ＭＰａ以上、より好ましくは５０ＭＰａ以上、更に好ましくは８０ＭＰａ以上であり、経済性の観点から、好ましくは２００ＭＰａ以下、より好ましくは１５０ＭＰａ以下、更に好ましくは１２０ＭＰａ以下である。藻類を効率良く破砕する観点及び経済性の観点から、減圧後の圧力（出口圧）は大気圧（絶対圧で０．１ＭＰａ）とすることができる。流路の構造等により完全に大気圧まで減圧されなくてもよく、出口圧は絶対圧で、好ましくは０．３ＭＰａ以下、より好ましくは０．２ＭＰａ以下、更に好ましくは０．１５ＭＰａ以下、より更に好ましくは０．１１ＭＰａ以下である。

均質バルブ式の高圧分散装置の具体例としては、圧力式ホモジナイザー（株式会社エスエムテー）、高圧ホモゲナイザー（株式会社イズミフードマシナリ）、及びミニラボ８．３Ｈ型（Rannie社）等が挙げられる。チャンバ式の高圧分散装置の例としては、マイクロフルイダイザー（Microfluidics社）、ナノヴェイタ（エス・ジーエンジニアリング株式会社、吉田機械興業株式会社）、スターバースト（スギノマシン株式会社）、アルティマイザー（スギノマシン株式会社）、ジーナスＰＹ（白水化学株式会社）、及びＤｅＢＥＥ２０００（日本ビーイーイー株式会社）等が挙げられる。これらのうち、少量処理が可能である観点からナノヴェイタが好ましく、工業化においては大量処理が可能である観点から圧力式ホモジナイザーが好ましい。

グリセリン処理の後、他の処理を行うことなく物理的処理を行うことができる。物理的処理の際に処理液がグリセリンを含んでいても、物理的処理を行うことができる。グリセリン処理の後すぐに物理的処理を行うことができるが、グリセリン処理の後、処理液を一旦保存してから物理的処理を行うこともできる。処理液を保存する場合、保存温度は、必要とするエネルギーを低減する観点から２０℃前後程度の常温とすることができる。処理液は、凍結保存することもできる。グリセリン処理の後、物理的処理の前に処理液の濃縮、希釈又は分散媒の置換、処理液のｐＨ調整等の操作を行うこともできる。

物理的処理の回数は１回とすることができるが、２回以上行うこともできる。また、グリセリン処理と物理的処理とのサイクルを複数回繰り返すようにすることもできる。

グリセリン処理の後に物理的処理を行うことにより不等毛植物門に属する微細藻類を効率良く破砕することができる。不等毛植物門に属する微細藻類である場合には、先に示したようなグリセリン処理と物理的処理との組み合わせとすることにより、物理的処理単独の場合よりも破砕効率を大きく向上させることができる。本実施形態の破砕方法においては、グリセリン処理に要するエネルギーは小さく、費用も非常に低く抑えられる。このため、物理的処理単独の場合と比べて、単純に破砕率が向上するだけでなく、必要とするエネルギーや費用を考慮した実質的な効率についても大きく向上する。また、グリセリン処理が数十時間〜数日間に及んだとしても、大きなエネルギーは必要とせず、グリセリン処理費用も低く抑えられる。また、サイクルタイムについても許容の範囲内であり、実質的な破砕率の向上効果が十分に得られる。

−酵素処理−
微細藻類を更に効率良く破砕するために、物理的処理よりも前に、酵素処理を行うことができる。酵素処理は、グリセリン処理の際に添加されたグリセリンの影響を避けることができるため、グリセリン処理の前に行うことが好ましい。但し、グリセリン処理と物理的処理との間に行うことも、グリセリン処理の前後両方で行うこともできる。酵素処理の後にグリセリン処理を行う場合、処理液が酵素を含んだ状態でグリセリン処理を行うことができる。また、溶媒の置換等を行い、酵素が除去された状態でグリセリン処理を行うこともできる。酵素処理の回数は１回とすることができるが、２回以上行うこともできる。酵素処理を２回以上行う場合、それぞれ異なる種類の酵素により処理を行うこともできる。酵素処理とグリセリン処理とのサイクルを複数回繰り返すこともできる。また、酵素処理とグリセリン処理と物理的処理とのサイクルを複数回繰り返すこともできる。

酵素処理に用いる酵素は、微細藻類を効率良く破砕する観点から、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ及びラミナリナーゼから選択された１種以上とすることが好ましい。

ヘミセルラーゼは、ヘミセルロースを分解する酵素を総称する。例えば、「セルラーゼ」第１刷（村尾 沢夫著）に記載されているように、ヘミセルロースとは、陸上植物の細胞壁を構成するセルロース、及びペクチン以外の多糖である。主なヘミセルロースの例として、キシラン、及びガラクトマンナン等が挙げられる。前者を分解する酵素の総称として、キシラナーゼと表記され、後者を分解する酵素の総称として、マンナナーゼと表記される。すなわち、ヘミセルラーゼは、キシラナーゼとマンナナーゼとを包括する。市販のヘミセルラーゼの例として、アスベルギルスニゲル（Aspergillus niger）由来のヘミセルラーゼである「Ｈ２１２５」（Sigma-Aldrich社製）が挙げられる。また、市販のマンナナーゼの例としては、セルロシンＧＭ５（HBI社製）、マンナナーゼＢＧＭ「アマノ」１０（天野エンザイム社製）、及びスミチームＡＣＨ（新日本化学工業社製）等が挙げられる。また、市販のキシラナーゼの例として、セルロシンＴＰ２５（HBI社製）、及びスミチームＸ（新日本化学工業社製）等が挙げられる。

セルラーゼは、セルロース中のβ-1,4-グルコシド結合を加水分解する酵素を総称する。セルロースは、グルコースのみがβ-1,4結合した多糖である。市販のセルラーゼの例としては、セルラーゼオノズカ Ｒ-１０（ヤクルト薬品工業社製）、及びセルラーゼＡ「アマノ」３（天野エンザイム社製）等が挙げられる。

ペクチナーゼは、ペクチン質の分解に関係する酵素類を意味する。ペクチン質は、ガラクチュロン酸がα-1,4のグルコシド結合で鎖状に重合したオリゴガラクチュロン酸、ポリガラクチュロン酸及びそれらのメチルエステル等からなっている。ペクチナーゼは、ポリガラクチュロナーゼ、ペクチンリアーゼ、及びペクチンエステラーゼの３種に大別される。市販のペクチナーゼ製剤は、いずれも、これらの酵素類の複数を含む酵素組成からなる。市販のペクチナーゼ製剤の例としては、セルロシンＰＥ６０（HBI社製）、Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ Ｒ-１０（ヤクルト薬品工業社製）、及びペクチネックスウルトラ（Novozymes社製）等が挙げられる。

ラミナリナーゼは、β-D-グルカン中のβ-1,3-のグルコシド結合の還元基側に隣接するβ-1,3又はβ-1,4-グルコシド結合,ラミナリン,(1,3;1,4)-β-Dグルカンを加水分解する酵素である。ラミナリナーゼの例として、Trichoderma sp.由来のラミナリナーゼである「Ｌ５２７２」（Sigma-Aldrich社製）、及びLaminarinase, from Trichoderma sp.（和光純薬工業社製）等が挙げられる。

ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ及びラミナリナーゼの中でも破砕効率の観点から、好ましくはヘミセルラーゼ、又はセルラーゼであり、より好ましくはヘミセルラーゼである。これらの酵素は、単独で使用することができる。また、複数種類を組み合わせて用いてもよい。また、酵素以外の細胞壁分解物質含んでいてもよい。酵素以外の細胞壁分解物質としては、例えば、塩、アルカリ、界面活性剤及び洗剤等が挙げられる。これらの細胞壁分解物質は複数組み合わせて用いてもよい。

酵素処理は、所定濃度に調製した酵素溶液を、微細藻類を含む処理液に添加することにより行うことができる。また、所定濃度に調製した酵素溶液に微細藻類を分散させてもよい。微細藻類を含む処理液に乾燥状態の酵素を加えて溶解させることも可能である。

酵素処理の条件は、使用する酵素が作用する条件とすればよい。例えば、処理液のｐＨは、酵素活性の観点から、好ましくは３．０以上であり、より好ましくは３．５以上であり、更に好ましくは４．０以上であり、より更に好ましくは４．５以上であり、また、好ましくは８．０以下であり、より好ましくは７．０以下であり、更に好ましくは６．５以下である。ｐＨは、JIS Z8802に従った測定方法により、処理液の温度を２５℃として測定することにより求めることができる。

酵素処理の温度は、酵素活性の観点から、好ましくは２０℃以上であり、より好ましくは２５℃以上であり、更に好ましくは３０℃以上であり、また、好ましくは６０℃以下であり、より好ましくは５０℃以下であり、更に好ましくは４５℃以下であり、より更に好ましくは４０℃以下である。

酵素濃度は、使用する酵素及び必要とする処理効率等に応じて適切な濃度とすればよい。例えば、分散液中に含まれる微細藻類の乾燥質量に対して、藻類の破砕性及び処理効率の観点から、好ましくは０．００１質量％以上であり、より好ましくは０．０１質量％以上であり、更に好ましくは０．０５質量％以上であり、より更に好ましくは０．１質量％以上であり、より更に好ましくは０．５質量％以上である。また、藻類の破砕性及び経済性の観点から、好ましくは１００質量％以下であり、より好ましくは１０質量％以下であり、更に好ましくは５質量％以下であり、更に好ましくは１質量％以下である。

酵素処理の処理時間は、処理効率の観点から、好ましくは０．５時間以上であり、より好ましくは８時間以上であり、更に好ましくは１２時間以上であり、より更に好ましくは２０時間以上である。生産性の観点から、好ましくは４８時間以下であり、より好ましくは３６時間以下であり、更に好ましくは３０時間以下である。

物理的処理よりも前に、酵素処理を行うことにより、グリセリン処理単独の場合よりも更に効率良く微細藻類の破砕を行うことができる。

＜微細藻類からの脂質の回収＞
以上説明した本実施形態の藻類の破砕方法により得られた藻類の破砕物に対して脂質の回収処理を行うことにより藻類から脂質を回収することができる。破砕率が高いほど、微細藻類の分散液からの脂質の回収率が向上する。従って、微細藻類を効率良く破砕できる本実施形態の破砕方法により、不等毛植物門に属する微細藻類を破砕してから脂質を回収することにより、脂質の回収率を大きく向上することができる。また、微細藻類の破砕率を高くすることにより、回収に用いる溶媒の量を低減できたり、回収に必要とするエネルギーや費用を低減できたりするという利点も得られる。

−脂質−
本開示において、脂質には、単純脂質、複合脂質及び誘導脂質が含まれる。単純脂質には、油脂又は脂肪酸エステルなどの脂肪酸と各種アルコールとのエステル等が含まれる。複合脂質には、脂肪酸、アルコール及びリン酸を含むリン脂質、並びに脂肪酸、アルコール及び糖を含む糖脂質等が含まれる。誘導脂質には、単純脂質又は複合脂質の加水分解生成物であり、水に不溶性の脂肪酸、高級アルコール、ステロール、テルペン、及び脂溶性ビタミン等が含まれる。脂質の回収性の観点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がより好ましく、油脂が更に好ましい。

−油脂−
油脂とは、脂肪酸とグリセリンとのエステルを意味し、具体的には、モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリドのような中性脂質をいう。油脂を構成する脂肪酸は、単一でなくてよい。

−脂肪酸−
脂肪酸は、炭素数が２〜４の短鎖脂肪酸、炭素数が５〜１２の中鎖脂肪酸、及び炭素数が１３以上の長鎖脂肪酸のいずれであってもよい。また、飽和脂肪酸でも不飽和脂肪酸でもよい。飽和脂肪酸の具体例としては、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、及びイコサン酸が挙げられる。一価の不飽和脂肪酸の具体例としては、９−ヘキサデセン酸、及び９−オクタデセン酸等が挙げられる。多価の不飽和脂肪酸の具体例としては、９，１２−オクタデカジエン酸、６，９，１２−オクタデカトリエン酸、５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸、９，１２，１５−オクタデカトリエン酸、５，８，１１，１４，１７−イコサペンタエン酸、及び４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸が挙げられる。

−脂肪酸エステル−
脂肪酸エステルとは、油脂以外の、脂肪酸とアルコールとのエステルであり、長鎖脂肪酸と１価又は２価の高級アルコールとのエステルである蝋や、中鎖脂肪酸と低級又は高級アルコールとのエステルである中鎖脂肪酸エステル等を含む。

−脂質の回収処理−
脂質の回収処理は、微細藻類の破砕物を含む分散液から脂質を分取することができれば特に限定されない。例えば、脂質の回収処理として溶媒抽出、遠心分離、静置処理、及びカラムクロマトグラフィー等から選ばれた１種又は２種以上の組み合わせを用いることができる。中でも、脂質の回収性の観点から、溶媒抽出、遠心分離及び静置処理から選ばれる１種又は２種以上の組み合わせが好ましく、中でも溶媒抽出と遠心分離との組み合わせ、又は溶媒抽出と静置処理との組み合わせが好ましい。

溶媒抽出は、微細藻類を破砕して得た破砕物を含む分散液に抽出用の溶媒を添加して混合すればよい。溶媒を添加した後、攪拌を行ってもよい。微細藻類から溶出した脂質は、溶媒に溶解するため、溶媒相と水相とを相分離させて、溶媒相を回収することにより、脂質を回収することができる。

溶媒抽出に用いる溶媒は、適宜選択することができ、例えば、特開２０１５−１２４２３９号公報に記載の溶媒等を用いることができる。また、超臨界二酸化炭素等を用いた超臨界抽出を用いることもできる。更に、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、又は亜臨界抽出等を用いることもできる。例えば、「生物化学実験法２４ 植物脂質代謝実験法」（山田晃弘 編著、株式会社学会出版センター、ｐ３−４）に記載の方法を参考にすることができる。

溶媒抽出の温度は特に限定されないが、脂質の回収性の観点から、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上である。また、上記観点及び溶媒を加温する等の経済性の観点から、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下、さらにより好ましくは４０℃以下である。

また、溶媒抽出の回数は１回でもよく、２回以上行ってもよい。溶媒抽出を２回以上行う場合は、同じ溶媒により行っても、異なる溶媒により行ってもよい。

遠心分離は、分離板型、円筒型、又はデカンター型等の一般的な機器を使用することができる。この場合の遠心力は、脂質の回収性の観点から、好ましくは５００Ｇ以上、より好ましくは１０００Ｇ以上とすることができる。また、経済性の観点から、好ましくは１００００Ｇ以下、より好ましくは５０００Ｇ以下、更に好ましくは２０００Ｇ以下とすることができる。

遠心分離の処理時間は、脂質の回収性の観点から、好ましくは１分以上、より好ましくは５分以上、更に好ましくは１０分以上とすることができる。また、経済性の観点から、好ましくは８０分以下、より好ましくは４０分以下、更に好ましくは２０分以下とすることができる。

遠心分離の際の温度は特に限定されないが、脂質の回収性及び経済性の観点から、好ましくは１０℃以上、より好ましくは１５℃以上であり、好ましくは５０℃以下、より好ましくは４０℃以下である。

溶媒抽出と遠心分離とを組み合わせる場合には、溶媒相と水相との分離を遠心分離により迅速に行うことができる。

静置処理は、脂質と水相とが相分離するまで処理液を静止状態に置けばよい。溶媒抽出と組み合わせる場合には、溶媒相と水相とが相分離するまで静止状態とすればよい。

本開示の藻類から脂質を回収する方法によれば、このような簡便な操作により、体内に脂質を蓄積した微細藻類から高い回収率で脂質を回収することができる。

微細藻類から回収された脂質は、直接又は精製処理若しくは分解処理等を行ってバイオディーゼル燃料等のバイオ燃料として用いることができる。また、機能性食品、医薬品、化成品、及び化粧品等の原料として用いることができる。

破砕した微細藻類から脂質を回収する方法について説明したが、糖質及び蛋白質等の脂質以外の生成物を回収して利用することもできる。これらの回収について既知の方法を用いることができる。

上述した実施の形態に関し、本開示は更に以下の藻類を破砕する方法及び藻類から脂質を回収する方法を開示する。

＜１＞
不等毛植物門に属する微細藻類に対して、グリセリンを含む処理液中に前記微細藻類を保持するグリセリン処理をした後、高圧分散装置を用いて物理的処理をする、藻類の破砕方法。

＜２＞
前記微細藻類が、ナンノクロロプシス属である、＜１＞に記載の藻類の破砕方法。

＜３＞
前記グリセリン処理の処理時間は、好ましくは０．５時間以上、より好ましくは８時間以上、更に好ましくは１２時間以上、より更に好ましくは２０時間以上であり、好ましくは４８時間以下、より好ましくは３６時間以下、更に好ましくは３０時間以下である、＜１＞又は＜２＞に記載の藻類の破砕方法。

＜４＞
前記処理液のグリセリン濃度は、前記処理液に含まれる前記微細藻類の乾燥質量に対し、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、更に好ましくは０．５質量％以上、より更に好ましくは１質量％以上、より更に好ましくは３質量％以上であり、好ましくは１５００質量％以下、より好ましくは５００質量％以下、更に好ましくは１００質量％以下、より更に好ましくは２０質量％以下である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。

＜５＞
前記物理的処理の圧力は、ゲージ圧で好ましくは１０ＭＰａ以上、より好ましくは３０ＭＰａ以上、更に好ましくは５０ＭＰａ以上、より更に好ましくは８０ＭＰａ以上であり、好ましくは２００ＭＰａ以下、より好ましくは１５０ＭＰａ以下、更に好ましくは１２０ＭＰａ以下の圧力を加えた後、絶対圧で、好ましくは０．３ＭＰａ以下、より好ましくは０．２ＭＰａ以下、更に好ましくは０．１５ＭＰａ以下、より更に好ましくは０．１１ＭＰａ以下、より更に好ましくは大気圧（０．１ＭＰａ）である、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。

＜６＞
前記物理的処理よりも前に、酵素処理を行う、＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。

＜７＞
前記酵素処理は、前記グリセリン処理よりも前に行う、＜６＞に記載の藻類の破砕方法。

＜８＞
前記酵素処理は、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ及びラミナリナーゼから選ばれた１種以上の酵素により行う、＜６＞又は＜７＞に記載の藻類の破砕方法。

＜９＞
前記酵素処理におけるｐＨは、好ましくは３．０以上、より好ましくは３．５以上、更に好ましくは４．０以上、より更に好ましくは４．５以上であり、好ましくは８．０以下、より好ましくは７．０以下、更に好ましくは６．５以下である、、＜６＞〜＜８＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。

＜１０＞
前記酵素処理の温度は、好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上、更に好ましくは３０℃以上であり、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下であり、更に好ましくは４５℃以下であり、より更に好ましくは４０℃以下である、＜６＞〜＜９＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。

＜１１＞
前記酵素処理における酵素濃度は、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０５質量％以上、より更に好ましくは０．１質量％以上であり、より更に好ましくは０．５質量％以上であり、好ましくは１００質量％以下、より好ましくは１０質量％以下、更に好ましくは５質量％以下、更に好ましくは１質量％以下である、＜６＞〜＜１０＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。

＜１２＞
前記酵素処理の処理時間は、好ましくは０．５時間以上、より好ましくは８時間以上、更に好ましくは１２時間以上、より更に好ましくは２０時間以上であり、好ましくは４８時間以下、より好ましくは３６時間以下、更に好ましくは３０時間以下である、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。

＜１３＞
前記グリセリン処理の温度は、好ましくは１０℃以上、より好ましくは１５℃以上、更に好ましくは２０℃以上であり、好ましくは５０℃以下、より好ましくは４５℃以下、更に好ましくは４０℃以下である、＜１＞〜＜１２＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。

＜１４＞
前記グリセリン処理における藻体濃度は、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．８ｇ／Ｌ以上、更に好ましくは５ｇ／Ｌ以上、より更に好ましくは３０ｇ／Ｌ以上であり、好ましくは２００ｇ／Ｌ以下、より好ましくは１５０ｇ／Ｌ以下、更に好ましくは１００ｇ／Ｌ以下、より更に好ましくは８０ｇ／Ｌ以下、より更に好ましくは６０ｇ／Ｌ以下である、＜１＞〜＜１３＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。

＜１５＞
前記グリセリン処理におけるｐＨは、好ましくは３．０以上、より好ましくは３．５以上、更に好ましくは４．０以上、より更に好ましくは４．５以上であり、好ましくは９．０以下、より好ましくは８．５以下、更に好ましくは８．０以下、より更に好ましくは７．５以下である、、＜１＞〜＜１４＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。

＜１６＞
高圧分散装置が、均質バルブ式の高圧分散装置又はチャンバ式の高圧分散装置である、＜１＞〜＜１５＞のいずれか１つに記載の藻類の破砕方法。

＜１７＞
＜１＞〜＜１６＞のいずれか１つに記載された藻類の破砕方法により得られた藻類の破砕物に対して脂質の回収処理を行い、藻類から脂質を回収する方法。

＜１８＞
前記脂質の回収処理が、溶媒抽出、遠心分離、静置処理、及びカラムクロマトグラフィーから選ばれた１種又は２種以上の組み合わせであり、好ましくは溶媒抽出、遠心分離及び静置処理から選ばれる１種又は２種以上の組み合わせであり、より好ましくは溶媒抽出と遠心分離との組み合わせ、又は溶媒抽出と静置処理との組み合わせである、前記＜１７＞に記載の藻類から脂質を回収する方法。

本開示について実施例を用いて更に詳細に説明する。以下の実施例は例示であり、本発明を限定するものではない。

＜使用藻体＞
沖縄県石垣島近郊の沿岸から藻体含む海水サンプルを取得した。取得した海水サンプルをフィルタによって濃縮し、マイクロピペットにより一つの藻体株を単離した。この単離した藻体は、培養液（ダイゴＩＭＫ培地、和光純薬工業社製）によって培養を行い、更に培養液（ｆ／２培地）を用いて藻体を増殖させた。この藻体の一部をテキサス大学（UTEX Culture Collection）に分析を依頼し、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）であることが同定された。

また、ナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）「ヤンマリンＫ−１」（クロレラ工業製、分散液を構成する液体：海水、藻体濃度：５０ｇ／Ｌ）を入手し、実験に用いた。

＜細胞数の計測＞
希釈した分散液２μＬをバクテリアカウンター（サンリード硝子製）の計算室に注入した後、光学顕微鏡「ECLIPSE80i」（Nikon製）を用いて観察倍率４００倍で観察し、ブロック内の細胞数をカウントした。バクテリアカウンターの計算室のうち、０．０５ｍｍ角のブロックを使用した。計算室には、０．０５ｍｍ角のブロック１６マス（縦４マス×横４マス）からなる集合体が、２５個（縦５個×横５個）並んでいる。これらの集合体のうち、顕微鏡の観察画面の右上から左下までの対角線上に存在する５個の集合体中に含まれる細胞数をカウントした。すなわち、０．０５ｍｍ角のブロックの８０マス（１６マス×５個）中の細胞数をカウントした。バクテリアカウンターの計算室の深さは０．０２０ｍｍであり、０．０５ｍｍ角のブロック１つあたりの体積は１／２００００ｍｍ³である。カウントした細胞の総数を、該当するブロックの体積（１／２００００ｍｍ³×８０マス）で除し、更にカウントに用いた希釈液の希釈倍率をこれに乗ずることにより、希釈前のサンプル１ｍＬあたりの細胞数を求めた。なお、希釈液には、ダイゴ人工海水ＳＰ（和光純薬工業製）を用いた。

＜細胞破砕率の算出＞
前述の細胞数の測定方法により、処理液中の細胞数を測定した。破砕前の細胞数から破砕後の細胞数を引いて、破砕前の細胞数で除し、１００を乗じた値を細胞破砕率（％）とした。

＜藻体濃度の測定＞
微細藻類を含む分散液を遠心分離機「CR22GIII」（HITACHI社製、ローター：18A）にて、遠心分離（回転数：１５０００ｒ／ｍｉｎ、温度：２５℃、時間：５分間）し、上清を捨てた後、０．１２５Ｍクエン酸-リン酸水素二ナトリウムバッファー（ｐＨ５）に再分散させた。再分散させた液をフィルタ「Supor-450」（日本ポール製、孔径０．４５μｍ）にて吸引ろ過し、等量の蒸留水で掛け洗いした。藻体を捕集したフィルタをアルミカップに移して１０５℃で２時間乾燥させた。乾燥後の重量を測定し、フィルタの風袋を差し引いて藻体濃度（ｇ／Ｌ）とした。また、分散液がフィルタで吸引ろ過しにくい場合は、適当な濃度に分散液を希釈して、乾燥後の重量を測定し、フィルタの風袋を差し引いた後、希釈率を乗じて藻体濃度（ｇ／Ｌ）とした。なお、希釈液には、０．１２５Ｍクエン酸−リン酸水素二ナトリウムバッファー（ｐＨ５）を用いることができる。

＜物理的処理＞
物理的処理は、高圧分散装置により行った。高圧分散装置には、ナノヴェイタ「NM-L200-D」（吉田機械興業社製、クロス型ノズル：NVGL-XT160）を用いた。処理圧力は、入口圧がゲージ圧で１００ＭＰａ、出口圧が絶対圧で０．１Ｍｐａ（大気圧）とし、端切りのために７ショット目から取得した。パス回数は１回とした。

（実施例１）
不等毛植物門に属する微細藻類としてナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）（分散液を構成する液体：人工海水「ダイゴ人工海水SP」日本製薬株式会社製、藻体濃度：１．０ｇ／Ｌ）を用いた。２５℃における処理液のｐＨは７．３であった。１ＭのＨＣｌを滴下し、処理液のｐＨを５．０に調整した。ｐＨを調整した処理液に対してグリセリンを０．０１質量％となるように添加し、２５℃で２４時間保持してグリセリン処理を行った。グリセリン処理後に物理的処理を行った。細胞の破砕率は４４％であった。

（実施例２）
処理液のグリセリン濃度を０．１質量％とした以外は、実施例１と同様にした。細胞の破砕率は４５％であった。

（比較例１）
処理液のｐＨを５．０に調整した後、グリセリン処理を行うことなく３０分以内に物理的処理を行った。細胞の破砕率は１６％であった。

（比較例２）
処理液のｐＨを調整せずに比較例１と同様に行った。細胞の破砕率は２２％であった。

（比較例３）
ｐＨの調整をしていない処理液に、プロピレングリコールを０．１質量％となるように添加し、２５℃で２４時間保持した。この後、物理的処理を行った。細胞の破砕率は２８％であった。

表１に実施例１、２、比較例１〜３の条件及び結果をまとめて示す。グリセリンを含む処理液中に微細藻類を保持するグリセリン処理をした後、物理的処理を行うことにより、破砕率が大きく向上した。

（実施例３）
不等毛植物門に属する微細藻類としてナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）「ヤンマリンＫ−１」（クロレラ工業製、分散液を構成する液体：海水、藻体濃度：５０ｇ／Ｌ）を用いた。分散液を、遠心分離（遠心力：２３０００Ｇ、回転数：１５０００ｒ／ｍｉｎ、温度：２５℃、時間：５分間）して、上清を捨てた後、０．１２５Ｍクエン酸−リン酸水素二ナトリウムバッファー（ｐＨ５）に藻体濃度が５０ｇ／Ｌとなるように再分散させた。遠心分離には遠心分離機「CR22GIII（日立工機株式会社製、ローター：18A）を用いた。藻体を再分散させた処理液に対してグリセリンを０．０７質量％となるように添加し、３７℃で２４時間保持してグリセリン処理を行った。グリセリン処理後に物理的処理を行った。細胞の破砕率は６５％であった。

（実施例４）
グリセリン処理の前に、酵素処理を行った。実施例３と同様にして藻体を再分散させた処理液を調製した後、処理液に含まれる微細藻類の乾燥質量に対して０．０４質量％となるように酵素を添加し、３７℃で２４時間酵素処理を行った。酵素にはヘミセルロースの１種であるキシラナーゼ（ＨＢＩ社製、セルロシンＴＰ−２５）を用いた。酵素処理の後、処理液にグリセリンを０．５質量％となるように添加し、３７℃で２４時間保持してグリセリン処理を行った。グリセリン処理後に、物理的処理を行った。細胞の破砕率は７２％であった。

（比較例４）
「ヤンマリンＫ−１」（５０ｇ／Ｌ）に対し、ｐＨ調整、酵素処理及びグリセリン処理を行わずに物理的処理を行った。細胞の破砕率は３５％であった。

表２に実施例３、４、比較例４の条件及び結果をまとめて示す。グリセリンを含む処理液中にて微細藻類を保持するグリセリン処理をした後、物理的処理を行うことにより、破砕率が大きく向上した。グリセリン処理と共に酵素処理を行うことにより更に破砕率が向上した。

１００ 均質バルブ
１０１ 均質バルブシート
１０２ 均質バルブ本体
１０３ インパクトリング
１１０ チャンバ
１１１ 流入管路
１１２ せん断管路
１１３ 流出管路
１２０ チャンバ
１２１ 流入管路
１２２ せん断管路
１２３ 流出管路

Claims (6)

1. 不等毛植物門に属する微細藻類に対して、グリセリンを含む処理液中に前記微細藻類を保持するグリセリン処理をした後、高圧分散装置を用いて物理的処理をする、藻類の破砕方法。
2. 前記微細藻類が、ナンノクロロプシス属である、請求項１に記載の藻類の破砕方法。
3. 前記グリセリン処理は、１２時間以上行う、請求項１又は２に記載の藻類の破砕方法。
4. 前記処理液のグリセリン濃度は、前記処理液に含まれる前記微細藻類の乾燥質量に対して０．０１質量％以上、１５００質量％以下とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の藻類の破砕方法。
5. 前記物理的処理は、ゲージ圧で１０ＭＰａ以上の圧力を加えた後、絶対圧で０．３ＭＰａ以下に減圧する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の藻類の破砕方法。
6. 前記物理的処理よりも前に、酵素処理を行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の藻類の破砕方法。

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