KR20160030179A - 초고압 균질화를 통해 클로렐라 세포벽을 파괴하기 위하여 최적화된 방법 - Google Patents

초고압 균질화를 통해 클로렐라 세포벽을 파괴하기 위하여 최적화된 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 미세조류 바이오매스를 가공하기 위한 초고압 균질화 기술이 수행되어 클로렐라 속의 미세조류, 더욱 상세하게는 클로렐라 불가리스, 클로렐라 소로키니아나 및 클로렐라 프로토테코이데스의 세포벽을 산업적 규모로 파괴하기 위하여 최적화된 방법에 관한 것이다.

Description

초고압 균질화를 통해 클로렐라 세포벽을 파괴하기 위하여 최적화된 방법{OPTIMISED METHOD FOR BREAKING CHLORELLA CELL WALLS BY MEANS OF VERY HIGH PRESSURE HOMOGENISATION}
본 발명은 클로렐라(Chlorella) 속 미세조류, 더욱 상세하게는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 또는 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides)의 세포벽들을 파괴하기 위하여 최적화된 방법에 관한 것이다.
선행 기술의 제시
클로렐라는, 단백질과 기타 필수 영양소들이 풍부하기 때문에 식품의 잠재적 공급원인 것으로 당업자들에게 널리 알려져 있다.
클로렐라는, 상세하게는 45%의 단백질, 20%의 지방, 20%의 탄수화물, 5%의 섬유소, 그리고 10%의 무기질과 비타민을 함유한다.
클로렐라를 식품 내에 효율적으로 사용하기 위해서, 이의 소화율 및 이의 흡수율이 용이하도록 종종 "세포 파괴"가 사용되고 있다.
미세조류의 "세포 파괴"는 다양한 기술들의 사용을 통해 특허 및 비특허문헌에 잘 기재되어 있다:
- 물리적 기술들(초음파, 마이크로비드, 열 충격, 고압 등)
- 화학적 기술들(산, 알칼리, 친수성 유기 용매 등)
- 효소 기술들(셀룰라제, 리파제 등).
그러나 다양한 기계적, 화학적 또는 효소적 대안들은 일반적으로 산업적 규모로 상당히 성공적으로 외삽될 수 없으며, 본질적으로 실험실 규모로 기술되어 있다.
뿐만 아니라, 만일 세포벽이 특히 높은 기계적 강도를 갖는 경우(상세하게는 클로렐라 속의 경우) 그리고 배지 내 세포 밀도가 높은 경우(100 g/ℓ 초과), 기술의 선택은 매우 제한된다.
외삽 시 산업적 문제점들(고용량, 신뢰성, 운영 비용, 투자 비용 등)이 또한 여기에 추가될 때, 현실적인 기계적 대안들은 마이크로비드가 사용되는 밀링(milling) 및 고압 기술로 본질적으로 제한된다.
본 발명에 의해 다루어진 분야인 고압 균질화에 의한 통상의 세포 파괴 기술들은, 예를 들어 특허 출원 또는 특허인 (단세포 청조류로부터의 시아닌 추출에 관한) CN 102433015호, (DHA-생산 미생물들로부터의 DHA 추출에 관한) CN 101817738호, (인지질 및 플루오르화탄소가 함유된 산소 보유 조성물의 수득에 관한) US 5,885,564호에 개시되어 있으며, 그렇지 않으면 (미세조류 바이오매스로부터의 지질 및 단백질 구성 성분들의 추출에 관한) CN 101352249호에 개시되어 있다.
동력학적 고압 균질화라고도 알려져 있는 고압 균질화(본 개시의 나머지 부분에서 "HPH"라고 칭함)가, 종래의 기계들보다 10배 내지 15배 높은 압력에 이르도록 할 수 있는 신세대 균질화기의 개발을 통해 제안된 바 있다.
"파괴"될 세포 물질의 성질을 고려하면, HPH는, 본질적으로 세포 파편들의 혼합물, 세포 내 수성 액체 및 오일로 구성된 유액이 생성되게 한다.
1980년대 초반, 액체 중에서 초고압, 100 MPa 초과 및 최대 300 MPa 내지 500 MPa의 압력을 발생시키고 관리할 수 있는 기계들의 유용성에 의해, 그리고 또한 균질화 챔버의 새로운 디자인에 의한 미세 유액의 생산을 위한 신기술이 제안되었다.
따라서, 고압 균질화기 제조업자 다수는 프로토타입 또는 산업적 규모의 장비, 예를 들어 마이크로플루이딕스(Microfluidics), 스탠스테드 플루이드 파워(Stansted Fluid Power), AVP, 아베스틴(Avestin) 또는 니로 소아비(Niro Soavi) 중 어느 하나를 제안한다.
개념상, 기본적인 균질화기는 고압 발생기, 예를 들어 유체가 특별히 디자인된 균질화 밸브들의 세트를 통과하도록 만드는, 증압기와 결합된 용적형 펌프로 이루어져 있다.
공정 유체의 (350 MPa 이하로의) 신속한 가압은 100 MPa당 약 3℃의 온도 상승을 유발하는 반면에, 균질화 밸브에서 일어나는 압력의 즉각적인 강하는 열의 대폭적인 증가를 유도한다(100 MPa당 15℃ 내지 20℃).
압력이 훨씬 적게 강하하는 제2 밸브는, 제1 단계에서 형성될 수 있는 응집체들을 파열시키도록 주밸브를 따라서 배치될 수 있다.
입력 온도(input temperature)와 작동 압력의 수준에 따라서 최종 온도가 높아질 수 있음을 고려하면, 공정 유체의 신속한 냉각은 가공된 생성물의 열 불안정성 구성 성분들을 보존함에 있어서 실효성이 우수하다.
주목할 점은, 이들 동력학적 고압 조작에 있어서, 유체는 초단기간(1초 내지 10초) 동안 고압에 노출된다는 점이다.
이러한 기간에서, 유체는 증압기로부터 파열 밸브(disruption valve)로 흘러야 한다. 파괴 작동은 주로 공정 유체가 고압에 노출되도록 하는 것에 의하기보다는, 고압 하에 있는 공정 유체가 조정 가능한 제한된 구멍을 보유하는 배출 밸브(discharge valve)로 통과하도록 함으로써 조절된다.
균질화 밸브의 유형이 어떠한 것이든 간에, 고압 하에서 가공된 액체는 "균질화 공간(homogenization space)"이라고 칭하여지는 수렴 섹션을 통과한 다음, 팽창된다.
압력은 작동기(actuator)에 의해 제어됨으로써, 밸브에 가하여지는 외력은 조정될 수 있다.
그러므로 이와 같은 HPH 기술은 효율성을 도모하도록 미세하게 제어되어야 하고, 의도된 목적들에 따라서 조정되어야 한다.
따라서, 미세조류가 더욱 소화되기 쉽도록 만들거나 관심 있는 미세조류의 함유물을 방출시키기 위하여, 예컨대 미세조류의 세포벽들을 파괴하기 위한 HPH의 용도와 함께 또 다른 응용은 미생물 의한 오염의 제거에 관한 것이다.
이 분야에서, 스탠스테드 플루이드 파워 리미티드(Stansted Fluid Power Ltd) 사는 유의적인 개선점을 균질화기 밸브 디자인에 도입하였으며, 이로써 유체 압력 수준이 최대 350 MPa로 증가하여 유액 또는 생체고분자의 질감을 변형시킴으로써 현장에서 생성물이 멸균될 수 있게 되었다.
이와 같은 세포 파괴 기술의 효과적인 산업적 외삽법이 의도될 때 HPH 기술이 유망할 것이라는 것은 전술된 전부에서 기인한다.
그러나, 일반적으로 미세조류의 세포들, 특히 클로렐라의 세포들을 파괴하는데 있어서 HPH 기술이 적용될 필요가 있을 때, 다수의 문제점이 발생한다.
클로렐라 바이오매스를 HPH로 가공하는 것과 관련된 첫 번째 문제점은 생성된 유액의 성질과 연관되어 있다.
이와 같은 유액의 안정성은, 무엇보다도, 계면에 존재하는 분자들뿐만 아니라, 균질화 기술에 의해 제공되는 유화 작업에 의존할 것이다.
상기 유액의 안정성은 일반적으로 이것이 다수의 식품 응용에 사용됨에 있어서 필수적이다.
두 번째 문제점은 상기 유액의 건조에 관한 것이다.
실제로, 이 유액이 (예를 들어 분무 건조법에 의해) 건조될 때, 유액의 분말도(fineness)는 분말의 유동 특성, 지질의 피포화 특성, 그리고 산화에 대한 안정성을 좌우할 것이다.
최종 생성물은 의도된 응용에 따라서 훨씬 더 용이하게 사용될 것이다.
매트릭스에 따라, 유화를 위해 필요한 에너지는, 충분히 미세하고 안정한 유액의 생성을 관리하기 위해 매우 많을 수 있다.
세 번째 문제점은 습한 바이오매스, 예를 들어 클로렐라 발효 즙(must)의 정화(refining)/정제(purification) 가공이 이루어지는 동안 관찰되는 미생물의 품질이다.
정화/정제 프로토콜이 비 멸균 환경에서 수행되는 경우, 미생물 오염이 발생하는 것을 제한하기 위해서는 (예를 들어 냉장 가공, 중간체 보관 단계 지속 기간의 제한 등에) 각별한 주의가 기울여져야 한다.
그러나, 이와 같은 예방 수단들은 불충분할 수 있으며, 저온살균/멸균 단계가 최종 생성물을 생성하는 최종 단계들 중에 필요한 것으로서 판명될 수 있다.
이와 같은 세 가지 문제점에 직면하여, 당업자는 적합한 기술들을 사용하여 연속적인 밀링, 저온살균/멸균 및 균질화 단계들을 포함하는 고된 공정을 수단으로 사용하여야 할 것이다.
본 발명의 주제
이와 같은 제약들을 극복하기 위해 본 출원인인 당사는 이들 세 가지 작업을 동시에 성공적으로 수행함으로써 조작 순서를 상당히 단순화하기 위하여 초고압(또는 극고압(ultrahigh pressure)) 기술의 제어에 대한 연구를 수행하기로 하였다.
더욱 상세하게는, 본 출원인인 당사는, 통상적으로 당업자에 의해 별개로 간주되는, HPH 기술의 상이한 응용 분야들 중 2개의 분야를 이용하기로 결정하였다.
첫 번째 분야는, HPH 기술에 의해 발생할 수 있는 물리적 변화들, 예를 들어 유액의 제조 또는 안정화나, 나노 입자 및 나노 현탁액 유형의 제조, 또는 점도 및 질감의 변화들을 얻기 위한 것으로서 일반적으로 기술되어 있거나 이러한 목적들로 사용되는, 현탁액 또는 유액의 입자, 비말 또는 미셀의 크기 감소, 크기 분포의 협소화에 관한 것이다.
두 번째 분야는, 일반적으로 생명공학 및 제약 업계에서 세포 내 물질을 회수하는데 적용되는 HPH에 의해 유도되는 세포 "파열" 효과에 중점을 두고 있는데, 여기서 HPH는 일반적으로 식품 및 의약품에서 미생물의 로드(microbial load)를 감소시키는데 사용된다.
따라서, 이러한 방식으로 HPH가 수행되면, 미세조류 세포들을 파괴하는데 오로지 HPH만이 효율적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라,
- 유액의 생산;
- 상기 유액의 건조;
- 용해된 바이오매스를 정화/정제하는 단계들이 진행되는 동안 잠재적 미생물 오염물들의 존재
와 관련된 문제점들을 관리하기 위해, 상기 기술에 의해 제공되는 모든 기능성이 이용될 수 있다.
또한, 미세조류 세포들을 효율적으로 파괴하기 위하여, 선행 기술에 기술된 바와 같이 다른 기술들(예를 들어 미세조류의 세포벽들을 분해하기 위해 특이적 효소들을 사용하는 것과 같은)을 HPH와 혼용할 필요를 없애는 것도 가능하다.
따라서, 본 발명은 산업적 규모로 클로렐라 속의 미세조류의 세포들의 세포벽을 파괴하는 방법에 관한 것으로서, 세포벽 파괴는, 80% 초과의 세포벽 파괴도, 1 ㎛ 미만의 생산된 유액의 입자 크기, 및 특히 1000배 또는 10,000배 만큼의 미생물 로드의 감소가 보장되는 방식으로, 고압 균질화가:
- 300 MPa 내지 400 MPa의 압력에서 적어도 1회 통과, 또는
- 150 MPa 내지 300 MPa의 압력에서 적어도 2회의 연속 통과, 및
- 4℃ 내지 40℃의 공급 온도
에서 수행됨을 특징으로 하는, 고압 균질화에 의해 수행된다.
특히 상기 방법은 미생물 로드를 유액 1g당 총 미생물 개체 10개 미만이 되도록 보장한다.
바람직하게, 고압 균질화는 고체를 15중량% 내지 50중량% 포함하는 미세조류 세포들의 바이오매스, 특히 미세조류 세포를 15 건조 중량% 내지 50 건조 중량% 포함하는 바이오매스를 대상으로 수행된다.
바람직하게, 클로렐라 속의 미세조류는 클로렐라 불가리스, 클로렐라 소로키니아나 및 클로렐라 프로토테코이데스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 상세하게는 클로렐라 프로토테코이데스이다. 바람직하게는, 미세조류 바이오매스는 지질을 적어도 10 건조 중량% 포함하고, 바람직하게는 지질을 적어도 20 건조 중량%, 30 건조 중량%, 40 건조 중량%, 50 건조 중량% 또는 60 건조 중량% 포함한다.
하나의 특정 구현예에서, 공급 온도는 20℃ 내지 40℃이다.
하나의 바람직한 구현예에서, 고압 균질화는 단일 통과시 300 MPa 내지 400 MPa의 압력에서 수행된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 고압 균질화는 2회, 3회, 4회 또는 5회의 연속 통과시 150 MPa 내지 300 MPa의 압력, 바람직하게는 150 MPa 내지 250 MPa의 압력에서 수행된다. 특히 고압 균질화는 2회 연속 통과시 150 MPa 내지 250 MPa의 압력에서 수행된다. 2회 연속 통과시의 압력은 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명은 또한 미세조류, 바람직하게는 클로렐라 속, 상세하게는 클로렐라 프로토테코이데스 미분(flour)을 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 미세조류 바이오매스를 생산하는 단계, 본 발명에 따른 방법으로 세포벽을 파괴하는 단계, 및 상세하게는 분무 건조법에 의해 바이오매스를 건조하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해 수득된 미세조류 미분에 관한 것이다. 바람직하게 상기 방법은 150 MPa 내지 300 MPa의 압력에서 적어도 2회의 연속 통과를 포함한다.
마지막으로, 본 발명은 상술된 바와 같이 미세조류 미분을 제조하기 위해, 본 발명에 따른 미세조류의 세포벽을 파괴하기 위한 방법의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명
본 출원인인 당사는, 클로렐라 속의 미세조류의 세포벽을 파괴하기 위한 초고압(또는 극고압) 균질화 기술이 관리 하에 활용되면, 원하는 밀링 품질이 달성될 수 있음을 발견하였다.
이와 같이 관리 하에 활용된다는 것은, HPH를 수행하기 위한, 표본 미세조류(본 출원의 경우에는 클로렐라 프로토테코이데스)에 맞추어진 각각의 매개 변수들을 연구 및 최적화하는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명의 바람직한 미세조류는 종속영양 조건(탄소 공급원으로서 당이 공급되고, 빛이 없는) 하에서 성장할 수 있다. 본 출원인인 당사는 클로렐라 속 중 지질이 풍부한 미세조류를 선택할 것을 권장한다. 사용된 미세조류는, 비제한적으로, 클로렐라 프로토테코이데스, 클로렐라 케슬러리(Chlorella kessleri ), 클로렐라 미뉴티시마(Chlorella minutissima), 클로렐라 종(Chlorella sp.), 클로렐라 소로키니아마, 클로렐라 루테오비리디스(Chlorella luteoviridis), 클로렐라 불가리스, 클로렐라 레이시글리이(Chlorella reisiglii), 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea), 클로렐라 사카로필라(Chlorella saccarophila), 파라클로렐라 케슬러리(Parachlorella kessleri), 파라클로렐라 베이저링키이(Parachlorella beijerinkii), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora) 및 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis)로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따라 사용된 미세조류는 클로렐라 프로토테코이데스 종에 속한다.
이러한 바이오매스를 생산하기 위해, 미세조류는 액체 배지 중에서 배양된다. 본 발명에 따르면, 미세조류는 빛이 없이 탄소 공급원과 질소 공급원을 함유하는 배지(종속영양 조건들)에서 배양된다. 고체 및 액체 성장 배지는 일반적으로 문헌에서 이용가능하며, 매우 다양한 미생물 균주들에 적합한 특정 배지를 제조하기 위한 권고 사항은, 예를 들어 오스틴 소재 텍사스 대학교에 의해 관리되는 조류 배양 수집소(UTEX)의 웹 사이트 www.utex.org/에서와 같이 온라인 상에서 발견될 수 있다. 바이오매스의 생산은 발효조(또는 생물 반응기) 내에서 수행된다.
생물 반응기, 배양 조건들, 종속영양 성장 및 번식 방법에 관한 구체적인 예들은, 미세조류 성장 및 지질의 효율을 개선하도록 임의의 적당한 방식으로 조합될 수 있다.
바람직하게, 초고압 균질화 방법이 적용되는 바이오매스의 고체 함량은 15 건조 중량% 내지 50 건조 중량%이다. 특히 고체 함량은 25% 내지 45%일 수 있고, 바람직하게는 35% 내지 45%일 수 있다. 바람직하게, 바이오매스는 초고압 균질화 방법이 적용되기 전에 세정 및 농축된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 고체 함량이 언급될 때, 이는 미세조류 세포의 건조중량을 기준으로 한 함량을 의미한다.
또한, 미세조류 바이오매스 중 지질 함량은 바람직하게는 최소로 적어도 10 건조 중량%, 20 건조 중량%, 30 건조 중량%, 40 건조 중량%, 50 건조 중량% 또는 60 건조 중량%, 예를 들어 20% 내지 80% 또는 30% 내지 70%이다.
적용 압력, 통과 횟수 및 공급 유체의 온도에 따른 세포 파괴도 평가
이하에 예시될 바와 같이, 유체에 적용되는 압력과 통과 횟수는 세포 파괴 효율에 유의적인 영향을 준다는 것이 확인된다.
그러므로, 본 발명에 따른 방법에 따르면 다음과 같은 조건들 하에서 작업하는 것이 추천된다:
- 300 MPa 내지 400 MPa의 압력에서 적어도 1회 통과, 및 바람직하게는 단일 통과, 또는
- 150 MPa 내지 300 MPa의 압력, 바람직하게는 150 MPa 내지 250 MPa의 압력에서 적어도 2회의 연속 통과, 및
- 4℃ 내지 40℃의 공급 온도.
이와 같은 방법에 있어서, 세포벽 파괴 백분율은 80%, 85% 또는 90% 초과이다. 더욱이, 미생물 로드는 본 방법에 의해 유의적으로 감소한다. 상세하게는, 유액 1g당 총 미생물 개체는 10개 미만이다.
1회 통과 구현예에서, 압력은 300 MPa 내지 325 MPa, 325 MPa 내지 350 MPa, 350 MPa 내지 375 MPa, 또는 375 MPa 내지 400 MPa일 수 있다.
수회 연속 통과 구현예에서, 압력은 150 MPa 내지 175 MPa, 175 MPa 내지 200 MPa, 200 MPa 내지 225 MPa, 225 MPa 내지 250 MPa, 250 MPa 내지 275 MPa, 또는 275 MPa 내지 300 MPa일 수 있다. 상세하게는, 압력은 200 MPa 내지 300 MPa, 또는 200 MPa 내지 250 MPa일 수 있다.
공급 온도는 20℃ 내지 40℃일 수 있다. 대안적으로, 공급 온도는 4℃ 내지 10℃, 10℃ 내지 20℃, 20℃ 내지 30℃, 또는 30℃ 내지 40℃일 수 있다.
미세 입자의 유액을 생성하는 HPH 기술의 능력 평가
이하에 개시될 바와 같이, 염색을 하거나 하지 않은 광학 현미경 관찰들은, HPH에 의한 파괴를 바탕으로 하는 기술이, 예를 들어 볼 밀링을 사용하는, 더욱 통상적인 세포 파괴 방법에 의해 생산되는 유액보다 더욱 미세한 유액을 생성할 수 있음을 보여준다.
HPH 세포 파괴로부터 얻어진 유액의 분획은 입자의 크기가 매우 작은 것을 특징으로 하는 반면에, 볼 밀링에 의해 얻어진 유액은 입자의 크기가 1 ㎛ 내지 40 ㎛ 초과로 입자가 더 거친(coarse) 것을 특징으로 한다. 실제로, 본 발명에 따른 방법이 사용될 때, 1 ㎛ 미만의 입자 크기를 갖는 모집단이 상당히 존재하며, 이 집단은 심지어 유액 중에 주류를 이루며 존재할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 HPH 세포 파괴로부터 얻어진 유액의 분획은 미분으로 제조된 유액의 입자 크기에 의해 특징지어진다. 이후 유액들은 레이저 입자 크기 분석에 의해 분석된다(레이저 마스터사이저(Laser Mastersizer) 2000E - 맬번(Malvern)).
따라서, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 유액은 총 모집단의 적어도 20%, 30%, 40% 또는 50%를 차지하는, 입자의 크기가 1 ㎛ 미만인 모집단에 의해 특징지어진다. 본원에서 용어 "%"는, 입자 크기에 관한 함수로서 용적%를 나타내는 그래프에서 면적 분포 백분율을 의미하는 것으로 의도된다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 유액은 총 모집단의 50% 초과를 차지하는, 입자의 크기가 1 ㎛ 미만인 모집단에 의해 특징지어진다. 본원에서 용어 "%"는, 입자 크기에 관한 함수로서 용적%를 나타내는 그래프에서 면적 분포 백분율을 의미하는 것으로 의도된다.
하나의 특히 바람직한 구현예에서, 본 방법은 150 MPa 내지 300 MPa, 바람직하게는 200 MPa 내지 300 MPa, 상세하게는 250 MPa의 압력에서 적어도 2회의 연속 통과를 포함하고, 본 발명에 따른 방법에 의해서 수득된 유액은 총 모집단의 50% 초과를 차지하는, 입자 크기가 1 ㎛ 미만인 모집단에 의해 특징지어진다.
그러므로, 유액의 입자 크기 특징으로 말미암아, 고압 균질화에 의해 수득된 유액은 볼 밀링으로 얻어진 유액보다 훨씬 더 안정하다.
비록 초고압, 상세하게는 적어도 300 MPa의 압력을 사용하지만, 단일 통과는 미세조류 세포들을 파괴하기 위한 방법으로 충분함이 입증되었으며; 또한 초고압 균질화는, 유액이 수회 연속 통과에서 생산되는 경우, 훨씬 더 안정화된 유액을 만들어낼 것임이 본 출원인인 당사에 의해 입증되었다. 그러므로, 본 방법은 2회, 3회, 4회 또는 5회의 연속 통과를 포함할 수 있다. 그러나, 산업적 목적으로 통과 횟수가 제한되는 것이 바람직하다. 그러므로, 하나의 바람직한 구현예에서, 2회 연속 통과가 이용될 것이다. 각 통과에 대해 사용되는 압력은 다양할 수 있거나 일정할 수 있다.
본 방법은 임의의 입수 가능한 고압 균질화기, 예를 들어 마이크로플루이딕스, 스탠스테드 플루이드 파워, AVP, 아베스틴 또는 니로 소아비에 의해 제공된 고압 균질화기 상에서 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 상술된 바와 같은 미세조류 미분을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 미세조류 바이오매스를 생산하는 단계, 본 발명에 따른 방법에 의해 세포벽을 파괴하는 단계, 및, 특히 분무 건조법에 의해 바이오매스를 건조하는 단계를 포함한다. 세포벽 파괴 이전에, 바이오매스가 세정 및/또는 농축되는 것이 가능하다. 본 발명은 또한 상술된 방법에 의해 수득된 미세조류 미분에 관한 것이다.
더욱 일반적으로, 본 발명은, 본 발명에 따른 미세조류 세포벽 파괴 방법을 사용하여, 상술된 미세조류 미분을 제조하는 방법에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은 상술된 미세조류 미분을 제조하기 위한 본 발명에 따른 미세조류 세포벽 파괴 방법의 용도에 관한 것이다.
이와 같은 미세조류 미분은 식품 산업 분야에서 유용하다. 그러므로, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 미분 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 미분의 식품 산업 분야에서의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 식품 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 이러한 미세조류 미분을 식품 조성물의 성분들 또는 식품 조성물 자체에 첨가하는 단계를 포함한다. 이와 같은 용도들은, 예를 들어 특허출원공보 WO 2010/045368호, WO 2010/120923호 또는 US 2010/0297296호에 기술되어 있다.
용어 "산업적 규모"는, 바람직하게는
- 밀링 챔버 또는 파괴 챔버의 부피가 100 리터 이상, 바람직하게는 500 리터 이상이고/이거나;
- 유속이 1 ㎥/h 초과이며/이거나;
- 회분이 1 ㎥ 내지 200 ㎥
인 경우의 방법을 의미하는 것으로 의도된다.
또한, 하나의 바람직한 산업적 규모 방식에 있어서, 바이오매스는 고체를 15중량% 내지 50중량%, 특히 세포를 15 건조 중량% 내지 50 건조 중량% 포함한다.
본 발명은 예시적이면서 비제한적인 것으로 의도되는 이하 실시예들을 통해서 더욱 명확히 이해될 것이다.
실시예
실시예 1. 클로렐라 프로토테코이데스 미세조류 바이오매스의 제조 및 사용된 도구들에 관한 제시
발효 프로토콜은 일반적으로 특허출원공보 WO 2010/120923호에 전부 기술된 것으로부터 응용된 방법이다.
생산용 발효조에는 클로렐라 프로토테코이데스의 예비 배양액이 접종된다. 접종후 부피는 9000ℓ에 이른다.
사용된 탄소 공급원은 시간/온도 계획이 적용되어 멸균된 55%w/w 글루코스 시럽이다.
발효는 글루코스 유속이, 잔여 글루코스 농도가 3 g/ℓ 내지 10 g/ℓ로 유지되도록 조정된 유가식 발효이다.
생산용 발효조 시간은 4일 내지 5일이다.
발효의 종료 시에 세포 농도는 185 g/ℓ에 이른다.
글루코스 공급 단계 동안, 배양 배지 중 질소 함량은, 지질이 (바이오매스의 중량을 기준으로) 50%의 양만큼 축적될 수 있도록 제한된다.
발효 온도는 28℃로 유지된다.
접종전 발효 pH는 6.8로 조정되고, 이후 발효 동안 이와 동일한 수치로 조절된다.
용해된 산소는 통기, 배압 및 발효조 교반을 제어함으로써 최소 30%로 유지된다.
발효 즙은 HTST 구역을 거치면서 75℃에서 1분의 계획으로 열 처리되고, 6℃까지 냉각된다.
그 다음, 바이오매스는 희석률 6:1(물/발효 즙)로 이산화탄소 제거 음용수로 세정되고, Alfa Lava Feux 510이 사용되는 원심분리에 의해 250 g/ℓ(25% DCW "건조 세포 중량")로 농축된다.
세포 파괴도의 측정
밀링 정도는, 초기 참조 시료와 비교하여, 밀링 후 잔여 세포들의 현미경 계수에 의해 측정된다.
시료들은 1/800으로 희석된다.
분석은 10×40 배율의 광학 현미경 하에 수행되는 표준 방법에 따라서 맬러세즈 셀(Malassez cell) 상에서의 계수를 통해 수행된다.
세포 파괴도는, 초기 참조 시료와 비교하여, 잔여 세포들의 백분율을 계산함으로써 결정된다.
실시예 2. HPH 에 의한 클로렐라 프로토테코이데스의 파괴 효율에 대한, 압력 수치, 통과 횟수, 및 온도의 영향력 측정
실시예 1에 따라서 제조된 바이오매스의 밀링 효율(파괴도 %로서 표시됨)에 대한, 적용 압력 수치(100 MPa 및 150 MPa) 및 통과 횟수의 영향력이 시험된다.
150 MPa 이하의 범위의 동력학적 압력 하에서, SEO 밸브가 장착된 라니 랩(Rannie LAB) 10.51VH 균질화기(SPX) 고압 균질화 시스템이 사용된다. 바이오매스는 약 60 ℓ/h의 유속으로 도입된다.
도 1은, 압력이 높을수록, 그리고 통과 횟수가 많아질수록 파괴 효율이 더 좋아질 것임을 명확히 보여준다.
적용 압력에 따른 세포 파괴 효율을 평가하기 위해, 두 번째 일련의 시험을 단일 통과에서 수행하되, 다양한 압력에서 수행하였다.
이를 위해, 380 MPa 이하의 범위의 동력학적 압력 하에서 스탠스테드 플루이드 파워 리미티드 11300(15 kW) 연속 극고압 시스템이 사용된다.
생성물은 단일 통과에서 약 100 ℓ/h의 유속으로 연속 공급된다.
도 2에 도시된 바와 같이, 세포들의 파괴는 100 MPa에서 시작하여 가시화되고, 150 MPa에서 시작하여 유의적이 되기 시작한다.
세포 파괴도는 300 MPa에서때 70%에 이르고, 이후 본 기술을 통해 가하여질 수 있는 최대 압력일 때 80%를 초과하는 파괴도에 이른다.
2회 연속 통과되되, 250 MPa로 압력이 제한되는 세 번째 일련의 시험이 수행된다.
도 3에 도시된 바와 같이, 이와 같은 환경설정에 있어서 200 MPa를 초과하는 압력에서 2회 연속 통과가 누적됨으로써, 약 90%의 세포 파괴도가 달성된다.
이러한 환경설정에 있어서 균질화 밸브에 적용되는 압력은 250 MPa 미만의 수치로 제한될 수 있다.
이러한 계획은 균질화-밸브 마모 현상을 방지할 수 있다.
입력 온도의 세포 파괴 효율에 대한 영향은 또 다른 일련의 시험에서 평가된다.
생성물 공급 온도에서의 증가는 세포 파괴 효율에 유리하게 작용한다(5% 초과로 증가)(도 4 참조).
그러나, 고압 균질화 방법 수행시 일어나는 발열 현상은 온도를 매우 유의적으로 상승시키는데, 이와 같은 온도 상승은 출력시 생성물의 민감도에 따른 제약을 이룰 수 있으므로; 입력 온도는 출력시의 최대 관용 역치값에 따라서 제한될 것이다.
결론적으로, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 하나의 양태에 따라 다음과 같은 조건들 하에서 작업하는 것이 권장된다:
- 350 MPa 내지 400 MPa의 압력에서 단일 통과, 또는
- 200 MPa 내지 250 MPa의 압력에서 2회 연속 통과, 및
- 4℃ 내지 40℃의 공급 온도.
실시예 3. HPH 파괴에 의해 생성된 유액의 품질
실시예 1에 따른 발효로부터 얻어진 바이오매스의 조성은 주류를 이루는 지질 분획(약 50 건조 중량%)에 의해 특징지어진다.
따라서, 세포 파괴 후, 유액(오일 중 세포 파편을 포함하는 수성 상)이 생성된다.
이 유액의 안정성은 지질 구체의 분말도에 의해 좌우된다.
균질화의 목적은 지질 구체들의 지름을 최소화함과 동시에 이 지질 구체를 가능한 한 균일하도록 만들어; 안정성을 개선하고, 배지의 점도를 증가시키기 위함이다.
그러므로 고압 균질화 기술은, 세포 파괴라는 단순한 목적을 넘어서, 생성된 유액을 균질화하고 따라서 안정화시킬 수 있는 잠재성의 측면에서 볼 밀링 기술과 비교됨으로써 평가된다.
그 다음, 바이오매스는 지름 0.5 ㎜인 지르코늄 규산염 볼이 사용되는 네취 랩스타(Netzsch Labstar) 볼 밀로 밀링된다(주변 속도 12 m/s, 충전율 90%, 유속 6 ㎏/h).
이후, 사용된 방법에 따라 유액을 비교하기 위하여 광학 현미경 하에서의 평가가 수행된다.
도 5 및 도 6은, 2가지 기술(350 MPa에서 1회 통과로 수행된 HPH 및 볼 밀링)에 의해 생성된 유액의 크기에서의 차이를 눈으로 확인할 수 있도록 해준다.
도 6은, 볼 밀링이, 구체 크기가 HPH 가공(생성된 유액은 육안상 훨씬 미세함) 후 수득된 구체(도 5)에 비하여 더욱 크고 이질적인, 훨씬 거친 유액을 생산한다는 사실을 입증해준다.
HPH 기술의 유화 잠재성이, 볼 밀링에 의해 수득된 것과 비교하여 더욱 정확하게 특성 규명되도록 하기 위하여, 생성된 유액들은 제작사의 사양들에 따라서 레이저 입자 크기 분석기(레이저 마스터사이저 2000E - 맬번) 상에서 분석된다.
도 7은, 미세하면서 잠재적으로 안정적인 유액의 생성에 사용되는 방법들의 효능이 특성 규명되도록 할 수 있다.
상기 2가지 경우에 있어서, 세포 파괴 후 이정 모집단(bimodal population)은, 처음의 바이오매스(부분적으로 전 세포 지름이 1 ㎛ 내지 10 ㎛ 사이에 속하는 단정 모집단을 보임)와 비교되면서 관찰된다.
그러나, 볼 밀링의 경우, 현미경 관찰에 따르면 유액은 1 ㎛ 내지 100 ㎛ 사이에 분포하면서 거칠다.
다시 말하면, 1 ㎛ 내지 30 ㎛ 사이에 분포하는 제1 모집단은 잔여 전 세포들뿐만 아니라 크기가 30 ㎛ 미만인 지질 구체들로도 구성되어 있다는 것이다.
제2 모집단은 부분적으로 지름이 40 ㎛ 초과인 지질 구체들로 구성된 유액으로 이루어져 있다.
그러므로, 볼 밀링에 의해 얻어진 유액은 전반적으로 거칠고 매우 이질적이다.
고압 균질화에 의한 세포 파괴의 경우, 배타적으로 잔여 전 세포들만으로 이루어진 모집단은 제2 모집단(1 ㎛ 내지 10 ㎛ 사이에 분포)이다.
세포 파괴를 통하여 얻어진 유액 분획은 입자 크기가 1 ㎛ 미만으로 매우 작은 제1 모집단으로서 특징지어진다.
이의 입자 크기 특징으로 말미암아, 고압 균질화에 의해 수득된 유액은 볼 밀링으로부터 얻어진 것보다 훨씬 더 안정적이다.
도 8은 결국, 유액의 입자 크기 분포에 균질화 압력이 미치는 영향력을 입증한다.
사실, 적용되는 압력이 높을수록 잔여 전 세포의 양이 적어지는 것이 주목되며, 이와 같은 결과는 상응하는 1 ㎛ 및 10 ㎛ 모집단의 크기가 감소하는 현상을 설명해준다.
한편, 유화된 지질 구체에 상응하는 분획의 크기는 가하여지는 압력이 증가함에 따라 같이 증가하면서 평균 입자 크기 분포에서의 감소를 초래한다.
도 9에 도시된 추가의 시험들은 고압(250 MPa)이 1회 또는 2회 통과되는 시스템을 평가하기 위한 것이다.
그러므로 초고압에서 2회의 연속 통과로 구성된 균질화 방법에 대한 압력의 영향력이, 단일 통과로 구성된 균질화 방법에 대한 압력의 영향력보다 훨씬 크다(그러므로 단일 통과와 함께 최대 달성가능 압력보다 심지어 더 큰, 누적 압력이 발생함).
이와 같은 초고압 균질화 환경설정으로 말미암아, 세포 파괴로부터 얻어진 지질 유액은 매우 안정되고, 이로써 이 유액을 가공하는 나머지 조작들 및 응용들에서 이의 사용을 용이하게 한다.
실시예 4. 미생물 로드의 감소
초고압 가공은 균질화 이전에 바이오매스의 오염을 감소시킬 잠재성에 관하여 평가된다.
균질화기의 밸브 압력에 의해 발생하는 전단력은 온도가 증가함과 아울러 바이오매스 중 미생물 로드를 유의적으로 감소시키고, 그로 말미암아 멸균력(sterilizing force)이 얻어진다.
그러므로, 오염 제거 잠재성은 스탠스테드 플루이드 파워 리미티드 11300(15kW)의 연속 극고압 시스템에서 상이한 압력 계획에 의해 평가된다.
하기 표는 이들 조건 하에서 수득된 미생물 로드 결과를 제시한다.
Figure pct00001
초고압 균질화는 총 미생물을 사실상 멸균 상태에 가깝에 감소시킴으로써 미생물 로드를 유의적으로 감소시킬 수 있다.
도면들에 관한 설명
도 1: 압력(100 MPa/150 MPa) 및 통과 횟수에 따른 파괴도 평가.
도 2: 1회 통과 시 압력에 따른 파괴도 평가.
도 3: 2회 연속 통과 시 압력에 따른 파괴도 평가.
도 4: 공급되고 있는 생성물 온도의 함수로서의 파괴도 평가.
도 5: 볼 밀링으로부터 얻어진 유액의 현미경 관찰(배율: 760배, 척도(막대)= 20 ㎛)
1 - 백색 광
2 - 나일 블루(Nile blue)로 염색 및 형광 조사.
도 6: 350 MPa에서 HPH 파괴로부터 얻어진 유액의 현미경 관찰(배율: 760배, 척도(막대)= 20 ㎛)
1 - 백색 광
2 - 나일 블루로 염색 및 형광 조사.
도 7: 초기 바이오매스 입자와 비교되는, 볼 밀링 또는 HPH에 의해 생산된 유액의 입자 크기 분석.
도 8: 적용된 압력에 따른 HPH에 의하여 생산된 유액의 입자 크기 분석.
도 9: 250 MPa에서 1회 또는 2회 통과 시 HPH에 의해 생산된 유액의 입자 크기 분석.

Claims (12)

  1. 클로렐라 속에 속하는 미세조류의 세포들의 세포벽을 산업적 규모로 파괴하기 위한 방법으로서, 세포벽 파괴는 고압 균질화에 의해 수행되는데, 고압 균질화는 80% 초과의 세포벽 파괴도, 1 ㎛ 미만의 생산된 유액의 입자 크기, 및 1000배 만큼의 미생물 로드의 감소가 보장되는 방식으로,
    - 300 MPa 내지 400 MPa의 압력에서 적어도 1회 통과되거나,
    - 150 MPa 내지 300 MPa의 압력에서 적어도 2회 연속 통과되고;
    - 4℃ 내지 40℃의 공급 온도에서; 그리고
    - 고체의 15중량% 내지 50중량%를 포함하는 미세조류 세포들의 바이오매스를 사용하여
    수행됨을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 클로렐라 속의 미세조류가 클로렐라 불가리스, 클로렐라 소로키니아나 및 클로렐라 프로토테코이데스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 상세하게는 클로렐라 프로토테코이데스임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 유액 1 g당 10개 미만의 총 미생물의 미생물 로드를 보장함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 고압 균질화는 1회 통과 시 300 MPa 내지 400 MPa의 압력에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 고압 균질화는 2회, 3회, 4회 또는 5회 연속 통과 시 150 MPa 내지 250 MPa의 압력에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 고압 균질화는 2회 연속 통과 시 150 MPa 내지 250 MPa의 압력에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 2회 연속 통과 시의 압력은 동일하거나 상이할 수 있음을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 공급 온도는 20℃ 내지 40℃임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미세조류 바이오매스는 적어도 10 건조 중량%의 지질, 바람직하게는 적어도 20 건조 중량%, 30 건조 중량%, 40 건조 중량%, 50 건조 중량% 또는 60 건조 중량%의 지질을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  10. 미세조류 바이오매스를 생산하는 단계, 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 따른 방법에 의하여 세포벽을 파괴하는 단계 및, 상세하게는 분무 건조에 의해 바이오매스를 건조하는 단계를 포함하는, 미세조류 미분(flour)을 제조하는 방법.
  11. 제10항에 따른 방법에 의하여 수득된 미세조류 미분으로서, 상기 방법이 150 MPa 내지 300 MPa의 압력에서 적어도 2회 연속 통과시키는 단계를 포함하는, 미세조류 미분.
  12. 미세조류 미분을 제조하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 따른 미세조류 세포벽 파괴를 위한 방법의 용도.
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